CH674713A5 - Filtration device for sepg. cell components from suspension - comprises modular elements, e.g. of PTFE, each retaining filter cloth and stacked together to form a column - Google Patents
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Abstract
Description
1 1
CH 674 713 A5 CH 674 713 A5
2 2nd
Beschreibung description
In der biologischen und biochemischen Laboratoriumstechnik, insbesondere in der genetischen Forschung, sieht man sich häufig vor die Aufgabe gestellt, aus einer vorzugsweise wässerigen und gepufferten Suspension von verschiedenen Zellbestandteilen, wie sie beispielsweise durch mechanische oder enzymatische Desintegration von Geweben oder auch aus Zellkulturen gewonnen wird, bestimmte Bestandteile auszusortieren und zu isolieren. Insbesondere handelt es sich dabei um das Aussortieren von Protoplasten und Zellorganellen, wie z.B. Zellkernen, Mitochondrien oder Chloropla-sten. In biological and biochemical laboratory technology, especially in genetic research, one is often faced with the task of using a preferably aqueous and buffered suspension of various cell components, such as is obtained, for example, by mechanical or enzymatic disintegration of tissues or from cell cultures. to sort out and isolate certain components. In particular, this involves sorting out protoplasts and cell organelles, e.g. Cell nuclei, mitochondria or chloroplasts.
Bei derartigen Sortier- und Isolieraufgaben war man bisher auf relativ langwierige und aufwendige Methoden, wie z.B. die Zentrifugation mittels eines Dichtegradienten angewiesen. Das dabei übliche Arbeitsverfahren mit Saccharoselösungen erfordert z.B. eine gekühlte Zentrifuge; zudem sind die osmotischen Einflüsse infolge der variablen Zuckerkonzentration den Zellbestandteilen oftmals nicht zuträglich, und es besteht auch immer die Gefahr einer enzymatischen Kontamination. Such sorting and isolation tasks have so far been based on relatively lengthy and complex methods, such as centrifugation by means of a density gradient. The usual working method with sucrose solutions requires e.g. a refrigerated centrifuge; in addition, the osmotic influences due to the variable sugar concentration are often not beneficial to the cell components, and there is always the risk of enzymatic contamination.
Bekannt sind z.B. auch Klassiergeräte, die auf optischem und/oder elektronischem Weg die Bestandteile nach ihrer Grösse oder nach andern Kriterien beurteilen und auf automatischem Wege, z.B durch eine in einen Flüssigkeitsstrom eingebaute Weiche, aussortieren. Sofern es sich lediglich um eine Klassierung der Bestandteile auf Grund ihrer Grösse handelt, besteht der einfachste Weg zum Aussortieren in einer Filtration mittels siebähnlicher Filtrationsmittel. Durch vertikales Übereinander-ordnen von Siebelementen verschiedener Lochweiten können dabei in einem Arbeitsgang mehrere Bestandteile gleichzeitig voneinander getrennt und aussortiert werden. For example, also classifiers that optically and / or electronically assess the components according to their size or other criteria and sort them out automatically, e.g. using a switch built into a liquid flow. If the components are only classified based on their size, the easiest way to sort them out is to use a filter-like filter. By vertically stacking screen elements of different hole sizes, several components can be separated and sorted out in one work step.
Als Siebelemente für biologische Bestandteile, wie z.B. einzelne Zellen, Protoplasten, und Organellen, wie Zellkerne, Chloroplasten oder Mitochondrien eignen sich in hervorragender Weise Gazegewebe, wie sie z.B. aus dem Müllereigewerbe bekannt sind. Solche Gewebe werden in verschiedenen Maschenweiten zwischen 1 und 500 um aus verschiedenen natürlichen und synthetischen Fasern, z.B. aus Baumwolle, natürlicher Seide oder vorzugsweise aus synthetischen Monofilamentfasern aus Polyamiden, Polypropylen und Polyestern, hergestellt und im Handel angeboten. Insbesondere die synthetischen Gazegewebe sind'mechanisch stabil, wasserbeständig, leicht zu reinigen und können ohne weiteres nach den in der Biologie üblichen Methoden sterilisiert werden, z.B. in einem Autoklaven bei 120°Cund 1 atü Überdruck. As sieve elements for biological components, e.g. individual cells, protoplasts, and organelles, such as cell nuclei, chloroplasts or mitochondria, are excellently suitable for gauze tissue, such as those e.g. are known from the milling industry. Such fabrics are made in various mesh sizes between 1 and 500 µm from various natural and synthetic fibers, e.g. made of cotton, natural silk or preferably synthetic monofilament fibers made of polyamides, polypropylene and polyesters, and offered commercially. The synthetic gauze fabrics in particular are mechanically stable, water-resistant, easy to clean and can be easily sterilized using the methods customary in biology, e.g. in an autoclave at 120 ° C and 1 atm pressure.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein für das biologisch-genetische Laboratorium, insbesondere für die Trennung von Zellbestandteilen konzipiertes Filtriergerät, das aus gleichartigen modulähnlichen Elementen zu einer Kolonne mit beliebig vielen Stufen zusammengebaut werden kann. Die modulähnlichen Elemente bestehen dabei aus je zwei hohlzylindrischen Stücken, die unter Zwischenlage je eines Stücks Filtergewebe zusammengesteckt werden. The present invention relates to a filtering device designed for the biological-genetic laboratory, in particular for the separation of cell components, which can be assembled from similar module-like elements to form a column with any number of stages. The module-like elements each consist of two hollow cylindrical pieces, which are put together with the interposition of a piece of filter fabric.
Durch Zusammenstecken einer Anzahl solcher zweiteiliger Elemente lässt sich eine Filtrierkolonne beliebiger Grösse bauen. Vorzugsweise werden die einzelnen Elemente von oben nach unten mit Filtergeweben abnehmender Maschenweite bestückt. Damit kann z.B. eine Suspension von biologischen • Teilchen in Fraktionen verschiedener Teilchengrös-se aufgetrennt werden. By plugging together a number of such two-part elements, a filtration column of any size can be built. The individual elements are preferably fitted with filter fabrics of decreasing mesh size from top to bottom. With this e.g. a suspension of biological particles is • separated into fractions of different particle sizes.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemässen Vorrichtung ist dabei, dass die Stücke von Filtergewebe nicht besonders zugeschnitten werden müssen. Ein einfacher, z.B. viereckiger Abschnitt genügt; infolge der besonderen Konstruktionsmerkmale der einzelnen Elemente wird das Filtergewebe beim Zusammenstecken der Teile glatt und faltenfrei über den offenen Querschnitt gestreckt. Der nicht benötigte Teil des Gewebestücks ragt dabei aus der Stelle, wo die Elemente zusammengesteckt werden, frei heraus. Da das Gewebe beim Zusammenstecken auch eine genügende Spannung erhält, ist ein Abstützen durch Lochplatten, Drahtgitter, Glas-fritten oder dergl. nicht nötig. Probleme infolge Undichtigkeit oder Verstopfung der Filter werden ebenfalls weitgehend vermieden. A particular advantage of the device according to the invention is that the pieces of filter fabric do not have to be specially cut. A simple, e.g. square section is sufficient; Due to the special design features of the individual elements, the filter fabric is stretched smoothly and wrinkle-free over the open cross-section when the parts are put together. The part of the fabric that is not required protrudes freely from the place where the elements are put together. Since the fabric also receives sufficient tension when it is put together, support by perforated plates, wire mesh, glass frits or the like is not necessary. Problems due to filter leakage or clogging are also largely avoided.
Ein weiterer Vorteil, der sich vor allem auf den Zeitaufwand und die Präparationskosten auswirkt, besteht darin, dass das zusammengesetzte Gerät inklusive der eingespannten Filtergewebe als Ganzes nach den in der Biologie üblichen Methoden unter Hitze und Dampf, z.B. in einem Autoklaven bei 120°C und 1 atü Überdruck beliebig oft sterilisiert werden kann. Auf die relativ kostspieligen vorsterilisierten Einwegfilter kann deshalb dank dem erfindungsgemässen Gerät verzichtet werden. Another advantage, which mainly affects the time and preparation costs, is that the assembled device including the clamped filter tissue as a whole according to the methods used in biology under heat and steam, e.g. can be sterilized as often as required in an autoclave at 120 ° C and 1 atm pressure. The relatively costly pre-sterilized disposable filter can therefore be dispensed with thanks to the device according to the invention.
Der Aufbau des Geräts ist aus den Figuren 1 bis 4 ersichtlich: The structure of the device can be seen from Figures 1 to 4:
Fig. 1 zeigt in perspektivischer Darstellung eines der modulartigen Elemente des Filtriergeräts, bestehend aus zwei unter Zwischenlage eines Stücks Filtergewebe zusammengesteckten hohlzylindrischen Teilen. Fig. 1 shows a perspective view of one of the modular elements of the filtering device, consisting of two hollow cylindrical parts put together with the interposition of a piece of filter fabric.
Fig. 2 zeigt, ebenfalls in perspektivischer Darstellung, die beiden Teile eines zusammensteckbaren Filterelements und das dazwischen einzuklemmende Stück Filtergewebe. Fig. 2 shows, also in perspective, the two parts of a pluggable filter element and the piece of filter fabric to be clamped between them.
Fig. 3 zeigt zwei verschiedene mit je einer zentralen Bohrung versehene Platten, die dem Gerät als untere Abschlussplatten angefügt werden können, derart, dass es direkt auf eine in der Figur ebenfalls dargestellte Petrischale aufgesetzt werden kann. 3 shows two different plates, each provided with a central bore, which can be added to the device as lower end plates, in such a way that it can be placed directly on a petri dish which is also shown in the figure.
Fig. 4 zeigt die einzelnen Teile eines Elements des Filtriergeräts im Längsschnitt; das zwischen den beiden beiden oberen Teilen einzusetzende Filtergewebe ist in dieser Darstellung weggelassen. Fig. 4 shows the individual parts of an element of the filter device in longitudinal section; the filter fabric to be used between the two upper parts is omitted in this illustration.
Fig. 1 stellt ein aus zwei zylindrischen Stücken (1) und (2) unter Zwischenlage des Filtergewebes (3) zusammengestecktes Filterelement dar. Fig. 1 shows a composed of two cylindrical pieces (1) and (2) with the interposition of the filter fabric (3) filter element.
In Fig. 2 sind die beiden zylindrischen Stücke (1) und (2) sowie das Filtergewebe (3) einzeln dargestellt. Das längere Stück (1) besitzt an seinem oberen Ende einen verstärkten äusseren Rand (9); seine Innenfläche ist eine glatte Zylinderfläche. Das In Fig. 2, the two cylindrical pieces (1) and (2) and the filter fabric (3) are shown individually. The longer piece (1) has a reinforced outer edge (9) at its upper end; its inner surface is a smooth cylindrical surface. The
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
2 2nd
3 3rd
CH 674 713 A5 CH 674 713 A5
4 4th
untere kurze Zylinderstück (2), mit einem Innendurchmesser, der etwas grösser ist als der Aus-sendurchmesser am untern Rand des grösseren Zylinderstückes (1), trägt an seiner Innenfläche unterhalb seines obern Randes einen ringförmigen Wulst (4), durch welchen das Filtergewebe beim Zusammenstecken gespannt und in seiner Lage festgehalten wird. Der Aussendurchmesser des Stücks (2) ist an seinem untern Ende (10) stufenförmig verjüngt und fügt sich beim Zusammenstecken mehrerer Filterelemente passend in den Innendurchmesser eines weiteren Stückes (1), womit aus mehreren Elementen beliebig lange Filtrierkolonnen aufgebaut werden können. The lower short cylinder piece (2), with an inner diameter that is slightly larger than the outer diameter at the lower edge of the larger cylinder piece (1), has an annular bead (4) on its inner surface below its upper edge, through which the filter fabric at Put together tight and held in place. The outer diameter of the piece (2) is tapered in a step-like manner at its lower end (10) and fits into the inner diameter of another piece (1) when several filter elements are plugged together, so that filter columns of any length can be constructed from several elements.
In Fig. 3 sind zwei plattenförmige Endstücke (5) und (7) dargestellt, jedes mit einem zentralen Loch, in welches das zylindrische Stück (2) mit seinem unteren Ende eingesteckt werden kann. Der äussere Rand (11) der beiden Endstücke ist etwas eingeschnitten, so dass die Platten passend auf je eine Petrischale (6), (8) aufgesetzt werden können. In Fig. 3 two plate-shaped end pieces (5) and (7) are shown, each with a central hole into which the cylindrical piece (2) can be inserted with its lower end. The outer edge (11) of the two end pieces is slightly cut so that the plates can be placed on a petri dish (6), (8).
In der Fig. 4 sind die zylindrischen Stücke (1) und (2) und die beiden Endplatten (5) und (7) im Schnitt dargestellt, wodurch der Wulst (4) und die Durchmesserverhältnisse der zusammensteckbaren Stücke klar ersichtlich werden. In Fig. 4, the cylindrical pieces (1) and (2) and the two end plates (5) and (7) are shown in section, whereby the bead (4) and the diameter ratios of the pluggable pieces are clearly visible.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, die in den Figuren nicht gezeigt ist, kann im obersten Filterelement oberhalb des obersten Filtergewebes eine zum Filter im wesentlichen parallele Platte angeordnet werden, die z.B. durch einen Wechselstrommagneten in vertikale Schwingungen versetzt wird. Eine derartige schwingende Platte erleichtert und beschleunigt in vielen Fällen die Filtration, insbesondere dort, wo mit sehr feinen Filtern gearbeitet wird, oder mit Materialien, die auf dem Filter zur Bildung einer kompakten, verstopfenden Schicht neigen. In a special embodiment of the invention, which is not shown in the figures, in the uppermost filter element above the uppermost filter fabric, a plate essentially parallel to the filter can be arranged, e.g. is caused to vibrate vertically by an AC magnet. Such a vibrating plate facilitates and accelerates the filtration in many cases, especially wherever very fine filters are used, or with materials that tend to form a compact, clogging layer on the filter.
Beispiel 1 : Isolation von keimfreien Protoplasten. Example 1: Isolation of aseptic protoplasts.
Ein Filtrationsgerät gemäss der vorliegenden Erfindung wird zusammengesteckt aus zwei Elementen, jedes bestehend aus einem zylindrischen Stück (1) mit einer Länge von 71 mm und einem Aussendurchmesser von 38 mm sowie einem zylindrischen Stück (2) mit einer Länge von 22 mm und einem Aussendurchmesser von 45 mm. Im ersten (oberen) Element befindet sich zwischen den Stücken (1) und (2) ein Filtergewebe mit einer Maschenweite von 100 um und im zweiten mit einer solchen von 50 um. Das zusammengesteckte Gerät wurde in eine Aluminiumfolie eingewickelt und anschliessend während 20 min im Autoklaven bei 125°C und 1 atü sterilisiert. A filtration device according to the present invention is put together from two elements, each consisting of a cylindrical piece (1) with a length of 71 mm and an outer diameter of 38 mm and a cylindrical piece (2) with a length of 22 mm and an outer diameter of 45 mm. In the first (upper) element between the pieces (1) and (2) there is a filter fabric with a mesh size of 100 µm and in the second with a size of 50 µm. The plugged-together device was wrapped in an aluminum foil and then sterilized for 20 minutes in an autoclave at 125 ° C. and 1 atm.
Blätter von in vitro kultivierten keimfreien Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) wurden in eine wässerige Lösung mit einem pH von 5.7, enthaltend pro Liter Leaves of in vitro cultivated aseptic tobacco plants (Nicotiana tabacum) were in an aqueous solution with a pH of 5.7 containing per liter
1480mgCaCl2 27,2 mg KH2P04 246 mg MgS04"7H20 0,025 mg CuS04-5H20 0,16 mg Kl und 130 g Mannitol eingelegt und während 1 Stunde im Dunkeln bei 28°C 1480mgCaCl2 27.2 mg KH2P04 246 mg MgS04 "7H20 0.025 mg CuS04-5H20 0.16 mg Kl and 130 g mannitol and placed in the dark at 28 ° C for 1 hour
vorplasmolysiert. Danach wurden die Blätter in pre-plasmolyzed. After that, the leaves were in
100 ml einer Lösung, enthaltend Containing 100 ml of a solution
500 mg Cellulase «Onozuka », 500 mg «Onozuka» cellulase,
100 mg Pectinase «Agrozym » 100 mg pectinase «Agrozym»
und 13 g Mannitol eingelegt und während 16 Stunden bei 28°C im Dunkeln inkubiert. and 13 g mannitol and incubated for 16 hours at 28 ° C in the dark.
Die so gewonnene Suspension, die neben nicht abgebauten Blattbestandteilen und Zellen mit nicht aufgeschlossenen Zellwänden eine grosse Anzahl Protoplasten, d.h. von ihrer Zellwand befreiten Zellen, enthielt, wurde in die Filtrationskolonne gegeben. Nach der Filtration wurden in der obersten Stufe vorwiegend verbleibende Aggregate aus der Plasmolyse sowie einige grössere Protoplasten und in der als Auffanggefäss dienenden Petrischale praktisch ausschliesslich Protoplaste gefunden. Die nach dieser Methode präparierten und isolierten Protoplasten wiesen zu mindestens 95% eine volle Lebens- und Teilungsfähigkeit auf. The suspension obtained in this way, in addition to undegraded leaf constituents and cells with undigested cell walls, a large number of protoplasts, i.e. cells freed from their cell wall were added to the filtration column. After the filtration, mostly remaining aggregates from the plasmolysis as well as some larger protoplasts were found in the uppermost stage and protoplasts were found almost exclusively in the petri dish serving as the collecting vessel. The protoplasts prepared and isolated using this method were at least 95% fully viable and capable of division.
Beispiel 2: Isolation von Zellkernen. Example 2: Isolation of cell nuclei.
Blätter von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) wurden in einem Kernenisolationspuffer, enthaltend pro Liter Leaves of tobacco plants (Nicotiana tabacum) were contained in a core isolation buffer containing 1 liter
10 mMol 2-Morpholino-äthansulfosäure- 10 mmol of 2-morpholino-ethanesulfonic acid
monohydrat monohydrate
200 mMol Saccharose, 200 mmol sucrose,
0,01 Gew.% Triton (Alkylphenyl-polyaethylenglykol) 10 mMol Natriumchlorid, 0.01% by weight of triton (alkylphenyl-polyethylene glycol) 10 mmol of sodium chloride,
10 mMol Kaliumchlorid 2,5 mMol 1,4-Dithioerythrit (DTE) 10 mmol potassium chloride 2.5 mmol 1,4-dithioerythritol (DTE)
2,5 mMol Aethylendiamin-tetraessigsäure Na2-Salz-Dihydrat und 2.5 mmol of ethylenediamine tetraacetic acid, Na2 salt dihydrate and
0,1 mMol N, N'-bis(3-aminopropyl-1,4-diaminobutan (Spermin) bei 40°C in kleine Stücke zerschnitten und anschliessend noch während 5 Minuten leicht geschüttelt. 0.1 mmol N, N'-bis (3-aminopropyl-1,4-diaminobutane (spermine) cut into small pieces at 40 ° C. and then shaken gently for 5 minutes.
Anschliessend wurde die Suspension in ein erfin-dungsgemässes Stufenfiltrationsgerät gegeben, das in vier Stufen mit verschiedenen Nylongeweben bestückt war, mit Maschenweiten, von oben nach unten gezählt, von 100, 40, 20 und 10 um. Die bei der Desintegration entstehenden Bruchstücke des Blattgewebes sammelten sich dabei in den verschiedenen Filtrationsstufen des Geräts, während eine Suspension, enthaltend die Zellkerne und kleinere Organellen wie Mitochondrien und Chloropia-sten die Filterkolonne nach unten verliessen. Durch eine weitere Filtrationsstufe mit einem Nylongewebe von 5 um Maschenweite konnten schliesslich die Zellkerne von den kleineren Organellen getrennt werden. The suspension was then placed in a step filtration device according to the invention, which was equipped in four steps with different nylon fabrics, with mesh sizes, counting from top to bottom, of 100, 40, 20 and 10 μm. The fragments of leaf tissue created during disintegration collected in the various filtration stages of the device, while a suspension containing the cell nuclei and smaller organelles such as mitochondria and chloropiaes left the filter column downwards. The cell nuclei could finally be separated from the smaller organelles by a further filtration stage with a nylon fabric of 5 µm mesh size.
Durch Waschen des feinsten Nylonnetzes mit einem kleinen Volumen der oben beschriebenen Pufferlösung konnte schliesslich eine fast ausschliesslich Zellkerne enthaltende Suspension gewonnen und für zellbiologische, genetische und biochemische Untersuchungen bereitgestellt werden. By washing the finest nylon mesh with a small volume of the buffer solution described above, an almost exclusively suspension containing cell nuclei could finally be obtained and made available for cell biological, genetic and biochemical investigations.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1816/88A CH674713A5 (en) | 1988-05-13 | 1988-05-13 | Filtration device for sepg. cell components from suspension - comprises modular elements, e.g. of PTFE, each retaining filter cloth and stacked together to form a column |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1816/88A CH674713A5 (en) | 1988-05-13 | 1988-05-13 | Filtration device for sepg. cell components from suspension - comprises modular elements, e.g. of PTFE, each retaining filter cloth and stacked together to form a column |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH674713A5 true CH674713A5 (en) | 1990-07-13 |
Family
ID=4219271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH1816/88A CH674713A5 (en) | 1988-05-13 | 1988-05-13 | Filtration device for sepg. cell components from suspension - comprises modular elements, e.g. of PTFE, each retaining filter cloth and stacked together to form a column |
Country Status (1)
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1988
- 1988-05-13 CH CH1816/88A patent/CH674713A5/en not_active IP Right Cessation
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