[0001] La présente invention concerne un dispositif et un procédé pour la préparation d'un concentré plaquettaire autologue, destiné à un usage thérapeutique, notamment à un usage hémostatique comme colle biologique autogène en vue d'accélérer le processus physiologique de la régénération tissulaire.
[0002] On connaît l'importance du rôle des matériaux autologues d'origine biologique dans le phénomène de la cicatrisation.
Plus particulièrement, deux matériaux autologues d'origine biologique sont directement impliqués dans la formation de la structure du caillot, qui est une barrière hémostatique dont le rôle est d'assurer l'hémostase et de sceller une plaie, à savoir:
la fibrine, qui provient de la séparation du fibrinogène plasmatique en deux brins sous l'effet de la thrombine, et
les membranes activées des plaquettes.
[0003] La phase de la réaction inflammatoire, qui suit la formation du caillot, est initiée par des signaux spécifiques, qui sont des protéines libérées par les globules blancs et les plaquettes.
Ces signaux attirent les macrophages pour "nettoyer" le site avant l'arrivée de nouvelles cellules qui vont se multiplier pour remplacer les cellules endommagées ou détruites.
[0004] La phase de régénération tissulaire est responsable du recrutement de cellules indifférenciées qui seront fixées dans l'échafaudage (ou matrice de croissance) que forme le caillot, et du déclenchement de leur division. Dans cette phase, il y a une dépendance mutuelle entre la structure et les signaux libérés par différentes sources. Les facteurs de croissance libérés par les granules a des plaquettes sont parmi les plus connus, mais le VEGF, qui est libéré par les leucocytes, joue aussi un rôle important dans l'initiation de l'angiogénèse.
Le plasma contient aussi de nombreuses protéines connues sous le terme "molécules de signal", qui facilitent la migration cellulaire et leur division dans le caillot.
[0005] Théoriquement, il est possible d'amplifier les effets de ces premières phases de la cascade de la cicatrisation en augmentant la concentration de facteurs de croissance.
[0006] Par l'utilisation des concentrés plaquettaires, il est possible de "manipuler" les trois phases de la cicatrisation.
[0007] La formation d'un caillot est un phénomène naturel qui est la conséquence d'une agression tissulaire. Le caillot lui-même peut être amplifié, c'est ce que l'on nommera par le terme "caillot enrichi" (CE). Un caillot est principalement formé de globules rouges, de plaquettes et de fibrine.
Le pourcentage en globules rouges est dépendant de l'hématocrite, et la quantité de plaquettes et de fibrine est normale ou à l'état natif.
[0008] Quand un concentré plaquettaire est utilisé pour former le "CE", ce caillot contient un faible pourcentage (> 1%) de globules rouges, 2 à 4 fois plus de plaquettes et une quantité normale de fibrine, et par conséquent ce caillot produira 2 à 4 fois plus de facteurs de croissance.
[0009] Par ailleurs, le rôle des plaquettes dans le chimiotactisme des globules blancs par l'émission de signaux spécifiques a déjà été démontré. Ainsi, les globules blancs, qui ont un rôle de détersion et bactéricide, vont être fixés dans l'échafaudage du caillot. De même, les plaquettes activées peuvent libérer des molécules qui ont un effet bactéricide sur certaines souches bactériennes.
Ainsi, le "CE" peut jouer un rôle essentiel dans la stimulation de la phase inflammatoire.
[0010] Le rôle du caillot dans la cicatrisation est déjà bien connu, également dans la consolidation des fractures osseuses. Le caillot forme un échafaudage où des facteurs de croissance sont libérés en abondance. C'est aussi une matrice de croissance où des cellules souches et indifférenciées sont attirées, fixées puis stimulées à se multiplier par les facteurs de croissance plaquettaires.
[0011] L'utilisation de concentrés plaquettaires est déjà connue, par exemple aux Etats-Unis pour l'implantologie dentaire et la chirurgie osseuse.
Par contre l'obtention des concentrés plaquettaires présente encore actuellement quelques problèmes et inconvénients, notamment ceux de nécessiter un appareillage relativement complexe et coûteux, ainsi que l'intervention également coûteuse de techniciens spécialisés.
[0012] En conséquence, le but de la présente invention est de remédier à ces inconvénients, en fournissant un dispositif et un procédé qui soient efficaces et relativement peu coûteux et qui permettent la préparation de concentrés plaquettaires en une seule opération aussi aisée que possible à mettre en ¼oeuvre, les propriétés du plasma sans érythrocytes et enrichi en plaquettes devant bien entendu être complètement préservées en vue de son usage thérapeutique in vivo;
plus spécifiquement, il est important que les plaquettes continuent à libérer les principaux facteurs de croissance impliqués dans la régénération tissulaire, avec des taux stables de PDGF, TGF-beta , IGF, VEGF et EGF pendant plusieurs jours.
[0013] Un premier objet de cette invention visant à atteindre le but précité consiste en un procédé pour la préparation d'un concentré plaquettaire, qui comprend la centrifugation d'un échantillon de sang complet en présence d'un gel polymérique thixotropique et d'une solution de citrate de sodium.
[0014] Un second objet de cette invention consiste en un dispositif pour la mise en ¼oeuvre du procédé précité, qui comporte un tube en verre à centrifugation contenant un gel polymérique thixotropique et une solution de citrate de sodium,
et présente un vide d'air destiné à recevoir l'échantillon de sang complet.
[0015] Plus particulièrement, le gel polymérique filtrant thixotropique présente un réseau de base de polyéthylène-glycol, et contient en outre de préférence de l'acide azélaïque (environ 7M).
[0016] En général, la concentration de la solution de citrate de sodium est d'environ 0,1 M.
[0017] Quant à la centrifugation, elle est effectuée entre 1500 et 1700 xg pendant 5 à 15 min., de préférence à 1650 xg pendant environ 10 min.
[0018] En ce qui concerne l'utilisation du plasma enrichi autologue obtenu, celui-ci peut encore être modifié avant application selon le but thérapeutique visé, par exemple:
des cellules fraîchement prélevées du patient (kératinocytes, fibroblastes, chondrocytes, cellules de la cornée, etc.) sont mises en suspension dans le plasma enrichi pour une application extemporanée sur les plaies dudit patient; on peut également utiliser des cellules de banques de cellules, ou bien des cellules de culture;
le plasma enrichi polymérisé est partiellement déshydraté pour obtenir un gel semi solide manipulable avec des instruments adéquats, par exemple pour combler une cavité ou un deffect tissulaire, ou comme matrice de croissance ("scaffolds") dans l'attente de la reconstitution de la matrice extracellulaire autogène.
[0019] Ainsi, selon la présente invention, le gel polymérique combiné au citrate de sodium va pendant la centrifugation séparer efficacement les érythrocytes du plasma sanguin enrichi, en cellules leucocytaires, en thrombocytes et en protéines d'adhésion (par exemple fibronectine).
L'enrichissement en plaquettes obtenu est de l'ordre de 2 à 4 fois la norme.
[0020] Il a en outre été démontré que le procédé selon l'invention ne modifie pas les paramètres de la coagulation, et préserve l'intégrité et l'activité du fibrinogène et des autres protéines d'adhésion, telles que la fibronectine, ainsi que des cellules leucocytaires et des thrombocytes, y compris des facteurs de croissance sécrétés par ceux-ci (PDFG, EGF, IGF, VEGF, etc.).
[0021] D'autre part, les D-dimers, marqueur de l'activation de la coagulation et de la lyse sont restés tout à fait stables au cours des manipulations.
Des tests de coagulation spécifiques ont d'autre part démontré la préservation de l'activation de la coagulation après centrifugation.
[0022] Enfin, et ceci est très important pour l'application bio-médicale subséquente, il a été démontré la présence de facteurs de croissance après activation des plaquettes et leur stabilité dans le temps au cours du stockage à 4 deg. C durant la nuit (période test de 21 heures). Les dosages des différents facteurs de croissance impliqués dans la cicatrisation des plaies chroniques ont démontré des taux facilement détectables et leur excellente stabilité au froid durant les 21 heures de conservation à 4 deg. C.
Ceci permet d'envisager la préparation du plasma riche en plaquettes, obtenu par le procédé selon l'invention, la veille d'une intervention de chirurgie réparatrice, afin de diminuer la charge de travail en salle d'opération et d'accélérer la procédure.
[0023] Quant à son usage thérapeutique subséquent, le concentré plaquettaire autologue est généralement mélangé à un activateur conventionnel, du type chlorure de calcium 10%, thrombine-chlorure de calcium 10% ou 20 BU de Batroxobine-chlorure de calcium 10%.
[0024] Une fois polymérisé, le plasma enrichi peut alors être avantageusement utilisé par exemple dans le traitement des plaies aiguës ou chroniques grâce à ses effets hémostatique, de collage des tissus (colle biologique autogène) et accélérateur de la régénération tissulaire,
ceci aussi bien chez les êtres humains que chez les animaux.
[0025] La présente invention sera maintenant illustrée en référence à l'exemple suivant.
Tube séparateur
[0026] Un tube en verre d'une contenance d'environ 15 ml (diamètre 16 mm et longueur 130 mm) contenant 3 ml de gel polymérique à base de PEG et 7M d'acide azélaïque, ainsi qu'un ml de solution de citrate de sodium (0,1 M), ce tube étant fermé de manière hermétique et stérile par un bouchon conventionnel, et présentant un vide utilisable d'environ 8,5 ml constitue le dispositif prêt à l'emploi pour la préparation d'un concentré plaquettaire.
Préparation d'un concentré plaquettaire autologue
[0027] On prélève 8,5 ml de sang sur le patient, qui est aspiré par le vide d'air dans le tube séparateur. Puis celui-ci est soumis à une centrifugation à environ 1650 xg pendant environ 10 min.
Le plasma enrichi en plaquettes est ensuite recueilli, et peut être utilisé pour l'une des applications thérapeutiques décrites précédemment.
[0028] Il a été démontré par des tests appropriés que le concentré plaquettaire ainsi obtenu contenait par rapport à un caillot sanguin naturel de 2 à 4 fois la norme en plaquettes, soit de 2 à 4 fois la norme en facteurs de croissance et une quantité de fibrine de fibrinogène correspondant à la norme, alors qu'il ne contenait pratiquement plus d'hématocytes (< 1% hématocrite, pour 35-50% d'hématocrite dans un caillot naturel).
[0029] De même, il a été constaté que l'activité des facteurs de coagulation est préservée, que les facteurs de croissance sont tout à fait stables pour une période d'au moins 21 heures lors d'un entreposage en chambre froide à 0 deg.
C.
Exemple d'utilisation thérapeutique du concentré plaquettaire autologue
[0030] Sur un patient âgé de 84 ans, présentant une insuffisance veineuse chronique et comme conséquence d'ulcères géants récurant des 2 chevilles, une greffe de peau est réalisée sur la face interne de la cheville.
Au cours de ce temps opératoire, on commence par un prélèvement de peau fine (0.2mm) sur la face antérieure de la cuisse; 2 cm<2> de cette peau sont mise en suspension dans le sérum enrichi du patient préparé par le procédé selon la présente invention
[0031] Puis, après activation de la coagulation par du chlorure de calcium à 10%, la colle autologue ainsi obtenue est appliquée sur la zone donneuse de la greffe.
[0032] Le premier contrôle de plaie est effectué à 3 jours post op montrant un début d'épithélialisation et, à 5 jours post op, la plaie est quasiment complètement réépithélialisée; à noter aussi que les douleurs post opératoires ont été nulles au niveau de la zone donneuse de greffe.
The present invention relates to a device and a method for the preparation of an autologous platelet concentrate for therapeutic use, including hemostatic use as an autogenous biological glue to accelerate the physiological process of tissue regeneration.
[0002] The importance of the role of autologous materials of biological origin in the phenomenon of cicatrization is well known.
More particularly, two autologous materials of biological origin are directly involved in the formation of the clot structure, which is a hemostatic barrier whose role is to ensure haemostasis and seal a wound, namely:
fibrin, which comes from the separation of plasma fibrinogen into two strands under the effect of thrombin, and
activated membranes of platelets.
The phase of the inflammatory reaction, which follows the formation of the clot, is initiated by specific signals, which are proteins released by white blood cells and platelets.
These signals attract macrophages to "clean up" the site before the arrival of new cells that will multiply to replace damaged or destroyed cells.
The tissue regeneration phase is responsible for the recruitment of undifferentiated cells which will be fixed in the scaffold (or growth matrix) that forms the clot, and the triggering of their division. In this phase, there is a mutual dependence between the structure and the signals released by different sources. Growth factors released by platelet granules are among the best known, but VEGF, which is released by leukocytes, also plays an important role in the initiation of angiogenesis.
Plasma also contains many proteins known as "signal molecules", which facilitate cell migration and division into the clot.
Theoretically, it is possible to amplify the effects of these first phases of the cicatrization cascade by increasing the concentration of growth factors.
By the use of platelet concentrates, it is possible to "manipulate" the three phases of healing.
The formation of a clot is a natural phenomenon that is the consequence of tissue injury. The clot itself can be amplified, so-called "enriched clot" (CE). A clot is mainly red blood cells, platelets and fibrin.
The percentage of red blood cells is dependent on the hematocrit, and the amount of platelets and fibrin is normal or native.
When a platelet concentrate is used to form the "CE", this clot contains a small percentage (> 1%) of red blood cells, 2 to 4 times more platelets and a normal amount of fibrin, and therefore this clot will produce 2 to 4 times more growth factors.
Moreover, the role of platelets in the chemotaxis of white blood cells by the emission of specific signals has already been demonstrated. Thus, the white blood cells, which have a role of debridement and bactericidal, will be fixed in the clot scaffolding. Similarly, activated platelets can release molecules that have a bactericidal effect on certain bacterial strains.
Thus, the "CE" can play a vital role in stimulating the inflammatory phase.
The role of the clot in healing is already well known, also in the consolidation of bone fractures. The clot forms a scaffold where growth factors are liberated in abundance. It is also a growth matrix where stem and undifferentiated cells are attracted, fixed and stimulated to multiply by platelet growth factors.
The use of platelet concentrates is already known, for example in the United States for dental implantology and bone surgery.
On the other hand, the obtaining of platelet concentrates still presents some problems and disadvantages, particularly those of requiring relatively complex and expensive equipment, as well as the equally costly intervention of specialized technicians.
Accordingly, the object of the present invention is to overcome these disadvantages by providing a device and a method that are effective and relatively inexpensive and that allow the preparation of platelet concentrates in a single operation as easy as possible to to implement, the properties of the plasma without erythrocytes and enriched in platelets must of course be completely preserved for its therapeutic use in vivo;
more specifically, it is important that platelets continue to release the major growth factors involved in tissue regeneration, with stable levels of PDGF, TGF-beta, IGF, VEGF, and EGF for several days.
A first object of this invention to achieve the above purpose is a process for the preparation of a platelet concentrate which comprises centrifugation of a whole blood sample in the presence of a thixotropic polymeric gel and a solution of sodium citrate.
A second object of this invention consists of a device for carrying out the aforementioned method, which comprises a centrifugation glass tube containing a thixotropic polymeric gel and a sodium citrate solution,
and has an air gap for receiving the whole blood sample.
More particularly, the thixotropic polymeric filter gel has a polyethylene glycol base network, and preferably also contains azelaic acid (about 7M).
In general, the concentration of the sodium citrate solution is about 0.1 M.
As for the centrifugation, it is carried out between 1500 and 1700 xg for 5 to 15 min, preferably at 1650 xg for about 10 min.
Regarding the use of autologous enriched plasma obtained, it can be further modified before application according to the intended therapeutic purpose, for example:
freshly removed cells from the patient (keratinocytes, fibroblasts, chondrocytes, corneal cells, etc.) are suspended in the enriched plasma for extemporaneous application to the wounds of said patient; cell bank cells or culture cells can also be used;
the polymerized enriched plasma is partially dehydrated to obtain a semi-solid gel that can be handled with suitable instruments, for example to fill a cavity or a tissue deffect, or as a growth matrix ("scaffolds") pending the reconstitution of the matrix autogenous extracellular
Thus, according to the present invention, the polymeric gel combined with sodium citrate during centrifugation effectively separate erythrocytes from enriched blood plasma, leukocyte cells, thrombocytes and adhesion proteins (eg fibronectin).
The platelet enrichment obtained is of the order of 2 to 4 times the norm.
It has furthermore been demonstrated that the method according to the invention does not modify the parameters of coagulation, and preserves the integrity and the activity of fibrinogen and other adhesion proteins, such as fibronectin, as well as than leukocyte cells and thrombocytes, including growth factors secreted by them (PDFG, EGF, IGF, VEGF, etc.).
On the other hand, D-dimers, a marker for the activation of coagulation and lysis, remained quite stable during handling.
Specific coagulation tests have also demonstrated the preservation of activation of coagulation after centrifugation.
Finally, and this is very important for the subsequent biomedical application, it has been shown the presence of growth factors after activation of platelets and their stability over time during storage at 4 deg. C during the night (test period of 21 hours). Assays of the various growth factors involved in the healing of chronic wounds demonstrated easily detectable levels and excellent cold stability during the 21 hours storage at 4 deg. vs.
This makes it possible to envisage the preparation of the platelet-rich plasma obtained by the process according to the invention, the day before a repair surgery procedure, in order to reduce the workload in the operating room and to speed up the procedure. .
As for its subsequent therapeutic use, the autologous platelet concentrate is usually mixed with a conventional activator, such as 10% calcium chloride, 10% thrombin-calcium chloride or 20% Batroxobin-10% calcium chloride.
Once polymerized, the enriched plasma can then be advantageously used, for example, in the treatment of acute or chronic wounds by virtue of its hemostatic effects, tissue bonding (autogenous biological glue) and accelerator of tissue regeneration,
this as well in humans as in animals.
The present invention will now be illustrated with reference to the following example.
Separator tube
A glass tube with a capacity of about 15 ml (diameter 16 mm and length 130 mm) containing 3 ml of polymeric gel based on PEG and 7M azelaic acid, and a ml of solution of sodium citrate (0.1 M), this tube being closed hermetically and sterile by a conventional cap, and having a usable void of about 8.5 ml constitutes the ready-to-use device for the preparation of a platelet concentrate.
Preparation of an autologous platelet concentrate
8.5 ml of blood is taken from the patient, which is sucked by the vacuum of air into the separator tube. This is then centrifuged at about 1650 xg for about 10 minutes.
The platelet-enriched plasma is then collected, and can be used for any of the therapeutic applications described above.
It has been demonstrated by appropriate tests that platelet concentrate thus obtained contained in relation to a natural blood clot of 2 to 4 times the platelet standard, that is to say 2 to 4 times the norm in growth factors and a quantity fibrinogen fibrin corresponding to the standard, while it contained virtually no hematocytes (<1% hematocrit, 35-50% hematocrit in a natural clot).
Similarly, it has been found that the activity of coagulation factors is preserved, the growth factors are quite stable for a period of at least 21 hours during storage in a cold room at 0. deg.
vs.
Example of Therapeutic Use of Autologous Platelet Concentrate
On a patient aged 84, with chronic venous insufficiency and as a consequence of giant ulcers scouring both ankles, a skin graft is performed on the inner face of the ankle.
During this operating time, we start with a thin skin sample (0.2mm) on the anterior aspect of the thigh; 2 cm 2 of this skin are suspended in the enriched serum of the patient prepared by the process according to the present invention.
Then, after activation of the coagulation with 10% calcium chloride, the autologous glue thus obtained is applied to the donor zone of the graft.
The first wound check is carried out at 3 days post op showing a beginning of epithelialization and, at 5 days post op, the wound is almost completely reepithelialized; It should also be noted that postoperative pain was absent at the level of the donor donor zone.