CH703278B1 - Appareil et plateforme pour analyse multiplex. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un appareil pour effectuer des dosages analytiques multiplex sur des plateformes de microréseaux. Cet appareil comporte, assemblées sur un socle a) une unité chauffante connectée à une unité de contrôleur électrique externe; b) une tablette structurée pour le placement de plateformes de microréseaux, c) une ou plusieurs plateformes de microréseaux, comprenant chacune un premier substrat doté de canaux et un deuxième substrat fermant les canaux du premier substrat pour former des chambres de réaction, dans lesquelles sont imprimées une ou plusieurs molécules de ligand, et d) une plaque formant couvercle offrant des connexions traversantes d’entrée et de sortie vers les plateformes de microréseaux et un système d’activation de fluide, respectivement. L’invention concerne également une plateforme de microréseaux, son procédé de fabrication et son utilisation dans le cadre de l’appareil de l’invention.

Description

Domaine de l’invention

[0001] La présente invention concerne un appareil et des dispositifs pour la fabrication et le développement de microréseaux, ainsi que leur application et leur utilisation dans le domaine analytique haut débit, y compris le développement de médicaments et le contrôle de qualité, ou en tant que partie de systèmes de test de pronostic et de diagnostic.

Arrière-plan de l’invention

[0002] Divers dosages biologiques et chimiques ont été développés pour détecter la présence de composés présentant un intérêt dans des échantillons à multicomposants complexes. Les dispositifs à microréseaux en général, et en particulier les microréseaux contenant des biopolymères en tant que ligands de capture, tels que les protéines, les polysaccharides, les acides nucléiques, ainsi que les composés de faible masse moléculaire, ont un large domaine d’applications de recherche, de diagnostic et d’analyse. Les dispositifs à microréseaux mesurent et quantifient des interactions moléculaires après interaction chimique, biochimique ou immunologique de ligands de capture immobilisés en surface avec leurs molécules cibles correspondantes. Ces dosages d’interactions biologiques, biochimiques ou chimiques se basent sur l’exposition d’un échantillon inconnu à un ou plusieurs réactifs connus et peuvent enregistrer la progression ou mesurer le résultat de la réaction. Il est souvent souhaitable d’exposer un échantillon à de multiples réactifs, de faire réagir des réactifs multiples avec des dilutions d’un seul échantillon, ou d’effectuer un dosage particulier avec un échantillon donné en un temps et un emplacement spécifiques.

[0003] L’industrie du diagnostic in vitro a envisagé, par exemple, une «puce à protéine» de diagnostic, dans laquelle un microréseau d’anticorps ou de ligands de capture est imprimé sur une éprouvette. En théorie, après qu’une telle puce a été inoculée avec un échantillon d’un patient (par exemple une goutte de sang, d’urine ou de salive), les protéines devraient se lier à des anticorps ou ligands de capture très spécifiques et devraient être rapidement mesurées pour qu’on détermine si elles sont à des niveaux normaux ou anormaux. Une telle technologie devrait permettre aux professionnels de la santé de pronostiquer ou diagnostiquer précocement l’état de santé, et d’administrer un médicament et/ou un traitement approprié rapidement et avec une plus grande confiance.

[0004] Nombre des obstacles techniques associés à la technologie des microréseaux comprenant des réseaux d’acides nucléiques, de protéines, d’hydrates de carbone ou de cellules, ont été surmontés, et des solutions ont été proposées ou présentées pour effectuer une immobilisation de ligand de capture, une suppression de liaison non spécifique, une préservation d’activité biologique, un transport de fluide, une fourniture de réactif au bon moment, un traitement analytique rapide et une amplification de signal.

[0005] Les limitations actuelles des microréseaux sont le temps et les efforts nécessaires pour développer des dosages analytiques conçus de façon appropriée, et pour obtenir en un temps court des résultats robustes et fiables de haute qualité, en particulier avec des dosages diagnostiques au point d’utilisation effectués ad hoc.

[0006] La technologie actuelle des microréseaux utilise des appareils et des plateformes de microréseaux qui sont personnalisés sous des formats spécifiques de produits (par exemple la puce à gènes Affymetrix, ou la puce à gènes Nanogen, plateforme analytique Randox) ou des plateformes ouvertes, conçues pour un usage général, sur la base de lamelles en verre ou de lamelles plastiques à des dimensions standard. Alors que des formats spécifiques d’un produit ont surmonté certaines limitations liées à un traitement reproductible avec des machines coûteuses et de grande taille, capables de traiter de grands nombres de plateformes simultanément, des systèmes simples et efficaces, conçus pour le traitement rapide et adressable d’une plateforme unique, ou pour une analyse de plateforme multiplex rapide, ne sont pas disponibles.

[0007] Loeffler et al. (EP 1 171 761), Tanaami Takeo (JP 2004 226 068) et Sigrist et al. (EP 1 300 194) décrivent des chambres de traitement de lamelles à multicomposants conçues pour des lamelles de microréseaux. Des systèmes fluidiques et des réseaux fluidiques, ainsi que des procédés pour les utiliser afin de favoriser des bio-interactions, ont été décrits par Lee et al. (demande de brevet US 2004 0 258 571). McNeely et al. (US 2004 0 037 739) décrivent un procédé et un système pour fournir une interface fluidique à des lamelles portant des microréseaux de biomolécules ou d’autres échantillons immobilisés dessus. Le brevet US N° 5 797 898 et le brevet US N° 6 123 861 décrivent des dispositifs à micropuces qui libèrent des molécules de médicament à partir de réservoirs ayant des bouchons de réservoir qui se désintègrent activement ou passivement. Kroy et al. (brevet US N° 5 252 294) décrivent des structures micromécaniques ayant des cavités fermées pour une utilisation dans le stockage et la manipulation de substances. Le brevet US N° 5 948 673 de Cottingham décrit un réacteur à chambres multiples indépendant pour la mise en œuvre de dosages d’hybridation dans une unité scellée, dans lequel certains réactifs sont fournis par revêtement des parois des chambres, et d’autres réactifs sont introduits dans les chambres ouvertes avant le démarrage de la réaction.

[0008] Au vu de ce qui précède, il existe un besoin pour des appareils et dispositifs correspondants permettant une utilisation diagnostique et analytique dans l’initiation et le contrôle de réactions biochimiques, immunologiques ou chimiques, pour la réalisation d’une détection bioanalytique rapide, pour des mesures dans une zone ou un volume d’échelle micrométrique, compatibles avec les technologies des microréseaux. Il serait aussi souhaitable de disposer de procédés pour produire et utiliser ces dispositifs et les appareils faciles à manipuler correspondants.

Définitions

[0009] Dans ce fascicule, les termes suivants devraient être interprétés conformément aux définitions correspondantes présentées ci-après «Appareil». Le mot appareil concerne un système pour usage analytique qui permet de loger et de traiter analytiquement une quantité sélectionnée de dispositifs de plateforme de microréseaux, les dispositifs de plateforme de microréseaux étant placés et fixés par vissage entre une plaque de type tablette structurée et une plaque formant couvercle, cette dernière permettant un accès et une connexion à un orifice d’entrée et un orifice de sortie. Au-dessous de la plaque de type tablette se trouve un coussinet chauffant monté sur une plaque, permettant au final un ajustement de la température dans la chambre de réaction de plateforme de microréseaux à la température ambiante et à une température supérieure. Tout l’assemblage de coussinet chauffant et de plaque, de plaque de type tablette et de plaque formant couvercle, avec les dispositifs de plateforme de microréseaux insérés, est monté sur un socle qui loge le câblage électrique et les connexions au coussinet chauffant et une unité de contrôleur électrique, ce dernier ne faisant pas partie de l’invention.

[0010] «Dispositif». Dans ce qui suit, le mot dispositif est utilisé dans le contexte de la plateforme de microréseaux, ledit dispositif de plateforme de microréseaux étant constitué d’un premier substrat de microréseaux et d’un deuxième substrat de microréseaux, chaque substrat ayant des première et deuxième surfaces. Le dispositif de plateforme de microréseaux est applicable en tant qu’outil analytique en combinaison avec l’appareil décrit ici. La plateforme de microréseaux et l’appareil correspondant forment un ensemble devant être utilisé à des fins analytiques et bioanalytiques.

[0011] «Plateforme de microréseaux». Les plateformes de microréseaux, en général, se réfèrent à des réseaux bidimensionnels, typiquement à la surface d’un matériau plat en verre ou en polymère, d’un filtre, ou d’une tranche de silicium, sur lesquels des espèces moléculaires chimiques ou biochimiques sont déposées ou synthétisées dans un ordre spatial prédéterminé leur permettant d’être rendues disponibles en tant que sondes d’une manière parallèle. La présente invention se réfère à de tels microréseaux où les espèces moléculaires chimiques, biochimiques ou immunologiques sont déposées sous la forme de ligands au-dessus de sous-structures, ces dernières étant disposées à l’intérieur de canaux ouverts préformés.

[0012] Un «canal», tel qu’utilisé ici, signifie une caractéristique tridimensionnelle dans un matériau de substrat de plateforme de microréseaux qui, sous sa forme ouverte («canal ouvert»), offre un accès externe physique depuis au moins une direction et qui, sous sa forme fermée («canal fermé»), est capable de conduire des fluides tels que des liquides ou des gaz, d’une manière directionnelle contrôlée. L’expression «canal fermé», telle qu’utilisée ici, se réfère à des canaux qui sont fermés sur toute la longueur à l’exception d’ouvertures à l’entrée et à la sortie des canaux. En plus de cela, les canaux fermés peuvent avoir n’importe quelle forme en coupe transversale, et les sections transversales le long d’un canal peuvent avoir différents types de sections transversales.

[0013] «Sous-structures». Le mot «sous-structures», dans le contexte des «canaux sous-structurés», se réfère à des différences de sections transversales des canaux le long de la longueur de canaux ouverts. La sous-structuration de microcanaux englobe une micro- et une nano-structuration au fond des canaux ouverts et/ou de leurs parois latérales, obtenue par un type quelconque de procédé de structuration de matériau, comme par exemple un décapage par voie humide ou un décapage à sec, un micro-usinage, un traitement par faisceau d’électrons, une abrasion, un emboutissage à chaud ou un moulage par injection.

[0014] L’expression «impression dans les canaux» concerne le procédé consistant à déposer des liquides contenant le ligand, éventuellement en combinaison avec des réactifs chimiques qui effectuent l’immobilisation du ligand, dans des canaux ouverts. Cette déposition de liquide peut être réalisée par n’importe quel dispositif ou instrument capable de rendre disponibles et de placer de petits volumes d’échantillons, d’une façon localement adressable précise.

[0015] Le terme «réactif» est utilisé pour n’importe quel type d’espèce chimique qui participe à une interaction chimique, biochimique ou immunologique, avec ou sans changement moléculaire de n’importe quelle espèce impliquée.

[0016] Un «ligand», tel qu’utilisé ici, se réfère à des espèces chimiques, biochimiques ou immunologiques qui sont immobilisées sur la première surface de la plateforme de microréseaux et participent en tant que réactifs. L’immobilisation d’un ligand englobe tous les procédés de liaison par adsorption (par exemple précipitation en surface, interactions hydrophobes, interactions ioniques, ainsi que leurs combinaisons) et tous les procédés impliquant une liaison covalente de ligand.

[0017] «Sonde cible». Les sondes cibles sont des composants de soluté interagissant avec lesdits ligands ou des complexes ligand-cible dans des chambres de réaction.

[0018] La «chambre de réaction», telle qu’utilisée dans la présente invention, est l’espace et le volume physique où les ligands et les sondes cibles subissent des interactions chimiques, biochimiques ou immunologiques, ou participent en tant que réactifs à des interactions chimiques, biochimiques ou immunologiques.

Résumé de l’invention

[0019] La présente invention introduit un appareil et des dispositifs correspondants à utiliser avec l’appareil pour effectuer des réactions biochimiques, immunologiques ou chimiques sur une nouvelle plateforme de microréseaux, l’ensemble étant constitué d’un ou plusieurs dispositifs de plateforme de microréseaux, et l’ensemble constitué de l’appareil et des plateformes étant approprié pour effectuer des analyses basées sur des microréseaux. Un autre objet de l’invention consiste à mettre à disposition des procédés pour utiliser ledit dispositif et les dispositifs de plateforme à microréseaux à des fins analytiques.

[0020] L’invention comprend en outre un appareil pour usage analytique qui permet de retenir et simultanément développer une quantité sélectionnée de dispositifs de plateforme de microréseaux, individuellement ou jusqu’à six articles en parallèle, les dispositifs de plateforme de microréseaux étant placés et fixés par vissage entre une plaque de type tablette structurée et une plaque formant couvercle, cette dernière permettant un accès et une connexion à un orifice d’entrée et un orifice de sortie. Au-dessous de la plaque de type tablette se trouve une plaque chauffante permettant un ajustement de la température dans la chambre de réaction à la température ambiante et au-delà. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le deuxième substrat de la plateforme de microréseaux est au contact de la plaque formant tablette, en réalisant ainsi un transfert de température efficace vers la chambre de réaction. La totalité de l’assemblage de la plaque chauffante, de la plaque de type tablette et de la plaque formant couvercle, avec les dispositifs de plateforme de microréseaux insérés, est montée sur un socle qui loge le câblage électrique et les connexions à la plaque chauffante et une unité de contrôleur de température (cette dernière ne faisant pas partie de l’invention). Un autre instrument externe est requis pour actionner le transport de liquide depuis le compartiment d’entrée de l’appareil, amenant lesdits liquides dans et à travers la chambre de réaction du dispositif de plateforme de microréseaux. Cette instrumentation ne fait pas partie de la présente invention.

[0021] L’invention comprend en gros un dispositif de plateforme de microréseaux qui peut être aussi grand ou plus grand qu’une lamelle de microscope ayant des première et deuxième surfaces et une ou plusieurs microstructures gravées dans ladite première surface, ladite microstructure dans le premier substrat comprenant une ou plusieurs sous-structures et un ou plusieurs sites biologiquement actifs disposés à l’intérieur de ladite microstructure de la deuxième surface ou sur le dessus desdites sous-structures, et un deuxième substrat de plateforme de microréseaux formant des chambres de réaction de petit volume après assemblage avec la première surface du deuxième substrat, lesdits premier et deuxième substrats de microréseaux formant la plateforme de microréseaux.

[0022] Un mode de réalisation préféré de l’invention concerne le dispositif de plateforme de microréseaux qui comprend un réseau imprimé dans un canal (imprimé en réseaux dans un canal ouvert) d’une ou plusieurs (bio)molécules formant ligands, les (bio)molécules formant ligands étant ainsi déposées et de préférence immobilisées de manière covalente à l’intérieur des cavités formant des canaux avant fermeture des canaux, ladite fermeture des canaux étant effectuée par scellement des canaux ouverts avec un deuxième substrat de plateforme de microréseaux. Ces dispositifs de microréseaux peuvent être utilisés en combinaison avec l’appareil pour analyse d’un seul échantillon, ou pour une analyse en série conjointement, par exemple, avec des systèmes de pipetage multiple robotisés.

[0023] Dans d’autres modes de réalisation préférés de la présente invention, les surfaces intérieures du canal ouvert (de la deuxième surface du premier substrat de microréseaux) sont sous-structurées, de façon que les sous-structures soient conçues pour effectuer une perturbation de l’écoulement de liquide. Dans des modes de réalisation préférés additionnels de la présente invention, lesdites sous-structures sont conçues pour une déposition confinée de molécules de ligand au niveau d’élévations, autres que le fond des canaux, en permettant ainsi un placement des molécules de ligand distinctif et un balayage sélectif, vis-à-vis de l’élévation, de la plateforme par des moyens optiques, par exemple par microscopie confocale. Des éléments de sous-structuration préférés de manière ultime de la présente invention déterminent un écoulement de liquide perturbé rapide à l’intérieur de micro-canaux structurés en hauteur.

[0024] Dans d’autres modes de réalisation préférés de la présente invention, les canaux ouverts formant une chambre de réaction sont gravés sur la deuxième surface du premier substrat de plateforme de microréseaux, et les connexions d’entrée et de sortie sont des connexions traversantes (trous) avec des structures autoclaves sur la première surface du premier substrat de microréseaux, qui est opposée à la chambre de réaction (assemblée sur la deuxième surface du premier substrat de microréseaux).

[0025] Dans encore d’autres modes de réalisation préférés, les orifices d’entrée de fluide des plateformes de microréseaux, se trouvant au niveau de la première surface du premier substrat de microréseaux, sont connectés à des entrées de fluide de la plaque formant couvercle, et le transport de fluide global est actionné soit par un mécanisme de déplacement de liquide mécanique, soit par application d’une pression de gaz positive ou négative (vide ou aspiration). Cet actionnement de fluide est effectué par un instrument approprié, ledit instrument ne faisant pas partie de la présente invention.

[0026] Dans encore un mode de réalisation préféré de la présente invention, l’appareil représenté sur la fig. 1 assure un ajustement par contact étroit de la plateforme de microréseaux à la plaque de type tablette au moyen de vis, et permet un transport de température rapide et efficace depuis la plaque chauffante, en passant via la plaque de type tablette vers la première surface du deuxième substrat de microréseaux et la chambre de réaction, qui est séparée par ledit deuxième substrat.

[0027] Des modes de réalisation préférés spécifiques de la présente invention apparaîtront de façon évidente à partir de la description plus détaillée qui suit de certains modes de réalisation et des revendications.

Brève description des dessins

[0028] <tb>La fig. 1<SEP>décrit l’appareil et ses composants constitutifs: le socle 1, la plaque chauffante 2, la plaque de type tablette 3, le dispositif de plateforme de microréseaux 5 et la plaque formant couvercle 6. Cette dernière est représentée ici en coupe partielle pour mieux montrer le positionnement des dispositifs de plateforme de microréseaux et les connexions d’entrée 7 et de sortie 8. <tb>La fig. 2<SEP>montre une vue d’ensemble partielle (fig. 2A ), une coupe longitudinale (fig. 2B ) et une coupe transversale (fig. 2C ) d’un ensemble constitué de la plaque de type tablette 3, des dispositifs de plateforme de microréseaux 5, et de la plaque formant couvercle 6. <tb>La fig. 3<SEP>est un dessin de la plaque chauffante 2 et du coussinet chauffant 11. <tb>La fig. 4<SEP>est une vue en perspective de la première surface du substrat de plateforme de microréseaux 12. <tb>La fig. 5<SEP>est une vue en perspective de la deuxième surface du premier substrat de plateforme de microréseau 13 avec un canal ouvert du type à méandres gravés 14. Le deuxième substrat de microréseaux avec sa première surface 15 et sa deuxième surface 16 est représenté au-dessus sous la forme d’un stratifié à des fins d’illustration. <tb>La fig. 6<SEP>décrit l’option préférée de sous-structures dans la chambre de réaction formant des canaux ouverts. <tb>La fig. 7<SEP>est une image de balayage fluorescent de molécules de ligand fluorescentes imprimées dans un canal.

Description détaillée de l’invention

[0029] La conception du dispositif selon la présente invention est décrite sur la fig. 1 . L’appareil est constitué d’un socle 1, d’une plaque chauffante 2 portant un coussinet chauffant 11, d’une plaque de type tablette structurée 3 pour placer jusqu’à 6 dispositifs de plateforme de microréseaux 6 et une plaque formant couvercle. Dans un mode de réalisation préféré, on utilise des matériaux métalliques pour le socle, la plaque de base chauffante et la plaque de type tablette, tandis que le matériau de la plaque formant couvercle est un polymère synthétique transparent. Pour une utilisation standard, le socle, la plaque de base chauffante, le coussinet chauffant et la plaque de type tablette sus-jacente sont assemblés et réunis par des vis, le tampon chauffant étant électriquement raccordé à une unité de contrôleur électrique qui ne fait pas partie de la présente invention.

[0030] Dans un autre aspect, l’invention met à disposition un appareil, représenté sur la fig. 1 , pour traiter un échantillon, en particulier un échantillon chimique ou biochimique, l’appareil comprenant de plus des moyens de commande informatisés et des moyens de régulation de température; les moyens d’activation de fluide, les moyens de commande informatisés et les moyens de régulation de température ne faisant pas partie de la présente invention.

[0031] L’appareil représenté sur la fig. 1 est utilisé conjointement avec des dispositifs de plateforme de microréseaux. Commodément, les moyens de maintien comprennent des moyens de serrage à vis (trous 9 pour placer ces vis) convenant pour «prendre en sandwich» les dispositifs de plateforme de microréseaux entre la plaque de type tablette et la plaque formant couvercle. Ce mécanisme de maintien permet un ajustement étroit de l’orifice d’entrée de la plaque formant couvercle 17 et de l’orifice d’entrée de la plateforme de microréseaux 18, et entre l’orifice de sortie de la plateforme de microréseaux 19 et l’orifice de sortie de la plaque formant couvercle 20. Un ajustement étroit entre les deux parties mentionnées peut être obtenu par des structures de guidage qui permettent un scellement autoclave ou n’importe quel autre type de scellement aux liquides connu de l’homme du métier. Un alignement précis du dispositif de plateforme de microréseaux et de la plaque formant couvercle peut en outre être déterminé par des cavités de réception et des broches correspondantes sur les surfaces de contact des composants de l’ensemble.

[0032] Des détails des moyens de chauffage sont présentés sur la fig. 3 . La plaque chauffante métallique 2, avec le coussinet chauffant 11 assemblé sur le dessus, est fixée sur la partie supérieure du socle. En tant que partie de cette invention, la plaque de type tablette est individuellement fixée par des vis sur le dessus du coussinet chauffant. Une telle configuration permet un retrait aisé de la plaque de type tablette sans déconnexion des connexions électriques, dans le cas où une décontamination de la plaque de type tablette est nécessaire.

[0033] La fig. 2A montre un assemblage de la plaque de type tablette et de la plaque formant couvercle avec 5 dispositifs de plateforme de microréseaux disposés en place. Pour le chargement d’un nombre souhaité de plateformes de microréseaux 5, lesdites plateformes de microréseaux sont placées dans les évidements 4 et la plaque formant couvercle est placée sur le dessus, en formant un assemblage «de type sandwich». La fig. 2B et la fig. 2C décrivent des coupes transversales d’un tel assemblage comprenant des dispositifs de plateforme de microréseaux. Il est important de noter que l’entrée 17 et la sortie 20 de la plaque formant couvercle sont spatialement connectées à l’orifice d’entrée 18 et à l’orifice de sortie 19 de la plateforme de microréseaux sur la première surface du substrat de plateforme de microréseaux. Des connexions étanches aux liquides sont obtenues au moyen de joints toriques proprement placés ou de fixations équivalentes de l’état de la technique à l’une ou l’autre connexion. Un assemblage serré des plateformes de microréseaux, «prises en sandwich» entre la plaque de type tablette et la plaque formant couvercle, est renforcé par des vis à serrage à main, placées une sur chaque côté d’une plateforme de microréseaux quelconque utilisée dans le procédé analytique. Ceci permet de traiter en parallèle un nombre sélectionné quelconque de plateformes de microréseaux, compris entre un et six.

[0034] Des détails de la plateforme analytique selon la présente invention sont présentés sur la fig. 4 et la fig. 5 . Des plateformes de microréseaux ayant les dimensions conventionnelles d’une lamelle de microscope (norme US: 1″ x 3″; norme européenne: 75 x 25 mm) sont préférées du fait de nombreux instruments analytiques disponibles dans le commerce (imprimante de microréseaux, lecteur de microréseaux, instruments d’hybridation, dispositifs de développement de microréseaux, basés sur le format d’une lamelle) pour un traitement efficace et un développement des microréseaux dudit format. Bien que cela soit préféré, la présente invention n’est pas limitée au format lamelle, et le principe d’impression dans un canal au-dessus d’une sous-structure peut être appliqué à de nombreux formats différents, ainsi qu’à des matériaux différents.

[0035] N’importe quel type de matériau permettant une micro-structuration du premier substrat de microréseaux et une étanchéité substantielle avec le deuxième substrat de microréseaux est considéré comme approprié pour la fabrication de plateformes de microréseaux selon l’invention. Les matériaux de premier substrat préférés sont des polymères synthétiques ayant un faible arrière-plan de fluorescence qui peuvent être structurés, par exemple, par moulage par injection ou emboutissage à chaud, et qui peuvent être produits en gros volumes. Ce premier substrat peut être constitué d’homopolymères ou copolymères, par exemple les polyuréthanes, les polyesters, les oléfines cycliques, le polypropylène, le polycarbonate, le polyéthylène, les polyesters, les acrylates, les polyamides, les polyurées ou d’autres polymères organiques connus de l’homme du métier. En variante, des matériaux pour le premier substrat de microréseaux faisant partie des matériaux non plastiques comprennent le verre, les matériaux siliconés, les métaux nobles, le quartz, les composites, en général les matériaux qui peuvent être structurés à des dimensions micrométriques et nanométriques par des procédés couramment connus. Les premiers substrats de microréseaux peuvent être microstructurés en un type de matériau et ensuite traités avec un revêtement de surface local ou total pour obtenir des propriétés de substrat appropriées, telles que requises pour une détection (par exemple mesure optique directe ou dépendante d’un fluorophore, revêtement d’or pour la détection d’interactions moléculaires par résonance plasmonique de surface, revêtements de guides d’ondes appropriés combinés à des réseaux de diffraction pour mesures réfractométriques, électrodes interdigitées combinées à des connexions électroniques pour enregistrer des signaux électrochimiques générés localement). Les matériaux qui sont par eux-mêmes coûteux et difficiles à microstructurer sont les moins recommandés pour une utilisation.

[0036] Dans le mode de réalisation préféré, une microstructuration de la plateforme de microréseaux peut être conforme ou similaire au dessin de la fig. 4 et de la fig. 5 . Le premier substrat de la plateforme de microréseau est structuré sur les deux côtés; la première surface du premier substrat de plateforme 12 est présentée sur la fig. 4 , et la deuxième surface du premier substrat 13 est indiquée sur la fig. 5 . La première surface du premier substrat de microréseaux, de format lamelle, est constituée d’une zone réservée pour le marquage de lamelle 23 et de la surface de la plateforme de microréseaux 12 qui est en contact avec la plaque formant couvercle. L’orifice d’entrée 18 établit la connexion trans-plateforme 22 aux microstructures sur la deuxième surface du premier substrat de plateforme de microréseaux (voir la fig. 4 ). La zone entourant l’orifice 24 comprend la partie de réception de la structure d’autoclave sur la plaque formant couvercle 10. L’orifice de sortie 19 sur la première surface de la première surface de plateforme de microréseaux établit un contact direct avec l’orifice de sortie de la plaque formant couvercle 20, ladite sortie étant connectée au système d’actionnement qui peut être d’un type quelconque de mécanisme de pompe à base de gaz, un type quelconque de système générant une aspiration par le vide, ou un dispositif entraîné par un courant du fait d’une pression positive exercée sur le compartiment d’entrée conique sur la plaque formant couvercle. Si le dispositif de plateforme de microréseaux est utilisé pour une analyse en série manuellement ou conjointement, par exemple, avec des systèmes de pipetage multiple robotisés, la zone entourant l’orifice d’entrée 7 a la forme d’un compartiment ouvert de récipient de liquide.

[0037] La fig. 6 montre une vue éclatée de la deuxième surface 13 du premier substrat de microréseaux avec une structure du type à méandres 14 représentant l’un des nombreux agencements et conceptions possibles de structure à canaux ouverts. D’autres agencements des structures à canaux ouverts peuvent prendre la forme de lignes droites, d’une spirale avec, par exemple, un orifice de sortie au centre, ou d’un agencement en spirale inversée. Dans un autre agencement, des structures à canaux ouverts individuelles peuvent être multiplexées sur la deuxième surface de la première plateforme de substrat de plateforme de microréseaux. La multiplicité desdits agencements structurels implique qu’il y ait une pluralité d’orifices d’entrée et d’orifices de sortie correspondant au nombre de microstructures sur ladite plateforme de microréseaux.

[0038] Indépendamment du type de l’agencement bidimensionnel, les canaux ouverts 25 dans la deuxième surface du premier substrat de plateforme de microréseaux 14 sont convertis en canaux fermés par recouvrement du deuxième substrat de plateforme de microréseaux. Dans un agencement préféré, ledit deuxième substrat de recouvrement est un film mince, un matériau flexible généralement connu sous l’appellation de stratifié, 15 & 16, capable de fermer les canaux ouverts de la plateforme de microréseaux après application au premier substrat de plateforme de microréseaux structuré solide 13. Une fermeture des canaux à l’épreuve des liquides est obtenue par exemple avec des stratifiés qui interagissent de façon réversible ou irréversible avec la surface 13. Une fermeture à l’épreuve des liquides peut être obtenue par collage à la température ambiante, au moyen de stratifiés du commerce, ou par thermosoudage ou soudage de stratifiés, l’une ou l’autre des procédures mentionnées correspondant à l’état de la technique actuellement utilisé pour le scellage réversible ou irréversible de microplaques. Les stratifiés de scellement 15 & 16 ont de préférence une épaisseur d’environ 100 micromètres, sont imperméables aux liquides et aux gaz, sont stables thermiquement dans la plage allant de –40 °C à +100 °C, sont optiquement transparents jusqu’à 250 nm, et sont résistants aux produits chimiques et aux solvants. Ces stratifiés sont généralement dotés d’une couche d’adhésif sensible à la pression sur leurs surfaces inférieures 15. En pratique, les stratifiés sont appliqués d’une manière similaire aux bandes adhésives, et servent à sceller de façon permanente les canaux ouverts, en recouvrant toute la surface 13.

[0039] L’invention n’est pas limitée à une stratification, mais une fermeture de canaux à l’épreuve des liquides peut également être obtenue par une fusion de matériau. Ceci s’applique au cas particulier où des matériaux durs sont utilisés en tant que deuxièmes substrats de plateforme de microréseaux (par exemple des matériaux en verre ou siliconés), ou par soudage de plastiques durs ou d’autres procédures connues de l’homme du métier.

[0040] La fig. 6 décrit une option préférée des sous-structures à canaux ouverts. Les formes en coupe transversale des canaux ouverts 25 peuvent être en U, rectangulaires, avec ou sans caractéristiques de fond arrondi, en V, ovales, ou rondes. Dans un mode de réalisation préféré, la deuxième surface du premier substrat de plateforme de microréseaux 13 et la première surface du deuxième substrat de plateforme de microréseaux 15 sont plates, ce qui donne des coupes transversales de canaux ayant les formes mentionnées avec un couvercle plat. La hauteur des canaux fermés ainsi formés est établie par l’étape de fabrication de la deuxième surface du premier substrat 13. La profondeur du canal est d’au moins 30 µm et d’au plus 400 µm, mieux encore comprise entre 50 µm et 150 µm. La largeur du canal ouvert 25 est d’au moins 200 µm et d’au plus 1000 µm, mieux encore comprise entre 400 µm et 800 µm. La largeur des ponts 26 entre les canaux individuels est d’au moins 200 µm et d’au plus environ 1000 µm, mieux encore comprise entre 400 µm et 600 µm. La microstructuration, complémentaire de la deuxième surface du premier substrat 14, peut être appliquée à la première surface du deuxième substrat de plateforme de microréseau 15, en particulier quand des matériaux durs sont utilisés en tant que deuxièmes substrats. Cette structuration peut engendrer au final des sections transversales rondes, ovales, en forme de losange, rectangulaires ou carrées des canaux fermés.

[0041] En fonction de la forme et de la taille des canaux fermés, le volume total de la chambre de réaction est compris entre au moins 4 µl l et au plus 40 µl, mieux encore entre 15 µl et 25 µl.

[0042] L’impression dans un canal de l’invention, et la détection dans un canal de réactions chimiques et biochimiques, peuvent comprendre des topographies à canaux ouverts sous-structurés, ladite sous-structuration améliorant les interactions moléculaires dues à des changements locaux des conditions d’écoulement de fluide. Cette sous-structuration améliore en outre l’exposition du ligand immobilisé aux réactifs, aux tampons de rinçage et aux solvants et, dans certaines configurations, place les ligands de capture à des élévations topiques distinctives permettant non seulement une déposition de ligand de capture confinée, mais aussi une lecture adressable distinctives de signaux générés, par exemple, par microscopie confocale ou détection optique sensible à la masse, telle qu’une réfractométrie ou une résonance plasmonique de surface. La fig. 6 montre des vues partielles agrandies d’exemples de sous-structures qui peuvent être des parties intégrées des chambres de réaction. Lesdites sous-structures sont générées durant la fabrication de la plateforme par des technologies d’emboutissage à chaud, de moulage par injection, d’ablation, courantes dans la technique (par exemple micro-usinage, ablation au laser, ablation par faisceau d’électrons), par des procédures de décapage (décapage humide, décapage à sec), ou par moulage par impression en positif. Les ligands de capture sont imprimés en des sites spécifiques à l’intérieur du canal ouvert par utilisation de systèmes d’impression de microréseaux par contact ou sans contact, connus de l’homme du métier.

[0043] Des topographies sélectionnées de sous-structures préférées sont davantage détaillées sur la fig. 6 . La version la plus simple d’une sous-structure de surface dans un canal consiste en un agencement de structures en forme de disques saillants 27 au fond des canaux ouverts. La surface supérieure desdites structures en forme de disques peut avoir une concavité minimale qui permet une déposition locale et un confinement efficaces de solutions de ligand imprimées. Dans certains autres modes de réalisation, des structures ondulées, s’étendant d’une paroi à l’autre, avec des transitions douces entre des élévations en alternance, sont introduites dans les canaux ouverts, les ligands étant imprimés sur le dessus des élévations, ou bien, dans un autre mode de réalisation, au niveau de dépressions intermittentes. Ces sous-structures effectuent une distorsion d’écoulement de fluide efficace et favorisent la cinétique réactionnelle au niveau du site d’interaction moléculaire.

[0044] La présente invention nécessite la déposition des ligands de capture dans des structures à canaux ouverts. La déposition de ligand est réalisée par des bio-imprimantes à contact ou sans contact, avec une préférence pour les instruments permettant un positionnement bidimensionnel précis du robot d’impression et une formation précise de petits volumes d’aliquotes par événement de déposition. Des instruments du commerce actuels délivrent des volumes de liquide compris entre 5 µl et plusieurs pl (picolitres).

[0045] La déposition de molécules de ligand peut être effectuée avec n’importe quel type d’instrumentation, qu’on appelle généralement système de formation de microréseaux, bio-imprimante, système de formation de réseaux, nanotraceur ou nano-imprimante, permettant une déposition locale précise de liquides en des quantités contrôlées. Lesdits systèmes de formation de microréseaux sont disponibles dans le commerce, et leurs spécifications sont généralement fournies par le producteur. L’impression piézo-activée et la déposition par broches de liquides contenant lesdites molécules de ligand font partie des systèmes d’impression préférés, et leur application se réfère à des procédures de l’état de la technique. En relation avec la présente invention, il est essentiel que la déposition de dits liquides contenant lesdites molécules de ligand ait lieu depuis le côté ouvert du «canal ouvert» 25. L’alignement bidimensionnel de l’instrument doit être suffisamment ajustable et précis pour permettre une impression dans les canaux et, dans le cas d’une sous-structuration des canaux, pour imprimer sur ou dans les sous-structures en question. La somme de toutes les caractéristiques imprimées peut former un réseau bidimensionnel de ligands déposés, comprenant éventuellement des redondances d’échantillons. Un type préféré de caractéristique d’impression est un mouchetage local de solutions de ligand individuelles. Les caractéristiques de mouchetage mises à part, l’instrumentation de microréseaux peut aussi être utilisée pour déposer entièrement ou partiellement des solutions de molécules de ligand, à l’intérieur ou le long d’une structure présélectionnée, telle que des zones étendues à l’intérieur d’un canal ou, comme décrit dans l’exemple 2, une section transversale d’un côté à l’autre d’un agencement de canal du type à méandres, de façon que le résultat puisse finalement devenir un type de code à barres en ligne. De façon similaire, l’image de signal traitée d’un réseau imprimé dans un canal d’une pluralité de caractéristiques peut avoir pour résultat un code à barres bidimensionnel.

[0046] Dans certains modes de réalisation, une simple déposition des molécules de ligand dans les canaux ouverts peut conduire à une adsorption physique (également appelée physisorption) ou à une chimisorption desdites molécules de ligands. Lesdits processus de sorption dépendent du type de matériau utilisé en tant que premier substrat de plateforme de microréseaux, de la nature physico-chimique de la molécule de ligand, et du solvant. Dans certains cas, des dosages basés sur des microréseaux peuvent être effectués sur la base d’une adsorption de molécules de ligand. Par exemple, des interactions moléculaires basées sur des forces telles que la bioaffinité et le caractère hydrophile ou le caractère hydrophobe peuvent être suffisamment fortes et conduire à une liaison cible-sonde stable.

[0047] Dans certains modes de réalisation, il peut être souhaitable de réaliser une interaction relativement forte de la molécule de ligand avec le matériau formant les canaux. Ces interactions peuvent être obtenues au moyen d’une liaison de forte affinité de molécules de ligand, ou par rattachement covalent des molécules de ligand au matériau. Certains des processus conduisant à une liaison de molécules de ligand covalente requièrent une préactivation du matériau ou le rattachement d’espèces chimiques réactives avant la déposition des molécules de ligand. Des processus chimiques conduisant à une liaison forte, et en particulier covalente, de molécules de ligands, sont nombreux, sont bien décrits dans la littérature sur le sujet, et sont connus de l’homme du métier. Une liaison cible-molécules de ligand covalente peut être réalisée conformément aux procédés décrits dans la monographie intitulée Bioconjugate Techniques, Ed. G.T. Hermanson, 1996, Académie Press Inc., et dans la revue «Surface immobilization of biomoiecules by light», H. Sigrist; A. Coilioud; J.-F. Clémence; H. Gao; R. Luginbuehl; M. Saenger; G. Sundarababu, Optical Engineering 1995, 34, 2339–2348, incorporées ici à titre de référence dans leur totalité. Le procédé décrit dans les références mentionnées peut être modifié lorsque c’est nécessaire pour s’accommoder du matériau (de premier substrat de plateforme de microréseaux) et des molécules de ligand de cible. Au vu de la simplicité du procédé, une liaison de molécules de ligand covalente est de préférence effectuée par des procédés à médiation par un polymère photolieur, de tels procédés impliquant la large réactivité d’intermédiaires photo-générés (en particulier les carbènes et les nitrènes ou les radicaux cétyle) avec une large diversité de matériaux, y compris les polymères plastiques et les élastomères.

Exemple 1

[0048] Un substrat plastique en polycarbonate (7,5 x 2,5 x 1 mm) a été structuré sur la deuxième surface avec un canal ouvert du type à méandres, conformément à la présente invention, une zone de réception a été gravée sur la première surface de la lamelle plastique, et des trous de connexion d’entrée et de sortie ont été forés. La deuxième surface du substrat plastique qui expose le canal ouvert du type à méandres a été stratifiée avec une bande en polyéthylène adhésive tous usages (par exemple Simport T329-1). La fonction du dispositif de plateforme de microréseaux a été explorée par application de 10 à 50 µl de solution de test sur la zone de réception et par application subséquente d’une pression négative au niveau de l’orifice de sortie, après connexion de l’orifice à une pompe péristaltique. Les échantillons de fluide testés pour un passage étanche comprenaient, entre autres, de la solution salée tamponnée au phosphate, de l’eau, des solutions aqueuses de colorants artificiels (colorants alimentaires), de la sérumalbumine bovine dans de la solution salée tamponnée au phosphate, ainsi que des échantillons de sang fraîchement soutiré. Les résultats confirment que le dispositif de plateforme de microréseaux est à l’épreuve des liquides, et que des fluides de différentes compositions et densités peuvent passer dans la chambre de réaction par application d’une pression négative (par exemple générée au moyen d’un vide par l’action d’une pompe péristaltique).

Exemple 2

[0049] Une plateforme de microréseaux microstructurés avec des canaux ouverts, comme détaillé dans l’exemple 1, a été traitée avec le polymère photolieur OptoDex<®>(un produit d’Arrayon Biotechnology SA, Neuchâtel, Suisse) et séchée à la température ambiante pendant 2 heures sous 5 x 10<–><2>mbar pour engendrer une surface photo-activable. Les molécules de ligand suivantes ont été dissoutes dans du phosphate de sodium 0,5 mM et du NaCI 1,5 mM, pH 7,4: 0,5 mg/ml d’immunoglobuline de souris (mlgG); 0,5 mg/ml d’immunoglobuline humaine (hlgG). 2 µl de chaque échantillon ont été pipetés dans des segments côte à côte séparés d’une structure du type à méandres à canal ouvert. Après déposition, les échantillons ont été séchés à la température ambiante pendant 1 heure sous 5 x 10<–><3>mbar et les surfaces imprimées ont été irradiées pendant 4 minutes avec une lampe Oriel (350 nm, 11 mW/cm<2>). Après photo-immobilisation, les canaux ouverts ont été stratifiés et la chambre de réaction a été rincée d’abord avec 20 µl de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de sérumalbumine bovine, 20 µl de PBS/Tween<®>20, 20 µl de PBS et 20 µl d’eau désionisée. A des fins de contrôle la plateforme de microréseaux a été balayée pour la fluorescence de Cy5 avec le scanner de réseaux Affymetrix 428 avant traitement ultérieur avec une cible fluorescente.

[0050] L’immuno-coloration de l’antigène immobilisé a été effectuée par introduction de 50 µl d’anticorps anti-souris marqué par fluorescence Cy5, l’écoulement de fluide étant entraîné par application d’une pression négative avec une pompe péristaltique. L’incubation avec l’antigène a été réalisée pendant 5 minutes et comprenait une agitation par écoulement inverse de la solution d’antigène. Après l’incubation, la chambre de réaction a été rincée d’abord avec 50 µl de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de sérumalbumine bovine, puis 50 µl de PBS/Tween<®>20, 50 µl de PBS et 20 µl d’eau désionisée. Le stratifié a été retiré et la plateforme de microréseaux a été balayée avec le scanner de réseaux Affymetrix 428. Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau I suivant.

Tableau I

[0051] <tb>Segment de canal 1: mlgG<SEP>273 ± 96<SEP>54 585 ± 2594 <tb>Segment de canal 2: mlgG<SEP>378 ±109<SEP>47 877 ± 3647 <tb>Segment de canal 3: hlgG<SEP>283 ± 58<SEP>9538 + 471

Exemple 3

[0052] L’exemple 3 documente les procédures pour la déposition adressable dans des canaux de molécules de ligand, et établit le processus de détection de signal par microscopie confocale. La fig. 7 montre une image de balayage de fluorescence d’une plateforme de microréseaux avec des microstructures du type à méandres après déposition de ligand marqué par fluorescence (OptoDex marqué au Cy5). En utilisant le nanotraceur NP2, un produit de GeSiM Ltd., Allemagne, qui permet une déposition d’échantillon liquide précise en mode sans contact, on a injecté et placé des échantillons de molécules de ligand fluorescent à l’intérieur des canaux ouverts. Le logiciel de l’instrument permet un positionnement approprié des piézo-pipettes, dont i’activation permet la déposition de gouttelettes uniques ayant un volume d’environ 0,4 nl chaque. La fig. 7 montre que les gouttelettes se déposent sous la forme de taches individuelles sans venir au contact des parois du canal ouvert. Des taches ayant des concentrations de molécules de ligand différentes sont distinctement révélées par balayage de fluorescence avec le scanner de réseaux Affymetrix 428 (produit d’Affymetrix Ltd., USA). En plus de cette observation, on a trouvé que le signal de fluorescence peut être détecté par microscopie confocale sans élimination du stratifié. La taille des taches et la résolution optique sont comparables même si l’intensité du signal est réduite comme prévu du fait de la présence du stratifié. Les résultats sont résumés dans le Tableau II.

Tableau II

[0053] <tb>Sans stratifié<SEP>18 753 ± 3013 <tb>Avec stratifié<SEP>10 446 ± 3409

Exemple 4

[0054] La performance du dispositif de plateforme de microréseaux et de l’appareil, les deux faisant l’objet de la présente invention, a été étudiée par analyse de la teneur en anticorps antitétaniques dans du sérum de sang humain. Les résultats de l’investigation comparative, présentés dans le tableau III, ont été obtenus par analyse de sérums sanguins de 16 donneurs pour la présence d’anticorps anti-anatoxine tétanique soit par des procédures ELISA (immunodosage enzymatique), qui sont des méthodes de diagnostic connues de l’homme du métier, soit par des procédures utilisant des microréseaux. Les procédures à microréseaux ont été effectuées comme suit. Avant la déposition locale de l’antigène anatoxine tétanique sur la plateforme de microréseaux, la plateforme de microréseaux a été revêtue d’une couche en film mince du polymère photolieur OptoDex<®>, et séchée. L’anatoxine tétanique a été dissoute dans du tampon phosphate et la solution a été imprimée avec un système robotisé dans les canaux ouverts, une seule gouttelette de cette solution d’antigène (volume 400 pl chaque) ayant été déposée sur le dessus de chaque structure saillante en forme de disque. Des caractéristiques positives et négatives, contenant soit de l’immunoglobuline IgG humaine soit de l’immunoglobuline de souris, respectivement, ont aussi été imprimées de façon analogue sur d’autres sous-structures en forme de disque de la plateforme de microréseaux, conjointement avec des solutions standard d’étalonnage de fluorescence. Après l’impression, les dispositifs de microréseaux ont d’abord été séchés sous vide et exposés à une lumière (350 nm, 4 min, 10 mW/cm<2>) effectuant une immobilisation covalente (photo-induite) des molécules imprimées; puis les plateformes de microréseaux ont été stratifiées. Après montage du microréseau imprimé dans l’appareil décrit sur la fig. 1 , la chambre de réaction a été perfusée d’abord avec du tampon, puis un échantillon de 2 microlitres de sérum, dilués dans 100 microlitres de tampon de dilution, a été introduit dans la chambre de réaction par actionnement avec une pompe péristaltique, et incubé pendant 16 minutes par mouvement cyclique alterné de la solution d’échantillon. Une fois l’incubation terminée, la chambre de réaction de la plateforme de microréseaux a été rincée avec du tampon, et ensuite perfusée avec de l’anti-immunoglobuline humaine marquée par un fluorophore. Au bout de 16 minutes, le microréseau a été rincé et la plateforme de microréseaux a fait l’objet d’un balayage de fluorescence. Par rapport aux standards d’étalonnage, l’intensité de fluorescence était en relation avec la teneur en immunoglobuline de l’échantillon de test original, et la concentration d’anticorps anti-anatoxine tétanique résultante a été exprimée en unités internationales (Ul/I).

Tableau III

[0055] <tb>60 052<SEP>12<SEP>9 <tb>71 246<SEP>20<SEP>30 <tb>82 284<SEP>51<SEP>57 <tb>60 122<SEP>192<SEP>212 <tb>82 106<SEP>307<SEP>401 <tb>82 300<SEP>507<SEP>518 <tb>62 103<SEP>628<SEP>537 <tb>61 180<SEP>903<SEP>790 <tb>60 394<SEP>1058<SEP>1403 <tb>82 236<SEP>1389<SEP>1501 <tb>82 303<SEP>1592<SEP>1657 <tb>60 284<SEP>1626<SEP>1995 <tb>82 316<SEP>1532<SEP>2050 <tb>82 299<SEP>2354<SEP>2697 <tb>82 424<SEP>4591<SEP>6106 <tb>81 109<SEP>5761<SEP>8120

Claims (12)

1. Appareil pour effectuer des dosages analytiques multiplex sur des plateformes de microréseaux, constitué des pièces suivantes assemblées sur un socle: a) une unité chauffante connectée à une unité de contrôleur électrique externe; b) une tablette structurée pour le placement de plateformes de microréseaux, c) une ou plusieurs plateformes de microréseaux, comprenant chacune un premier substrat doté de canaux et un deuxième substrat fermant les canaux du premier substrat pour former des chambres de réaction, dans lesquelles sont imprimées une ou plusieurs molécules de ligand, d) une plaque formant couvercle offrant des connexions traversantes d’entrée et de sortie vers les plateformes de microréseaux et un système d’activation de fluide.

2. Appareil selon la revendication 1, dans lequel l’unité chauffante permet un ajustement de la température du fluide dans la chambre de réaction des plateformes de microréseaux à une température présélectionnée située dans la plage allant de 20 °C à 92 °C, de préférence dans la plage allant de 20 °C à 40 °C.

3. Plateforme de microréseaux comprenant un premier substrat comprenant des canaux dans lesquels une ou plusieurs molécules de ligand sont imprimées et un, c. à. d. déposées et de préférence immobilisées de manière covalente à l’intérieur des canaux deuxième substrat fermant le ou les canaux du premier substrat pour former une ou plusieurs chambres de réaction.

4. Plateforme selon la revendication 3, dans laquelle la profondeur des canaux est comprise entre 15 et 400 micromètres, de préférence 100 micromètres.

5. Plateforme selon les revendications 3 et 4, comportant plusieurs canaux et dans laquelle des ponts sont formés entre les canaux, la largeur desdits pont étant comprise entre 200 et 1000 micromètres, de préférence 500 micromètres.

6. Plateforme selon les revendications 3 à 5, dans laquelle les canaux comportent des sous-structures en forme de disque ayant un rayon de 150 micromètres et une hauteur de 25 à 45 micromètres.

7. Plateforme selon les revendications 3 à 6, dans laquelle le deuxième substrat est réalisé en une matière plastique dure transparente, un élastomère ou un verre.

8. Procédé de réalisation d’une plateforme selon l’une des revendications 3 à 7, dans lequel les molécules de ligand sont imprimées au niveau du fond plat du premier substrat microstructuré avant application du deuxième substrat de plateforme de microréseaux.

9. Procédé de réalisation d’une plateforme selon l’une des revendications 6 ou 7, dans lequel les molécules de ligand sont imprimées sur lesdites sous-structures du premier substrat avant application du deuxième substrat de plateforme de microréseaux.

10. Utilisation de la plateforme de microréseaux selon les revendications 3 à 7, avec l’appareil selon la revendication 1 ou 2, pour des études microanalytiques ou pour des analyses alimentaires et environnementales.

11. Utilisation selon la revendication 10, dans laquelle une liaison de molécules de ligand à une molécule cible est enregistrée par détection de fluorescence d’un réactif de dosage après retrait du deuxième substrat de plateforme de microréseaux.

12. Utilisation selon la revendication 10, dans laquelle une liaison de molécules de ligand à une molécule cible est enregistrée par détection de fluorescence d’un réactif de dosage sans retrait préalable du deuxième substrat de plateforme de microréseaux.