CN100342020C - 一种大片段dna制备乳腺生物反应器新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法,该方法包括步骤:制备BAC、YAC和P1载体上的含目的基因的大片段DNA,其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达;用原核注射法将大片段DNA注射入山羊受精卵内,移植到***山羊体内,产生转基因的山羊,大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达。用本发明方法可有效地实现目的基因在乳腺中的定点、定时表达。
Description
本发明涉及基因工程领域和药物领域,更具体地,本发明涉及制备乳腺生物反应器的制备方法,尤其是用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法。
乳腺生物反应器制药是80年代末90年代初兴起的新兴技术。这项技术原理是将人药用蛋白基因转入乳用家畜体内,药用蛋白在家畜乳腺中表达,进而在乳汁中提取蛋白。与细菌表达重组蛋白及哺乳动物细胞表达方法相比,该方法有明显优势,例如生产的蛋白不但可以表达较大的蛋白,以复杂的糖基化进行修饰,产生正常的生理活性,而且产量大、生产成本低,因而此技术有着广阔的市场前景。
自90年以来乳腺生物反应器先后成功表达了抗胰蛋白酶,纤溶酶原,凝血因子九,血浆白蛋白等药用蛋白,并打入了药品市场,现在每年产值近十亿美元。
但是随着该技术的大规模应用,一些技术难题渐渐显现出来。其中最突出的是转基因表达的位点效应,即转基因在基因组中随机整合,但只有整合在活化的染色质区才能表达;这样只有10-20%的转基因整合动物的才会不同程度的表达目标蛋白,而且表达量相差显著,这就大大提高了生产转基因动物的成本,使得该技术产业化困难。
为了克服位点效应各国科学家作了多年的研究,发现乳蛋白基因的5′和3′调控区远端存在基因座控制区(locus control region,简称为“LCR”)或基质附着区(matrix attachment region,简称为“MAR”)[Jew P cell 1992][Kioussis.D,Curr Opin Genet Develop 1997][Blackwood,Science 1998],这些序列的存在可以克服转基因表达中的位点效应。但是乳蛋白的LCR序列大多位于基因上下游的几十KB的范围内,如果用质粒来克隆如此大的DNA片段是不可能的,因为质粒的克隆能力在15KB以内。
以YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和P1人工染色体技术为代表的大片段DNA转基因技术的发展,提供解决了这一难题的可能。这些载体可以克隆长达几百KB的DNA片段,可以一次克隆下乳蛋白基因的上下游远端几十KB的调控序列。实验已表明用BAC、YAC载体构建的大片段DNA消除了转基因表达中的位点效应,而且明显体现了转基因拷贝数与目标蛋白表达的正相关性,转基因整合的拷贝数越多,表达量越高[Keneth,PNAS 1993]。这些载体不仅克隆能力很强,而且在细菌中和酵母内的同源重组率高[Xiangdong W,Nature Biotechnology 1997],因而对BAC、YAC分子同源重组改造方便,可以向YAC中重组引入筛选标志,酶切位点等,并可以将目标蛋白基因转入YAC转基因载体中或突变YAC中的基因,酵母中成熟的分子克隆技术促进了YAC载体在转基因领域的应用。
近年来,大片段DNA转基因技术应用越来越广泛,从大基因组基因的功能研究到建立疾病模型都有应用例[Keneth PNAS 1993]。在90年代中后期大片段DNA转基因技术渐渐应用起来。
97年-99年日本科学家Y.Fujiwara等第一次将YAC载体引入乳腺生物反应器的研究中,97年用含乳清白蛋白基因的YAC DNA(210KB)转基因,得到了乳清白蛋白表达量高达2-3ml/ml。98年又进一步对YAC进行酵母内同源重组,成功地完成了重组YAC DNA的转基因。目标蛋白生长激素的表达量可达0.8mg/ml。
1999年法国的Marie-Georges研究组成功应用了170KB的BAC DNA乳腺表达了羊乳清白蛋白,表达量可达0.8-1mg/ml。
Y.Fujiwara和Marie-Georges的成功提示大片段DNA转基因在乳腺生物反应器领域的应用将领导乳腺制药领域的技术潮流。应用该技术有利于基因表达调控的进一步深入研究;揭示基因基因定位高效表达的分子机理;促进乳腺制药产业的发展。
然而,目前的大片段DNA制备乳腺生物反应器的技术仍存在一些缺点,如由于大片段DNA转基因构建过程的复杂性和操作过程的难度大,所以目前世界上还只有两三个实验室作该领域工作;而且只能表达一些长度在10kb以内较小的目的基因;还只能应用该技术生产转基因小鼠,还没有该技术生产转基因大动物的先例。
本发明的目的就是提供一种新的用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法,该方法具有至少如下一个或多个优点:
1.简化了大片段DNA转基因构建方法,使其程式化,促进了在乳腺制药工业的应用。
2.将酵母内YAC嵌合技术引入大片段DNA转基因构建方法,使得可以表达长度10kb-200kb的目的基因的基因组基因,扩展了大片段DNA转基因技术的应用范围。
3.首次应用大片段DNA转基因技术制备转基因乳山羊。
本发明提供了一种用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法,它包括步骤:
制备BAC、YAC和P1载体上的含目的基因的大片段DNA,其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达;
用原核注射法将大片段DNA注射入山羊受精卵内,
移植到***山羊体内,产生转基因的山羊,大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达。
在本发明的一个实施例中,该目的基因编码乳铁蛋白,而且将含乳蛋白基因的大片段直接用于转基因。
在本发明的一个实施例中,该大片段DNA通过酵母内同源重组的方法进行改造,从而在该大片段DNA中乳蛋白基因的调控序列位于目的基因的两侧并指导目的基因的表达。一种酵母内同源重组的方法改造大片段DNA的具体程序包括步骤:用聚合酶链式反应方法调取乳蛋白基因上下游各一段300-1500bp调控序列作为同源臂,两者之间***要表达的目的基因构建成打靶载体。较佳地,还包括步骤:将所述的打靶载体,与含有乳蛋白基因大片段上下游序列及基因自身的完整编码序列的大分子YAC、BAC、P1克隆进行酵母内重组,从而将目的基因***在乳蛋白基因的大片段调控序列下。
在本发明的一个较佳实施例中,大片段DNA可包括长度为5-200kb的含目的基因的基因组序列,和位于所述基因组序列两侧并指导目的基因表达的长度为50-200KB的乳蛋白基因的调控序列。
如本领域技术人员所熟知的那样,所述的乳蛋白基因的调控序列指乳蛋白基因编码区的5′和3′序列,通常包括如下控制乳蛋白基因转录的核心序列:如TATA盒、GC盒,远端基因座控制区。
在本发明的另一实施例中,所述的大片段DNA是用酵母内YAC嵌合方法制备的。一种具体的用酵母内YAC嵌合方法制备大片段DNA的程序包括步骤:
制备乳腺定位表达ALA的表达载体和含目的基因的基因组序列的表达载体;
用聚合酶链式反应(PCR)方法调取乳蛋白基因上下游各一小段调控序列(300-1500bp,较佳地500-1000bp),和目的基因的头尾各一小段序列(500-1000bp,较佳地300-1500bp),用同源重组方式将所述的乳蛋白基因上下游各一小段调控序列分别***所述目的基因的头尾各一段序列的上下游,形成两个嵌合载体;
嵌合载体与所述的含目的基因的基因组序列的表达载体进行同源重组,形成目的基因嵌合载体,其中所述的乳蛋白基因上下游各一小段调控序列位于目的基因的两侧;
将目的基因嵌合载体与乳腺定位表达乳蛋白的表达载体转入同一酵母中,两者重组形成嵌合分子,其中该嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指导目的基因的基因组序列的表达。
在附图中,
图1显示了含HLF目的基因的大片段DNA,其中在上方标出了各酶切位点。
图2显示了载体RS-ALA-IL的结构。
图3显示了用酵母同源重组方法制备含IL-11目的基因大片段DNA的过程。
图4显示了载体RS-ALA-IL与含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)之间的同源重组,从而获得含IL-11目的基因和ALA调控序列的YAC分子(Y-ALA-IL-11)。
图5显示了载体RS-FIX2的结构。
图6显示了载体RS-FIX1的结构。
图7显示了用载体RS-ALA-IL与含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)之间的同源重组,从而获得含IL-11目的基因和ALA调控序列的YAC分子(Y-ALA-IL-11)。
在本发明中,“大片段DNA”指长度大于50kb,较佳地大于100kb,更佳地大于150kb的DNA分子。
适用于本发明的动物包括常见的哺乳动物,尤其是用于畜牧业和产奶业的哺乳动物,例如牛和羊。更佳地该动物是羊,例如:莎能乳山羊、波尔羊、普通山羊。
由于本发明方法具有通用型,因此,适用于本发明方法的目的基因没有特别限制,例如在本发明的3个实施例中就选用了HLF、IL-11、FIX3中不同的蛋白。至于获得目的基因的途径,一种较方便的方法就是通过市售的各种YAC克隆,或者通过用常规方法构成的YAC克隆,采用PCR法和酶切的方法获得含目的基因的DNA片段,尤其是基因组片段。
在本发明中,通常采用YAC和BAC作为转基因载体,由于YAC有着平均700kb、BAC有着200KB左右的DNA装载能力,因而可以容纳人或哺乳动物的乳蛋白基因的大片段上下游序列。
更佳地,采用YAC作为转基因载体。与目前大多数转基因动物采用的质粒载体相比,用YAC DNA作为转基因构建,有明显的优越性。
1、可以克服整合位点效应。
采用质粒上的小片段转基因构建时,由于质粒的DNA装载能力有限(只有20kb之内),只能克隆较短的乳腺表达启动序列,这样转基因构建必须整合到转录活性高的基因组部位,才能得到较高表达,但是整合是随机的,这样生产出的转基因动物的目的基因产物表达量就很不均一,有的不表达,有的低表达,只有极少数较高表达。
相反,用YAC载体的大片段转基因构建转基因时,由于含有足够的上下游调控序列,因而无论整合在基因组何处,转基因本身序列有形成局部转录活性单元的能力,这就克服了整合位点效应,使转基因动物的表达量稳定。
2、提高表达量,稳定高效表达。
许多例子表明,蛋白质乳腺表达时采用目标蛋白基因组DNA(gDNA)的表达量明显高于mRNA的表达量。但在质粒载体转基因时,对于gDNA稍大的蛋白(10KB以上)往往只能采用该基因的mRNA了。与此相比,YAC载体不仅可以得到足够长度的调控序列,而且应用YAC嵌合和同源重组技术可以克隆很长的目标蛋白gDNA用于乳腺表达。
一般来说,采用YAC大片段DNA转基因时,基因的表达水平与体内的同源基因表达水平相当,这对于乳腺制药工业中在乳腺中大量表达外源目的基因的目标来说,YAC转基因有很好的应用前景,质粒载体的大片段DNA表达量都要比体内同源基因的水平低1-2个数量级。
3、可以克服异位表达。
乳腺特异表达的转基因在乳腺以外的表达,叫作异位表达。乳腺中表达的外源基因产物常常在肝、肾等脏器也有微量的表达,这严重地影响了转基因动物本身的健康。而采用YAC载体调取大片段的调控序列则可严格控制转基因表达的组织特异性和发育表达的时序性,从而克服异位表达。
综上所述,采用大片段DNA转基因可以大大提高乳腺制药过程中的成功率,对于降低成本,稳定质量具有深远的推动作用。
在本发明中,构建乳腺表达载体时通常有三种方式:
1、对于含有乳蛋白调控序列的目的基因(如人乳蛋白基因),可以直接制备含人乳蛋白基因的大片段DNA,并以原核注射法生产转基因山羊。
该方式的优点是:构建转基因大片段DNA简单,而且目的产物表达量高。
2、利用同源重组方法,改造乳蛋白基因的大片段DNA,将外源基因(如珍贵的药用蛋白基因)重组入大片段DNA上,使其位于乳腺表达基因的上下游调控序列下,受其调控。
该方式的优点是:构建转基因大片段DNA周期短。
3、利用YAC嵌合方法,将含目的基因的克隆和乳蛋白基因的YAC克隆转入同一酵母中,两者重组形成嵌合YAC分子,其中嵌合YAC分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指导目的基因大分子基因组基因的表达。
该方式的优点是:适用性强,以此方法可以表达几乎所有的目的基因。
下面结合实施例对发明的进一步说明,其中实施例1、2、和3分别对应上述的三种制备乳腺表达载体的方式。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:人乳铁蛋白(HLF)乳腺转基因构建人乳铁蛋白(HLF)乳腺表达载体构建
人HLF是在人乳腺中特异性高表达量蛋白,在人乳中的表达量可达1.4克/毫升乳汁,所以其基因本身的启动子即可指导HLF的高效定位表达,为此用PCR调取了该基因的YAC克隆,并进行了稀少酶切分析,确定该YAC株中含有80kb和120kb的启动序列和下游调控序列。直接用于乳腺表达。
一、实验材料
人基因组CHEF YAC文库(上海市第二医科大学血研所陈竺院士惠赠),脉冲场电泳仪CHEF-II,超滤器(Millipore UTK00),核酸内切酶,Taq酶及琼脂糖酶购自Promega公司。
P32 CTP同位素标记试剂盒购自Promega公司。
二、构建过程
1、用PCR和Southern印迹法来调取并验证含有人HLF基因的YAC株。
用PCR方法筛选含HLF基因的YAC分子。其中PCR程序为95℃ 5分钟,94℃ 30秒,55℃ 40秒35个循环,72℃延伸7分钟。引物为Primer HLF(引物:HLF:5′AAGCCTGTGAATTCCTCAG 3′和5′GCTAAGACTACAGCAGGG 3′),筛人基因组YAC文库。经多轮筛选得到了含HLF基因克隆YAC克隆Y-HLF。进一步的Southern印迹结果表明该YAC分子为410KB。
2、含HLF的YAC克隆进一步酶切分析和HLF基因的定位。
用低熔点琼脂糖法制备HLF克隆的染色体包块,分别用限制性内切酶SalI,NotI,NruI,MluI和BssHII部分酶切,转膜。pBR322质粒用BamHI和PvuII酶切,回收1.2KB的YAC分子左臂序列,以α32P标记后与上膜杂交,进而得到该克隆的稀有酶切图谱。以此为基础,以α32P标记引物对HLF的PCR产物与上膜杂交,确定了HLF基因在该YAC分子的中部,上下游各有100KB和180KB的调控序列(图1)。
3、Y-HLF分子的纯化
①染色体包块制备
挑取YAC单克隆接种10ml的AHC培养基中,30℃通气培养过夜。1500rpm离心5分钟收集酵母,用10ml 50mM EDTA以同条件离心洗涤两次,总酵母体积调整到200ul。加100u的lyticase 20ul,混匀,再加200ul 37℃的融化的2%低熔点琼脂糖,混匀后灌入模板制成包块。加入原生质球制备液中(50mM EDTA,3%巯基乙醇),37℃过夜。更换裂解液(50mM EDTA,100ul/ml蛋白酶k)消化24小时。
②Y-HLF分子的纯化
用含YAC分子的酵母染色体包块,跑脉冲场电泳胶采用1%的超低溶点琼脂糖。在经染色观察后,切取YAC条带,在65摄氏度水浴5分钟,之后加入琼脂糖酶和其25倍的缓冲液,42摄氏度消化2小时。
用截断分子量为20000的超滤器来浓缩YAC分子,达到2ug/ml的浓度,再用注射缓冲液(Tris-Cl,pH8.0,NaCl 100mM,EDTA 0.025mM),透析4小时,此时制备的YAC分子即可用于显微注射来生产转基因动物。
③转基因动物的制备
A、显微注射:将上述纯化后的YAC分子,通过显微注射的方法导入到莎能奶山羊受精卵雄原核内,再移植到同步发情的受体山羊输卵管内,待其妊娠产仔。山羊超排、注射、移植以及产仔等试验结果如下:
B、转基因整合检测:将出生不久的小羊羔取其耳组织提取DNA,应用PCR的方法(参见“二、构建过程1”,引物是:HLF:5′AAGCCTGTGAATTCCTCAG 3′和5′GCTAAGACTACAGCAGGG 3′)进行转基因的整合检测,结果转基因的整合率为20%(10/50),PCR+Southern试验证实了基因的整合。
C、表达检测:将性成熟的转基因羊通过人工催乳,应用Western方法检测其乳汁中目的蛋白。结果表明其中有人乳铁蛋白的表达。
实施例2:Y-ALA-IL-11转基因YAC DNA的构建
在该实施例中,应用同源重组的方法将人白介素IL-11基因重组入含人乳清白蛋白(ALA)基因的YAC中,从而受到ALA基因的启动子和下游调控序列的控制(图3)。
一、实验材料:
Y-ALA:为含有ALA基因的YAC分子(上海市第二医科大学 血研所陈竺院士惠赠),穿梭载体RS403(带His 3筛选基因)购自Stratagene公司。IL-11基因组基因克隆(由本研究中心筛库获得)。
引物:ALA1:5′CCGGAATTCGCCTAGATGCTTTCATACAGG 3′
5′TCCCCCGGGTTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′
ALA2:5′ATTGGGCCCATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′
5′CCGCTCGAGAAGGCTCAGAGACAGATAAG 3′。
A-I3:5′GCTCCTGGGCTCAAGTG 3′
5′CTTTAACCCTTCCCTGTCC 3′
A-I4:5′TGACTGTGTATTTTGCATGAC 3′
5′TTCAAGAATTCGGTGATGTC3′
二、构建过程(调取ALA基因的上下游同源臂结构)
1、构建酵母内穿梭重组载体PRS-ALA。
通过PCR反应,分别用引物对ALA1和引物对ALA2从人基因组DNA中克隆人ALA基因的上下游各700和900bp的ALA-up和ALA-down片段。PCR循环的条件与实施例1中相同。
扩增出的ALA-up和ALA-down片段经ApaI+XhoI酶切和EcoRI+SmaI酶切后与酶切后的PRS403载体相连接,形成PRS-ALA载体。
2、将人IL-11基因重组入Y-ALA上,形成表达IL-11乳腺表达载体
将含有IL-11基因DNA用BamHI和NotI酶切,收取6.0kb的IL-11基因编码区(带有全部外显子和内含子,但不含有其调控序列),克隆入PRS-ALA中的相应位点,构建成RS-ALA-IL(图2)。该载体中AlA-up片段的3′末端位于ALA基因转录启始位点下游25bp处。ALA-down片段的5′位于ALA基因的第四个外显子上。
以下为ALA-up,ALA-down和IL-11的测序结果,其中粗体为外显子,正常为内含子。
ALA-up序列(SEQ ID NO:1)--
GTGCCTGGCCTAGATGCTTTCATACAGGCTTTTCAATTATGCATTTTCCTTAAGTAGGAAGTCTTAAGATCCAAGTTATATCG
GATTGTTGTAGTCTACGTTCCCATATTCTATTCCTATTTCTGAGCCTTCAGTCATGAGCTACCATATTAAAGAACTAAATTCTGG
GCCTTGTTACATGGCTGGATTGGTTGGACAAGTGCCAGCTCTGATCCTGGGACTGTGGCATGTGATGACATACACCCCCT
CTCCACATTCTGCATGTCTCTAGGGGGGAAGGGGGAAGCTCGGTATAGAACCTTTATTGTATTTTCTGATTGCCTCACTTC
TTATATTGCCCCCATGCCCTTCTTTGTTCCTCAAGTAACCAGAGACAGTGCTTCCCAGAACCAACCCTACAAGAAACAAAG
GGCTAAACAAAGCCAAATGGGAAGCAGGATCATGGTTTGAACTCTTTCTGGCCAGAGAACAATACCTGCTATGGACTAGAT
ACTGGGAGAGGGAAAGGAAAAGTAGGGTGAATTATGGAAGGAAGCTGGCAGGCTCAGCGTTTTCTGTCTTGGCATGACCA
GTCTCTCTTCATTCTCTTCCTAGATGTAGGGCTTGGTACCAGAGCCCCTGAGGCTTTCTGCATGAATATAAATAAATGAAAC
TGAGTGATGCTTCCATTTCAGGTTCTTGGGGGTAGCCAAA-------以下接IL-11基因
ALA5′UTR------IL-11基因(SEQ ID NO:2)-
ATGCCTCCCCTCCCCAGCCGCGGGCCCAGCTGACCCTCGGGGCTCCCCCGGCAGCGGACAGG
GAAGGGTTAAAGGCCCCCGGCTCCCTGCCCCCTGCCCTGGGGAACCCCTGGCCCTGTGGGGA
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GGGTGGGCGGGGCGGCCGGGGTGGGCTGCGGGGAGCGAGCTCCGGACCCCCGCGCCCCCGGCGCCCCCCGCGCC
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ALA-down(SEQ ID NO:3)
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AGTTTGTTTCTTTCTGTTCCCCCAAAGCTTATCTGTC
3.对含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)进行转宿主
Y-ALA分子是存在于宿主AB1380中的,由于AB1380中的遗传标记少,不利于同源重组,所以将该YAC分子转移到YPD925宿主菌中,有利于下一步的基因重组。YPD925酵母株可以用-His或-Leu的营养标记来筛选重组基因。
过夜培养YPD925菌体和含Y-ALA的酵母株,第二天各收取1ml菌液混和离心(2500rpm,2min),用1ml新鲜的YPD重悬,30摄氏度培养6-8小时,后吸取0.2ml培养物涂筛选平板(-Ura,含有放线菌酮3ug/ml),培养3天出现菌落。此时YAC分子已转移到酵母株YPD925中。
4将IL-11基因重组入Y-ALA分子中,构建重组YAC ALA-IL。
过夜培养,Y-ALA菌株100ml,培养物OD值达到0.5左右时,离心收集,用水重悬,离心,用RS-ALA-IL载体通过LiAC法转化Y-ALA菌株,从而让RS-ALA-IL与Y-ALA之间发生重组(图4)。筛选到His+,Ura+和Trp+的转化子。进一步用引物对A-I3和A-I4鉴定,可分别拉出700和1000bp产物的,即为同源重组子YAC-ALA-IL(或称为Y-ALA-IL-11)。
5重组YAC的纯化
重组YAC的纯化同实施例1。制备的YAC分子即可用于显微注射来生产转基因动物。
A、显微注射:将上述纯化后的YAC分子,通过显微注射的方法导入到莎能奶山羊受精卵雄原核内,再移植到同步发情的受体山羊输卵管内,待其妊娠产仔。山羊超排、注射、移植以及产仔等试验结果如下:
B、转基因整合检测:将出生不久的小羊羔取其耳组织提取DNA,应用PCR的方法(与本实施例“二、构建过程1”中的PCR法相同)进行转基因的整合检测,结果转基因的整合率为20% 10/50),PCR+Southern试验证实了基因的整合。
C、表达检测:将性成熟的转基因羊通过人工催乳,应用Western方法检测其乳汁中目的蛋白。结果证实了IL-11的表达。
实施例3
一、实验材料
Y-ALA、Y-FIX(含有凝血因子9基因的YAC克隆)(上海市第二医科大学 血研所陈竺院士惠赠),RS403,RS-401(购自Stratagene公司),AB1610酵母(常用菌株)。
引物:ALA1:5′CCGGAATTCGCCTAGATGCTTTCATACAGG 3′
5′TCCCCCGGGTTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′
ALA2:5′ATTGGGCCCATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′
5′CCGCTCGAGAAGGCTCAGAGACAGATAAG 3′
FIX1 5′CAAAGGTTATGCAGCGC 3′
5′AGCTGACATCATGTCTGGAG 3′
FIX2 5′GTCATAATTTCAGAACCCACG 3′
5′TGAATTAACCTTGGAAATCC 3′
F-A1 5′TGGACATTATTTCCCAGAAG 3′
5′TTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′
F-A2 5′ATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′
5′GGTAAAATATGAAATTCTCCC 3′
二、构建过程
1、调取ALA基因的上下游调控序列片段。
通过PCR反应,分别用引物对ALA1和引物对ALA2从人基因组DNA中扩增出人ALA基因的上下游各700和900bp的片段。PCR循环参数同实施例1。
2、调取凝血因子9基因的头、尾片段。
通过PCR反应,分别用引物对FIX1和引物对FIX2从人基因组DNA中扩增出人FIX基因的头尾各1KB和1.2KB的片段。PCR循环参数同实施例1。
3、构建重组载体
将步骤1中的700bp的ALA上游片段经EcoRV和NotI酶切与1KB的凝血因子9基因头段经EcoRV和XhoI酶切,***RS403相应位点中,形成载体RS-FIX1(图5)。
将步骤1中900bp的ALA下游片段(经EcoRV和NotI酶切)与1.2kb的凝血因子9基因尾段(经EcoRV和XhoI酶切)***RS401相应位点中,形成RS-FIX2(图6)。
4、酵母内重组构建重组Y-rFIX
同时将RS-FIX1和RS-FIX 2用LiAC法转化含Y-ALA的YPD925酵母株,筛取Leu+和His+特性的重组YAC分子(图7)。进一步用引物对F-A1和F-A2筛选同源重组子,PCR反应得到750和850bp条带即为重组子Y-rFIX。
5、Y-ALA与重组Y-FIX分子发生YAC嵌合重组
提取Y-ALA分子,原生质体法转化导入AB1610,过夜培养该菌及含Y-rFIX的AB1380菌株,第二天,各取1ml混和离心,后用1ml新鲜的YPD培养液30摄氏度培养4-8小时,涂筛选平板(-Leu,-Trp,-Ura),3天后长出克隆。克隆进一步在孢子形成培养基上培养3天,用1ml水来洗下菌体,用超生波处理,得到孢子液,进一步涂于筛选培养基,筛取Trp+、Ura+、Leu+、His-,TK-的酵母株,此株即为Y-ALA-FIX重组YAC株。
电泳结果表明:Y-ALA-FIX重组YAC株长度为230KB,比Y-ALA样品长。
6.按实施例1类似的方法,提取重组的YAC分子,用于显微注射。
A、显微注射:将上述纯化后的YAC分子,通过显微注射的方法导入到莎能奶山羊受精卵雄原核内,再移植到同步发情的受体山羊输卵管内,待其妊娠产仔。山羊超排、注射、移植以及产仔等试验结果如下:
B、转基因整合检测:将出生不久的小羊羔取其耳组织提取DNA,应用PCR的方法(与本实施例“二、构建过程1”中PGR法相同)进行转基因的整合检测,结果转基因的整合率为20%(10/50),PCR+Southern试验证实了基因的整合。
C、表达检测:将性成熟的转基因羊通过人工催乳,应用Western方法检测其乳汁中目的蛋白。结果证实了FIX因子的表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1、一种用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法,其特征在于,它包括步骤:
制备细菌人工染色体BAC、酵母人工染色体YAC和P1载体上的含目的基因的大片段DNA,其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达,并且在所述目的基因的两侧具有乳蛋白基因的调控序列;
用原核注射法将大片段DNA注射入山羊受精卵内,
移植到***山羊体内,产生转基因的山羊,大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,该目的基因编码乳铁蛋白。
3、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,该大片段DNA通过酵母内同源重组的方法进行改造,从而在该大片段DNA中乳蛋白基因的调控序列位于目的基因的两侧并指导目的基因的表达。
4、根据权利要求3所述的方法,其特征在于,在用酵母内同源重组的方法改造大片段DNA时,包括步骤:
用聚合酶链式反应方法调取乳蛋白基因上下游各一段300-1500bp调控序列作为同源臂,两者之间***要表达的目的基因构建成打靶载体。
5、如权利要求4所述的方法,其特征在于,还包括步骤:
将所述的打靶载体,与含有乳蛋白基因大片段上下游序列及基因自身的完整编码序列的大分子YAC、BAC、P1克隆进行酵母内重组,从而将目的基因***在乳蛋白基因的大片段调控序列下。
6、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,该大片段DNA包括长度为5-200kb的含目的基因的基因组序列,和位于所述基因组序列两侧并指导目的基因表达的长度为50-200KB的乳蛋白基因的调控序列。
7、根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的乳蛋白基因的调控序列包括乳蛋白基因编码区的5′和3′序列,其上包括如下控制乳蛋白基因转录的核心序列:TATA盒、GC盒,远端基因座控制区。
8、根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的大片段DNA是用酵母内YAC嵌合方法制备的。
9、如权利要求8所述的方法,其特征在于,用酵母内YAC嵌合方法制备大片段DNA时包括步骤:
制备乳腺定位表达乳清白蛋白ALA的表达载体和含目的基因的基因组序列的表达载体;
用聚合酶链式反应方法调取乳蛋白基因上下游各一小段300-1500bp调控序列和目的基因的头尾各一小段300-1500bp序列,用同源重组方式将所述的乳蛋白基因上下游各一小段调控序列分别***所述目的基因的头尾各一段序列的上下游,形成两个嵌合载体;
嵌合载体与所述的含目的基因的基因组序列的表达载体进行同源重组,形成目的基因嵌合载体,其中所述的乳蛋白基因上下游各一小段调控序列位于目的基因的两侧;
将目的基因嵌合载体与乳腺定位表达乳蛋白的表达载体转入同一酵母中,两者重组形成嵌合分子,其中该嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指导目的基因的基因组序列的表达。
10、如权利要求1所述的方法,其特征在于,该目的基因编码选自下组的蛋白:人乳铁蛋白、白细胞介素11、凝血因子9,且该山羊选自下组:莎能乳山羊、波尔羊、普通山羊。
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