CH653363A5

CH653363A5 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF BIOCATALYSTS WITH ENZYMATIC ACTIVITY AND PRODUCTS OBTAINED.

Info

Publication number: CH653363A5
Application number: CH7375/81A
Authority: CH
Inventors: Jean-Louis Leuba; Albert Renken; Erwin Flaschel
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 1981-11-17
Filing date: 1981-11-17
Publication date: 1985-12-31
Also published as: ES517408A0; ZA827728B; JPS6216637B2; JPS5889185A; EP0079595A1; AU8979382A; US4918016A; ES8401776A1; AU551149B2; DE3263162D1; IE822729L; IE53983B1; NZ202314A; EP0079595B1

Description

La présente invention a trait à un procédé de préparation de biocatalyseurs doués d'activité enzymatique insolubles en milieux aqueux et convenant particulièrement à l'utilisation en lit fluidisé ou en lit fixe. The present invention relates to a process for the preparation of biocatalysts endowed with enzymatic activity which are insoluble in aqueous media and which are particularly suitable for use in a fluidized bed or in a fixed bed.

La mise en œuvre industrielle de réactions enzymatiques a fait apparaître des biocatalyseurs insolubles en milieux aqueux. En effet, les enzymes sont trop coûteux pour être désactivés après une seule utilisation, ce qui a conduit à les fixer sur un support inerte ou à les immobiliser de manière à pouvoir les séparer physiquement de la substance à traiter ou substrat. The industrial implementation of enzymatic reactions has revealed insoluble biocatalysts in aqueous media. Indeed, the enzymes are too expensive to be deactivated after a single use, which has led to fix them on an inert support or to immobilize them so as to be able to physically separate them from the substance to be treated or substrate.

On a proposé plusieurs méthodes de fixation d'enzymes sur des supports: Several methods of attaching enzymes to supports have been proposed:

— L'enzyme est adsorbé directement sur un matériau minéral tel que la céramique, le verre, la silice, etc. Les produits obtenus ont l'inconvénient d'être peu stables, l'enzyme n'étant que faiblement lié au support. - The enzyme is adsorbed directly on a mineral material such as ceramic, glass, silica, etc. The products obtained have the disadvantage of being not very stable, the enzyme being only weakly bound to the support.

— L'enzyme est lié chimiquement à un support organique tel qu'un polymère synthétique (par exemple une aminoéthylcellulose selon le brevet britannique Np 1357317) ou naturel (par exemple le chitosane selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 4094743) par l'intermédiaire d'un réactif bifonctionnel tel qu'un dialdéhyde ou monofonctionnel comme un carbodiimide. Les enzymes immobilisés sur un support synthétique sont coûteux et n'ont pas la qualité alimentaire requise. D'autre part, les supports organiques ne sont pas bien adaptés aux procédés industriels, car ils sont compressibles et d'un poids spécifique relativement faible et de ce fait leur utilisation dans des réacteurs à lit fluidisé ou à lit fixe à des débits élevés est difficile sinon impossible. - The enzyme is chemically linked to an organic support such as a synthetic polymer (for example an aminoethylcellulose according to the British patent Np 1357317) or natural (for example chitosan according to the patent of the United States of America N ° 4094743) via a bifunctional reagent such as a dialdehyde or a monofunctional reagent such as a carbodiimide. The enzymes immobilized on a synthetic support are expensive and do not have the required food quality. On the other hand, organic supports are not well suited to industrial processes, since they are compressible and of a relatively low specific weight and therefore their use in fluidized bed or fixed bed reactors at high flow rates is difficult if not impossible.

En outre, il est nécessaire d'assurer un bon contact entre l'enzyme et la substance à convertir ou substrat. Cela implique que l'enzyme soit immobilisé de préférence 4 sur la surface extérieure et pas dans les pores ou dans la matrice du support inerte. In addition, it is necessary to ensure good contact between the enzyme and the substance to be converted or substrate. This implies that the enzyme is preferably immobilized 4 on the outer surface and not in the pores or in the matrix of the inert support.

Les difficultés et limites de l'application mentionnées sont plus sévères si le milieu réactionnel est visqueux et s'il contient des substances ou impuretés colloïdales ou solides. De telles difficultés sont rencontrées couramment dans le domaine de l'industrie alimentaire. The difficulties and limits of the application mentioned are more severe if the reaction medium is viscous and if it contains colloidal or solid substances or impurities. Such difficulties are commonly encountered in the food industry.

Nous avons trouvé une méthode d'immobilisation d'enzyme avantageuse, compatible avec une application dans l'industrie alimentaire et qui ne présente pas les inconvénients précités. We have found an advantageous enzyme immobilization method, compatible with an application in the food industry and which does not have the aforementioned drawbacks.

Le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait qu'on enrobe des particules d'une matière minérale rigide et dense avec une couche de chitosane, qu'on stabilise les particules enrobées par un réactif bifonctionnel et qu'on fixe un enzyme sur le support ainsi traité. The method according to the invention is characterized by the fact that particles of a rigid and dense mineral material are coated with a layer of chitosan, that the particles coated with a bifunctional reagent are stabilized and that an enzyme is fixed on the support thus treated.

Le noyau minéral utilisé est choisi parmi les substances minérales inertes chimiquement rigides et de préférence poreuses en surface. On peut citer par exemple les particules microporeuses de gel de silice, d'oxydes métalliques tels que Ti02, Zr02 de céramique, etc. Les particules ont généralement 0,05 à 5 mm de diamètre, et de préférence 0,1 à 0,25 mm. The mineral core used is chosen from chemically rigid inert mineral substances, preferably porous on the surface. Mention may be made, for example, of microporous particles of silica gel, of metal oxides such as Ti02, Zr02 of ceramic, etc. The particles are generally 0.05 to 5 mm in diameter, and preferably 0.1 to 0.25 mm.

Pour l'enrobage du noyau, on utilise du chitosane qui est un polymère naturel obtenu par déacétylation de la chitine en milieu fortement basique et à température élevée. Il est insoluble dans l'eau, sauf en présence d'un acide autre que l'acide sulfurique. For coating the core, chitosan is used which is a natural polymer obtained by deacetylation of chitin in a highly basic medium and at high temperature. It is insoluble in water, except in the presence of an acid other than sulfuric acid.

La chitine est le composant organique principal de l'enveloppe protectrice des invertébrés (carapace de crustacés ou cuticule d'insectes) que l'on trouve aussi dans la paroi squelettique de certaines formes inférieures végétales (champignons par exemple). C'est un polymère linéaire de la N-acétyl-D-glucosamine, de haut poids moléculaire (200 000 environ), qui se caractérise par des liaisons du type ß (1 —►4). Le groupe N-acétyl étant difficile à éliminer, la déacétylation n'est jamais complète et varie généralement de 50 à 85% dans les produits commerciaux. Ce sont ces produits que l'on désigne sous le nom de chitosane. Chitin is the main organic component of the protective envelope of invertebrates (shell of shellfish or cuticle of insects) which is also found in the skeletal wall of certain lower plant forms (mushrooms for example). It is a linear polymer of N-acetyl-D-glucosamine, of high molecular weight (approximately 200,000), which is characterized by bonds of the ß (1 —►4) type. Since the N-acetyl group is difficult to remove, deacetylation is never complete and generally varies from 50 to 85% in commercial products. These are the products that are designated by the name of chitosan.

On procède généralement de la manière suivante: We generally proceed as follows:

Pour charger la surface des particules minérales avec du chitosane, on prépare une solution aqueuse de chitosane dans un acide, par exemple l'acide acétique concentré (10 à 80% en poids et de préférence 30 à 60%), à raison de 1 à 30 g de chitosane/1, et de préférence 4 à 10 g/1. On ajoute à la solution les particules minérales sous agitation jusqu'à l'obtention d'une concentration de 10 à 500 g de matière solide par litre. On dégaze le mélange sous vide, laisse la suspension au repos quelques heures et, après décantation, on récupère les particules enrobées par filtration. Celles-ci sont lavées à l'eau et séchées sous vide. Le support ainsi obtenu a pratiquement la masse volumique du support minéral, par exemple de 0,33 g/ml pour le gel de silice, c'est-à-dire plus élevée que celle du chitosane (0,24 g/ml). Il a par rapport au chitosane seul des avantages décisifs du point de vue de l'utilisation industrielle. En effet: To charge the surface of the mineral particles with chitosan, an aqueous solution of chitosan in an acid is prepared, for example concentrated acetic acid (10 to 80% by weight and preferably 30 to 60%), in a proportion of 1 to 30 g of chitosan / 1, and preferably 4 to 10 g / 1. The mineral particles are added to the solution with stirring until a concentration of 10 to 500 g of solid material is obtained per liter. The mixture is degassed under vacuum, the suspension is left to stand for a few hours and, after decantation, the coated particles are recovered by filtration. These are washed with water and dried under vacuum. The support thus obtained has practically the density of the mineral support, for example 0.33 g / ml for silica gel, that is to say higher than that of chitosan (0.24 g / ml). Compared to chitosan alone, it has decisive advantages from the point of view of industrial use. Indeed:

— Il est généralement aussi actif en unités enzymatiques par gramme de poids sec que le chitosane seul. Cela s'explique par le fait que les sites actifs du chitosane sont mieux utilisés puisqu'ils sont répartis sur la surface des particules. - It is generally as active in enzymatic units per gram of dry weight as chitosan alone. This is explained by the fact that the active sites of chitosan are better used since they are distributed over the surface of the particles.

— Du fait de sa masse volumique plus élevée, il occupe dans une colonne un volume plus faible que le chitosane pour un poids ou une activité équivalents. - Due to its higher density, it occupies in a column a lower volume than chitosan for an equivalent weight or activity.

— Le noyau minéral rend le catalyseur beaucoup plus dur et rigide, donc moins compressible que le chitosane. - The mineral core makes the catalyst much harder and rigid, therefore less compressible than chitosan.

— Le catalyseur est adapté à une utilisation en lit fluidisé qui est compatible avec une utilisation industrielle. Lors de la fluidisation, le substrat peut être transformé en utilisant des débits élevés. Le trai5 - The catalyst is suitable for use in a fluidized bed which is compatible with industrial use. During fluidization, the substrate can be transformed using high flow rates. Trai5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3

653 363 653,363

tement des fluides biologiques (par exemple lait, sérum lactique, etc.) ou des fluides contenant des colloïdes en suspension pose beaucoup moins de problèmes de colmatage qu'en lit fixe. Des essais de fluidi-sation sur chitosane ont été réalisés mais n'ont pas donné satisfaction. Il se forme des agrégats et du «channelling». L'utilisation du chitosane en lit fixe pose aussi quelques problèmes; lorsque le débit augmente, le chitosane, de par sa faible densité, a tendance à se soulever et à se tasser à la sortie de la colonne. La pression interne augmente et le processus s'amplifie avec diminution rapide du débit et colmatage de la colonne. Un autre avantage de la fluidisation est que les particules de catalyseur sont en agitation permanente dans le substrat. De ce fait, les problèmes de diffusion sont limités et l'activité enzymatique est maximale. biological fluids (for example milk, lactic serum, etc.) or fluids containing colloids in suspension pose much less clogging problems than in a fixed bed. Fluidization tests on chitosan have been carried out but have not been satisfactory. Aggregates and "channeling" are formed. The use of chitosan in a fixed bed also poses some problems; when the flow rate increases, the chitosan, due to its low density, tends to rise and to settle at the outlet of the column. The internal pressure increases and the process is amplified with rapid reduction in flow and clogging of the column. Another advantage of fluidization is that the catalyst particles are in permanent agitation in the substrate. As a result, diffusion problems are limited and the enzymatic activity is maximum.

— Les manipulations sont beaucoup plus aisées qu'avec le chitosane. - The manipulations are much easier than with chitosan.

Les particules enrobées de chitosane sont traitées avec un réactif bifonctionnel de préférence choisi parmi les dialdéhydes linéaires. Ce peut être par exemple le malonaldéhyde, le succinaldéhyde, le glutaraldéhyde, l'adipaldéhyde. On préfère utiliser le glutaraldéhyde qui présente l'avantage d'être un produit commercial bon marché. Cette opération a pour but d'activer le chitosane et/ou de former un réseau de polymère autour de la couche de chitosane de manière à la fixer au noyau minéral et éviter le pelage de celle-ci. The particles coated with chitosan are treated with a bifunctional reagent preferably chosen from linear dialdehydes. It can be, for example, malonaldehyde, succinaldehyde, glutaraldehyde, adipaldehyde. It is preferred to use glutaraldehyde which has the advantage of being an inexpensive commercial product. The purpose of this operation is to activate the chitosan and / or to form a polymer network around the chitosan layer so as to fix it to the mineral core and prevent it from peeling.

Selon une première forme spéciale d'exécution du procédé, utilisable lorsque l'enzyme n'est pas sensible au glutaraldéhyde, c'est-à-dire lorsqu'il ne perd pas ses propriétés catalytiques en présence de glutaraldéhyde, le support est mis en présence d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde de concentration allant jusqu'à 25% en poids. Comme enzymes insensibles au glutaraldéhyde, on peut citer ceux qui n'ont pas de groupe thiol dans leur site actif. Le traitement s'effectue de préférence à température ambiante à pH compris entre 2 et 8, de préférence dans une solution tampon. La durée du traitement dépend de la concentration en glutaraldéhyde. Elle est généralement comprise entre 31 min et quelques heures. On laisse réagir de préférence en l'absence d'air, par exemple sous vide, et on élimine l'excès de glutaraldéhyde par lavage à l'eau. La concentration et la durée de la réaction sont telles que la surface du support soit hérissée de groupes aldéhydes liés chimiquement à celui-ci, le glutaraldéhyde fixé représentant, par exemple dans le cas où le support est un gel de silice, de 0,5 à 5% du poids du support. Le support est ainsi activé. According to a first special embodiment of the process, usable when the enzyme is not sensitive to glutaraldehyde, that is to say when it does not lose its catalytic properties in the presence of glutaraldehyde, the support is put in presence of an aqueous glutaraldehyde solution with a concentration of up to 25% by weight. As enzymes insensitive to glutaraldehyde, mention may be made of those which do not have a thiol group in their active site. The treatment is preferably carried out at room temperature at pH between 2 and 8, preferably in a buffer solution. The duration of treatment depends on the concentration of glutaraldehyde. It is generally between 31 min and a few hours. The reaction is preferably allowed to take place in the absence of air, for example under vacuum, and the excess glutaraldehyde is removed by washing with water. The concentration and the duration of the reaction are such that the surface of the support is bristling with aldehyde groups chemically linked thereto, the fixed glutaraldehyde representing, for example in the case where the support is a silica gel, of 0.5 at 5% of the weight of the support. The support is thus activated.

On fixe alors l'enzyme contenant des groupes fonctionnels capables de réagir avec les groupes aldéhydes libres du support activé, par exemple les groupes amino libres portés par les maillons lysine, par mise en contact du support activé avec une solution aqueuse de l'enzyme. Il est nécessaire de maintenir le pH de la solution enzymatique dans le domaine de stabilité de l'enzyme mis en œuvre, par exemple au moyen d'une solution tampon appropriée. La réaction a lieu habituellement à température ambiante, le maintien d'une température basse n'étant nécessaire que dans le cas des enzymes fragiles. L'enzyme non fixé est ensuite éliminé par lavage avec une solution tampon. Pour obtenir un catalyseur particulièrement stable, ce qui est préféré pour l'utilisation en lit fluidisé, on peut effectuer un traitement complémentaire du support déjà chargé de l'enzyme avec un réactif bifonctionnel, de préférence le glutaraldéhyde, par exemple en solution aqueuse de concentration allant jusqu'à 25% en poids. Ce traitement complémentaire a pour effet de réticuler l'ensemble et également de renforcer la liaison entre l'enzyme et le support. The enzyme containing functional groups capable of reacting with the free aldehyde groups of the activated support is then fixed, for example the free amino groups carried by the lysine links, by bringing the activated support into contact with an aqueous solution of the enzyme. It is necessary to maintain the pH of the enzyme solution within the stability range of the enzyme used, for example by means of an appropriate buffer solution. The reaction usually takes place at room temperature, maintaining a low temperature is only necessary in the case of fragile enzymes. The unbound enzyme is then removed by washing with a buffer solution. To obtain a particularly stable catalyst, which is preferred for use in a fluidized bed, it is possible to carry out a complementary treatment of the support already loaded with the enzyme with a bifunctional reagent, preferably glutaraldehyde, for example in aqueous concentration solution. up to 25% by weight. This additional treatment has the effect of crosslinking the whole and also of strengthening the bond between the enzyme and the support.

Une seconde forme spéciale d'exécution du procédé est mise en œuvre dans le cas où l'enzyme perd ses propriétés catalytiques en présence de glutaraldéhyde, par exemple dans le cas d'une lactase de levure possédant des groupes thiols sensibles aux oxydants. On traite le support enrobé du chitosane et réticulé comme indiqué ci-dessus par mise en présence d'une solution contenant de 0,01 à 1 % en poids de glutaraldéhyde, par réaction des groupes aldéhydes libres avec un composé porteur d'un groupe amine comme la glycine, l'asparagine ou la lysine ou, de préférence, par réduction de ceux-ci, par exemple A second special embodiment of the process is implemented in the case where the enzyme loses its catalytic properties in the presence of glutaraldehyde, for example in the case of a yeast lactase having thiol groups sensitive to oxidants. The support coated with chitosan and crosslinked is treated as indicated above by bringing into contact with a solution containing 0.01 to 1% by weight of glutaraldehyde, by reaction of the free aldehyde groups with a compound carrying an amine group such as glycine, asparagine or lysine or, preferably, by reduction of these, for example

à l'aide de borohydrure de sodium. Après inactivation des groupes aldéhydes, on met le support en présence d'un enzyme, par exemple d'une lactase de levure, préalablement protégé au niveau du site actif par un composé inhibiteur compétitif tel que par exemple la galacto-no-y-lactone ou la glucono-y-lactone à la concentration de 20 à 50 mg/ml de milieu réactionnel. Ce sucre protecteur ne modifie pas l'adsorption de l'enzyme sur le support et est libéré par un excès de lactose. Le traitement a lieu dans une solution tampon adéquate en général à basse température, par exemple de 2 à 10° C pendant 30 min à 24 h, et l'excès d'enzyme fixé est lavé avec une solution tampon puis à l'eau. using sodium borohydride. After inactivation of the aldehyde groups, the support is placed in the presence of an enzyme, for example a yeast lactase, previously protected at the active site by a competitive inhibitor compound such as for example galacto-no-y-lactone or glucono-y-lactone at a concentration of 20 to 50 mg / ml of reaction medium. This protective sugar does not modify the adsorption of the enzyme on the support and is released by an excess of lactose. The treatment takes place in an adequate buffer solution in general at low temperature, for example from 2 to 10 ° C for 30 min to 24 h, and the excess of fixed enzyme is washed with a buffer solution and then with water.

Pour augmenter la stabilité de l'enzyme, on préfère lier chimiquement celui-ci au chitosane par l'intermédiaire d'un agent de couplage tel que par exemple un carbodiimide ou le réactif de Woodward, 3-(2-éthyl-5-isoxazolo)benzènesulfonate, capable d'activer les groupes carboxyles de l'enzyme et de les faire réagir avec les groupes amino libres du chitosane. La réaction a lieu pendant 1 à 48 h à température de 2 à 25° C en maintenant un pH de 4 à 6,5, en utilisant de 10 à 50 mg de carbodiimide par millilitre de milieu réactionnel. Une fois la réaction achevée, on lave ensuite l'excès de réactif et l'urée produite par la réaction avec une solution tampon appropriée puis à l'eau. En variante, au lieu de procéder séquentiellement, on peut mettre en présence le support, le composé inhibiteur, l'enzyme et le carbodiimide. To increase the stability of the enzyme, it is preferable to chemically bind it to chitosan via a coupling agent such as for example a carbodiimide or the reagent of Woodward, 3- (2-ethyl-5-isoxazolo ) benzenesulfonate, capable of activating the carboxyl groups of the enzyme and of reacting them with the free amino groups of chitosan. The reaction takes place for 1 to 48 h at a temperature of 2 to 25 ° C while maintaining a pH of 4 to 6.5, using 10 to 50 mg of carbodiimide per milliliter of reaction medium. Once the reaction is complete, the excess reagent and the urea produced by the reaction are then washed with an appropriate buffer solution and then with water. Alternatively, instead of proceeding sequentially, the support, the inhibitor compound, the enzyme and the carbodiimide can be brought into contact.

Le produit obtenu par le procédé selon l'invention a une activité enzymatique qui se rapproche de celle de l'enzyme libre correspondant, propriété qui est rarement conservée dans les procédés de fixation connus. De plus, ledit produit est stable pendant plusieurs mois et a une température d'inactivation plus élevée que l'enzyme libre correspondant. The product obtained by the process according to the invention has an enzymatic activity which is close to that of the corresponding free enzyme, a property which is rarely preserved in known fixing processes. In addition, said product is stable for several months and has a higher inactivation temperature than the corresponding free enzyme.

Comme mentionné plus haut, ce produit peut être employé dans les réactions enzymatiques à la place de l'enzyme libre correspondant en lit fixe (colonne) ou, de préférence, en lit fluidisé. Son emploi dans l'industrie alimentaire ne doit soulever aucune difficulté, le chitosane étant une substance organique naturelle. As mentioned above, this product can be used in enzymatic reactions in place of the corresponding free enzyme in a fixed bed (column) or, preferably, in a fluidized bed. Its use in the food industry should not raise any difficulty, chitosan being a natural organic substance.

Les exemples suivants illustrent la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Dans ceux-ci, les quantités et pourcentages sont pondéraux sauf indication contraire. The following examples illustrate the implementation of the method according to the invention. In these, the quantities and percentages are by weight unless otherwise indicated.

Exemple 1: Example 1:

Chargement du support avec du chitosane Loading media with chitosan

On dissout 8 g de chitosane dans 300 ml d'acide acétique concentré et 400 ml d'eau. On agite le mélange à 40° C pendant 1 h, et on le filtre sur un tissu Propylex 619 106 |i pour éliminer les résidus non dissous. On place la solution de chitosane dans un dessiccateur et on ajoute 120 g d'un gel de silice (Grâce, diamètre des particules dP 100-125 |i, volume des pores 1,2 ml/g, surface spécifique 320 m2/g) en agitant légèrement. On laisse cette suspension sous vide, jusqu'à disparition de la mousse. Après avoir laissé le mélange reposer pendant la nuit, on décante le liquide et on récupère le gel de silice enrobé de chitosane par filtration. Après un léger lavage du gel de silice avec de l'eau, on sèche le support dans une étuve sous vide à 70° C, pendant une nuit. 8 g of chitosan are dissolved in 300 ml of concentrated acetic acid and 400 ml of water. The mixture was stirred at 40 ° C for 1 hr, and filtered through Propylex 619 106 | i fabric to remove undissolved residue. The chitosan solution is placed in a desiccator and 120 g of silica gel are added (Grace, particle diameter dP 100-125 | i, pore volume 1.2 ml / g, specific surface 320 m2 / g) shaking lightly. This suspension is left under vacuum, until the foam disappears. After allowing the mixture to stand overnight, the liquid is decanted and the silica gel coated with chitosan is recovered by filtration. After a light washing of the silica gel with water, the support is dried in a vacuum oven at 70 ° C, overnight.

Préparation d'un support d'immobilisation activé Preparation of an activated immobilization support

On met dans un dessiccateur 120 g du support ci-dessus (gel de silice chargé de chitosane), avec 1600 ml d'une solution aqueuse contenant 200 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 25%. On agite légèrement la suspension qu'on met ensuite sous vide. Après dégazage, on laisse la suspension à la pression atmosphérique pendant 2 h, en l'agitant de temps en temps légèrement. Le support est ainsi activé, ce qui est visible par un changement de sa couleur de blanc au jaune-orange. 120 g of the above support are placed in a desiccator (silica gel loaded with chitosan), with 1600 ml of an aqueous solution containing 200 ml of a 25% glutaraldehyde solution. The suspension is slightly stirred and then placed under vacuum. After degassing, the suspension is left at atmospheric pressure for 2 h, stirring occasionally from time to time. The support is thus activated, which is visible by a change in color from white to yellow-orange.

On récupère le support par filtration et on le lave soigneusement à l'eau. The support is recovered by filtration and washed thoroughly with water.

Immobilisation d'invertase sur le support activé Immobilization of invertase on the activated support

On prépare une solution de 15 mg d'invertase (Maxinvert A 15 mg solution of invertase is prepared (Maxinvert

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

653 363 653,363

4 4

200 000 de Gist- Brocades nv) dans 100 ml d'eau et on ajuste le pH à 4 avec une solution de HCl 0,1M. On mélange 30 ml de cette solution à 3 g de support activé humide, préparé comme ci-dessus. Après avoir agité légèrement la suspension pendant 2 h, on récupère le catalyseur par filtration. On détermine la quantité d'enzyme active en mesurant l'activité de l'hydrolyse du sucre de canne. Les 30 ml de solution initiale contiennent 4,5 mg d'invertase, le filtrat après fixation 0,68 mg, et le catalyseur 4,02 mg. Le rendement d'immobilisation est de 89%, une perte de l'activité pendant ce procédé n'est pas détectable. 200,000 Gist-Brocades nv) in 100 ml of water and the pH is adjusted to 4 with a 0.1M HCl solution. 30 ml of this solution are mixed with 3 g of wet activated support, prepared as above. After having slightly stirred the suspension for 2 h, the catalyst is recovered by filtration. The amount of active enzyme is determined by measuring the hydrolysis activity of cane sugar. The 30 ml of initial solution contains 4.5 mg of invertase, the filtrate after fixing 0.68 mg, and the catalyst 4.02 mg. The immobilization yield is 89%, a loss of activity during this process is not detectable.

Exemple 2: Example 2:

Retraitement de l'invertase Invertase reprocessing

On traite pendant 2 h 15 g du catalyseur humide préparé selon l'exemple 1, et contenant 16 mg d'invertase active, avec une solution de glutaraldéhyde à 1 %, en agitant faiblement le mélange et on récupère le catalyseur par filtration. Après lavage, l'activité du catalyseur mesurée comme dans l'exemple 1 correspond à 14 mg d'invertase active, soit un rendement de 87%. The wet catalyst prepared according to Example 1, and containing 16 mg of active invertase, is treated for 2 h 15 g with a 1% glutaraldehyde solution, with gentle mixing of the mixture, and the catalyst is recovered by filtration. After washing, the activity of the catalyst measured as in Example 1 corresponds to 14 mg of active invertase, ie a yield of 87%.

Exemple 3: Example 3:

Immobilisation d'une lactase fongique sur support activé Immobilization of a fungal lactase on an activated support

On met dans une colonne de verre de 2,5 cm de diamètre et d'une hauteur de 20 cm 28 g de support humide, activé selon l'exemple 1. La colonne fait partie d'un système de recyclage équipé d'une pompe péristaltique réglable et d'un réservoir dont le contenu est agité par un agitateur magnétique. L'entrée de la pompe est connectée au réservoir, sa sortie est placée à la base de la colonne. La sortie à la tête de la colonne ramène le milieu au réservoir. Ce système est chargé de 120 ml d'une solution aqueuse à un pH de 4. La pompe est réglée jusqu'à cé que le support soit fluidisé à une hauteur maximale de 15 cm dans la colonne. On dissout 0,6 g de lactase d'Aspergillus niger (Rapidase, France, 200 000 unités/g) dans le réservoir, pendant que le système de recirculation fonctionne, et on laisse le support à l'état fluidisé pendant 2 h. L'analyse de l'activité établie comme dans l'exemple 1 montre que 72% de l'activité se trouve sur le support, tandis que 20% reste dans le filtrat après filtration et lavage du catalyseur. 28 g of wet support, activated according to Example 1, are placed in a glass column 2.5 cm in diameter and 20 cm high. The column is part of a recycling system equipped with a pump. peristaltic adjustable and a tank whose contents are stirred by a magnetic stirrer. The pump inlet is connected to the tank, its outlet is placed at the base of the column. The outlet at the head of the column brings the medium back to the reservoir. This system is charged with 120 ml of an aqueous solution at a pH of 4. The pump is adjusted until the support is fluidized to a maximum height of 15 cm in the column. 0.6 g of Aspergillus niger lactase (Rapidase, France, 200,000 units / g) is dissolved in the tank, while the recirculation system is operating, and the support is left in the fluidized state for 2 h. Analysis of the activity established as in Example 1 shows that 72% of the activity is on the support, while 20% remains in the filtrate after filtration and washing of the catalyst.

Exemple 4: Example 4:

Retraitement de la lactase fongique immobilisée Reprocessing of immobilized fungal lactase

On mélange 10 g de la lactase humide, préparée selon l'exemple 3, avec 50 ml d'une solution aqueuse contenant 5% de glutaraldéhyde, ajustée à un pH de 4. On agite ce mélange de temps en temps et on récupère le catalyseur par filtration après 2 h. L'analyse de l'activité du catalyseur (par hydrolyse du lactose) avant le retraitement indique une activité correspondant à 21 mg de préparation de lactase (Rapidase, France, 200 000 unités/g) par gramme de catalyseur humide, tandis qu'après le retraitement, on mesure une activité correspondant à 19 mg/g de catalyseur humide. Cela correspond à une préservation de l'activité de 90%. 10 g of the wet lactase, prepared according to Example 3, are mixed with 50 ml of an aqueous solution containing 5% glutaraldehyde, adjusted to a pH of 4. This mixture is stirred from time to time and the catalyst is recovered by filtration after 2 h. Analysis of the activity of the catalyst (by hydrolysis of lactose) before reprocessing indicates an activity corresponding to 21 mg of lactase preparation (Rapidase, France, 200,000 units / g) per gram of wet catalyst, while after the reprocessing, an activity corresponding to 19 mg / g of wet catalyst is measured. This corresponds to 90% activity preservation.

Exemple 5: Example 5:

Immobilisation de trypsine sur support activé Immobilization of trypsin on activated support

On suspend 1 g de gel de silice chargé de chitosane (selon l'exemple 1) dans 20 ml de tampon acétate de sodium (0,5M; pH 6,0). On ajoute 5 ml de glutaraldéhyde (solution aqueuse à 25%) préalablement dilué 1:1 par le tampon précédent. Ce traitement activateur est poursuivi pendant 30 min à température ambiante (25° C) sous légère agitation. Le matériau ainsi activé est lavé plusieurs fois à l'eau distillée pour éliminer le glutaraldéhyde résiduel. 50 mg de trypsine bovine cristallisée (Merck) sont solubilisés dans 20 ml de tampon borate de sodium (0,1M; pH 8,0) contenant du chlorure de calcium (20 mM). On ajoute alors la solution de trypsine au gel de silice chargé de chitosane préparé auparavant. On laisse en contact une nuit à 4° C sous agitation rotative modérée. On sépare ensuite le support chargé d'enzyme de la solution par centrifugation ou filtration, puis on le lave plusieurs fois successivement par: a) du tampon borate de sodium (0,1M; pH 8,0) contenant du chlorure de sodium (0,15M), 1 g of silica gel loaded with chitosan (according to Example 1) is suspended in 20 ml of sodium acetate buffer (0.5M; pH 6.0). 5 ml of glutaraldehyde (25% aqueous solution) previously diluted 1: 1 with the above buffer are added. This activating treatment is continued for 30 min at room temperature (25 ° C) with gentle stirring. The material thus activated is washed several times with distilled water to remove the residual glutaraldehyde. 50 mg of crystallized bovine trypsin (Merck) are dissolved in 20 ml of sodium borate buffer (0.1 M; pH 8.0) containing calcium chloride (20 mM). The trypsin solution is then added to the silica gel loaded with chitosan prepared previously. It is left in contact overnight at 4 ° C. with moderate rotary stirring. The support loaded with enzyme is then separated from the solution by centrifugation or filtration, then it is washed several times successively with: a) sodium borate buffer (0.1M; pH 8.0) containing sodium chloride (0 , 15M),

5 b) du tampon borate de sodium (0,1M; pH 8,0), et c) de l'eau distillée jusqu'à ce que l'adsorption à 280 nm (spectro-mètre UV) des eaux de lavage soit nulle. L'activité enzymatique de la trypsine soluble est déterminée en utilisant comme substrat le chlorhydrate de Na-benzoyl-L-arginine-p-nitroaniline (L-BANA) à io la concentration de 1 mM, dans du tampon Tris (ou trishydroxy-méthylaminométhane)-HCl (50 mM; pH 8,0) et à 25° C. La p-nitro-aniline libérée par l'hydrolyse enzymatique est mesurée par spectro-photométrie UV à 405 nm. Une unité d'activité trypsine (1 UI) correspond à la quantité d'enzyme qui libère 1 (xmol de p-nitroaniline îs par minute dans les conditions données. L'activité de la trypsine immobilisée est déterminée selon la même méthode mais en lit agité, en utilisant un dispositif à mesure intermittente analogue à celui décrit dans «Methods in Enzymology», 44, 344-345 (1976). La quantité d'enzyme fixé sur le support est obtenue indirectement en calculant 20 la différence entre la quantité d'enzyme ajouté initialement et la quantité d'enzyme non fixé, sur la base des concentrations en protéine déterminées par la méthode de Folin-Lowry («J. Biol. Chem.», 193, 265,1951). La préparation obtenue contient 35,2 mg de trypsi-ne/g de support et a une activité enzymatique de 72 unités interna-25 tionales (UI) par gramme de support. Le rendement de fixation est de 63,7%. L'activité spécifique de la trypsine immobilisée est de 2,04 Ul/mg d'enzyme immobilisé alors que celle de l'enzyme soluble est de 2,26 Ul/mg. 5 b) sodium borate buffer (0.1M; pH 8.0), and c) distilled water until the adsorption at 280 nm (UV spectrometer) of the washing water is zero . The enzymatic activity of soluble trypsin is determined using as substrate Na-benzoyl-L-arginine-p-nitroaniline hydrochloride (L-BANA) at a concentration of 1 mM, in Tris buffer (or trishydroxy-methylaminomethane). ) -HCl (50 mM; pH 8.0) and at 25 ° C. The p-nitro-aniline released by the enzymatic hydrolysis is measured by UV spectrophotometry at 405 nm. One unit of trypsin activity (1 IU) corresponds to the quantity of enzyme which releases 1 (xmol of p-nitroaniline is per minute under the given conditions. The activity of immobilized trypsin is determined according to the same method but in bed stirred, using an intermittent measuring device similar to that described in "Methods in Enzymology", 44, 344-345 (1976). The amount of enzyme fixed on the support is obtained indirectly by calculating the difference between the amount of the enzyme initially added and the amount of enzyme not attached, based on the protein concentrations determined by the Folin-Lowry method ("J. Biol. Chem.", 193, 265, 1951). The preparation obtained contains 35 0.2 mg of trypsin / g of support and has an enzymatic activity of 72 international units (IU) per gram of support. The binding yield is 63.7%. The specific activity of immobilized trypsin is 2.04 IU / mg of immobilized enzyme while that of the soluble enzyme is 2.26 IU / mg.

Exemple 6: Example 6:

Stabilisation du support pour l'immobilisation d'enzymes sensibles au glutaraldéhyde Stabilization of the support for the immobilization of enzymes sensitive to glutaraldehyde

40 g de support enrobé de chitosane selon l'exemple 1 sont dispersés dans 150 ml de tampon phosphate de potassium (50 mM; pH 6,5). On ajoute 1,5 ml de glutaraldéhyde (solution aqueuse à 25%, Fluka AG, pract.). On laisse réagir 30 min sous agitation rotative lente, à température ambiante. On sépare ensuite le support de 4o la solution par filtration (tamis métallique, maille de 50 |xm) ou centrifugation, puis on le lave plusieurs fois avec de l'eau distillée. On resuspend le support dans 150 ml du tampon précédent. On ajoute 500 mg de borohydrure de sodium solide, par portions. On laisse réagir 30 min dans les mêmes conditions. On récupère le support par 45 filtration, on le lave avec de l'eau distillée, on l'essore puis l'utilise pour l'immobilisation d'enzymes comme indiqué dans les exemples 7 et 8 ci-après. 40 g of support coated with chitosan according to Example 1 are dispersed in 150 ml of potassium phosphate buffer (50 mM; pH 6.5). 1.5 ml of glutaraldehyde (25% aqueous solution, Fluka AG, pract.) Are added. The reaction is left to react for 30 min with slow rotary stirring, at room temperature. The support is then separated from the solution by filtration (metal sieve, 50 µm mesh) or centrifugation, then washed several times with distilled water. The support is resuspended in 150 ml of the preceding buffer. 500 mg of solid sodium borohydride is added in portions. It is left to react for 30 min under the same conditions. The support is recovered by filtration, washed with distilled water, wrung out and then used for the immobilization of enzymes as indicated in Examples 7 and 8 below.

50 50

Exemple 7: Example 7:

Immobilisation d'une lactase neutre de levure par adsorption Immobilization of a neutral yeast lactase by adsorption

40 g de support stabilisé selon l'exemple 6 sont dispersés dans 150 ml de tampon phosphate de potassium (50 mM; pH 6,5) contenant 0,1 mM de chlorure de manganèse et 0,02% d'azidure de 55 sodium. On ajoute du D-galactono-y-lactone (Koch-Light Lab.) à la concentration finale 0,1M. On ajuste le pH du milieu à 6,5 si nécessaire. On ajoute 6 ml d'une solution de lactase de levure (Maxilact LX 5000 de Gist-Brocades na, Delft, Hollande). On agite le milieu contenant l'enzyme et le support pendant 16 h. On sépare le support 60 du milieu par filtration et on le lave successivement par: 500 ml de tampon phosphate de potassium (50 mM; pH 6,5) et 0,1 mM de chlorure de manganèse; 500 ml de tampon précédent contenant en plus 50 mM de chlorure de potassium; de l'eau distillée (3 x 500 ml). Le support doué d'activité lactasique est conservé dans le ss premier tampon mentionné (phosphate/manganèse/azidure). 40 g of stabilized support according to Example 6 are dispersed in 150 ml of potassium phosphate buffer (50 mM; pH 6.5) containing 0.1 mM of manganese chloride and 0.02% of sodium azide. D-galactono-y-lactone (Koch-Light Lab.) Is added to the final concentration 0.1M. The pH of the medium is adjusted to 6.5 if necessary. 6 ml of a yeast lactase solution (Maxilact LX 5000 from Gist-Brocades na, Delft, Holland) are added. The medium containing the enzyme and the support are stirred for 16 h. The support 60 is separated from the medium by filtration and washed successively with: 500 ml of potassium phosphate buffer (50 mM; pH 6.5) and 0.1 mM of manganese chloride; 500 ml of the preceding buffer additionally containing 50 mM of potassium chloride; distilled water (3 x 500 ml). The support endowed with lactase activity is kept in the first buffer mentioned (phosphate / manganese / azide).

L'activité enzymatique soluble ou immobilisée est déterminée par spectrophotométrie UV en utilisant comme substrat une solution 5mM d'o-nitrophényl-P-galactopyrannoside (ONPG) à 30° C. The soluble or immobilized enzymatic activity is determined by UV spectrophotometry using as substrate 5mM solution of o-nitrophenyl-P-galactopyrannoside (ONPG) at 30 ° C.

5 5

653 363 653,363

L'o-nitrophénol libéré par l'enzyme est déterminé à 405 nm (sm 9NP:1097 M-'cm-1 à pH 6,5). L'activité de l'enzyme immobilisé est déterminée comme indiqué dans l'exemple 5, en utilisant le substrat indiqué ci-dessus. Une unité internationale (UI) d'activité lacta-sique corrspond à la libération de 1 |imol d'o-nitrophénol par s minute dans les conditions indiquées. La lactase immobilisée possède une activité de 423 Ul/g de support sec. The o-nitrophenol released by the enzyme is determined at 405 nm (sm 9NP: 1097 M-'cm-1 at pH 6.5). The activity of the immobilized enzyme is determined as indicated in Example 5, using the substrate indicated above. An international unit (IU) of lactic activity corresponds to the release of 1 | imol of o-nitrophenol per minute under the conditions indicated. The immobilized lactase has an activity of 423 IU / g of dry support.

Exemple 8: 10 Example 8: 10

Immobilisation d'une lactase neutre de levure par covalence Covalent immobilization of a neutral yeast lactase

L'enzyme adsorbé selon l'exemple 7 peut être plus fortement lié à son support par un traitement additionnel au carbodiimide. Après 30 min de contact entre la lactase et son support, dans les conditions 15 décrites dans l'exemple 7, on ajoute par petites portions 2,5 g de carbodiimide [l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide de métho-p-toluidinesulfonate (Sigma Chem. Co.)] en maintenant le pH à 6,5 pendant 2 h à température ambiante, puis 16 h à 4° C sous agitation rotative. On procède par la suite aux mêmes lavages que 20 ceux indiqués dans l'exemple 7. L'activité lactasique du support déterminée comme indiqué dans l'exemple 5 est de 285 Ul/g de support sec. The enzyme adsorbed according to Example 7 can be more strongly linked to its support by an additional treatment with carbodiimide. After 30 min of contact between the lactase and its support, under the conditions described in Example 7, 2.5 g of carbodiimide [l-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide of metho- p-toluidinesulfonate (Sigma Chem. Co.)] maintaining the pH at 6.5 for 2 h at room temperature, then 16 h at 4 ° C with rotary stirring. The same washes are then carried out as those indicated in Example 7. The lactase activity of the support determined as indicated in Example 5 is 285 IU / g of dry support.

Exemple 9: Example 9:

Hydrolyse de lactosérum Whey hydrolysis

On pompe du lactosérum déprotéiné de bas en haut au travers de la colonne selon l'exemple 3, remplie du catalyseur retraité selon l'exemple 4, à la température de 50° C. On constate une baisse de l'activité du catalyseur de 18% pendant les premières 12 h. Après cette baisse initiale, on constate, en effectuant une détermination de l'activité du catalyseur après une semaine, que celle-ci est stable dans les conditions du traitement indiquées ci-dessus. Deproteinized whey is pumped from bottom to top through the column according to Example 3, filled with the reprocessed catalyst according to Example 4, at a temperature of 50 ° C. There is a drop in the activity of the catalyst by 18 % during the first 12 hours. After this initial drop, it is found, by determining the activity of the catalyst after one week, that it is stable under the conditions of the treatment indicated above.

Exemple 10: Example 10:

Hydrolyse en continu de lait écrémé Continuous hydrolysis of skim milk

On dépose 90 ml d'une suspension de biocatalyseur selon l'exemple 8 dans une colonne de 2,5 cm de diamètre. La hauteur du lit d'enzyme est de 18,3 cm. On pompe du lait écrémé stérilisé (UHT) de bas en haut au travers de la colonne avec un débit de 180 ml/h. Dans ces conditions, le lit d'enzyme se fluidisé et atteint une hauteur de 25,5 cm. On maintient la température du système à 6,2° C et le taux d'hydrolyse du lactose est de 92%. Après 275 h d'opération continue (excepté quelques heures de lavage par un détergent approprié tous les 2-3 d), l'activité restante du catalyseur représente les 85% de l'activité initiale. 90 ml of a suspension of biocatalyst according to Example 8 are deposited in a column 2.5 cm in diameter. The height of the enzyme bed is 18.3 cm. Sterilized skimmed milk (UHT) is pumped from bottom to top through the column with a flow rate of 180 ml / h. Under these conditions, the enzyme bed becomes fluidized and reaches a height of 25.5 cm. The system temperature is maintained at 6.2 ° C and the lactose hydrolysis rate is 92%. After 275 h of continuous operation (except a few hours of washing with an appropriate detergent every 2-3 d), the remaining activity of the catalyst represents 85% of the initial activity.

r r

Claims

653 363653,363

1. Procédé de préparation de biocatalyseurs doués d'activité en-zymatique insolubles en milieu aqueux et convenant particulièrement à l'utilisation en lit fluidisé ou en lit fixe, caractérisé par le fait qu'on enrobe des particules d'une matière minérale rigide et dense avec une couche de chitosane, qu'on stabilise les particules enrobées par un réactif bifonctionnel et qu'on fixe un enzyme sur le support ainsi traité. 1. Process for the preparation of biocatalysts endowed with in-zymatic activity insoluble in aqueous medium and particularly suitable for use in a fluidized bed or in a fixed bed, characterized in that the particles are coated with a rigid mineral material and dense with a layer of chitosan, stabilize the particles coated with a bifunctional reagent and fix an enzyme on the support thus treated.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le réactif bifonctionnel est le glutaraldéhyde. 2. Method according to claim 1, characterized in that the bifunctional reagent is glutaraldehyde.

2 2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la matière minérale est choisie parmi les particules ou billes poreuses de gel de silice, d'oxyde métallique ou de céramique. 3. Method according to claim 1, characterized in that the mineral material is chosen from particles or porous beads of silica gel, metal oxide or ceramic.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que, l'enzyme n'étant pas sensible au glutaraldéhyde, on active le support enrobé de chitosane par traitement avec du glutaraldéhyde et on fixe l'enzyme au support par liaison chimique entre les groupes aldéhydes libres et les groupes amino libres portés par l'enzyme. 4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that, the enzyme not being sensitive to glutaraldehyde, the support coated with chitosan is activated by treatment with glutaraldehyde and the enzyme is fixed to the support by chemical bond between the free aldehyde groups and the free amino groups carried by the enzyme.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que, après fixation de l'enzyme, le support est retraité par le glutaraldéhyde de manière à augmenter sa stabilité. 5. Method according to claim 4, characterized in that, after fixing of the enzyme, the support is reprocessed with glutaraldehyde so as to increase its stability.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que, l'enzyme étant sensible au glutaraldéhyde, on traite le catalyseur stabilisé par le glutaraldéhyde à l'aide d'un réactif réducteur et on adsorbe l'enzyme sur le support. 6. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that, the enzyme being sensitive to glutaraldehyde, the catalyst stabilized with glutaraldehyde is treated with a reducing reagent and the enzyme is adsorbed on the support.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le réactif réducteur est le borohydrure de sodium. 7. Method according to claim 6, characterized in that the reducing reagent is sodium borohydride.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'enzyme adsorbé est lié chimiquement au support par un agent de couplage tel qu'un carbodiimide ou le 3-(2-éthyl-5-isoxazolo) benzènesulfonate. 8. Method according to claim 6, characterized in that the adsorbed enzyme is chemically linked to the support by a coupling agent such as a carbodiimide or 3- (2-ethyl-5-isoxazolo) benzenesulfonate.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que les sites actifs de l'enzyme sont protégés par adjonction d'un inhibiteur compétitif. 9. Method according to claim 8, characterized in that the active sites of the enzyme are protected by the addition of a competitive inhibitor.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'inhibiteur compétitif est la glucono-y-lactone ou la galactono-y-lactone. 10. Method according to claim 9, characterized in that the competitive inhibitor is glucono-y-lactone or galactono-y-lactone.

11. Biocatalyseur préparé par le procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 11. Biocatalyst prepared by the method according to one of claims 1 to 10.