CH671157A5 - STABLE PHARMACEUTICAL PREPARATION CONTAINING GRANULOCYT COLONY STIMULATING FACTOR, AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME. - Google Patents
STABLE PHARMACEUTICAL PREPARATION CONTAINING GRANULOCYT COLONY STIMULATING FACTOR, AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME. Download PDFInfo
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Description
BESCHREIBUNG DESCRIPTION
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein stabiles pharmazeutisches Präparat, enthaltend einen Granulocytkolonie stimulierenden Faktor. Im speziellen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein stabilisiertes pharmazeutisches Präparat, enthaltend einen Granulocytkolonie stimulierenden Faktor, welcher geschützt ist gegenüber dem Verlust oder der Inaktivierung der aktiven Komponente (d.h. Granulocytkolonie stimulierender Faktor) bedingt durch die Adsorption an der Wand eines Behälters, in welchen das Präparat gegeben worden ist, oder bedingt durch die Assoziation, Polymerisation oder Oxidation der genannten Komponente. The present invention relates to a stable pharmaceutical preparation containing a granulocyte colony stimulating factor. In particular, the present invention relates to a stabilized pharmaceutical preparation containing a granulocyte colony stimulating factor which is protected against the loss or inactivation of the active component (ie granulocyte colony stimulating factor) due to adsorption on the wall of a container in which the Preparation has been given, or due to the association, polymerization or oxidation of the component mentioned.
Chemotherapie ist angewendet worden als ein Verfahren für die Behandlung einer Vielzahl von infektiösen Krankheiten, aber es ist kürzlich gefunden worden, dass Chemotherapie einige ernsthafte klinische Probleme verursacht, wie etwa die Erzeugung von arzneimittelresistenten Organismen, Veränderung der ursächlichen Organismen, und hohe Nebeneffekte. Um diese Probleme zu vermeiden, welche mit der Chemotherapie assoziiert sind, einschliesslich die Verwendung von therapeutischen Mitteln, wie etwa Antibiotika und Bakterizide, sind Anstrengungen unternommen worden, eine Substanz zu verwenden, welche die prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes gegenüber eines Infektion verursachenden Organismus aktiviert und dabei eine vollständige Lösung der oben erwähnten Probleme der Chemotherapie zur Verfügung stellt. Von der Vielzahl der prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes glaubt man, dass die phagocytisch bakterizide Wirkung von Leucocyten den stärksten Einfluss auf die anfängliche Periode von bakterieller Infektion verursacht, und es wurde daher angenommen, dass es wichtig ist, die Infektion schützenden Fähigkeiten des Wirtes zu begünstigen mittels Förderung des Wachstums von Neutrophilen und deren Differentiation im reifen Stadium. Der Granulocytkolonie stimulierender Faktor (G-CSF) ist eine der sehr brauchbaren Substanzen, welcher solche Wirkungen zeigt, und die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben vorgängig eine Patentanmeldung betreffend einem Infektion schützenden Mittel unter Verwendung von G-CFS eingereicht (Japanische Patentanmeldung Nr. 23 777/1985). Chemotherapy has been used as a method for treating a variety of infectious diseases, but it has recently been found that chemotherapy causes some serious clinical problems, such as the production of drug-resistant organisms, alteration in the causative organisms, and high side effects. In order to avoid these problems associated with chemotherapy, including the use of therapeutic agents such as antibiotics and bactericides, efforts have been made to use a substance which activates the host's prophylactic abilities against an organism causing infection and thereby provides a complete solution to the chemotherapy problems mentioned above. From the variety of host prophylactic abilities, it is believed that the phagocytic bactericidal activity of leucocytes has the greatest impact on the initial period of bacterial infection, and it has therefore been believed that it is important to promote the host's infection protective abilities Promoting the growth of neutrophils and their differentiation in the mature stage. Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is one of the very useful substances showing such effects, and the applicants of the present invention have previously filed a patent application for an anti-infection agent using G-CFS (Japanese Patent Application No. 23,777 / 1985).
Wie weiter oben erwähnt, umfasst die Chemotherapie, wie sie gegenwärtig praktiziert wird, verschiedene unvermeidbare Probleme, und intensive Anstrengungen werden gemacht, um eine Arzneimittelsubstanz zu verwenden, wel5 As mentioned above, chemotherapy as it is currently practiced involves various unavoidable problems and intensive efforts are made to use a drug substance which5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
3 3rd
671157 671157
che fähig ist zur Aktivierung der prophylaktischen Funktionen des Wirtes oder der Person, welche infisziert worden ist. is capable of activating the prophylactic functions of the host or the person who has been infected.
Unnötig zu sagen, dass G-CSF selbst die Fähigkeit entfaltet, die prophylaktischen Funktionen des Wirtes zu aktivieren, und es ist auch gefunden worden, dass G-CSF grössere therapeutische Effekte bei klinischen Anwendungen zeigt, wenn er angewendet wird in Kombination mit einer Substanz, welche die prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes aktiviert. Needless to say, G-CSF itself has the ability to activate the host's prophylactic functions, and it has also been found that G-CSF exhibits greater therapeutic effects in clinical applications when used in combination with a substance, which activates the prophylactic abilities of the host.
G-CSF wird in einer sehr geringen Menge angewendet, und ein pharmazeutisches Präparat, enthaltend 0,1 —100 (ig (vorzugsweise 5 — 50 (ig) an G-CSF, wird normalerweise verabreicht bei einer Dosismenge von 1 — 7 mal pro Woche an eine erwachsene Person. Jedoch hat G-CSF eine Tendenz, an der Wand eines Behälters, wie etwa einer Ampulle für die Injektion oder eine Spritze, absorbiert zu werden. Wenn das Arzneimittel als eine Injektion in solch einer Form wie eine wässrige Lösung verwendet wird, wird sie daher an der Wand des Behälters, wie etwa eine Ampulle oder eine Spritze, adsorbiert. Dies resultiert daher entweder im Misslingen von G-CSF, seine Aktivität als ein pharmazeutisches Mittel voll zu entfalten, oder es macht die Inkorporation von G-CSF in einer mehr als notwendigen Menge nötig, wobei man dem möglichen Verlust, bedingt durch die Adsorption, Rechnung trägt. G-CSF is used in a very small amount and a pharmaceutical preparation containing 0.1-100 (ig (preferably 5-50 (ig) of G-CSF) is usually administered at a dose of 1-7 times a week to an adult, however, G-CSF tends to be absorbed on the wall of a container such as an ampoule for injection or a syringe when the drug is used as an injection in such a form as an aqueous solution , it is therefore adsorbed onto the wall of the container, such as an ampoule or a syringe, resulting in either G-CSF failing to fully develop its activity as a pharmaceutical agent, or it incorporates G-CSF in an amount more than necessary, taking into account the possible loss due to adsorption.
Ferner ist G-CSF labil und stark empfindlich gegenüber Umweltfaktoren, wie etwa Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Sauerstoff und Ultraviolettstrahlen. Durch die Einwirkung von solchen Faktoren erfährt G-CSF physikalische oder chemische Veränderungen, wie etwa Assoziation, Polymerisation und Oxidation, und erleidet einen grossen Verlust an Aktivität. Diese Phänomene machen es schwierig, die vollständige Erfüllung eines therapeutischen Aktes mittels Verabfolgung einer sehr geringen Menge an G-CSF in einer sehr exakten Art sicherzustellen. G-CSF is also unstable and highly sensitive to environmental factors such as temperature, humidity, oxygen and ultraviolet rays. Through the action of such factors, G-CSF undergoes physical or chemical changes, such as association, polymerization and oxidation, and suffers a great loss of activity. These phenomena make it difficult to ensure complete fulfillment of a therapeutic act by administering a very small amount of G-CSF in a very precise manner.
Es ist daher notwendig, ein stabiles pharmazeutisches Präparat von G-CSF zu entwickeln, welches vollständig geschützt ist gegenüber einem Abfall in der Aktivität seiner wirksamen Komponente. Dies ist das Hauptziel der vorliegenden Erfindung, welche ein stabiles pharmazeutisches Präparat von G-CSF zur Verfügung stellt. It is therefore necessary to develop a stable pharmaceutical preparation of G-CSF which is completely protected against a drop in the activity of its active component. This is the main object of the present invention, which provides a stable pharmaceutical preparation of G-CSF.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten intensive Studien durch, um die Stabilität eines G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates zu begünstigen, und sie fanden, dass dieses Ziel wirkungsvoll erreicht werden kann mittels der Hinzugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Oberflächenmittels, Saccharides, Proteines oder hochmolekulargewichtigen Verbindung. The inventors of the present invention conducted intensive studies to favor the stability of a pharmaceutical preparation containing G-CSF, and found that this object can be achieved effectively by adding a pharmaceutically acceptable surfactant, saccharide, protein or high molecular weight compound.
Demgemäss ist das stabile G-CSF enthaltende pharmazeutische Präparat der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl G-CSF und wenigstens eine Substanz enthält, ausgewählt aus der Gruppe eines pharmazeutisch annehmbaren Oberflächenmittels, Saccharides, Proteins und hochmolekulargewichtigen Verbindung. Accordingly, the stable G-CSF-containing pharmaceutical preparation of the present invention is characterized in that it contains both G-CSF and at least one substance selected from the group of a pharmaceutically acceptable surface agent, saccharides, protein and high molecular weight compound.
Der G-CSF, welcher im pharmazeutischen Präparat der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kann erhalten werden 5 mittels irgend einem Verfahren, wie etwa jenen Verfahren, welche in den Beschreibungen der japanischen Patentanmeldungen Nrn. 153 273/1984,169 455/1985, 269 456/1985, 270 838/1985 und 270 839/1985 beschrieben sind. Zum Beispiel kann ein menschlicher G-CSF hergestellt werden ent-lo weder mittels Kultivierung eines Zellstammes (CNCM Hinterlegungs-Nummer 1-315 oder 1-483), gesammelt aus Tumorzellen von Patienten mit Mundhöhlenkrebs (oral cavity cancer) oder mittels Eingabe (expressing) einer rekombinierten DNA (welche hergestellt worden ist mittels Einwirkung i5 eines menschlichen G-CSF Chiffrierungsgenes [encoding gene]) in eine geeignete Wirtzelle (z.B. E. coli, C 127 Zelle oder Ovarienzellen eines chinesischen Hamsters). The G-CSF contained in the pharmaceutical preparation of the present invention can be obtained by any method such as those described in the descriptions of Japanese Patent Application Nos. 153 273/1984, 169 455/1985, 269 456 / 1985, 270 838/1985 and 270 839/1985. For example, a human G-CSF can be produced either by culturing a cell strain (CNCM deposit number 1-315 or 1-483) collected from tumor cells from patients with oral cavity cancer (oral cavity cancer) or by input (expressing) a recombined DNA (which has been produced by the action of a human G-CSF encoding gene [encoding gene]) in a suitable host cell (eg E. coli, C 127 cell or Chinese hamster ovary cells).
Irgend ein menschlicher G-CSF. welcher in hohem Grad gereinigt worden ist, kann verwendet werden als G-CSF, um 20 im pharmazeutischen Präparat der vorliegenden Erfindung enthalten zu sein. Vorzugsweise sind die menschlichen G-CSFs solche, welche erhalten worden sind mittels Isolation aus dem auf der Oberfläche schwimmenden Teil der Kultur einer menschlichen G-CSF produzierenden Zelle, und ein 25 Polypeptid oder Glycoprotein, welches die menschliche G-CSF Aktivität hat, welches erhalten worden ist mittels Transformierung eines Wirtes mit einem rekombinierten Vector, welcher darin ein Gen inkorporiert hat, welches ein Polypeptid, das die menschliche G-CSF Aktivität hat, co-30 diert. Some human G-CSF. which has been highly purified can be used as G-CSF to contain 20 in the pharmaceutical preparation of the present invention. Preferably, the human G-CSFs are those obtained by isolation from the floating part of the culture of a human G-CSF producing cell, and a polypeptide or glycoprotein which has human G-CSF activity by transforming a host with a recombined vector that has incorporated therein a gene that co-30s a polypeptide that has human G-CSF activity.
Zwei speziell bevorzugte Beispiele von menschlichen G-CSF werden im nachfolgenden gezeigt: Two particularly preferred examples of human G-CSF are shown below:
(1) Menschlicher G-CSF, welcher die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat: (1) Human G-CSF, which has the following physicochemical properties:
35 i) Molekulargewicht: etwa 19 000 ± 1000, gemessen mittels Elektrophorese mittels einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel; 35 i) Molecular weight: about 19,000 ± 1000, measured by electrophoresis using a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel;
ii) Isoelektrischer Punkt: mindestens einer der drei isoelektrischen Punkte habend: pl = 5.5 ± 0.1, pl = 5.8 ± 0.1, ii) Isoelectric point: having at least one of the three isoelectric points: pl = 5.5 ± 0.1, pl = 5.8 ± 0.1,
40 undpl = 6.1 ± 0.1; 40 undpl = 6.1 ± 0.1;
iii) Ultraviolettabsorption: eine maximale Absorption be 280 nm und eine minimale Absorption bei 250 nm habend; iii) Ultraviolet absorption: having a maximum absorption at 280 nm and a minimum absorption at 250 nm;
iv) Aminosäuresequenz der 21 Reste von N-Enden: H2N — Thr—Pro — Leu — Gly—Pro—Ala—Ser—Ser— iv) amino acid sequence of the 21 residues of N-ends: H2N - Thr — Pro - Leu - Gly — Pro — Ala — Ser — Ser—
45 Leu—Pro — Gin — Ser—Phe—Leu — Leu—Lys — Cys — Leu-Glu-Gin-Val-; 45 Leu-Pro-Gin-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gin-Val-;
(2) Menschlicher G-CSF, enthaltend entweder ein Polypeptid, welches die menschliche Granulocytstimulierenden Faktor Aktivität hat, welches dargestellt wird durch die ge- (2) Human G-CSF containing either a polypeptide which has human granulocyte-stimulating factor activity, which is represented by the
50 samte oder teilweise Aminosäuresequenz, die weiter unten gezeigt wird, oder ein Glycoprotein, welches sowohl das genannte Polypeptid als auch einen Zuckerketteteil hat: 50 whole or partial amino acid sequence shown below, or a glycoprotein that has both said polypeptide and a sugar chain part:
(Met)n (Met) n
Thr Thr
Pro Per
Leu Leu
Gly Gly
Pro Per
Ala Ala
Ser Ser
Ser Ser
Leu Leu
Pro Per
Gin gin
Ser Ser
Phe Phe
Leu Leu
Leu Leu
Lys Lys
Cys Cys
Leu Leu
Glu Glu
Gin gin
Val Val
Arg Arg
Lys Lys
Ile Ile
Gin gin
Gly Gly
Asp Asp
Gly Gly
Ala Ala
Ala Ala
Leu Leu
Gin gin
Glu Glu
Lys Lys
Leu Leu
(Val (Val
Ser Ser
Glu)m Glu) m
Cys Cys
Ala Ala
Thr Thr
Tyr Tyr
Lys Lys
Leu Leu
Cys Cys
His His
Pro Per
Glu Glu
Glu Glu
Leu Leu
Val Val
Leu Leu
Leu Leu
Gly Gly
His His
Ser Ser
Leu Leu
Gly Gly
Ile Ile
Pro Per
Trp Trp
Ala Ala
Pro Per
Leu Leu
Ser Ser
Ser Ser
Cys Cys
Pro Per
Ser Ser
Gin gin
Ala Ala
Leu Leu
Gin gin
Leu Leu
Ala Ala
Gly Gly
Cys Cys
Leu Leu
Ser Ser
Gin gin
Leu Leu
His His
Ser Ser
Gly Gly
Leu Leu
Phe Phe
Leu Leu
Tyr Tyr
Gin gin
Gly Gly
Leu Leu
Leu Leu
Gin gin
Ala Ala
Leu Leu
Glu Glu
Gly Gly
Ile Ile
Ser Ser
Pro Per
Glu Glu
Leu Leu
Gly Gly
Pro Per
Thr Thr
Leu Leu
Asp Asp
Thr Thr
Leu Leu
Gin gin
Leu Leu
Asp Asp
Val Val
Ala Ala
Asp Asp
Phe Phe
Ala Ala
Thr Thr
Thr Thr
Ile Ile
Trp Trp
Gin gin
Gin gin
Met Mead
Glu Glu
Glu Glu
Leu Leu
Gly Gly
Met Mead
Ala Ala
Pro Per
Ala Ala
Leu Leu
Gin gin
Pro Per
Thr Thr
Gin gin
Gly Gly
Ala Ala
Met Mead
Pro Per
Ala Ala
Phe Phe
Ala Ala
Ser Ser
Ala Ala
Phe Phe
Gin gin
Arg Arg
Arg Arg
Ala Ala
Gly Gly
Gly Gly
671157 671157
Val Glu Gin Val Glu Gin
Leu Val Pro Leu Val Pro
Val Ser Val Ser
Ala Tyr Ala Tyr
Ser Arg Ser Arg
His Val His Val
Leu Leu Leu Leu
Gin Arg Gin Arg
Ser His Ser His
Phe Leu Phe Leu
Leu Ala Leu Ala
(worin m 0 oder 1 ist und n 0 oder 1 ist). (wherein m is 0 or 1 and n is 0 or 1).
Für Details für das Verfahren zur Herstellung dieser beiden Arten von G-CSF beachte man die Beschreibungen der Japanischen Patentanmeldungen Nrn. 153 273/1984, 269 455/1985, 269 456/1985, 270 838/1985 und 270 839/1985, welche alle durch die Anmelder der vorliegenden Erfindung eingereicht worden sind. For details of the process for producing these two types of G-CSF, see the descriptions of Japanese Patent Application Nos. 153 273/1984, 269 455/1985, 269 456/1985, 270 838/1985 and 270 839/1985, all of which have been filed by the applicants of the present invention.
Ein weiteres Verfahren, welches verwendet werden kann, besteht in der Bewerkstellung der Fusion einer G-CSF produzierenden Zelle mit einer selbstwuchernden bösartigen Tumorzelle, und der Kultivierung des resultierenden Hybridomas in der Gegenwart oder Abwesenheit von Mytogen. Another method that can be used is to merge a G-CSF producing cell with a self-proliferating malignant tumor cell and cultivate the resulting hybridoma in the presence or absence of mytogen.
Die erhaltene Lösung, welche menschliches G-CSF enthält, kann in einem gefrorenen Stadium gelagert werden, nachdem sie weiter gereinigt und konzentriert worden ist, falls notwendig, und zwar mittels bekannten Techniken. Alternativ hierzu kann die Lösung gelagert werden, nachdem sie dehydratisiert worden ist, beispielsweise etwa mittels Gefriertrocknung. The resulting solution, which contains human G-CSF, can be stored in a frozen state after being further purified and concentrated, if necessary, by known techniques. Alternatively, the solution can be stored after it has been dehydrated, for example by means of freeze drying.
Alle so hergestellten menschlichen G-CSFs können so verarbeitet werden, wie dies in der vorliegenden Erfindung angegeben ist, um stabile, G-CSF enthaltende pharmazeutische Präparate zu erhalten. All of the human G-CSFs thus produced can be processed as indicated in the present invention to obtain stable pharmaceutical preparations containing G-CSF.
Typische Beispiele von Oberflächenmitteln, welche verwendet werden, um das stabile, G-CSF enthaltende pharmazeutische Präparat der vorliegenden Erfindung zu erhalten, werden im folgenden aufgelistet: Nichtionische Oberflächenmittel mit HLB von 6—18, wie etwa Sorbitan aliphatische Säureester (z.B. Sorbitan-monocaprylat, Sorbitan-monolau-rat und Sorbitan-monopalmitat), Glycerinaliphatische Säureester (z. B. Glycerin-monocaprylat, Glycerin-monomyri-stat und Glycerin-monostearat), Polyglycerinaliphatische Säureester (z.B. Decaglyceryl-monostearat, Decaglyceryldi-stearat und Decaglyceryl-monolinoleat), Polyoxyethylen sorbitanaliphatische Säureester (z.B. Polyoxyethylen-sorbi-tan-monolaurat, Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat, Poly-oxyethylen-sorbitan-monostearat, Polyoxyethylen-sorbitan-monopalmitat, Polyoxyethylen-sorbitan-trioleat und Poly-oxyethylen-sorbitan-tristearat), Polyoxyethylen-sorbitolali-phatische Säureester (z. .B. Polyoxyethylen-sorbitol-tetra-stearat und Polyoxyethylen-sorbitol-tetraoleat), Polyethy-len-glycerinaliphatische Säureester (z.B. Polyoxyethylen-glyceryl-monostearat), Polyethylen-glycolaliphatische Säureester (z.B. Polyethylen-glycol-distearat), Polyoxyethylen-alkylether (z.B. Polyoxyethylen-lauryl-ether), Polyoxyethy-len-polyoxypropylen-alkyl-ether (z.B. Polyoxyethylen-polyoxypropylen-glycol-ether, Polyoxyethylen-polyoxypro-pylen-propyl-ether, und Polyoxyethylen-polyoxypropylen-cetylether), Polyoxyethylen-alkylphenylether (z.B. Polyoxy-ethylen-nonylphenyl-ether), polyoxyethyliertes Rizinusöl (polyoxyethyliertes hydriertes Rizinusöl), polyoxyethylierte Bienenwachsderivate (z.B. polyoxyethylierter Sorbitolbie-nenwachs), polyoxyethylierte Lanolinderivate (z.B. Poly-oxyethylen-lanolin), und Polyoxyethylen-aliphatische Säure-amide (z. B. Polyethylen-stearinsäureamid); anionische Oberflächenmittel, wie etwa Alkylschwefelsäuresalze mit einer Cio—Ci8 Alkylgruppe (z.B. Natriumcetylsulfat; Natri-umlaurylsulfat und Natriumoleylsulfat), Polyoxyethylenal-kylether-Schwefelsäuresalze, worin die durchschnittliche molare Zahl an Ethylenoxidaddition 2—4 ist und die Alkylgruppe 10—18 Kohlenstoffatome hat, (z.B. Polyoxyethylen-Natrium-Laurylsulfat), Salze von Alkylsulfosuccinatestern, worin die Alkylgruppe 8 — 18 Kohlenstoffatome hat (z. B. Natriumlaurylsulfosuccinatester); und natürliche Oberflä- Typical examples of surfactants used to obtain the stable G-CSF-containing pharmaceutical preparation of the present invention are listed below: HLB 6-18 nonionic surfactants, such as sorbitan aliphatic acid esters (e.g. sorbitan monocaprylate, Sorbitan monolate and sorbitan monopalmitate), glyceryl aliphatic acid esters (e.g. glycerin monocaprylate, glycerine monomyri-stat and glycerol monostearate), polyglycerin aliphatic acid esters (e.g. decaglyceryl monostearate, decaglyceryldolcerol) stearate, Polyoxyethylene sorbitan aliphatic acid esters (e.g. polyoxyethylene sorbitan tan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, poly oxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate and polyoxyethylene sorbitan troxy stearate) sorbitol aliphatic acid esters (e.g. polyoxyethylene sorbitol tetra stearate and polyoxyethylene sorbitol ol-tetraoleate), polyethylene-glyceraliphatic acid esters (e.g. Polyoxyethylene glyceryl monostearate), polyethylene glycolaliphatic acid esters (e.g. polyethylene glycol distearate), polyoxyethylene alkyl ethers (e.g. polyoxyethylene lauryl ether), polyoxyethylene len polyoxypropylene alkyl ethers (e.g. polyoxyethylene polyoxypropylene glycol ether) , Polyoxyethylene polyoxypropylene propyl ether, and polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether), polyoxyethylene alkylphenyl ether (e.g. polyoxyethylene nonylphenyl ether), polyoxyethylated castor oil (polyoxyethylated hydrogenated castor oil), polyoxyethylated beeswax derivatives (e.g. polyoxyethylated wax sorbitol) , polyoxyethylated lanolin derivatives (for example polyoxyethylene lanolin), and polyoxyethylene aliphatic acid amides (for example polyethylene stearic acid amide); anionic surfactants, such as alkyl sulfuric acid salts with a Cio-Ci8 alkyl group (e.g. sodium cetyl sulfate; sodium umlauryl sulfate and sodium oleyl sulfate), polyoxyethylene alkyl ether sulfuric acid salts, in which the average molar number of ethylene oxide addition is 2-4 and the alkyl group has 10-18 carbon atoms ( e.g. polyoxyethylene sodium lauryl sulfate), salts of alkyl sulfosuccinate esters in which the alkyl group has 8-18 carbon atoms (e.g. sodium lauryl sulfosuccinate ester); and natural surfaces
5 chenmittel, wie etwa Lecithin, Glyerophospholipid, Sphin-gophospholipid (z.,B. Sphingomyelin), und Sucrose-alipha-tische Säureester, worin die aliphatische Säure 12—18 Kohlenstoffatome hat. Diese Oberflächenmittel können natürlich entweder unabhängig voneinander oder im Gemisch io miteinander verwendet werden. 5 agents such as lecithin, glyophospholipid, sphinophospholipid (e.g. sphingomyelin), and sucrose aliphatic acid esters, wherein the aliphatic acid has 12-18 carbon atoms. These surfactants can of course be used either independently of one another or in a mixture with one another.
Die weiter oben aufgeführten Oberflächenmittel werden vorzugsweise in Mengen von 1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-CSF verwendet. The surface agents listed above are preferably used in amounts of 1 to 10,000 parts by weight per part by weight of G-CSF.
Das Saccharid, welches verwendet wird bei der Herstel-i5 lung des stabilen, G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung kann ausgewählt sein aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden, wie auch aus Phosphatestern und Nucleotidderivaten davon, solange diese pharmazeutisch annehmbar sind. Typi-20 sehe Beispiele werden weiter unten angegeben: trivalente und höhere Zuckeralkohole, wie etwa Glycerin, Erythritol, Ara-bitol, Xylitol, Sorbitol, und Mannitol; saure Zucker, wie etwa Glucuronsäure, Iduronsäure, Neuraminsäure, Galactu-ronsäure, Gluconsäure, Mannuronsäure, Ketoglycolsäure, 25 Ketogalactonsäure und Ketogulonsäure; Hyaluronsäure und Salze davon, Chondroitinsulfat und Salze davon, Heparin, Inulin, Chitin und Derivate davon, Chitosan und Derivate davon, Dextrin, Dextran mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 5000—150 000, und Alginsäure und Sal-30 ze davon. Alle diese Saccharide können mit Vorteil entweder unabhängig voneinander oder im Gemisch miteinander verwendet werden. The saccharide used in the manufacture of the stable G-CSF-containing pharmaceutical preparation of the present invention can be selected from monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides, as well as from phosphate esters and nucleotide derivatives thereof, as long as they are pharmaceutically acceptable. Typi-20 see examples are given below: trivalent and higher sugar alcohols, such as glycerin, erythritol, ara-bitol, xylitol, sorbitol, and mannitol; acidic sugars such as glucuronic acid, iduronic acid, neuraminic acid, galacturonic acid, gluconic acid, mannuronic acid, ketoglycolic acid, ketogalactonic acid and ketogulonic acid; Hyaluronic acid and salts thereof, chondroitin sulfate and salts thereof, heparin, inulin, chitin and derivatives thereof, chitosan and derivatives thereof, dextrin, dextran with average molecular weights of 5,000-150,000, and alginic acid and Sal-30 ze. All of these saccharides can advantageously be used either independently of one another or in a mixture with one another.
Die weiter oben aufgeführten Saccharide werden vorzugsweise in Mengen von 1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-35 Teil an G-CSF verwendet. The saccharides listed above are preferably used in amounts of 1 to 10,000 parts by weight per part by weight of G-CSF.
Typische Beispiele von Proteinen, welche verwendet werden bei der Herstellung des stabilen, G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung umfassen menschliches Serumalbumin, menschliches Se-40 rumglobulin, Gelatin, Säure-behandeltes Gelatin (durchschnittliches Molekulargewicht = 7000—100 100), Alkalibehandeltes Gelatin (durchschnittliches Molekulargewicht = 7000—100 000), und Collagen. Unnötig zu sagen, dass diese Proteine entweder unabhängig voneinander oder im 45 Gemisch miteinander verwendet werden können. Typical examples of proteins used in the preparation of the stable G-CSF-containing pharmaceutical preparation of the present invention include human serum albumin, human Se-40 rum globulin, gelatin, acid-treated gelatin (average molecular weight = 7000-100 100), alkali-treated Gelatin (average molecular weight = 7,000-100,000), and collagen. Needless to say, these proteins can be used either independently or in a mixture.
Die weiter oben angegebenen Proteine werden vorzugsweise in Mengen von 1 —20 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-CSF verwendet. The proteins given above are preferably used in amounts of 1-20,000 parts by weight per part by weight of G-CSF.
Typische Beispiele der hoch-molekulargewichtigen Verso bindung, welche verwendet wird bei der Herstellung des stabilen, G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung, umfassen: Natürliche Polymere, wie etwa Hydroxypropylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, und Hydroxyethylcellulo-55 se; und synthetische Polymere, wie etwa Polyethylenglycol (Molekulargewicht = 300—6000), Polyvinylalkohol (Molekulargewicht = 20 000 — 100 000), und Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht = 20 000—100 000). Unnötig zu sagen, dass diese höher-molekulargewichtigen Verbindungen ent-60 weder alleine oder in Kombination verwendet werden können. Typical examples of the high molecular weight compound used in the manufacture of the stable G-CSF containing pharmaceutical preparation of the present invention include: natural polymers such as hydroxypropyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, and hydroxyethyl cellulose-55 se; and synthetic polymers such as polyethylene glycol (molecular weight = 300-6000), polyvinyl alcohol (molecular weight = 20,000-100,000), and polyvinylpyrrolidone (molecular weight = 20,000-100,000). Needless to say, these higher molecular weight compounds can not be used alone or in combination.
Die hochmolekulargewichtigen Verbindungen, welche weiter oben angegeben worden sind, werden vorzugsweise in Mengen von 1 —20 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-65 CSF verwendet. The high molecular weight compounds mentioned above are preferably used in amounts of 1-20,000 parts by weight per part by weight of G-65 CSF.
Zusätzlich zum Oberflächenmittel, dem Saccharid, dem Protein oder der höher-molekulargewichtigen Verbindung, welche alle weiter oben beschrieben worden sind, kann noch In addition to the surfactant, saccharide, protein, or higher molecular weight compound, all of which have been described above, may also
5 5
671157 671157
wenigstens ein Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminosäure, einem Schwefel-reduzieren-den Mittel und einem Antioxidationsmittel, bei der Herstellung des G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung inkorporiert werden. Illustrative Aminosäuren umfassen Glycin, Threonin, Tryptophan, Lysin, Hydroxylysin, Histidin, Arginin, Cystein, Cystin, und Methionin. Illustrative Schwefel-reduzierende Mittel umfassen: N-Acetylcystein, N-acetylhomocystein, Thioctinsäure, Thiodiglycol, Thioethanolamin, Thioglycerol, Thiosorbitol, Thioglycolsäure und Salze davon, Natriumthiosulfat, Natriumhydrogensulfit, Natriumpyrosulfit, Natriumsulfit, Thio-milchsäure, Dithiothreitol, Glutathion, und ein mildes Schwefel-reduzierendes Mittel, welches eine Sulfhydrylgrup-pe hat, wie etwa eine Ci — Cz-Thioalkansäure. Illustrative Antioxidationsmittel umfassen Erythorbinsäure, Dibutylhy-droxytoluol, Butylhydroxyanisol, dl-a-Tocopherol, Toco-pherol-acetat, L-Ascorbinsäure und Salze davon. L-Ascor-binsäure-palmitat, L-Ascorbinsäure-stearat, Triamyl-gallat, Propyl-gallat und Chelierungsmittel, wie etwa Dinatrium-ethylendiamintetraacetat (EDTA), Natriumpyrophosphat und Natriummetaphosphat. at least one ingredient selected from the group consisting of an amino acid, a sulfur reducing agent and an antioxidant may be incorporated in the preparation of the pharmaceutical preparation of the present invention containing G-CSF. Illustrative amino acids include glycine, threonine, tryptophan, lysine, hydroxylysine, histidine, arginine, cysteine, cystine, and methionine. Illustrative sulfur reducing agents include: N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof, sodium thiosulfate, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrosulfite, sodium thiol sulfite, glutothisulfite, dithutulfide, thio-sulfothionic acid, dithutiol sulfite, dithutyl sulfite, dithutiol sulfite, dithutiol sulfate, thio -reducing agent which has a sulfhydryl group, such as a Ci - Cz-thioalkanoic acid. Illustrative antioxidants include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylated hydroxyanisole, dl-a-tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid, and salts thereof. L-ascorbic acid palmitate, L-ascorbic acid stearate, triamyl gallate, propyl gallate and chelating agents such as disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate and sodium metaphosphate.
Die weiter oben angegebenen Aminosäuren, Schwefelreduzierenden Mittel und Antioxidationsmittel oder Gemische davon werden vorzugsweise in Mengen von 1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-CSF verwendet. The amino acids, sulfur-reducing agents and antioxidants or mixtures thereof indicated above are preferably used in amounts of 1 to 10,000 parts by weight per part by weight of G-CSF.
Für den Zweck der Formulierung des stabilen, G-CSF enthaltenden Präparates der vorliegenden Erfindung in eine geeignete Dosierungsform kann eines oder mehrere der folgenden Bestandteile inkorporiert werden: Ein Verdünnungsmittel, eine Löslichkeitshilfe, ein isotonisches Mittel, ein Arzneimittelträger, ein pH-Wertmodifikator, ein schmerzlinderndes Mittel, und ein Buffer. For the purpose of formulating the stable G-CSF-containing preparation of the present invention in a suitable dosage form, one or more of the following ingredients can be incorporated: a diluent, a solubility aid, an isotonic agent, a drug carrier, a pH modifier, an analgesic Means, and a buffer.
Das stabilisierte G-CSF pharmazeutische Präparat der vorliegenden Erfindung kann entweder für die orale Verabfolgung oder für die parenterale Verabfolgung formuliert sein, wie etwa durch Injektion, angewendet in verschiedenen Wegen, und eine Vielzahl von Verabfolgungsformen kann verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der spezifischen Art der Verabfolgung. Typische Dosierungsformen umfassen: Jene, welche für die orale Verabfolgung bestimmt sind, wie etwa Tabletten, Pillen, Kapseln, Granulate und Suspensionen; Lösungen, Suspensionen und gefriergetrocknete Präparate, hauptsächlich bestimmt für intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion, subkutane Injektion und intrakutane Injektion; und jene, welche für die transmukosa-le Verabfolgung bestimmt sind, wie etwa rektale Supposito-rien, nasale Arzneimittel, und vaginale Suppositorien. The stabilized G-CSF pharmaceutical preparation of the present invention may be formulated for either oral or parenteral administration, such as by injection, used in various ways, and a variety of modes of administration may be used, depending on the specific one Method of administration. Typical dosage forms include: those intended for oral administration, such as tablets, pills, capsules, granules and suspensions; Solutions, suspensions and freeze-dried preparations mainly intended for intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection and intracutaneous injection; and those intended for transmucosal administration, such as rectal suppositories, nasal drugs, and vaginal suppositories.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oberflächenmittel, einem Saccharid, einem Protein oder einer hochmolekulargewichtigen Verbindung zu einem G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparat hinzugegeben, so dass dieses daran gehindert wird, an der Wand seines Behälters oder einer Spritze absorbiert zu werden, währenddem es gleichzeitig stabil über eine verlängerte Zeitspanne bleibt. According to the present invention, at least one substance selected from the group consisting of a surface agent, a saccharide, a protein or a high molecular weight compound is added to a pharmaceutical preparation containing G-CSF so as to prevent it from being attached to the wall of its container or a syringe while remaining stable over an extended period of time.
Der detaillierte Mechanismus, mit welchem die weiter oben erwähnten Substanzen den G-CSF stabilisieren oder ihn daran hindern, absorbiert zu werden, muss noch geklärt werden. In der Gegenwart eines Oberflächenmittels würde die Oberfläche vom G-CSF, welcher ein hydrophobes Protein ist, mit dem Oberflächenmittel bedeckt, um solubilisiert zu werden, so dass der G-CSF, welcher in einer Spurenmenge vorhanden ist, wirksam daran gehindert wird, an der Wand seines Behälters oder einer Spritze absorbiert zu werden. Ein Saccharid oder eine hydrophile hoch-molekularge-wichtige Verbindung würde eine hydratisierte Schicht zwischen G-CSF und der adsorptiven Oberfläche der Wand des Behälters oder einer Spritze bilden, wobei die Adsorption von G-CSF in einer wirksamen Art verhindert wird. Ein Protein würde mit dem G-CSF bezüglich der Adsoption an der Wand seines Behälters oder einer Spritze konkurrieren, wobei die Adsorption von G-CSF wirksam verhindert wird. The detailed mechanism by which the substances mentioned above stabilize G-CSF or prevent it from being absorbed has yet to be clarified. In the presence of a surface agent, the surface of the G-CSF, which is a hydrophobic protein, would be covered with the surface agent to be solubilized, so that the G-CSF, which is present in a trace amount, is effectively prevented from doing so Wall of his container or a syringe to be absorbed. A saccharide or a hydrophilic, high molecular weight compound would form a hydrated layer between G-CSF and the adsorptive surface of the wall of the container or a syringe, preventing the adsorption of G-CSF in an effective manner. A protein would compete with the G-CSF for adsorption on the wall of its container or syringe, effectively preventing the adsorption of G-CSF.
Neben der Verhinderung der G-CSF Adsorption tragen die oben erwähnten Substanzen auch zur Verhinderung der Assoziation oder Polymerisation der G-CSF Moleküle bei. In der Gegenwart eines Oberflächenmittels, Saccharides, Proteines oder hoch-molekulargewichtigen Verbindung werden die einzelnen Moleküle von G-CSF in diesen Substanzen dispergiert, und die Interaktion zwischen den G-CSF-Mole-külen wird genügend reduziert, um eine signifikante Abnahme der Wahrscheinlichkeit ihrer Assoziation oder Polymerisation zu bewirken. Zusätzlich verzögern diese Substanzen die Autoxidation von G-CSF, welche bei hohen Temperaturen oder Luftfeuchtigkeit beschleunigt wird, oder sie hindern G-CSF daran, assoziiert oder polymerisiert zu werden, als ein Resultat der Autoxidation. Diese Effekte der Verzögerung der Autoxidation von G-CSF oder der Verhinderung der Assoziation oder Polymerisation werden weiter begünstigt durch die Hinzugabe einer Aminosäure, eines Schwefelreduzierenden Mittels oder eines Antioxidationsmittels. In addition to preventing G-CSF adsorption, the substances mentioned above also help to prevent the association or polymerization of the G-CSF molecules. In the presence of a surfactant, saccharide, protein, or high molecular weight compound, the individual molecules of G-CSF are dispersed in these substances and the interaction between the G-CSF molecules is reduced enough to significantly decrease the likelihood of them Association or polymerization to effect. In addition, these substances delay the autoxidation of G-CSF, which is accelerated at high temperatures or humidity, or prevent G-CSF from being associated or polymerized as a result of the autoxidation. These effects of delaying the autoxidation of G-CSF or preventing association or polymerization are further enhanced by the addition of an amino acid, a sulfur reducing agent, or an antioxidant.
Die weiter oben beschriebenen Probleme treten speziell in Lösungen für Injektionen und in Suspensionen auf, aber sie treten auch während des Verfahrens der Formulierung von G-CSF in anderen Dosierungsformen, wie etwa Tabletten, auf. Die Hinzugabe von Oberflächenmitteln, Sacchari-den, Proteinen oder hoch-molekulargewichtigen Verbindungen ist auch in diesem letzteren Fall wirksam. The problems described above occur specifically in solutions for injections and in suspensions, but they also occur during the process of formulating G-CSF in other dosage forms, such as tablets. The addition of surface agents, saccharides, proteins or high molecular weight compounds is also effective in the latter case.
Durch die Hinzugabe wenigstens einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oberflächenmittel, Saccharid, Protein und einer hoch-molekulargewichtigen Verbindung, wird G-CSF stark stabilisiert und behält seine Aktivität für eine verlängerte Zeitspanne, wie dies in den folgenden Beispielen gezeigt wird. Zur Erzielung dieser Resultate ist die Menge von jeder dieser Substanzen, im speziellen deren untere Grenze, kritisch, und die folgenden Bereiche sind wünschbar: 1 — 10 000 Gew.-Teile an Oberflächemnittel, 1 — 10 000 Gew.-Teile an Saccharid, 1 — 20 000 Gew.-Teile an Protein, und 1—20 000 Gew.-Teile an hoch-molekulargewichtiger Verbindung, pro 1 Gew.-Teil an G-CSF. By adding at least one substance selected from the group consisting of a surfactant, saccharide, protein and a high molecular weight compound, G-CSF is strongly stabilized and retains its activity for an extended period of time, as shown in the following examples . To achieve these results, the amount of each of these substances, especially their lower limit, is critical and the following ranges are desirable: 1 - 10,000 parts by weight of surface agent, 1 - 10,000 parts by weight of saccharide, 1 - 20,000 parts by weight of protein, and 1-20,000 parts by weight of high molecular weight compound, per 1 part by weight of G-CSF.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Oberflächenmittel, ein Saccharid, ein Protein und/oder eine hochmolekulargewichtige Verbindung in einer spezifizierten Konzentration verwendet, und dies ist nicht nur wirksam bei der Verhinderung von G-CSF, an der Wand seines Behälters oder einer Spritze absorbiert zu werden, sondern auch bei der Begünstigung der Stabilität eines G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates. Als ein Resultat davon wird es möglich, die Verabfolgung einer kleinen aber hochpräzisen Dosis an G-CSF an Patienten sicherzustellen. Weil G-CSF teuer ist, führt seine effiziente Verwendung zu niedrigen Kosten bei der Herstellung von G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparaten. According to the present invention, a surfactant, a saccharide, a protein and / or a high molecular weight compound is used in a specified concentration, and this is not only effective in preventing G-CSF from being absorbed on the wall of its container or a syringe , but also in favor of the stability of a pharmaceutical preparation containing G-CSF. As a result, it becomes possible to ensure the administration of a small but highly precise dose of G-CSF to patients. Because G-CSF is expensive, its efficient use leads to low costs in the manufacture of pharmaceutical preparations containing G-CSF.
Die folgenden Beispiele dienen dem Zwecke der weiteren Illustration der vorliegenden Erfindung, und sie sollen in keinem Sinn als begrenzend betrachtet werden. In diesen Beispielen wurde die übrigbleibende Aktivität an G-CSF bestimmt mittels einem der folgenden Verfahren. The following examples are for the purpose of further illustrating the present invention and are not to be considered as limiting in any sense. In these examples, the remaining activity on G-CSF was determined using one of the following methods.
(a) Weiche Agar-Methode unter Verwendung von Mäuseknochenmarkzellen: (a) Soft agar method using mouse bone marrow cells:
Ein Pferdeserum (0,4 ml), 0,1 ml der Probe, 0,1 ml einer C3H/He (weiblichen) Mäuseknochenmarkzellensuspension (0,5 — 1 x 105 nukleare Zellen), und 0,4 ml einer modifizierten McCoy's 5A Kulturlösung, enthaltend 0,75% an Agar, A horse serum (0.4 ml), 0.1 ml of the sample, 0.1 ml of a C3H / He (female) mouse bone marrow cell suspension (0.5-1 x 105 nuclear cells), and 0.4 ml of a modified McCoy's 5A culture solution , containing 0.75% of agar,
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
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40 40
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50 50
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6 6
wurden miteinander vermischt, in ein Kunststoffgefäss für Gewebekulturen (35 mm0), geleert, coaguliert, und während 5 Tagen bei einer Temperatur von 37 °C in 5% C02/95% Luft und einer 100%igen Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Anzahl an gebildeten Kolonien wurde gezählt (eine Kolonie bestand aus wenigstens 50 Zellen), und die Aktivität wurde bestimmt mit einer Einheit, welche die Aktivität ist für die Bildung einer Kolonie. were mixed together, in a plastic container for tissue cultures (35 mm0), emptied, coagulated, and cultivated for 5 days at a temperature of 37 ° C. in 5% CO 2/95% air and 100% atmospheric humidity. The number of colonies formed was counted (one colony consisted of at least 50 cells) and the activity was determined by a unit which is the activity for forming a colony.
Die modifizierte McCoy's 5A Kulturlösung, welche in der Methode (a) verwendet wurde, wurde durch die folgenden Verfahren hergestellt. The modified McCoy's 5A culture solution used in Method (a) was prepared by the following procedures.
Modifizierte McCoy's 5A Kulturlösung (doppelte Konzentration) Modified McCoy's 5A culture solution (double concentration)
12 g an McCoy's 5a Kulturlösung (Gibco), 2,55 g an MEM Ammosäure-Vitaminmedium (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2,18 g an Natriumbicarbonat und 50 000 Einheiten an Kalium-Penicillin G wurden zweimal in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde aseptisch durch einen Milliporefilter (0,22 um) filtriert. 12 g of McCoy's 5a culture solution (Gibco), 2.55 g of MEM amino acid vitamin medium (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2.18 g of sodium bicarbonate and 50,000 units of potassium penicillin G were distilled twice in 500 ml Water was dissolved and the solution was aseptically filtered through a Millipore filter (0.22 µm).
(b) «Reverse-phase» HPLC (high-performance liquid chromatography: (b) reverse phase HPLC (high-performance liquid chromatography:
Unter Verwendung einer «reverse-phase» C8 Säule (4,6 mm x 300 mm; 5 (xm) und einem n-Propanol/Trifhiores-sigsäure-Gemisch als mobile Phase wurde die übrigbleibende Aktivität von G-SCF (injiziert in einer Menge équivalent zu 1 ng) bestimmt unter den folgenden Gradientbedingungen. Using a reverse phase C8 column (4.6 mm x 300 mm; 5 (xm) and an n-propanol / trifhioresacetic acid mixture as the mobile phase, the remaining activity of G-SCF (injected in an amount equivalent to 1 ng) determined under the following gradient conditions.
Zeit (Sek.) Time (sec.)
0 15 25 0 15 25
Lösungsmittel Lösungsmittel Gradient (A) (B) Solvent solvent gradient (A) (B)
100% 0% 100% 100% 0% 100%
0% 100% 0% 0% 100% 0%
) linear | linear ) linear | linear
Lösungsmittel (A): 30% n-Propanol und 0,1% Trifhioressig-säure Solvent (A): 30% n-propanol and 0.1% trifhioacetic acid
Lösungsmittel (B): 60% n-Propanol und 0,1% Trifluoressig- Solvent (B): 60% n-propanol and 0.1% trifluoroacetic acid
saure acid
Der Nachweis wurde ausgeführt bei einer Wellenlänge von 210 nm, und der prozentmässige Anteil der übrigbleibenden G-CSF Aktivität wurde mittels der folgenden Formel berechnet: The detection was carried out at a wavelength of 210 nm, and the percentage of the remaining G-CSF activity was calculated using the following formula:
Übrigbleibende G-CSF Aktivität (0/ Remaining G-CSF activity (0 /
übrigbleibende Menge an G-CSF nach dem Ablauf einer gegebenen Zeit anfängliche Menge an G-CSF remaining amount of G-CSF after a given time initial amount of G-CSF
x 100 x 100
Die übrigbleibende Menge an G-CSF, bestimmt mittels diesem Verfahren, korrelierte sehr gut mit dem Resultat, io welches erhalten wurde bei der Messung mit der weichen Agarmethode (a) unter Verwendung von Mäuseknochen-markzellen. The remaining amount of G-CSF, determined by this method, correlated very well with the result obtained in the measurement using the soft agar method (a) using mouse bone marrow cells.
Beispiel 1 example 1
15 Zu 5 p.g an G-CSF wurde eines der Stabilisierungsmittel, welche in Tabelle 1 aufgelistet sind, hinzugegeben, und das Gemisch wurde aseptisch gelöst in einer 20 mM Bufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4), um ein pharmazeutisches Präparat herzustellen, enthaltend 5 \xg G-20 CSF pro ml, welches anschliessend gefriergetrocknet wurde. Die zeitabhängige Veränderung der G-CSF Aktivität wurde mittels der Methode (a) gemessen, und die Resultate werden in der Tabelle 1 gezeigt. Der Ausdruck «Aktivität (%)» in der Tabelle stellt die übrigbleibende Aktivität an G-CSF dar, 25 relativ zur anfänglichen Einheit, und wird definiert durch die folgende Formel: 15 To 5 pg of G-CSF, one of the stabilizing agents listed in Table 1 was added and the mixture was aseptically dissolved in a 20 mM buffer solution (containing 100 mM sodium chloride; pH 7.4) to prepare a pharmaceutical preparation , containing 5 \ xg G-20 CSF per ml, which was then freeze-dried. The time-dependent change in G-CSF activity was measured using method (a), and the results are shown in Table 1. The expression “activity (%)” in the table represents the remaining activity on G-CSF, 25 relative to the initial unit, and is defined by the following formula:
Aktivität (%) = Activity (%) =
30 30th
Aktivitäteinheit nach dem Ablauf einer gegebenen Zeit anfängliche Aktivitätseinheit x 100 Activity unit after a given time initial activity unit x 100
Die Gefriertrocknung wurde durch die folgenden Verfahren ausgeführt: Freeze drying was carried out by the following methods:
Die G-CSF-Lösung, enthaltend ein Stabilisierungsmittel, wurde in ein steriles, sulfa-behandelndes Glasfläschchen ge-35 geben, auf eine Temperatur von —40 °C oder darunter während 4 Stunden gefroren, dann einem ersten Trocknen mittels Erwärmung von —40 °C auf 0 °C während einer Zeitspanne von 48 Stunden unter einem Druck, welcher von 0,03 auf 0,1 Torr erhöht wurde, dann einem zweiten Trocknen 40 mittels Erwärmung von 0 °C auf 20 °C während einer Zeitspanne von 12 Stunden unter einem Druck, welcher von 0,03 auf 0,08 Torr erhöht wurde, unterworfen, wonach das Innere des Glasfläschchens mit einem sterilen trockenen Stickstoffgas gefüllt wurde, um einen atmosphärischen Druck zu 45 erhalten, und das Glasfläschchen wurde mit einem Gefriertrocknungsgummistopfen verschlossen und anschliessend mit einer Aluminiumkappe abgedichtet. The G-CSF solution containing a stabilizing agent was placed in a sterile, sulfa-treating glass vial, frozen to a temperature of -40 ° C or below for 4 hours, then a first drying by heating at -40 ° C to 0 ° C over a period of 48 hours under a pressure which was increased from 0.03 to 0.1 Torr, then a second drying 40 by heating from 0 ° C to 20 ° C over a period of 12 hours subjected to a pressure which was increased from 0.03 to 0.08 torr, after which the inside of the glass vial was filled with a sterile dry nitrogen gas to maintain an atmospheric pressure, and the glass vial was sealed with a freeze-drying rubber stopper and then with sealed with an aluminum cap.
Tabelle 1 Table 1
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Aktivität (%) Stabilizing agent amount (weight activity (%)
Teile) Parts)
Nach Lagerung Nach Lagerung bei bei 4 °C während 37 CC während 6 Monaten 1 Monat After storage After storage at 4 ° C for 37 months for 6 months for 1 month
Xylitol Mannitol Glucuronsäure Hyaluronsäure Xylitol mannitol glucuronic acid hyaluronic acid
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
Heparin Heparin
Chitosan Chitosan
Alginsäure menschliches Serum-albumin menschliches Serum-globulin säurebehandeltes Gelatin alkali-behandeltes Gelatin Collagen Alginic acid human serum albumin human serum globulin acid-treated gelatin alkali-treated gelatin collagen
10,000 10,000
92 92
86 86
10,000 10,000
91 91
85 85
10,000 10,000
86 86
82 82
2,000 2,000
92 92
89 89
2,000 2,000
95 95
90 90
5,000 5,000
85 85
80 80
2,000 2,000
93 93
91 91
2,000 2,000
90 90
90 90
1,000 1,000
98 98
99 99
1,000 1,000
98 98
95 95
2,000 2,000
97 97
95 95
1,000 1,000
99 99
96 96
2,000 2,000
95 95
90 90
7 7
Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)
671157 671157
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Aktivität (%) Stabilizing agent amount (weight activity (%)
Teile) Parts)
Nach Lagerung Nach Lagerung bei bei 4 C während 37 C während 6 Monaten 1 Monat After storage After storage at 4 C for 37 months at 37 C for 1 month
Polyethylenglycol (Molekulargewicht 4 000) Hydroxypropyl-cellulose Natrium-carboxymethylcellulose Hydroxymethyl-cellulose Polyvinyl-alkohol (Molekulargewicht 50 000) Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 50 000) Polyethylene glycol (molecular weight 4,000) hydroxypropyl cellulose sodium carboxymethyl cellulose hydroxymethyl cellulose polyvinyl alcohol (molecular weight 50,000) polyvinylpyrrolidone (molecular weight 50,000)
menschliches Serum-albumin human serum albumin
Mannitol Mannitol
Cystein menschliches Serum-albumin Human serum albumin cysteine
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Polyoxyethylene sorbitan monolaurate
Mannitol menschliches Serum-albumin Hydroxypropyl-cellulose Dextran (Molekulargwicht 40 000) Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Sorbitol Mannitol human serum albumin hydroxypropyl cellulose dextran (molecular weight 40,000) polyoxyethylene sorbitan monolaurate sorbitol
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Dextran (Molekulargewicht 40 000) Polyoxyethylated hardened castor oil dextran (molecular weight 40,000)
nichts hinzugegeben nothing added
Beispiel 2 Example 2
Zu 10 Hg an G-CSF wurde eines der Stabilisierungsmittel, welche in Tabelle 2 aufgelistet sind, hinzugegeben, und das Gemisch wurde aseptisch gelöst in einer 20 mM Phosphatbufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4), um ein pharmazeutisches Präparat herzustellen, enthaltend 10 (ig an G-CSF pro ml. Das Präparat wurde aseptisch To 10 Hg of G-CSF, one of the stabilizing agents listed in Table 2 was added, and the mixture was aseptically dissolved in a 20 mM phosphate buffer solution (containing 100 mM sodium chloride; pH 7.4) to prepare a pharmaceutical preparation, containing 10% of G-CSF per ml. The preparation became aseptic
94 90 94 90
98 94 98 94
88 80 88 80
92 90 92 90
96 95 96 95
2,000 95 94 2,000 95 94
2,000 2,000
2,000 100 97 2,000 100 97
100 2,000 100 2,000
100 99 96 100 99 96
2,000 2,000 2,000 2,000
500 98 92 500 98 92
2,000 100 2,000 100
2,000 98 96 2,000 98 96
100 100
2,000 94 92 2,000 94 92
74 58 74 58
30 in ein sulfa-behandeltes Glasfläschchen gegeben und abgedichtet, um eine G-CSF-Lösung herzustellen. Die zeitabhängige Veränderung in der Aktivität an G-CSF in dieser Lösung wurde mittels dem gleichen Verfahren gemessen, wie in Beispiel 1 verwendet, und die Resultate sind in der Tabelle 2 35 angegeben. 30 placed in a sulfa treated glass vial and sealed to produce a G-CSF solution. The time-dependent change in activity of G-CSF in this solution was measured by the same method as used in Example 1, and the results are shown in Table 2 35.
10,000 1,000 1,000 5,000 2,000 10,000 1,000 1,000 5,000 2,000
Tabelle 2 Table 2
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Stabilizing agent amount (wt.
Teile) Parts)
Aktivität (%) Activity (%)
Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei After storage at after storage at after storage at
4 =C während 4 :C während Raumtemperatur 4 = C during 4: C during room temperature
7 Tagen 2 Monaten während 1 Monat 7 days 2 months for 1 month
Mannitol Mannitol
5,000 5,000
91 91
87 87
82 82
Hyaluronsäure Hyaluronic acid
2,000 ' 2,000 '
93 93
87 87
70 70
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
2,000 2,000
96 96
95 95
85 85
Glycerin Glycerin
10,000 10,000
90 90
90 90
88 88
Neuraminsäure Neuraminic acid
5,000 5,000
93 93
91 91
84 84
Chitin Chitin
2,000 2,000
95 95
92 92
86 86
Dextrin Dextrin
2,00 2.00
90 90
92 92
87 87
menschliches Serum-albumin human serum albumin
1,000 1,000
99 99
95 95
92 92
menschliches Serum-globulin human serum globulin
1,000 1,000
98 98
94 94
90 90
säurebehandeltes Gelatin acid-treated gelatin
2,000 2,000
97 97
96 96
87 87
alkalibehandeltes Gelatin alkali-treated gelatin
500 500
99 99
95 95
92 92
Collagen Collages
2,000 2,000
99 99
94 94
88 88
Polyethylenglycol (Molekulargewicht 40 000) Polyethylene glycol (molecular weight 40,000)
10,000 10,000
94 94
89 89
90 90
Hydroxypropyl-cellulose Hydroxypropyl cellulose
2,000 2,000
98 98
95 95
92 92
Natrium-carboxymethyl-cellulose Sodium carboxymethyl cellulose
2,000 2,000
92 92
91 91
80 80
Hydroxyethyl-cellulose Hydroxyethyl cellulose
4,000 4,000
92 92
94 94
90 90
Polyvinyl-alkohol (Molekulargewicht 50 000) Polyvinyl alcohol (molecular weight 50,000)
4,000 4,000
97 97
93 93
90 90
Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 50 000) Polyvinyl pyrrolidone (molecular weight 50,000)
4,000 4,000
95 95
95 95
92 92
Sorbitan-monolaurat Sorbitan monolaurate
400 400
97 97
96 96
95 95
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Polyoxyethylene sorbitan monolaurate
400 400
100 100
96 96
94 94
Polyoxyethylen-sorbitan-monostearat Polyoxyethylene sorbitan monostearate
400 400
98 98
97 97
94 94
Polyoxyethylen Polyoxyethylene
Polyoxypropylen Polyoxypropylene
400 400
100 100
94 94
93 93
Glycolether Glycol ether
671157 671157
8 8th
Tabelle 2 (Fortsetzung) Table 2 (continued)
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Stabilizing agent amount (wt.
Teile) Parts)
Aktivität (%) Activity (%)
Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei After storage at after storage at after storage at
4 C während 4 C während Raumtemperatur 4 C during 4 C during room temperature
7 Tagen 2 Monaten während 1 Monat 7 days 2 months for 1 month
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Polyoxyethylated hardened castor oil
400 400
99 99
98 98
90 90
Natrium-lauryl-sulfat Sodium lauryl sulfate
2,000 2,000
97 97
93 93
87 87
Lecithin Lecithin
2,000 2,000
97 97
94 94
90 90
menschliches Serum-albumin human serum albumin
2,000 2,000
Mannitol Mannitol
2,000 2,000
100 100
99 99
97 97
Cystein Cysteine
100 100
menschliches Serum-albumin human serum albumin
2,000 2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Polyoxyethylene sorbitan monolaurate
100 100
99 99
97 97
95 95
Mannitol Mannitol
2,000 2,000
menschliches Serum-albumin human serum albumin
1,000 1,000
Hydroxypropyl-cellulose Hydroxypropyl cellulose
500 500
99 99
97 97
95 95
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
2,000 2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monopalmitat Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate
100 100
96 96
96 96
93 93
Sorbitol Sorbitol
2,000 2,000
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Polyoxyethylated hardened castor oil
100 100
95 95
92 92
92 92
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
2,000 - 2,000 -
nichts hinzugegeben nothing added
- -
72 72
61 61
47 47
Beispiel 3 Example 3
Zu 10 |ig G-CSF wurde eines der Stabilisierungsmittel, welche in Tabelle 3 aufgelistet sind, hinzugegeben, und das Gemisch wurde in einer 20 mM Phosphatbufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4) gelöst, um ein pharmazeutisches Präparat herzustellen, enthaltend 10 jag an G-CSF pro ml. Ein Milliliter des Präparates wurde in ein sulfa-behandeltes, Silikon-beschichtetes Glasfläschchen gegeben und bei einer Temperatur von 4 CC gelassen. Die Wirksamkeit von jenem Stabilisierungsmittel bei der Verhinderung der G-CSF Adsorption wurde evaluiert mittels Mes-30 sung der übrigbleibenden Aktivität an G-CSF in der Lösung nach 0,5, 2 und 24 Stunden. Die Messung wurde gemäss Methode (b) ausgeführt unter Verwendung von «reverse-phase» HPLC (high-performance liquid chromatography). Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. To 10 ig G-CSF was added one of the stabilizing agents listed in Table 3, and the mixture was dissolved in a 20 mM phosphate buffer solution (containing 100 mM sodium chloride; pH 7.4) to prepare a pharmaceutical preparation containing 10 hours of G-CSF per ml. One milliliter of the preparation was placed in a sulfa-treated, silicone-coated glass vial and left at a temperature of 4 CC. The effectiveness of that stabilizing agent in preventing G-CSF adsorption was evaluated by measuring the remaining activity of G-CSF in the solution after 0.5, 2 and 24 hours. The measurement was carried out according to method (b) using reverse phase HPLC (high-performance liquid chromatography). The results are shown in Table 3.
Tabelle 3 Table 3
Stabilisierungsmittel Stabilizing agent
Menge (Gew.-Teile) Quantity (parts by weight)
Übrigbleibende Aktivität (%) anfänglich 0,5 h 2 h Remaining activity (%) initially 0.5 h 2 h
24 h 24 hours
Mannitol Mannitol
5,000 5,000
100 100
93 93
90 90
91 91
Hyaluronsäure Hyaluronic acid
2,000 2,000
100 100
97 97
92 92
92 92
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
2,000 2,000
100 100
98 98
95 95
96 96
Glycerin Glycerin
10,000 10,000
100 100
94 94
91 91
90 90
Heparin Heparin
2,000 2,000
100 100
92 92
90 90
90 90
Glucuronsäure Glucuronic acid
5,000 5,000
100 100
96 96
90 90
91 91
Ketoglycolsäure Ketoglycolic acid
5,000 5,000
100 100
92 92
88 88
90 90
menschliches Serum-albumin human serum albumin
1,000 1,000
100 100
100 100
101 101
99 99
menschliches Serum-globulin human serum globulin
1,000 1,000
100 100
98 98
100 100
98 98
alkali-behandeltes Gelatin alkali-treated gelatin
500 500
100 100
99 99
98 98
99 99
säurebehandeltes Gelatin acid-treated gelatin
2,000 2,000
100 100
99 99
97 97
97 97
Collagen Collages
2,000 2,000
100 100
100 100
98 98
99 99
Polyethylenglycol (Molekulargewicht 4 000) Polyethylene glycol (molecular weight 4,000)
10,000 10,000
100 100
100 100
100 100
99 99
Hydroxypropyl-cellulose Hydroxypropyl cellulose
2,000 2,000
100 100
100 100
100 100
99 99
Natriumcarboxymethyl-cellulose Sodium carboxymethyl cellulose
2,000 2,000
100 100
98 98
96 96
95 95
Hydroxyethyl-cellulose Hydroxyethyl cellulose
4,000 4,000
100 100
96 96
93 93
92 92
Polyvinylalkohol (Molekulargewicht 50 000) Polyvinyl alcohol (molecular weight 50,000)
4,000 4,000
100 100
99 99
100 100
98 98
Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht Polyvinyl pyrrolidone (molecular weight
50 000) 50,000)
4,000 4,000
100 100
98 98
98 98
96 96
Sorbitan-monocaprylat Sorbitan monocaprylate
400 400
100 100
100 100
100 100
98 98
Polyoxyethylen-sorbitan-monstearat Polyoxyethylene sorbitan monstearate
400 400
100 100
100 100
98 98
100 100
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Polyoxyethylated hardened castor oil
400 400
100 100
99 99
101 101
99 99
Natriumlaurylsulfat Sodium lauryl sulfate
2,000 2,000
100 100
100 100
99 99
97 97
Lecithin Lecithin
2,000 2,000
100 100
99 99
100 100
98 98
menschliches Serum-albumin human serum albumin
2,000 2,000
Mannitol Mannitol
2,000 2,000
100 100
100 100
100 100
101 101
Cystein Cysteine
100 100
Tabelle 3 (Fortsetzung) Table 3 (continued)
Stabilisierungsmittel Stabilizing agent
Menge (Gew.- Quantity (wt.
Übrigbleibende Aktivität (%) Remaining activity (%)
Teile) Parts)
anfänglich initially
0,5 h 0.5 h
2h 2h
24 h menschliches Serum-albumin 24 h human serum albumin
2,000 2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Polyoxyethylene sorbitan monolaurate
100 100
100 100
100 100
98 98
99 99
Mannitol Mannitol
2,000 2,000
menschliches Serum-albumin human serum albumin
1,000 1,000
Hydroxypropyl-cellulose Hydroxypropyl cellulose
500 500
100 100
101 101
99 99
100 100
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
2,000 2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Polyoxyethylene sorbitan monolaurate
100 100
100 100
100 100
99 99
99 99
Sorbitol Sorbitol
2,000 2,000
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Polyoxyethylated hardened castor oil
100 100
100 100
100 100
98 98
97 97
Dextran (Molekulargewicht 40 000) Dextran (molecular weight 40,000)
2,000 2,000
nichts hinzugegeben nothing added
- -
100 100
91 91
72 72
73 73
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
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