CN100344223C - 具有多倍体减数***稳定性基因的多倍体水稻选育及鉴测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种解决多倍体水稻结实率低问题的具有多倍体减数***稳定性(Polyploid Meiosis Stability，PMeS)基因的多倍体水稻选育及鉴测方法。其选育过程为：a.选择亲本；b.杂交或复合杂交；c.挑选杂种连续回交；d.染色体加倍；e.多倍体鉴定；f.结实性选择；g.减数***行为观察；h.自交稳定成品系；i.高结实性杂交测定。鉴测指标为：a.亚洲栽培稻中的籼稻或粳稻的多倍体品系；b.具有≥65%的结实率；c.减数***行为正常。d.花粉形态和生理活性正常，经0.1%I-KI染色，正常可染花粉≥95%；e.以PMeS多倍体水稻与其它多倍体水稻品种杂交的后代结实率在70%以上，与A基因组野生稻杂种的多倍体后代结实率在65%以上。本发明解决了多倍体水稻结实率低的问题，可应用于多倍体水稻育种。

Description

具有多倍体减数***稳定性基因的多倍体水稻选育及鉴测方法

                        技术领域

本发明涉及一种具有多倍体减数***稳定性(Polyploid MeiosisStability，PMeS)基因的多倍体水稻选育及鉴测方法，属于多倍体水稻育种的技术领域。

                        背景技术

自然界高等植物70％左右都是多倍体，主要粮棉油作物如小麦、棉花、油菜等也都是多倍体，它们经历了二倍体向多倍体进化的过程，而且随着倍性的增加，它们的产量都成倍增长。

但是自从1933年日本学者Nakamori发现多倍体水稻以来(Nakamori，E.Onthe occurrence of the tetraploid plant of rice Oryza sativa L.，Proc，Imp.Acad.9，340-341，1933)，世界上有许多科学家从事水稻多倍体研究，虽然已经发现多倍体水稻具有茎杆粗壮、籽粒变大的优点，然而多倍体水稻育种进展缓慢。其主要原因是多倍体水稻的结实率低，一般都低于50％，达不到应用于生产的水平(宋文昌，张玉华，水稻四倍化及其对农艺性状和营养成分的影响，作物学报，18(2)：137-144，1992)。中国专利(ZL00114471.5)发明人蔡得田、袁隆平、卢兴桂从进化育种学的角度出发，提出利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻，它包括三个阶段即亚种间、种间和基因组间杂种优势利用，三种技术即拉大亲缘关系距离、利用广亲和基因和Ph基因(Pairinghomoeologous，部分同源染色体配对).提出了多倍体育种的新思路和技术，扩大了多倍体育种的应用范围，但与多倍体水稻高结实率相关的基因和品系尚未选育出来，多倍体水稻的结实率仍然不理想。

                        发明内容

本发明的目的是选育出多倍体减数***稳定性(PMeS)基因的多倍体水稻，用以解决多倍体水稻结实率低的问题，并使其形成的PMeS品系应用于多倍体水稻育种。

本发明的技术方案为：a.选择亲本，b.杂交或复合杂交，c.挑选杂种连续回交，d.染色体加倍，e.多倍体鉴定，f.结实性选择，g.减数***行为观察，h.自交稳定成品系，i.高结实性杂交测定。

本发明的具体过程为

a.选择亲本

选择亲本包括亚洲栽培稻的籼稻、粳稻品种，具备株型紧凑，穗大粒多，着粒密的特征，或带有广亲和基因和特殊性状的籼稻或粳稻品种。具体是选育Sg99012(PMeS-1)时的亲本为卷叶稻(籼型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)；选育HN2026(PMeS-2)时的亲本为HT99104(光壳稻/粳稻F₈的粳型品系)，蜀恢362。

b.杂交或复合杂交

在Sg99012选育中，以卷叶稻×高粱稻得到F₁-a，卷叶稻×GC574得到F₁-b，然后将F₁-a和F₁-b进行复合杂交。可以籼稻为母本，以粳稻为父本，或者以粳稻为母本，以籼稻为父本配制成不同的籼粳亚种间杂种，然后，将两个不同的杂种F₁进行复合杂交；在HN2026选育中，以HT99104×蜀恢362得到F₁杂种。

c.挑选杂种连续回交

从杂交或复合杂交后代中挑选株型紧凑，穗大粒多，着粒密，具有30％以上结实率的水稻植株为亲本，以农艺性状良好的粳稻(向粳型方向培育品种)或籼稻(向籼型方向培育品种)为回交亲本进行3～5代回交，获得许多性状基本倾向回交亲本的粳型或籼型回交后代。

d.染色体加倍

用秋水仙素处理上一步得到的分蘖期的水稻苗；也可以用秋水仙素处理水稻幼穗组织培养形成的愈伤组织。

e.多倍体鉴定

从外部形态上观察鉴定，即多倍体表现出茎杆粗壮，叶片厚实，谷粒变大(比二倍体大1/3至一倍)，大多数谷粒有芒。检查它们的根尖染色体数目为2n＝4x＝48。

f.结实性选择

按育种学的考种方法对多倍体水稻植株进行考种，选择等于和高于65％的多倍体水稻植株。

g.减数***行为观察

对其细胞遗传学特征减数***行为观察。在减数***时期，对确定为多倍体，且结实率≥65％的多倍体水稻植株的花粉母细胞减数***行为进行观察，将那些减数***正常即前期I以二价体配对为主，有3～6个四价体，而没有或低于1.0％的单价体或高价体，中期I无落后染色体，后期I无染色体桥、无落后染色体，末期I无微核出现，减数***II正常，进而形成正常四分体，经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％的多倍体水稻单株挑选出来。

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系。

i.高结实性杂交测定

以h过程中的PMeS稳定品系与多倍体籼稻、粳稻品种杂交，得到F₁杂种，即得到具有多倍体减数***稳定性(PMeS)基因的多倍体杂交水稻。考察F₁的结实率，一般结实率≥70％以上。

本发明确定多倍体减数***稳定性(PMeS)基因的多倍体水稻品系、品种及杂种的鉴测指标为：

a.本身是亚洲栽培稻(Oryza sativa)中的籼稻或粳稻的多倍体品系。

b.具有≥65％的结实率。

c.减数***行为正常。在前期I，染色体配对以二价体占优势，有3-6个四价体，但没有或仅有低于1.0％的单价体或高价体(四价体以上的配对染色体)；在中期I，后期I和末期I以及减数***II中没有或低于0.5％落后染色体或微核出现。

d.花粉形态和生理活性正常，经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％。

e.以PMeS多倍体水稻与其它多倍体水稻品种的多倍体后代结实率在70％以上，与A基因组野生稻杂种的多倍体后代结实率在65％以上。

本发明所产生的PMeS多倍体水稻具有以下积极效果：1、选育出一种本身具有较高结实率(≥65％)的多倍体水稻；2、利用PMeS多倍体水稻与其它多倍体水稻品种的多倍体后代结实率在70％以上，与A基因组野生稻物种杂交的后代结实率在65％以上，解决了长期未能解决的多倍体水稻结实率低的问题，使利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻成为可能；3、利用PMeS多倍体水稻与多倍体水稻不育系或多倍体水稻恢复系杂交，可以选育出具有PMeS品系高结实率特点的多倍体不育系和恢复系，为实现多倍体水稻杂种优势利用提供了条件。这样使水稻育种发生由二倍体水平向多倍体水平，品种间杂交向亚种间、种间甚至基因组间杂交的重大转变，可以充分利用远缘杂交和多倍体双重优势，有利于选育出大幅度增产(30％以上)的多倍体水稻品种或杂种。

                    具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明。

实施例1：PMeS-1(Sg99012)的选育

a.选择亲本

以卷叶稻(籼型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)为亲本，各选10株。

b.杂交和复合杂交

卷叶稻×高粱稻得到F₁-a，卷叶稻×GC574得到F₁-b，然后将F₁-a和F₁-b进行复合杂交。选出50粒杂种。

c.挑选杂种连续回交

挑选出倾粳型，株型紧凑，剑叶挺，穗子大，着粒密的杂种单株10株，作为母本用GC574回交得到BC₁F₁(47株)，从中挑选倾粳型，株型紧凑，剑叶挺，穗子大，着粒较密的杂种株(30株)与GC574回交得到BC₂F₁(15株)，连续回交3～4次得到BC₄F₁(选出20株)。

d.染色体加倍

用秋水仙素处理上一步得到的分蘖期的水稻苗。取带1-2个分蘖的BC₄F₁杂种秧苗(20株)，用刀片在基部横切一刀，深达基部的一半，然后将秧苗浸泡在0.2～0.3％秋水仙素水溶液中，在1500～2000LX光照、20～25℃条件下处理48～56h，待秧苗根尖出现肿大形状时，将秧苗取出，置于流水中冲洗4小时以上，然后将秧苗移栽在泥土钵中，于1500～2000LX光照、20℃条件下缓苗10～15天，待秧苗的叶腋中新生出分蘖，挑选那些呈现出叶片增厚、叶色变浓特征的秧苗，让其自然生长10～15天后，将它们转入到室外栽培，这些秧苗可能发育成多倍体水稻。

e.多倍体鉴定

从外部形态上观察鉴定，即多倍体表现出茎杆粗壮，叶片厚实，谷粒变大(比二倍体大1/3至一倍)，大多数谷粒有芒。检查它们的根尖染色体数目为2n＝4x＝48。

f.结实性选择

按育种学的考种方法对多倍体水稻植株进行考种，选择等于和高于65％的多倍体水稻植株。

g.对其细胞遗传学特征减数***行为观察

在减数***时期，对确定为多倍体，且结实率≥65％的多倍体水稻植株的花粉母细胞减数***行为进行观察，将那些减数***正常即前期I以二价体配对为主，有3～6个四价体，而没有或低于1.0％的单价体或高价体，中期I无落后染色体，后期I无染色体桥、无落后染色体，末期I无微核出现，减数***II正常，进而形成正常四分体，经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％的多倍体水稻单株挑选出来(7株)。

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系，定名为Sg99012。

i.高结实性杂交测定

用PMeS稳定品系Sg99012与多倍体Dure(籼)、PA64s(籼)品种杂交，得到F₁杂种PSR120(Dure/Sg99012)、PSR012(PA64_s/Sg99012)，考察F₁的结实率分别为73.87％、78.82％，株系单株产量都超过100克。

实施例2：PMeS-2(HN2026)的选育

a.选择亲本

以HT99104(粳型)，蜀恢362(籼型)为亲本，各选10株。

b.杂交或复合杂交

HT99104×蜀恢362，获得12株F₁。

c.挑选杂种连续回交

基本与实施例1同，仅以HT99104为回交亲本不同，回交四次后得到BC₄F₁杂种15株。

d.染色体加倍

采用的是幼穗愈伤组织，在添加有500mg/l秋水仙素的N6液体培养基中诱导加倍，而后分化成多倍体水稻苗。

e、f、g过程与实施例1基本相同。

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系，定名为HN2026。

i.高结实性杂交测定

用PMeS稳定品系HN2026与多倍体HT99128(籼)、PA64s(籼)、HT99133(籼)品种杂交，得到F₁杂种PSR026(PA64s/HN2026)、PSR073(HT99128/HN2026)、PSR183(HT99133/HN2026)，考察F₁的结实率分别为79.88％、77.78％、87.75％，株系单株产量都超过100克。

Claims (2)

1.一种具有多倍体减数***稳定性基因的多倍体水稻选育方法，其特征在于过程为：

a、选择亲本，b、杂交或复合杂交，c、挑选杂种连续回交，d、染色体加倍，e、多倍体鉴定，f、结实性选择，g、减数***行为观察，h、自交稳定成品系，i、高结实性杂交测定。

2、按权利要求1所述的具有多倍体减数***稳定性基因的多倍体水稻选育方法，其特征在于具体过程为：

a.选择亲本

选择亲本包括亚洲栽培稻的籼稻、粳稻品种，具备株型紧凑，穗大粒多，着粒密的特征，或带有广亲和基因和特殊性状的籼稻或粳稻品种，具体为籼型卷叶稻，粳型高粱稻，粳型GC574；HT99104，蜀恢362；

b.杂交或复合杂交

在Sg99012选育中，以卷叶稻×高粱稻得到F₁-a，卷叶稻×GC574得到F₁-b，然后将F₁-a和F₁-b进行复合杂交，可以籼稻为母本，以粳稻为父本，或者以粳稻为母本，以籼稻为父本配制成不同的籼粳亚种间杂种，然后，将两个不同的杂种F₁进行复合杂交；或者在HN2026选育中，以HT99104×蜀恢362得到F₁杂种；

c.挑选杂种连续回交

从复合杂交后代中挑选株型紧凑，穗大粒多，着粒密，具有30％以上结实率的水稻植株为亲本，向粳型方向培育品种时以农艺性状良好的粳稻、向籼型方向培育品种时以农艺性状良好的籼稻为回交亲本进行3～5代回交，获得许多性状基本倾向回交亲本的粳型或籼型回交后代；

d.染色体加倍

用秋水仙素处理上一步得到的分蘖期的水稻苗；也可以用秋水仙素处理水稻幼穗组织培养形成的愈伤组织；

e.多倍体鉴定

从外部形态上观察鉴定，即多倍体表现出茎杆粗壮，叶片厚实，谷粒比二倍体变大1/3至一倍，大多数谷粒有芒。检查它们的根尖染色体数目为2n＝4x＝48；

f.结实性选择

按育种学的考种方法对多倍体水稻植株进行考种，选择等于和高于65％的多倍体水稻植株；

g.减数***行为观察

在减数***时期，对确定为多倍体，且结实率≥65％的多倍体水稻植株的花粉母细胞减数***行为进行观察，将那些减数***正常即前期I以二价体配对为主，有3～6个四价体，而没有或低于1.0％的单价体或高价体，中期I无落后染色体，后期I无染色体桥、无落后染色体，末期I无微核出现，减数***II正常；经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％，进而形成正常四分体的多倍体水稻单株挑选出来；

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系；

i.高结实性杂交测定

以h过程中的PMeS稳定品系与多倍体籼稻、粳稻品种杂交，得到F₁杂种，即得到具有多倍体减数***稳定性PMeS基因的多倍体杂交水稻，考察F₁的结实率，一般结实率≥70％以上。