CH685057A5 - A process for producing glycosyltransferases. - Google Patents

Description

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Beschreibung description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA-Technik und stellt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Glycosyltransferasen mittels transformierter Hefestämme bereit. The invention relates to the field of recombinant DNA technology and provides an improved method for producing glycosyltransferases by means of transformed yeast strains.

Glycosyltransferasen übertragen Zuckerreste von einem aktivierten Donorsubstrat, üblicherweise einem Nukleotidzucker, auf einen spezifischen Akzeptorzucker unter Ausbildung einer glycosidischen Bindung. Je nach der Art des übertragenen Zuckers werden diese Enzyme in Familien unterteilt, wie z.B. Gaiactosyltransferasen, Sialyltransferasen und Fucosyltransferasen. Als membrangebundene Proteine, die hauptsächlich im Golgi-Apparat vorkommen, verfügen die Glycosyltransferasen über eine gemeinsame Domänenstruktur, die aus einem kurzen aminoterminalen cytoplasmatischen Schwanz, einer Signal-Ankerdomäne und einer erweiterten Stammregion besteht, an die sich eine grosse carboxyl-terminale katalytische Domäne anschliesst. Die Signal-Ankerdomäne hat sowohl die Funktion eines nichtspaltbaren Signalpeptids als auch die eines sich über die Membran erstreckenden Ankers und richtet die katalytische Domäne der Glycosyltransferase innerhalb des Lumens des Golgi-Apparats aus. Von der lumi-nalen Stammregion, auch Spacer-Region genannt, wird angenommen, dass sie die Funktion einer flexiblen Kette hat, die der katalytischen Domäne die Glycosylierung von Kohlehydratgruppen membrangebundener und löslicher Proteine des «Secretory Pathway» ermöglicht, die den Golgi-Apparat passieren. Ausserdem wurde entdeckt, dass der Stammabschnitt die Funktion eines Retentionssignals ausübt, um die Enzyme an die Golgi-Membran gebunden zu halten (PCT Anmeldung Nr. 91/06 635). Lösliche Formen der Glycosyltransferasen finden sich in der Milch, im Serum und in anderen Körperflüssigkeiten. Es wird angenommen, dass diese löslichen Glycosyltransferasen durch proteolytische Freisetzung der entsprechenden membrangebundenen Formen der Enzyme durch endogene Proteasen entstehen, vermutlich durch Spaltung zwischen der katalytischen Domäne und der durch die Membran ragenden Domäne. Glycosyltransferases transfer sugar residues from an activated donor substrate, usually a nucleotide sugar, to a specific acceptor sugar to form a glycosidic bond. Depending on the type of sugar transferred, these enzymes are divided into families, e.g. Gaiactosyltransferases, sialyltransferases and fucosyltransferases. As membrane-bound proteins, which are mainly found in the Golgi apparatus, the glycosyltransferases have a common domain structure, which consists of a short amino-terminal cytoplasmic tail, a signal anchor domain and an extended stem region, followed by a large carboxyl-terminal catalytic domain. The signal anchor domain functions both as a non-cleavable signal peptide and as an anchor extending across the membrane and aligns the catalytic domain of the glycosyltransferase within the lumen of the Golgi apparatus. The luminal stem region, also called the spacer region, is believed to have the function of a flexible chain which enables the catalytic domain to glycosylate carbohydrate groups of membrane-bound and soluble proteins of the "secretory pathway" that pass through the Golgi apparatus . In addition, it was discovered that the stem section functions as a retention signal to keep the enzymes bound to the Golgi membrane (PCT Application No. 91/06 635). Soluble forms of glycosyltransferases can be found in milk, serum and other body fluids. It is believed that these soluble glycosyltransferases result from the proteolytic release of the corresponding membrane-bound forms of the enzymes by endogenous proteases, presumably through cleavage between the catalytic domain and the domain protruding through the membrane.

Die enzymatische Synthese von Kohlehydratstrukturen hat den Vorteil, dass Stereoselektivität und Regioselektivität hoch sind, wodurch die Glycosyltransferasen zu einem wertvollen Werkzeug für die Modifizierung oder Synthese von Glycoproteinen, Glycolipiden und Oligosacchariden werden. Im Gegensatz zu chemischen Methoden ist die zeitaufwendige Einführung von Schutzgruppen überflüssig. The enzymatic synthesis of carbohydrate structures has the advantage that stereoselectivity and regioselectivity are high, which makes the glycosyltransferases a valuable tool for the modification or synthesis of glycoproteins, glycolipids and oligosaccharides. In contrast to chemical methods, the time-consuming introduction of protective groups is unnecessary.

Da Glycosyltransferasen in der Natur in sehr geringen Mengen vorkommen, sind ihre Isolierung aus Naturstoffen und ihre anschliessende Reinigung schwierig. Es wurde daher an ihrer Produktion mittels der rekombinanten DNA-Methode gearbeitet. Zum Beispiel wurden Gaiactosyltransferasen in Zellen von E. coli (PCT 90/07 000) und Ovarien des chinesischen Hamsters (CHO) exprimiert (Smith, D.F. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 6225-34), Sialyltransferasen wurden in CHO-Zellen (Lee, E.U. (1990) Diss. Abstr. Int. B. 50, 3453-4) und COS-1-Zellen (Paulsen, J. C. et al. (1988) J. Cell. Biol. 107, 10A) exprimiert, und Fucosyltransferasen wurden in COS-1-Zellen (Goelz, S. E. et al. (1990) Cell 63, 1349-1356; Larsen R. D. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 87, 6674-6678) und CHO-Zellen (Potvin, B. (1990) J. Biol. Chem. 265,1615-1622) produziert. Berücksichtigt man, dass heterologe Expression in Prokaryonten den Nachteil hat, dass nicht glycosylierte Produkte erhalten werden, Glycosyltransferasen jedoch Glycoproteine sind, und dass die Produktion von Glycosyltransferasen mittels Säugetierwirten sehr teuer, und auf Grund der Gegenwart vieler endogener Glycosyltransferasen, die das erwünschte Produkt verunreinigen würden, kompliziert ist, so besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren, die die wirtschaftliche Produktion von Glycosyltransferasen in grossem Massstab ermöglichen. Since glycosyltransferases occur in very small quantities in nature, their isolation from natural substances and their subsequent purification are difficult. It was therefore worked on their production using the recombinant DNA method. For example, gaiactosyltransferases have been expressed in cells of E. coli (PCT 90/07 000) and Chinese hamster ovaries (CHO) (Smith, DF et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 6225-34), sialyltransferases were in CHO cells (Lee, EU (1990) Diss. Abstr. Int. B. 50, 3453-4) and COS-1 cells (Paulsen, JC et al. (1988) J. Cell. Biol. 107, 10A) and fucosyl transferases were expressed in COS-1 cells (Goelz, SE et al. (1990) Cell 63, 1349-1356; Larsen RD et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6674 -6678) and CHO cells (Potvin, B. (1990) J. Biol. Chem. 265, 1615-1622). Considering that heterologous expression in prokaryotes has the disadvantage that non-glycosylated products are obtained, but glycosyltransferases are glycoproteins, and that the production of glycosyltransferases by mammalian hosts is very expensive and due to the presence of many endogenous glycosyltransferases that would contaminate the desired product , is complicated, there is a need for improved processes which enable the economical production of glycosyltransferases on a large scale.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, solche Verfahren bereitzustellen. It is an object of the present invention to provide such methods.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Produktion von biologisch aktiven Glycosyltransferasen mittels der rekombinanten DNA-Technik bereit, in dem ein Hefe-Vektor-Expressionssystem verwendet wird. The present invention provides a method for the production of biologically active glycosyltransferases using recombinant DNA technology, in which a yeast vector expression system is used.

Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransferase, einer Sia-lyltransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise einer deren Varianten, bereit, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette bestehend aus einem Promoter und einer für die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierenden DNA-Sequenz enthält, wobei diese DNA vom genannten Promoter kontrolliert wird, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird. More specifically, the present invention provides a method for the production of a membrane-bound glycosyltransferase from the group consisting of a galactosyltransferase, a sialyltransferase and a fucosyltransferase, or one of their variants, which method is characterized in that a yeast strain is cultivated which has been transformed with a hybrid vector which contains an expression cassette consisting of a promoter and a DNA sequence coding for said glycosyltransferase or its variant, said DNA being controlled by said promoter, and the enzymatic activity is obtained.

In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Produktion einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransferase, einer Sia-lyltransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise einer deren Varianten, bereit, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter, eine für die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierenden DNA-Sequenz, wobei diese DNA von besagtem Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz mit Hefe-Transkriptionsterminationssignalen, enthält, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird. In a first embodiment, the invention provides a process for the production of a membrane-bound glycosyltransferase from the group consisting of a galactosyltransferase, a sialyltransferase and a fucosyltransferase, or one of their variants, the process being characterized in that a yeast strain is cultivated which has been transformed with a hybrid vector which contains an expression cassette comprising a promoter, a DNA sequence coding for said glycosyltransferase or its variant, this DNA being controlled by said promoter, and a DNA sequence with yeast transcription termination signals , and the enzymatic activity is obtained.

In einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransferase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyltransferase beziehungsweise einer deren Varianten, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybrid2 In a second embodiment, the invention relates to a method for the production of a membrane-bound glycosyltransferase from the group consisting of a galactosyltransferase, a sialyltransferase and a fucosyltransferase or one of their variants, the method mentioned being characterized in that a yeast strain is cultured with a Hybrid2

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

vektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter, der funktionell mit einer ersten, ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, die im richtigen Leseraster mit einer zweiten, für die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, und eine DNA-Sequenz mit Hefe-Transkriptionsterminationssignalen, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird. vector which comprises an expression cassette comprising a yeast promoter which is functionally linked to a first DNA sequence coding for a signal peptide and which is linked in the correct reading frame to a second DNA sequence coding for the glycosyltransferase mentioned or its variant, and a DNA sequence Sequence with yeast transcription termination signals, has been transformed, and the enzymatic activity is obtained.

Der Begriff «Glycosyltransferase», wann immer dieser im vorstehenden oder folgenden Text verwendet wird, ist so zu verstehen, dass er die Familie der Gaiactosyltransferasen, die Familie der Sialyltransferasen und die Familie der Fucosyltransferasen umfasst. Die genannten Glycosyltransferasen sind natürlich vorkommende Enzyme, die in Säugetieren, z.B. Rindern, Mäusen, Ratten und Menschen, vorkommen. Bevorzugte Glycosyltransferasen sind natürlich vorkommende menschliche Glycosyltransferasen in ihrer vollen Länge, inklusive jener Enzyme, die im folgenden Text mit ihren EC-Nummern bezeichnet sind. The term "glycosyltransferase" whenever used in the preceding or following text is to be understood to include the family of gaiactosyltransferases, the family of sialyltransferases and the family of fucosyltransferases. The glycosyltransferases mentioned are naturally occurring enzymes which are found in mammals, e.g. Cattle, mice, rats and humans. Preferred glycosyltransferases are naturally occurring human glycosyltransferases in their full length, including those enzymes which are referred to in the text below with their EC numbers.

Die membrangebundenen Gaiactosyltransferasen und ihre Varianten, die nach dem erfinderischen Verfahren erhältlich sind, katalysieren die Übertragung eines Galactoserests von einem aktivierten Do-nor, üblicherweise einem nucleotidaktivierten Donor, wie z.B. Uridindiphosphatgalactose (UDP-Gal), auf eine Kohlehydratgruppe. The membrane-bound gaiactosyl transferases and their variants, which are obtainable by the inventive method, catalyze the transfer of a galactose residue from an activated donor, usually a nucleotide activated donor, e.g. Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal), on a carbohydrate group.

Beispiele membrangebundener Gaiactosyltransferasen sind UDP-Galactose: ß-Galactosid-a(1-3)-ga-lactosyltransferase (EC 2.4.1.151), für die Galactose als Akzeptorsubstrat unter Ausbildung einer a(1-3)-Bindung dient, und UDP-Galactose: ß-N-Acetylglucosamin-ß(1-4)-galactosyltransferase (EC 2.4.1.22), die Galactose auf N-Acetylglucosamin (GIcNAc) unter Ausbildung einer ß(1-4)-Bindung überträgt, ihre jeweiligen Varianten miteingeschlossen. In der Gegenwart von a-Lactalbumin dient der ß(1 ^-Galactosyltransferase auch Glucose als Akzeptorsubstrat, wodurch die Laclosesynthese katalysiert wird. Examples of membrane-bound gaiactosyltransferases are UDP-galactose: β-galactoside-a (1-3) -ga-lactosyltransferase (EC 2.4.1.151), for which galactose serves as an acceptor substrate with formation of an a (1-3) bond, and UDP- Galactose: ß-N-acetylglucosamine-ß (1-4) -galactosyltransferase (EC 2.4.1.22), which transfers galactose to N-acetylglucosamine (GIcNAc) to form a ß (1-4) bond, including their respective variants. In the presence of a-lactalbumin, the β (1 ^ -galactosyltransferase also serves as glucose as an acceptor substrate, thereby catalyzing the laclos synthesis.

Die am meisten bevorzugte membrangebundene Galactosyltransferase ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, die unter der SEQ ID-Nr. 1 im Sequenzprotokoll angegeben ist. The most preferred membrane bound galactosyltransferase is the enzyme with the amino acid sequence listed under SEQ ID NO. 1 is specified in the sequence listing.

Die membrangebundenen Sialyltransferasen und ihre Varianten, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlich sind, katalysieren die Übertragung von Sialinsäuren (zum Beispiel N-Acetylneur-aminsäure (NeuAc)) von einem aktivierten Donor, üblicherweise einer Cytidinmonophosphatsialinsäure (CMP-SA), auf einen Kohlehydratakzeptorrest. Ein Beispiel einer membrangebundenen Siaiyitransferase, die nach dem erfinderischen Verfahren erhältlich ist, ist CMP-NeuAc: ß-Galactosid-a(2-6)-sialyltrans-ferase (EC 2.4.99.1), die die NeuAc-a(2-6)Gal-ß(1-4)GlcNAc~Sequenz bildet, die in vielen N-gebundenen Kohlehydratgruppen zu finden ist. The membrane-bound sialyltransferases and their variants, which are obtainable by the process according to the invention, catalyze the transfer of sialic acids (for example N-acetylneuraminic acid (NeuAc)) from an activated donor, usually a cytidine monophosphatsialic acid (CMP-SA), to a carbohydrate acceptor residue. An example of a membrane-bound siaiyitransferase which can be obtained by the process according to the invention is CMP-NeuAc: β-galactoside-a (2-6) sialyltransferase (EC 2.4.99.1), which the NeuAc-a (2-6) Gal-β (1-4) GlcNAc ~ sequence that is found in many N-linked carbohydrate groups.

Die am meisten bevorzugte membrangebundene Siaiyitransferase ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID-Nr. 3 angeführt ist. The most preferred membrane-bound siaiyitransferase is the enzyme with the amino acid sequence, which is listed in the sequence listing under SEQ ID no. 3 is listed.

Die membrangebundenen Fucosyltransferasen und ihre Varianten, die nach dem erfinderischen Verfahren erhältlich sind, katalysieren die Übertragung eines Fucoserests von einem aktivierten Donor, üblicherweise einem nucleotidaktivierten Donor wie z.B. Guanosindiphosphatfucose (GDP-Fuc), auf eine Kohlehydratgruppe. Beispiele solcher Fucosyltransferasen sind GDP-Fucose: ß-Galactosid-a(1 ^-fucosyltransferase (EC 2.4.1.69) und GDP-Fucose:N-Acetylamin-a(1-3/4)-fucosyltransferase (EC 2.4.1.65). The membrane-bound fucosyltransferases and their variants, which are obtainable by the inventive method, catalyze the transfer of a fucose residue from an activated donor, usually a nucleotide activated donor such as e.g. Guanosine diphosphate fucose (GDP-Fuc), on a carbohydrate group. Examples of such fucosyltransferases are GDP-fucose: β-galactoside-a (1 ^ -fucosyltransferase (EC 2.4.1.69) and GDP-fucose: N-acetylamine-a (1-3 / 4) -fucosyltransferase (EC 2.4.1.65).

Die am meisten bevorzugte membrangebundene Fucosyltransferase ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID-Nr. 5 angeführt ist. The most preferred membrane-bound fucosyltransferase is the enzyme with the amino acid sequence, which is shown in the sequence listing under SEQ ID no. 5 is listed.

Unter dem Begriff Varianten sind sowohl membrangebundene als auch lösliche Varianten der natürlich vorkommenden membrangebundenen Glycosyltransferasen zu verstehen, mit der Massgabe, dass diese Varianten enzymatisch aktiv sind. Bevorzugt sind beim Menschen vorkommende Varianten. The term variants means both membrane-bound and soluble variants of the naturally occurring membrane-bound glycosyltransferases, with the proviso that these variants are enzymatically active. Variants occurring in humans are preferred.

Zum Beispiel ist der Begriff «Varianten» so zu verstehen, dass er natürlich vorkommende membrangebundene Varianten von membrangebundenen Glycosyltransferasen beinhaltet, die sich innerhalb einer bestimmten Art finden, wie z.B. eine Variante einer Galactosyltransferase, die sich vom Enzym mit der unter SEQ ID-Nr. 1 angegebenen Aminosäuresequenz insofern unterscheidet, als ihr das Serin in der Position 11 fehlt und in den Positionen 31 und 32 Valin und Tyrosin an Stelle von Alanin beziehungsweise Leucin vorkommen. Solch eine Variante kann von einem verwandeten Gen derselben Genfamilie oder von einer allelen Variante eines bestimmten Gens kodiert werden. Der Begriff «Varianten» schliesst auch Glycosyltransferasen mit ein, die von einer in vitro-mutierten DNA produziert werden, solange das von der genannten DNA kodierte Protein die enzymatische Aktivität der nativen Glycosyltransferase aufweist. Solche Modifikationen können in einer Addition, einem Austausch und/oder einer Deletion von Aminosäuren bestehen, wobei im letzteren Fall verkürzte Varianten entstehen. For example, the term "variants" is to be understood to include naturally occurring membrane-bound variants of membrane-bound glycosyltransferases that are found within a certain type, e.g. a variant of a galactosyltransferase, which is derived from the enzyme with the SEQ ID no. 1 given amino acid sequence in that it lacks the serine in position 11 and in positions 31 and 32 valine and tyrosine occur in place of alanine and leucine, respectively. Such a variant can be encoded by a related gene of the same gene family or by an allelic variant of a specific gene. The term “variants” also includes glycosyltransferases that are produced by an in vitro mutated DNA, as long as the protein encoded by said DNA has the enzymatic activity of the native glycosyltransferase. Such modifications can consist of an addition, an exchange and / or a deletion of amino acids, in which case shortened variants arise.

Bevorzugte Varianten, die nach der erfindungsgemässen Methode hergestellt werden, sind verkürzte Varianten, insbesondere lösliche Varianten, d.h. Varianten, die nicht membrangebunden sind. Verkürzte Varianten sind zum Beispiel lösliche Formen von membrangebundenen Glycosyltransferasen und ihren membrangebundenen Varianten, z.B. jene oben genannten Varianten, welche von einem transformierten, im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Hefestamm sezerniert werden können. Gemäss der vorliegenden Erfindung sind diese löslichen Enzyme die bevorzugten verkürzten Varianten. Preferred variants which are produced by the method according to the invention are shortened variants, in particular soluble variants, i.e. Variants that are not membrane-bound. Shortened variants are, for example, soluble forms of membrane-bound glycosyltransferases and their membrane-bound variants, e.g. those variants mentioned above which can be secreted by a transformed yeast strain used in the method according to the invention. According to the present invention, these soluble enzymes are the preferred shortened variants.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer löslichen Variante einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransferase, einer Siaiyitransferase und einer Fucosyltransferase, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter, eine mit diesem Promoter funktionell verbundene DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid The invention also relates to a method for producing a soluble variant of a membrane-bound glycosyltransferase from the group consisting of a galactosyltransferase, a siaiyitransferase and a fucosyltransferase, this method being characterized in that a yeast strain is cultured which is associated with a hybrid vector comprising an expression cassette a promoter, a DNA sequence which is functionally linked to this promoter and which is responsible for a signal peptide

3 3rd

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

kodiert, und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten, für die genannte Variante kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, transformiert wurde, und dass besagte Variante isoliert wird. encoded, and which is connected in the correct reading frame to a second DNA sequence coding for the said variant, and a DNA sequence which contains yeast transcription termination signals has been transformed, and that said variant is isolated.

Die lösliche Form einer Glycosyltransferase ist per definitionem eine verkürzte Variante, die sich von der entsprechenden Form mit der vollen Länge, d.h. der membrangebundenen Form, die sich natürlicherweise im endoplasmatischen Reticulum oder im Golgi-Komplex befindet, durch das Fehlen des cytoplasmatischen Schwanzes, des Signalankers und, gegebenenfalls, eines Teils der Stammregion unterscheidet. Der Begriff «Teil der Stammregion» ist im Zusammenhang mit dem vorliegenden Text so definiert, dass er einen kleineren Teil der N-terminalen Seite der Stammregion bezeichnet und aus bis zu 12 Aminosäuren besteht. Das heisst in anderen Worten, dass die löslichen Varianten, die gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, aus der im wesentlichen ganzen Stammregion und der katalytischen Domäne bestehen. The soluble form of a glycosyltransferase is by definition a shortened variant, which differs from the corresponding form with the full length, i.e. the membrane-bound form, which is naturally found in the endoplasmic reticulum or in the Golgi complex, due to the absence of the cytoplasmic tail, the signal anchor and, if necessary, part of the stem region. The term “part of the stem region” is defined in the context of the present text in such a way that it denotes a smaller part of the N-terminal side of the stem region and consists of up to 12 amino acids. In other words, the soluble variants which are produced according to the present invention consist of the essentially entire stem region and the catalytic domain.

Die löslichen Varianten sind enzymatisch aktive Enzyme, die sich von den jeweiligen Formen mit der vollen Länge dadurch unterscheiden, dass ein NH2-terminales Peptid bestehend aus 26 bis 61 Aminosäuren fehlt, mit der Massgabe, dass bei denjenigen Formen, bei denen ein Teil der Stammregion fehlt, lediglich der oben definierte kleinere Teil dieser Region fehlt. Bevorzugte lösliche Varianten sind diejenigen, die aus den membrangebundenen Glycosyltransferasen erhältlich sind, für die EC-Nummern angegeben sind, und zusätzlich lösliche Varianten, die aus der membrangebundenen Fucosyltransferase mit der SEQ. ID-Nr. 5 erhältlich sind. The soluble variants are enzymatically active enzymes which differ from the respective full-length forms in that an NH2-terminal peptide consisting of 26 to 61 amino acids is missing, with the proviso that those forms in which part of the stem region missing, only the smaller part of this region defined above is missing. Preferred soluble variants are those which are obtainable from the membrane-bound glycosyltransferases for which EC numbers are indicated, and additionally soluble variants which are from the membrane-bound fucosyltransferase with the SEQ. ID no. 5 are available.

Bevorzugte lösliche Varianten der Gaiactosyltransferasen unterscheiden sich von den jeweiligen Formen mit der vollen Länge dadurch, dass ihnen ein NH2-terminales Peptid fehlt, welches aus 37 bis 55, insbesondere 41 bis 44 Aminosäuren besteht. Die am meisten bevorzugte lösliche Variante, die gemäss dem erfinderischen Verfahren hergestellt wird, ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, das unter der SEQ ID-Nr. 2 im Sequenzprotokoll angeführt ist. Preferred soluble variants of the gaiactosyl transferases differ from the respective full-length forms in that they lack an NH2-terminal peptide which consists of 37 to 55, in particular 41 to 44, amino acids. The most preferred soluble variant, which is produced according to the inventive method, is the enzyme with the amino acid sequence, which is under the SEQ ID no. 2 is listed in the sequence listing.

Bevorzugten löslichen Varianten von Sialyltransferasen fehlt verglichen mit den Formen der vollen Länge ein NH2-terminales Peptid, das aus 26 bis 38 Aminosäuren besteht. Die am meisten bevorzugte lösliche Variante, die gemäss dem erfinderischen Verfahren hergestellt wird, ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, das im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID-Nr. 4 angeführt ist. Ebenfalls bevorzugt ist die mit ST(Lys27-Cys406) bezeichnete lösliche Variante, die aus den Aminosäuren 27 bis 406 der in SEQ ID-Nr. 3 angegebenen Aminosäuresequenz besteht. Preferred soluble variants of sialyltransferases lack an NH2-terminal peptide, which consists of 26 to 38 amino acids, compared to the full-length forms. The most preferred soluble variant, which is prepared according to the inventive method, is the enzyme with the amino acid sequence, which is in the sequence listing under SEQ ID no. 4 is listed. Also preferred is the soluble variant designated ST (Lys27-Cys406), which consists of amino acids 27 to 406 of the sequence shown in SEQ ID no. 3 given amino acid sequence exists.

Bevorzugte lösliche Varianten der Fucosyltransferasen unterscheiden sich von den jeweiligen Enzymen mit der vollen Länge dadurch, dass ihnen ein NH2-terminales Peptid fehlt, das aus 56 bis 67, insbesondere 56 bis 61 Aminosäuren besteht. Besonders bevorzugt ist die mit FT(Arg62-Arg4os) bezeichnete lösliche Variante, die aus den Aminosäuren 62 bis 405 der in SEQ ID-Nr. 5 angeführten Aminosäuresequenz besteht. Preferred soluble variants of the fucosyltransferases differ from the respective full-length enzymes in that they lack an NH2-terminal peptide which consists of 56 to 67, in particular 56 to 61, amino acids. Particularly preferred is the soluble variant designated FT (Arg62-Arg4os), which consists of amino acids 62 to 405 of the sequence shown in SEQ ID no. 5 amino acid sequence listed exists.

Die Hefe-Wirtsstämme und die Bestandteile der Hybridvektoren sind die unten angegebenen. The yeast host strains and the components of the hybrid vectors are those given below.

Die transformierten Hefestämme werden nach Methoden gezüchtet, die dem Fachmann bekannt sind. The transformed yeast strains are grown using methods known to those skilled in the art.

So werden die erfindungsgemässen transformierten Hefestämme in einem Flüssigmedium gezüchtet, das assimilierbare Quellen an Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen enthält. Thus the transformed yeast strains according to the invention are grown in a liquid medium which contains assimilable sources of carbon, nitrogen and mineral salts.

Eine Reihe von Kohlenstoffquellen können verwendet werden. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Maltose, Mannit, Fructose oder Lactose, oder ein Acetat wie Natriumacetat, welche entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Zu den geeigneten Stickstoffquellen gehören zum Beispiel Aminosäuren wie Casa-minosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, weiterhin Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, ebenso Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Zu den anorganischen Salzen, die verwendet werden können, zählen zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Kalziumsulfate, -Chloride, -phosphate und -carbonate. Das Nährmedium kann zusätzlich auch wachstumsfördernde Substanzen enthalten. Zu den wachstumsfördernden Substanzen zählen zum Beispiel Spurenelemente wie Eisen, Zink, Mangan u.ä., oder einzelne Aminosäuren. A number of carbon sources can be used. Examples of preferred carbon sources are assimilable carbohydrates such as e.g. Glucose, maltose, mannitol, fructose or lactose, or an acetate such as sodium acetate, which can be used either alone or in suitable mixtures. Suitable nitrogen sources include, for example, amino acids such as casamino acids, peptides and proteins and their breakdown products such as trypton, peptone or meat extracts, furthermore yeast extract, malt extract, corn steep liquor, as well as ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate or ammonium nitrate, which are used either alone or in suitable mixtures can be. The inorganic salts that can be used include, for example, sodium, potassium, magnesium and calcium sulfates, chlorides, phosphates and carbonates. The nutrient medium can also contain growth-promoting substances. The growth-promoting substances include, for example, trace elements such as iron, zinc, manganese and the like, or individual amino acids.

Wegen der Inkompatibilität zwischen der endogenen zwei-Mikron-DNA und Hybridvektoren mit deren Replicon zeigen Hefezellen, die mit solchen Hybridvektoren transformiert wurden, eine Tendenz, diese zu verlieren. Solche Hefezellen müssen unter selektiven Bedingungen gezüchtet werden, d.h. Bedingungen, unter welchen die Expression eines plasmidkodierten Gens für das Wachstum erforderlich ist. Die meisten derzeit verwendeten selektiven und in den erfindungsgemässen Hybridvektoren vorkommenenden (siehe unten) Marker sind Gene, die Enzyme für die Aminosäure- oder Purinbiosynthese kodieren. Daher müssen synthetische Minimalmedien, in denen die jeweilige Aminosäure oder Purinbase fehlt, verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, Gene zu verwenden, die Resistenz gegen ein geeignetes Biocid verleihen [z.B. ein Gen, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G418 verleiht]. Hefezellen, die mit Vektoren transformiert wurden, die Gene für Antibiotika-Resistenz enthalten, werden in komplexen Medien gezüchtet, die das jeweilige Antibiotikum enthalten, wodurch höhere Wachstumsraten und grössere Zelldichte erreicht werden. Because of the incompatibility between the endogenous two micron DNA and hybrid vectors with their replicon, yeast cells transformed with such hybrid vectors show a tendency to lose them. Such yeast cells must be grown under selective conditions, i.e. Conditions under which expression of a plasmid-encoded gene is required for growth. Most of the currently used selective markers which are present in the hybrid vectors according to the invention (see below) are genes which code for enzymes for amino acid or purine biosynthesis. Therefore minimal synthetic media, in which the respective amino acid or purine base is missing, must be used. However, it is also possible to use genes that confer resistance to a suitable biocid [e.g. a gene that confers resistance to the aminoglycoside G418]. Yeast cells transformed with vectors containing genes for antibiotic resistance are grown in complex media that contain the respective antibiotic, resulting in higher growth rates and higher cell density.

Hybridvektoren, die die vollständige zwei-Mikron-DNA (inklusive einer funktionellen Replikations-Start-stelle) enthalten, bleiben stabil innerhalb von Saccharomvces cerevisiae-Stämmen erhalten, denen Hybrid vectors containing the complete two micron DNA (including a functional replication start site) remain stable within Saccharomvces cerevisiae strains, which

4 4th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

endogene zwei-Mikron-Plasmide fehlen (sogenannte cir°-Stämme), so dass sie unter nicht selektiven Wachstumsbedingungen gezüchtet werden können, d.h. in einem komplexen Medium. endogenous two-micron plasmids are missing (so-called cir ° strains), so that they can be grown under non-selective growth conditions, i.e. in a complex medium.

Hefezellen, die Hybridplasmide mit einem konstitutiven Promoter enthalten, exprimieren die DNA, die für eine vom obengenannten Promoter kontrollierte Glycosyltransferase, oder eine Variante davon kodiert, ohne Induktion. Wenn jedoch die obengenannte DNA von einem regulierten Promoter kontrolliert wird, muss die Zusammensetzung des Kulturmediums geändert werden, um ein Maximum an mRNA-Transkripten zu erhalten, so muss beispielsweise, wenn der PH05-Promoter verwendet wird, die Konzentration an anorganischem Phosphat im Kulturmedium niedrig sein, um diesen Promoter zu derepri-mieren. Yeast cells which contain hybrid plasmids with a constitutive promoter express the DNA which codes for a glycosyltransferase controlled by the abovementioned promoter, or a variant thereof, without induction. However, if the above-mentioned DNA is controlled by a regulated promoter, the composition of the culture medium must be changed in order to obtain a maximum of mRNA transcripts, for example, when the PH05 promoter is used, the concentration of inorganic phosphate in the culture medium must be low to dereprize this promoter.

Die Züchtung erfolgt mittels üblicher Techniken. Die Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH des Mediums und Fermentationszeit, werden so gewählt, dass ein Maximum an heterologem Protein produziert wird. Ein ausgewählter Hefestamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in einer Sub-merskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von ca. 25° bis 35°C, vorzugsweise bei ca. 28°C, und bei einem pH von 4 bis 7, z.B. ungefähr pH 5, mindestens 1 bis 3 Tage gezüchtet, vorzugsweise so lange wie zufriedenstellende Proteinausbeuten erhalten werden. Breeding is carried out using conventional techniques. The breeding conditions such as temperature, pH of the medium and fermentation time are chosen so that a maximum of heterologous protein is produced. A selected yeast strain is preferably grown under aerobic conditions in a submerged culture with shaking or stirring at a temperature of about 25 ° to 35 ° C, preferably at about 28 ° C, and at a pH of 4 to 7, e.g. approximately pH 5, cultured for at least 1 to 3 days, preferably as long as satisfactory protein yields are obtained.

Nach ihrer Expression in Hefe wird die membrangebundene Glycosyltransferase oder ihre Variante entweder innerhalb der Zellen angereichert oder in das Kulturmedium sezerniert und auf konventionellem Weg isoliert. After its expression in yeast, the membrane-bound glycosyltransferase or its variant is either enriched within the cells or secreted into the culture medium and isolated in a conventional manner.

Beispielsweise besteht der erste Schritt üblicherweise darin, dass die Zellen durch Zentrifugieren von der Kulturflüssigkeit abgetrennt werden. Hat sich die membrangebundene Glycosyltransferase oder ihre Variante innerhalb der Zellen angereichert, muss das Protein aus dem Zellinneren durch Zellaufschluss freigesetzt werden. Hefezellen können auf verschiedenen Wegen, die dem Fachmann geläufig sind, aufgeschlossen werden: z.B. durch Ausübung mechanischer Kräfte wie Schütteln mit Glasperlen, durch Ultraschallvibration, osmotischen Schock und/oder durch enzymatische Verdauung der Zellwand. Ist die gewünschte membrangebundene Glycosyltransferase oder ihre Variante an eine Membranfraktion assoziiert oder gebunden, kann eine weitere Anreicherung z.B. dadurch erreicht werden, dass der Zellextrakt einer differentiellen Zentrifugation unterworfen wird, und die jeweilige Fraktion gegebenenfalls anschliessend mit einem Detergenz wie z.B. Triton behandelt wird. Zu den für die Reinigung der «Roh»glycosyltransferase, oder deren Variante geeigneten Methoden zählen die üblichen chromatographischen Verfahren wie Affinitätschromatographie, zum Beispiel mit einem geeigneten Substrat, mit Antikörpern oder mit Concanavalin A, lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Verteilungschromatographie, HPLC, Elektrophorese, Fällungsschritte wie die Ammoniumsulfatfällung, und andere Verfahren, insbesondere die aus der Literatur bekannten Verfahren. For example, the first step usually consists in separating the cells from the culture liquid by centrifugation. If the membrane-bound glycosyltransferase or its variant has accumulated within the cells, the protein must be released from the cell interior by cell disruption. Yeast cells can be disrupted in various ways that are known to those skilled in the art: e.g. by exerting mechanical forces such as shaking with glass beads, by ultrasonic vibration, osmotic shock and / or by enzymatic digestion of the cell wall. If the desired membrane-bound glycosyltransferase or its variant is associated or bound to a membrane fraction, further enrichment e.g. can be achieved by subjecting the cell extract to a differential centrifugation and, if appropriate, then the respective fraction subsequently with a detergent such as e.g. Triton is being treated. The methods suitable for the purification of the "raw" glycosyltransferase, or its variant, include the usual chromatographic methods such as affinity chromatography, for example with a suitable substrate, with antibodies or with Concanavalin A, ion exchange chromatography, gel filtration, partition chromatography, HPLC, electrophoresis, precipitation steps such as ammonium sulfate precipitation, and other processes, in particular the processes known from the literature.

Wird die Glycosyltransferase oder ihre Variante von der Hefezelle in den periplasmatischen Raum sezerniert werden, kann ein vereinfachtes Isolierungsprotokoll verwendet werden: das Protein wird ohne Zell-Lyse durch enzymatische Entfernung der Zellwand oder durch Chemikalien, z.B. Thiol-Reagenzien oder EDTA, welche Zellwandschäden induzieren und so die Freisetzung der produzierten Glycosyltransferase ermöglichen, gewonnen. Wird die Glycosyltransferase, oder die Variante, in die Kulturflüssigkeit sezerniert, kann sie direkt daraus gewonnen und mittels der obengenannten Methoden gereinigt werden. If the glycosyltransferase or its variant is secreted from the yeast cell into the periplasmic space, a simplified isolation protocol can be used: the protein is removed without cell lysis by enzymatic removal of the cell wall or by chemicals, e.g. Thiol reagents or EDTA, which induce cell wall damage and thus enable the release of the glycosyltransferase produced, are obtained. If the glycosyltransferase, or the variant, is secreted into the culture liquid, it can be obtained directly therefrom and purified using the methods mentioned above.

Zum Nachweis von Glycosyltransferase-Aktivität können literaturbekannte Tests verwendet werden. Galactosyltransferaseaktivität kann z.B. dadurch bestimmt werden, dass die Menge an radioaktiv markierter Galactose, die in ein geeignetes Akzeptormolekül wie ein Glycoprotein oder einen freien Zuckerrest eingebaut wird, gemessen wird. Auf analoge Weise kann Sialyltransferaseaktivität dadurch getestet werden, dass z.B. Sialinsäure in geeignete Substrate eingebaut wird, und Fucosyltransferase-Aktivität kann durch die Übertragung von Fucose auf einen geeigneten Akzeptor getestet werden. Tests known from the literature can be used to detect glycosyltransferase activity. Galactosyltransferase activity can e.g. be determined by measuring the amount of radiolabelled galactose that is incorporated into a suitable acceptor molecule such as a glycoprotein or a free sugar residue. Analogously, sialyltransferase activity can be tested by e.g. Sialic acid is incorporated into suitable substrates, and fucosyltransferase activity can be tested by transferring fucose to a suitable acceptor.

Die erfindungsgemässen transformierten Hefe-Wirtszellen können unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken nach den folgenden Schritten hergestellt werden: The transformed yeast host cells according to the invention can be produced using recombinant DNA techniques according to the following steps:

- Herstellung eines Hybridvektors, der einen Hefe-Promoter und eine für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierende DNA-Sequenz umfasst, wobei diese DNA-Sequenz von besagtem Promoter kontrolliert wird, Production of a hybrid vector comprising a yeast promoter and a DNA sequence coding for a membrane-bound glycosyltransferase or its variant, this DNA sequence being controlled by said promoter,

- Transformation eines Hefe-Wirtsstamms mit dem genannten Hybridvektor, - transformation of a yeast host strain with said hybrid vector,

- und Selektion der transformierten Hefezellen von den untransformierten Hefezellen. - and selection of the transformed yeast cells from the untransformed yeast cells.

Expressionsvektoren Expression vectors

Der erfindungsgemässe Hefe-Hybridvektor enthält eine Expressionskassette, die einen Hefe-Promoter und eine für die membrangebundene Glycosyltransferase oder eine Variante davon kodierende DNA-Sequenz umfasst, wobei diese DNA-Sequenz von besagtem Promoter kontrolliert wird. The yeast hybrid vector according to the invention contains an expression cassette which comprises a yeast promoter and a DNA sequence coding for the membrane-bound glycosyltransferase or a variant thereof, this DNA sequence being controlled by said promoter.

In einer ersten Ausführungsform enthält der erfindungsgemässe Hefe-Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefe-Promoter, einer für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodierende DNA-Sequenz, wobei diese DNA-Sequenz vom genannten Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, umfasst. In a first embodiment, the yeast hybrid vector according to the invention contains an expression cassette which contains a yeast promoter, a DNA sequence coding for a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants, this DNA sequence being controlled by the promoter mentioned, and a DNA sequence, which contains yeast transcription termination signals.

In einer zweiten Ausführungsform enthält der erfindungsgemässe Hefe-Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefe-Promoter, der funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, In a second embodiment, the yeast hybrid vector according to the invention contains an expression cassette which contains a yeast promoter which is functionally linked to a first DNA sequence.

5 5

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

die für ein Signalpeptid kodiert, und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine Variante davon kodiert, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, umfasst. which encodes a signal peptide and which is linked in the correct reading frame to a second DNA sequence which codes for a membrane-bound glycosyltransferase or a variant thereof and which comprises a DNA sequence which contains yeast transcription termination signals.

Der Hefe-Promoter ist ein regulierter (induzierbarer) oder konstitutiver Promoter, der vorzugsweise von einem hochexprimierten Hefegen, insbesondere einem Saccharomvces cerevisiae-Gen stammt. So können die Promoter des TRP1-Gens. des ADHI- oder ADHII-Gens. des Saure-Phosphatase (PH051-Gens, ein Promoter der Hefe-Paarungspheromongene, die für den a- oder a-Faktor kodieren, oder ein Promoter aus einem für ein giycolytisches Enzym kodierenden Gen, wie der Promoter der Enolase-, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP)-. 3-Phosphoglyceratkinase (PGKK Hexokinase-, Py-ruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- oder Glucokinase-Gene verwendet werden. Weiterhin ist es möglich, Hybridpromoter enthaltend «upstream activation sequences» (UAS) von einem Hefegen und «downstream promoter elements» mit einer funktionellen «TATA-Box» eines anderen Hefegens zu verwenden, zum Beispiel einen Hybridpromoter mit den UAS des Hefe-PH05-Gens und «downstream promoter elements» mit einer funktionellen «TATA-Box» des Hefe-GAP-Gens (PH05-GAP-Hvbrid promoter). Ein bevorzugter Promoter ist der Promoter des GAP-Gens, insbesondere dessen funktionelle Fragmente, die bei Nucleotiden zwischen den Positionen -550 und -180, insbesondere bei Nucleotid -540, -263 oder -198, beginnen und bei Nucleotid -5 des GAP-Gens enden. Ein weiterer bevorzugter Promoter des regulierten Typs ist der PH05-Promoter. Ein bevorzugter konstitutiver Promoter ist ein verkürzter Saure-Phosphatase-PH05-Promoter. dem die «upstream regulatory elements» (UAS) fehlen, ebenso wie das PH05M73)-Promoter-Element, das bei Nucleotid -173 des PH05-Gens beginnt und bei Nucleotid -9 dieses Gens endet. The yeast promoter is a regulated (inducible) or constitutive promoter, which is preferably derived from a highly expressed yeast gene, in particular a Saccharomvces cerevisiae gene. So the promoters of the TRP1 gene. of the ADHI or ADHII gene. of the acid phosphatase (PH051 gene, a promoter of the yeast mating pheromone genes which code for the a or a factor, or a promoter of a gene coding for a glycolytic enzyme, such as the promoter of the enolase, glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase (GAP) -. 3-phosphoglycerate kinase (PGKK hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose 6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triophosphate isomerase, or gene glucose isase is used further it is possible to use hybrid promoters containing “upstream activation sequences” (UAS) from a yeast gene and “downstream promoter elements” with a functional “TATA box” of another yeast gene, for example a hybrid promoter with the UAS of the yeast PH05 gene and “downstream promoter elements” with a functional “TATA box” of the yeast GAP gene (PH05-GAP hybrid promoter) A preferred promoter is the promoter of the GAP gene, in particular whose functional fragments begin with nucleotides between positions -550 and -180, in particular with nucleotide -540, -263 or -198, and end with nucleotide -5 of the GAP gene. Another preferred promoter of the regulated type is the PH05 promoter. A preferred constitutive promoter is a truncated acid phosphatase PH05 promoter. which lack the upstream regulatory elements (UAS), as well as the PH05M73) promoter element, which begins at nucleotide -173 of the PH05 gene and ends at nucleotide -9 of this gene.

Die ein Signalpeptid («signal sequence») kodierende DNA-Sequenz stammt vorzugsweise aus einem Hefegen, das für ein Polypeptid kodiert, welches normalerweise sezerniert wird. Andere Signalsequenzen heterologer Proteine, die normalerweise sezerniert werden, können ebenfalls gewählt werden. Hefe-Signalsequenzen sind beispielsweise die Signal- und Prepro-Sequenzen des Hefe-Invertase-Gens, a-Faktor-Gens, pheromone Peptidase (KEXI)-Gens, «Killer toxin»-Gens und des reprimierbaren Saure-Phosphatase (PH05)-Gens. und die Glucoamylase-Signalsequenz aus Aspergillus awamori. Alternativ können kombinierte Signalsequenzen dadurch konstruiert werden, dass ein Teil der Signalsequenz (falls vorhanden) des mit dem verwendeten Promoter auf natürlichem Weg verbundenen Gens (zum Beispiel PH05) mit einem Teil der Signaisequenz eines anderen heterologen Proteins ligiert wird. Bevorzugte Kombinationen sind solche, die präzises Schneiden zwischen der Signalsequenz und der Glycosyltransferase-Aminosäu-resequenz erlauben. Zusätzliche Sequenzen wie Pro- oder Spacer-Sequenzen mit oder ohne spezielle Processing-Signale können ebenfalls in die Konstruktionen miteinbezogen werden, um genaues Processing von Vorläufermoleküien zu ermöglichen. Es ist jedoch auch möglich, Fusionsproteine mit internen Processing-Signalen herzustellen, die das Reifen in vivo oder in vitro ermöglichen. Zum Beispiel enthalten die Processing-Signale Lys-Arg, das von einer Hefe-Endopeptidase in den Golgi-Membranen erkannt wird. Die gemäss der vorliegenden Erfindung bevorzugte Signalsequenz ist die des Hefe-Invertase-Gens. The DNA sequence encoding a signal peptide ("signal sequence") preferably originates from a yeast gene which codes for a polypeptide which is normally secreted. Other signal sequences of heterologous proteins that are normally secreted can also be chosen. Yeast signal sequences are, for example, the signal and prepro sequences of the yeast invertase gene, a-factor gene, pheromone peptidase (KEXI) gene, “killer toxin” gene and the repressible acid phosphatase (PH05) gene . and the Aspergillus awamori glucoamylase signal sequence. Alternatively, combined signal sequences can be constructed by ligating part of the signal sequence (if present) of the gene naturally associated with the promoter used (for example PH05) with part of the signal sequence of another heterologous protein. Preferred combinations are those that allow precise cutting between the signal sequence and the glycosyltransferase amino acid sequence. Additional sequences such as pro- or spacer sequences with or without special processing signals can also be included in the constructions in order to enable precise processing of precursor molecules. However, it is also possible to produce fusion proteins with internal processing signals that enable maturation in vivo or in vitro. For example, the processing signals contain Lys-Arg, which is recognized by a yeast endopeptidase in the Golgi membranes. The preferred signal sequence according to the present invention is that of the yeast invertase gene.

Wenn eine Glycosyltransferase mit der vollen Länge oder eine ihrer membrangebundenen Varianten in Hefe exprimiert wird, enthält der bevorzugte Hefehybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefepromoter, eine für die genannte Glycosyltransferase oder Variante kodierende DNA-Sequenz, die vom genannten Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminations-signale enthält, umfasst. When a full length glycosyltransferase or one of its membrane bound variants is expressed in yeast, the preferred yeast hybrid vector contains an expression cassette which contains a yeast promoter, a DNA sequence coding for said glycosyltransferase or variant and controlled by said promoter, and a DNA Sequence comprising yeast transcription termination signals.

Wird eine lösliche Variante einer Glycosyltransferase in Hefe exprimiert, so enthält der bevorzugte Hefe-Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefepromoter, der funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die für die genannte Variante kodiert, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, umfasst. If a soluble variant of a glycosyltransferase is expressed in yeast, the preferred yeast hybrid vector contains an expression cassette which contains a yeast promoter which is functionally linked to a first DNA sequence which codes for a signal peptide and which is in the correct reading frame with a second DNA Sequence is connected, which codes for the variant mentioned, and comprises a DNA sequence which contains yeast transcription termination signals.

DNA, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, kann mittels dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden und enthält genomische DNA, z.B. DNA, die aus einer genomischen DNA-Bibliothek von Säugetieren, z.B. Ratten-, Mäuse- und Rinderzellen oder menschlichen Zellen, isoliert wurde. Falls erforderlich, werden die Introns, die in der genomischen DNA, die für das Enzym kodiert, vorkommen, entfernt. Eine für eine membrangebundene Glycosyltranferase oder eine ihrer Varianten kodierende DNA umfasst auch cDNA, die aus einer Säugetier-cDNA-Bibliothek isoliert oder aus der entsprechenden mRNA hergestellt werden kann. Die cDNA-Bibliothek kann aus Zellen verschiedener Gewebe, z.B. Plazentazellen oder Leberzellen, stammen. Die cDNA wird über die mRNA mittels üblicher Methoden wie der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt. DNA encoding a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants can be produced by methods known to those skilled in the art and contains genomic DNA, e.g. DNA derived from a mammalian genomic DNA library, e.g. Rat, mouse and bovine or human cells. If necessary, the introns that occur in the genomic DNA encoding the enzyme are removed. A DNA coding for a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants also comprises cDNA which can be isolated from a mammalian cDNA library or prepared from the corresponding mRNA. The cDNA library can be made from cells of different tissues, e.g. Placental cells or liver cells. The cDNA is produced via the mRNA using customary methods such as the polymerase chain reaction (PCR).

Zum Beispiel erfolgt die Isolierung von Poly(A)+RNA aus Säugetierzellen, z.B. HeLa-Zellen, und die anschliessende Synthese des ersten Stranges der cDNA nach der Fachwelt bekannten Standardmethoden. Von dieser synthetisierten DNA-Matrize ausgehend kann mittels PCR die Zielsequenz, d.h. die Glycosyltransferase-DNA oder eines ihrer Fragmente, amplifiziert werden, während die Amplifizierung der im Überschuss vorliegenden unerwünschten Sequenzen minimiert wird. Zu diesem Zweck muss die Sequenz eines kleinen Nucleotidabschnittes beidseitig der Zielsequenz bekannt sein. Mit diesen flankierenden Sequenzen werden zwei synthetische einzelsträngige Primer-Oligonucleotide aufgebaut, deren Sequenz so gewählt wird, dass die Basen zu der jeweiligen flankierenden Sequenz komplementär sind. For example, poly (A) + RNA is isolated from mammalian cells, e.g. HeLa cells, and the subsequent synthesis of the first strand of the cDNA according to standard methods known in the art. Starting from this synthesized DNA template, the target sequence, i.e. the glycosyltransferase DNA, or one of its fragments, is amplified while minimizing the amplification of the excess undesirable sequences. For this purpose the sequence of a small nucleotide section on both sides of the target sequence must be known. These flanking sequences are used to build up two synthetic single-stranded primer oligonucleotides, the sequence of which is chosen such that the bases are complementary to the flanking sequence in question.

6 6

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

PCR beginnt mit der Denaturierung des mRNA-DNA-Hybridstranges, darauf folgt die Anlagerung des Primers an die die Zielsequenz flankierenden Sequenzen. Durch Zusatz einer DNA-Polymerase und von Deoxynucieosid-Triphosphaten werden zwei Stücke Doppelstrang-DNA gebildet, wobei jedes beim Primer beginnt und sich über die Zielsequenz erstreckt, wobei letztere kopiert wird. Jedes der neu synthetisierten Produkte kann als Matrize für das Anheften von Primern und für Verlängerungen (im nächsten Zyklus) verwendet werden, wodurch dies zu einem exponentiellen Anstieg an doppelsträngigen Fragmenten diskreter Länge führt. PCR begins with the denaturation of the mRNA-DNA hybrid strand, followed by the attachment of the primer to the sequences flanking the target sequence. By adding a DNA polymerase and deoxynucieoside triphosphates, two pieces of double-stranded DNA are formed, each beginning with the primer and extending over the target sequence, the latter being copied. Each of the newly synthesized products can be used as a template for primer attachment and extensions (in the next cycle), resulting in an exponential increase in double-stranded fragments of discrete length.

Darüberhinaus kann eine DNA, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, enzymatisch oder chemisch synthetisiert werden. Eine Variante einer membrangebundenen Glycosyltransferase mit enzymatischer Aktivität und einer Aminosäuresequenz, in der eine oder mehrere Aminosäuren deletiert (DNA-Fragmente) und/oder gegen eine oder mehrere andere Aminosäuren ausgetauscht werden, wird von einer DNA-Mutante kodiert. Unter einer mutierten DNA ist auch eine stille Mutante zu verstehen, in der ein oder mehrere Nucleotide durch andere Nucleotide ersetzt werden, wobei die neuen Codons für dieselbe(n) Aminosäure(n) kodieren. Solch eine mutierte Sequenz kann auch eine degenerierte DNA-Sequenz sein. Letztere sind insofern bezüglich des genetischen Codes degeneriert, als eine unbegrenzte Anzahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt werden kann, ohne dass dies eine Änderung der anfänglich kodierten Aminosäuresequenz bedeutet. Solche degenerierten DNA-Sequenzen können von Nutzen sein, da sie über unterschiedliche Restriktionsstellen und/oder Häufigkeiten gewisser Codons verfügen, die von einem spezifischen Wert für die optimale Expression einer Glycosyltransferase bevorzugt werden. Solche DNA-Sequenzen haben vorzugsweise Codons, wie sie vorzugsweise von Hefe verwendet werden. In addition, a DNA encoding a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants can be synthesized enzymatically or chemically. A variant of a membrane-bound glycosyltransferase with enzymatic activity and an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted (DNA fragments) and / or exchanged for one or more other amino acids is encoded by a DNA mutant. A mutated DNA is also to be understood as a silent mutant in which one or more nucleotides are replaced by other nucleotides, the new codons coding for the same amino acid (s). Such a mutated sequence can also be a degenerate DNA sequence. The latter are degenerate in genetic code in that an unlimited number of nucleotides can be replaced by other nucleotides without changing the initially encoded amino acid sequence. Such degenerate DNA sequences can be useful because they have different restriction sites and / or frequencies of certain codons that are preferred by a specific value for optimal expression of a glycosyltransferase. Such DNA sequences preferably have codons, as are preferably used by yeast.

Eine DNA-Mutante kann auch dadurch erhalten werden, dass eine natürlich vorkommende genomische DNA oder eine cDNA nach der Fachwelt bekannten Methoden in vitro mutiert wird. Zum Beispiel kann aus einer für die jeweilige membrangebundene Glycosyltransferase kodierende DNA mit der vollen Länge eine Teil-DNA, die für eine lösliche Form einer Glycosyltransferase kodiert, unter Verwendung von Restriktionsenzymen herausgeschnitten werden. Für diesen Zweck ist es von Vorteil, wenn eine geeignete Restriktionsstelle zur Verfügung steht. A DNA mutant can also be obtained by mutating a naturally occurring genomic DNA or a cDNA in vitro according to methods known in the art. For example, from a full-length DNA encoding the particular membrane-bound glycosyltransferase, a partial DNA encoding a soluble form of a glycosyltransferase can be excised using restriction enzymes. For this purpose it is advantageous if a suitable restriction site is available.

Eine bevorzugte DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, ist die 3'-flankie-rende Sequenz eines Hefegens, das korrekte Signale für Transkriptionstermination und die Polyadenyla-tion enthält. Geeignete 3-flankierende Sequenzen sind z.B. die Sequenzen des Hefegens, die natürlicherweise mit dem verwendeten Promoter verbunden sind. Die bevorzugte flankierende Sequenz ist die des Hefe-PH05-Gens. A preferred DNA sequence that contains yeast transcription termination signals is the 3 'flanking sequence of a yeast gene that contains correct signals for transcription termination and polyadenyla- tion. Suitable 3-flanking sequences are e.g. the sequences of the yeast gene which are naturally linked to the promoter used. The preferred flanking sequence is that of the yeast PH05 gene.

Der Hefepromoter, die gegebenenfalls vorhandene DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, die DNA-Sequenz, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, und die DNA-Sequenz, die die Hefe-Transkriplionsterminationssignale enthält, sind funktionell in einer Tandemanordnung verbunden, d.h. sie sind auf solche Weise nebeneinandergesetzt, dass ihre normalen Funktionen erhalten bleiben. Sie sind so angeordnet, dass der Promoter eine richtige Expression der DNA-Sequenz, die eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, bewirkt (gegebenenfalls mit einer vorgeschalteten Signalsequenz), dass die Transkriptionstermina-tionssignale eine richtige Termination der Transkription und der Polyadenylation bewirken, und dass die gegebenenfalls vorhandene Signalsequenz im richtigen Leseraster mit der obengenannten DNA-Sequenz in solch einer Weise verbunden ist, dass das letzte Codon der Signalsequenz direkt mit dem ersten Codon der genannten DNA-Sequenz verbunden ist und das Protein sezerniert wird. Wenn der Promoter und die Signalsequenz von verschiedenen Genen stammen, wird der Promoter vorzugsweise an die Signalsequenz an einer Stelle zwischen dem mRNA-Hauptbeginn und dem ATG des mit dem Promoter natürlich verbundenen Gens angefügt. Die Signalsequenz sollte ihr eigenes ATG für die Translationsinitiation besitzen. Diese Sequenzen können mittels synthetischer Oligodeoxynucleotid-Linker mit der Erkennungssequenz einer Endonuclease zusammengefügt werden. The yeast promoter, the optional DNA sequence encoding the signal peptide, the DNA sequence encoding a membrane bound glycosyltransferase or one of its variants, and the DNA sequence containing the yeast transcription termination signals are functional in a tandem arrangement connected, ie they are placed side by side in such a way that their normal functions are retained. They are arranged in such a way that the promoter effects correct expression of the DNA sequence encoding a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants (if appropriate with an upstream signal sequence), that the transcription termination signals bring about a correct termination of the transcription and the polyadenylation, and that the optionally present signal sequence is connected in the correct reading frame to the above-mentioned DNA sequence in such a way that the last codon of the signal sequence is connected directly to the first codon of the said DNA sequence and the protein is secreted. If the promoter and the signal sequence are from different genes, the promoter is preferably added to the signal sequence at a location between the main mRNA start and the ATG of the gene naturally associated with the promoter. The signal sequence should have its own ATG for translation initiation. These sequences can be combined with the recognition sequence of an endonuclease by means of synthetic oligodeoxynucleotide linkers.

Vektoren, die für die Replikation und Expression in Hefe geeignet sind, enthalten eine Hefe-Repükati-onsstartstelle. Hybridvektoren, die eine Hefe-Replikationsstartstelle enthalten, zum Beispiel das chromosomale autonom replizierende Segment (ARS), bleiben nach der Transformation extrachromosomal in der Hefezelle und werden während der Mitose autonom repliziert. Hybridvektoren, die Sequenzen enthalten, die mit der Hefe-2|i-Plasmid-DNA homolog sind, können ebenfalls verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination in 2p.-Plasmide integriert, die bereits in der Zelle existieren, oder sie replizieren autonom. Vectors suitable for replication and expression in yeast contain a yeast repositioning start site. Hybrid vectors containing a yeast replication start site, for example the chromosomal autonomously replicating segment (ARS), remain extrachromosomally in the yeast cell after transformation and are replicated autonomously during mitosis. Hybrid vectors containing sequences homologous to yeast 2 | i plasmid DNA can also be used. Such hybrid vectors are integrated by recombination into 2p. Plasmids that already exist in the cell, or they replicate autonomously.

Die erfindungsgemässen Hybridvektoren enthalten vorzugsweise einen oder mehrere, insbesondere einen oder zwei selektive genetische Marker für Hefe und solch einen Marker und eine Replikations-startstelle für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli. The hybrid vectors according to the invention preferably contain one or more, in particular one or two, selective genetic markers for yeast and such a marker and a start of replication for a bacterial host, in particular Escherichia coli.

Was die selektiven Gen-Marker für Hefe betrifft, so können sämtliche Markergene verwendet werden, die die Selektion auf Transformanten auf Grund der phenotypischen Expression des Markergens ermöglichen. Beispiele geeigneter Marker für Hefe sind diejenigen, die Resistenz gegen Antibiotika expri-mieren oder, im Fall auxotropher Hefemutanten, Gene, die Defizienzen des Wirts kompensieren. Die betreffenden Gene verleihen zum Beispiel Resistenz gegen die Antibiotika G418, Hygromycin oder Bleomycin, oder vermittein Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, zum Beispiel das URA3-. I FU?-. I.YS2- oder TRP1 Gen. As far as the selective gene markers for yeast are concerned, all marker genes can be used which enable selection for transformants on the basis of the phenotypic expression of the marker gene. Examples of suitable markers for yeast are those which express resistance to antibiotics or, in the case of auxotrophic yeast mutants, genes which compensate for deficiencies in the host. The genes in question confer resistance, for example, to the antibiotics G418, hygromycin or bleomycin, or mean prototrophy in an auxotrophic yeast mutant, for example the URA3-. I FU? -. I.YS2 or TRP1 gen.

7 7

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Da die Amplifizierung der Hybridvektoren auf bequemem Weg in E. coli durchgeführt werden kann, ist es vorteilhaft, einen genetischen Marker für E. coli und eine E. coli-Repiikationsstartstelle einzubauen. Diese können aus E. coli-Plasmiden wie z.B. pBR322, oder einem pUC-Plasmid, zum Beispiel pUC18 oder pUC19, erhalten werden, welche sowohl eine E. coli-Replikationsstartstelle und einen genetischen Marker für E. coli, der Resistenz gegen Antibiotika wie Ampicillin verleiht, enthalten. Since the amplification of the hybrid vectors can be carried out conveniently in E. coli, it is advantageous to incorporate a genetic marker for E. coli and an E. coli repeat site. These can be derived from E. coli plasmids such as e.g. pBR322, or a pUC plasmid, for example pUC18 or pUC19, can be obtained which contain both an E. coli replication start site and a genetic marker for E. coli which confers resistance to antibiotics such as ampicillin.

Die erfindungsgemässen Hybridvektoren werden mittels der Fachwelt bekannten Methoden hergestellt, zum Beispiel dadurch, dass die Expressionskassette umfassend einen Hefe-Promoter und eine für eine Glycosyltransferase, oder eine Variante, kodierende DNA-Sequenz, die vom genannten Promoter kontrolliert wird, beziehungsweise mehrere Komponenten der Expressionskassette, mit den DNA-Fragmenten, die selektive genetische Marker für Hefe und für einen bakteriellen Wirt und Replikations-startsteilen für Hefe und für einen bakteriellen Wirt enthalten, in der vorherbestimmten Reihenfolge verbunden werden. The hybrid vectors according to the invention are produced by methods known to those skilled in the art, for example by the expression cassette comprising a yeast promoter and a DNA sequence coding for a glycosyltransferase, or a variant, which is controlled by the promoter mentioned, or several components of the expression cassette , with the DNA fragments containing selective genetic markers for yeast and for a bacterial host and replication starting parts for yeast and for a bacterial host, in the predetermined order.

Hefestämme und ihre Transformation Yeast strains and their transformation

Geeignete Hefe-Wirtsorganismen sind Stämme der Gattung Saccharomvces. insbesondere Stämme von Saccharomvces cerevisiae. Die genannten Hefestämme umfassen Hefestämme, die gegebenenfalls von endogenen zwei-Mikron-Plasmiden befreit wurden und/oder die gegebenenfalls keine Hefe-Peptida-seaktivität(en), z.B. Peptidase yscoa-, yscA-, yscB-, yscY-, und/oder yscS-Aktivität aufweisen. Suitable yeast host organisms are strains of the genus Saccharomvces. especially strains of Saccharomvces cerevisiae. The yeast strains mentioned include yeast strains which have optionally been freed from endogenous two-micron plasmids and / or which may have no yeast peptide activity (s), e.g. Peptidase have yscoa, yscA, yscB, yscY, and / or yscS activity.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Hefestamm, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter und eine für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodierende DNA-Sequenz enthält, wobei diese DNA vom genannten Promoter kontrolliert wird. The invention further relates to a yeast strain which has been transformed with a hybrid vector which contains an expression cassette comprising a yeast promoter and a DNA sequence coding for a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants, this DNA being controlled by the promoter mentioned.

In einer ersten Ausführungsform wurde der erfindungsgemässe Hefestamm mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefe-Promoter, eine DNA-Sequenz, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, wobei diese DNA-Sequenz vom genannten Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transformationsterminationssi-gnale enthält, transformiert. In a first embodiment, the yeast strain according to the invention with a hybrid vector comprising an expression cassette comprising a yeast promoter, a DNA sequence coding for a membrane-bound glycosyl transferase or one of its variants, this DNA sequence being controlled by the promoter mentioned, and one DNA sequence containing yeast transformation termination signals transformed.

In einer zweiten Ausführungsform wurde der erfindungsgemässe Hefestamm mit einem Hybridvektor transformiert, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter, der funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, transformiert. In a second embodiment, the yeast strain according to the invention was transformed with a hybrid vector which has an expression cassette comprising a yeast promoter which is functionally linked to a first DNA sequence which codes for a signal peptide and which is linked in the correct reading frame to a second DNA sequence, which codes for a membrane-bound glycosyltransferase or one of its variants, and transforms a DNA sequence which contains yeast transcription termination signals.

Die Transformation von Hefe mit den erfindungsgemässen Hybridvektoren wird nach der Fachwelt bekannten Verfahren durchgeführt, zum Beispiel nach den von Hinnen et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1978) 75,1929) und Ito et al. (J. Bact. (1983) 153,163-168) beschriebenen Methoden. The transformation of yeast with the hybrid vectors according to the invention is carried out according to methods known in the art, for example according to the method described by Hinnen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1978) 75, 1929) and Ito et al. (J. Bact. (1983) 153, 163-168).

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten membrangebundenen Glycosyltransferasen und ihre Varianten können auf an sich bekannte Weise verwendet werden, z.B. für die Synthese und/oder Modifizierung von Glycoproteinen, Oligosacchariden und Glycolipiden (US-Patent 4 925 796; EP-Anmeldung 414 171). The membrane-bound glycosyltransferases produced by the process according to the invention and their variants can be used in a manner known per se, e.g. for the synthesis and / or modification of glycoproteins, oligosaccharides and glycolipids (US patent 4 925 796; EP application 414 171).

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf das Verfahren für die Herstellung membrangebundener Glycosyltransferasen und ihrer Varianten, der Hybridvektoren und der transformierten Hefestämme, wie sie in den Beispielen beschrieben sind. The invention relates in particular to the process for the preparation of membrane-bound glycosyltransferases and their variants, the hybrid vectors and the transformed yeast strains, as described in the examples.

In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: GT = Galactosyltransferase (EC 2.4.1.22); PCR ê Polymerase-Kettenreaktion; ST = Siaiyitransferase (EC 2.4.99.1) Varianten; FT = Fucosyltransferase The following abbreviations are used in the examples: GT = galactosyltransferase (EC 2.4.1.22); PCR ê polymerase chain reaction; ST = Siaiyitransferase (EC 2.4.99.1) variants; FT = fucosyltransferase

Beispiel 1: Example 1:

Klonierung der Galactosyltransferase (GTi-cDNA aus HeLa-Zellen Cloning of galactosyltransferase (GTi cDNA from HeLa cells

GT-cDNA wird aus HeLa-Zellen (Watzele, G. und Berger, E. G. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 7174) mit dem Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren isoliert: GT cDNA is isolated from HeLa cells (Watzele, G. and Berger, E.G. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 7174) using the polymerase chain reaction (PCR) method:

1.1 Präparation von PoIy(A)+RNA aus HeLa-Zellen. 1.1 Preparation of PoIy (A) + RNA from HeLa cells.

Für die RNA-Präparation werden HeLa-Zellen auf 5 Platten (23 x 23 cm) in einer Einzelzellschicht-Kultur gezüchtet. RNA wird aus den kultivierten Zellen schnell und wirksam mittels Extraktion mit Guani-din-HCI wie von MacDonald, R. J. et al (Meth. Enzymol. (1987) 152, 226-227) beschrieben, isoliert. Im allgemeinen sind die Ausbeuten ca. 0.6 bis 1 mg Gesamt-RNA pro Platte konfluent gewachsener Zellen. Die PoIy(A)+RNA wird durch Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-Zellulose nach der im Maniatis-Handbuch beschriebenen Methode angereichert (Sambrook, J. Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd édition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA), wobei 4 mg Gesamt-RNA auf eine 400 nl-Säule aufgetragen werden. 3% der auf8 For the RNA preparation, HeLa cells are grown on 5 plates (23 × 23 cm) in a single cell layer culture. RNA is quickly and effectively isolated from the cultured cells by means of extraction with guani-din-HCl as described by MacDonald, R.J. et al (Meth. Enzymol. (1987) 152, 226-227). In general, the yields are approximately 0.6 to 1 mg of total RNA per plate of confluently grown cells. The PoIy (A) + RNA is enriched by affinity chromatography on oligo (dT) cellulose according to the method described in the Maniatis manual (Sambrook, J. Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd édition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA), with 4 mg of total RNA being applied to a 400 nl column. 3% of the 8

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

getragenen RNA werden als angereicherte Poiy(A)+RNA zurückerhalten, mit dem dreifachen Volumen an Ethanol gefällt und aliquotiert bei -70°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Carried RNAs are recovered as enriched Poiy (A) + RNA, precipitated with three times the volume of ethanol and stored aliquoted at -70 ° C until use.

1.2 Synthese von Erststrang-cDNA für die PCR 1.2 Synthesis of first strand cDNA for PCR

Poly(A)+RNA (mRNA) wird mit Moloney Murine Leukemia Virus RNase H-Reverse Transcriptase (M-MLV H-RT) (BRL) in DNA revers-transkribiert. Bei der Herstellung der 20 nl Reaktionsmischung wird mit geringen Abweichungen nach dem von BRL bereitgestellten Protokoll vorgegangen: 1 ng HeLa-Zel-len-Poly(A)+RNA und 500 ng Oligo (dT)i2-i8(Pharmacia) in 11,5 p.l sterilem H2O werden 10 Minuten lang auf 70°C erhitzt und dann schnell auf Eis abgekühlt. Dann werden 4 nl Reaktionspuffer (BRL; 250 mM Tris-HCI pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCb), 2 fil 0,1 M Dithiothreitol, 1 |il gemischtes dNTP (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP, TTP, Pharmacia), 0,5 jaI (17,5 U) RNAguard (RNase-lnhibitor von Pharmacia) und 1 nl (200 U) M-MLVH-RT zugesetzt. Die Reaktion wird bei 42°C durchgeführt und nach einer Stunde durch 10minütiges Erhitzen des Röhrchens auf 95°C abgestoppt. Poly (A) + RNA (mRNA) is reverse transcribed in DNA using Moloney Murine Leukemia Virus RNase H-Reverse Transcriptase (M-MLV H-RT) (BRL). The 20 nl reaction mixture is prepared with slight deviations according to the protocol provided by BRL: 1 ng HeLa cell poly (A) + RNA and 500 ng oligo (dT) i2-i8 (Pharmacia) in 11.5 pl sterile H2O are heated to 70 ° C for 10 minutes and then quickly cooled on ice. Then 4 nl reaction buffer (BRL; 250 mM Tris-HCl pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCb), 2 ml 0.1 M dithiothreitol, 1 | il mixed dNTP (each 10 mM dATP, dCTP, dGTP, TTP, Pharmacia), 0.5 jaI (17.5 U) RNAguard (RNase inhibitor from Pharmacia) and 1 nl (200 U) M-MLVH-RT added. The reaction is carried out at 42 ° C and stopped after one hour by heating the tube to 95 ° C for 10 minutes.

Um die Wirksamkeit der Reaktion zu überprüfen, wird ein Aliquot der Mischung (5 |il) in der Gegenwart von 2 p.Ci a-32P dCTP inkubiert. Durch Messung des eingebauten dCTP wird die Menge an synthetisierter cDNA berechnet. Die Ausbeute bei der Synthese des ersten Stranges ist routinemässig zwischen 5 und 15%. To check the effectiveness of the reaction, an aliquot of the mixture (5 | il) is incubated in the presence of 2 p.Ci a-32P dCTP. The amount of cDNA synthesized is calculated by measuring the built-in dCTP. The first strand synthesis yield is routinely between 5 and 15%.

1.3 Polymerase-Kettenreaktion 1.3 Polymerase chain reaction

Die für die PCR verwendeten Oligodeoxynucleotid-Primer werden in vitro nach dem Phosphoramidit-Verfahren (M. H. Caruthers, in Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, H. G. Gassen und A. Lang, Hrsg. Verlag Chemie, Weinheim, BRD) in einem Applied Biosystems Synthesizer, Modell 380B, synthetisiert. Sie sind in Tabelle 1 angeführt. The oligodeoxynucleotide primers used for the PCR are applied in vitro using the phosphoramidite method (MH Caruthers, in Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, HG Gassen and A. Lang, ed. Verlag Chemie, Weinheim, FRG) in an Applied Biosystems Synthesizer , Model 380B, synthesized. They are listed in Table 1.

Tabelle 1: PCR-primers entsprechend Table 1: PCR primers accordingly

Primer Sequenz (5' to 3')1} bp in GT cDNA2) Primer sequence (5 'to 3') 1} bp in GT cDNA2)

Plup (Kpnl) Plup (Kpnl)

cacaatACCCTTCTTAAAGCGGCGGCGGGAAGATG cacaatACCCTTCTTAAAGCGGCGGCGGGAAGATG

(-26) - (-26) -

3 3rd

PI (EcoRI) PI (EcoRI)

gccsaattcATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCG gccsaattcATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCG

1 - 1 -

28 28

P3 (Sacl) P3 (Sacl)

CTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC CTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC

448- 448-

473 473

P2d (EcoRI) P2d (EcoRI)

scceaaTTCAGTCTCTTATCCGTGTACCAAAACGCCTA scceaaTTCAGTCTCTTATCCGTGTACCAAAACGCCTA

1222- 1222-

1192 1192

P4 (HindIII) P4 (HindIII)

cccaaactTGGAATGATGATGGCCACCTTGTGAGG cccaaactTGGAATGATGATGGCCACCTTGTGAGG

546- 546-

520 520

' Großbuchstaben stehen für GT-Sequenzen, Kleinbuchstaben sind zusätzliche Sequenzen, Stellen für 'Upper case letters stand for GT sequences, lower case letters are additional sequences, digits for

Restriktionsenzyme sind unterstrichen, "Start"- und "Stop"-Codons für die RN A-Translation sind fettgedruckt. ^ DT-cDN A-Sequenz aus der mensclichen Plazenta wie in GenBank veröffenlicht (Eingangs-Nr. M22921 ). Restriction enzymes are underlined, "start" and "stop" codons for RN A translation are in bold. ^ DT-cDN A sequence from the human placenta as published in GenBank (entry no. M22921).

Die folgenden sind Standard-PCR-Bedingungen für einen 30 jxl Inkubationsansatz: 1 jil der Reverse-Transkriptase-Reaktion (siehe Beispiel 1.2), die ca. 5 ng Erststrang-cDNA enthält, jeweils 15 pmol der relevanten Primer, jeweils 200 p.mol der vier Desoxynucleosid-Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und TTP) in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCI pH 8,3 (bei 23°C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine) und 0,5 U AmpliTaq Polymerase (Perkin Elmer). Die Amplifizierung wird im Thermocycler 60 (Biomed) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 0,5 Minuten Denaturierung bei 95°C, 1 Minute Anlagerung bei 56°C und 1 Minute 15 Sekunden Verlängerung bei 72°C, über insgesamt 20-25 Zyklen. Im letzten Zyklus dauert die Primer-Verlängerung bei 72°C 5 Minuten lang. The following are standard PCR conditions for a 30 μl incubation batch: 1 μl of the reverse transcriptase reaction (see Example 1.2), which contains approx. 5 ng first-strand cDNA, in each case 15 pmol of the relevant primers, in each case 200 pmol the four deoxynucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and TTP) in PCR buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.3 (at 23 ° C), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% gelatin) and 0.5 U AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer). The amplification is carried out in the Thermocycler 60 (Biomed) under the following conditions: 0.5 minutes denaturation at 95 ° C, 1 minute addition at 56 ° C and 1 minute 15 seconds extension at 72 ° C, over a total of 20-25 cycles. In the last cycle, primer extension takes 5 minutes at 72 ° C.

Für das Sequenzieren und Subklonieren wird die HeLa-GT-cDNA in zwei überlappenden Teilstücken amplifiziert, wobei verschiedene Primer-Kombinationen verwendet werden: For sequencing and subcloning, the HeLa-GT cDNA is amplified in two overlapping sections, using different primer combinations:

(1) Fragment P1-P4: Die Primer P1 und P4 werden für die Amplifikation eines 0,55 kb DNA-Fragments verwendet, das sich über die Nucleotidpositionen 7-556 in HeLa-GT-cDNA erstreckt (SEQ ID-NR. 1) (1) Fragment P1-P4: The primers P1 and P4 are used for the amplification of a 0.55 kb DNA fragment which extends over the nucleotide positions 7-556 in HeLa-GT cDNA (SEQ ID NO. 1)

(2) Fragment P3-P2d: Die Primer P3 und P2d werden für die Amplifikation eines 0,77 kb Fragments verwendet, das sich über die Nucleotidpositionen 457-1232 erstreckt (SEQ ID-Nr. 1). (2) Fragment P3-P2d: The primers P3 and P2d are used for the amplification of a 0.77 kb fragment which extends over the nucleotide positions 457-1232 (SEQ ID No. 1).

9 9

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Um Irrtümer während der Amplifizierung zu vermeiden, werden 4 unabhängige PCR pro Fragment durchgeführt. Primer P1up (Kpnl) wird zusammen mit Primer P4 verwendet, um die DNA-Sequenz, an die sich das «Start»-Codon anschliesst, zu bestimmen. In order to avoid errors during the amplification, 4 independent PCRs are carried out per fragment. Primer P1up (Kpnl) is used together with primer P4 to determine the DNA sequence, which is followed by the «start» codon.

Nach der PCR-Amplifizierung wird Fragment P1-P4 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hindill verdaut, der Verdau auf einem 1,2%igen Agarosegei analysiert, vom Gel mittels GENECLEAN (BIO 101) eluiert und in den Vektor pUC18 (Pharmacia), der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, sub-kloniert. Fragment P3-P2d wird mit Sacl und EcoRI verdaut, der Verdau wird auf einem 1,2%igen Gel analysiert, eluiert und in pUC18, das mit Sacl und EcoRI verdaut wurde, subkloniert. Die erhaltenen Subklone sind pUC18/P1-P4 bzw. pUC18/P3-P2d. Für das Subklonieren, die Ligation und die Transformation von E. coli-Stamm DH5a wird nach Standardprotokollen, wie in Beispiel 2 beschrieben, verfahren. Minipräparationen der Plasmide pUC18/P1-P4 bzw. pUC18/P3-P2d werden für die Didesoxy-Se-quenzierung von denaturierter Doppelstrang-DNA mit dem T7-Polymerase-Sequenzierkit (Pharmacia) verwendet. Zur Sequenzierung überlappender Fragmente, die aus beiden DNA-Strängen durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen hergestellt wurden, werden M13/pUC Sequenzierungsprimer und reverse Sequenzierungsprimer (Pharmacia) eingesetzt. Weiteres Subklonieren von Restriktionsfragmenten des GT-Gens ist für ausführliche Sequenzierung überlappender Fragmente beider Stränge erforderlich. Die Sequenz von Fragmenten, die mittels unabhängiger PCR amplifiziert wurden, zeigt, dass der Amplifizierungsfehler kleiner als 1 in 3000 Nucleotiden ist. Die vollständige Nucleotidsequenz der HeLa-Zellen-GT-cDNA, die in SEQ ID-Nr. 1 dargestellt ist, ist zu 99,2% mit der der menschlichen Plazenta homolog (Genbank-Eingangs Nr. M22921). Es finden sich drei Unterschiede: After the PCR amplification, fragment P1-P4 is digested with the restriction enzymes EcoRI and Hindill, the digestion is analyzed on a 1.2% agarose gel, eluted from the gel using GENECLEAN (BIO 101) and into the vector pUC18 (Pharmacia), which contains was digested with the same enzymes, sub-cloned. Fragment P3-P2d is digested with Sacl and EcoRI, the digest is analyzed on a 1.2% gel, eluted and subcloned into pUC18, which was digested with Sacl and EcoRI. The subclones obtained are pUC18 / P1-P4 and pUC18 / P3-P2d. Standard protocols as described in Example 2 are followed for subcloning, ligation and transformation of E. coli strain DH5a. Mini preparations of the plasmids pUC18 / P1-P4 or pUC18 / P3-P2d are used for the dideoxy sequencing of denatured double-stranded DNA with the T7 polymerase sequencing kit (Pharmacia). M13 / pUC sequencing primers and reverse sequencing primers (Pharmacia) are used for sequencing overlapping fragments which have been produced from both DNA strands by digestion with different restriction enzymes. Further subcloning of restriction fragments of the GT gene is required for extensive sequencing of overlapping fragments of both strands. The sequence of fragments amplified by independent PCR shows that the amplification error is less than 1 in 3000 nucleotides. The complete nucleotide sequence of the HeLa cell GT cDNA, which is shown in SEQ ID no. 1 is 99.2% homologous to that of the human placenta (Genbank entry no. M22921). There are three differences:

(a) Drei zusätzliche Basenpaare in den Nucleotidpositionen 37-39 (SEQ ID-Nr. 1), die eine zusätzliche Aminosäure (Ser) in der N-terminalen Region des Proteins ergeben; (b) bp 98 bis 101 sind «CTCT» anstelle von «TCTG» in der Sequenz der menschlichen Plazenta, was zwei konservative Aminosäuresubstitutionen (Ala Leu anstelle von ValTyr) in den Aminosäurepositionen 31 und 32 in der membranumfassenden Domäne von GT zur Folge hat; (c) das Nucleotid in Position 1047 ändert sich von «A» auf «G», ohne dass dies Änderungen in der Aminosäuresequenz bewirkt. (a) Three additional base pairs in nucleotide positions 37-39 (SEQ ID NO: 1) which give an additional amino acid (Ser) in the N-terminal region of the protein; (b) bp 98-101 are "CTCT" instead of "TCTG" in the sequence of the human placenta, which results in two conservative amino acid substitutions (Ala Leu instead of ValTyr) in amino acid positions 31 and 32 in the GT membrane-wide domain; (c) the nucleotide at position 1047 changes from "A" to "G" without causing changes in the amino acid sequence.

Die zwei überlappenden DNA-Fragmente P1-P4 und P3-P2d, die die HeLa-GT-cDNA kodieren, sind über die Notl-Restriktionsstelle in der Nucleotidposition 498 zusammengefügt, die in beiden Fragmenten existiert. The two overlapping DNA fragments P1-P4 and P3-P2d, which encode the HeLa-GT cDNA, are joined via the NotI restriction site in nucleotide position 498, which exists in both fragments.

Die vollständige HeLa-Zellen-GT-cDNA (SEQ ID-Nr. 1) wird als 1,2 kb EcoRI-EcoRI Restriktionsfragment in Plasmid plC-7 kloniert, wobei plC-7 ein Abkömmling von pUC8 mit zusätzlichen Restriktionsschnittstellen in der multiplen Klonierungsstelle ist (Marsh, J. L„ Erfle, M. und Wykes, E. J. (1984) Gene 32, 481-485), was den Vektor p4AD113 ergibt. Um die GT-Expressionskassette zu konstruieren, wird die EcoRI-Restriktionsstelle (bp 1227) am 3'-Ende der cDNA-Sequenz folgendermassen eliminiert: Vektor p4AD113 wird zuerst mittels Verdau mit EcoRV linearisiert und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Ausserdem wird 1 ng der linearisierten Plasmid-DNA mit 0,25 U EcoRI 1 Stunde lang bei 37°C teilverdaut. Nach Elektrophorese auf Agarosegel wird aus dem Gel mittels GENECLEAN (Bio 101) ein Fragment isoliert, das der Grösse des linearisierten Plasmids (3,95 kb) entspricht. Das überstehende EcoRI-Ende wird mit Klenow-Polymerase, wie im Maniatis-Handbuch beschrieben (siehe oben), aufgefüllt. Nach Phenolisierung und Fällung mit Ethanol wird das Plasmid wieder ligiert und für die Transformierung von E. coli DH5a (Gibco/BRL) verwendet. Von sechs Transformanten werden Plasmid-Mi-nipräparationen hergestellt. Die erhaltenen Plasmide werden mittels Restriktionsanalyse auf das Fehlen der EcoRI- und EcoRV-Restriktionsstellen am 3-Ende der HeLa-GT-cDNA überprüft. Das mit p4AE113 bezeichnete Plasmid wird für die folgenden Experimente ausgewählt, da seine DNA-Sequenz identisch mit der von Plasmid p4AD113 ist, mit der Ausnahme dass bp 1232-1238 mit den EcoRI-EcoRV-Re-striktionsstellen eliminiert sind. The complete HeLa cell GT cDNA (SEQ ID No. 1) is cloned as a 1.2 kb EcoRI-EcoRI restriction fragment in plasmid plC-7, where plC-7 is a derivative of pUC8 with additional restriction sites in the multiple cloning site (Marsh, J.L. "Erfle, M. and Wykes, EJ (1984) Gene 32, 481-485), which gives the vector p4AD113. To construct the GT expression cassette, the EcoRI restriction site (bp 1227) at the 3 'end of the cDNA sequence is eliminated as follows: Vector p4AD113 is first linearized by digestion with EcoRV and then treated with alkaline phosphatase. In addition, 1 ng of the linearized plasmid DNA is partially digested with 0.25 U EcoRI for 1 hour at 37 ° C. After electrophoresis on agarose gel, a fragment is isolated from the gel using GENECLEAN (Bio 101), which corresponds to the size of the linearized plasmid (3.95 kb). The protruding EcoRI end is filled in with Klenow polymerase as described in the Maniatis manual (see above). After phenolization and precipitation with ethanol, the plasmid is ligated again and used for the transformation of E. coli DH5a (Gibco / BRL). Plasmid minipreps are made from six transformants. The plasmids obtained are checked by restriction analysis for the absence of the EcoRI and EcoRV restriction sites at the 3 end of the HeLa-GT cDNA. The plasmid designated p4AE113 is selected for the following experiments since its DNA sequence is identical to that of plasmid p4AD113, with the exception that bp 1232-1238 with the EcoRI-EcoRV restriction sites are eliminated.

Beispiel 2: Example 2:

Konstruktion von Exoressionskassetten für vollständige GT Construction of extra cassettes for full GT

Für heterologe Expression in Saccharomvces cerevisiae wird die vollständige HeLa-GT-cDNA-Se-quenz (SEQ ID-Nr. 1) mit Transkriptionskontrollsignalen der Hefe kombiniert, um wirksame Initiierung und Termination der Transkription zu erreichen. Die Promoter- und Terminatorsequenzen stammen vom Saure-Phosphatase-Gen der Hefe (PH05Ì (EP 100 561). Der vollständige PH05 Promoter wird durch den Vorrat an anorganischem Phosphat im Kulturmedium reguliert. Hohe P,-Konzentrationen führen zu Reprimierung des Promoters, während ein niedriger Pj-Gehalt induzierend wirkt. Es kann jedoch auch ein kurzes 173 bp PH05-Promoterfraament verwendet werden, dem alle regulierenden Elemente fehlen und das sich deshalb wie ein konstitutiver Promoter verhält. For heterologous expression in Saccharomvces cerevisiae, the complete HeLa-GT cDNA sequence (SEQ ID No. 1) is combined with transcriptional control signals from the yeast in order to achieve effective initiation and termination of the transcription. The promoter and terminator sequences come from the yeast acid phosphatase gene (PH05Ì (EP 100 561). The complete PH05 promoter is regulated by the supply of inorganic phosphate in the culture medium. High P, concentrations lead to repression of the promoter during an low Pj content has an inductive effect, but a short 173 bp PH05 promoter fragment can be used, which lacks all the regulating elements and which therefore behaves like a constitutive promoter.

2.1 Konstruktion einer phosphatinduzierbaren Expressionskassette 2.1 Construction of a phosphate-inducible expression cassette

Die GT-cDNA-Sequenz wird folgendermassen mit dem Hefe-PH05-Promoter und Transkriptionstermi-nationssequenzen kombiniert: The GT cDNA sequence is combined as follows with the yeast PH05 promoter and transcription termination sequences:

10 10th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

(a) Vollständige HeLa-GT-cDNA-Sequenz: (a) Complete HeLa-GT cDNA sequence:

Vektor p4AE113 mit der vollständigen GT-cDNA-Sequenz wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Bgiii verdaut. Die DNA-Fragmente werden elektrophoretisch auf einem 1%igen Agarosegel getrennt. Ein 1,2 kb DNA-Fragment, das die komplette cDNA-Sequenz für HeLa-GT enthält, wird vom Gel durch Adsorption an «Glasmilk» mittels des GENECLEAN-Kits (B10 101) isoliert. Auf diesem Fragment ist das «ATG»-Startcodon für die Proteinsynthese von GT direkt hinter der Schnittstelle für EcoRI angeordnet, während sich an das «TAG»-Stopcodon 32 bp anschliessen, an deren Zusammensetzung die 3'-untranslatierte Region der HeLa-GT und die multiple Klonierungsstelle des Vektors mit der Bglli-Re-striktionsstelle beteiligt sind. Vector p4AE113 with the complete GT cDNA sequence is digested with the restriction enzymes EcoRI and Bgiii. The DNA fragments are separated electrophoretically on a 1% agarose gel. A 1.2 kb DNA fragment, which contains the complete cDNA sequence for HeLa-GT, is isolated from the gel by adsorption on "glass milk" using the GENECLEAN kit (B10 101). On this fragment, the "ATG" start codon for the protein synthesis of GT is located directly behind the interface for EcoRI, while the "TAG" stop codon is followed by 32 bp, the composition of which is the 3'-untranslated region of the HeLa-GT and the multiple cloning site of the vector with the Bglli restriction site are involved.

(b) Vektor für die Amplifizierung in E. coli: (b) Vector for amplification in E. coli:

Der Amplifizierungsvektor, Plasmid p31R (vgl. EP 100 561), ein pBR322-Abkömmling, wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Sali verdaut. Die Restriktionsfragmente werden auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, und ein 3,5 kb Vektorfragment wie oben beschrieben aus dem Gel isoliert. Dieses DNA-Fragment enthält das grosse Sall-Hindlll-Vektorfragment des pBR322-Abkömmlings und eine 337 bp PH05-Transkriptionsterminationsseauenz anstelle der Hindlll-BamHI-Sequenz von pBR322. The amplification vector, plasmid p31R (cf. EP 100 561), a pBR322 derivative, is digested with the restriction enzymes BamHI and Sali. The restriction fragments are separated on a 1% agarose gel and a 3.5 kb vector fragment is isolated from the gel as described above. This DNA fragment contains the large Sall-HindIII vector fragment of the pBR322 derivative and a 337 bp PH05 transcription termination sequence instead of the HindIII-BamHI sequence from pBR322.

(c) Sequenz für den induzierbaren PH05-Promoter: (c) Sequence for the inducible PH05 promoter:

Das die Regulationselemente (UASp) für Phosphat-Induktion enthaltende PH05-Promoterfraament wird aus Plasmid p31R (vgl. EP 100 561) durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen Sali und EcoRI isoliert. Das 0,8 kb Sall-EcoRI-DNA-Fragment enthält die 276 bp Sail-BamHI pBR322-Sequenz und das 534 bp BamHI-EcoR! PH05-Promolerfraament mit dem EcoRI-Linker (5'-GAATTC-3'), der in Position -8 der PH05-Promoterseguenz eingeführt wurde. The PH05 promoter fragment containing the regulatory elements (UASp) for phosphate induction is isolated from plasmid p31R (cf. EP 100 561) by digestion with the restriction enzymes Sali and EcoRI. The 0.8 kb Sall-EcoRI-DNA fragment contains the 276 bp Sail-BamHI pBR322 sequence and the 534 bp BamHI-EcoR! PH05 promoter fragment with the EcoRI linker (5'-GAATTC-3 ') introduced in position -8 of the PH05 promoter sequence.

(d) Konstruktion von Plasmid pGTA 1132 (d) Construction of plasmid pGTA 1132

Die drei DNA-Fragmente (a) bis (c) werden in einer 12 nl Ligationsmischung ligiert: 100 ng DNA-Fragment (a) und jeweils 30 ng der Fragmente (b) und (c) werden bei 15°C 18 Stunden lang mit 0,3 U T4-DNA-Ligase (Boehringer) im mitgelieferten Ligasepuffer (66 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM Dithioerythri-tol, 5 mM MgCb, 1 mM ATP) ligiert. Mit der Hälfte der Ligationsmischung werden kompetente Zellen vom E. coli Stamm DH5a (Gibco/BRL) transformiert. Für die Herstellung von kompetenten Zellen und für die Transformation wird nach dem Standardprotokoll, wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) angegeben, vorgegangen. Die Zellen werden auf selektivem, mit 75 |ig/ml Ampicillin ergänztem LB-Medium ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Man erhält ca. 120 Transformanten. Von sechs unabhängigen Transformanten werden Plasmid-Minipräparationen nach dem modifizierten alkalischen Lyse-Protokoll von Birnboim, H. C. und Doly, J., wie im Maniatis-Handbuch angegeben (siehe oben), durchgeführt. Die isolierten Plasmide werden durch Restriktionsanalyse mit 4 verschiedenen Enzymen charakterisiert (EcoRI, Pstl, HindIII, Sali, und Kombinationen). Alle sechs Plasmide zeigen die erwarteten Restriktionsfragmente. Einer der Klone wird ausgewählt und als pGTA 1132 bezeichnet. Plasmid pGTA 1132 enthält die Expressionskassette mit der vollständigen HeLa-GT-cDNA, die unter der Kontrolle des phosphatregulierten PH05-Promoters steht, und die PH05-Transkriptionsterminationssequenz. Diese Expressionskassette kann aus pGTA 1132 als ein 2,35 kb Sall-Hindlll-Fragment herausgeschnitten werden und wird als DNA-Fragment (1A) bezeichnet. The three DNA fragments (a) to (c) are ligated in a 12 nl ligation mixture: 100 ng DNA fragment (a) and 30 ng each of fragments (b) and (c) are kept at 15 ° C. for 18 hours 0.3 U T4 DNA ligase (Boehringer) in the ligase buffer supplied (66 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM dithioerythritol, 5 mM MgCb, 1 mM ATP) ligated. Competent cells from the E. coli strain DH5a (Gibco / BRL) are transformed with half of the ligation mixture. For the production of competent cells and for the transformation, the standard protocol as described in the Maniatis manual (see above) is used. The cells are spread on selective LB medium supplemented with 75 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. About 120 transformants are obtained. Plasmid minipreparations are carried out from six independent transformants according to the modified alkaline lysis protocol of Birnboim, H.C. and Doly, J., as specified in the Maniatis manual (see above). The isolated plasmids are characterized by restriction analysis with 4 different enzymes (EcoRI, Pstl, HindIII, Sali, and combinations). All six plasmids show the expected restriction fragments. One of the clones is selected and designated pGTA 1132. Plasmid pGTA 1132 contains the expression cassette with the complete HeLa-GT cDNA, which is under the control of the phosphate-regulated PH05 promoter, and the PH05 transcription termination sequence. This expression cassette can be cut out of pGTA 1132 as a 2.35 kb SalI HindIII fragment and is referred to as DNA fragment (1A).

2.2 Konstruktion einer konstitutiven Expressionskassette: 2.2 Construction of a constitutive expression cassette:

Für die Konstruktion einer Expressionskassette mit einem konstitutiven, nicht regulierten Promoter wird ein am 5'-Ende verkürztes PH05-Promoterfraament ohne Phosphat-Regulationselemente verwendet, das aus Plasmid p31/PH05M73)RIT isoliert wird. For the construction of an expression cassette with a constitutive, unregulated promoter, a 5'-shortened PH05 promoter fragment without phosphate regulatory elements is used, which is isolated from plasmid p31 / PH05M73) RIT.

(a) Konstruktion von Plasmid p31/PH05f-173)RIT (a) Construction of plasmid p31 / PH05f-173) RIT

Plasmid p31 RIT12 (EP 288 435) enthält den vollständigen regulierten PH05-Promoter (mit einer in der Nucleotidposition -8 auf einem 534 bp BamHl-EcoRI-Fragment eingeführten EcoRI-Stelle), woran sich die kodierende Sequenz für die Hefe-Invertase-Signalsequenz (72 bp EcoRI-Xhol) und das PH05-Trans-kriptionsterminationssignal (135 bp Xhol-Hindlll), kloniert in Tandemanordnung zwischen BamHI und Hindill des von pBR322 abgeleiteten Vektors, anschliesst. Plasmid p31 RIT12 (EP 288 435) contains the fully regulated PH05 promoter (with an EcoRI site introduced in the nucleotide position -8 on a 534 bp BamHl-EcoRI fragment), which is followed by the coding sequence for the yeast invertase signal sequence (72 bp EcoRI-Xhol) and the PH05 transcription termination signal (135 bp Xhol-HindIII), cloned in tandem between BamHI and HindIII of the vector derived from pBR322.

Das konstitutive PH05M 73)-Promoterelement aus Plasmid pJDB207/PH05M 73VYHIR (EP 340 170) umfasst die Nucleotidsequenz des Hefe-PH05-Promoters von der Nucleotidposition -9 bis -173 (BstEil-Restriktionsstelle), hat aber «stromaufwärts» keine regulierenden Sequenzen (UASp). Der PH05M731-Promoter verhält sich daher wie ein konstitutiver Promoter. Dieses Beispiel beschreibt den Ersatz des The constitutive PH05M 73) promoter element from plasmid pJDB207 / PH05M 73VYHIR (EP 340 170) comprises the nucleotide sequence of the yeast PH05 promoter from nucleotide position -9 to -173 (BstEil restriction site), but has no regulatory sequences "upstream" ( UASp). The PH05M731 promoter therefore behaves like a constitutive promoter. This example describes the replacement of the

11 11

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

regulierten PH05-Promoters in Plasmid p31RIT12 durch das kurze, konstitutive PH05M 73)-Promoter-element, um Plasmid p31/PH05f-173)RIT zu erhalten. regulated PH05 promoter in plasmid p31RIT12 by the short, constitutive PH05M 73) promoter element to obtain plasmid p31 / PH05f-173) RIT.

Die Plasmide p31RIT12 (EP 288, 435) und pJDB207/PH05M73)-YHIR (EP 340, 170) werden mit den Restriktionsendonucleasen Sali und EcoRI verdaut. Die jeweiligen 3,6 kb und 0,4 kb Sall-EcoRI-Fragmente werden auf einem 0,8%igen Agarosegel isoliert, aus dem Gel eluiert, mit Ethanol gefällt und in H2O in einer Konzentration von 0,1 pmol/nl resuspendiert. Die beiden DNA-Fragmente werden ligiert, und Aliquots der Ligationsmischung von 1 nl werden für die Transformation von kompetenten E. coli HB101 (ATCC)-Zellen verwendet. Ampicillinresistente Kolonien werden individuell in mit Ampicillin (100 p.g/ml) ergänztem LB-Medium gezüchtet. Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes, D. S. et al. (Anal. Biochem. (1981) 144, 193) isoliert und mittels Restriktionsverdau mit Sali und EcoRI analysiert. Das Plasmid eines Klones mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als p31/PH05(-173)RIT bezeichnet. The plasmids p31RIT12 (EP 288, 435) and pJDB207 / PH05M73) -YHIR (EP 340, 170) are digested with the restriction endonucleases Sali and EcoRI. The respective 3.6 kb and 0.4 kb Sall-EcoRI fragments are isolated on a 0.8% agarose gel, eluted from the gel, precipitated with ethanol and resuspended in H2O at a concentration of 0.1 pmol / nl. The two DNA fragments are ligated and aliquots of the 1 nl ligation mixture are used for the transformation of competent E. coli HB101 (ATCC) cells. Colonies resistant to ampicillin are grown individually in LB medium supplemented with ampicillin (100 p.g / ml). Plasmid DNA is prepared using the method of Holmes, D.S. et al. (Anal. Biochem. (1981) 144, 193) isolated and analyzed by restriction digestion with Sali and EcoRI. The plasmid of a clone with the correct restriction fragments is called p31 / PH05 (-173) RIT.

(b) Konstruktion von Plasmid pGTB 1135 (b) Construction of plasmid pGTB 1135

Plasmid p31/PH05M73iRIT wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Sali verdaut. Nach Trennung auf einem 1%igen Agarosegel wird ein 0,45 kb Sall-EcoRI-Fragment aus dem Gel mittels GENECLEAN (BIO 101) isoliert. Dieses Fragment enthält die 276 bp Sall-BamHI-Sequenz von pBR322 und das 173bp BamHI(BstEII)-EcoRI-Fragment des konstitutiven PH05-Promoters. Das 0,45 kb Sall-EcoRI-Fragment wird mit der 1,2 kb EcoRI-Bglll GT-cDNA (Fragment (a)) ligiert und der 3,5 kb BamHI-Sall-Vektorteil wird für Amplifizierung in E. coli mit dem in Beispiel 2.1. beschriebenen PH05-Terminator (Fragment (b)) ligiert. Ligation und Transformierung von E. coli-Stamm DH5a werden wie oben durchgeführt, wobei 58 Transformanten erhalten werden. Plasmide werden aus sechs unabhängigen Kolonien mittels Minipräparationen isoliert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Alle sechs Plasmide zeigen das erwartete Fragmentierungsmuster. Ein richtiger Klon wird als pGTB 1135 bezeichnet und für weitere Klonierungsexperimente verwendet, um die Expressionskassette für HeLa-GT unter der Kontrolle des konstitutiven PH05M 73)-Promoterfragments bereitzustellen. Diese Expressionskassette kann aus Vektor pGTB 1135 als 2 kb Sall-Hindlll-Fragment herausgeschnitten werden und wird als DNA-Fragment (IB) bezeichnet. Plasmid p31 / PH05M73iRIT is digested with the restriction enzymes EcoRI and Sali. After separation on a 1% agarose gel, a 0.45 kb SalI EcoRI fragment is isolated from the gel using GENECLEAN (BIO 101). This fragment contains the 276 bp Sal-BamHI sequence from pBR322 and the 173 bp BamHI (BstEII) EcoRI fragment of the constitutive PH05 promoter. The 0.45 kb Sall-EcoRI fragment is ligated with the 1.2 kb EcoRI-BglII GT cDNA (fragment (a)) and the 3.5 kb BamHI-Sall vector part is used for amplification in E. coli with the in Example 2.1. described PH05 terminator (fragment (b)) ligated. Ligation and transformation of E. coli strain DH5a are carried out as above, whereby 58 transformants are obtained. Plasmids are isolated from six independent colonies using mini preparations and characterized by restriction analysis. All six plasmids show the expected fragmentation pattern. A correct clone is designated pGTB 1135 and used for further cloning experiments to provide the HeLa-GT expression cassette under the control of the constitutive PH05M 73) promoter fragment. This expression cassette can be cut out from vector pGTB 1135 as a 2 kb SalI-HindIII fragment and is referred to as a DNA fragment (IB).

Beispiel 3: Example 3:

Konstruktion der Expressionsvektoren dDPGTA8 und pDPGTB5 Construction of the expression vectors dDPGTA8 and pDPGTB5

Der für heterologe Expression verwendete Hefevektor ist der episomale Vektor pDP34 (11,8 kb), welcher ein Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor mit dem Ampicillinresistenz-Marker für E. coli und den für Hefe selektiven Markern URA3 und dLEU2 ist. Vektor pDP34 (vgl. EP 340 170) wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Der linearisierte Vektor wird mittels GENECLEAN isoliert, und die überstehenden Enden werden mittels Klenow-Polymerase-Behandlung, wie im Maniatis-Handbuch beschrieben (siehe oben), aufgefüllt. Die Reaktion wird nach 30 Minuten durch 20minütiges Erhitzen auf 65°C zusammen mit 10 mM EDTA abgestoppt. Nach Ethanolfällung wird das Plasmid mit Sali verdaut und der Verdau mittels Gelelektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Der (BamHI)-stumpfendige, mit Sali geschnittene Vektor pDP34 wird mittels des GENECLEAN-Kits als 11,8 kb DNA-Fragments aus dem Gel isoliert. The yeast vector used for heterologous expression is the episomal vector pDP34 (11.8 kb), which is a yeast E. coli shuttle vector with the ampicillin resistance marker for E. coli and the yeast-selective markers URA3 and dLEU2. Vector pDP34 (cf. EP 340 170) is digested with the restriction enzyme BamHI. The linearized vector is isolated using GENECLEAN and the protruding ends are filled in using Klenow polymerase treatment as described in the Maniatis manual (see above). The reaction is stopped after 30 minutes by heating at 65 ° C. for 20 minutes together with 10 mM EDTA. After ethanol precipitation, the plasmid is digested with saline and the digest is separated by gel electrophoresis on a 0.8% agarose gel. The (BamHI) blunt-ended vector pDP34 cut with saline is isolated from the gel as an 11.8 kb DNA fragment using the GENECLEAN kit.

Analog zur Vektorpräparation werden die Plasmide pGTA 1132 und pGTB 1135 jeweils mit Hindill verdaut. Die überstehenden Enden der linearisierten Plasmide werden mittels Klenow-Polymerase-Behandlung aufgefüllt und anschliessend einem Sall-Verdau unterworfen, wobei Analogous to the vector preparation, the plasmids pGTA 1132 and pGTB 1135 are each digested with HindIII. The protruding ends of the linearized plasmids are filled in by means of Klenow polymerase treatment and then subjected to a Sall digestion, whereby

(2A) ein 2,35 kb (Hindlll)-stumpfendiges Sall-Fragment mit der phosphatregulierten Expressionskassette oder (2A) a 2.35 kb (HindIII) blunt-ended SalI fragment with the phosphate-regulated expression cassette or

(2B) ein 2,0 kb (Hindlll)-stumpfendiges Sall-Fragment mit der konstitutiven Expressionskassette entsteht. (2B) a 2.0 kb (HindIII) blunt-ended Sall fragment with the constitutive expression cassette is formed.

Die Ligation des stumpfendigen Sali pDP34-VektorteiIs mit Fragment 2A oder Fragment 2B und die Transformation kompetenter Zellen des E. coli-Stamms DH5a werden wie oben in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, wobei 80 ng des Vektorteils und 40 ng Fragment 2A bzw. 2B verwendet werden. 58 bzw. 24 Transformanten werden erhalten. Von jeder Transformation werden sechs Plasmide präpariert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. 2 Plasmide weisen das für die Konstruktion mit der regulierten Expressionskassette erwartete Restriktionsmuster (Fragment 2A) auf. Einer der Klone wird gewählt und mit pDPGTA8 bezeichnet. Ein Plasmid weist das für die Konstruktion mit der konstitutiven Expressionskassette (Fragment 2B) erwartete Restriktionsmuster auf und wird als pDPGTB5 bezeichnet. The ligation of the blunt-ended Sali pDP34 vector part with fragment 2A or fragment 2B and the transformation of competent cells of the E. coli strain DH5a are carried out as described above in Example 2, using 80 ng of the vector part and 40 ng of fragment 2A or 2B . 58 and 24 transformants are obtained. Six plasmids from each transformation are prepared and characterized by means of restriction analysis. 2 plasmids have the restriction pattern (fragment 2A) expected for the construction with the regulated expression cassette. One of the clones is chosen and designated pDPGTA8. A plasmid has the restriction pattern expected for construction with the constitutive expression cassette (fragment 2B) and is referred to as pDPGTB5.

Beispiel 4: Example 4:

Transformation des S. cerevisiae-Stammes BT 150 Transformation of the S. cerevisiae strain BT 150

Mittels CsCI gereinigte DNA der Expressionsvektoren pDPGTA8 und pDPGTB5 wird nach dem Protokoll von R. Treisman im Maniatis-Handbuch (siehe oben) hergestellt. Jeder der proteasedefizienten DNA of the expression vectors pDPGTA8 and pDPGTB5 purified by means of CsCI is produced according to the protocol by R. Treisman in the Maniatis manual (see above). Each of the protease deficient

12 12th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

cerevisiae-Stämme BT 150 (MATa, his4, Ieu2, ura3, pral, prbl, prcl, cpsl) und H 449 (MATa, prbl, cpsl, ura3A5, leu 2-3, 2-112, cir°) wird mit jeweils 5 der Plasmide pDPGTA8, pDPTGB5 und pDP34 (Kontrolle ohne Expressionskassette) nach der Lithiumacetat-Transformationsmethode (Ito, H. et al., siehe oben) transformiert. Ura+-Transformanten werden isoliert und für ein Screening auf GT-Aktivität (siehe oben) verwendet. Einzelne transformierte Hefezellen werden selektiert und folgendermassen bezeichnet: cerevisiae strains BT 150 (MATa, his4, Ieu2, ura3, pral, prbl, prcl, cpsl) and H 449 (MATa, prbl, cpsl, ura3A5, leu 2-3, 2-112, cir °) each have 5 the plasmids pDPGTA8, pDPTGB5 and pDP34 (control without expression cassette) were transformed according to the lithium acetate transformation method (Ito, H. et al., see above). Ura + transformants are isolated and used for screening for GT activity (see above). Individual transformed yeast cells are selected and labeled as follows:

Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTA8 Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDP34 Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPGTA8 Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDP34

Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPGTA8 Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae H 449/pDP34 Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDPGTA8 Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDP34

Beispiel 5: Example 5:

Enzvmaktivität vollständiger, in Hefe exprimierter GT Enzyme activity of complete GT expressed in yeast

5.1 Herstellung von Zellextrakten 5.1 Production of cell extracts

Zellen der transformierten Saccharomvces cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 werden jeweils unter Uracilselektion in mit Histidin und Leucin angereicherten Hefe-Minimalmedien (Difco) gezüchtet. Die Wachstumsrate der Zeilen wird in keinem Fall durch die Einführung eines Expressionsvektors beeinflusse Exponentiell wachsende Zellen (bei einer OD578 von 0,5) oder stationäre Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, einmal mit 5 mM Tris-HCI Puffer, pH 7,4 (Puffer 1), gewaschen und in einer Konzentration entsprechend 0,1-0,2 OD578 in Puffer 1 suspendiert. Die Zellen werden mechanisch durch 4minütiges starkes Schütteln auf einem Vortexmixer mit Glaskugeln (0,45-0,5 mm Durchmesser) aufgebrochen, wobei zwischendurch gekühlt wird. Die Rohextrakte werden direkt für die Bestimmung der Enzymaktivität verwendet. Cells of the transformed Saccharomvces cerevisiae strains BT 150 and H 449 are each grown with uracil selection in minimal yeast media (Difco) enriched with histidine and leucine. The growth rate of the lines is in no way influenced by the introduction of an expression vector. Exponentially growing cells (with an OD578 of 0.5) or stationary cells are harvested by centrifugation, once with 5 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 (buffer 1 ), washed and suspended in a concentration corresponding to 0.1-0.2 OD578 in buffer 1. The cells are broken up mechanically by shaking vigorously for 4 minutes on a vortex mixer with glass balls (0.45-0.5 mm in diameter), with cooling in between. The crude extracts are used directly for the determination of the enzyme activity.

Durch différentielles Zentrifugieren des Extrakts wird eine Fraktionierung der Zellkomponenten erreicht. Der Extrakt wird zuerst 5 Minuten bei 450 g zentrifugiert; der erhaltene Überstand wird anschliessend 45 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert. Fractionation of the cell components is achieved by differential centrifugation of the extract. The extract is first centrifuged at 450 g for 5 minutes; the supernatant obtained is then centrifuged at 20,000 g for 45 minutes.

Der Überstand wird abgezogen, und die Pellets werden in Puffer 1 suspendiert. The supernatant is drawn off and the pellets are suspended in buffer 1.

Für die Phosphatinduktion der GT-Expression unter der Kontrolle des induzierbaren PH05-Promoters werden jeweils Zellen der Transformanten BT 150/pDPGTA8 und H 449/pDPGTA8 in der Masse auf ein Minimalmedium mit niedrigem Phosphatgehalt umgesetzt (Meyhack, B. et a. Embo J. (1982) 1, 675-680). Die Zellextrakte werden wie oben beschrieben hergestellt. For the phosphate induction of GT expression under the control of the inducible PH05 promoter, cells of the transformants BT 150 / pDPGTA8 and H 449 / pDPGTA8 are converted in bulk to a minimal medium with a low phosphate content (Meyhack, B. et a. Embo J. (1982) 1, 675-680). The cell extracts are prepared as described above.

5.2 Proteintest 5.2 Protein test

Die Proteinkonzentration wird durch die Verwendung eines BCA-Proteinassaykit (Pierce) bestimmt. Protein concentration is determined using a BCA protein assay kit (Pierce).

5.3 Test auf GT-Aktivität 5.3 Test for GT activity

GT-Aktivität kann mit radiochemischen Methoden entweder unter der Verwendung von Ovalbumin, eines Glycoproteins, das ausschliesslich GIcNAc als Akzeptor aufweist, oder von freiem GIcNAc als Akzeptorsubstrat gemessen werden. Zellextrakte (mit 1-2 zellbedingten ODS578) werden 45 oder 60 Minuten lang bei 37°C in 100 (il Inkubationsmischung mit 100 mM Tris-HCI pH 7,4, 50 nCi UDP-i4C-Gal (325 mCi/mmol), 80 nmol UDP-Gal, 1 ßmol MnCk, 1% Triton X-100 und 1 mg Ovalbumin oder 2 nmol GIcNAc als Akzeptor getestet. Wenn ein Glycoprotein-Akzeptorsubstrat verwendet wird, wird die Reaktion durch Säurefällung des Proteins abgestoppt, und die Menge an 14C-Galactose, die in das Ovalbumin eingebaut wurde, wird mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt (Berger, E.G. et al. (1978) Eur. J. Biochem. 90, 213-222). Ist GIcNAc das Akzeptorsubstrat, wird die Reaktion durch Zugabe von 0,4 ml eiskaltem H2O abgestoppt, und die nicht aufgenommene UDP-14C-Galactose wird von den ^-Produkten auf einer Anionenaustauschersäule (AG X1-8, BioRad), wie beschrieben, getrennt (Masibay, A.S. und Qasba, P.K. (1989) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86, 5733-5737). Tests mit und ohne Akzeptormoleküle werden durchgeführt, um das Ausmass der Hydrolyse von UDP-Gal durch Nucleotidpyrophospha-tasen zu beurteilen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. GT activity can be measured by radiochemical methods either using ovalbumin, a glycoprotein that has only GIcNAc as the acceptor, or free GIcNAc as the acceptor substrate. Cell extracts (with 1-2 cell-related ODS578) are left for 45 or 60 minutes at 37 ° C in 100 (il incubation mixture with 100 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 nCi UDP-i4C-Gal (325 mCi / mmol), 80 nmol UDP-Gal, 1 µmol MnCk, 1% Triton X-100 and 1 mg ovalbumin or 2 nmol GIcNAc tested as acceptor. If a glycoprotein acceptor substrate is used, the reaction is stopped by acid precipitation of the protein and the amount of 14C- Galactose, which was incorporated into ovalbumin, is determined by liquid scintillation counting (Berger, EG et al. (1978) Eur. J. Biochem. 90, 213-222) ml ice-cold H2O is stopped, and the unabsorbed UDP-14C-galactose is separated from the ^ products on an anion exchange column (AG X1-8, BioRad) as described (Masibay, AS and Qasba, PK (1989) Proc. Nati Acad Sci. USA 86, 5733-5737) Tests with and without acceptor molecules are carried out to determine the extent of the Hy Drolysis of UDP-Gal to be assessed by nucleotide pyrophosphatases. The results are shown in Table 2.

13 13

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Tabelle 2: Table 2:

GT-Aktivität im mit verschiedenen Plasmiden transformierten S. cerevisiae-Stamm BT 150. GT activity in the S. cerevisiae strain BT 150 transformed with various plasmids.

Plasmid Plasmid

PH05-Promoter PH05 promoter

GT-spezifische Aktivität hohes Pi GT specific activity high Pi

(mU/mg Protein) niedriges Pi pDP34 (mU / mg protein) low Pi pDP34

- -

< 0,01 <0.01

n.b.1) n.b.1)

pDPGTA8 pDPGTA8

phosphatreguliert phosphate regulated

0,1 0.1

0,6-1 0.6-1

pDPGTB pDPGTB

konstitutiv constitutive

0,6 0.6

n.b.1) n.b.1)

1) nicht bestimmt 1) not determined

Die GT-Aktivität von auf induzierbare Bedingungen umgestellte Kulturen (Minimalmedium mit niedrigem Pj-Gehalt) ist ungefähr gleich der Aktivität von Kulturen in Minimalmedien, die GT konstitutiv expri-mieren (Tabelle 2). Wie erwartet, findet sich keine Enzymaktivität in Zellen, die nur mit dem Vektor transformiert werden. The GT activity of cultures switched to inducible conditions (minimal medium with low Pj content) is approximately equal to the activity of cultures in minimal media which constitutively express GT (Table 2). As expected, there is no enzyme activity in cells that are only transformed with the vector.

Während der Fraktionierung findet sich die meiste GT-Aktivität (70-90%, siehe Tabelle 3) und die höchste spezifische Aktivität immer im bei der hohen Beschleunigung erhaltenen Pellet (20 000 g). Die Enzymaktivität kann durch einen Zusatz von 1-2% Triton X-100 zum Enzymtest erhöht werden. Beide Ergebnisse lassen darauf schliessen, dass rekombinante GT in Hefezellen sowohl als in HeLa-Zellen membrangebunden vorliegt. During the fractionation, the most GT activity (70-90%, see Table 3) and the highest specific activity are always found in the pellet obtained at the high acceleration (20,000 g). Enzyme activity can be increased by adding 1-2% Triton X-100 to the enzyme test. Both results suggest that recombinant GT is membrane-bound in yeast cells as well as in HeLa cells.

Tabelle S.Verteilung der GT-Aktivität während der Fraktionierung von BT 150/pDPGT5-Zellen Table S. Distribution of GT activity during fractionation of BT 150 / pDPGT5 cells

Fraktion fraction

GT-Aktivität in GIcNAc eingebaute UDP-i4C-Gal, in cpm GT activity in GIcNAc-built UDP-i4C-Gal, in cpm

% %

Rohextakt Raw act

19400 19400

400 g Pellet 400 g pellet

1000 1000

4,6% 4.6%

20 000 g Pellet 20,000 g pellet

15800 15800

72,5% 72.5%

20 000 g Überstand 20,000 g of supernatant

5000 5000

22,9% 22.9%

Gesamt total

21800 21800

100% 100%

Beispiel 6: Example 6:

Reinigung der rekombinanten GT Purification of the recombinant GT

Um das membrangebundene Enzym freizusetzen, wird die 20 000 g-Pelletfraktion der BT 150/pDPG-TB5-Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% (w/v)Triton X-100 behandelt und mit 50 mM Tris HCl pH 7,4, 25 mM MgCl2, 0,5 mM UMP und 1% (w/v) Triton X-100 äquilibriert. Der nach Zentrifu-gation erhaltene Überstand wird 0,2 um filtriert und eine GIcNAc-p-Aminophenyl-Sepharosesäule (Berger, E.G. et al. (1976) Experientia 32, 690-691) wird mit dem Filtrat beschickt, wobei das Bettvolumen 5 ml und die Durchflussrate 0,2 ml/min bei 4°C beträgt. Das Enzym wird mit 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 5 mM GIcNAc, 25 mM EDTA und 1% Triton X-100 eluiert. Ein einziger Peak mit Enzymaktivität wird innerhalb von fünf Fraktionen (Grösse: 1 ml) eluiert. Diese Fraktionen werden zusammengegeben und gegen 2 x 1150 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,1% Triton X-100 dialysiert. Die gereinigte GT ist enzymatisch aktiv. To release the membrane bound enzyme, the 20,000 g pellet fraction of the BT 150 / pDPG-TB5 cells is treated with 1% (w / v) Triton X-100 at room temperature for 10 minutes and with 50 mM Tris HCl pH 7.4 , 25 mM MgCl2, 0.5 mM UMP and 1% (w / v) Triton X-100 equilibrated. The supernatant obtained after centrifugation is filtered 0.2 .mu.m and a filtrate is charged to a GIcNAc-p-aminophenyl-Sepharose column (Berger, EG et al. (1976) Experientia 32, 690-691), the bed volume being 5 ml and the flow rate is 0.2 ml / min at 4 ° C. The enzyme is eluted with 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM GIcNAc, 25 mM EDTA and 1% Triton X-100. A single peak with enzyme activity is eluted within five fractions (size: 1 ml). These fractions are pooled and dialyzed against 2 x 1150 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1% Triton X-100. The cleaned GT is enzymatically active.

Beispiel 7: Example 7:

Konstruktion einer Expressionskassette für lösliche GT Construction of an expression cassette for soluble GT

In Hefe exprimierte Galactosyltransferase kann in das Kulturmedium sezerniert werden, wenn ein Hefepromoter funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für die Signalsequenz des Hefe-Invertasegens SUC2 kodiert und diese im richtigen Leseraster mit einer cDNA verbunden ist, die für eine lösliche GT kodiert. Galactosyltransferase expressed in yeast can be secreted into the culture medium if a yeast promoter is functionally linked to a first DNA sequence which codes for the signal sequence of the yeast invertase gene SUC2 and which is linked in the correct reading frame to a cDNA which is used for a soluble GT encoded.

(a)HeLa-GT-cDNA-Teiisequenz (a) HeLa GT cDNA sequence

GT-cDNA wird aus Plasmid p4AD113 (Beispiel 1) mittels EcoRI-Verdau freigesetzt. Das 1,2 kb Fragment mit der vollständigen GT-cDNA wird isoliert und mit Mvnl (Boehringer) teilverdaut, wobei die GT- GT cDNA is released from plasmid p4AD113 (Example 1) by means of EcoRI digestion. The 1.2 kb fragment with the complete GT cDNA is isolated and partially digested with Mvnl (Boehringer), the GT

14 14

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Sequenz in den Positionen 43, 55, 140 und 288 der in SEQ ID-Nr. 1 abgebildeten Nucleotidsequenz geschnitten wird. Wenn 0,2 (ig des EcoRI-EcoRI-Fragments eine Stunde lang mit 0,75 ß Mvnl verdaut werden, wird die GT-cDNA nur ein einziges Mal in der Nucleotidposition 134 geschnitten, wobei ein 1,1 kb Mvnl-EcoRi-Fragment entsteht. Sequence in positions 43, 55, 140 and 288 of the in SEQ ID no. 1 shown nucleotide sequence is cut. When 0.2 µg of the EcoRI-EcoRI fragment is digested with 0.75β Mvnl for one hour, the GT cDNA is cut only once at nucleotide position 134, with a 1.1 kb Mvnl EcoRi fragment arises.

(b) Vektor für die Amplifizierung in E. coli (b) Vector for amplification in E. coli

Plasmid pUC18 (Pharmacia) wird mit BamHI und EcoRI an der multiplen Klonierungsstelle geschnitten. Das Plasmid wird anschliessend mit alkalischer Phosphatase, wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) beschrieben, behandelt, einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, und aus dem Gel als 2,7 kb DNA-Fragments isoliert. Plasmid pUC18 (Pharmacia) is cut with BamHI and EcoRI at the multiple cloning site. The plasmid is then treated with alkaline phosphatase as described in the Maniatis manual (see above), subjected to agarose gel electrophoresis, and isolated from the gel as a 2.7 kb DNA fragment.

(c) Der konstitutive PH05M 73)-Promoter und die SUC2-Sianalseauenz (c) The constitutive PH05M 73) promoter and the SUC2 sianal sequence

Der Vektor p31/PH05f-173l RIT(Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut. Ein 0,25 kb BamHI-Xhol-Fragment mit dem konstitutiven PH05H 73)-Promoter und der benachbarten Sequenz, die für die Invertase-Signalsequenz (inv ss) kodiert, wird isoliert. Das Fragment wird dann nochmals mit Hgal (BioLabs) geschnitten. Die Hgal-Erkennungssequenz befindet sich auf dem DNA-Antisensestrang. Das Restriktionsenzym schneidet «stromaufwärts» der Erkennungssequenz auf solche Weise, dass das 5-überstehende Ende des Antisensestrangs mit dem Ende der kodierenden Sequenz der Invertase-Signalsequenz übereinstimmt. Das mit BamHI und Hgal geschnittene 0,24 kb DNA-Fragment enthält die konstitutive PH05(-173)-Promotersequenz, die mit der Hefe-Invertase-Signalse-quenz verbunden ist. The vector p31 / PH05f-173l RIT (Example 2) is digested with the restriction enzymes BamHI and Xhol. A 0.25 kb BamHI-Xhol fragment with the constitutive PH05H 73) promoter and the adjacent sequence, which codes for the invertase signal sequence (inv ss), is isolated. The fragment is then cut again with Hgal (BioLabs). The Hgal recognition sequence is on the DNA antisense strand. The restriction enzyme cuts "upstream" of the recognition sequence in such a way that the 5-protruding end of the antisense strand coincides with the end of the coding sequence of the invertase signal sequence. The 0.24 kb DNA fragment cut with BamHI and Hgal contains the constitutive PH05 (-173) promoter sequence which is linked to the yeast invertase signal sequence.

(d) Adaptor (d) adapter

Fragment (a) ist mit Fragment (c) mittels einer Adaptorsequenz verbunden, die aus äquimolaren Mengen der synthetischen Oligonucleotide (Microsynth) 5'CT GCA CTG GCT GGC CG 3' und 5'CG GCC AGC CAG 3' für den Komplementärstrang hergestellt wird. Die Oligonucleotide werden aneinander dadurch angelagert, dass sie zuerst auf 95°C erhitzt werden und dann langsam auf 20°C gekühlt werden. Der angelagerte Adaptor wird in gefrorenem Zustand aufbewahrt. Fragment (a) is linked to fragment (c) by means of an adapter sequence which is produced from equimolar amounts of the synthetic oligonucleotides (microsynth) 5'CT GCA CTG GCT GGC CG 3 'and 5'CG GCC AGC CAG 3' for the complementary strand. The oligonucleotides are attached to one another by first heating them to 95 ° C. and then slowly cooling them to 20 ° C. The attached adapter is kept frozen.

(e) Konstruktion des Plasmids psGT (e) Construction of the plasmid psGT

Für die Ligation werden der linearisierte Vektor (b), das GT-cDNA Fragment (a), Fragment (c) mit dem Promoter und der Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, und Adaptor (d) in einem molaren Verhältnis von 1:2:2:30-100 eingesetzt. Die Ligation wird in 12 ni Ligasepuffer (66 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCfe, 1 mM ATP) 18 Stunden lang bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsmischung wird für die Transformation kompetenter E. coli-Stamm DH5a-Zellen (siehe oben) verwendet. Von 24 unabhängigen Transformanten werden Plasmid-Minipräparationen durchgeführt. Die isolierten Plasmide werden durch Restriktionsanalyse mit vier verschiedenen Enzymen (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol, auch in Kombination) charakterisiert. Ein Einzelklon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird als psGT bezeichnet. For the ligation, the linearized vector (b), the GT cDNA fragment (a), fragment (c) with the promoter and the sequence coding for the signal peptide, and adapter (d) in a molar ratio of 1: 2 : 2: 30-100. The ligation is carried out in 12 ni ligase buffer (66 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM dithioerythritol, 5 mM MgCfe, 1 mM ATP) at 16 ° C. for 18 hours. The ligation mixture is used for the transformation of competent E. coli strain DH5a cells (see above). Plasmid mini-preparations are carried out from 24 independent transformants. The isolated plasmids are characterized by restriction analysis with four different enzymes (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol, also in combination). A single clone with the expected restriction pattern is called psGT.

Die richtige Sequenz an der Fusionsstelle der Sequenz, die Invertase-Signalpeptid kodiert, mit der cDNA, die für lösliche GT kodiert, wird für Plasmid-psGT dadurch bestätigt, dass das T7-Sequencing Kit (Pharmacia) und Primer 5' AGTCGAGGTTAGTATGGC 3', der in Position -77 im konstitutiven PH05M 73i-Promoter beginnt, verwendet werden. The correct sequence at the fusion site of the sequence encoding invertase signal peptide with the cDNA encoding soluble GT is confirmed for plasmid psGT by the fact that the T7 sequencing kit (Pharmacia) and primer 5 'AGTCGAGGTTAGTATGGC 3', beginning in position -77 in the constitutive PH05M 73i promoter can be used.

DNA- Mvnl DNA Mvnl

Sequenz^^: 5' AAA ATA Tct gca ctg gct ggc cgC GAC CTG AGC 3' Sequence ^^: 5 'AAA ATA Tct gca ctg gct ggc cgC GAC CTG AGC 3'

3' TTT TAT AGA CGT Protein: Lys Ile Ser Ala 3 'TTT TAT AGA CGT Protein: Lys Ile Ser Ala

16 19 16 19

inv ss gac cga ccg gcG CAG GAC TCG 5' Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 42 inv ss gac cga ccg gcG CAG GAC TCG 5 'Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 42

GT Sequenz Schnittstelle für Signal-Endopeptidase GT sequence interface for signal endopeptidase

Kleinbuchstaben bezeichnen die Adaptersequenz Lower case letters denote the adapter sequence

15 15

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Die Expressionskassette für lösliche GT, die den konstitutiven PH05M 73)-Promoter, die für Inverta-se-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die partielle GT-cDNA aus dem Plasmid psGT enthält, kann in Form eines 1,35 kb Sali (BamHI)-EcoRI-Fragments herausgeschnitten werden. Der Expressionskassette fehlen noch immer die PH05-Terminatorseauenzen. die im anschliessenden Klonierungs-schritt zugefügt werden. The expression cassette for soluble GT, which contains the constitutive PH05M 73) promoter, the DNA sequence coding for inverted signal peptide and the partial GT cDNA from the plasmid psGT, can be in the form of a 1.35 kb Sali (BamHI) -EcoRI fragments are cut out. The expression cassette is still missing the PH05 terminator sequences. which are added in the subsequent cloning step.

Beispiel 8: Example 8:

Konstruktion des Expressionsvektors dDPGTS Construction of the expression vector dDPGTS

Die folgenden Fragmente werden zusammengefügt, um den Expressionsvektor für lösliche GT zu konstruieren: The following fragments are assembled to construct the soluble GT expression vector:

(a) Vektorteil (a) Vector part

Plasmid pDP34 wird verdaut und wie in Beispiel 3 beschrieben vorbehandelt, wobei ein stumpfendi-ges Sall-Vektorfragment von 11,8 kb entsteht. Plasmid pDP34 is digested and pretreated as described in Example 3, producing a blunt-digested Sall vector fragment of 11.8 kb.

(b) Expressionskassette (b) Expression cassette

Plasmid psGT wird erst durch Verdau mit Sali (an der multiplen Klonierungsstelle) linearisiert und anschliessend mit EcoRI teilverdaut. Ein 1,35 kb DNA-Fragment, das den konstitutiven PH05f-173i-Pro-moter, eine das Hefe-Invertase-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die partielle GT-cDNA enthält, wird isoliert. Plasmid psGT is first linearized by digestion with Sali (at the multiple cloning site) and then partially digested with EcoRI. A 1.35 kb DNA fragment containing the constitutive PH05f-173i promoter, a DNA sequence encoding the yeast invertase signal peptide and the partial GT cDNA is isolated.

(c) PH05-Terminatorsequenz (c) PH05 terminator sequence

Die PH05-Terminatorsequenz wird aus Plasmid p31 isoliert, welches wie in EP 100 561 beschrieben aus Plasmid p30 konstruiert wird. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym HindIII werden die überstehenden Enden mittels Klenow-Polymerasebehandlung, wie oben beschrieben, aufgefüllt. Das Plasmid wird dann mit EcoRI verdaut, und ein stumpfendiges EcoRI-Fragment von 0,39 kb mit den PH05-Termi-natorsequenzen isoliert. The PH05 terminator sequence is isolated from plasmid p31, which is constructed from plasmid p30 as described in EP 100 561. After digestion with the restriction enzyme HindIII, the protruding ends are filled in using Klenow polymerase treatment as described above. The plasmid is then digested with EcoRI and a blunt-ended EcoRI fragment of 0.39 kb with the PH05 terminator sequences is isolated.

Die Ligation der Fragmente (a), (b) und (c) und die Transformation kompetenter Zellen des E. coli-Stamms DH5a werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Aus den erhaltenen Transformanten werden Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid eines Klons mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als pDPGTS bezeichnet. The ligation of fragments (a), (b) and (c) and the transformation of competent cells of the E. coli strain DH5a are carried out as described in Example 2. Plasmids are isolated from the transformants obtained and characterized by restriction analysis. The plasmid of a clone with the correct restriction fragments is called pDPGTS.

Beispiel 9: Example 9:

Expression löslicher GT in Hefe Expression of soluble GT in yeast

Analog zu Beispiel 4 wird mittels CsCI gereinigte DNA des Expressionsvektors pDPGTS für die Transformation der S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 verwendet. Ura+-Transformanten werden isoliert und einem Screening auf GT-Aktivität unterworfen. Jeweils eine Transformante wird ausgewählt und jeweils als Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTS und Saccharomvces cerevisiae H 449/ pDPGTS bezeichnet. Bei Durchführung des in Beispiel 5 beschriebenen Tests findet sich GT-Aktivität in den Kulturbrühen beider Transformanten. Analogously to Example 4, DNA of the expression vector pDPGTS purified by means of CsCI is used for the transformation of the S. cerevisiae strains BT 150 and H 449. Ura + transformants are isolated and screened for GT activity. One transformant each is selected and referred to as Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPGTS and Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDPGTS, respectively. When the test described in Example 5 is carried out, GT activity is found in the culture broths of both transformants.

Beispiel 10: Example 10:

Klonierung der Siaiyitransferase (STi-cDNA aus menschlichen HepG2-Zellen Cloning of siaiyitransferase (STi cDNA from human HepG2 cells

ST-cDNA wird aus HepG2-Zellen mittels PCR analog zur GT-cDNA isoliert. Die Präparation von Po-ly(A)+RNA und die Synthese von Erststrang-cDNA werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die für die PCR verwendeten Primer (Microsynth) sind in Tabelle 5 aufgeführt. ST-cDNA is isolated from HepG2 cells by means of PCR analogous to GT-cDNA. The preparation of poly (A) + RNA and the synthesis of first-strand cDNA are carried out as described in Example 1. The primers (Microsynth) used for the PCR are listed in Table 5.

16 16

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Tabelle 5: PCR-Primer enspricht bp Table 5: PCR primer corresponds to bp

Primer Sequenz (5' to 3')1} in ST cDNA2) Primer sequence (5 'to 3') 1} in ST cDNA2)

PslI/EcoRI PslI / EcoRI

SIA1 cgctgcagaattcaaaATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGT 1 - 28 BamHI ' SIA1 cgctgcagaattcaaaATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGT 1 - 28 BamHI '

SI A3 cgcggatCCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC 1228 - 1198 SI A3 cgcggatCCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC 1228-1198

^ Grossbuchstaben stehen für ST-Sequenzen, Kleinbuchstaben sind zusätzliche Sequnzen mit Restriktionsstellen (unterstrichen). "Start"- und "Stop-" Codons für die Proteinsynthese sind fettgedruckt. ^ Upper case letters stand for ST sequences, lower case letters are additional sequnts with restriction points (underlined). "Start" and "stop" codons for protein synthesis are printed in bold.

^ ST -cDNA -Sequenz aus menschlicher Plazenta (27) wie in EMBL Data Bank (Emgangs-Nr.X 17247) veröffentlicht. ^ ST cDNA sequence from human placenta (27) as published in EMBL Data Bank (Issue No.X 17247).

HepG2-ST-cDNA kann mittels der Primer SIA1 und SIA3 als ein 1,2 kb DNA-Fragments amplifiziert werden. Die PCR wird wie für GT-cDNA beschrieben unter leicht abgeänderten Zyklusbedingungen durchgeführt: 0,5 Minuten Denaturieren bei 95°C, 1 Minute 15 Sekunden Anlagern bei 56°C, und 1 Minute 30 Sekunden Verlängerung bei 72°C, über insgesamt 25 bis 35 Zyklen. Im letzten Zyklus dauert die Primer-Verlängerung bei 72°C 5 Minuten. HepG2-ST cDNA can be amplified using the primers SIA1 and SIA3 as a 1.2 kb DNA fragment. The PCR is carried out as described for GT-cDNA under slightly changed cycle conditions: 0.5 minutes denaturing at 95 ° C, 1 minute 15 seconds attachment at 56 ° C, and 1 minute 30 seconds extension at 72 ° C, over a total of 25 to 35 cycles. In the last cycle, primer extension takes 5 minutes at 72 ° C.

Nach der PCR-Amplifizierung wird das 1,2 kb Fragment mit den Restriktionsenzymen BamHI und Pstl verdaut, der Verdau wird auf einem 1,2%igen Agarosegel analysiert, aus dem Gel eluiert und in den Vektor pl)C18 subkloniert. Der erhaltenen Subklon wird als pSIA2 bezeichnet. After the PCR amplification, the 1.2 kb fragment is digested with the restriction enzymes BamHI and Pstl, the digestion is analyzed on a 1.2% agarose gel, eluted from the gel and subcloned into the vector pl) C18. The subclone obtained is called pSIA2.

Beispiel 11: Example 11:

Konstruktion der konstitutiven ST-Expressionskassette Construction of the constitutive ST expression cassette

Für konstitutive heterologe Expression wird ST-cDNA mit dem konstitutiven PH05(-173)-Promoterfrag-ment und den PH05-Terminatorsequenzen ligiert. For constitutive heterologous expression, ST cDNA is ligated with the constitutive PH05 (-173) promoter fragment and the PH05 terminator sequences.

Plasmid pSIA2 wird erst durch Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI linearisiert und anschliessend mit EcoRI teilverdaut. Da ST-cDNA ebenfalls eine interne Restriktionsstelle für das Enzym EcoRI enthält (bei bp 144), wird ein 1,2 kb Fragment mit der kompletten ST-cDNA (SEQ. ID-Nr. 3) durch Teilverdau mit EcoRI hergestellt, wobei 1 p,g DNA und 0,25 U EcoRI verwendet werden (1 h, 37°C). Nach Gelelektrophorese wird das 1,2 kb EcoRI-BamHI-Fragment mit der kompletten ST-cDNA (SEQ ID-Nr. 3) isoliert. Auf diesem DNA-Fragment befindet sich das «ATG»-Startcodon für die Translation von ST in der Nähe der EcoRI-Restriktionsstelle. Drei Adenosinphosphate (siehe PCR Primer SIA 1) stellen ein «A» in der bp-Position 12 zur Verfügung, welches sich in der Konsens-Sequenz um «ATG» aus hoch-exprimierten Genen in Hefe findet (Hamilton, R. et al. (1987) Nucleic Acids Res. 14, 5125-5149). An das Stop-Codon «TAA» und an 5 bp der 3'-untranslatierten Genregion schliesst sich die BamHI-Stelle an. Plasmid pSIA2 is first linearized by digestion with the restriction enzyme BamHI and then partially digested with EcoRI. Since ST-cDNA also contains an internal restriction site for the enzyme EcoRI (at bp 144), a 1.2 kb fragment with the complete ST-cDNA (SEQ. ID No. 3) is produced by partial digestion with EcoRI, 1 p , g DNA and 0.25 U EcoRI can be used (1 h, 37 ° C). After gel electrophoresis, the 1.2 kb EcoRI-BamHI fragment with the complete ST cDNA (SEQ ID No. 3) is isolated. The «ATG» start codon for the translation of ST is located on this DNA fragment in the vicinity of the EcoRI restriction site. Three adenosine phosphates (see PCR primer SIA 1) provide an “A” in bp position 12, which is found in the consensus sequence for “ATG” from highly expressed genes in yeast (Hamilton, R. et al. (1987) Nucleic Acids Res. 14, 5125-5149). The BamHI site follows the stop codon “TAA” and 5 bp of the 3 ′ untranslated gene region.

Das 1,2 kb EcoRI-BamHI-ST-cDNA-Fragment wird mit dem 0,45 kb Sall-EcoRI-Fragment mit dem konstitutiven PH05M73)-Promoter (Beispiel 2.2(b)) und mit einem 3,5 kb BamHI-Sall-Vektorteil für die Amplifizierung in E. coli, der die PH05-Terminatorseauenz enthält (vgl. Beispiel 2.1, Fragment (b)) ligiert. Ligation und Transformation von E. coli-Stamm DH5a werden, wie in Beispiel 2.1 näher angegeben, durchgeführt. Ein Klon, der das erwartete Restriktionsmuster aufweist, wird als pST2 bezeichnet. The 1.2 kb EcoRI-BamHI-ST cDNA fragment is combined with the 0.45 kb Sall-EcoRI fragment with the constitutive PH05M73) promoter (Example 2.2 (b)) and with a 3.5 kb BamHI-Sall -Vector part for the amplification in E. coli, which contains the PH05 terminator sequence (cf. Example 2.1, fragment (b)) ligated. Ligation and transformation of E. coli strain DH5a are carried out as specified in Example 2.1. A clone that has the expected restriction pattern is called pST2.

Vektor pST2 enthält die Expressionskassette für HepG2-ST unter der Kontrolle des konstitutiven PH05M 73)-Promoters in der Form eines 2,0 kb Sall-Hindlll-Fragments, das als DNA-Fragment (IC) bezeichnet wird. Vector pST2 contains the expression cassette for HepG2-ST under the control of the constitutive PH05M 73) promoter in the form of a 2.0 kb SalI-HindIII fragment, which is referred to as a DNA fragment (IC).

Beispiel 12: Example 12:

Expression von ST in Hefe Expression of ST in yeast

Vektor pDP34 (vgl. EP 340 170) wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Der linearisierte Vektor wird mit GENECLEAN isoliert und die überstehenden Enden werden mittels Klenow-Polymerase-behandlung wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) beschrieben aufgefüllt. Die Reaktion wird nach 30 Minuten durch 20minütiges Erhitzen auf 65°C in der Gegenwart von 10 mM EDTA abgestoppt. Nach Ethanolfällung wird das Plasmid mit Sali verdaut und einer Gelelektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel unterworfen. Der (BamHI)-stumpfendige, mit Sali geschnittene Vektor pDP34 wird mit dem GENECLEAN-Kit in der Form eines 11,8 kb DNA-Fragments isoliert. Vector pDP34 (cf. EP 340 170) is digested with the restriction enzyme BamHI. The linearized vector is isolated with GENECLEAN and the protruding ends are filled in using Klenow polymerase treatment as described in the Maniatis manual (see above). The reaction is stopped after 30 minutes by heating at 65 ° C for 20 minutes in the presence of 10 mM EDTA. After ethanol precipitation, the plasmid is digested with saline and subjected to gel electrophoresis on a 0.8% agarose gel. The (BamHI) blunt-ended, sali-cut vector pDP34 is isolated with the GENECLEAN kit in the form of an 11.8 kb DNA fragment.

Plasmid pST2 wird mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und analog zur Präparation des Vek- Plasmid pST2 is digested with the restriction enzyme HindIII and analogous to the preparation of the vector

17 17th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

tors mittels Klenow-Polymerasebehandlung an der Hindi I-Stelle aufgefüllt, und zwar analog zur Präparation des Vektors. Das Produkt wird mit Sali verdaut, wobei ein 2,0 kb (Hindlll)-stumpfendiges Sall-Fragment mit der konstitutiven ST-Expressionskassette entsteht (2C). tors filled by Klenow polymerase treatment at the Hindi I site, analogously to the preparation of the vector. The product is digested with sali, whereby a 2.0 kb (Hindlll) blunt-ended SalI fragment is formed with the constitutive ST expression cassette (2C).

Die Ligation von 80 ng des pDP34-Vektors mit 40 ng Fragment 2C, und die Transformation kompetenter Zellen von E. coli-Stamm DH5a wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Ein Klon, der das erwartete Restriktionsmuster aufweist, wird ausgewählt und als pDPSTö bezeichnet. The ligation of 80 ng of the pDP34 vector with 40 ng fragment 2C, and the transformation of competent cells from E. coli strain DH5a is carried out as described in Example 2. A clone that has the expected restriction pattern is selected and designated pDPSTo.

Zur Transformation von Hefe wird mit CsCI gereinigte DNA des Expressionsvektors pDPST5 nach der im Maniatis-Handbuch (siehe oben) angegebenen Standardmethode hergestellt. Die S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 werden jeweils mit 5 ng Plasmid-DNA nach der Lithiumacetat-Transformati-onsmethode transformiert (Ito, H. et al, siehe oben). Ura+-Transformanten werden selektiert und einem Screening auf ST-Aktivität unterworfen. Jeweils eine positive Transformante wird ausgewählt und als Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPST5 und Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPST5 bezeichnet. For the transformation of yeast, DNA of the expression vector pDPST5 purified with CsCI is produced according to the standard method given in the Maniatis manual (see above). The S. cerevisiae strains BT 150 and H 449 are each transformed with 5 ng plasmid DNA according to the lithium acetate transformation method (Ito, H. et al, see above). Ura + transformants are selected and screened for ST activity. In each case a positive transformant is selected and designated Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPST5 and Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDPST5.

Beispiel 13: Example 13:

Enzvmaktivität vollständiger in Hefe exprimierter ST Enzyme activity of complete ST expressed in yeast

13.1 Herstellung von Zellextrakten 13.1 Production of cell extracts

Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPST5-Zellen werden unter Uracil-Selektion auf mit Histidin und Leucin angereicherten Minimal-Hefemedien gezüchtet. Exponentiell wachsende Zellen (bei einer OD578 von 0,5) oder stationäre Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet, einmal mit 50 mM Imidazolpuffer pH 7,0 (Puffer 1) gewaschen, und bei einer Konzentration entsprechend 0,1-0,2 OD578 wieder in Puffer 1 suspendiert. Die Zellen werden mechanisch durch kräftiges 4minütiges Schütteln mit Glasperlen (0,45-0,5 mm Durchmesser) auf einem Vortex-Mixer aufgebrochen, wobei zwischendurch gekühlt wird. Die ST-Aktivität in den Rohextrakten kann mit dem unten beschriebenen Test gemessen werden. Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPST5 cells are grown with uracil selection on minimal yeast media enriched with histidine and leucine. Exponentially growing cells (with an OD578 of 0.5) or stationary cells are harvested by centrifugation, washed once with 50 mM imidazole buffer pH 7.0 (buffer 1), and in again at a concentration corresponding to 0.1-0.2 OD578 Buffer 1 suspended. The cells are broken up mechanically by shaking vigorously for 4 minutes with glass beads (0.45-0.5 mm in diameter) on a vortex mixer, with cooling in between. The ST activity in the crude extracts can be measured using the test described below.

13.2 Test auf ST-Aktivität 13.2 Test for ST activity

Die ST-Aktivität kann dadurch bestimmt werden, dass die Menge an radioaktiv markierter Sialinsäure die von der CMP-Sialinsäure auf einen Glycoproteinakzeptor übertragen wird, gemessen wird. Nach Beendigung der Reaktion durch Säurefällung wird der Niederschlag über Glasfaserfilter (Whatman GFA) filtriert, gründlich mit eiskaltem Ethanol gewaschen und durch Flüssigszintillationszählung (Hesford et al. (1984), Glycoconjugate J. 1, 141-153) auf Radioaktivität getestet. Die Zellextrakte werden 45 Minuten lang in einer Inkubationsmischung getestet, die 37 nl Zellextrakt, was ungefähr 0,5 mg Protein entspricht, und 3 n' Imidazol-Puffer 50 mMol/i, pH 7,0, 50 nMol CMP-N-Acetylneuraminsäure (Sigma) mit einem Zusatz von CMP-3H-N-Acetylneuraminsäure (Amersham), um schliesslich eine spezifische Aktivität von 7,3 Ci/mol zu erhalten, und 75 ng Asialo-Fetuin (hergestellt durch 60minütige Säurehydrolyse mit 0,1 M H2SO4 bei 80°C und anschliessende Neutralisierung, Dialyse und Lyophilisierung) enthält. ST activity can be determined by measuring the amount of radiolabeled sialic acid that is transferred from CMP sialic acid to a glycoprotein acceptor. After completion of the reaction by acid precipitation, the precipitate is filtered through glass fiber filters (Whatman GFA), washed thoroughly with ice-cold ethanol and tested for radioactivity by liquid scintillation counting (Hesford et al. (1984), Glycoconjugate J. 1, 141-153). The cell extracts are tested for 45 minutes in an incubation mixture containing 37 nl cell extract, which corresponds to approximately 0.5 mg protein, and 3 n 'imidazole buffer 50 mmol / i, pH 7.0, 50 nmol CMP-N-acetylneuraminic acid ( Sigma) with the addition of CMP-3H-N-acetylneuraminic acid (Amersham) to finally obtain a specific activity of 7.3 Ci / mol and 75 ng Asialo-Fetuin (produced by acid hydrolysis with 0.1 M H2SO4 for 60 minutes 80 ° C and subsequent neutralization, dialysis and lyophilization) contains.

ST-Aktivität findet sich in den aus S. cerevisiae BT 150/pDPST5- und H449/pDPST5-Zellen hergestellten Rohextrakten. ST activity is found in the crude extracts made from S. cerevisiae BT 150 / pDPST5 and H449 / pDPST5 cells.

Beispiel 14: Example 14:

Konstruktion einer Expressionskassette für lösliche ST (Lvsaa-Cvsanfii Construction of an expression cassette for soluble ST (Lvsaa-Cvsanfii

Die als ST(Lys39-Cys406) bezeichnete lösliche ST ist eine N-terminal verkürzte Variante und besteht aus 368 Aminosäuren (SEQ. ID-Nr.4). The soluble ST (Lys39-Cys406) is an N-terminal shortened variant and consists of 368 amino acids (SEQ. ID No. 4).

(a) HepG2-ST-cDNA-Teilsequenz (a) HepG2-ST cDNA partial sequence

Plasmid pSIA2 wird mit EcoRI verdaut und ein 1,1 kb EcoRI-EcoRi-Fragment isoliert. Plasmid pSIA2 is digested with EcoRI and a 1.1 kb EcoRI-EcoRi fragment is isolated.

(b) Vektor für die Amplifizierung in E. coli (b) Vector for amplification in E. coli

Plasmid pUC18 (Pharmacia) wird an der multiplen Klonierungsstelle mit BamHI und EcoRI verdaut. Das Plasmid wird anschliessend mit alkalischer Phosphatase, wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) beschrieben, behandelt, einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und vom Gel in der Form eines 2,7 kb DNA-Fragments isoliert. Plasmid pUC18 (Pharmacia) is digested with BamHI and EcoRI at the multiple cloning site. The plasmid is then treated with alkaline phosphatase as described in the Maniatis manual (see above), subjected to agarose gel electrophoresis and isolated from the gel in the form of a 2.7 kb DNA fragment.

(c) Der konstitutive PH05f-173)-Promoter und die SUC2-Sianalsequenz (c) The constitutive PH05f-173) promoter and the SUC2 sianal sequence

Der Vektor p31/PH05f-173ì RIT (Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut. Ein 0,25 kb BamHI-Xhol-Fragment mit dem konstitutiven PH05M73)-Promoter und der benachbarten Kodiersequenz für die Invertase-Signalsequenz (inv ss) wird isoliert. Das Fragment wird anschliessend nochmals mit Hgal (BioLabs) geschnitten. Die Hgal-Erkennungssequenz findet sich auf dem DNA-Antisensestrang. Das Restriktionsenzym schneidet oberhalb der Erkennungssequenz auf sol18 The vector p31 / PH05f-173ì RIT (Example 2) is digested with the restriction enzymes BamHI and Xhol. A 0.25 kb BamHI-Xhol fragment with the constitutive PH05M73) promoter and the adjacent coding sequence for the invertase signal sequence (inv ss) is isolated. The fragment is then cut again with Hgal (BioLabs). The Hgal recognition sequence can be found on the DNA antisense strand. The restriction enzyme cuts to sol18 above the recognition sequence

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

che Weise, dass das 5-überstehende Ende des Antisensestrangs mit dem Ende der Kodiersequenz der Invertase-Signalsequenz übereinstimmt. Das mit BamHI und Hgal geschnittenen 0,24 kb DNA-Fragment enthält die an die Hefe-Invertase-Signalsequenz gebundene konstitutive PH05H 73)-Promotersequenz. way that the 5-protruding end of the antisense strand coincides with the end of the coding sequence of the invertase signal sequence. The 0.24 kb DNA fragment cut with BamHI and Hgal contains the constitutive PH05H 73) promoter sequence bound to the yeast invertase signal sequence.

(d) Adaptor (d) adapter

Fragment (a) ist an Fragment (c) über eine Adaptorsequenz gebunden, die aus äquimolaren Mengen der synthetischen Oligonucleotide 5' CTGCAAAATTGCAAACCAAGG 3' und Fragment (a) is linked to fragment (c) via an adapter sequence which consists of equimolar amounts of the synthetic oligonucleotides 5 'CTGCAAAATTGCAAACCAAGG 3' and

5' AATTCCTTGGTTTGCAATTT 3' im Falle des Komplementärstrangs hergestellt wird. Die Oligonucleotide werden einander dadurch angelagert, dass sie zuerst auf 95°C erhitzt werden und dann langsam auf 20°C gekühlt werden. Der angelagerte Adaptor wird im gefrorenen Zustand aufbewahrt. 5 'AATTCCTTGGTTTGCAATTT 3' is produced in the case of the complementary strand. The oligonucleotides are attached to one another by first heating them to 95 ° C. and then slowly cooling them to 20 ° C. The attached adapter is stored in the frozen state.

(e) Konstruktion einer Plasmid psST (e) Construction of a plasmid psST

Für die Ligation werden der linearisierte Vektor (b), das STcDNA-Fragment (a), Fragment (c) mit dem Promoter und der für das Signalpeptid kodierenden Sequenz, und Adaptor (d) in einem molaren Verhältnis von 1:2:2:30-100 verwendet. Die Ligation erfolgt über 18 Stunden in 12 |il Ligasepuffer (66 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCI2, 1 mM ATP) bei 16°C. Mit der Ligationsmischung werden kompetente Zellen des E. coli-Stamms DH5a wie oben beschrieben transformiert. Plasmid-Mi-nipräparationen werden aus 24 unabhängigen Transformanten hergestellt. Ein einzelner Klon, der nach Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse mit vier verschiedenen Enzymen (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol, auch in Kombination) das erwartete Restriktionsmuster zeigt, wird als psST bezeichnet. For the ligation, the linearized vector (b), the STcDNA fragment (a), fragment (c) with the promoter and the sequence coding for the signal peptide, and adapter (d) are used in a molar ratio of 1: 2: 2: 30-100 used. The ligation is carried out over 18 hours in 12 μl ligase buffer (66 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM dithioerythritol, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP) at 16 ° C. Competent cells of the E. coli strain DH5a are transformed with the ligation mixture as described above. Plasmid mi-nip preparations are made from 24 independent transformants. A single clone that shows the expected restriction pattern after characterization by restriction analysis with four different enzymes (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol, also in combination) is called psST.

Die korrekte Sequenz an der Fusionsstelle der für das Invertase-Signalpeptid kodierenden Sequenz mit der für lösliche ST kodierenden cDNA(Lys39-Cys406) wird für Plasmid psST mittels des T7-Sequen-cing Kit (Pharmacia) und Primer 5' ACGAGGTTAATGGC 3', der bei Position -77 im konstitutiven PH05-(-173)-Promoter beginnt, bestätigt. The correct sequence at the fusion site of the sequence coding for the invertase signal peptide with the cDNA coding for soluble ST (Lys39-Cys406) is determined for plasmid psST using the T7-Sequence-cing Kit (Pharmacia) and primer 5 'ACGAGGTTAATGGC 3', the starts at position -77 in the constitutive PH05 - (- 173) promoter, confirmed.

DNA- DNA

Sequenz^- ^ Sequence ^ - ^

Protein inv ss ST Sequenz Protein inv ss ST sequence

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase Interface for signal endopeptidase

^ Kleinbuchstaben bezeichnen die Adaptersequenz ^ Lower case letters denote the adapter sequence

Die Expressionskassette für lösliche ST mit dem konstitutiven PH05M 73VPromoter. der für Invertase-Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST cDNA aus Plasmid psST kann in der Form eines 1,35 kb Sali (BamHI)-EcoRI-Fragments herausgeschnitten werden. Der Expressionskassette fehlen noch immer die im anschliessenden Klonierungsschritt anzufügenden PH05-Terminatorsequen-zen. The expression cassette for soluble ST with the constitutive PH05M 73V promoter. the DNA sequence coding for invertase signal peptide and the partial ST cDNA from plasmid psST can be excised in the form of a 1.35 kb Sali (BamHI) EcoRI fragment. The expression cassette still lacks the PH05 terminator sequences to be added in the subsequent cloning step.

Beispiel 15: Example 15:

Konstruktion des Expressionsvektors pDPSTS Construction of the expression vector pDPSTS

Zur Konstruktion des Expressionsvektors für lösliche ST(Lys39-Cys406) werden die folgenden Fragmente zusammengefügt: The following fragments are assembled to construct the expression vector for soluble ST (Lys39-Cys406):

5' 5 '

AAA AAA

ATA ATA

Tct gca aaa ttg caa acc aag gAA 3' Tct gca aaa ttg caa acc aag gAA 3 '

3' 3 '

TTT TTT

TAT DID

AGA AGA

GTG GTG

ttt aac gtt tgg ttc ctt 5 ' ttt aac gtt tgg ttc ctt 5 '

Lys Lys

Ile Ile

Ser Ser

Ala Ala

Lys Lys

Leu Leu

Gin gin

Thr Thr

Lys Lys

Glu Glu

16 16

19 19th

39 39

19 19th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

(a) Vektorteil (a) Vector part

Plasmid pDP34 wird verdaut und wie in Beispiel 3 beschrieben vorbehandelt, was ein stumpfendiges Sall-Vektorfragment von 11,8 kb ergibt. Plasmid pDP34 is digested and pretreated as described in Example 3, which results in a blunt-ended SalI vector fragment of 11.8 kb.

(b) Expressionskassette (b) Expression cassette

Plasmid psST wird erst durch Verdauung mit Sali (an der multiplen Klonierungsstelle) linearisiert und dann mit EcoRI teilverdaut. Ein 1,35 kb DNA-Fragment mit dem konstitutiven PH05M 73i-Promoter. einer für das Hefe-Invertasesignalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST-cDNA wird isoliert. Plasmid psST is first linearized by digestion with Sali (at the multiple cloning site) and then partially digested with EcoRI. A 1.35 kb DNA fragment with the constitutive PH05M 73i promoter. a DNA sequence coding for the yeast invertase signal peptide and the partial ST cDNA is isolated.

(c) PH05-Terminatorseauenz (c) PH05 terminator sequence

Die PH05-Terminatorsequenz wird aus Plasmid p31 isoliert, welches aus Plasmid p30 wie in EP 100 561 beschrieben konstruiert wird. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Hindill werden die überstehenden Enden mittels Klenow-Polymerasebehandlung wie oben beschrieben aufgefüllt. Das Plasmid wird dann mit EcoRI verdaut, und ein stumpfendiges EcoRI-Fragment von 0,39 kb mit den PH05-Termi-natorsequenzen wird isoliert. The PH05 terminator sequence is isolated from plasmid p31, which is constructed from plasmid p30 as described in EP 100 561. After digestion with the restriction enzyme Hindill, the protruding ends are filled in using Klenow polymerase treatment as described above. The plasmid is then digested with EcoRI and a 0.39 kb blunt-ended EcoRI fragment with the PH05 terminator sequences is isolated.

Die Ligation der Fragmente (a), (b) und (c) und die Transformation kompetenter Zellen des E. coli-Stamms DH5a werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Plasmide werden aus den erhaltenen Transformanten isoliert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid eines Klons mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als pDPSTS bezeichnet. The ligation of fragments (a), (b) and (c) and the transformation of competent cells of the E. coli strain DH5a are carried out as described in Example 2. Plasmids are isolated from the transformants obtained and characterized by means of restriction analysis. The plasmid of a clone with the correct restriction fragments is called pDPSTS.

Beispiel 16: Example 16:

Expression löslicher ST in Hefe Expression of soluble ST in yeast

Analog Beispiel 4 werden S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 mittels mit CsCI gereinigter DNA des Expressionsvektors pDPSTS transformiert. Ura+-Transformanten werden isoliert und einem Screening auf ST-Aktivität unterworfen. Jeweils eine Transformante wird ausgewählt und als Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPSTS und Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPSTS bezeichnet. Mit dem in Beispiel 13 beschriebenem Test findet sich ST-Aktivität in den Kulturbrühen beider Transformanten. Analogously to Example 4, S. cerevisiae strains BT 150 and H 449 are transformed by means of DNA of the expression vector pDPSTS purified with CsCI. Ura + transformants are isolated and screened for ST activity. One transformant each is selected and designated Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPSTS and Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDPSTS. With the test described in Example 13, ST activity is found in the culture broths of both transformants.

Beispiel 17: Example 17:

Konstruktion einer Expressionskassette für lösliche STfLvs^-Cvsdnfii Construction of an expression cassette for soluble STfLvs ^ -Cvsdnfii

Die als ST(Lys27-Cys406) bezeichnete lösliche ST ist eine N-terminal verkürzte Variante, die die gesamte Stammregion und die katalytische Domäne umfasst. Sie besteht aus 380 Aminosäuren, das sind die Aminosäuren 27 bis 406 der in SEQ ID-Nr. 3 angegebenen Aminosäuresequenz. The soluble ST (Lys27-Cys406) is an N-terminal shortened variant that encompasses the entire stem region and the catalytic domain. It consists of 380 amino acids, that is amino acids 27 to 406 of the SEQ ID no. 3 given amino acid sequence.

(a) HepG2-ST-cDNA-Teilsequenz (a) HepG2-ST cDNA partial sequence

Plasmid pSIA2 wird mit EcoRI verdaut und ein 1,1 kb EcoRI-EcoRI-Fragment isoliert. Plasmid pSIA2 is digested with EcoRI and a 1.1 kb EcoRI-EcoRI fragment is isolated.

(b) Vektor für Amplifikation in U. coli (b) Vector for amplification in U. coli

Plasmid pUC18 (Pharmacia) wird mit BamHI und EcoRI an der multiplen Klonierungsstelle verdaut. Das Plasmid wird anschliessend wie im Maniatis-Handbuch beschrieben (siehe oben) mit alkalischer Phosphatase behandelt, einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und aus dem Gel als 2,7 kb DNA-Fragment isoliert. Plasmid pUC18 (Pharmacia) is digested with BamHI and EcoRI at the multiple cloning site. The plasmid is then treated with alkaline phosphatase as described in the Maniatis manual (see above), subjected to agarose gel electrophoresis and isolated from the gel as a 2.7 kb DNA fragment.

(c) Der konstitutive PH05M 73)-Promoter und die SUC2-Signalsequenz (c) The constitutive PH05M 73) promoter and the SUC2 signal sequence

Der Vektor p31/PH05(-173l RIT (Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut. Ein 0,25 kb BamHI-Xhol-Fragment mit dem konstitutiven PH05H 73)-Promoter und der benachbarten Kodiersequenz für die Invertase-Signalsequenz (inv ss) wird isoliert. Das Fragment wird anschliessend nochmals mit Hgal (BioLabs) geschnitten. Die Hgal-Erkennungssequenz findet sich auf dem DNA-Antisensestrang. Das Restriktionsenzym schneidet «stromaufwärts» der Erkennungssequenz auf solche Weise, dass das 5-überstehende Ende des Antisensestrangs mit dem Ende der Kodiersequenz der Invertase-Signalsequenz übereinstimmt. Das mit BamHI und Hgal geschnittenen 0,24 kb DNA-Fragment enthält die an die Hefe-Invertase-Signalsequenz gebundene PH05M 73)-Promoterse-quenz. The vector p31 / PH05 (-173l RIT (Example 2) is digested with the restriction enzymes BamHI and Xhol. A 0.25 kb BamHI-Xhol fragment with the constitutive PH05H 73) promoter and the adjacent coding sequence for the invertase signal sequence ( inv ss) is isolated. The fragment is then cut again with Hgal (BioLabs). The Hgal recognition sequence can be found on the DNA antisense strand. The restriction enzyme cuts "upstream" of the recognition sequence in such a way that the 5-protruding end of the antisense strand matches the end of the coding sequence of the invertase signal sequence. The 0.24 kb DNA fragment cut with BamHI and Hgal contains the PH05M 73) promoter sequence bound to the yeast invertase signal sequence.

20 20th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

(d) Adaptor (d) adapter

Fragment (a) ist an Fragment (c) über eine Adaptorsequenz gebunden, die aus äquimolaren Mengen der synthetischen Oligonucleotide 5' CTGCAAAGGAAAA GAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTT AAATTGCAAACCAAGG 3', und 5' AATTCCTTGTTGCAATTTAAAGGAATCATAGTAACTCCC TTTCTT CTTTTCCTT 3' im Falle des Komplementärstrangs hergestellt wird. Die Oligonucleotide werden einander dadurch angelagert, dass sie zuerst auf 95°C erhitzt werden und dann langsam auf 20°C gekühlt werden. Der angelagerte Adaptor wird im gefrorenen Zustand aufbewahrt. Fragment (a) is linked to fragment (c) via an adapter sequence, which is produced from equimolar amounts of the synthetic oligonucleotides 5 'CTGCAAAGGAAAA GAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTT AAATTGCAAACCAAGG 3', and 5 'AATTCCTTGTTGCAATTTAAAGGAATTCTTaTtrT in the complTCCTT 3Rst case in the complTCCTT 3RT case. The oligonucleotides are attached to one another by first heating them to 95 ° C. and then slowly cooling them to 20 ° C. The attached adapter is stored in the frozen state.

(e) Konstruktion des Plasmids psST1 (e) Construction of plasmid psST1

Für die Ligation werden der linearisierte Vektor (b), das STcDNA-Fragment (a), Fragment (c) mit dem Promoter und der für das Signalpeptid kodierenden Sequenz, und Adaptor (d) in einem molaren Verhältnis von 1:2:2:30-100 verwendet. Die Ligation erlolgt über 18 Stunden in 12 p.l Ligasepuffer (66 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCb, 1 mM ATP) bei 16°C. Mit der Ligationsmischung werden kompetente Zellen des U. coli-Stamms DH5ot wie oben beschrieben transformiert. Plasmid-Mi-nipräparationen werden aus 24 unabhängigen Transformanten hergestellt. Ein einzelner Klon, der nach Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse mit vier verschiedenen Enzymen (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol, auch in Kombination) das erwartete Restriktionsmuster zeigt, wird als psSTI bezeichnet. For the ligation, the linearized vector (b), the STcDNA fragment (a), fragment (c) with the promoter and the sequence coding for the signal peptide, and adapter (d) are used in a molar ratio of 1: 2: 2: 30-100 used. The ligation is carried out over 18 hours in 12 μl ligase buffer (66 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM dithioerythritol, 5 mM MgCb, 1 mM ATP) at 16 ° C. With the ligation mixture, competent cells of the U. coli strain DH5ot are transformed as described above. Plasmid mi-nip preparations are made from 24 independent transformants. A single clone, which after characterization by means of restriction analysis with four different enzymes (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol, also in combination) shows the expected restriction pattern, is referred to as psSTI.

Die korrekte Sequenz an der Fusionsstelle der für das Invertase-Signalpeptid kodierenden Sequenz mit der für lösliche ST kodierenden cDNA(Lys27-Lys406) wird für Plasmid psSTI mittels des T7-Sequen-cing Kit (Pharmacia) und Primer 5' AGTCGAGTAGTATGGC 3', der bei Position -77 im konstitutiven PH05M 73^-Promoter beginnt, bestätigt. The correct sequence at the fusion site of the sequence coding for the invertase signal peptide with the cDNA coding for soluble ST (Lys27-Lys406) is for plasmid psSTI using the T7-Sequencing-Kit (Pharmacia) and primer 5 'AGTCGAGTAGTATGGC 3', the starts at position -77 in the constitutive PH05M 73 ^ promoter, confirmed.

DNA- DNA

Sequenz- Sequence-

Protein protein

5' 5 '

AAA AAA

ATA ATA

Tct gca aag gaa aag aag aaa ggg Tct gca aag gaa aag aag aaa ggg

3 ' 3 '

3' 3 '

TTT TTT

TAT DID

AGA AGA

GTG GTG

ttc ctt ttc ttc ttt ccc ttc ctt ttc ttc ttt ccc

5' 5 '

Lys Lys

Ile Ile

Ser Ser

Ala Ala

Lys Lys

Glu Glu

Lys Lys

Lys Lys

Lys Lys

Gly Gly

16 16

19 19th

27 27

mv ss ST Sequenz mv ss ST sequence

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase l) Kleinbuchstaben bezeichnen die Adaptorsequenz Interface for signal endopeptidase l) Lower case letters denote the adapter sequence

Die Expressionskassette für lösliche ST(Lys27-Cys406) mit dem konstitutiven PH05M 73)-Promoter, der für Invertase-Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST cDNA aus Plasmid psSTI können in der Form eines 1,35 kb Sali (BamHI)-EcoRI-Fragments herausgeschnitten werden. Der Expressionskassette fehlen noch immer die im anschliessenden Klonierungsschritt anzufügenden PH05-Terminatorsequenzen. The expression cassette for soluble ST (Lys27-Cys406) with the constitutive PH05M 73) promoter, the DNA sequence coding for invertase signal peptide and the partial ST cDNA from plasmid psSTI can be in the form of a 1.35 kb Sali (BamHI) - EcoRI fragments are cut out. The expression cassette still lacks the PH05 terminator sequences to be added in the subsequent cloning step.

Beispiel 18: Example 18:

Konstruklion des Expressionsvektors pDPSTSI Construction of the expression vector pDPSTSI

Zur Konstruktion des Expressionsvektors für lösliche ST (Lys27-Cys406) werden die folgenden Fragmente zusammengefügt: The following fragments are combined to construct the expression vector for soluble ST (Lys27-Cys406):

(a) Vektorteil (a) Vector part

Plasmid pDP34 wird verdaut und wie in Beispiel 3 beschrieben vorbehandelt, was ein stumpfendiges Sall-Vektorfragment von 11,8 kb ergibt. Plasmid pDP34 is digested and pretreated as described in Example 3, which results in a blunt-ended SalI vector fragment of 11.8 kb.

21 21

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

(b) Expressionskassette (b) Expression cassette

Plasmid psSTI wird erst durch Verdau mit Sali (an der multiplen Klonierungsstelle) linearisiert und dann mit EcoRI teilverdaut. Ein 1,35 kb DNA-Fragment mit dem konstitutiven PH05M73)-Promoter, einer für das Hefe-Invertasesignalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST-cDNA wird isoliert. Plasmid psSTI is first linearized by digestion with Sali (at the multiple cloning site) and then partially digested with EcoRI. A 1.35 kb DNA fragment with the constitutive PH05M73) promoter, a DNA sequence coding for the yeast invertase signal peptide and the partial ST cDNA is isolated.

(c) PH05-Terminalorsequenz (c) PH05 terminal sequence

Die PH05-Terminatorseauenz wird aus Plasmid p31 isoliert, welches ausgehend von Plasmid p30 wie in EP 100 561 beschrieben konstruiert wird. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym HindIII werden die überstehenden Enden mittels Klenow-Polymerasebehandlung wie oben beschrieben aufgefüllt. Das Plasmid wird dann mit EcoRI verdaut, und ein stumpfendiges EcoRI-Fragment von 0,39 kb mit den PH05-Terminatorsequenzen wird isoliert. The PH05 terminator sequence is isolated from plasmid p31, which is constructed starting from plasmid p30 as described in EP 100 561. After digestion with the restriction enzyme HindIII, the protruding ends are filled in by means of Klenow polymerase treatment as described above. The plasmid is then digested with EcoRI and a 0.39 kb blunt-ended EcoRI fragment with the PH05 terminator sequences is isolated.

Die Ligation der Fragmente (a), (b) und (c) und die Transformation kompetenter Zellen von U. coli-Stamm DH5a werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Aus den erhaltenen Transformanten werden Plasmide isoliert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid eines Klons mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als pDPSTSI bezeichnet. The ligation of fragments (a), (b) and (c) and the transformation of competent cells from U. coli strain DH5a are carried out as described in Example 2. Plasmids are isolated from the transformants obtained and characterized by means of restriction analysis. The plasmid of a clone with the correct restriction fragments is called pDPSTSI.

Beispiel 19: Example 19:

Expression löslicher ST(Lvs?7-Cvs4nRÌ in Hefe Expression of soluble ST (Lvs? 7-Cvs4nRÌ in yeast

Analog Beispiel 4 werden S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 mittels mit CsCI gereinigter DNA des Expressionsvektors pDPSTS 1 transformiert. Ura+-Transformanten werden isoliert und einem Screening auf ST-Aktivität unterworfen. Jeweils eine Transformante wird ausgewählt und als Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPSTS1 und Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPSTS1 bezeichnet. Mit dem in Beispiel 13 beschriebenen Test findet sich ST-Aktivität in den Kulturbrühen beider Transformanten. Analogously to Example 4, S. cerevisiae strains BT 150 and H 449 are transformed by means of DNA of the expression vector pDPSTS 1 purified with CsCI. Ura + transformants are isolated and screened for ST activity. One transformant each is selected and referred to as Saccharomvces cerevisiae BT 150 / pDPSTS1 and Saccharomvces cerevisiae H 449 / pDPSTS1. With the test described in Example 13, ST activity is found in the culture broths of both transformants.

Beispiel 20: Example 20:

Klonieren der FTcDNA aus der menschlichen HL 60-Zellinie Cloning the FTcDNA from the human HL 60 cell line

Basierend auf der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Goelz, S.E. et al. (1990) Cell 63, 1349-1356) für ELFT (ELAM-1-Liganden-Fucosyltransferase), die für a(1-3)-Fucosyltransferase kodiert, werden die folgenden Oligonucleotid-Primer entwickelt, um ein DNA-Fragment, das das offene Leseraster der ELFT-cDNA enthält, mittels PCR-Technik zu amplifizieren: 5'-CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3' (ELFT-1B) und 5-GGAGATGCACAGTAGAGGATCA-3' (ELFT-2B). ELFT-1B fungien als Primer bei den Basenpaaren 38-59 der veröffentlichten Sequenz, und ELFT-2B bei bp 1347-1326 im Antisensestrang. Mit diesen Primern wird ein 1,3 kb Fragment unter Verwendung des Perkin-Elmer Cetus Taq-Polymerase-Kits amplifiziert. Das Fragment wird aus frischer HL60-cDNA in der Gegenwart von 5% DMSO und 2 mM MgCb amplifiziert, wobei der Zyklus folgendermassen ist: Based on the published cDNA sequence (Goelz, SE et al. (1990) Cell 63, 1349-1356) for ELFT (ELAM-1 ligand fucosyltransferase) which codes for a (1-3) fucosyltransferase, the developed the following oligonucleotide primer in order to amplify a DNA fragment which contains the open reading frame of the ELFT cDNA by means of the PCR technique: 5'-CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3 '(ELFT-1B) and 5-GGAGATGCACAGTAGAGGATCA-3' (ELFT -2 B). ELFT-1B acts as a primer at base pairs 38-59 of the published sequence, and ELFT-2B at bp 1347-1326 in the antisense strand. A 1.3 kb fragment is amplified with these primers using the Perkin-Elmer Cetus Taq polymerase kit. The fragment is amplified from fresh HL60 cDNA in the presence of 5% DMSO and 2 mM MgCb, the cycle being as follows:

95°C 5 min 95 ° C 5 min

25 x (1 min 95°C, 1 min 60°C, 1,5 min 72°C) 25 x (1 min 95 ° C, 1 min 60 ° C, 1.5 min 72 ° C)

10 x (1 min 95°C, 1 min 60°C, 1,5 min + 15 sec/Zyklus 72°C). 10 x (1 min 95 ° C, 1 min 60 ° C, 1.5 min + 15 sec / cycle 72 ° C).

In der Agarose-Gelelektrophorese zeigt sich eine deutliche 1,3 kb Bande, welche bei Verdau mit Smal oder Apal das von der publizierten Sequenz vorhergesagte Muster aufweist. Die 1,3 kb Bande wird mittels eines Gene-clean Kits (Bio 101) gereinigt und in den Vektor pCR1000 (Invitrogen) subkloniert. Ein Einzelklon mit dem richtigen 1,3 kb Insert wird ausgewählt und als BRB.ELFT/pCR1000-13 bezeichnet. Die FTcDNA wird in den Vektor so eingefügt, dass sie bezüglich des 17-Promoters gegensinnig orientiert ist. Das offene Leseraster der FTcDNA wird vollständig sequenziert und ist mit der veröffentlichten Sequenz identisch (SEQ ID-Nr. 5) Agarose gel electrophoresis shows a distinct 1.3 kb band, which, when digested with Smal or Apal, shows the pattern predicted by the published sequence. The 1.3 kb band is purified using a gene clean kit (Bio 101) and subcloned into the vector pCR1000 (Invitrogen). A single clone with the correct 1.3 kb insert is selected and designated as BRB.ELFT / pCR1000-13. The FTcDNA is inserted into the vector so that it is oriented in opposite directions with respect to the 17 promoter. The open reading frame of the FTcDNA is completely sequenced and is identical to the published sequence (SEQ ID No. 5)

Beispiel 21: Example 21:

Konstruktion von Plasmiden für induzierbare und konstitutive Expression löslicher FTfArqfip-Arcunsi in Hefe Construction of plasmids for inducible and constitutive expression of soluble FTfArqfip-Arcunsi in yeast

Lösliche FT(Arg62-Arg405) wird von der FT-cDNA, die bei Nucleotidposition 241 (Nrul-Restriktionsstel-le) beginnt, exprimiert, wobei die für den cytoplasmatischen Schwanz und die membranumfassende Domäne kodierende Region fehlt (siehe Sequenz ID-Nr. 5). Soluble FT (Arg62-Arg405) is expressed by the FT cDNA starting at nucleotide position 241 (Nrul restriction site), lacking the region coding for the cytoplasmic tail and membrane-encompassing domain (see Sequence ID No. 5 ).

Plasmid BRB.ELFT/pCR1000-13 wird mit Hindill verdaut, welches in der multiplen Klonierungsregion 3' des FT-cDNA-Inserts schneidet. Die kohäsiven Enden werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Po-lymerase in stumpfe Enden umgewandelt. Xhol-Linker (5' CCTCGAGG 3', Biolabs) werden mit Kinase behandelt, angelagert, und mit den stumpfen Enden des Plasmids ligiert, wobei ein 100-facher molarer Überschuss an Linkern verwendet wird. Überschüssige Linker werden durch Isopropanol-Fällung der DNA entfernt, und diese wird weiter mit Xhol und Nrul verdaut (Schnitt an Nucleotidposition 240 der Plasmid BRB.ELFT / pCR1000-13 is digested with HindIII which cuts in the multiple cloning region 3 'of the FT cDNA insert. The cohesive ends are converted to blunt ends in a reaction with Klenow DNA polymerase. Xhol linkers (5 'CCTCGAGG 3', Biolabs) are treated with kinase, annealed and ligated to the blunt ends of the plasmid using a 100-fold molar excess of linkers. Excess linkers are removed by isopropanol precipitation of the DNA and this is further digested with Xhol and Nrul (cut at nucleotide position 240 of the

22 22

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

FT-cDNA nach Sequenz ID-Nr. 5). Das 1,1 kb Nrul-Xhol-Fragment (a) enthält die FT-cDNA Sequenz ohne die für den cytoplasmatischen Schwanz und die membranumfassende Domäne kodierende Region bis zu Aminosäure 61. FT cDNA according to sequence ID no. 5). The 1.1 kb Nrul-Xhol fragment (a) contains the FT-cDNA sequence without the region coding for the cytoplasmic tail and the membrane-encompassing domain up to amino acid 61.

Die Plasmide p31 RIT12 und p3 1/PH05(-173)RIT (siehe Beispiel 2) werden jeweils mit Sali und Xhol verdaut. Die 0,9 kb bzw. 0,5 kb Fragmente werden isoliert und mit Hgal geschnitten. Die entstehenden kohäsiven Enden werden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt. Die so hergestellten stumpfen Enden stimmen mit dem 3'-Ende der kodierenden Sequenz für die Hefe-Invertase-Signalsequenz überein. Anschliessendes Schneiden mit BamHI ergibt ein BamHI-«blunt end» Fragment (b) mit 596 bp, welches den induzierbaren PH05-Promoter und die Invertase-Signalsequenz mit ihrem eigenen ATG oder ein BamHI-«blunt end» Fragment (c) mit 234 bp mit dem kurzen konstitutiven PH05M 73)-Promoter und der Invertase-Signalsequenz enthält. The plasmids p31 RIT12 and p3 1 / PH05 (-173) RIT (see Example 2) are digested with Sali and Xhol, respectively. The 0.9 kb and 0.5 kb fragments are isolated and cut with Hgal. The resulting cohesive ends are filled in with Klenow DNA polymerase. The blunt ends so produced match the 3 'end of the coding sequence for the yeast invertase signal sequence. Subsequent cutting with BamHI yields a BamHI blunt end fragment (b) with 596 bp, which contains the inducible PH05 promoter and the invertase signal sequence with its own ATG or a BamHI blunt end fragment (c) with 234 bp with the short constitutive PH05M 73) promoter and the invertase signal sequence.

Plasmid p31 RIT12 wird mit der Restriktionsendonuclease Sali linearisiert. Teilverdau mit HindIII in der Gegenwart von Ethidiumbromid ergibt ein 1 kb Sall-Hindlll-Fragment, das die 276 bp Sail-BamHI-pBR322-Sequenz, den 534 bp Promoter der sauren Phosphatase von Hefe PH05. die Hefe-Invertase-Signalsequenz (die für 19 Aminosäuren kodiert) und den PH05-Transkriptionsterminator enthält. Das 1 kb Sall-Hindlll-Fragment von p31RIT12 wird in den Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor pJDB207 (Beggs, J. D. in: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, Seiten 383-389), kloniert, der zuvor mit Sali und Hindlll geschnitten wurde. Das entstandene Plasmid mit dem 1 kb In-sert wird als pJDB207/PH05-RIT12 bezeichnet. Plasmid p31 RIT12 is linearized with the restriction endonuclease Sali. Partial digestion with HindIII in the presence of ethidium bromide gives a 1 kb SalI-HindIII fragment which contains the 276 bp Sail-BamHI-pBR322 sequence, the 534 bp promoter of the acidic phosphatase from yeast PH05. contains the yeast invertase signal sequence (encoding 19 amino acids) and the PH05 transcription terminator. The 1 kb SalI-HindIII fragment of p31RIT12 is used in yeast E. coli shuttle vector pJDB207 (Beggs, J.D. in: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, pages 383-389), which had previously been cut with Sali and Hindlll. The resulting plasmid with the 1 kb insert is called pJDB207 / PH05-RIT12.

Plasmid pJDB207/PH05-RIT12 wird mit BamHI und Xhol verdaut, und das grosse 6,8 kb BamHI-Xhol-Fragment (d) wird isoliert. Dieses Fragment enthält alle Sequenzen des pJDB207-Vektors und den PH05-T ranskriptionsterminator. Plasmid pJDB207 / PH05-RIT12 is digested with BamHI and Xhol, and the large 6.8 kb BamHI-Xhol fragment (d) is isolated. This fragment contains all sequences of the pJDB207 vector and the PH05 transcription terminator.

Das BamHI-«blunt end» Fragment (b) mit 596 bp, das 1,1.kb Nrul-Xhol-Fragment (a) und das 6,8 kb Xhol-BamHI-Vektorfragment (d) werden unter Standardbedingungen für die Ligation stumpfer Enden ligiert. Kompetente E. c.oli-HB101-Zellen werden mit aliquoten Teilen der Ligationsmischung transformiert. Plasmid-DNA aus ampicillinresistenten Kolonien wird durch Restriktionsverdau analysiert. Ein Einzelklon mit dem richtigen Expressionsplasmid wird als pJDB207/PH05-l-FT bezeichnet. The BamHI blunt end fragment (b) with 596 bp, the 1.1.kb Nrul-Xhol fragment (a) and the 6.8 kb Xhol-BamHI vector fragment (d) become blunt under standard conditions for the ligation Ends ligated. Competent E. c.oli HB101 cells are transformed with aliquots of the ligation mixture. Plasmid DNA from ampicillin-resistant colonies is analyzed by restriction digestion. A single clone with the correct expression plasmid is called pJDB207 / PH05-l-FT.

Die Ligation der DNA-Fragmente (c), (a) und (d) ergibt das Expressionsplasmid pJDB207/PH05 (-173)-I-FT. Die Expressionskassetten dieser Plasmide enthalten die Kodiersequenz der Invertase-Si-gnalsequenz, die im Leserahmen mit der der löslichen a(1~3)Fucosyltransferase fusioniert ist, welche unter der Kontrolle des induzierbaren PH05- beziehungsweise konstitutiven PH05M 73)-Promoters exprimiert wird. Die Expressionskassetten werden in den Hefe-U coli-Shuttlevektor pJDB207 zwischen die BamHI- und Hindlll-Restriktionsstellen kloniert. Ligation of the DNA fragments (c), (a) and (d) gives the expression plasmid pJDB207 / PH05 (-173) -I-FT. The expression cassettes of these plasmids contain the coding sequence of the invertase signal sequence, which is fused in frame with that of the soluble a (1 ~ 3) fucosyltransferase, which is expressed under the control of the inducible PH05 or constitutive PH05M 73) promoter. The expression cassettes are cloned into the yeast U coli shuttle vector pJDB207 between the BamHI and HindIII restriction sites.

Die Nucleotidsequenz an der Fusionsstelle zwischen Invertase-Signalsequenz und der für lösliche FT kodierenden cDNA wird durch DNA-Sequenzierung an einer Doppelstrang-Plasmid-DNA bestätigt, wobei der Primer 5' AGTCGAGGTTAGTATGGC 3' verwendet wird, der von Position -77 bis -60 die Nucleotidsequenz des PH05- und des PH05(-1731-Promoters aufweist. Der richtige Anschluss sieht folgendermassen aus: The nucleotide sequence at the fusion site between the invertase signal sequence and the cDNA coding for soluble FT is confirmed by DNA sequencing on a double-strand plasmid DNA, using the primer 5 'AGTCGAGGTTAGTATGGC 3', which is from position -77 to -60 Nucleotide sequence of the PH05 and the PH05 (-1731 promoter. The correct connection looks like this:

DNA- DNA

Sequenz : Sequence:

5' 5 '

AAA AAA

ATA ATA

TCT TCT

GCA GCA

CGA CGA

CCG CCG

GTG GTG

3' 3 '

3' 3 '

TTT TTT

TAT DID

AGA AGA

G TG G TG

GCT GCT

GGC GGC

CAC CAC

5' 5 '

Protein protein

Lys Lys

Ile Ile

Ser Ser

Ala Ala

Arg Arg

Pro Per

Val Val

16 16

19 19th

62 62

inv ss FT Sequenz inv ss FT sequence

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase Interface for signal endopeptidase

Beispiel 22: Example 22:

Konstruktion von Plasmiden für die induzierbare und konstitutive Expression von membrangebundener FT in Hefe Construction of plasmids for the inducible and constitutive expression of membrane-bound FT in yeast

Diese Konstruktionen verwenden die Kodiersequenz der FT-cDNA mit ihrem eigenen ATG. Die Nucleotidsequenz unmittelbar stromaufwärts des ATG ist jedoch wegen ihres hohen G-C-Gehalts relativ un23 These constructions use the coding sequence of the FT cDNA with its own ATG. However, the nucleotide sequence immediately upstream of the ATG is relatively un23 due to its high G-C content

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

günstig für Expression in Hefe. Diese Region wurde durch eine A-T-reiche Sequenz mittels PCR-Metho-den ersetzt. Zugleich wird eine EcoRI-Restriktionsstelle an den neuen Nucleotidpositionen -4 bis -9 eingeführt. favorable for expression in yeast. This region was replaced by an A-T-rich sequence using PCR methods. At the same time, an EcoRI restriction site is introduced at the new nucleotide positions -4 to -9.

Tabelle 6: PCR-Primer Table 6: PCR primers

Primer Sequenz (5' bis 3')"^ entspricht Primer sequence (5 'to 3') "^ corresponds

FT cDNA Nukleotid FT cDNA nucleotide

FT1 cgaga a 11 cat aATGGGGGCACCGTGGGGC 58-75 FT1 cgaga a 11 cat aATGGGGGCACCGTGGGGC 58-75

FT2 ccqctcgagGAGCGCGGCTTCACCGCTCG 1285-1266 FT2 ccqctcgagGAGCGCGGCTTCACCGCTCG 1285-1266

1 ) Großbuchstaben bedeuten Nucleotide aus der FT, Kleinbuchstaben sind zusätzliche neue Sequenzen, Restriktionsstellen sind unterstrichen, und "Start"- und "Stop"-Codons sind fettgedruckt. 1) Capital letters mean nucleotides from the FT, lower case letters are additional new sequences, restriction sites are underlined, and "start" and "stop" codons are printed in bold.

Mittels PCR-Standardbedingungen wird die FT-cDNA mit den Primern FT1 und FT2 (siehe Tabelle 6) in 30 Zyklen von DNA-Synthese (Taq-DNA-Polymerase, Perkin-Elmer, 5 U/nl eine Minute bei 72°C), Denaturierung (10 Sekunden bei 93°C) und Anlagern (40 Sekunden bei 60°C) amplifiziert. Das entstandene 1,25 kb DNA-Fragment wird durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt, und dann mit EcoRI, Xhol und Nrul verdaut. Das 191 bp EcoRI-Nrul-Fragment (e) wird auf einem präparativem 4%igem Nusieve 3:1 Agarosegel (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) in Tris-Boratpuffer pH 8,3 isoliert, aus dem Gel eluiert und mit Ethanol gefällt. Fragment (e) enthält den 5'-Teil des für die Aminosäuren 1 bis 61 kodierenden FT-Gens. Die DNA verfügt über eine 5-Verlängerung mit einer EcoRI-Schnittstelle wie im PCR-Primer FT1. Using standard PCR conditions, the FT cDNA with the primers FT1 and FT2 (see Table 6) in 30 cycles of DNA synthesis (Taq DNA polymerase, Perkin-Elmer, 5 U / nl one minute at 72 ° C.), Denaturation (10 seconds at 93 ° C) and attachments (40 seconds at 60 ° C) amplified. The resulting 1.25 kb DNA fragment is purified by phenol extraction and ethanol precipitation, and then digested with EcoRI, Xhol and Nrul. The 191 bp EcoRI-Nrul fragment (e) is isolated on a preparative 4% Nusieve 3: 1 agarose gel (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) in Tris-Borate buffer pH 8.3, eluted from the gel and with ethanol like. Fragment (e) contains the 5 'part of the FT gene coding for amino acids 1 to 61. The DNA has a 5 extension with an EcoRI site as in the PCR primer FT1.

Die Plasmide p31RIT12 und p31/PH05(-173)RIT werden jeweils mit EcoRI und Xhol verdaut. Die grossen Vektorfragmente (f bzw. g) werden auf einem präparativen 0,8%igen Agarosegel isoliert, eluiert und gereinigt. Das 4,1 kb Xhol-EcoRI-Fragment (f) enhält den auf pBR322 basierenden Vektor, den 534 bp PH05-Promoter (3' EcoRI-Stelle) und den 131 bp PH05-Transkriptionsterminator (5' Xhol-Stelle). Das 3,7 kb Xhol-EcoRI-Fragment (g) unterscheidet sich lediglich durch den kurzen konstitutiven 172 bp PH05M73i-Promoter (3' EcoRI-Stelle) anstelle des vollständigen PH05-Promoters. The plasmids p31RIT12 and p31 / PH05 (-173) RIT are digested with EcoRI and Xhol, respectively. The large vector fragments (f and g) are isolated, eluted and purified on a preparative 0.8% agarose gel. The 4.1 kb Xhol-EcoRI fragment (f) contains the vector based on pBR322, the 534 bp PH05 promoter (3 'EcoRI site) and the 131 bp PH05 transcription terminator (5' Xhol site). The 3.7 kb Xhol-EcoRI fragment (g) differs only in the short constitutive 172 bp PH05M73i promoter (3 'EcoRI site) instead of the full PH05 promoter.

Das 191 bp EcoRI-Nrul-Fragment (e), das 1,1 kb Nrul-Xhol-Fragment (a) und das 4,1 kb Xhol-EcoRI-Fragment (f) werden ligiert. Kompetente E. coli-HB101-Zellen werden mit 1 nl Aliquot der Ligationsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA ampicillinresistenter Kolonien wird analysiert. Plasmid-DNA eines Einzelklons wird als p31 R/PH05-ssFT bezeichnet. The 191 bp EcoRI-Nrul fragment (e), the 1.1 kb Nrul-Xhol fragment (a) and the 4.1 kb Xhol-EcoRI fragment (f) are ligated. Competent E. coli HB101 cells are transformed with 1 nl aliquot of the ligation mixture. The plasmid DNA of ampicillin resistant colonies is analyzed. Single clone plasmid DNA is referred to as p31 R / PH05-ssFT.

Die Ligation der DNA-Fragmente (e), (a) und (g) ergibt Plasmid p31R/PH05(-173)-ssFT. Diese Plasmide enthalten die kodierende Sequenz der membrangebundenen FT unter der Kontrolle des induzierbaren PH05- bzw. konstitutiven PH05M 731-Promoters. Ligation of DNA fragments (e), (a) and (g) results in plasmid p31R / PH05 (-173) -ssFT. These plasmids contain the coding sequence of the membrane-bound FT under the control of the inducible PH05 or constitutive PH05M 731 promoter.

Beispiel 23: Example 23:

Klonierung der FT-Exoressionskassette in pDP34: Cloning of the FT extra cassette in pDP34:

Die Plasmide p31 R/PH05-ssFT und p31 R/PH05(-173)-ssFT werden mit Hindill verdaut, die am 3' des PH05-Transkriptionsterminators schneidet. Nach einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase wird die DNA mit Sali verdaut. Die 2,3 kb und 1,9 kb Sall-«blunt end» Fragmente werden jeweils isoliert. The plasmids p31 R / PH05-ssFT and p31 R / PH05 (-173) -ssFT are digested with HindIII which cuts at 3 'of the PH05 transcription terminator. After a reaction with Klenow DNA polymerase, the DNA is digested with Sali. The 2.3 kb and 1.9 kb Sall blunt end fragments are isolated.

Die Plasmide pJDB207/PH05-l-FT und pJDB207/PH05(-173)-l-FT werden mit Hindill in der Gegenwart von 0,1 mg/ml Ethidiumbromid (um ein Schneiden an einer zusätzlichen Hindlll-Stelle in der Invertase-Signalsequenz zu vermeiden) teilverdaut und anschliessend mit Klenow-DNA-Polymerase und Sali wie oben behandelt. Ein 2,1 kb bzw. 1,8 kb Fragment wird isoliert. The plasmids pJDB207 / PH05-l-FT and pJDB207 / PH05 (-173) -l-FT are mixed with Hindill in the presence of 0.1 mg / ml ethidium bromide (to cut at an additional Hindlll site in the invertase signal sequence to avoid) partially digested and then treated with Klenow DNA polymerase and saline as above. A 2.1 kb or 1.8 kb fragment is isolated.

Jedes der 4 DNA-Fragmente wird mit dem stumpfendigen 11,8 kb Sali-Vektorfragment von pDP34 ligiert (siehe Beispiel 3). Nach Transformation kompetenter E. coli-HB 101-Zellen und Analyse der Plasmid-DNA einzelner Transformanten werden 4 richtige Expressionsplasmide als pDP34/PH05-l-FT; pDP34/PH05(-173)-l-FT; pDP34R/PH05-ssFT und pDP34R/PH05(-173)-ssFT bezeichnet. Each of the 4 DNA fragments is ligated with the blunt-ended 11.8 kb Sali vector fragment of pDP34 (see Example 3). After transformation of competent E. coli HB 101 cells and analysis of the plasmid DNA of individual transformants, 4 correct expression plasmids are identified as pDP34 / PH05-1-FT; pDP34 / PH05 (-173) -I-FT; pDP34R / PH05-ssFT and pDP34R / PH05 (-173) -ssFT.

24 24th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Die S. cerevisiae-Stämme BT150 und H449 werden mit jeweils 5 ug der 4 Expressionsplasmide (oben) analog Beispiel 4 transformiert. Einzelne transformierte Hefezellkolonien werden selektiert und folgendermassen bezeichnet: The S. cerevisiae strains BT150 and H449 are each transformed with 5 μg of the 4 expression plasmids (above) analogously to Example 4. Individual transformed yeast cell colonies are selected and labeled as follows:

Saccharomvces cerevisiae Saccharomvces cerevisiae

Saccharomvces cerevisiae BT150/pDP34/PH05-l-FT: Saccharomvces cerevisiae BT150 / pDP34 / PH05-l-FT:

Saccharomvces cerevisiae BT 1 50/dDP34/PHQ5M 73Ì-I-FT: Saccharomvces cerevisiae BT 1 50 / dDP34 / PHQ5M 73Ì-I-FT:

Saccharomvces cerevisiae BT150/pDP34R/PH05-ssFT: Saccharomvces cerevisiae BT150 / pDP34R / PH05-ssFT:

Saccharomvces cerevisiae BT 1 50/dD P34R/PH05M 73)-ssFT: Saccharomvces cerevisiae BT 1 50 / dD P34R / PH05M 73) -ssFT:

Saccharomvces cerevisiae H449/pDP34/PH05-l-FT: Saccharomvces cerevisiae H449 / pDP34 / PH05-l-FT:

Saccharomvces cerevisiae H449/pDP34/PH05C-1731-l-FT: Saccharomvces cerevisiae H449 / pDP34 / PH05C-1731-l-FT:

Saccharomvces cerevisiae H449/pDP34R/PH05-ssFT: Saccharomvces cerevisiae H449 / pDP34R / PH05-ssFT:

Saccharomvces cerevisiae H449/pDP34R/PH05M 731-ssFT Saccharomvces cerevisiae H449 / pDP34R / PH05M 731-ssFT

Die Fermentation und Herstellung von Zellextrakten wird gemäss Beispiel 5 durchgeführt. Mit einem Test analog dem von Goetz et al. (oben) beschriebenen wird FT-Aktivität in den Rohextrakten aus BT 150/pDP34R/PH05-ssFT, BT150/pDP34R/PH05(-173)-ssFT, H449/pDP34R/PH05-ssFT und H449/ pDP34R/PH05(-173)-ssFT und in den Kulturbrühen von H449/pDP34/PH05-l-FT, H449/pDP34/PH05 (-173H-FT, BT 150/pDP34/PH05-l-FT und BT150/pDP34/PH05(-173)-l-FT gefunden. The fermentation and production of cell extracts is carried out according to Example 5. With a test analogous to that of Goetz et al. FT activity is described in the crude extracts from BT 150 / pDP34R / PH05-ssFT, BT150 / pDP34R / PH05 (-173) -ssFT, H449 / pDP34R / PH05-ssFT and H449 / pDP34R / PH05 (-173) -ssFT and in the culture broths of H449 / pDP34 / PH05-l-FT, H449 / pDP34 / PH05 (-173H-FT, BT 150 / pDP34 / PH05-l-FT and BT150 / pDP34 / PH05 (-173) -l -FT found.

Hinterlegung der Mikroorganismen Deposit of the microorganisms

Die folgenden Mikroorganismenstämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig, hinterlegt (angegeben sind die Hinterlegungsdaten und Eingangsnummern): The following microorganism strains were deposited with the German Collection of Microorganisms (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig (the filing dates and entry numbers are given):

Escherichia coli JM109/pDP34: 14. März 1988; DSM 4473 Escherichia coli HB101/p30: 23. Oktober 1987; DSM 4297 Escherichia coli HB101/p31R: 19. Dezember 1988; DSM 5116 Saccharomvces cerevisiae H 449: 18. Februar 1988; DSM 4413 Saccharomvces cerevisiae BT 150: 23. Mai 1991; DSM 6530 Escherichia coli JM109 / pDP34: March 14, 1988; DSM 4473 Escherichia coli HB101 / p30: October 23, 1987; DSM 4297 Escherichia coli HB101 / p31R: December 19, 1988; DSM 5116 Saccharomvces cerevisiae H 449: February 18, 1988; DSM 4413 Saccharomvces cerevisiae BT 150: May 23, 1991; DSM 6530

25 25th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

REO ID-Nr. 1 REO ID no. 1

SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENCE TYPE: Nucleotide with the corresponding protein

SEQUENZLÄNGE: 1265 bp SEQUENCE LENGTH: 1265 bp

STRÄNGIGKEIT: doppelt STRENGTH: double

TOPOLOGIE: linear TOPOLOGY: linear

MOLEKÜLTYP: rekombinant MOLECULE TYPE: recombinant

UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Plasmid p4AD113 aus E. coli DH5a/p4AD 113 DIRECT EXPERIMENTAL ORIGIN: Plasmid p4AD113 from E. coli DH5a / p4AD 113

MERKMALE: von 6 bis 1200 bp von 1 bis 6 bp von 497 bis 504 bp von 1227 bis 1232 bp von 1236 bis 1241 bp von 1243 bis 1248 bp CHARACTERISTICS: from 6 to 1200 bp from 1 to 6 bp from 497 to 504 bp from 1227 to 1232 bp from 1236 to 1241 bp from 1243 to 1248 bp

Für HeLa-Zellen-Galactosyl-transferase kodierende cDNA-Sequenz CDNA sequence encoding HeLa cell galactosyl transferase

EcoRI-Stelle EcoRI site

Notl-Stelle Notl position

EcoRI-Stelle EcoRI site

EcoRV-Stelle EcoRV office

Bglll-Stelle Bglll site

EIGENSCHAFTEN: EcoRI-Hindlll-Fragment aus Plasmid p4AD113 mit für vollständige Galactosyltransferase kodierender HeLa-Zellen-cDNA (EC2.4.1.22) PROPERTIES: EcoRI-HindIII fragment from plasmid p4AD113 with HeLa cell cDNA coding for complete galactosyltransferase (EC2.4.1.22)

GAATTC ATG AGG CTT CGG GAG CCG CTC CTG AGC GGC AGC Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser GAATTC ATG AGG CTT CGG GAG CCG CTC CTG AGC GGC AGC Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser

5 10 5 10

39 39

GCC GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC 78 Ala Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg 15 20 GCC GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC 78 Ala Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg 15 20

CTG CTC GTG GCC GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr 25 30 35 CTG CTC GTG GCC GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr 25 30 35

117 117

26 26

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

10 10th

15 15

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

60 60

65 65

CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC CGC GAC CTG AGC CGC CTG 156 Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 40 45 50 CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC CGC GAC CTG AGC CGC CTG 156 Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 40 45 50

CCC CAA CTG GTC GGA GTC TCC ACA CCG CTG CAG GGC GGC 195 Pro Gin Leu Val Gly Val -Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly CCC CAA CTG GTC GGA GTC TCC ACA CCG CTG CAG GGC GGC 195 Pro Gin Leu Val Gly Val -Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly

55 60 55 60

TCG AAC AGT GCC GCC GCC ATC GGG CAG TCC TCC GGG GAG 234 Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 20 65 70 75 TCG AAC AGT GCC GCC GCC ATC GGG CAG TCC TCC GGG GAG 234 Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 20 65 70 75

CTC CGG ACC GGA GGG GCC CGG CCG CCG CCT CCT CTA GGC 273 Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly 80 85 CTC CGG ACC GGA GGG GCC CGG CCG CCG CCT CCT CTA GGC 273 Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly 80 85

GCC TCC TCC CAG CCG CGC CCG GGT GGC GAC TCC AGC CCA 312 Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 90 95 100 GCC TCC TCC CAG CCG CGC CCG GGT GGC GAC TCC AGC CCA 312 Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 90 95 100

GTC GTG GAT TCT GGC CCT GGC CCC GCT AGC AAC TTG ACC 351 Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr. GTC GTG GAT TCT GGC CCT GGC CCC GCT AGC AAC TTG ACC 351 Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr.

105 110 115 105 110 115

TCG GTC CCA GTG CCC CAC ACC ACC GCA CTG TCG CTG CCC 3 90 Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro TCG GTC CCA GTG CCC CAC ACC ACC GCA CTG TCG CTG CCC 3 90 Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro

120 125 120 125

GCC TGC CCT GAG GAG TCC CCG CTG CTT GTG GGC CCC ATG 42 9 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met 55 120 135 140 GCC TGC CCT GAG GAG TCC CCG CTG CTT GTG GGC CCC ATG 42 9 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met 55 120 135 140

CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG 468 Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val 145 150 CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG 468 Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val 145 150

27 27

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

GCA AAG CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT 507 Ala Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 5 155 160 165 GCA AAG CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT 507 Ala Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 5 155 160 165

10 10th

15 15

20 20th

35 35

40 40

45 45

50 50

60 60

65 65

GCC CCC AGG GAC TGC GTC TCT CCT CAC AAG GTG GCC ATC 546 Ala Pro Arg Asp Cys Val-Ser Pro His Lys Val Ala Ile 170 175 180 GCC CCC AGG GAC TGC GTC TCT CCT CAC AAG GTG GCC ATC 546 Ala Pro Arg Asp Cys Val-Ser Pro His Lys Val Ala Ile 170 175 180

ATC ATT CCA TTC CGC AAC CGG CAG GAG CAC CTC AAG TAC 585 Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys Tyr ATC ATT CCA TTC CGC AAC CGG CAG GAG CAC CTC AAG TAC 585 Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys Tyr

185 190 185 190

TGG CTA TAT TAT TTG CAC CCA GTC CTG CAG CGC CAG CAG 624 25 Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin 195 200 205 TGG CTA TAT TAT TTG CAC CCA GTC CTG CAG CGC CAG CAG 624 25 Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin 195 200 205

30 CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC CAG GCG GGA GAC 663 Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp 210 215 30 CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC CAG GCG GGA GAC 663 Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp 210 215

ACT ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC AAT GTT GGC TTT 7 02 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 220 225 230 ACT ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC AAT GTT GGC TTT 7 02 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 220 225 230

CAA GAA GCC TTG AAG GAC TAT GAC TAC ACC TGC TTT GTG 741 Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 235 240 245 CAA GAA GCC TTG AAG GAC TAT GAC TAC ACC TGC TTT GTG 741 Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 235 240 245

TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT CCA ATG AAT GAC CAT AAT 780 Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 55 250 255 TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT CCA ATG AAT GAC CAT AAT 780 Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 55 250 255

GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA CGG CAC ATT TCC GTT 819 Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 260 265 270 GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA CGG CAC ATT TCC GTT 819 Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 260 265 270

28 28

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

40 40

45 45

50 50

GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC CTA CCT TAT GTT CAG 858 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin 275 280 GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC CTA CCT TAT GTT CAG 858 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin 275 280

TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT 897 Tyr Phe Gly Gly Val Ser -Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 285 290 295 TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT 897 Tyr Phe Gly Gly Val Ser -Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 285 290 295

CTA ACC ATC AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG 93 6 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 300 305 310 CTA ACC ATC AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG 93 6 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 300 305 310

GGA GGA GAA GAT GAT GAC ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT 975 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe GGA GGA GAA GAT GAT GAC ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT 975 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe

315 320 315 320

AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT GCT GTG GTC GGG 1014 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 35 325 330 335 AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT GCT GTG GTC GGG 1014 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 35 325 330 335

AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TCA AGA GAC AAG AAA AAT 1053 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 340 345 AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TCA AGA GAC AAG AAA AAT 1053 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 340 345

GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA 1092 Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 350 355 360 GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA 1092 Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 350 355 360

AAG GAG ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TCA CTC ACC 1131 55 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 365 370 375 AAG GAG ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TCA CTC ACC 1131 55 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 365 370 375

60 TAC CAG GTG CTG GAT GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC 117 0 Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 60 TAC CAG GTG CTG GAT GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC 117 0 Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr

380 385 380 385

65 65

29 29

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA CCG AGC TAGGACTTTT 1210 Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 390 395 CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA CCG AGC TAGGACTTTT 1210 Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 390 395

GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG 1250 GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG 1250

AGCTCGCGAA AGCTT 1265 AGCTCGCGAA AGCTT 1265

30 30th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

RFO ID-Nr. 2 RFO ID no. 2nd

SEQUENZTYP: Protein SEQUENLÄNGE: 357 Aminosäuren SEQUENCE TYPE: Protein SEQUENCE LENGTH: 357 amino acids

MOLEKÜLTYP: C-terminales Fragment vollständiger HeLa-Zellen-Galactosyltransferase EIGENSCHAFTEN: Lösliche Galactosyltransferase (EC 2.4.1.22) aus HeLa-Zellen MOLECULE TYPE: C-terminal fragment of complete HeLa cell galactosyltransferase PROPERTIES: Soluble galactosyltransferase (EC 2.4.1.22) from HeLa cells

Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu

5 5

Pro Gin Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly 10 15 20 Pro Gin Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly 10 15 20

Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 25 30 35 Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 25 30 35

Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly

40 45 40 45

Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 50 55 60 Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 50 55 60

Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 65 70 Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 65 70

Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 75 80 85 Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 75 80 85

Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met 90 95 100 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met 90 95 100

Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val

105 110 105 110

31 31

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Ala Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 115 120 125 Ala Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 115 120 125

Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile 130 • 135 Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile 130 • 135

Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys iyr 140 145 150 Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys iyr 140 145 150

Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin 155 160 165 Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin 155 160 165

Leu Asp Tyr Gly Ile iyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp Leu Asp Tyr Gly Ile iyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp

170 175 170 175

Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 180 185 190 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 180 185 190

Gin Glu Ala Leu Lys Asp iyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 195 200 Gin Glu Ala Leu Lys Asp iyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 195 200

Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 205 210 215 Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 205 210 215

Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 220 225 230 Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 220 225 230

Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin

235 240 235 240

Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 245 250 255 Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 245 250 255

Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 260 265 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 260 265

32 32

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 270 275 280 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 270 275 280

Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 285 • 290 295 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 285 • 290 295

Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn

300 305 300 305

Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 310 315 320 Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 310 315 320

Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 325 330 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 325 330

Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 335 340 345 Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 335 340 345

Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 350 355 Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 350 355

33 33

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

SEQ ID-Nr. 3 SEQ ID no. 3rd

SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENCE TYPE: Nucleotide with the corresponding protein

SEQUENZLÄNGE: 1246 bp SEQUENCE LENGTH: 1246 bp

STRÄNGIGKEIT: doppelt STRENGTH: double

TOPOLOGIE: linear TOPOLOGY: linear

MOLEKÜLTYP: rekombinant MOLECULE TYPE: recombinant

UNMTTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Plasmid pSIA2 aus E. coli DH5a/lpSIA2 DIRECT EXPERIMENTAL ORIGIN: Plasmid pSIA2 from E. coli DH5a / lpSIA2

MERKMALE: von 15 bis 1232 bp von 1 bis 6 bp von 6 bis 11 bp von 144 bis 149 bp von 1241 bis 1246 bp CHARACTERISTICS: from 15 to 1232 bp from 1 to 6 bp from 6 to 11 bp from 144 to 149 bp from 1241 to 1246 bp

Für HepG2-Zellen-Sialyltransfe-rase kodierende cDNA-Sequenz HepG2 cell sialyltransferase encoding cDNA sequence

Pstl-Stelle Pstl position

EcoRI-Stelle EcoRI site

EcoRI-Stelle EcoRI site

BamHI-Stelle BamHI site

EIGENSCHAFTEN: Pstl-BamHI-Fragment aus Plasmid pSIA2 mit für vollständige Siaiyitransferase kodierender HepG2-cDNA (EC 2.4.99.1) PROPERTIES: PstI-BamHI fragment from plasmid pSIA2 with HepG2 cDNA coding for complete siaiyitransferase (EC 2.4.99.1)

CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA

Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys

5 5

38 38

AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC TTT CTT CTG TTT GCA Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val Phe Leu Leu Phe Ala 10 15 20 AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC TTT CTT CTG TTT GCA Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val Phe Leu Leu Phe Ala 10 15 20

77 77

GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG AGT TAC Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly Ser Tyr 25 30 GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG AGT TAC Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly Ser Tyr 25 30

116 116

TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val 35 40 45 TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val 35 40 45

155 155

34 34

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

194 194

233 233

272 272

311 311

350 350

389 389

428 428

467 467

506 506

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

TTA AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG TCT GAT TCC Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 50 55 60 TTA AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG TCT GAT TCC Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 50 55 60

CAG TCT GTA TCC TCA AGC -AGC ACC CAG GAC CCC CAC AGG Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg CAG TCT GTA TCC TCA AGC -AGC ACC CAG GAC CCC CAC AGG Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg

65 70 65 70

GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT CTC AGA GGC CTA GCC AAG Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys 75 80 85 GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT CTC AGA GGC CTA GCC AAG Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys 75 80 85

GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG AAC AAG GAC Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp Asn Lys Asp 90 95 GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG AAC AAG GAC Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp Asn Lys Asp 90 95

AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG CAA AAG ATC Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile 100 105 110 AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG CAA AAG ATC Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile 100 105 110

TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC AAA GTG TCC Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser 115 120 125 TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC AAA GTG TCC Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser 115 120 125

TAC AAG GGG CCA GGA CCA GGC ATC AAG TTC AGT GCA GAG Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu TAC AAG GGG CCA GGA CCA GGC ATC AAG TTC AGT GCA GAG Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu

130 135 130 135

GCC CTG CGC TGC CAC CTC CGG GAC CAT GTG AAT GTA TCC Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser 140 145 150 GCC CTG CGC TGC CAC CTC CGG GAC CAT GTG AAT GTA TCC Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser 140 145 150

ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC AAT ACC TCT GAA Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 155 160 ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC AAT ACC TCT GAA Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 155 160

35 35

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

10 10th

15 15

25 25th

30 30th

35 35

50 50

55 55

60 60

65 65

TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC AAG 545 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 165 170 175 TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC AAG 545 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 165 170 175

GCT GGG CCT TGG GGC AGG -TGT GCT GTT GTG TCG TCA GCG 584 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 180 185 190 GCT GGG CCT TGG GGC AGG -TGT GCT GTT GTG TCG TCA GCG 584 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 180 185 190

GGA TCT CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT 623 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 20 195 2 00 GGA TCT CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT 623 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 20 195 2 00

GAT CAT GAC GCA GTC CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA 662 Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 205 210 215 GAT CAT GAC GCA GTC CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA 662 Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 205 210 215

GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC ACA AAA ACT ACC ATT 701 Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 220 225 GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC ACA AAA ACT ACC ATT 701 Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 220 225

CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG AAG CGC 740 40 Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 230 235 240 CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG AAG CGC 740 40 Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 230 235 240

45 TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT 779 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 245 250 255 45 TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT 779 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 245 250 255

GTA TGG GAC CCA TCT GTA TAC CAC TCA GAT ATC CCA AAG 818 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys GTA TGG GAC CCA TCT GTA TAC CAC TCA GAT ATC CCA AAG 818 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys

260 265 260 265

TGG TAC CAG AAT CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC 857 Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 270 275 280 TGG TAC CAG AAT CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC 857 Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 270 275 280

36 36

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

AAG ACT K Lys Thr AAG ACT K Lys Thr

O O

10 ATC CTC Ile Leu 295 10 ATC CTC Ile Leu 295

15 15

CTT CAA Leu Gin CTT CAA Leu Gin

20 20th

CCA TCC CCA TCC

25 25th

Pro Ser Per ser

30 30th

CTG TGT Leu Cys 35 335 CTG TGT Leu Cys 35 335

AAG CGC 40 Lys Arg AAG CGC 40 Lys Arg

45 45

TTC GAT Phe Asp TTC GAT Phe Asp

360 360

50 50

CTC TAT 55 Leu iyr CTC TAT 55 Leu iyr

60 ACA GAT Thr Asp 60 ACA GAT Thr Asp

65 65

TAT CGT AAG Tyr Arg Lys 285 TAT CGT AAG Tyr Arg Lys 285

AAG CCC CAG Lys Pro Gin AAG CCC CAG Lys Pro Gin

GAA ATC TCC Glu Ile Ser 310 GAA ATC TCC Glu Ile Ser 310

TCT GGG ATG Ser Gly Met 325 TCT GGG ATG Ser Gly Met 325

GAC CAG GTG Asp Gin Val GAC CAG GTG Asp Gin Val

AAG ACT GAC Lys Thr Asp 350 AAG ACT GAC Lys Thr Asp 350

AGT GCC TGC Ser Ala Cys AGT GCC TGC Ser Ala Cys

GAG AAG AAT Glu Lys Asn 375 GAG AAG AAT Glu Lys Asn 375

GAG GAC ATC Glu Asp Ile 390 GAG GAC ATC Glu Asp Ile 390

CTG CAC CCC Leu His Pro CTG CAC CCC Leu His Pro

ATG -CCT TGG Met Pro Trp 300 ATG -CCT TGG Met Pro Trp 300

CCA GAA GAG Pro Glu Glu 315 CCA GAA GAG Pro Glu Glu 315

CTT GGT ATC Leu Gly Ile CTT GGT ATC Leu Gly Ile

GAT ATT TAT Asp Ile Tyr 340 GAT ATT TAT Asp Ile Tyr 340

GTG TGC TAC Val Cys Tyr GTG TGC TAC Val Cys Tyr

ACG ATG GGT Thr Met Gly 365 ACG ATG GGT Thr Met Gly 365

TTG GTG AAG Leu Val Lys 380 TTG GTG AAG Leu Val Lys 380

TAC CTG CTT Tyr Leu Leu TAC CTG CTT Tyr Leu Leu

AAT CAG CCC Asn Gin Pro 290 AAT CAG CCC Asn Gin Pro 290

GAG CTA TGG Glu Leu Trp 305 GAG CTA TGG Glu Leu Trp 305

ATT CAG CCA Ile Gin Pro ATT CAG CCA Ile Gin Pro

ATC ATC ATG Ile Ile Met 330 ATC ATC ATG Ile Ile Met 330

GAG TTC CTC Glu Phe Leu GAG TTC CTC Glu Phe Leu

TAC TAC CAG iyr Tyr Gin 355 TAC TAC CAG iyr Tyr Gin 355

GCC TAC CAC Ala Tyr His 370 GCC TAC CAC Ala Tyr His 370

CAT CTC AAC His Leu Asn CAT CTC AAC His Leu Asn

GGA AAA GCC Gly Lys Ala 395 GGA AAA GCC Gly Lys Ala 395

TTT TAC 896 Phe Tyr TTT TAC 896 Phe Tyr

GAC ATT 935 Asp Ile GAC ATT 935 Asp Ile

AAC CCC 974 Asn Pro 320 AAC CCC 974 Asn Pro 320

ATG ACG 1013 Met Thr ATG ACG 1013 Met Thr

CCA TCC 1052 Pro Ser 345 CCA TCC 1052 Pro Ser 345

AAG TTC 1091 Lys Phe AAG TTC 1091 Lys Phe

CCG CTG 1130 Pro Leu CCG CTG 1130 Pro Leu

CAG GGC 1169 Gin Gly 385 CAG GGC 1169 Gin Gly 385

ACA CTG 12 08 Thr Leu ACA CTG 12 08 Thr Leu

37 37

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

CCT GGC TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAAGCACAGG ATCC 1246 CCT GGC TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAAGCACAGG ATCC 1246

Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 400 405 Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 400 405

SEQ ID-NIR. 4 SEQ ID NIR. 4th

SEQUENZTYP: Protein SEQUENZLÄNGE: 368 Aminosäuren SEQUENCE TYPE: Protein SEQUENCE LENGTH: 368 amino acids

MOLEKÜLTYP: C-terminales Fragment von vollständiger Siaiyitransferase EIGENSCHAFTEN: Lösliche Siaiyitransferase (EC 2.4.99.1) aus menschlichen HepG2-Zellen MOLECULE TYPE: C-terminal fragment of complete siaiyitransferase PROPERTIES: Soluble siaiyitransferase (EC 2.4.99.1) from human HepG2 cells

Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val

5 5

Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 10 15 20 Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 10 15 20

Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg 25 30 35 Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg 25 30 35

Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys

40 45 40 45

Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp Asn Lys Asp 50 55 60 Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp Asn Lys Asp 50 55 60

Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile 65 70 Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile 65 70

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser 75 80 85 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser 75 80 85

Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu 90 95 100 Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu 90 95 100

Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser

105 110 105 110

38 38

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 115 120 125 Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 115 120 125

Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 130 ' 135 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 130 '135

Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 140 145 150 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 140 145 150

Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 155 160 165 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 155 160 165

Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr

170 175 170 175

Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 180 185 190 Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 180 185 190

Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 195 200 Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 195 200

Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 205 210 215 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 205 210 215

Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys 220 225 230 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys 220 225 230

Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr

235 240 235 240

Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr 245 250 255 Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr 245 250 255

Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile 260 265 Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile 260 265

39 39

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Leu Gin Glu Ile Ser Pro 270 275 Leu Gin Glu Ile Ser Pro 270 275

Pro Ser Ser Gly Met Leu 285 Per Ser Ser Gly Met Leu 285

Leu Cys Asp Gin Val Asp Leu Cys Asp Gin Val Asp

300 300

Lys Arg Lys Thr Asp Val 310 Lys Arg Lys Thr Asp Val 310

Phe Asp Ser Ala Cys Thr 325 Phe Asp Ser Ala Cys Thr 325

Glu Glu Ile Gin Pro Asn Pro Glu Glu Ile Gin Pro Asn Pro

280 280

Gly Ile Ile Ile Met Met Thr 290 295 Gly Ile Ile Ile Met Met Thr 290 295

Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 305 Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 305

Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe 315 320 Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe 315 320

Met Gly Ala Tyr His Pro Leu 330 Met Gly Ala Tyr His Pro Leu 330

Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gin Gly 335 340 345 Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gin Gly 335 340 345

Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 350 355 360 Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 350 355 360

Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys

365 365

40 40

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

SFQ ID-NR. 5 SFQ ID NO. 5

SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENCE TYPE: Nucleotide with the corresponding protein

SEQUENZLÄNGE: 1400 bp SEQUENCE LENGTH: 1400 bp

STRÄNGIGKEIT: doppelt STRENGTH: double

TOPOLOGIE: linear TOPOLOGY: linear

MOLEKÜLTYP: rekombinant MOLECULE TYPE: recombinant

UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: BRB.ELFT/pCR1000-13 DIRECT EXPERIMENTAL ORIGIN: BRB.ELFT / pCR1000-13

MERKMALE: Von 58 bis 1272 bp für menschliche ct(1-3) Fucosyltransferase kodierende cDNA-Se-quenz von 238 bis 243 bp Nrul-Stelle EIGENSCHAFTEN: Für vollständige <x(1-3) Fucosyltransferase kodierende cDNA CHARACTERISTICS: From 58 to 1272 bp cDNA sequence encoding human ct (1-3) fucosyltransferase from 238 to 243 bp Nrul site. CHARACTERISTICS: For complete cDNA encoding <x (1-3) fucosyltransferase

CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50 CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50

TCGCGCC ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG ACG GCG GCG 90 TCGCGCC ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG ACG GCG GCG 90

Met Gly Ala Pro Trp Gly Ser Pro Thr Ala Ala Met Gly Ala Pro Trp Gly Ser Pro Thr Ala Ala

5 10 5 10

GCG GGC GGG CGG CGC GGG TGG CGC CGA GGC CGG GGG CTG 129 GCG GGC GGG CGG CGC GGG TGG CGC CGA GGC CGG GGG CTG 129

Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Arg Arg Gly Arg Gly Leu 15 20 Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Arg Arg Gly Arg Gly Leu 15 20

CCA TGG ACC GTC TGT GTG CTG GCG GCC GCC GGC TTG ACG 168 CCA TGG ACC GTC TGT GTG CTG GCG GCC GCC GGC TTG ACG 168

Pro Trp Thr Val Cys Val Leu Ala Ala Ala Gly Leu Thr 25 30 35 Per Trp Thr Val Cys Val Leu Ala Ala Ala Gly Leu Thr 25 30 35

TGT ACG GCG CTG ATC ACC TAC GCT TGC TGG GGG CAG CTG 207 TGT ACG GCG CTG ATC ACC TAC GCT TGC TGG GGG CAG CTG 207

Cys Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala Cys Trp Gly Gin Leu 40 45 50 Cys Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala Cys Trp Gly Gin Leu 40 45 50

CCG CCG CTG CCC TGG GCG TCG CCA ACC CCG TCG CGA CCG 246 CCG CCG CTG CCC TGG GCG TCG CCA ACC CCG TCG CGA CCG 246

Pro Pro Leu Pro Trp Ala Ser Pro Thr Pro Ser Arg Pro Pro Pro Leu Pro Trp Ala Ser Pro Thr Pro Ser Arg Pro

55 60 55 60

41 41

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

285 285

324 324

363 363

402 402

441 441

480 480

519 519

558 558

597 597

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

GTG GGC GTG CTG CTG TGG TGG GAG CCC TTC GGG GGG CGC GTG GGC GTG CTG CTG TGG TGG GAG CCC TTC GGG GGG CGC

Val Gly Val Leu Leu Trp Trp Glu Pro Phe Gly Gly Arg Val Gly Val Leu Leu Trp Trp Glu Pro Phe Gly Gly Arg

65 70 75 65 70 75

GAT AGC GCC CCG AGG CCG CCC CCT GAC TGC CGG CTG CGC GAT AGC GCC CCG AGG CCG CCC CCT GAC TGC CGG CTG CGC

Asp Ser Ala Pro Arg Pro Pro Pro Asp Cys Arg Leu Arg Asp Ser Ala Pro Arg Pro Pro Pro Asp Cys Arg Leu Arg

80 85 80 85

TTC AAC ATC AGC GGC TGC CGC CTG CTC ACC GAC CGC GCG TTC AAC ATC AGC GGC TGC CGC CTG CTC ACC GAC CGC GCG

Phe Asn Ile Ser Gly Cys Arg Leu Leu Thr Asp Arg Ala Phe Asn Ile Ser Gly Cys Arg Leu Leu Thr Asp Arg Ala

90 95 100 90 95 100

TCC TAC GGA GAG GCT CAG GCC GTG CTT TTC CAC CAC CGC TCC TAC GGA GAG GCT CAG GCC GTG CTT TTC CAC CAC CGC

Ser Tyr Gly Glu Ala Gin Ala Val Leu Phe His His Arg Ser Tyr Gly Glu Ala Gin Ala Val Leu Phe His His Arg

105 110 115 105 110 115

GAC CTC GTG AAG GGG CCC CCC GAC TGG CCC CCG CCC TGG GAC CTC GTG AAG GGG CCC CCC GAC TGG CCC CCG CCC TGG

Asp Leu Val Lys Gly Pro Pro Asp Trp Pro Pro Pro Trp Asp Leu Val Lys Gly Pro Pro Asp Trp Pro Pro Pro Trp

120 125 120 125

GGC ATC CAG GCG CAC ACT GCC GAG GAG GTG GAT CTG CGC GGC ATC CAG GCG CAC ACT GCC GAG GAG GTG GAT CTG CGC

Gly Ile Gin Ala His Thr Ala Glu Glu Val Asp Leu Arg Gly Ile Gin Ala His Thr Ala Glu Glu Val Asp Leu Arg

130 135 140 130 135 140

GTG TTG GAC TAC GAG GAG GCA GCG GCG GCG GCA GAA GCC GTG TTG GAC TAC GAG GAG GCA GCG GCG GCG GCA GAA GCC

Val Leu Asp Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Val Leu Asp Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala

145 150 145 150

CTG GCG ACC TCC AGC CCC AGG CCC CCG GGC CAG CGC TGG CTG GCG ACC TCC AGC CCC AGG CCC CCG GGC CAG CGC TGG

Leu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Gly Gin Arg Trp Leu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Gly Gin Arg Trp

155 160 165 155 160 165

GTT TGG ATG AAC TTC GAG TCG CCC TCG CAC TCC CCG GGG Val Trp Met Asn Phe Glu Ser Pro Ser His Ser Pro Gly 170 175 180 GTT TGG ATG AAC TTC GAG TCG CCC TCG CAC TCC CCG GGG Val Trp Met Asn Phe Glu Ser Pro Ser His Ser Pro Gly 170 175 180

42 42

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CTG CGA AGC CTG GCA AGT AAC CTC TTC AAC TGG ACG CTC 636 CTG CGA AGC CTG GCA AGT AAC CTC TTC AAC TGG ACG CTC 636

Leu Arg Ser Leu Ala Ser Asn Leu Phe Asn Trp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Ala Ser Asn Leu Phe Asn Trp Thr Leu

185 190 185 190

TCC TAC CGG GCG GAC TCG GAC GTC TTT GTG CCT TAT GGC 675 TCC TAC CGG GCG GAC TCG GAC GTC TTT GTG CCT TAT GGC 675

Ser Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Val Phe Val Pro Tyr Gly 195 200 205 Ser Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Val Phe Val Pro Tyr Gly 195 200 205

TAC CTC TAC CCC AGA AGC CAC CCC GGC GAC CCG CCC TCA 714 TAC CTC TAC CCC AGA AGC CAC CCC GGC GAC CCG CCC TCA 714

Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser His Pro Gly Asp Pro Pro Ser 210 215 Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser His Pro Gly Asp Pro Pro Ser 210 215

GGC CTG GCC CCG CCA CTG TCC AGG AAA CAG GGG CTG GTG 7 53 GGC CTG GCC CCG CCA CTG TCC AGG AAA CAG GGG CTG GTG 7 53

Gly Lea Ala Pro Pro Leu Ser Arg Lys Gin Gly Leu Val 220 225 230 Gly Lea Ala Pro Pro Leu Ser Arg Lys Gin Gly Leu Val 220 225 230

GCA TGG GTG GTG AGC CAC TGG GAC GAG CGC CAG GCC CGG 792 GCA TGG GTG GTG AGC CAC TGG GAC GAG CGC CAG GCC CGG 792

Ala Trp Val Val Ser His Trp Asp Glu Arg Gin Ala Arg 235 240 245 Ala Trp Val Val Ser His Trp Asp Glu Arg Gin Ala Arg 235 240 245

GTC CGC TAC TAC CAC CAA CTG AGC CAA CAT GTG ACC GTG 831 GTC CGC TAC TAC CAC CAA CTG AGC CAA CAT GTG ACC GTG 831

Val Arg Tyr Tyr His Gin Leu Ser Gin His Val Thr Val 40 250 255 Val Arg Tyr Tyr His Gin Leu Ser Gin His Val Thr Val 40 250 255

GAC GTG TTC GGC CGG GGC GGG CCG GGG CAG CCG GTG CCC 87 0 GAC GTG TTC GGC CGG GGC GGG CCG GGG CAG CCG GTG CCC 87 0

Asp Val Phe Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gin Pro Val Pro 260 265 270 Asp Val Phe Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gin Pro Val Pro 260 265 270

GAA ATT GGG CTC CTG CAC ACA GTG GCC CGC TAC AAG TTC 909 GAA ATT GGG CTC CTG CAC ACA GTG GCC CGC TAC AAG TTC 909

Glu Ile Gly Leu Leu His Thr Val Ala Arg Tyr Lys Phe 275 280 Glu Ile Gly Leu Leu His Thr Val Ala Arg Tyr Lys Phe 275 280

TAC CTG GCT TTC GAG AAC TCG CAG CAC CTG GAT TAT ATC 948 TAC CTG GCT TTC GAG AAC TCG CAG CAC CTG GAT TAT ATC 948

Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Gin His Leu Asp Tyr Ile 285 290 295 Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Gin His Leu Asp Tyr Ile 285 290 295

43 43

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

ACC GAG AAG CTC TGG CGC AAC GCG TTG CTC GCT GGG GCG 987 ACC GAG AAG CTC TGG CGC AAC GCG TTG CTC GCT GGG GCG 987

Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Gly Ala 300 305 310 Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Gly Ala 300 305 310

GTG CCG GTG GTG CTG GGC CCA GAC CGT GCC AAC TAC GAG 102 6 GTG CCG GTG GTG CTG GGC CCA GAC CGT GCC AAC TAC GAG 102 6

Val Pro Val Val Leu Gly Pro Asp Arg Ala Asn Tyr Glu 315 320 Val Pro Val Val Leu Gly Pro Asp Arg Ala Asn Tyr Glu 315 320

CGC TTT GTG CCC CGC GGC GCC TTC ATC CAC GTG GAC GAC 1065 CGC TTT GTG CCC CGC GGC GCC TTC ATC CAC GTG GAC GAC 1065

Arg Phe Val Pro Arg Gly Ala Phe Ile His Val Asp Asp 325 330 335 Arg Phe Val Pro Arg Gly Ala Phe Ile His Val Asp Asp 325 330 335

TTC CCA AGT GCC TCC TCC CTG GCC TCG TAC CTG CTT TTC 1104 TTC CCA AGT GCC TCC TCC CTG GCC TCG TAC CTG CTT TTC 1104

Phe Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Tyr Leu Leu Phe 340 345 Phe Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Tyr Leu Leu Phe 340 345

CTC GAC CGC AAC CCC GCG GTC TAT CGC CGC TAC TTC CAC 1143 CTC GAC CGC AAC CCC GCG GTC TAT CGC CGC TAC TTC CAC 1143

Leu Asp Arg Asn Pro Ala Val Tyr Arg Arg Tyr Phe His 350 355 360 Leu Asp Arg Asn Pro Ala Val Tyr Arg Arg Tyr Phe His 350 355 360

TGG CGC CGG AGC TAC GCT GTC CAC ATC ACC TCC TTC TGG 1182 Trp Arg Arg Ser Tyr Ala Val His Ile Thr Ser Phe Trp 365 370 375 TGG CGC CGG AGC TAC GCT GTC CAC ATC ACC TCC TTC TGG 1182 Trp Arg Arg Ser Tyr Ala Val His Ile Thr Ser Phe Trp 365 370 375

GAC GAG CCT TGG TGC CGG GTG TGC CAG GCT GTA CAG AGG 1221 GAC GAG CCT TGG TGC CGG GTG TGC CAG GCT GTA CAG AGG 1221

Asp Glu Pro Trp Cys Arg Val Cys Gin Ala Val Gin Arg 380 385 Asp Glu Pro Trp Cys Arg Val Cys Gin Ala Val Gin Arg 380 385

GCT GGG GAC CGG CCC AAG AGC ATA CGG AAC TTG GCC AGC 1260 GCT GGG GAC CGG CCC AAG AGC ATA CGG AAC TTG GCC AGC 1260

Ala Gly Asp Arg Pro Lys Ser Ile Arg Asn Leu Ala Ser 390 395 400 Ala Gly Asp Arg Pro Lys Ser Ile Arg Asn Leu Ala Ser 390 395 400

TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGGA AGCGACCCAG 1302 TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGGA AGCGACCCAG 1302

Trp Phe Glu Arg 405 Trp Phe Glu Arg 405

GGGAGGCCAA GTTGTCAGCT TTTTGATCCT CTACTGTGCA TCTCCTTGAC 1352 GGGAGGCCAA GTTGTCAGCT TTTTGATCCT CTACTGTGCA TCTCCTTGAC 1352

TGCCGCATCA TGGGAGTAAG TTCTTCAAAC ACCCATTTTT GCTCTATG 1400 TGCCGCATCA TGGGAGTAAG TTCTTCAAAC ACCCATTTTT GCTCTATG 1400

44 44

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 685 057 A5 CH 685 057 A5

Claims (20)

PatentansprücheClaims 1. Verfahren für die Herstellung einer membrangebundenen Säugetierglycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransferase, einer Siaiyitransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise membrangebundene oder lösliche Varianten davon, mit der Massgabe, dass diese Varianten enzymatisch aktiv sind, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter und eine für die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierende DNA-Sequenz enthält, wobei diese DNA von besagtem Promoter kontrolliert wird, transformiert ist, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.1. A process for the preparation of a membrane-bound mammalian glycosyltransferase from the group consisting of a galactosyltransferase, a siaiyitransferase and a fucosyltransferase, or membrane-bound or soluble variants thereof, with the proviso that these variants are enzymatically active, characterized in that a yeast strain is cultivated, which is transformed with a hybrid vector which contains an expression cassette comprising a promoter and a DNA sequence coding for said glycosyltransferase or its variant, said DNA being controlled by said promoter, and the enzymatic activity is obtained. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycosyltransferase menschlichen Ursprungs ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the glycosyltransferase is of human origin. 3. Verfahren für die Herstellung einer Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Variante durch das Fehlen des cytoplasmatischen Schwanzes, des Signalankers und, gegebenenfalls, eines kleineren Teils der Stammregion von der entsprechenden Form mit der vollen Länge unterscheidet.3. The method for producing a variant according to claim 1, characterized in that the variant differs from the corresponding form with the full length by the absence of the cytoplasmic tail, the signal anchor and, if appropriate, a smaller part of the stem region. 4. Verfahren für die Herstellung einer Variante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hefestamm kultiviert wird, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter, der funktionell mit einer ersten, ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, die im richtigen Leseraster mit einer zweiten, für die genannte Variante kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, die vom genannten Promoter kontrolliert wird, enthält, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.4. The method for the production of a variant according to claim 3, characterized in that a yeast strain is cultivated, the expression cassette comprising a promoter, which is functionally linked to a first, a signal peptide coding DNA sequence, which is in the correct reading frame with a second DNA sequence coding for the variant mentioned, which is controlled by the promoter mentioned, and which contains the enzymatic activity. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycosyltransferase eine Galactosyltransferase ist.5. The method according to claim 1, characterized in that the glycosyltransferase is a galactosyltransferase. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Galactosyltransferase UDP-Galactose: ß-Galactosid-a(1-3) galactosyltransferase (EC 2.4.1.151) oder UDP-Galactose: ß-N-Acetylgluco-samin-ß(1-4) galactosyltransferase (EC 2.4.1.22) ist.6. The method according to claim 5, characterized in that the galactosyl transferase UDP-galactose: β-galactoside-a (1-3) galactosyl transferase (EC 2.4.1.151) or UDP-galactose: β-N-acetylglucosamin-β (1 -4) galactosyltransferase (EC 2.4.1.22). 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Galactosyltransferase die in SEQ ID-Nr. 1 abgebildete Aminosäuresequenz hat.7. The method according to claim 5, characterized in that the galactosyltransferase the in SEQ ID no. 1 amino acid sequence shown. 8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Galactosyltransferase die in SEQ ID-Nr. 2 abgebildete Aminosäuresequenz hat.8. The method according to claim 3, characterized in that the galactosyltransferase the in SEQ ID no. 2 amino acid sequence shown. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycosyltransferase eine Siaiyitransferase ist.9. The method according to claim 1, characterized in that the glycosyltransferase is a siaiyitransferase. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Siaiyitransferase CMP-NeuAc-ß-Galactosid-a(2-6)sialyltransferase (EC 2.4.99.1) ist.10. The method according to claim 9, characterized in that the siaiyitransferase is CMP-NeuAc-β-galactoside-a (2-6) sialyltransferase (EC 2.4.99.1). 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Siaiyitransferase die in SEQ ID-Nr. 3 abgebildete Aminosäuresequenz hat.11. The method according to claim 9, characterized in that the siaiyitransferase the in SEQ ID no. 3 amino acid sequence shown. 12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Siaiyitransferase als ST(Lys27-Cys406) bezeichnet wird und aus den Aminosäuren 27 bis 406 der in SEQ ID-Nr. 3 aufgelisteten Aminosäuresequenz besteht.12. The method according to claim 9, characterized in that the siaiyitransferase is referred to as ST (Lys27-Cys406) and from amino acids 27 to 406 of the SEQ ID no. 3 listed amino acid sequence. 13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Siaiyitransferase die in SEQ ID-Nr. 4 abgebildete Aminosäuresequenz hat.13. The method according to claim 9, characterized in that the siaiyitransferase the in SEQ ID no. 4 amino acid sequence shown. 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycosyltransferase eine Fucosyltransferase ist.14. The method according to claim 1, characterized in that the glycosyltransferase is a fucosyltransferase. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fucosyltransferase GDP-Fucose: ß-Galactosid-a(1-2) fucosyltransferase (EC 2.4.1.69) und GDP-Fucose: N-Acetylglucosamin-a(1 -3/4) fucosyltransferase (EC 2.4.1.65) ist.15. The method according to claim 14, characterized in that the fucosyltransferase GDP-fucose: β-galactoside-a (1-2) fucosyltransferase (EC 2.4.1.69) and GDP-fucose: N-acetylglucosamine-a (1 -3/4 ) is fucosyltransferase (EC 2.4.1.65). 16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fucosyltransferase die unter SEQ ID-Nr. 5 abgebildete Aminosäuresequenz hat.16. The method according to claim 14, characterized in that the fucosyltransferase the SEQ ID no. 5 amino acid sequence shown. 17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fucosyltransferase als FT(Arg62-Arg405) bezeichnet wird und aus den Aminosäuren 62 bis 405 der unter SEQ ID-Nr. 5 abgebildeten Aminosäuresequenz besteht.17. The method according to claim 14, characterized in that the fucosyl transferase is referred to as FT (Arg62-Arg405) and from amino acids 62 to 405 of the SEQ ID no. 5 amino acid sequence shown consists. 18. Ein Hefe-Hybridvektor für einen Hefestamm zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter und eine für eine membrangebundene Säugetierglycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransferase, einer Siaiyitransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise eine deren membrangebundene oder lösliche, enzymatische aktive Varianten kodierende DNA-Sequenz, enthält, wobei diese DNA-Sequenz vom genannten Promotor kontrolliert wird.18. A yeast hybrid vector for a yeast strain for carrying out the method according to claim 1, characterized in that it has an expression cassette comprising a yeast promoter and one for a membrane-bound mammalian glycosyltransferase from the group consisting of a galactosyltransferase, a siaiyitransferase and a fucosyltransferase, or one thereof contains DNA sequences encoding membrane-bound or soluble enzymatic active variants, this DNA sequence being controlled by the promoter mentioned. 19. Ein mit einem Hybridvektor nach Anspruch 18 transformierter Hefestamm zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1.19. A yeast strain transformed with a hybrid vector according to claim 18 for carrying out the method according to claim 1. 20. Ein Hefestamm nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefestamm Saccharomvces cerevisiae BT 150, DSM 6530, ist.20. A yeast strain according to claim 19, characterized in that the yeast strain is Saccharomvces cerevisiae BT 150, DSM 6530. 4545