CN100336906C - 脂肪酶基因序列及其在酵母中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能在酵母中有效表达的脂肪酶基因序列及具有该基因序列的酵母菌。其主要特征在于：根据脂肪酶氨基酸序列，设计出具有在酵母中使用频率较高的密码子的基因序列，在该基因序列的5’端连接与目的酵母相配合的基因片段，在3’端连接限制性内切酶位点。本发明的酵母菌能有效分泌脂肪酶蛋白，能广泛用于石油工业、造纸业、生物制药、化工等领域，起去脂、增香、洗涤等功用。

Description

脂肪酶基因序列及其在酵母中的应用

本发明涉及一种能在酵母(尤其是在毕赤巴斯德酵母)中表达的基因序列和可供其克隆的载体及可供其表达的酵母菌，以及酵母菌的筛选方法和从酵母基因工程菌中得到的基因工程脂肪酶。

脂肪酶(甘油酯水解酶，Lipase)是能够水解非水溶性酯类物质，如长链三甘油酯triglycerides(脂肪)，的酯酶。它在水脂介面上特异性地将脂肪水解为脂肪酸和甘油，并在非水介质中催化逆反应。脂肪酶水解发生部位为油脂的酯键，其催化反应如下：

上述反应还可以进行到单酸甘油酯，直至水解成甘油。(Ghosh & Saxena，79(Pt 2)：119-571996；Sober & Palmeros，Crit Rev Microbiol，20(2)：95-1051994)。脂肪酶在非水介质中还能催化酯化反应或改变酯键，在酯化反应和转酯反应中具有很高的专一性和相互选择性。脂肪酶广泛存在于动植物各种器官组织和微生物中。微生物脂肪酶种类很多，它们的生化特性和底物特异性与产生菌有关。对脂肪酶结构功能的研究主要集中于皱落假丝酵母Candida rugosa(又称柱状假丝酵母Candida cylindracea)。Candida rugosa脂肪酶是一种在脂肪酸的诱导下分泌产生的，由几种具有不同催化活性的异构酶组成的胞外脂肪酶。脂肪酶基因家族编码序列组成高度同源而底物作用区域结构各异的多种酶蛋白。Lip1基因所表达的酶蛋白是其中主要的一种。通过点突变合成的该基因在酿酒酵母和毕赤酵母中都得到了表达，在毕赤酵母中经过208小时发酵的表达量为150U/mL。(Lotti & Monticelli，Chem Phys Lipids，93(1-2)：143-8 1998 Jun：Grochulski & Bouthillier，Biochemistry，33(12)：3494-500 1994 Mar 29；Norin & Haeffner，Protein Sci，3(9)：1493-503 1994 Sep：Brocca & Schmidt-Darmert，Protein Sci，7(6)：1415-22 1998 Jun；Mileto & Brocca，Chem Phys Lipids，93(1-2)：47-55 1998 Jun；Longhi &Fusetti，Biochim Biophys Acta，1131(2)：227-321992 Jun 15)脂肪酶具有多种催化活性和宽广的底物作用特异性，在有机物中稳定性好，这些特性使它在有机工业***中，如石油工业、食品加工、造纸业、新药开发、生物活化剂、洗涤剂、脱脂、增香、饲料添加剂、临床医学、皮革、皮毛、纺织和明胶工业中的去脂等，具有非常广泛的应用。目前，产自德氏根酶、柱状假丝酵母、曲霉、毛酶、粘质色杆菌等的脂肪酶制剂已供应市场。其中来自皱落假丝酵母Candida rugosa的脂肪酶(CRL)倍受市场青睐。(Lotti & Tramontano，Protein Eng，7(4)：531-51994 Apr；Benjamin & Pandey，Yeast，14(12)：1069-87 1998 Sep 15；Vaysse & Dubreucq，JBiotechnol，53(1)：41-6 1997 Feb 28；Gray & Narang，Enzyme Microb Technol，12(10)：800-71990 Oct；Holmquist，Chem Phys Lipids，93(1-2)：57-66 1998 Jun。)

本发明的第一个目的是提供一种能在酵母中有效表达的脂肪酶基因序列。

本发明的第二个目的是提供供上述基因序列克隆的载体。

本发明的第三个目的是提供能将脂肪酶分泌表达到酵母细胞外的上述载体之重组质粒。

本发明的第四个目的是提供具有上述基因序列的酵母菌。

本发明的第五个目的是提供上述酵母基因工程菌的筛选方法。

本发明的第一个目的是这样实现的：一种能在酵母中有效表达的脂肪酶基因序列，其特征在于：根据脂肪酶氨基酸序列，设计出具有在酵母中使用频率较高的密码子的基因序列，在该基因序列的5’端连接与目的酵母相配合的基因片段，在3’端连接限制性内切酶位点。为了从Lip1(Candida rugosa.脂肪酶的一种)氨基酸序列(见图1)出发，设计出能转入酵母中表达的DNA序列，必须采用在目的酵母中使用频率较高的密码子设计与脂肪酶的氨基酸相对应的DNA序列。在此基础上，还必须在其5’端连接一段与目的酵母相配合的基因片段，如：CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT；为了能将序列克隆到相应的载体上，必须在其3’端连接限制性内切酶位点，这样才能有效地，甚至高效地实现上述基因在酵母中的表达。

本发明的上述方案可作如下的完善：①根据在毕赤酵母中的密码子偏爱性设计与Lip1氨基酸序列相对应的DNA序列。②为了能在毕赤巴斯德酵母中实现表达，本发明可以将基因片段GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT连接在5’端。③在该序列的3’端连接限制性内切酶位点TCTAGA，是由于基因中没有该位点，在克隆时不会造成误切。④把该序列的第144位和第1461位设计为C，避免BamHI位点。本发明经以上处理之后可以形成下面具体的基因序列(Tsp)：

CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCTGCT CCA ACT GCT ACT TTG GCT AAC

GGT GAT ACT ATT ACT GGT TTG AAC GCT ATT ATT AAC GAA GCT TTT TTG GGT

ATT CCA TTT GCT GAA CCA CCA GTT GGT AAC TTG AGA TTT AAG GAC CCA GTT

CCA TAC TCT GGT TCT TTG GAT GGT CAA AAG TTT ACT TCT TAC GGT CCA TCT

TGT ATG CAA CAA AAC CCA GAA GGT ACT TAC GAA GAA AAC TTG CCA AAG GCT

GCT TTG GAT TTG GTT ATG CAA TCT AAG GTT TTT GAA GCT GTT TCT CCA TCT

TCT GAA GAT TGT TTG ACT ATT AAC GTT GTT AGA CCA CCA GGT ACT AAG GCT

GGT GCT AAC TTG CCA GTT ATG TTG TGG ATT TTT GGT GGT GGT TTT GAA GTT

GGT GGT ACT TCT ACT TTT CCA CCA GCT CAA ATG ATT ACT AAG TCT ATT GCT

ATG GGT AAG CCA ATT ATT CAT GTT TCT GTT AAC TAC AGA GTT TCT TCT TGG

GGT TTT TTG GCT GGT GAT GAA ATT AAG GCT GAA GGT TCT GCT AAC GCT GGT

TTG AAG GAT CAA AGA TTG GGT ATG CAA TGG GTT GCT GAT AAC ATT GCT GCT

TTT GGT GGT GAT CCA ACT AAG GTT ACT ATT TTT GGT GAA TCT GCT GGT TCT

ATG TCT GTT ATG TGT CAT ATT TTG TGG AAC GAT GGT GAT AAC ACT TAC AAG

GGT AAG CCA TTG TTT AGA GCT GGT ATT ATG CAA TCT GGT GCT ATG GTT CCA

TCT GAT GCT GTT GAT GGT ATT TAC GGT AAC GAA ATT TTT GAT TTG TTG GCT TCT

AAC GCT GGT TGT GGT TCT GCT TCT GAT AAG TTG GCT TGT TTG AGA GGT GTT

TCT TCT GAT ACT TTG GAA GAT GCT ACT AAC AAC ACT CCA GGT TTT TTG GCT

TAC TCT TCT TTG AGA TTG TCT TAC TTG CCA AGA CCA GAT GGT GTT AAC ATT

ACT GAT GAT ATG TAC GCT TTG GTT AGA GAA GGT AAG TAC GCT AAC ATT CCA

GTT ATT ATT GGT GAT CAA AAC GAT GAA GGT ACT TTT TTT GGT ACT TCT TCT

TTG AAC GTT ACT ACT GAT GCT CAA GCT AGA GAA TAC TTT AAG CAA TCT TTT

GTT CAT GCT TCT GAT GCT GAA ATT GAT ACT TTG ATG ACT GCT TAC CCA GGT

GAT ATT ACT CAA GGT TCT CCA TTT GAT ACT GGT ATT TTG AAC GCT TTG ACT

CCA CAA TTT AAG AGA ATT TCT GCT GTT TTG GGT GAT TTG GGT TTT ACT TTG

GCT AGA AGA TAC TTT TTG AAC CAT TAC ACT GGT GGT ACT AAG TAC TCT TTT

TTG TCT AAG CAA TTG TCT GGT TTG CCA GTT TTG GGT ACT TTT CAT TCT AAC

GAT ATT GTT TTT CAA GAT TAC TTG TTG GGT TCT GGT TCT TTG ATT TAC AAC AAC

GCT TTT ATT GCT TTT GCT ACT GAT TTG GAC CCA AAC ACT GCT GGT TTG TTG

GTT AAG TGG CCA GAA TAC ACT TCT TCT TCT CAA TCT GGT AAC AAC TTG ATG

ATG ATT AAC GCT TTG GGT TTG TAC ACT GGT AAG GAT AAC TTT AGA ACT GCT

GGT TAC GAT GCT TTG TTT TCT AAC CCA CCA TCT TTT TTT GTT TAATCTAGA

本发明所设计的脂肪酶基因序列可以通过PCR合成的方法来获(见图2)：首先根据脂肪酶基因设计27条引物，其中CAG93 F1～F14为正向引物，CAG93 R1～R13为反向引物(见图3)。合成27条引物后，再将不同引物通过DNA聚合酶反应(链延伸反应和PCR反应)、酶切和连接反应等最终合成为全长脂肪酶基因序列(见图2～8)。

本发明中引物的合成、PCR法合成全长脂肪酶基因等工作可以通过专门的生物技术公司或机构来完成。

本发明的第二个目的是这样实现的：上述脂肪酶基因可以组成以下的重组质粒：通过在5’端和3’端的限制性酶切位点将脂肪酶基因功能序列连接入酵母表达载体。由于在基因设计时加入了限制性酶切位点，合成的脂肪酶基因可以通过在其5’端和3’端的限制性酶切位点将功能序列连接入载体。为使脂肪酶基因能在酵母中高效表达，选用带有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)或者乙醇氧化酶(AOX)基因启动子的毕赤巴斯德酵母表达载体(pGAPZαA或者pPICZαA，美国Invitrogen公司)，利用合成脂肪酶基因序列5’端的XhoI限制性内切酶位点和3’端的XbaI限制性酶切位点，将该脂肪酶合成基因(Tsp)克隆入载体pGAPZαA(见图9)。由于在脂肪酶基因序列前加入了部分α信号肽编码序列，该序列与载体pGAPZαA中的部分α信号肽编码序列发生融合，从而构成完整的α信号肽编码序列，并形成了正确的读码框，为脂肪酶基因在酵母中的正确分泌表达奠定了基础。如果将Tsp序列的5’端进行适当的修改，就可以在pGAPZαB，C或者pPICZαB，C中表达。毕赤巴斯德酵母表达载体以pGAPZαA为最佳选择。

为了将上述脂肪酶基因克隆到载体上形成重组质粒，本发明的载体必须具有XhoI和XbaI两个位点，具体的载体可以是：pBluescript II SK(+)、pGAPZαA或pGAPZαB或pGAPZαC、pPICZαA或pPICZαB或pPICZαC。pBluescript II SK(+)等载体用于克隆脂肪酶基因片段。该重组载体可以转化大肠杆菌，由于重组质粒含有Amp抗性基因，通过筛选Amp阳性克隆即可获得含重组质粒的大肠杆菌，从而得到大量的脂肪酶基因，使该基因片段在大肠杆菌中得以保存和繁殖(见图10)。

本发明的第三个目的是这样实现的：将基因序列克隆入载体，再将克隆后的重组质粒转化入毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。本发明优选的毕赤酵母(P.pastoris)表达***与Van Gorcom等的专利(US Pat：5436156，1995；US Pat：5863533，1999)所采用的宿主菌霉菌相比，毕赤巴斯德酵母具有很多方面的优势。第一，霉菌的生长繁殖周期比毕赤酵母长根多：第二，霉菌的营养生长是通过菌丝体尖端的伸长生长实现的，这种生长特性尤其适合固体培养，而并不适合现代发酵工艺所常用的液态发酵，一般而言固体发酵工效低，周期长，成本高，由此使获得大量发酵产品的成本比之液态发酵要增加很多。相比之下，毕赤巴斯德酵母是通过裂殖来增加营养体的，这种繁殖特性十分适合液态发酵；第三，霉菌营养体在生长发育期间需要提供足够的、较复杂的碳氮有机养分，这也会增加发酵成本，毕赤巴斯德酵母营养体的生长发育主要利用廉价的简单养分，如甲醇、葡萄糖和氨水等。获得同等量的营养体毕赤巴斯德酵母比霉菌消耗的养分要便宜得多。酵母的高细胞密度、低成本发酵方法已经建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，34：403-404，1989)，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素和生物素等都很便宜；第四，霉菌特有的霉味会降低适口性，而毕赤巴斯德酵母发酵产生的一种酱香味具有良好的诱食作用；第五，毕赤巴斯德酵母含有多种大量的促进生长的有机化合物，如低聚糖、核苷酸、各种氨基酸、短肽等，这些优势都是霉菌比不上的或所不具有的；第六，在真核生物表达***中，酵母，包括毕赤巴斯德酵母在内，无疑是研究得最为详尽的，在进行分子生物学操作时酵母比霉菌更为容易、方便和有效。酵母作为一种良好的真核表达***已成功地高效表达出许多具有生物活性的外源基因产物。第七、毕赤巴斯德酵母本身具有很好的安全性，曾作为单细胞蛋白广泛应用，酵母培养基中不含有毒物质和致热源，所以重组酵母表达的脂肪酶就可以不用分离纯化而能直接以酵母培养物的形式直接利用，可降低脂肪酶的生产成本；第八、表达的脂肪酶在信号肽的引导下会分泌到培养基中，这使脂肪酶直接暴露出来而无需破碎酵母菌体，也为把包含脂肪酶的酵母培养物直接利用到工业生产中提供了可能，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产脂肪酶奠定了基础。

本发明采用的含脂肪酶合成基因的重组表达质粒pGAPZαA或pGAPZαB或pGAPZαC，pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC可以转化酵母，用于实现将脂肪酶基因片段整合到酵母染色体上，达到有效或高效分泌表达外源基因的目的(见图11)。

上述经克隆后的载体重组质粒不具备将脂肪酶表达、分泌到酵母细胞之外的功能，为解决这个问题，本发明采用将上述基因序列5’端的序列设计为pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC或pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC载体上相应的片段的办法达到这个目的。其原因在于；由于含合成基因的重组表达质粒pGAPZαA上有毕赤巴斯德酵母GAP基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pGAPZαA可以定向整合到毕赤巴斯德酵母基因组DNA上，并且GAP启动子无需外源诱导物甲醇存在即可启动脂肪酶合成基因的表达。同时，信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，正确切割，将具有生物活性的外源蛋白表达产物——脂肪酶最终分泌至胞外。

含脂肪酶合成基因的重组表达质粒pGAPZαA转化毕赤巴斯德酵母前，需将环状的重组表达质粒用内切酶酶切，使之线性化。不同的表达质粒、不同的内切酶位点，可选择不同的内切酶。本发明用内切酶BspHI消化重组表达质粒pGAPZαA，电泳检测酶切是否定全，纯化回收完全线性化的重组表达质粒pGAPZαA，-20℃保存备用(见图9)。

毕赤巴斯德酵母的转化常采用电激法或化学转化法，准备受体菌(P.Pastoris蛋白酶A缺陷型菌株AMD1168H)，将50～80μl受体菌和5～90μg线性化重组质粒pGAPZαA DNA混匀，电激(电压：1500V；电容；25μF；电阻；200Ω)处理，然后筛选重组子(见图10)。

上述发明中含脂肪酶合成基因的重组质粒pBluescript II SK(+)或pGAPZαA需用的工具酶及载体、表达***等，均有专门的生物技术公司提供(如：美国Promega公司、日本TaKaRa公司、美国Invitrogen公司等)。构建方法、详细步骤也有专门的说明书介绍。

本发明的第四个目的是这样实现的：在表型抗性筛选的基础上，通过酶活力测定进行蛋白质功能筛选。本发明具有表达脂肪酶的毕赤巴斯德酵母是通过将上述基因序列克隆入载体，再将克隆后的重组质粒转入毕赤巴斯德酵母来实现的。表达载体pGAPZαA上原本就带有Zeocin抗性基因和GAP启动子序列，当含有脂肪酶基因的重组表达质粒转化进入毕赤巴斯德酵母并重组至染色体上后，该转基因工程菌即获得对Zeocin的抗性。在所获得的菌群中其酶活力有很大的差别，因此，为了证实合成的脂肪酶基因整合并表达，本发明采用了在抗性筛选(Zeocin⁺)的基础上，进一步通过PH值测定、温度测定和耐热性测定等方法对具有抗性的酵母重组子进行酶活力测定。现在保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏号为No.M201002，保藏日期为2000年月日的菌株是上述方法筛选出的优良菌种。

本发明的第五个目的是这样实现的：将酵母细胞YPD液体培养92小时，离心去除菌体后获得上清液。经过酶活力测定，该上清液在PH为7.2，温度介乎30～40℃时的酶活力为120-160U/mL。

经测定，本发明中毕赤巴斯德酵母工程菌的脂肪酶表达量在发酵培养92小时，PH为7.2，温度介乎30～40℃时的酶活力达到120-160U/mL。据国外报道，经高密度发酵280小时后得到的发酵液酶活力为150U/mL。证明我们对脂肪酶基因的改造是成功的。

本发明提供的重组脂肪酶基因工程菌株经发酵培养，编码脂肪酶基因表达并将脂肪酶分泌到发酵液中。可以在摇床上用成分简单的培养基，经发酵、诱导产生脂肪酶。具体方法为：

(1)种子活化：将斜面保存的重组脂肪酶基因工程菌株接种于YPD平板，30℃静置培养48小时。

(2)一级种子：活化菌种接种于5ml YPD液体培养基中，30℃，230rpm水浴震荡培养18小时。

(3)二级种子：0.1ml菌液接种于50mLYPD液体培养基中，30℃，260rpm水浴震荡培养72小时。

本发明的脂肪酶基因序列表达产生的脂肪酶进行各种改造，如用各种化学修饰基团进行修饰，如糖基化、磷酸化、N端氨基化、蛋白内切割等；也可为改善其表达后的转运而在添加信号肽及在其前或后加上融合肽等，而不改变蛋白基因序列的基本功能。这些通称为本发明基因序列的功能生物。

综上所述：本发明中根据Candida rugosa中Lip1的蛋白氨基酸结构，通过对脂肪酶全长基因序列进行体外设计，使其适于在毕赤巴斯德酵母中表达；通过基因合成、重组表达载体构建、转化及表达筛选，即可获得高效表达脂肪酶的毕赤巴斯德酵母基因工程菌，为工业化大规模发酵生产脂肪酶提供基础。

(1)本发明根据所选择的表达宿主——毕赤巴斯德酵母对遗传密码的偏爱程度，对脂肪酶基因进行了密码子选择，用在毕赤巴斯德酵母中使用频率较高的密码子设计DNA序列，使得到的基因序列能够在毕赤巴斯德酵母中正确且高效表达。

(2)在上述基础上，对脂肪酶基因进行基因的人工改造，增加了酵母分泌表达的部分信号肽序列和限制性内切酶位点；改造后的脂肪酶基因序列能够在酵母中正确转录、翻译、表达脂肪酶并分泌至发酵液中。同时，根据表达宿主——毕赤巴斯德酵母的特点，设计了能使脂肪酶基因分泌到胞外的部分信号肽序列，在构建重组表达质粒时能与表达载体形成正确的读码框，使脂肪酶基因能够正确分泌至胞外；经上述改造，产生了一个能够在毕赤巴斯德酵母中正确、高效表达并分泌到胞外的脂肪酶基因序列。

(3)通过PCR合成出该脂肪酶基因序列，采用表达载体pGAPZαA，进一步构建出含有该合成基因，并能在毕赤巴斯德酵母中整合、表达的重组表达质粒。

(4)将重组表达质粒转化毕赤巴斯德酵母，得到一系列表达脂肪酶的毕赤巴斯德酵母基因工程菌。

(5)通过对上述工程菌株的筛选，获得一株高效表达脂肪酶合成基因的工程菌株。

本发明由于选择了具有良好活性的脂肪酶及合适的酵母***，尤其是毕赤巴斯德酵母，作为DNA设计的基础，因此，已实现了活性脂肪酶的有效表达，又获得了简化而有效的工业化、规模化的基因工程脂肪酶的生产方法。本发明由于采用将基因序列5’端序列设计为载体上相应片段的办法，实现了脂肪酶的酵母体外表达和体外分泌。

图1：Candida rugosa(皱落假丝酵母)脂肪酶Lip1成熟蛋白氨基酸序列：

图2：Tsp基因序列的合成示意图(“←”正向引物；“→”反和引物)

图3：引物的碱基序列(F表示正向引物，R表示反向引物)

图4：合成的CAG93-44F、CAG93(Fhc01)、CAG93-44 CAG93F1、CAG93-44 CAG93F2和CAG93-44R片段碱基序列

图5：合成的脂肪酶基因(CAG93-44F片段)全自动测序图

图6：合成的脂肪酶基因(CAG93-44 CAG93F1片段)全自动测序图

图7：合成的脂肪酶基因(CAG93-44 CAG93F2片段)全自动测序图

图8：合成的脂肪酶基因(CAG93-44R片段)全自动测序图

图9：重组载体构建示意图

图10：含合成脂肪酶基因Tsp的重组质粒pBluescript II SK(+)电泳图

说明：第一泳道为：marker(来源于大连宝生物工程公司DL2000，DL15000)

第二泳道为：Pbluescript II SK(+)的XbaI+XhoI双酶切结果

第二泳道为：Pbluescript II SK(+)Tsp的XbaI+XhoI双酶切结果

图11：含合成脂肪酶基因Tsp的重组质粒pGAZαA电泳图

说明：第一泳道为：pGAZαA+Tsp的XbaI+XhoI双酶切结果

第二泳道为：pGAZαA的XbaI+XhoI双酶切结果

第三泳道为：marker(来源于DL2000，DL15000)

实施例1：编码脂肪酶的基因序列设计及人工合成

本发明在Candida rugosa脂肪酶Lip1氨基酸序列(见图1)的基础上，采用偏爱性高的密码子，设计出具有在酵母中使用频率较高的密码子的基因序列，将基因片段GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT连接在5’端；在该序列的3’端连接限制性内切酶位点TCTAGA；将脂肪酶基因序列中在目的酵母中使用频率低的密码子，替换为使用频率高的密码子，可以形成以下具体的基因序列Tsp：

CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCTGCT CCA ACT GCT ACT TTG GCT AAC

GGT GAT ACT ATT ACT GGT TTG AAC GCT ATT ATT AAC GAA GCT TTT TTG GGT

ATT CCA TTT GCT GAA CCA CCA GTT GGT AAC TTG AGA TTT AAG GAC CCA GTT

CCA TAC TCT GGT TCT TTG GAT GGT CAA AAG TTT ACT TCT TAC GGT CCA TCT

TGT ATG CAA CAA AAC CCA GAA GGT ACT TAC GAA GAA AAC TTG CCA AAG GCT

GCT TTG GAT TTG GTT ATG CAA TCT AAG GTT TTT GAA GCT GTT TCT CCA TCT

TCT GAA GAT TGT TTG ACT ATT AAC GTT GTT AGA CCA CCA GGT ACT AAG GCT

GGT GCT AAC TTG CCA GTT ATG TTG TGG ATT TTT GGT GGT GGT TTT GAA GTT

GGT GGT ACT TCT ACT TTT CCA CCA GCT CAA ATG ATT ACT AAG TCT ATT GCT

ATG GGT AAG CCA ATT ATT CAT GTT TCT GTT AAC TAC AGA GTT TCT TCT TGG

GGT TTT TTG GCT GGT GAT GAA ATT AAG GCT GAA GGT TCT GCT AAC GCT GGT

TTG AAG GAT CAA AGA TTG GGT ATG CAA TGG GTT GCT GAT AAC ATT GCT GCT

TTT GGT GGT GAT CCA ACT AAG GTT ACT ATT TTT GGT GAA TCT GCT GGT TCT

ATG TCT GTT ATG TGT CAT ATT TTG TGG AAC GAT GGT GAT AAC ACT TAC AAG

GGT AAG CCA TTG TTT AGA GCT GGT ATT ATG CAA TCT GGT GCT ATG GTT CCA

TCT GAT GCT GTT GAT GGT ATT TAC GGT AAC GAA ATT TTT GAT TTG TTG GCT TCT

AAC GCT GGT TGT GGT TCT GCT TCT GAT AAG TTG GCT TGT TTG AGA GGT GTT

TCT TCT GAT ACT TTG GAA GAT GCT ACT AAC AAC ACT CCA GGT TTT TTG GCT

TAC TCT TCT TTG AGA TTG TCT TAC TTG CCA AGA CCA GAT GGT GTT AAC ATT

ACT GAT GAT ATG TAC GCT TTG GTT AGA GAA GGT AAG TAC GCT AAC ATT CCA

GTT ATT ATT GGT GAT CAA AAC GAT GAA GGT ACT TTT TTT GGT ACT TCT TCT

TTG AAC GTT ACT ACT GAT GCT CAA GCT AGA GAA TAC TTT AAG CAA TCT TTT

GTT CAT GCT TCT GAT GCT GAA ATT GAT ACT TTG ATG ACT GCT TAC CCA GGT

GAT ATT ACT CAA GGT TCT CCA TTT GAT ACT GGT ATT TTG AAC GCT TTG ACT

CCA CAA TTT AAG AGA ATT TCT GCT GTT TTG GGT GAT TTG GGT TTT ACT TTG

GCT AGA AGA TAC TTT TTG AAC CAT TAC ACT GGT GGT ACT AAG TAC TCT TTT

TTG TCT AAG CAA TTG TCT GGT TTG CCA GTT TTG GGT ACT TTT CAT TCT AAC

GAT ATT GTT TTT CAA GAT TAC TTG TTG GGT TCT GGT TCT TTG ATT TAC AAC AAC

GCT TTT ATT GCT TTT GCT ACT GAT TTG GAC CCA AAC ACT GCT GGT TTG TTG

GTT AAG TGG CCA GAA TAC ACT TCT TCT TCT CAA TCT GGT AAC AAC TTG ATG

ATG ATT AAC GCT TTG GGT TTG TAC ACT GGT AAG GAT AAC TTT AGA ACT GCT

GGT TAC GAT GCT TTG TTT TCT AAC CCA CCA TCT TTT TTT GTT TAATCTAGA。

本发明新设计的基因可以通过PCR人工合成(见图2)，步骤如下：

根据新设计的基因序列设计并合成27条引物(见图3)，其中包括14条正向引物：CAG93F1～F14，以及13条反向引物CAG93R1～R13。每条引物平均长为80nt，其中F1/F2、F2/F3、F3/R13、R13/R12、R12/R11、R11/F4、F4/F5、F5/F6、F6/R10、R10/R9、R9/R8、R8/F7、F7/F8、F8/F9、F9/R7、R7/R6、R6/R5、R5/F10、F10/F11、F11/F12、F12/R4、R4/R3、R3/F13、F13/F14、F14/R2和R2/R1每对引物之间各有平均20nt的重复序列：CAG93 F1的5’端加有Xho I位点，CAG93 R1引物5’端加有Xba I位点。

PCR合成新设计的脂肪酶基因时，先以合成5个片段为目标，然后加入新的引物，通过PCR延长小片段，再用PCR反应所得小片段PCR扩增大片段，最后将得到的5个大片断合成一条长链，步骤如下：

首先由F3/R13、F6/R10、P9/R7、F12/R4、F14/R2五对引物进行延长反应，反应体系包括引物F3或F6、F9、F12、F14(0.01 OD/μl)5μl、引物R13或R10、R7、R4、R2(0.01OD/μl)5μl、10xTaKaRa LA Buffer 10μl、dNTP 16μl、H₂O 63μl；于94℃保温5min后，在10min内冷却至55℃，加入TaKaRa LA Taq酶1μl，保温5min，再于72℃保温5min，得到DNA延伸液。

第二步以第一步所得的DNA延伸液为模板，分别以F2/R12、F5/R9、F8/R6、F11/R3、F13/R1为引物对进行PCR反应，扩增得到较长的片段。反应体系为引物F2或F5、F8、F11、F13(0.01OD/μl)1μl、引物R12或R9、R6、R3、R1(0.01OD/μl)1μl、DNA延伸液1μl、dNTP 10μl、10xTaKaRa LA Buffer 10μl、TaKaRa Ex Taq酶1μl、H₂O 76μl。在94℃ 30s、55℃30s、72℃30s的PCR反应条件下，共进行30个循环；获得的PCR产物用乙醇沉淀后溶解于100μl TE中，得到DNA片段A1、B1、C1、D1和F1。

第三步以第二步所得的DNA片段A1、B1、C1、D1和F1为模板，分别以F1/R11、F4/R8、F7/R5、F10/R3、F13/R1为引物扩增更长的片段，反应体系包括引物F1或F4、F7、F11、F13(0.01OD/μl)5μl、引物R11或R8、R5、R3、R1(0.01OD/μl)5μl、10xTaKaRa LA Buffer10μl、dNTP 16μl、H₂O 63μl ；于94℃保温5min后，在10min内冷却至55℃，加入TaKaRaLA Taq酶1μl，保温5min，再于72℃保温5min，得到新的DNA延伸液，延伸液中包含DNA片段CAG93-44F、CAG93(Fhc01)、CAG93-44 CAG93F1、CAG93-44 CAG93F2和CAG93-44R。(见图4)

第四步以第三步所得的DNA延伸液为模板，分别以F1/R1为引物进行PCR反应，扩增全长的DNA链。反应体系为引物F1(0.01OD/μl)1μl、引物R1(0.01OD/μl)1μl、DNA延伸液1μl、dNTP 10μl、10xTaKaRa LA Buffer 1μl、TaKaRa Ex Taq酶1μl、H₂O 76μl。在94℃30s、55℃30s、72℃30s的PCR反应条件下，共进行30个循环；获得的PCR产物用乙醇沉淀后溶解于100μl TE中。

CAG93-44F、CAG93-44 CAG93F1、CAG93-44 CAG93F2和CAG93-44R片断通过DNA全自动测序仪测序，结果与设计序列相同(见图5~8)。

基因的改造可利用已知的PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来实现。本发明除了基因设计和引物设计外，引物合成、新设计基因的PCR合成及测序等均可以通过专业生物技术公司(大连宝生物工程公司)完成。

实施例2：含合成脂肪酶基因的重组质粒pBluescript II SK(+)-Tsp的构建

在实施例1中得到的合成脂肪酶基因必须克隆到适当的载体质粒上，以便保存利用。本发明选择大肠杆菌载体质粒pBluescript II SK(+)，构建出含合成脂肪酶基因的重组质粒pBluescript II SK(+)-Tsp。具体步骤如下：

1、菌株与载体：大肠杆菌菌株JM109，质粒pBluescript II DK(+)等购自Promega公司。

2、酶与试剂盒：限制性内切酶、各类修饰酶为TaKaRa公司产品。

3、生化试剂：IPTG、X-Gal均为Sigma公司产品。

4、培养基：LB培养基

5、将合成好后的Tsp基因序列用XhoI和XbaI双酶切，与同样经XhoI和XbaI双酶切的载体pBluescript II SK(+)于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，涂板后挑选阳性重组子，得到重组质粒pBluescript II SK(+)-Tsp。通过DNA测序分析，证实得到了改造的脂肪酶基因完整序列。

6、甘油保存阳性重组子，需用时扩增阳性重组子，提取重组质粒，用XhoI和Xba I双酶切重组质粒即可得到大量脂肪酶基因(Tsp)。

实施例3：含合成脂肪酶基因的重组表达质粒pGAPZαA-Tsp的构建

本发明实施例1中合成的脂肪酶基因Tsp需要在真核表达***中才能正确表达。由于毕赤巴斯德酵母是目前较为成功的表达***，为此，需要构建出含合成脂肪酶基因的重组表达质粒pGAPZαA-Tsp，以便在毕赤巴斯德酵母中表达脂肪酶。具体步骤如下：

1、菌株与载体：酵母菌株Pichia pastoris SMD1168H、质粒pGAPZαA购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒：限制性内切酶、各类修饰酶为TaKaRa公司产品。

3、生化试剂：IPTG、X-Gal、SDS、过硫酸氨、丙烯酰及甲叉双丙烯酰(所用系列化试剂应该有所变化)均为Sigma公司产品，其它为国产分析纯。

4、将重组质粒pBluescript II SK(+)-Tsp用XhoI和XbaI酶切，电泳回收约1.65kb的DNA片段。同时用XhoI和XbaI双酶切载体质粒pGAPZαA，电泳回收3.1kb大片段。再将1.65kb小片段与3.1kb大片段相连，得到了一个用于酵母转化的表达载体pGAPZαA-Tsp。带有部分分泌信号序列的目的基因***到上述表达载体的信号肽序列下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建出能通过载体上的P.pastrois GAP部分基因序列与染色体基因组之间的同源重组稳定整合到酵母染色体上的重组表达载体。

实施例4：毕赤巴斯德酵母的转化与基因工程菌(武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心、保藏号No.M201002)的筛选

在实施例3中得到的含有脂肪酶基因的重组表达载体pGAPZαA-Tsp，进一步转化P.pastoris，通过抗性筛选和酶活力测定，筛选出高效表达脂肪酶基因的基因工程菌。具体步骤如下：(参考文献：《分子克隆实验掼第二版》，科学出版社，北京，1998年)

1、菌株与载体；酵母菌株Pichia pastoris SMD1168H、质粒pGAPZαA购自Invitrogen公司，含有脂肪酶合成基因的重组表达载体pGAPZαA-Tsp来自实施例3。

2、酶与试剂盒：限制性内切酶、各类修饰酶为TaKaRa公司产品。

3、生化试剂：Zeocin为法国公司产品，其它为国产。

4、培养基：酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB(18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast)；

5、重组酵母发酵培养基为YPD。

6、重组酵母表达载体首先用内切酶BspHI消化(经PEG法纯化)，电泳检测酶切是否完全，使之线性化，电泳检测酶切是否完全；线性化的pGAPZαA用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。

7、将5ml SMD1168H菌液接种子50ml YPD液体培养基30℃培养过夜。取过夜培养的菌液0.1～0.5ml接种于500ml新鲜YPD液体培养基，再30℃过夜培养至OD600＝1.3～1.5。在+4℃，1500Xg离心5分钟，用500ml 0℃无菌水重悬菌体。离心同上，再重悬于250ml0℃无菌水。离心同上，重悬于20ml 0℃1M山梨醇溶液。离心同上，再重悬于1ml 0℃1M山梨醇溶液，置于冰上(当天使用)。

8、将上述制备的细胞80μl和5～90μg线性化DNA注入0℃电击池(电击还是电激)，混匀，置冰上5分钟。据酵母脉冲参数脉冲细胞。(电压：1500V；电容：25μF；电阻：200Ω)。迅速加1ml 0℃1M山梨醇溶液到电击池内，混匀。再将池内液体转置1.5ml EP管，30℃培养1～2小时。取150μl涂布含Zeocin 1000μg/ml的YPDS固体培养基，30℃培养2～3天。

9、用无菌牙签从转化平板上挑取Zeo⁺重组子，再在含1000μg/ml Zeocin的YPD固体培养基上划线，分离单克隆。

10、将上述9制备的Zeocin⁺表型的重组子约26株进一步作脂肪酶的酶活力测定。并筛选出一株在PH为7.2，温度介乎30～40℃时酶活力为120-160U/mL的菌株。

Claims (4)

1、一种脂肪酶基因序列，其特征在于，所述序列的结构如下：

CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GCT CCA ACT GCT ACT TTG GCT AACGGT GAT ACT ATT ACT GGT TTG AAC GCT ATT ATT AAC GAA GCT TTT TTG GGT ATTCCA TTT GCT GAA CCA CCA GTT GGT AAC TTG AGA TTT AAG GAC CCA GTT CCATAC TCT GGT TCT TTG GAT GGT CAA AAG TTT ACT TCT TAC GGT CCA TCT TGT ATGCAA CAA AAC CCA GAA GGT ACT TAC GAA GAA AAC TTG CCA AAG GCT GCT TTGGAT TTG GTT ATG CAA TCT AAG GTT TTT GAA GCT GTT TCT CCA TCT TCT GAA GATTGT TTG ACT ATT AAC GTT GTT AGA CCA CCA GGT ACT AAG GCT GGT GCT AACTTG CCA GTT ATG TTG TGG ATT TTT GGT GGT GGT TTT GAA GTT GGT GGT ACT TCTACT TTT CCA CCA GCT CAA ATG ATT ACT AAG TCT ATT GCT ATG GGT AAG CCA ATTATT CAT GTT TCT GTT AAC TAC AGA GTT TCT TCT TGG GGT TTT TTG GCT GGT GATGAA ATT AAG GCT GAA GGT TCT GCT AAC GCT GGT TTG AAG GAT CAA AGA TTGGGT ATG CAA TGG GTT GCT GAT AAC ATT GCT GCT TTT GGT GGT GAT CCA ACTAAG GTT ACT ATT TTT GGT GAA TCT GCT GGT TCT ATG TCT GTT ATG TGT CAT ATTTTG TGG AAC GAT GGT GAT AAC ACT TAC AAG GGT AAG CCA TTG TTT AGA GCTGGT ATT ATG CAA TCT GGT GCT ATG GTT CCA TCT GAT GCT GTT GAT GGT ATT TACGGT AAC GAA ATT TTT GAT TTG TTG GCT TCT AAC GCT GGT TGT GGT TCT GCT TCTGAT AAG TTG GCT TGT TTG AGA GGT GTT TCT TCT GAT ACT TTG GAA GAT GCT ACTAAC AAC ACT CCA GGT TTT TTG GCT TAC TCT TCT TTG AGA TTG TCT TAC TTG CCAAGA CCA GAT GGT GTT AAC ATT ACT GAT GAT ATG TAC GCT TTG GTT AGA GAAGGT AAG TAC GCT AAC ATT CCA GTT ATT ATT GGT GAT CAA AAC GAT GAA GGTACT TTT TTT GGT ACT TCT TCT TTG AAC GTT ACT ACT GAT GCT CAA GCT AGA GAATAC TTT AAG CAA TCT TTT GTT CAT GCT TCT GAT GCT GAA ATT GAT ACT TTG ATGACT GCT TAC CCA GGT GAT ATT ACT CAA GGT TCT CCA TTT GAT ACT GGT ATTTTG AAC GCT TTG ACT CCA CAA TTT AAG AGA ATT TCT GCT GTT TTG GGT GAT TTGGGT TTT ACT TTG GCT AGA AGA TAC TTT TTG AAC CAT TAC ACT GGT GGT ACT AAGTAC TCT TTT TTG TCT AAG CAA TTG TCT GGT TTG CCA GTT TTG GGT ACT TTT CATTCT AAC GAT ATT GTT TTT CAA GAT TAC TTG TTG GGT TCT GGT TCT TTG ATT TACAAC AAC GCT TTT ATT GCT TTT GCT ACT GAT TTG GAC CCA AAC ACT GCT GGT TTGTTG GTT AAG TGG CCA GAA TAC ACT TCT TCT TCT CAA TCT GGT AAC AAC TTGATG ATG ATT AAC GCT TTG GGT TTG TAC ACT GGT AAG GAT AAC TTT AGA ACT GCTGGT TAC GAT GCT TTG TTT TCT AAC CCA CCA TCT TTT TTT GTT TAATCTAGA

连接5’端与目的酵母相配合的基因片段为CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT；连接3’端的终止密码子与限制性内切酶位点的序列为：TAATCTAGA。

2、一种含有权利要求1所述基因序列的重组载体pBluescript II SK(+)-Tsp，其中Tsp是指权利要求1所述的脂肪酶基因序列。

3、一种含有权利要求1所述基因序列的重组载体pGAPZαA-Tsp，其中Tsp是指权利要求1所述的脂肪酶基因序列。

4、一种由权利要求3所述的重组载体所转化的酵母菌，其特征在于，将表达载体pGAPZαA-Tsp转化入毕赤巴斯德酵母。

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