CH670655A5

CH670655A5 -

Info

Publication number: CH670655A5
Application number: CH316/87A
Authority: CH
Inventors: Pavel Viktorovich Melnikov; Taras Petrovich Pasternak; Jury Jurievich Gleba; Konstantin Merkurievich Sytnik
Original assignee: Inst Botan Im N G Kholodnogo A
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1989-06-30
Also published as: GB2200367A; DE3738874C2; GB2200367B; GB8702006D0; DE3738874A1

Description

BESCHREIBUNG DESCRIPTION

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten, das zur Herstellung neuer Arten (Formen) von Pflanzen, darunter auch von landwirtschaftlichen Pflanzen Verwendung findet, die durch bestimmte Eigenschaften gekennzeichnet werden, wie spezifische Beständigkeit gegen Herbizide, spezifische Beständigkeit gegen pathogene Viren und Mikroorganismen, die veränderte Aminosäurezusammensetzung, die Erhöhung der nützlichen Biomasse, eine erhöhte Beständigkeit gegen ungünstige Umgebungsfaktoren und ähnliches. The present invention relates to a method for producing genetically transformed plant objects, which is used for the production of new types (forms) of plants, including agricultural plants, which are characterized by certain properties, such as specific resistance to herbicides, specific resistance to pathogenic viruses and microorganisms, the changed amino acid composition, the increase in the useful biomass, an increased resistance to adverse environmental factors and the like.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, die gestatten, Proto-plaste von höheren Pflanzen mit darauffolgender Herstellung daraus durch Selektion von Zellenlinien und Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften zu transformieren. So ist beispielsweise ein Verfahren bekannt, das darin besteht, dass zur Suspension der Protoplasten Nicotiana tabacum DNS zugegeben wird, das erhaltene Gemisch nachher durch physikalische und chemische Faktoren beeinflusst wird, was zum Durchdringen von DNS in Proto-plaste führt (Potiykus J., Shillito R.D., Saul M.W., Paszkowski J. Direct Gene Transfer. State of the Art and Future Potential. Plant Mol. Biol. Reporter, v. 3, No. 3, 1985, p. 117-128). Various methods are known which make it possible to transform protoplasts of higher plants with subsequent production therefrom by selecting cell lines and plants with new inheritable properties. For example, a method is known which consists in adding Nicotiana tabacum DNA to the suspension of the protoplasts, the mixture obtained subsequently being influenced by physical and chemical factors, which leads to the penetration of DNA into protoplasts (Potiykus J., Shillito RD, Saul MW, Paszkowski J. Direct Gene Transfer. State of the Art and Future Potential. Plant Mol. Biol. Reporter, v. 3, No. 3, 1985, p. 117-128).

Es ist auch ein Verfahren bekannt, in welchem zu Protoplasten Nicotiana tabacum genetisches Material zugegeben wird, das in Lipidbläschen (Liposome) in Gegenwart eines Agglutinators eingeschlossen ist, was zum Zusammenfluss von Protoplasten und Liposomen unter Durchdringen des genetischen Materials in den Protoplast führt (Nagata T. Liposomes as a Carrier of Ti-plasmid into Protoplasts. In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction. Ed. Pühler, Springer-Verlag, Berlin e.a. 1983, 268-273). A method is also known in which genetic material is added to protoplasts Nicotiana tabacum, which is enclosed in lipid vesicles (liposomes) in the presence of an agglutinator, which leads to the confluence of protoplasts and liposomes with penetration of the genetic material into the protoplast (Nagata T. Liposomes as a Carrier of Ti-plasmid into Protoplasts. In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction. Ed. Pühler, Springer-Verlag, Berlin ea 1983, 268-273).

Die genannten Verfahren werden durch deren begrenzte Anwendungsmöglichkeiten gekennzeichnet, weil diese zu einer begrenzten Anzahl der Pflanzenarten angewendet werden können, und zwar nur zu den Pflanzen und Zellenkulturen, für welche die Methoden zur Herstellung und Kultivierung der Protopla-ste mit darauffolgender Regeneration von Pflanzen daraus entwik-kelt worden sind. Ausserdem werden die genannten Verfahren durch eine niedrige Transformationseffektivität (höchstens ein Prozent) und einen bedeutenden Verbrauch an transformierendem Faktor gekennzeichnet. The methods mentioned are characterized by their limited application possibilities, because they can be used for a limited number of plant species, and only for the plants and cell cultures for which the methods for producing and cultivating the protoplast with subsequent regeneration of plants develop therefrom -celt. In addition, the methods mentioned are characterized by a low transformation effectiveness (at most one percent) and a significant consumption of transforming factor.

Es ist ein Verfahren zur Herstellung der genetisch transformierten Pflanzenobjekte bekannt, bei dem als Empfänger Proto-plaste von Nicotiana tabacum verwendet werden. In Protoplaste wird durch die Mikroinjektion die Plasmide pCGN 561 eingeführt (Crossway A. et al., Integration of foreign DNA following microinjection of tabacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. A method for producing the genetically transformed plant objects is known, in which proto-plastics from Nicotiana tabacum are used as the recipient. The plasmids pCGN 561 are introduced into protoplasts by microinjection (Crossway A. et al., Integration of foreign DNA following microinjection of tabacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen.

Genet., 1986, v. 202, p. 179-185). Genet., 1986, v. 202, p. 179-185).

Im erwähnten Verfahren wurden weder Zellenlinien noch Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften erhalten, es wurde auch die Expression des eingeführten genetischen Materials nicht gezeigt. Das genannte Verfahren kann ausschliesslich zu Protoplasten angewendet werden, wurde nur im Labormassstab verwirklicht und kann keine praktische Verwendung finden. Neither cell lines nor plants with new heritable properties were obtained in the mentioned method, nor was the expression of the introduced genetic material shown. The method mentioned can only be used for protoplasts, was only implemented on a laboratory scale and cannot be used in practice.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Erweiterung des Kreises von Objekt-Rezipienten und transformierenden Faktoren ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, die Transformationseffektivität zu erhöhen, den Verbrauch des transformierenden Faktors herabzusetzen und die Anzahl der Pflanzenarten zu vergrössera, die den genetischen Manipulationen mit höheren Pflanzen ausgesetzt werden können. The invention has for its object to develop a method by expanding the circle of object recipients and transforming factors, which makes it possible to increase the transformation effectiveness, reduce the consumption of the transforming factor and to increase the number of plant species, the genetic manipulations can be exposed to higher plants.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass im erfindungsgemäs-sen Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten durch Einführung des transformierenden Faktors in den Empfanger und darauffolgende Selektion daraus von Zellenlinien und Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften erfmdungsgemäss als transformierender Faktor ein DNS-Molekül oder eine sich autonom replizierende Zellenorganelle und als Objekt-Empfanger der Protoplast, die Einzelzelle oder eine Zelle im Zellverband verwendet werden, wobei die Einführung des transformierenden Faktors in den Objekt-Empfänger durch Mikroinjektion erfolgt. Die Mikroinjektionen können nach beliebigen geeigneten Methoden durchgeführt werden. Es ist zweckmässig, die Mikroinjektionen unter Einwirkung vom Druck oder vom elektrischen Feld durchzuführen. The object was achieved in that, in the method according to the invention for producing genetically transformed plant objects, by introducing the transforming factor into the recipient and subsequently selecting cell lines and plants with new heritable properties from them, according to the invention, a DNA molecule or an autonomously transforming factor Replicating cell organelles and the protoplast, the single cell or a cell in the cell assembly can be used as the object receiver, the transformation factor being introduced into the object receiver by microinjection. The microinjections can be carried out by any suitable method. It is expedient to carry out the microinjections under the influence of the pressure or the electric field.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, die Transformationseffektivität auf 40% zu erhöhen, was die Transformationseffektivität von bekannten Verfahren um das 10- bis 20fache übersteigt, dabei wird der Verbrauch am transformierenden Faktor bedeutend geringer. The method according to the invention allows the transformation effectiveness to be increased to 40%, which exceeds the transformation effectiveness of known methods by 10 to 20 times, the consumption of the transforming factor being significantly lower.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, als Objekt-Empfanger sowohl den Protoplast als auch die Einzelzelle und eine Zelle im Zellverband oder in der Pflanze, und als transformierenden Faktor sowohl die DNS-Moleküle als auch die sich autonom replizierenden Zellenorganellen auszunutzen. Das gestattet, die Anzahl der Pflanzenarten zu erweitern, die in genetische Manipulationen eingezogen werden, einschliesslich landwirtschaftlich wichtige Kulturen, beispielsweise Gräserkulturen. The method according to the invention allows the protoplast as well as the single cell and a cell in the cell cluster or in the plant to be used as the object receiver, and both the DNA molecules and the autonomously replicating cell organelles as the transforming factor. This allows to expand the number of plant species that are fed into genetic manipulations, including agriculturally important crops, for example grass crops.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird wie folgt durchgeführt. The method according to the invention is carried out as follows.

Der Protoplast, die Einzelzelle oder eine Zelle im Zellverband oder in der Pflanze (Mikrokallus, embiyogener Kallus, The protoplast, the single cell or a cell in the cell cluster or in the plant (micro callus, embiyogenic callus,

Embiyoid), die als Objekt-Empfänger verwendet werden, werden in der entsprechenden Nährlösung in einer Mikrokammer untergebracht, die auf dem Objektträger des Mikroskops montiert wurde, und mit Hilfe einer Einrichtung zum Festsaugen oder durch das Begiessen mit Agar oder mechanisch fixiert. Die mit dem transformierenden Faktor (Plasmide, Kosmide, Chloroplast) im entsprechenden Medium gefüllte Glasnadel wird mit Hilfe eines Mikromanipulators in den Objekt-Empfanger unter visueller Kontrolle durch das Mikroskop eingeführt. Die Mikroinjektion wird unter Einwirkung des pneumatischen oder hydraulischen Drucks oder unter Einwirkung des elektrischen Feldes verwirklicht. Das Volumen der einzuführenden Lösung wird von 1 bis 10 pl (Pikoliter) dosiert. Die ganze Arbeit wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die injizierten Objekt-Empfanger werden auf das selektive Nährmedium übertragen. Die Auswahl des selektiven Nährmediums wird durch den transformierenden Faktor bestimmt. Die Auswahl des Transformanten und die Anreicherung deren Biomasse wird beim mehrmaligen passieren der Objekt-Empfanger auf selektiven Medien durchgeführt. Aus den transformierten Zellenlinien und Zellenkulturen werden auf den selektiven Medien Pflanzen regeneriert. Die Transformationseffektivität beträgt höchstens 40%. Die Erschliessung und die Expression des eingeführten genetischen Materials wird nach Embiyoid), which are used as object receivers, are accommodated in the corresponding nutrient solution in a micro-chamber, which has been mounted on the microscope slide, and fixed with the aid of a device for suctioning or by pouring agar or mechanically. The glass needle filled with the transforming factor (plasmids, cosmids, chloroplast) in the appropriate medium is inserted into the object receiver with the aid of a micromanipulator under visual control through the microscope. Microinjection is carried out under the influence of pneumatic or hydraulic pressure or under the influence of the electric field. The volume of the solution to be introduced is dosed from 1 to 10 pl (picoliter). All of the work is done under sterile conditions. The injected object receivers are transferred to the selective nutrient medium. The selection of the selective nutrient medium is determined by the transforming factor. The selection of the transformant and the enrichment of its biomass is carried out on multiple passes through the object receiver on selective media. Plants are regenerated from the transformed cell lines and cell cultures on the selective media. The transformation effectiveness is at most 40%. The indexing and expression of the imported genetic material becomes after

2 2nd

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3rd

670 655 670 655

bekannten biochemischen Methoden bestätigt. known biochemical methods confirmed.

Zum besseren Verständnis der vorliegendën Erfindung werden folgende Beispiele zur Verwirklichung des erfindungsgemäs-sen Verfahrens angeführt. In order to better understand the present invention, the following examples are given for realizing the method according to the invention.

Beispiel 1 example 1

In den aus dem Kallus Nicotiana debneyi isolierten Protoplast fuhrt man eine Mikronadel mit einem Durchmesser der Spitze von etwa 1 um ein und presst mit dem hydraulischen System 1 bis 2 pl (Pikoliter) Pufferlösung (10 mMol Iis, der pH-Wert 7,2, 1 mMol Natriumäthylendiamintetraazetat, 5 mMol KCl) aus, die die Plasmide pSV2 Neo in einer Menge von ungefähr 100 Kopien pro 1 Pikoliter Puffer enthält. Bei der Mikroinjektion und bis zu den ersten Zellteilungen befindet sich der Protoplast im Caboche-Nährmedium unter Zugabe von 0,1 Gew.-% Agarose. Die aus den injizierten Protoplasten gebildeten Mikrokolonien werden auf das Gamborg-Nährmedium unter Zugabe von 60 mg/dm3 Antibiotikum Kanamyzinsulfat übertragen. Von 53 injizierten Protoplasten wurden 8 Zellenlinien erhalten, die zum Wachstum auf einem Medium fähig sind, das bis 120 mg/dm3 Antibiotikum enthält. Die Transformationseffektivität beträgt 15%. Aus drei beständigen Linien wurden auf dem Gamborg-Nährmedium ohne Zugabe von Phytohormonen Pflanzen regeneriert, die zum Wachstum und zur Verfestigung auf dem Medium mit Kanamyzin fähig sind. A microneedle with a tip diameter of about 1 .mu.m is inserted into the protoplast isolated from the Nicotiana debneyi callus, and 1 to 2 μl (picoliter) of buffer solution (10 mmol of Iis, pH 7.2) are pressed using the hydraulic system. 1 mmol sodium ethylenediaminetetraacetate, 5 mmol KCl), which contains the plasmids pSV2 Neo in an amount of approximately 100 copies per 1 picoliter buffer. During the microinjection and until the first cell divisions, the protoplast is in the Caboche nutrient medium with the addition of 0.1% by weight agarose. The microcolonies formed from the injected protoplasts are transferred to the Gamborg nutrient medium with the addition of 60 mg / dm3 antibiotic kanamycin sulfate. From 53 injected protoplasts, 8 cell lines were obtained which are capable of growing on a medium containing up to 120 mg / dm3 antibiotic. The transformation effectiveness is 15%. From three stable lines, plants capable of growth and consolidation on the medium with kanamycin were regenerated on the Gamborg nutrient medium without the addition of phytohormones.

Beispiel 2 Example 2

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipienten werden die Einzelzellen von Nicotiana tabacum und als transformierender Faktor die Plasmide pLGV23 Neo ausgenutzt. Die Mikroinjektion wird mit Hilfe des pneumatischen Systems verwirklicht. Von 20 injizierten Zellen wurden nach der Selektionsmethode 3 Zellenlinien ausgewählt, die zum Wachstum auf dem Gamborg-Nährmedium fähig sind, das 120 mg/dm3 Antibiotikum Kanamyzinsulfat enthält. The procedure is carried out similarly to Example 1. The individual cells of Nicotiana tabacum are used as object recipients and the plasmids pLGV23 Neo as the transforming factor. The microinjection is carried out with the help of the pneumatic system. From 20 injected cells, 3 cell lines were selected according to the selection method which are capable of growing on the Gamborg nutrient medium containing 120 mg / dm3 antibiotic kanamycin sulfate.

Beispiel 3 Example 3

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipienten werden die Zellen im Mikrokallus (von 8 bis 30 Zellen) Lycopersicon esculentum im Sachin-Nährmedium unter Zugabe von 0,3 Gew.-% Agarose ausgenutzt. Als transformierender Faktor wird die Plasmide pGV0319 ausgenutzt. Entsprechend den mit der Plasmide kodierten Eigenschaften wird die Selektion der Transformanten auf dem Sachin-Nährmedium durchgeführt, das keine Hormone enthält. Bei der Einfuhrung der Plasmide in 95 Zellen wurden nach der Selektionsmethode 19 Zellenlinien ausgewählt, die zum Wachstum auf einem hormonlosen Medium fähig sind. Die Transformationseffektivität beträgt 19%. The procedure is carried out similarly to Example 1. The cells in the microcallus (from 8 to 30 cells) Lycopersicon esculentum in the Sachin nutrient medium with the addition of 0.3% by weight of agarose are used as object recipients. The plasmid pGV0319 is used as a transforming factor. According to the properties coded with the plasmid, the selection of the transformants is carried out on the Sachin nutrient medium which does not contain any hormones. When the plasmids were introduced into 95 cells, 19 cell lines were selected according to the selection method which are capable of growing on a hormone-free medium. The transformation effectiveness is 19%.

Beispiel 4 Example 4

5 Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipienten werden die Einzelzellen von Nicotiana tabacum und als transformierender Faktor die Kosmide pGA 471 ausgenutzt, dabei wird die Injektion unter Einwirkung der elektrischen Feldstärke von 5 bis 10 V mit einigen Impulsen von 0,5 Dauer bei einem Stromwert bis 0,1 jiA verwirklicht. Von 23 auf solche Weise transformierten Zellen wurden 6 Zellenlinien erhalten, die zum Wachstum auf dem Nährmedium fähig sind, das 120 mg/dm3 Kanamyzinsulfat enthält. Die Transformationseffektivität beträgt etwa 25%. Aus 2 Zellenlinien wurden Pflanzen regeneriert, die zum Wachstum und zur Verfestigung auf dem Medium mit Kanamyzin fähig sind. 5 The procedure is carried out similarly to Example 1. The individual cells of Nicotiana tabacum are used as object recipients and the cosmid pGA 471 as the transforming factor. The injection is effected under the influence of the electric field strength of 5 to 10 V with a few pulses of 0.5 duration at a current value of up to 0.1 jiA realized. From 23 cells transformed in this way, 6 cell lines were obtained which are capable of growing on the nutrient medium containing 120 mg / dm3 kanamycin sulfate. The transformation effectiveness is about 25%. Plants were regenerated from 2 cell lines, which are capable of growth and solidification on the medium with kanamycin.

Beispiel 5 Example 5

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 4 durchgeführt. Als Objekt-Rezipient werden die Zellen des embiyogenen Kallus vom Weizen Triticum aestivum der Sorte Mironovskaya rannyaya verwendet, die mechanisch fixiert werden. Es werden 8 Kallusse ausgenutzt und in jeden werden von 20 bis 100 Zellen injiziert. Die Kallusse werden auf dem Nährmedium von Murashige-Skoog mit 2 mg/dm2 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure unter Zugabe von 60 mg/dm3 Kanamyzinsulfat passiert. Es wurden 8 Zellenlinien erhalten, die zum Wachstum auf dem Nährmedium mit Kanamyzinsulfat fähig sind. The procedure is carried out similarly to Example 4. The cells of the embiyogenic callus from the Triticum aestivum wheat of the Mironovskaya rannyaya variety are used as the object recipient, which are mechanically fixed. Eight calluses are used and from 20 to 100 cells are injected into each. The calluses are passed through on the culture medium of Murashige-Skoog with 2 mg / dm2 2,4-dichlorophenoxyacetic acid with the addition of 60 mg / dm3 kanamycin sulfate. Eight cell lines were obtained which are capable of growing on the culture medium with kanamycin sulfate.

Beispiel 6 Example 6

Das Verfahren wird ähnlich mit dem Beispiel 1 durchgeführt. Als Objekt-Rezipient werden einzelne weisse Zellen der Plasto-menmutante von Nicotiana tabacum der Linie IP und als die sich autonom replizierenden Organellen Chloroplaste ausgenutzt, die aus den Blättern von Nicotiana tabacum der Linie SR2 isoliert wurden, welche durch die Beständigkeit gegen das mit Chloropla-sten kodierte Antibiotikum Streptomyzin gekennzeichnet wird. Mit der Chloroplastensuspension im Nährmedium von Jensen und Basshem füllt man eine Mikropipette mit dem Durchmesser der Spitze bis 8 um und presst daraus 5 bis 10 Chloroplaste in die Zelle aus. Die injizierten Zellen nach den ersten Teilstrichen werden auf das Gamborg-Nährmedium übertragen, das 1 mg/dm3 Streptomyzinsulfat enthält. Von 16 auf solche Weise injizierten Zellen wurden 3 Zellenlinien ausgewählt, die durch die grüne Farbe und die Fähigkeit zum Wachstum auf einem Nährmedium mit 1 mg/dm3 Antibiotikum gekennzeichnet werden. The procedure is carried out similarly to Example 1. Individual white cells of the Nicotiana tabacum plastom-mutant of the IP line and as the autonomously replicating organelles chloroplasts, which were isolated from the leaves of Nicotiana tabacum of the SR2 line, were used as the object recipient. most encoded antibiotic streptomycin is labeled. The chloroplast suspension in the nutrient medium from Jensen and Basshem is used to fill a micropipette with a tip diameter of up to 8 µm and to press 5 to 10 chloroplasts into the cell. The injected cells after the first tick marks are transferred to the Gamborg culture medium, which contains 1 mg / dm3 streptomycin sulfate. From 16 cells injected in this way, 3 cell lines were selected, which are characterized by the green color and the ability to grow on a nutrient medium with 1 mg / dm3 antibiotic.

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

Claims

670 655 PATENTANSPRÜCHE670 655 PATENT CLAIMS

1. Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzenobjekten durch Einführung eines transformierenden Faktors in den Objekt-Empfänger und darauffolgende Selektion der Zellinien und Pflanzen mit neuen vererblichen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, dass als transformierender Faktor ein DNS-Molekül oder eine sich autonom replizierende Zellorganelle und als Objekt-Empfänger ein Protoplast, eine Einzelzelle oder ein Zelle im Zellverband verwendet werden, wobei die Einführung des transformierenden Faktors in den Objekt-Empfanger durch Mikroinjektion durchgeführt wird. 1. A process for the production of genetically transformed plant objects by introducing a transforming factor into the object receiver and then selecting the cell lines and plants with new heritable properties, characterized in that a DNA molecule or an autonomously replicating cell organelle and as a transforming factor Object recipient, a protoplast, a single cell or a cell in the cell cluster can be used, the introduction of the transforming factor into the object recipient being carried out by microinjection.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroinjektion unter Einwirkung von Druck oder Einwirkung eines elektrischen Feldes durchgeführt wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that the microinjection is carried out under the action of pressure or an electric field.

3. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 erhaltenen Pflanzenobjekte zur Herstellung von Pflanzen durch Regeneration auf selektiven Medien. 3. Use of the plant objects obtained by the process according to claim 1 for the production of plants by regeneration on selective media.