CH707735A2 - Apparat zur Untersuchung von Zellproben mittels Fluoreszenz. - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Zellanalyse-Apparat, bestehend aus a. einem Probenträger (10), der eine Zellprobe enthält, welche mit mindestens einem fluoreszierenden Agens behandelt wurde; b. einem Probenmess-Mittel, bestehend aus (i) mindestens einem Probenbeleuchtungs-Mittel (101, 102), wobei das mindestens eine Probenbeleuchtungs-Mittel (101, 102) aus einer Lichtquelle besteht, um die Probe zu beleuchten; (ii) einem Detektions-Mittel (103), bestehend aus einer ferngesteuerten Fokussierlinse (15), die darauf ausgelegt ist, die fluoreszente Strahlung, die von der Probe emittiert wird, zu empfangen; und d. einem Kontroll- und Datenanalyse-Mittel (1), das darauf ausgelegt ist, die funktionellen Operationen des Probenmess-Mittels zu kontrollieren und Daten zu empfangen, analysieren und Resultate zu präsentieren, wobei das Kontroll- und Datenanalyse-Mittel (1) getrennt von der Probe und vom Probenmess-Mittel vorliegt. Der Apparat ist leicht und transportierbar.
Description
[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Durchflusszytometrie und im Speziellen auf ein kleines, robustes Gerät zur Zellanalyse und Zellzählung.
[0002] Die Detektion und Zählung von biologischen Zellen ist von zentraler Bedeutung in zahlreichen Anwendungen wie in der Überwachung der Gesundheit (im humanen und Veterinären Bereich, z.B. bei der Zählung von CD4 Zellen, bei der Detektion von Tuberkulose oder bei der Blutzellzählung), in der Biotechnologie (z.B. Zellanalyse während Wachstumsversuchen und Produktionsprozessen), in der Umweltanalyse (z.B. in der Abwasser Mikrobiologie) und in der Getränke- und Nahrungsmittel Industrie (z.B. in der Trinkwasserüberwachung oder beim Nachweis von Bakterien und Parasiten in Lebensmitteln).
[0003] Gegenwärtige Praxis in der Detektion und Zählung von biologischen Zellen ist die Durchflusszytometrie. In der Durchflusszytometrie passieren fluoreszentmarkierte Zellen einzeln einen Laserstrahl. Dies resultiert in Streulicht Signalen und Emissionslicht Signalen und diese Art der Detektion erfordert aufwändige Optik und Fluidik, empfindliche Photomultiplier, komplexe Elektronik und leistungsfähige Rechner zur Speicherung und Analyse der Daten. Das Resultat sind unzufriedenstellend komplexe Systeme mit einer limitierten Mobilität (grosses Gewicht, hoher Energieverbrauch) sowie hohen Anschaffungs- und Betriebskosten. Zudem erfordert der Betrieb hoch qualifiziertes Personal. Aufgrund ihrer Komplexität ist Durchflusszytometrie nur unter kontrollierten Laborbedingungen möglich und nicht für Feldversuche oder dezentralisierte (point-of-care) Anwendungen geeignet.
[0004] Für spezielle Anwendungsgebiete ist Mikroskopie mit anschliessender Bildanalyse zur Identifikation und Zählung von Zellen eine leistungsstarke Alternative zur Durchflusszytometrie. Die Meisten der oben genannten Nachteile der Durchflusszytometrie treten nicht auf bei der sogenannten Image Cytometry (Bildzytometrie). In der Image Cytometry wird typischerweise eine Zellsuspension enthaltende Aussparung mit definiertem Volumen mit einem Mikroskopie System untersucht. Das Mikroskopie System besteht aus einer Lichtquelle, einem Linsensystem zur Vergrösserung der biologischen Zellen, einem Bildsensor (CMOS oder CCD-Chip) zur Bildaufzeichnung und einem integrierten Rechner um die Aufzeichnung zu kontrollieren, die Bildanalyse durchzuführen und Interaktionen mit dem Benutzer zu ermöglichen.
[0005] Ein Vorschlag für ein einfaches, portables Gerät kann in WO 2011 143 075 gefunden werden. Dieses Gerät ist bestrebt die zahlreichen Probleme von Stand-der-Technik Apparaten zu überwinden und wird durch einen integrierten Rechner betrieben, was in einem Energiebedarf von 55 W und einem Totalgewicht von 15 kg resultiert.
[0006] In der vorliegenden Erfindung wird ein simples, robustes Gerät zur Image Cytometry beschrieben, welches durch ein Kontroll- und Datenanalyse Mittel ferngesteuert werden kann und somit nicht mehr von einem integrierten Rechner zur Steuerung, Berechnung und Organisation der Benutzer Interaktion abhängig ist.
[0007] Das erfindungsgemässe Zell Analyse Gerät beinhaltet: a. einen Probenträger 10 der eine Zellprobe enthält die mit mindestens einem fluoreszierenden Stoff behandelt wurde; b. ein Probenmess-Mittel bestehend aus (i) mindestens einem Probenbeleuchtenden Mittel 101, 102, das eine Lichtquelle beinhaltet um die Probe zu beleuchten (ii) einem Detektions-Mittel 103 das eine fokussierende Linse 15 beinhaltet die ferngesteuert werden kann und die angepasst wird um das fluoreszente Licht das von der Probe abgestrahlt wird empfangen zu können; und c. ein Kontroll- und Datenanalyse Mittel 1, welches die Funktionen des Probenmess-Mittels kontrolliert und welches fähig ist die Resultate zu empfangen, zu analysieren und zu präsentieren, wobei dieses Kontroll- und Datenanalyse Mittel abseitig vom Probenmess-Mittel bereitgestellt wird und dieses somit fernsteuert.
[0008] Die Vollständige Trennung der Probenmess-Funktion von der Kontroll-/Datenempfang- und -Analyse/Präsentations-Funktion hat zur Folge, dass das Probenmess-Mittel besonders klein und robust ist sowie dass das Kontroll- und Datenanalyse Mittel ein kleines, robustes, portables und günstig herzustellendes Gerät mit grosser Prozessor Leistung (beispielsweise ein Mobiltelefon oder Tablet) ist. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Probenmess-Mittel ein in der Hand gehaltenes Gerät (hand-held device), welches ausreichend klein und leicht ist um getragen zu werden und ohne zusätzliche Gerätschaft gebraucht werden kann. Dies macht das Probenmess-Mittel ideal für den Gebrauch in abgelegenen Gebieten unter schwierigen äusseren Bedingungen wo grösserer Geräte schwierig zu transportieren und gebrauchen wären.
[0009] Die Zellen innerhalb oder auf dem Probenträger sind stationär, das heisst enthalten in einer Aussparung oder auf der Oberfläche des Probenträgers fixiert. Folglich wird kein Probenfluss und somit keine komplexe Fluidik benötigt. Die Probe enthaltende Aussparung ist typischerweise 0.1 mm tief wobei andere Tiefen (grössere und kleinere) abhängig von der Anwendung möglich sind. Der Probenträger kann eine einfache Messkammer beinhalten, welche chemische und biologische Agenzien enthält, die mit der Messprobe eine Reaktion eingehen.
[0010] Die Zellen im/oder auf dem Probenträger werden mit mindestens einem fluoreszierenden Stoff behandelt. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die zu messende Probe mit einer Mehrzahl solcher Agenzien behandelt, bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung mit zwei Agenzien die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren. Im Fall von zwei Agenzien, kann die Strahlung entweder durch zwei verschiedene Lichtquellen, typischerweise LEDs (light-emitting diodes) welche zwei verschiedene Wellenlängen aufweisen, oder durch eine einzelnen Lichtquelle bestehend aus zwei umschaltbaren Quellen bereitgestellt werden. Typische Beispiele solcher fluoreszierender Agenzien beinhalten fluoreszenz-markierte Antikörper (z.B. APC, FITC) oder andere fluoreszierende Zellfärbe Mittel (z.B. Auramin O, Acridinorange, SYBR green, Propidiumiodid) und typische verwendete Anregungswellenlängen sind blau(470 nm) und rot (640 nm). In der nachfolgend Ausführungsform der Erfindung wird der Fall von einer Lichtquelle beschrieben, wobei jedoch zwei oder mehrere Lichtquellen auch enthalten sind.
[0011] Das von der Lichtquelle produzierte Licht wird kollimiert durch ein Kollimator-Mittel, welches aus einem System von mindestens einer Linse besteht, das eine parallelgerichtete Lichtstrahlung erzeugt.
Die erzeugte Strahlung trifft auf den Probenträger und verursacht die Fluoreszenz des dazugehörenden Fluorochroms der in oder auf der Zelle vorhanden ist. Die fluoreszente Strahlung (das emittierte Licht) wird vom Detektions-Mittel empfangen. Das Detektions-Mittel kann jegliches Mittel sein, das fähig ist das emittierte Licht zu detektieren und ein dazugehöriges Signal zu generieren, welches vom Kontroll- und Datenanalyse Mittel interpretiert werden kann. Das Detektions-Mittel besteht aus einer fokussierbaren Linse. Diese kann aus einer einzelnen Linse oder einem Linsensystem jeglicher bekannten Art (Glas und Polymer Linsen, Linsenarrays oder Gradienten-Index Linsen (GRIN) bestehen und das Fokussieren kann durch passende Mittel wie beispielsweise durch eine bewegliche Linse oder ein Linsenelement, oder aber auch durch adaptive Linsen (Linsen mit einstellbarer Brennweite, focus-tunable lens) gelöst werden. Der Fokus wird während dem Betrieb verändert, so dass die Zellprobe oder fluoreszierende Markierungen welche auf dem Probenträger vorhanden sind entweder fokussiert sind, oder so dass die emittierte Strahlung in verschiedenen Tiefen der Probe (grösser als die Schärfentiefe des optischen Systems) untersucht werden können um ein vollständiges Bild der Probe zu erhalten.
[0012] Das Signalerzeugende Mittel kann ein beliebig passendes Gerät sein, beispielsweise ein CMOS oder CCD chip. Zudem kann zwischen der Linse und dem Signalerzeugenden Mittel ein Filter vorhanden sein, der nur spezifisch das emittierte Licht passieren lässt. Im Fall von einem Fluorochrom kann dies ein Bandpass- oder Langpassfilter sein, wohingegen im Fall von mehreren Fluorochromen ein Multibandpassfilter verwendet werden kann.
Das Kontroll- und Datenanalyse Mittel (folglich K/A Mittel genannt) ist verantwortlich für die Funktionen des Geräts und für den Empfang und die Analyse der Resultate vom Probenmess-Prozess. Es kontrolliert den Betrieb des Geräts – wie nachfolgend in der Liste der Operationen beschrieben. Nicht alle dieser Operationen sind in allen Geräten oder für alle Verwendungszwecke nötig. Somit ist es möglich ein Gerät mit limitierter Funktionalität bereitzustellen. Eine Alternative dazu ist die Bereitstellung von vielerlei Funktionen, sodass der Benutzer die Möglichkeit hat die benötigten Operationen entsprechend der Situation auszuwählen. Das K/A Mittel dient weiter als Benutzeroberfläche um Resultate zu präsentieren. Das K/A Mittel ist getrennt vom Probenmess-Mittel und die Kommunikation zwischen den beiden kann via Kabel-Verbindung oder kabellos erfolgen. Bei einer Ausführungsform der Erfindung, ist das K/A Mittel ein tragbarer mobiler Apparat, wie ein Smartphone oder ein Tablet und ein USB-Kabel wird zur Kommunikation genutzt.
[0013] Um die nötigen Funktionen zu erbringen, ist das K/A Mittel mit einer Software ausgestattet, welche dem K/A Mittel die Kontrolle des Probenmess-Mittels, den Empfang der Resultat im erwünschten Format sowie die Analyse der Resultate ermöglicht. Die Software kann durch Benutzerinteraktion aktiviert werden (beispielsweise durch einen «Start-Knopf auf dem Bildschirm des K/A Mittels) oder aber auch autonom nachdem die Anwesenheit einer neuen Probe im Probenmess-Mittel festgestellt wurde. Einmal aktiviert, führt das K/A Mittel eine Anzahl von Operationen, wie nachfolgend aufgelistet, durch (einige sind optional).
(optional), es empfängt vom Probenmess-Mittel Informationen über den Aufbau und die Natur des Probenträgers und der Operationen die durchgeführt werden sollen;
(optional), es kontrolliert die Bewegung des Probenträgers, sofern die Bewegung des Probenträgers für bestimmte Analysen, wie beispielsweise zur Abbildung von mehreren Gesichtsfeldern (field-of-views) nötig ist;
(optional), es kontrolliert eine oder mehrere Lichtquellen die mittels Kabel versorgt werden, sofern dies nötig ist;
es kontrolliert den Fokus der Detektions-Mittel Linse, so dass die Probe oder fluoreszierende Markierungen (z.B. Fadenkreuze, Orientierungshilfen oder Elemente zur Qualitätskontrolle) auf dem Probenträger im Fokus sind und/oder dass die ganze Tiefe der Probe erfasst werden kann;
es kontrolliert und passt Parameter des Licht empfangenden Detektors an (z.B. Belichtungszeit, Verstärkung, Kontraststärke, Bildtemperatur, Farbton, Helligkeit, Kontrast, Sättigung);
es löst den Probenmess-Prozess auf dem Licht empfangenden Detektor aus
es empfängt und speichert die Messdaten vom Detektor nach der Messung
es analysiert die empfangenen Daten und identifiziert Zellen oder Objekte von Interesse durch Bildoptimierung und Bildauswerte Algorithmen und zählt die gefundenen Zellen und/oder Strukturen
es errechnet die Resultate und stellt diese im erwünschten Format auf dem Bildschirm dar, beispielsweise als Graphik oder Live-Bild.
es speichert Daten und/oder Resultate
(optional), es sendet die Daten und/oder Resultate an eine zentrale Datenbank durch Nutzung der Kommunikationsfunktionalität (z.B. GSM, GPRS, UMTS, HSDAP, LTE, Wireless oder LAN) des K/A Mittels
[0014] Die individuellen Schritte einzelne betrachtet sind nicht neu, jedoch die Durchführung dieser Schritte als automatische Sequenz sowie die Einbringung dieser Funktionen in ein mobiles, vom Detektions-Mittel getrenntes Kontroll- und Analyse Gerät, bringen eine ungewohntes Mass an Robustheit, Einfachheit und Bedienerfreundlichkeit (beispielsweise eine einfach zu betreibende Benutzeroberfläche), welche im Gebiet der Zellanalyse und Zytometrie bis anhin nicht möglich war. Die Software kann durch die Einbringung von existierendem Softwarecode durch einen Fachmann/eine Fachfrau entwickelt werden und auf verschiedenen Betriebssystemen ausgeführt werden.
[0015] Als Betriebssystem des K/A Geräts kommen diverse passende Systeme in Frage, nicht-limitierende Beispiele beinhalten Android, Apple iOS, Windows Phone, Windows, BlackBerry OS, Symbian und Linux. In ähnlicher Weise kann die Software in jeglicher passenden Programmiersprache programmiert werden, nicht limitierende Beispiele enthalten Java, Objective-C, .NET, Python, HTML, JavaScript, CSS, C++, C und C#. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Betriebssystem Android und die Programmiersprache Java.
[0016] Die Software kontrolliert die Kommunikation mit dem Probenmess-Mittel, die Benutzerinteraktionen und führt die Bildoptimierung und Bildanalyse an den empfangenen Daten durch. In einer Ausführungsform der Erfindung nutzt die Software die USB Host Mode Fähigkeit des K/A Geräts (USB On-The-Go) um gleichzeitig das Probenmess-Mittel mit Energie zu versorgen und mit dem Probenmess-Mittel zu kommunizieren. Dies erlaubt dem Benutzer beispielsweise den Betrieb via Touch-Screen wo sich beispielsweise die Manipulation von Gleitbedienelementen (Sliding-Conrols) oder das Zeihen (drag) eines Bildes in der Bewegung des Probenträgers auswirkt.
[0017] In einer weiteren Ausführung der Erfindung verwendet die Software den «USB accessory mode» zur Kommunikation mit dem Probenmess-Mittel. Im «USB accessory mode liefert das Probenmess-Mittel die Energie via USB Schnittstelle.
[0018] In einer weiteren Ausführung der Erfindung verwendet die Software des K/A Mittels eine kabellose «wireless» Verbindung um mit dem Probenmess-Mittel zu interagieren.
[0019] In einer spezifischen Art des Betriebs, beinhaltet die Datenanalyse bekannte Techniken der Bildbearbeitung wie Bildoptimierung (z.B. multi-frame super resolution techniques) und Zell Identifikations-Algorithmen (z.B. Otsu Algorithmus für Thresholding, Watershed Algorithmus für Segmentation, und Objekterkennungs-Algorithmen).
[0020] Ein Aspekt des Geräts ist dessen Fähigkeit mehrere Fluorochrome die in der Zellprobe vorliegen ohne Wechsel von optischen Filtern zu messen. In der aktuellen Image Cytometry ist das mechanische Auswechseln des Emissionsfilters auf einem Filterrad das Standardprozedere um die einzelnen Emissionen (und somit die Fluoreszenzintensität von jedem Fluorochrom) separat zu messen. Dieses mechanische Auswechseln von Filtern reduziert die Robustheit des Systems, erhöht den Energieverbrauch und die Systemgrösse.
[0021] Dieser Nachteil wurde überwunden durch die Messung von mehreren Fluorochromen durch Verwendung eines Multibandpassfilters in Kombination mit einer zeitkontrollierten Ein-/Ausschaltung der verschiedenen Anregungslichtquellen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Dualbandpassfilter und zwei Anregungslichtquellen verwendet womit bis zu zwei Fluoreszenzen in der Probe gemessen werden können. Allerdings ist auch der Gebrauch von Triple-, Quad- oder Pentabandpassfiltern möglich, sodass bis zu fünf Fluoreszenzen ohne Auswechslung des Filter möglich sind. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, wenn nur ein Fluorochrom gemessen werden muss, genügt ein herkömmlicher Bandpassfilter in Kombination mit einer Anregungslichtquelle.
[0022] Das nachfolgend beschriebene Gerät ist brauchbar für die Untersuchung und Messung für vielerlei Zellen, beispielsweise Zellen in Sputum-, Blut- oder Urin-Proben. Es ist im speziellen nützlich für die Detektion von Tuberkulose Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben.
[0023] Das Gerät wird im nachstehenden anhand der Zeichnungen und nicht-limitierenden Beispielen weiter beschrieben. Es zeigen: Fig. 1 : Schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des in dieser Erfindung beschriebenen Geräts Fig. 2 : Schematische Darstellung des Querprofils des Geräts aus Fig. 1 Fig. 3 : Darstellung einer typischen Applikations-Benutzeroberfläche
[0024] Fig. 1 und 2 zeigen ein Ausführungsbeispiel des in dieser Erfindung beschriebenen Geräts mit zwei Probenbeleuchtenden Mitteln 101 und 102, und einem Detektions-Mittel 103. Das Gerät besitzt zwei LED Lichtquellen 2 und 6 wobei jede dieser Lichtquellen mit einer Kollimator Linse 3 und einem optischen Bandpassfilter (4 respektive 8) bereitgestellt ist. Die LED Lichtquelle 2 ist blau (Peakwellenlänge bei 470 nm), die LED Lichtquelle 6 ist rot (Peakwellenlänge bei 640 nm) und die jeweiligen Bandpassfilter weisen Bänder von 470–495 nm und 565–650 nm auf.
[0025] Die zwei LEDs werden via Kabel 5 betrieben und in Sequenz aktiviert um die Zellprobe auf dem Probenträger 10 zu beleuchten. Der Probenträger enthält die Probe in einer Aussparung 18 und kann auf zwei orthogonalen Achsen, die mit 7 gekennzeichnet sind oder um die Rotationsachse 70 bewegt werden. Zwei Fluorochrome (16 respektive 17) sind in den behandelten Zellen vorhanden und werden bei der jeweiligen Wellenlänge der LEDs angeregt. (Die Fluorochrome werden passend zum beabsichtigten Gebrauch des Gerätes ausgewählt, wie aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich wird). Die Fluoreszenz (emittierte Strahlung) wird vom Detektions-Mittel 103 empfangen, welches aus einer Objektiv Linse 13, einem optischen Multibandpassfilter 14 (Emissions-Bänder bei 520–560 nm und 655–685 nm) der darauf ausgelegt ist die gesamte Lichtstrahlung ausser die von den Fluorochromen emittierten Wellenlängen zu entfernt, einer Fokussierlinse 15 und einem Sensor Array 12, der ein CMOS Chip (5 MP) ist, besteht. Der Sensor wandelt das empfangenen fluoreszente Licht in eine Signal um, welches via USB cable 11 zum Kontroll- und Analyse Mittel gesendet wird, welches in diesem Beispiel ein Smartphone ist, welches zur Kontrolle des Geräts programmiert wurde. Das Betriebssystem ist Android und die Software ist in Java geschrieben.
[0026] Zum Betrieb wird die Zellprobe, welche mit einem Fluorochrom behandelt wurde in den Probenträger 10 gegeben und der Probenträger ins Gerät eingeführt was zur Folge hat, dass das Gerät durch das Smartphone 1 eingeschaltet wird. In der Folge beleuchten die LEDs die Probe für eine genügend lange Zeitdauer damit die Fokussierlinse auf die Zellen fokussieren kann und ein Bild aufgezeichnet werden kann. Die Daten werden zum Smartphone weitergeleitet, welches die Bildoptimierung und Bildanalyse durchführt und das Resultat in gewünschter Form numerisch und graphisch darstellt. Zusätzlich werden die Resultate auf dem Smartphone gespeichert und unter Verwendung der Kommunikationsmöglichkeiten des Smartphone an eine zentrale Datenbank gesandt.
[0027] In Fig. 2 , werden Zellen die eine ersten Fluorochrom 16 enthalten mit Licht 20 (in einem typischen Ausführungsbeispiel der Erfindung bei 470–495 nm) von einem ersten LED 2 angeregt. Das Licht wird mit einer Kollimatorlinse 3 kollimiert und mittels eines Bandpassfilters 4 gefiltert. Das emittierte Licht 23 vom ersten Fluorochrom (typischerweise bei 520–560 nm) kann den Multibandpassfilter 14 passieren und detektiert werden, wohingegen Licht mit anderen Wellenlängen (z.B. gestreutes Anregungslicht 22 von Zellen 19 ohne Fluorochrom (typischerweise 470–495 nm)) blockiert wird. In einem zweiten Schritt, wird LED 2 ausgeschaltet und die zweite Lichtquelle 6 eingeschaltet. Zellen die einen zweiten Fluorochrom 17 enthalten werden angeregt mit Licht 21 (typischerweise 565–650 nm) das von einer zweiten Lichtquelle 6 stammt, und auch kollimiert (mittels einer Kollimatorlinse 3) und gefiltert (durch einen Bandpassfilter 8) wurde. Das vom zweiten Fluorochrom emittierte Licht 25 (typischerweise 655–685 nm) kann den Multibandpassfilter 14 passieren und detektiert werden, wohingegen unerwünschtes Streulicht 24 (565–650 nm) wiederum durch den Multibandpassfilter 14 blockiert wird. Im Allgemeinen blockiert der Multibandpassfilter 14 Streulicht 22, 24, wohingegen von den Fluorochromen emittiertes Licht 23, 25 den Filter passieren kann (die Wellenlängenbänder sind durch die beiden Peaks 9 dargestellt).
[0028] Jede Lichtquelle dient zur Anregung eines spezifischen Fluorochroms und resultiert in emittierten Lichtintensitäten (SLEDx) die einzig von einem Fluorochromen emittiert wurden. Aus diesem Grund ist keine Kalibration nötig und die Intensitätssignale (SLEDx), die mittels CMOS chip 12 gemessen werden sind proportional (Faktoren α, β) zu den Konzentrationen des jeweiligen Fluorochroms ([A], [B]):
[0029]
[0030] Folglich kann die Intensität (SLEDx) für jeden Fluorochrom (proportional zur Konzentration) für jede detektierte Zelle gemessen und für die Datenanalyse genutzt werden, z.B. um Intensitätshistogramme oder Dotplots zu erzeugen, beides Darstellungen die allgemein bekannt sind in der Durchflusszytometrie.
[0031] Fig. 3 zeigt einen typischen Bildschirm des K/A Geräts mit laufender Applikations-Benutzeroberfläche zur Interaktion mit dem Benutzer und Daten/Resultat Präsentation. Im normal Modus wird der Probenmessvorgang durch Drücken des «Analyse Sample» Bedienknopfs 26 gestartet und die Messprozedur wird initialisiert. Spezifische Regionen der Probe können vor der automatisierten Messung durch Verwendung der Manuellen Kontrollfunktionen 27 untersucht werden. Alternativ kann das live-Bild 29 durch Ziehen bewegt werden, was eine entsprechende mechanische Bewegung des Probenträgers 10 entlang den Achsen 7 zur Folge hat. Fokus, Belichtungszeit und Verstärkung können über die Schieber 27 kontrolliert werden. Die Lichtquellen können mittels den Bedienknöpfen 28 ausgewählt werden. Das Live Bild 29 vom Lichtempfangenden Detektor 12 wird angezeigt und der Benutzer kann unmittelbar Resultate 30 und Veränderungen im detektierten Bild aufgrund geänderter Parametereinstellungen sehen.
Bespiel 1
Mikroskopischer Nachweis von säurefesten Bazillen in Sputum
[0032] Dieses Beispiel beschreibt eine Ausführungsform der Erfindung von Fig. 1 zur Detektion von Mycobacterium tuberculosis auf Auramin O gefärbten Sputum Smears.
[0033] Um eine genügend hohe Auflösung zu erhalten um eine Computeralgorithmus gestützte Identifikation von individuellen Tuberkulose Bakterien zu ermöglichen, wurde die Vergrösserung durch die Objektiv Linse 13 und die Fokussier Linse 15 auf M=3 festgelegt. Folglich ist die untersuchte Fläche auf dem Probenträger 10 kleiner als die Fläche auf dem CMOS Bildsensor 13. Dies resultiert in einem Gesichtsfeld (field-of-view) von 1.8 mm<2>. Die Auflösung ist limitiert durch die Pixelgrösse des CMOS Bildsensors und liegt zwischen 0.8–1.5 µm, was genügend hoch ist zur Darstellung von M. tuberculosis Bakterien.
[0034] In diesem Beispiel wurden acid-fast control slides (Doenitz Prolab, Augsburg, Germany) nach einem gängigen Auramin O Färbeprotokoll eingefärbt. Ein positiv- und ein negativ control slide wurden gemessen. Der entsprechende Probenträger wurde in das Gerät eingefügt und die automatische Analyse wurde durch Drücken des «Analyse Sample» Bedienknopfes 26 auf dem Smartphone initialisiert. Total 18 Gesichtsfelder (fields-of-view) wurden durch Rotation 70 des Probenträgers 10 untersucht. Das Lesen/Bewegen/Fokussieren der Probe wurde durch das K/A Mittel 1 kontrolliert und erforderte weniger als 60 Sekunden. Auramin O absorbiert blaues Licht und emittiert grünes Licht; folglich kann nur Fluoreszenz gemessen werden wenn das LED 2 eingeschaltet ist. Wenn LED 6 eingeschaltet ist, wird keine Flureszenz detektiert.
[0035] Die Bildoptimierung und Bildanalyse wurde für alle 18 Bilder durchgeführt. Auf dem positive control slide wurden erfolgreich grün fluoreszierende Tuberkulose Bakterien durch die Bildanalyse die auf dem K/A Gerät abläuft identifiziert und die Identifizierten Bakterien werden dem Benutzer zur finalen Diagnose auf dem Bildschirm präsentiert. Auf dem negative control slide wurden keine passenden Bakterien identifiziert.
[0036] In herkömmlichen Auramin O Protokollen zur mikroskopischen Identifikation von Tuberkulose in Suptum Smears untersucht der Mikroskopist nur einen Bereich von 7–12 mm<2>(normalerweise 40 Gesichtsfelder (field-of-views) mit dem 40-fach Objektiv eines Mikroskops). Das ist um den Faktor 3 weniger also mit dem erfindungsgemässen Gerät. Folglich ist eine erhöhte Sensitivität mit dem erfindungsgemässen Gerät erreichbar. Dies ist speziell in Patienten mit einer HIV/Tuberkulose co-Infektion wichtig, da diese Patientengruppen eine tiefere Anzahl von Bakterien in Sputum aufweisen.
Beispiel 2
Zählung von weissen Blutzellen in Vollblut
[0037] Dieses Beispiel beschreibt den Gebrauch des Geräts aus Fig. 1 unter Verwendung eines anderen Fluorochroms um zu beweisen, dass sich das Gerät für verschiedene Anwendungen eignet und dass dessen Verwendung nicht auf Immunfluoreszenz Färbung oder mehrere Fluorochrome limitiert ist.
[0038] 20 µL EDTA Blut wurden mit 100 µL Acridinorange Färbelösung (Zusammensetzung 0.06 mg/100 mL Acridinorange, 1% Formaldehyd, 0.25% Natriumeitrat, 3% Ethylenglykol) gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Acridinorange färbt die DNS aller weissen Blutzellen. Die resultierende Zellsuspension wurde in die Aussparung 18 eines Polycarbonat Probenträgers 10 gegeben. Die Aussparung hat eine definierte Tiefe von 0.1 mm. Die Vergrösserung welche durch die Kombination von Objektiv Linse 13 und Fokussier Linse 15 verursacht wurde war M=0.55 und somit war das Gesichtsfeld (field-of-view) 52 mm<2>. Dies resultiert in einem untersuchten Probenvolumen von 5.2 µL.
[0039] Die Fluoreszenz des Acridinoranges das an die DNS gebunden ist, wurde gemessen durch Aufnahme eines Bildes während der Anregung mit blauem Licht (470–495 nm) was in Lichtemission zwischen 520 und 560 nm resultiert. Die Software zählt die Anzahl weisser Blutzellen im Bild und zeigt das diagnostische Resultat in weissen Blutzellen pro µL an. Weiter wird die Lichtintensität per Zelle, die Zellgrösse sowie die Zirkularität per Zelle berechnet und als Intensitäts- oder Zellgrössen Histogramm und Dotplot dargestellt.
Beispiel 3
Diagnose einer Insektengiftallergie in Blut durch Beobachtung der Aktivierung von basphilen Zellen
[0040] Dieses Beispiel beschreibt den Gebrauch des Geräts aus Fig. 1 zur Messung von immunofluoreszenz gefärbten Zellen.
In diesem Beispiel wurde Immunfärbung für CD203c zur Identifizierung von basophilen Zellen und gleichzeitige Immunfärbung des basophilen Aktivierungsmarkers CD63 zur Messung des Anteils von aktivierten Basophilen durchgeführt. 100 µL EDTA Blut eines allergischen Spenders wurden mit 100 µL Stimulationspuffer (der Kalzium, Heparin und lnterleukin-3 enthält, Bühlmann Laboratories, Schweiz), 100 µL Yellow Jacket Wasp Venom (Bühlmann Laboratories, Schweiz), 10 µL CD203c-APC (monoklonaler Antikörper, anti-human, Miltenyl BiotecGmbH, Deutschland) and 10 µL CD63-FITC (monoklonaler Antikörper, anti-human, Lucerna-Chem AG, Schweiz) gemischt. Die Mischung wurde für 20 Minuten bei 37 °C inkubiert und dann für 4 Minuten bei 400 x g zentrifugiert. Der Zellüberstand wurde abdekantiert und das Zellpellet in 50 µL rote Blutzellen Lyse Puffer (Zusammensetzung: 1% Formaldehyd, 0.25% Natriumeitrat, 3% Ethylenglykol) resuspendiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert bis die Lyse der roten Blutzellen komplettiert ist. Die resultierende Zellsuspension wurde in die Aussparung 18 des Probenträgers 10 überführt und der Probenträger in das Gerät aus Fig. 1 eingeführt. Die automatische Analyse wurde durch Drücken des «Analyse Sample» Bedienknopfes 26 auf dem Smartphone 1 gestartet. Die beiden Fluorochrome (APC und FITC) wurden hintereinander gemessen. APC Fluoreszent wurde durch die Aufnahme eines ersten Bildes bei Rot Licht Anregung (565–650 nm) mit resultierender Lichtemission bei 655–685 nm gemessen. APC positive Zellen repräsentieren alle basophilen Zellen in der untersuchten Probe. FITC Fluoreszenz wurde durch die Aufnahme eines zweiten Bildes bei blau Licht Anregung (470–495 nm) mit resultierender grüner Lichtemission bei 520–560 nm gemessen. FITC positive Zellen repräsentieren aktivierte Zellen aufgrund einer allergischen Reaktion. In diesem Beispiel wurde ein Probenvolumen von 5 µL untersucht was in einer Gesamtzahl von 412 CD203c-APC positiven basophilen Zellen resultierte. 272 dieser basophilen Zellen wurden als CD63-FITC aktivierte Zellen detektiert, was einem Anteil von 66% aller Zellen und einer klaren Reaktion des Patientenbluts aufgrund des Wespengifts entspricht (gemäss dem Hersteller von ähnlichen Tests gemessen mit Durchflusszytometrie liegt der vorgeschlagene Schwellenwert um eine allergische Reaktion nachzuweisen bei 10% aktivierten Basophilen).
Claims (8)
1. Ein Zellanalyse Apparat bestehend aus
a. einem Probenträger 10 der eine Zellprobe enthält welche mit mindestens einem fluoreszierenden Agens behandelt wurde;
b. einem Probenmess-Mittel bestehend aus (i) mindestens einem Probenbeleuchtungs-Mittel 101, 102, wobei beide aus einer Lichtquelle bestehen um die Probe zu beleuchten; (ii) einem Detektions-Mittel 103 bestehend aus einer ferngesteuerten Fokussierlinse 15 die darauf ausgelegt ist die fluoreszente Strahlung die von der Probe emittiert wird zu empfangen; und
c. ein Kontroll- und Datenanalyse-Mittel 1, das darauf ausgelegt ist die funktionellen Operationen des Probenmess-Mittels zu kontrollieren und Daten zu empfangen, analysieren und Resultate zu präsentieren, wobei das Kontroll- und Datenanalyse-Mittel 1 getrennt von der Probe und vom Probemess-Mittel vorliegt.
2. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontroll- und Datenanalyse-Mittel 1 ein portables Kommunikationsgerät ist, ausgewählt aus einem Smartphone und einem Tablet Computer.
3. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontroll- und Datenanalyse-Mittel 1 mit dem Probenmess-Mittel durch Nutzung einer elektrischen Verbindung kommuniziert.
4. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontroll- und Datenanalyse-Mittel 1 mit dem Probenmess-Mittel durch Nutzung einer kabellosen Verbindung kommuniziert.
5. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontroll- und Datenanalyse Mittel 1 eine Software beinhaltet, die darauf ausgelegt ist um
– optional vom Probenmess-Mittel Informationen über die Natur des Probenträgers und der Operationen die durchgeführt werden müssen zu erhalten;
– optional die Bewegung des Probenträgers zu kontrollieren;
– optional eine oder mehrere Lichtquellen zu kontrollieren;
– die Parameter des Detektions-Mittels zu kontrollieren und anzupassen;
– den Probenmess-Prozess auf dem Detektions-Mittel auszulösen
– die Messdaten vom Detektions-Mittel zu empfangen und diese zu speichern nachdem der Messprozess beendet wurde;
– Die empfangenen Daten zu analysieren und Bildanalyse Algorithmen anzuwenden um Zellen oder Strukturen zu identifizieren und/oder diese auszuzählen;
– die Resultate zu errechnen und diese im gewünschten Format auf dem Bildschirm zu präsentieren;
– die Daten und/oder Resultate zu speichern; und
– optional die Daten und/oder Resultate an eine zentrale Datenbank zu kommunizieren.
6. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektions-Mittel ein Signalerzeugendes Mittel ist ausgewählt aus einem CMOS und einem CCD Chip.
7. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Fluorochrome verwendet werden und deren Strahlung durch die Verwendung eines Multibandpassfilters in Kombination mit einem zeitlich kontrollierten Ein-/Aus- Schalten von mehreren Lichtquellen gemessen wird.
8. Apparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Fluorochrome in Verbindung mit zwei Lichtquellen und einem Dualpassfilter verwendet werden.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AZW | Rejection (application) |