CH651222A5 - Adsorbens fuer die affinitaetsspezifische trennung von nukleinsaeuren. - Google Patents

Adsorbens fuer die affinitaetsspezifische trennung von nukleinsaeuren. Download PDF

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CH651222A5
CH651222A5 CH2106/78A CH210678A CH651222A5 CH 651222 A5 CH651222 A5 CH 651222A5 CH 2106/78 A CH2106/78 A CH 2106/78A CH 210678 A CH210678 A CH 210678A CH 651222 A5 CH651222 A5 CH 651222A5
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren, wie z. B. Gemischen aus einsträngigen und/oder zweisträngigen Nukleinsäuren, insbesondere Desoxyribonukleinsäuren (im folgenden abgekürzt als DNA bezeichnet), ein Verfahren zur Herstellung dieses Adsorbens sowie dessen Verwendung.
Die Isolierung von einzelnen Genen oder von Sätzen gleicher Gene in repititiver Anordnung aus dem Genom eukary-otischer Zellen ist nicht nur von rein wissenschaftlichem Interesse, sondern im Hinblick auf die Gentechnologie auch von grosser praktischer Bedeutung. Möglich waren solche Isolierungen nur dann, wenn sich die Basenzusammensetzung des Gens oder der Gengruppe mit ihren «Spacern» wenigstens 6 bis 7% von der mittleren Basenzusammensetzung des Gesamtgenoms unterschied. Als Trennverfahren wurden meist Cäsiumionendichtegradientenzentrifugationen mit DNA-basenspezifischen Zusätzen, wie Silber-, Quecksilberoder Platinionen oder Actinomycin, Netropsin oder dem Farbstoff «Hoechst 33258» angewendet. Die Struktur des Farbstoffes Hoechst 33258 wird weiter unten angegeben. Diese Verfahren haben nur beschränkte Kapazität, sind teuer und zeitraubend.
Die Entwicklung von Materialien zur Affinitätschromatographie von Biopolymeren hat in den vergangenen Jahren die Isolierung einer Vielzahl von Biopolymeren stark vereinfacht oder ihre Reindarstellung überhaupt erst ermöglicht. Bei diesen Verfahren geht man in der Regel von einem Trägermaterial aus, das nach chemischer Aktivierung mit einer Substanz umgesetzt wird, die das zu isolierende Biopolymere möglichst spezifisch bindet. Aufgrund dieser Spezifität kann das gesuchte Biopolymere im Idealfall selektiv aus einem 40 Gemisch ähnlicher Verbindungen an das Chromatographiematerial adsorbiert und anschliessend unter geeigneten Bedingungen in reinem Zustand desorbiert werden (P. Cuatre-casas und C.B. Anfinsen, Ann. Rev. Biochem. 40 (1971) 259 bis 278).
45 Trotz der Fülle von Beispielen für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode konnte für eine Vielzahl von Biopolymeren bislang kein Chromatographiematerial entwik-kelt werden, das eine ähnlich selektive und programmierbare Auftrennung auch für Nukleinsäuregemische ermöglicht, so Eine hochauflösende Fraktionierung von Nukleinsäuregemi-schen im Grammassstab ist aber eine Voraussetzung für die angesprochene Isolierung von einzelnen Genen oder von Sätzen gleicher Gene.
Bei den vorhandenen Verfahren zur Auftrennung von 55 Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht, zum Beispiel Transfer-Ribonukleinsäuren, wird die Auftrennung in die verschiedenen Spezies an Adsorbentien erreicht, die Ionenaustauschereigenschaften mit lipophilen Wechselwirkungen kombinieren (R.M. Kothari und V. Shankar, Journal of 60 Chromatography 98 (1974) 449 bis 475). Dabei werden im wesentlichen die Wechselwirkungsmöglichkeiten des Trägers mit den seltenen Basen der Nukleinsäuren ausgenützt, die in den verschiedenen Transfer-Ribonukleinsäuren in unterschiedlicher Menge vorhanden sind.
65 Da die höhermolekularen Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren in der Regel keine seltenen Basen enthalten, können Methoden zu ihrer Auftrennung nur auf den folgenden Unterschiedsmerkmalen aufgebaut werden:
651 222
a) Verhältnis von Einzel- zu Doppelstrang b) Unterschiede in der Basenzusammensetzung c) Unterschiede in der Basensequenz d) Unterschiede in den Molekulargewichten e) Unterschiede in den Tertiärstrukturen.
All diese Merkmale werden tatsächlich bei den heute üblichen Fraktioniermethoden genutzt (R.M. Kothari, Chro-matog. Rev. 12 (1970) 127 bis 155).
Bei der wirksamsten Methode, der Fraktionierung im Salzgradienten in der Ultrazentrifuge führen Unterschiede gemäss b, c und e zu Unterschieden in der Schwebedichte für einzelne DNA-Spezies, die durch Zusatz von basenspezifischen Substanzen noch vergrössert werden können. Die Trennschärfe nimmt mit abnehmendem Molekulargewicht, die Kapazität mit zunehmendem Molekulargewicht ab. Bei der Adsorptionschromatographie an Hydroxyapatit erfolgt die Fraktionierung im wesentlichen gemäss a und nur in geringerem Ausmass gemäss b, indem Guanin-Cytosin-reiche-re Nukleinsäuren schon bei etwas geringeren Salzkonzentrationen desorbiert werden als die Adenin-Thymin-reicheren Komponenten (W. Pakroppa und W. Müller, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (3) (1974) 699 bis 703).
Ganz analog können doppelsträngige Nukleinsäuren auch an spezifischen Protein-Kieselgur-Adsorbentien (zum Beispiel Methyl-Serum-Albumin-Kieselgur) (gemäss Unterschieden der Basenzusammensetzung fraktioniert werden, wobei wieder die Guanin-Cytosin-reicheren DNA-Spezies zuerst eluiert werden (J.D. Mandell und A.D. Hershey, Analytical Biochemistry 1 (1960) 66 bis 77; N. Sueoka und Ts'ai-Ying Cheng, J. Mol. Biol. 4 (1962) 161 bis 172). Die eigentliche Wirkungsweise dieser mehr zufallig entdeckten Adsorbentien ist nicht bekannt. Daher konnte die geringe Trennschärfe dieser Materialien trotz aller Bemühungen bis heute nicht grundsätzlich verbessert werden.
Erst in den letzten Jahren wurden bei der systematischen Untersuchung von zahlreichen Substanzen, die mit Nukleinsäuren Komplexe bilden, Verbindungen aufgefunden, die zu einer gezielten Synthese von Materialien für die Affinitätschromatographie geeignet erschienen (W. Müller und D.M. Crothers, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 267 bis 277; W. Müller, H. Bünemann und N. Dattagupta, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 279 bis 291 und W. Müller und F. Gautier, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 385 bis 394). Welche Vorteile die Anwendung derartiger gut untersuchter Substanzen bei der Trennung von Nukleinsäuregemischen bringt, konnte bereits an den Beispielen der kombinierten Anwendung von Hydroxyapatit und Ethidiumbromid als basenspezifischem Zusatz zur Trennung von superhelicaler und helicaler DNA (W. Pakroppa, W. Goebel und W. Müller, Analytical Biochemistry 67 (1975) 372 bis 383) und von Hydroxyapatit in Kombination mit Phenylneutralrotderivaten als basenspezifischen Komplexbildnern bei der Trennung von doppel-strängigen DNA-Spezies demonstriert werden (W. Pakroppa und W. Müller, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (3) (1974) 699 bis 703).
Das Auflösungsvermögen dieser zuletzt erwähnten Methoden ist mit dem eines präparativen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten vergleichbar, das heisst DNA-Fraktionen mit Unterschieden im (G-t-C)-Gehalt (wobei G für Guanin und C für Cytosin stehen) lassen sich voneinander trennen. Trotz hoher Kapazität hat das Verfahren den Nachteil, dass sich DNA-Gemische mit einem mittleren Molekulargewicht der Komponenten von mehr als 20 x 106 nicht mehr gut handhaben lassen und dass der als Adsorbens verwendete spezielle Hydroxyapatit selbst hergestellt werden muss.
Seit längerem ist bekannt, dass sich Nukleinsäure-Gemi-sche im Polyäthylenglykol-Dextran-System unter bestimmten Bedingungen in RNA und einsträngige DNA einerseits und doppelsträngige DNA andererseits auftrennen lassen. Dabei reichert sich die doppelsträngige DNA stets in der (leichteren) Polyäthylenglykolphase an, das heisst sie besitzt einen höheren Verteilungskoeffizienten als einsträngige s Nukleinsäuren. Die Absolutwerte der Verteilungskoeffizienten lassen sich zwar durch Zusätze von Kalium- und Lithiumsalzen über rd. 3-4 Zehnerpotenzen variieren, eine Fraktionierung nach der Basenzusammensetzung gelingt in diesen Systemen jedoch nicht.
io Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, Adsorbentien bereitzustellen, mit denen eine affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren und insbesondere Gemischen von einsträngigen und/oder zweisträngigen und/oder supereoiled und/oder linearen Nukleinsäuren, ins-15 besondere von DNA-Gemischen, bei hoher Kapazität erreicht werden kann.
Unter Affinitätsspezifität ist vor allem die Strukturspezifität und die Basenspezifität zu verstehen.
Es hat sich nunmehr gezeigt, dass die genannte Aufgabe 20 mit einem Adsorbens gelöst werden kann, das ein polymeres Trägermaterial aufweist, an das direkt oder über längere Zwischengruppen (polymere Spacer) ein basen- und/oder strukturspezifischer Komplexbildner für Nukleinsäuren kovalent gebunden ist.
25 Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft nun ein Adsorbens der definierten Art, das gekennzeichnet ist durch ein kleinporiges, wenig komprimierbares, polymeres Trägermaterial, auf das ein Copolymeres aus mindestens zwei mischpolymerisierbaren Mo-30 nomeren aufgepfropft ist, von denen eines aus dem basen-und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren besteht.
Vorzugsweise werden basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren verwendet, die in 35 den genannten Literaturstellen beschrieben sind. Insbesondere enthalten diese Komplexbildner Reste von Farbstoffen der folgenden allgemeinen Formel I und II
40
(I)
55
60
65
R^N
©r
NR2
,0
(ii)
nr.
5
651 222
in welchen allgemeinen Formeln
X für eine CH-Gruppe oder ein Stickstoffatom und Y für ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe oder eine Gruppe der Formel
7. Di-tert.-butyl-proflavin:
2,7 -Di-t-butyl-3,6-diaminoacridin
> \=
NtR1)
iCHjijC CICHJIJ
nh steht,
die R1 unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Methylgruppen bedeuten,
R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe-, R3 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R4 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und
A~ für ein Anion, wie z.B. ein Cloridanion, ein Perchlo-ratanion oder ein Oxalatanion, bedeuten, geeignet.
Erfindungsgemäss besonders bevorzugte, an das polyme re Trägermaterial gebundene basenspezifische Komplexbildner sind die Reste der folgenden Farbstoffe:
8. Di-tert-butyl-acriflavin:
2,7 -Di-t-butyl-3,6-diamino-10-methylacridinium-salz
10
9.
20
1. Diamidinophenyl-indol (DAPI)
hn=c ~ n NH2 h
nh nh.
2. Malachitgrün
V,c,o<
3. Kristallviolett jfTTl
NICHJJÏ
er
(CHj)jN
jacva
NlCHjlj
4. Methylgrün
* NlCHjh
J cior
(CH))jN
N(CH))î
5. Auramin
NH
(CHJJJN
O'Xx
N(CHJ)J
6. Farbstoff Hoechst 33258:
2-(4-Hydroxyphenyl)-5-{5-[ 1 -methylpiperazin-4-yl]-benzimidazol-2-yl}-benzimidazol
<*,<>
H
-OH
N ri
10.
25
30
11.
35
12.
40
45
13.
50
14.
15.
60
16.
(Cri)))C
CH,
^^*nhj cl0'
^nh,
(CHj),N
CHJCHJCOOK
fyt\.r
(CHj NjCHjlj
H,N
I
CH,
NH,
fYY\. A"
H ,NNH, CH,CH=CH,
jXCuA"
ô
(CHjljN^^^N-^/ 5 N(CHj)J
a"
651222
17.
fCHj^N
^,'CHÏ -
31. Methylenblau
iU-CK"!Cle., A"
18.
19.
a-
NH,
,] 'VVH* A-
20. Proflavin M N © A
NH,
h
21.
22.
23.
24.
H» N
il T © A
H
® NH.
25. Thionin
H» N
ttì ©
kNH*
26. Acridinorange
M. A"
"•j* N
• *
h
27. Pyroriin G ^ -NM.
g a
28. Thiopyronin
29.
30.
M*
M.2*ajsì^©., a"
32.
nh-ch2-ck2-nh2
och.
wobei in den obigen Formeln Me für die Methylgruppe und 15 A- für ein Anion steht.
33. Ethidiumbromid
20
Die erfindungsgemäss bevorzugten basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner sind jedoch Phenylneutral-30 rot der Formel
35
(ch3)2n
40
und Malachitgrün der Formel
n(ch3)2cl'
50
55
«
n!ch3)2
Diese Farbstoffe sind an sich bekannt und im Handel erhältlich oder können nach Verfahrensweisen hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig und beispielsweise in den oben erwähnten Veröffentlichungen von W. Müller und 60 D.M. Crothers (Eur. J. Biochem. 54 (1975) 267 bis 277), W. Müller, H. Bünemann und N. Dattagupta (Eur. J. Biochem. 54 (1975) 279 bis 291) und W. Müller und F. Gautier (Eur. J. Biochem. 54 (1975) 385 bis 394) beschrieben sind.
Diese basen- und/oder strukturspezifischen Komplexes bildner können nach Methoden, die dem Fachmann ohne weiteres geläufig sind, kovalent an das Trägermaterial gebunden werden, beispielsweise durch Veresterung mit an dem Trägermaterial vorhandenen Hydroxylgruppen über in
651 222
das Farbstoffmolekül eingeführte Carboxylgruppen, durch Amidbildung, durch Urethanbildung oder auch durch Co-polymerisation in Abwesenheit und vorzugsweise in Gegenwart von anderen copolymerisierbaren Monomeren über copolymerisierbare Doppelbindungen, die in das Farbstoffmolekül eingeführt sind, beispielsweise über eine Acrylamid-
gruppe, wie es für die erfmdungsgemäss bevorzugten basen-und/oder strukturspezifischen Komplexbildner Acryl-phenylneutralrot und Acryl-malachitgrün der folgenden Formeln der Fall ist. Diese genannten Bezeichnungen sind Trivialnamen, die exakte Bezeichnung lautet Acryloylamino-phenylneutralrot und Acryloylaminomalachitgrün.
(cf^^n
. ,N (CH3)2 Cl
N(CH3)2
Die basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner können von dem Fachmann in an sich bekannter Weise durch Einführen des Acrylrestes in die genannten Farbstoffmoleküle hergestellt werden. Dies gilt auch für die weiter oben genannten Farbstoffmoleküle.
Die Bezeichnung Acryl-Rest ist in den vorliegenden Fällen gleichbedeutend mit Acryloyl-Rest.
Bevorzugt erfolgt die Herstellung jedoch nach den in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Verfahren. Die Acryloyl-Farbstoffe sind neu.
Erfmdungsgemäss verwendet man als polymeres Trägermaterial vorzugsweise ein kleinporiges, wenig komprimierbares polymeres Trägermaterial, wie Poly-bisacrylamid. Diese kleinporigen und wenig komprimierbaren polymeren Trä-
55 germaterialien haben sich für die Affinitätschromatographie von hochviskosen Nukleinsäurelösungen als sehr vorteilhaft erwiesen. Weiterhin zeigen diese polymeren Trägermaterialien keine starken Wechselwirkungen mit den basen- und/ oder strukturspezifischen Komplexbildnern für Nukleinsäu-60 ren, die entweder direkt oder über polymere Spacer an die polymeren Trägermaterialien gebunden werden.
Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, zwischen dem polymeren Trägermaterial und dem basen- und/oder spezifischen Komplexbildner einen längeren Spacer, das heisst eine länge-65 re Molekülkette ohne funktionelle Gruppen, einzuführen, da hierdurch die Komplexbildung des basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildners mit der helicalen Nukleinsäure durch sterische Hinderung nicht beeinträchtigt wird.
651 222
In besonders bevorzugter Weise ist daher bei dem erfin-dungsgemässen Adsorbens der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner über ein Copolymeres, das vorzugsweise einen Polymerisationsgrad von 200 bis 300 aufweist, an das polymere Trägermaterial gebunden. Zur Bildimg dieses Copolymeren verwendet man vorzugsweise ein weiteres Monomeres, das mit der für die Polymerisation in den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner eingeführten Gruppe und den an dem polymeren Trägermaterial vorliegenden, copolymerisierbaren Gruppen copolymerisier-bar ist.
Vorzugsweise verwendet man als dieses weitere Monomere Acrylamid und pfropft die genannten acrylgruppenhal-tigen Farbstoffe auf ein Poly-bisacrylamid auf, das noch freie, copolymerisierbare Doppelbindungen aufweist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der genannten Adsorbentien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man zunächst durch Polymerisation oder durch Polykondensation mindestens eines Monomeren, das zusätzlich zu der für die Polymerisation oder die Polykondensation erforderlichen funktionellen Gruppe eine weitere funktionelle Gruppe aufweist, über die der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren direkt oder über einen polymeren Spacer gebunden werden kann, das polymere Trägermaterial bildet, das polymere Trägermaterial gegebenenfalls zu der gewünschten Teilchengrösse zerkleinert und dann den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren entweder direkt oder durch Copolymerisation in Gegenwart mindestens eines weiteren Monomeren als Copolymeres aufpfropft.
Das Aufpfropfen kann in beliebiger Weise, beispielsweise durch Veresterung, durch Amidbildung oder durch Ure-thanbildung, erfolgen, wozu man übliche Reagenzien und übliche Verfahrensbedingungen anwenden kann bzw. die für diese Reaktionen geeigneten Gruppen in das polymere Trägermaterial bzw. den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren einführen kann.
Man kann jedoch auch den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren, der eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweist, in Gegenwart eines Uberschusses eines weiteren copolymerisierbaren Monomeren als Copolymeres auf Polybisacrylamid aufpfropfen, da Polybisacrylamid noch freie, copolymerisierbare Doppelbindungen aufweist. Die Pfropfcopolymerisation kann in Wasser oder irgendeinem inerten organischen Lösungsmittel und in Gegenwart eines üblichen Polymerisationskatalysators durchgeführt werden.
Vorzugsweise verwendet man als copolymerisierbaren Komplexbildner Acryl-phenylneutralrot oder Acryl-malachitgrün und als weiteres copolymerisierbares Monomeres Acrylamid, wobei man ein Copolymeres aus diesen Bestandteilen auf Polybisacrylamid aufpfropft. Gemäss einer bevorzugten Arbeitsweise pfropft man ein Copolymeres aus Acrylamid und Acryl-phenylneutralrot oder Acryl-malachit-grün mit einem Polymerisationsgrad von 200 bis 300 auf.
Bei dieser Pfropfcopolymerisation arbeitet man vorzugsweise bei einem Verhältnis von dem eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden, basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren zu dem weiteren copolymerisierbaren Monomeren von 1:100 bis 1:5000, wobei man diese Reaktion vorzugsweise bei einem Verhältnis von 1:3000 durchführt. Hierbei hat sich gezeigt, dass das molare Ausgangsverhältnis des weiteren Monomeren zu dem eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden Komplexbildner auch in dem Copolymeren erhalten bleibt. Bei einem mittleren Polymerisationsgrad des Copolymeren von 200 bis 300 kann man davon ausgehen, dass die aufgepfropften Copolymerketten jeweils nur einen basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren tragen. Die Copolymeren bilden somit Spacer unterschiedlicher Länge zwischen dem Komplexbildner und dem polymeren Trägermaterial, insbesondere den Poly-bisacrylamid-Teil-chen.
Es hat sich gezeigt, dass die erfmdungsgemässen Adsorbentien die gesetzten Anforderungen erfüllen und ohne weiteres synthetisch in einfacher Weise gewonnen werden können. Beispielsweise erhält man das polymere Trägermaterial durch Polymerisation von Bisacrylamid in hochkonzentrierter Lösung. Das Polymerisationsprodukt ist ein spröder, farbloser Festkörper, der sehr leicht zu gut sedimentierenden Scherben zerrieben werden kann, die durch mehrfache Siebung bis zur gewünschten Partikelgrösse homogenisiert werden können. Das Quellverhalten in wässriger Lösung ist auch bei extremen Salzkonzentrationen konstant und von der Durchflussgeschwindigkeit bei der Chromatographie praktisch unabhängig. Da diese Teilchen noch eine Vielzahl nicht umgesetzter, polymerisierbarer Doppelbindungen enthalten, können sie, wie oben bereits erläutert wurde, für die weitere Pfropfpolymerisation eingesetzt werden.
So erhält man mit dem Adenin-Thymin-spezifischen Acryl-malachitgrün und mit dem Guanin-Cytosin-spezifi-schen Acryl-phenylneutralrot mit Acrylamid in Gegenwart dieser Poly-bisacrylamid-Teilchen durch Copolymerisation in wässriger Lösung die erfmdungsgemäss bevorzugten Adsorbentien. Dabei werden im allgemeinen 40 bis 50% der gebildeten Copolymeren mit einem mittleren Polymerisationsgrad von ca. 200 unter üblichen Reaktionsbedingungen in Form von Pfropfcopolymeren an die Trägerpartikel aus dem Poly-bisacrylamid gebunden. Nach dem gründlichen Spülen geben die stark gefärbten Adsorbens-Teilchen keinen Farbstoff mehr ab und können dann direkt für die Affinitätschromatographie von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Üblicherweise wird das Nukleinsäuregemisch in 0,01 m Phosphatpuffer an das Material adsorbiert und mit einem linearen Salzgradienten desorbiert. Die Art des Salzes hängt von der Art der Nukleinsäuren ab. Während für die Desorption von Ribonukleinsäuren, einschliesslich der Transfer-Ribonukleinsäuren, Natriumchlorid ausreicht, ist für die basenspezifische Elution von DNA von Acryl-malachitgrünhalti-gen Adsorbentien Perchlorat erforderlich.
Es hat sich gezeigt, dass es zur Herstellung des Trägermaterials auch möglich ist, von unlöslichen Materialien mit Hydroxy- bzw. Aminogruppen auszugehen, die in Perlform vorliegen, wie z.B. Aminoalkylsepharose, mikrakristalline Cellulose, vernetztes Hydroxyäthylmethacrylat oder Epoxy-propylacrylat. Bei diesen Trägern können die zur nachträglichen Pfropfung notwendigen Acrylgruppen durch Umsetzung mit Acryloylchlorid eingeführt werden. Es kann so eine ähnlich hohe Beladung mit Farbstoff erzielt werden wie bei der Pfropfung aus Acrylamidscherben.
Die genannten Adsorbentien können zur Auftrennung von Nukleinsäuren durch Zweiphasen-Affinitätsverteilung, durch Zweiphasenverteilungschromatographie, durch Gelelektrophorese und insbesondere durch Affinitätschromatographie verwendet werden. Mit Vorteil lassen sich diese Adsorbentien für die Auftrennung von Gemischen von ein-strängigen und/oder zweisträngigen Nukleinsäuren, insbesondere von DNA-Gemischen, einsetzen.
Da die erfmdungsgemässen Adsorbentien, die basen-und/oder strukturspezifische Komplexbildner auf der Grundlage von 5-Phenylphenazoniumsalzen tragen, für Guanin-Cytosin-reiche DNA spezifisch wirken und die erfmdungsgemässen Adsorbentien, die basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner auf der Grundlage von Tri-phenylmethanfarbstoffen tragen, für Adenin-Thymin-reiche DNA spezifisch wirken, lassen sich die gewünschten basen-
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und/oder strukturspezifischen bzw. sequenzspezifischen Trennungen von Nukleinsäuregemischen durchführen.
Als vorwiegend strukturspezifische Komplexbildner kommen die zur Intercalation befähigten Verbindungen in Frage. Unter Intercalation versteht man insbesondere eine spezielle Wechselwirkung von Farbstoffmolekülen mit DNA, wobei sich das Farbstoffmolekül zwischen zwei benachbarte Basenpaare der DNA-Doppelhelix schiebt. Welche Substanzen von der Struktur her intercalierungsfähig sind, ist dem Fachmann geläufig. Es handelt sich um planare, elektronenreiche Chromophore. Es sind vor allem die Reste von planaren polycyclischen, wie z. B. bi-, tri- oder tetra-cyclischen, kondensierten Ringsystemen, welche Heteroato-me wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel enthalten können, zu verstehen.
Der Effekt kann erhöht sein, wenn, wie z.B. im Fall des Ethidiumbromids und des 9-(Acryloylaminoäthyl-amino)-2-methoxy-6-chlor-acridins, eine Aminogruppe am Ringsystem vorhanden ist, die eine Bindung an die Phosphatgruppen der DNA ermöglicht. Es ist für den Fachmann leicht, entsprechend brauchbare Verbindungen einzusetzen, wie beispielsweise Acridine, Benzacridine, Phenanthrene, Phen-antridine, Pyridoindole, Naphthaline, Naphthothiophene, Benzothiophene, Thianthrene, Xanthine, Phenoxanthine, Chinoline, Chinoxaline, Phenanthroline, Phenothiazine, Phenoxazine, Phthalazine usw.
Acridin-Derivate, beispielsweise das 9-(Acryloylamino-äthyl-amino)-2-methoxy-6-chlor-acridin, oder Phenanthri-din-Derivate, beispielsweise Ethidiumbromid (5-Äthyl-3,8-diamino-6-phenyl-phenanthridiumbromid), trennen nach ihrer Kupplung an Bisacrylamidpartikel basenunspezifisch doppelsträngige DNA von supercoiled DNA (Elutionsdia-gramm Fig. 7). Dies ist sehr wichtig für eine einfache Abtrennung von Plasmid- und Viren-DNAs aus Zellaufschlüssen. Die Säule ersetzt den aufwendigen Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Gradienten. Diese Trennung ist auch mit der Acryloylaminophenylneutralrot-Säule möglich, da beide Farbstoffe mit der DNA einen Komplex ähnlicher Struktur (Intercalation-Komplex) bilden. Das Acryloylaminophenyl-neutralrot trennt sowohl struktur- als auch basenspezifisch. Je nach dem anstehenden Trennproblem ist daher eine Reihe von Variationen bezüglich der Zusammensetzung des Adsorbens möglich.
Da die basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner über eine stabile kovalente Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung gebunden sind, können die erfmdungsgemässen Adsorbentien auch bei extremeren pH-Werten eingesetzt werden, mit Detergentien gewaschen und mit Salzlösungen regeneriert werden. Weiterhin ist der Einbau mehrerer verschiedener basen- und/oder strukturspezifischer Komplexbildner oder Monomerer möglich, so dass Adsorbentien gebildet werden können, die zur Auftrennung von Transfer-Ribonukleinsäuren genutzt werden können. Die Kettenlänge der aufgepfropften Copolymeren und damit die Länge der Ketten zwischen dem polymeren Trägermaterial und dem basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner kann in üblicher Weise durch Mercaptoäthanol gesteuert werden.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung weiter anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 ein Schema für die Herstellung erfmdungsgemäss besonders bevorzugter Adsorbentien durch die beanspruchte zweistufige Polymerisation;
Fig. 2 das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten, bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren unter Verwendung eines erfmdungsgemässen Adsorbens;
Fig. 3 das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten, bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren, das unter Verwendung eines weiteren erfmdungsgemässen Adsorbens erhalten wurde;
5 Fig. 4 das Elutionsdiagramm eines EcoRI-Hydrolysats von A.-Phagen-Desoxyribonukleinsäure, das unter Verwendung eines erfmdungsgemässen Adsorbens erhalten wurde;
Fig. 5 das Elutionsdiagramm, das unter Verwendung eines erfmdungsgemässen Adsorbens bei der Trennung eines io DNA-RNA-Gemisches aus einem Aufschluss von M.luteus erhalten wurde; und
Fig. 6 das Elutionsdiagramm eines Gemisches aus vier verschiedenen Transfer-Ribonukleinsäuren aus Hefe, das mit einem erfmdungsgemässen Adsorbens erhalten wurde. i5 Fig. 7 das Elutionsdiagramm für die Trennung von supercoiled und linearer DNA.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
20 Beispiel 1
A) Herstellung des Poly-bisacrylamid-Trägermaterials.
Man suspendiert 50 g N,N'-Methylenbisacrylamid in
100 ml Methanol in einem hohen 1-Liter-Polyäthylenbecher-glas und versetzt mit 200 ml kochendem bidestilliertem Was-25 ser. Während des Rührens der Mischung mit dem Magnet-rührer geht das Bisacrylamid vollständig in Lösung. Zu der auf 60 °C abgekühlten und intensiv gerührten Lösung pipettiert man zunächst 1 ml N,N,N',N'-Tetramethyläthylendi-amin und gibt dann in einem Guss eine Lösung von 0,2 g 30 Ammoniumperoxydisulphat in 5 ml Wasser zu. Sofort nach dem Durchmischen stellt man den Rührer ab. Die Lösung trübt sich nach wenigen Sekunden und erstarrt unter Erhitzen zu einem farblosen Block. Die Polymerisation wird nach etwa 1 Minute abgebrochen, indem der Polymerblock mit ei-35 nem grossen Spatel rasch grob zerkleinert wird. Die Bruchstücke werden in einem 2-Liter-Polyäthylenbecherglas in 11 Methanol suspendiert und zu einem körnigen Brei verrieben. Zur weiteren Homogenisierung der Partikel reibt man den Brei nacheinander durch Siebe mit abnehmender Maschen-40 grosse (1 mm x 1 mm, 0,5 mm x 0,5 mm und 0,25 mm x 0,25 mm). Die entstandenen Scherben lässt man sedimentie-ren, worauf man den milchig-trüben Überstand abdekantiert. Diese Prozedur wird mehrfach wiederholt, und zwar zunächst mit Methanol, dann mit einer Methanol/Wasser-45 Mischung, anschliessend mit einer l%igen Essigsäurelösung und schliesslich erneut mit destilliertem Wasser. Die erhaltenen Polybisacrylamidteilchen werden in wässriger Lösung gelagert und können jederzeit für die im folgenden beschriebene Pfropfcopolymerisation verwendet werden.
so Aus 300 ml der Polymerisationslösung erhält man etwa 300 ml abgesetzte Polybisacrylamidteilchen.
B) Aufpfropfen eines Copolymeren aus Acrylamid und Acryl-phenylneutralrot auf das in der Stufe A erhaltene Polybisacrylamid.
55 Man suspendiert 60 ml der in der Stufe A erhaltenen, abgesetzten Polybisacrylamidteilchen in einer Flasche mit Schraubverschluss in 20 ml destilliertem Wasser. In dieser Suspension löst man 5 g Acrylamid und 10,3 mg Acrylphe-nylneutralrot-chlorid, wozu man die Suspension in der Fla-6o sehe vorsichtig schüttelt, bis sich der Farbstoff vollständig gelöst hat. Die Copolymerisation wird dann durch Zugabe von 0,050 ml Mercaptoäthanol zur Einstellung des Polymerisationsgrades und 1 ml einer Natriumperoxidlösung (0,8 g Natriumperoxid in 100 ml Im Natriumacetatpuffer mit ei-65 nem pH-Wert von 5,5) als Katalysator gestartet. Die gebildete Suspension wird sofort noch während 5 Minuten mit Stickstoff begast und dann unter Luftabschluss bei Raumtemperatur gehalten. Nach etwa 30 Minuten hat sich die
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Reaktionsmischung deutlich erwärmt, und nach ca. 2 Stunden ist die Polymerisation im wesentlichen beendet. Man lässt noch einige Stunden stehen, bevor man die viskose Suspension in eine Nutsche überführt. Man saugt die viskose, tiefgefärbte Lösung ab und wäscht die auf der Nutsche zurückbleibenden, stark gefärbten Teilchen gründlich mit Wasser, bis die Waschlösung auch bei Verwendung einer 1 %igen Essigsäurelösung farblos bleibt. Nach einer abschliessenden kontinuierlichen Spülung mit einem 0,01 m Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 über Nacht kann man das Material für die Affinitätschromatographie von Nukleinsäuren verwenden.
Die Bestimmung der Ausbeute erfolgt bei Acrylamid durch eine 14C-Markiening und bei dem Farbstoff über die optische Dichte. Die Ausbeuten sind die folgenden:
Farbstoff: Einbau in das Copolymere
(gebunden und nicht gebunden) 60,5% Acrylamid: Einbau in das Copolymere
(gebunden und nicht gebunden) 49,2% Farbstoff: Einbau in das gebundene Copolymere, bezogen auf die Stimme 51,0% Acrylamid: Einbau in das gebundene Copolymere, bezogen auf die Summe 57,0%.
Es ist festzustellen, dass das molare Ausgangsverhältnis von Farbstoff zu Acrylamid (1:3000) auch in den Copolymeren erhalten bleibt. Da der mittlere Polymerisationsgrad des Copolymeren zu 200 bis 300 ermittelt wurde, kann davon ausgegangen werden, dass die Copolymerketten jeweils nur ein Farbstoffmolekül pro Kette tragen.
Das oben beschriebene Verfahren wird schematisch durch die Fig. 1 erläutert.
Beispiel 2
Auftrennung von Nukleinsäuregemischen durch Affinitätschromatographie an erfmdungsgemässen Adsorbentien.
Wie die in den Fig. 2 bis 6 dargestellten Elutionsdiagram-me zeigen, ist die Anwendungsmöglichkeit der erfmdungsgemässen Adsorbentien auf dem Gebiet der Nukleinsäurefrak-tionierung sehr vielseitig. Je nach der Basenspezifltät des gebundenen Farbstoffs werden Gemische von doppelsträngi-gen Nukleinsäuren entsprechend ihrer Basenzusammensetzung aufgetrennt.
So zeigt die Fig. 2 das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 700 000 D mit unterschiedlicher Basenzusammensetzung. Hierzu wurde eine Säule mit den Abmessungen 16 cm x 1,5 cm verwendet, die als Adsorbens auf Polybisacrylamidteilchen aufgepfropfte Acrylmalachitgrün-acrylamid-Copolymere enthält. Die eingesetzte Desoxyribonukleinsäuremenge beträgt ca. 1 mg.
Die Fig. 3 zeigt das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 700 000 D, die eine unterschiedliche Basenzusammensetzung aufweisen. Zur Elution von 1 mg der Nukleinsäuremischung wurde eine Säule mit den Abmessungen 15,2 cm x 1,5 cm verwendet, die als Adsorbens Bisacrylamidteilchen enthält, auf die Acryl-phenylneutralrot-acrylamid-Copolymere aufgepfropft sind.
Unter Verwendung der erfmdungsgemässen Adsorbentien können auch DNA-Fragmente, die durch Einwirkung von Restriktionsendonukleasen gewonnen wurden, fraktioniert werden. Dies ist in der Fig. 4 gezeigt, die das Elutionsdiagramm eines Eco-RI-Hydrolysats von X-Phagen-Desoxy-ribonukleinsäure wiedergibt, das in einer Menge von 0,5 mg unter Verwendung einer Säule mit den Abmessungen 15,8 cm x 1,5 cm getrennt wurde, die als Adsorbens Polybisacrylamidteilchen enthält, auf die Acrylmalachitgrün-acryl-amid-Copolymere aufgepfropft sind.
Die Bezeichnung der DNA-Fragmente im eingeschobenen Bild einer gelelektrophoretischen Trennung für die einzelnen Fraktionen im Vergleich zum Ausgangsmaterial entspricht der Bezeichnung in der Arbeit von Thomas und Da-s vis im J. Mol. Biol. 91, 315-328 (1975).
Auch die Abtrennung von Ribonukleinsäuren von den Desoxyribonukleinsäuren des gleichen Organismus gelingt mit den erfmdungsgemässen Adsorbentien glatt, wie aus der Fig. 5 zu ersehen ist. In dieser Fig. 5 ist das Elutionsdia-io gramm eines DNA-RNA-Gemisches aus einem Aufschluss von M.luteus (72% G+C) gezeigt, wobei das Gemisch in einer Menge von 1 mg mit Hilfe einer Säule mit den Abmessungen 16,2 cm x 1,5 cm getrennt wurde, welche Säule mit Polybisacrylamidteilchen beschickt ist, auf die Acrylmala-15 chitgrün-Copolymere aufgepfropft sind.
Die Fig. 6 zeigt das Elutionsdiagramm für ein Gemisch aus vier verschiedenen, aus Hefe gewonnenen Transfer-Ribonukleinsäuren. Bei dem in einer Menge von 1,5 mg getrennten Gemisch handelt es sich um ein Gemisch aus t-20 RNAphe, t-RNALys, t-RNAGlu und t-RNAGly. Für die Affinitätschromatographie wurde eine Säule mit den Abmessungen 16 cm x 1,5 cm verwendet, die mit Polybisacrylamidteilchen beschickt wurde, auf die Acrylphenylneutralrot-acryl-amid-Copolymere aufgepfropft sind.
25 Die Fig. 7 zeigt das Elutionsdiagramm für die Trennung von supercoiled und linearer DNA. Für die Affinitätschromatographie wurden Polybisacrylamidteilchen verwendet, wobei 9-(Acryloylamino-äthyl-amino)-2-methoxy-6-chlor-acridin-Teilchen aufgepfropft sind.
30 Bei der Verwendung der erfmdungsgemässen Adsorbentien zur Auftrennung von Nukleinsäuregemischen durch Affinitätschromatographie, wie sie oben beschrieben wurde, verwendet man als Elutionsmittel wässrige Salz-Konzentrationsgradienten, wozu man als Salze vorzugsweise Alkalime-35 tallsalze, wie Natriumchlorid, Natriumperchlorat, Li-thiumperchlorat etc. verwendet. In gewissen Fällen können auch Puffer verwendet werden, beispielsweise Phosphatpuffer, wobei man für Adsorptionsmittel, die als basenspezifischen Komplexbildner den Rest von Malachitgrün enthal-40 ten, einen schwach sauren Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6 verwendet, beispielsweise einen 0,01 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6.
Die für die Erzielung optimalen Salzgradienten, ihre Bestandteile, Konzentrationen, pH-Werte und die dafür ver-45 wendeten Puffer können jedoch vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden.
Zusammenfassend ist also festzustellen, dass die erfmdungsgemässen Adsorbentien hervorragend geeignet sind für die affinitätsspezifische Trennung von makromolekularen so Stoffen und insbesondere Biopolymeren, wie Nukleinsäuregemischen: Diese Adsorbentien lassen sich in einfacher Weise herstellen und in Bezug auf ihre Basenspezifltät gezielt einstellen.
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Beispiel 3
Herstellung von Acryloylamino-malachitgrün la) 15,1 g (0,1 Mol) 4-Nitro-benzaldehyd und 36,3 g = 38 ml (0,3 Mol) N,N-Dimethylanilin und 40,5 g Zinkchlorid 60 (wasserfrei) werden gemischt und auf 100 °C Badtemperatur erhitzt. Die anfangs leicht bewegliche Mischung wird im Laufe der Reaktionszeit zu einer festen, grünen Masse, die nicht mehr rührbar ist. Nach 5 Stunden Reaktionszeit lässt man Abkühlen. Das Produkt wird in 150 ml Aceton aufge-65 nommen, wobei nach einiger Zeit unter Rühren das Produkt gelöst und Zinksalz ausgeschieden wird. Das unlösliche Salz wird abgesaugt, mit Aceton gewaschen und das Filtrat mit so viel Wasser versetzt, bis Kristallisation eintritt. Das Kri-
stallisat wird abgesaugt, mit Wasser, Isopropanol und Äther gewaschen.
Ausbeute: 28,7 g (76,6% d.Th.); Fp. 168 °C (die Substanz ist lichtempfindlich).
lb) 3,75 g (0,01 Mol) der nach la) erhaltenen Nitroverbindung werden in 200 ml Eisessig (99%) und 20 ml Wasser gelöst und mit 4 g Zinkchlorid versetzt. Anschliessend werden unter Rühren und Kühlen bei Raumtemperatur (20-30 °C) 20 g Zinkstaub portionsweise zugegeben. Es wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, danach das überschüssige Zink abgesaugt und mit Eisessig gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum bei 50 °C eingedampft, der Rückstand in 150 ml Chloroform und 100 ml Wasser gelöst und getrennt, anschliessend wird die Chloroform-Phase mit 80 ml 2n-Natriumcarbonat-Lösung und 100 ml Wasser geschüttelt. Die Chloroform-Phase wird abgetrennt und mit Natriumsulfat getrocknet und filtriert, so dann auf etwa 100 ml im Vakuum bei 50 °C eingeengt und direkt weiter umgesetzt (schwach violette Lösung).
lc) Die erhaltenen 100 ml Chloroform-Lösung der Aminoverbindung werden mit 50 ml Methanol versetzt. Es werden 10 g Natriumcarbonat (wasserfrei) und eine Spatelspitze 1,3-Dinitrobenzol zugegeben und anschliessend unter Rühren und Eiskühlung (0 °C-5 °C) 1,81 g = 1,65 ml Acryloylchlorid (zweifache Molmenge) tropfenweise zugegeben. Die Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, danach wird das Natriumcarbonat abgesaugt und das Filtrat im Vakuum bei 35- 40 °C eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml Chloroform und 50 ml Wasser aufgenommen und geschüttelt, die Chloroform-Phase wird abgetrennt, mit 50 ml Wasser nachextrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 35- 40 °C eingedampft. Der ölige, grünliche Rückstand wird mit 20 ml Isopropanol angerieben und zur Kristallisation kühlgestellt. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Isopropanol und Äther gewaschen und im Exikkator getrocknet.
Ausbeute über die Stufen lb und lc: 2,9 g (72,7% d.Th.); Fp. 175 °C
C, H, N-Analyse: ber. C78,2 H 7,27 N 10,52 gef. C75,9 H 7,21 N 9,999 NMR-Spektrum(Hexadeuterodimethylsulfoxid): CH3-(N-Methyl) S 2,83 PPM, =CH-(Acryl) Q 5,7 PPM, CH2 = (Acryl) P 6,3 PPM, aromatische Protonen zwischen 6,5 und 7,5 PPM.
ld) 250 mg (0,001 Mol) Chloranil werden in 15 ml Tetra-hydrofuran gelöst und mit 0,4 g (0,001 Mol) Acryloylverbin-dung (lc) versetzt. Die Lösung wird sofort blau und nach ca. 2 Stunden Stehen bei Raumtemperatur tritt Kristallisation ein. Es wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, danach das Kristallisat abgesaugt, mit Tetrahydrofuran und Äther gewaschen und im Exikkator getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird wieder in Wasser aufgenommen, mit HCl neutralisiert und dann mit Essigester ausgeschüttelt. Das saubere Produkt wird durch Zugabe von Natriumchlorid aus der wässrigen Lösung ausgefallt.
Ausbeute: 0,335 g (84,2% d.Th.)
Im NMR-Spektrum von ld) ist im Vergleich zu lc) eine Verschiebung des N-Methyl-protonsignals auf 3,3 PPM zu beobachten.
Beispiel 4
Herstellung von Acryloylaminophenylneutralrot la) 6,9 g (0,05 Mol) 4-Nitro-anilin werden in 150 ml Te-trahydrofuran/Chloroform 1:1 gelöst, mit einer Spatelspitze 1,3-Dinitrobenzol und 8 ml Triäthylamin versetzt. Unter Rühren werden bei 10-20 °C langsam 9 ml (0,1 Mol) Acryloylchlorid zugetropft. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei Triäthylammoniumchlorid
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auskristallisiert. Dann wird im Vakuum bei 50 °C das Tetra-hydrofuran-Chloroform-Gemisch abgedampft, der Rückstand mit Wasser angerieben, abgesaugt und mit Wasser, Isopropanol und Äther gewaschen. Das Produkt wird im Vakuum bei 50 °C getrocknet.
lb) 2,5 g Acryloylverbindung 2 a werden in 60 ml Tetrahydrofuran unter Rühren bei 50 °C gelöst und mit 60 ml Eisessig (99%) verdünnt und auf 30 °C abgekühlt. Anschliessend werden portionsweise 10 g Zinkstaub zugegeben, wobei die Temperatur unter Eiskühlung auf 35-40 °C ansteigt. Danach wird 10 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt, das überschüssige Zink abgesaugt und mit Eisessig gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum bei 45 °C eingedampft. Der ölige Eindampfrückstand ist chromatographisch praktisch rein und wird so zur nächsten Reaktion eingesetzt.
lc) Eine Lösung von 4,2 g (0,02 Mol) N,N-Dimethyl-p-phenylendiammoniumdichlorid und 2,88 g (0,02 Mol) o-Toluidiniumchlorid in 400 ml HzO werden langsam unter Rühren bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 12 g Na-triumchromat (0,04 Mol) in 100 ml Wasser versetzt. Das ausgeschiedene grüne Produkt wird nach 15 Minuten abgesaugt, dreimal mit Wasser gewaschen, wobei die Waschlösung grün bleibt, der Niederschlag wird dann sofort weiterverarbeitet, indem er in einer kleineren Menge Wasser suspendiert und homogenisiert wird. Die homogene Suspension wird mit Wasser auf 1,6 Liter verdünnt. Nach Zugabe von 1,15 x 0,02 Mol N-Acryloyl-p-phenylen-diammoniumacetat in 100 ml Wasser wird die Reaktionsmischung mit 130 ml 3 M Natrium-acetat-Lösung auf pH 4,9 gestellt. Anschliessend wird die Mischung unter Rühren zum Sieden erhitzt. Die Lösung färbt sich dabei zunächst tiefblau und dann bei Sieden dunkelviolett (zur Vervollständigung der Reaktion 5 Minuten kochen lassen). Anschliessend wird die siedend heisse Lösung über eine Nutsche abgesaugt, das Filtrat (ca. 21) mit 240 g Natriumchlorid auf 2 m Lösung eingestellt und über Nacht im Kühlraum stehengelassen. Das ausgefallene Kristallisat wird abgesaugt und im Exikkator getrocknet (es darf nicht mit Wasser gewaschen werden, da die Substanz leicht in Wasser löslich ist).
Ausbeute: 2,4 g Rohprodukt.
Zur weiteren Reinigung werden 1,3 g des Rohprodukts in 25 ml Methanol und 0,1 M Natriumchlorid (4:1) gelöst und auf eine Kieselgel 60-Säule (4 x 95 cm) aufgetragen. Es wird dann mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert (Fraktionsvolumen = 20 ml). Fraktionen 22-55 werden vereinigt und im Vakuum auf ca. 15 ml eingeengt. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit wenig 0,1 M Natriumchlorid gewaschen und im Exikkator getrocknet.
Ausbeute: 0,665 g chromatographisch reiner Farbstoff.
Beispiel 5
Herstellung von 9-(Acryloylamino-äthylamino)-3-chlor-
7-methoxy-acridin 854 mg 3,9-Dichloro-7-methoxy-acridin werden mit 1 ml Äthylendiamin und 7,7 g Phenol 30 Min. lang im Ölbad auf 60 °C erhitzt. Die Schmelze wird in 200 ml Chloroform und 150 ml Wasser aufgenommen, auf pH 4 mit Essigsäure eingestellt und äquilibriert. Die organische Phase wird 3-4 mal mit 0,1 m Natriumacetatpuffer nachextrahiert und dann verworfen.
Die wässrigen Extrakte werden auf pH 9,5 mit Sodalösung eingestellt, mit Chloroform-n-Butanol (20:1) extrahiert, die organische Phase über Siliconpapier filtriert und im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird in 0,1 m Natriumacetatpuffer gelöst, Reste von dimerisiertem Produkt abfiltriert und die Lösung auf pH 10 eingestellt. Nach 1 Std. bei Zimmertemperatur wird das Präzipitat abfiltriert,
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mit wenig verdünnter Ammoniak-Lösung (4 °C) gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 50-80% d.Th.
206 mg der erhaltenen Aminoverbindung werden in 25 ml Chloroform in der Wärme gelöst und nach Abkühlen mit 0,3 ml Acrylchlorid versetzt. Die Lösung färbt sich sofort dunkler. Nach einigen Minuten scheidet sich das Acroylderivat ab. Nach dem Absaugen und Waschen mit etwas Chloroform erhält man 122 mg (50% d.Th.) 9-Acryloyl-amino-äthylamino)-3-chlor-7-methoxy-acridin in chromatographisch reiner Form.
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S
7 Blatt Zeichnungen

Claims (21)

  1. 651 222
    2
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren auf der Basis eines polymeren Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, dass an das polymere Trägermaterial ein basen- und/oder strukturspezifischer Komplexbildner für Nukleinsäuren direkt oder über einen polymeren «Spacer» kovalent gebunden ist.
  2. 2. Adsorbens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein kleinporiges, wenig komprimierbares, polymeres Trägermaterial, auf das ein Copolymeres aus mindestens zwei misch-polymerisierbaren Monomeren als polymerer «Spacer» aufgepfropft ist, von denen eines aus dem basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren besteht.
  3. 3. Adsorbens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren den Rest eines Farbstoffes der folgenden allgemeinen Formel I oder II enthält
    R2
    m sches, kondensiertes Ringsystem, welches Heteroatome, z.B. Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, enthalten kann, trägt.
  4. 4. Adsorbens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der basenspezifische und/oder strukturspezifi-
    5 sehe Komplexbildner den Rest von Malachitgrün, von Kristallviolett, von Methylgrün, von Auramin, von 2-(4-Hy-droxyphenyl)-5-{5-[l-methylpiperazin-4-yl]-benzimidazol-2-yl}-benzimidazol, von 2,7-Di-t-butyl-3,6-diaminoacridin, von 2,7-Di-t-butyl-3,6-diamino-l O-methylacridiniumsalz, io von Diamidino-phenyl-indol, von 1-Methyl-N(5)phe-nylneutralrot, von Ethidiumbromid oder von Acridin enthält oder aus 9-(Acryloylamino-äthylamino)-2-methoxy-6-chloracridin besteht.
  5. 5. Adsorbens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, 15 dass der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner einen Rest der folgenden Formel enthält
    20
    (ch3)2n
    Cl
  6. 6. Adsorbens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der basen- und/oder strukturspezifische Kom-30 plexbildner einen Rest der folgenden Formel enthält
    Xu?
    ©i vi PI *
    nr
    *e
    35
    (ii)
    in welchen allgemeinen Formeln
    X für eine CH-Gruppe oder ein Stickstoffatom und Y für ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe oder eine Gruppe der Formel
    N
    (r1)
    steht,
    die R1 unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Methylgruppen bedeuten,
    R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R3 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R4 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und A~ für ein Anion, z.B. ein Chloridanion, ein Perchlorat-anion oder ein Oxalatanion,
    steht,
    oder den Rest eines intercalierenden Farbstoffs, enthaltend ein planares polycyclisches, z.B. bi-, tri- oder tetracycli-
    45
    n(ch3)2
  7. 7. Adsorbens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Trägermaterial ein Polymeres oder Copolymeres von Monomeren ist,
    so die neben der zur Bildung des Polymeren oder Copolymeren erforderlichen funktionellen Gruppe mindestens eine weitere funktionelle Gruppe aufweisen, über die der polymere «Spacer» mit dem basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren kovalent gebunden werden
    55 kann.
  8. 8. Adsorbens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Trägermaterial ein Polybisacrylamid ist, an das der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren in Gegenwart eines Überschusses
    6o eines weiteren copolymerisierbaren Monomeren durch Co-polymerisation aufgepfropft ist, oder das Trägermaterial aminiertes Epoxypropylmethacrylat ist.
  9. 9. Adsorbens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der eine freie Doppelbindung tragende basen- und/oder
    65 strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren in Gegenwart von Acrylamid durch Copolymerisation über die freien Doppelbindungen des Polybisacrylamids kovalent an dieses polymere Trägermaterial gebunden ist.
  10. 10. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial ein vernetz-tes hydrophiles Polymeres mit Hydroxy- oder Aminogrup-pen, in die nachträglich Acryloyl-Gruppen eingeführt sind, wie z.B. Polysaccharide oder Aminoalkyl-Polysaccharide,
    ist.
  11. 11. Verfahren zur Herstellung des Adsorbens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst durch Polymerisation oder Polykondensation mindestens eines Monomeren, das zusätzlich eine funktionelle Gruppe aufweist, über die der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren direkt oder über einen polymeren «Spacer» gebunden werden kann, das polymere Trägermaterial bildet und dann den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren entweder direkt oder durch Copolymerisation in Gegenwart mindestens eines weiteren Monomeren als Copolymeres aufpfropft.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das polymere Trägermaterial durch Perlpolymerisation herstellt.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das polymere Trägermaterial nach seiner Bildung auf die gewünschte Teilchengrösse zerkleinert.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Herstellung des Adsorbens nach einem der Ansprüche 2 bis 9.
  15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man den eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren in Gegenwart
    3 651222
    eines Überschusses eines weiteren copolymerisierbaren Monomeren als Copolymeres auf Polybisacrylamid aufpfropft.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pfropfcopolymerisation in Wasser oder in
    5 einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Polymerisationskatalysators durchführt.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als den eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden basen- und/oder strukturspezifischen io Komplexbildner für Nukleinsäuren Acryl-phenylneutralrot oder Acryl-malachitgrün und als weiteres copolymerisierba-res Monomeres Acrylamid verwendet.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Copolymeres aus Acrylamid und Acryl-
    i5 phenylneutralrot oder Acryl-malachitgrün mit einem Polymerisationsgrad von 200 bis 300 aufpfropft.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man den eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden, basen- und/oder strukturspezifischen Kom-
    20 plexbildner für Nukleinsäuren und das weitere copolymerisierbare Monomere in einem Gewichtsverhältnis von 1:100 bis 1:5000 einsetzt.
  20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem Verhältnis von etwa 1:3000 arbeitet.
    25 21. Verwendung der Adsorbentien nach Anspruch 1 zur affinitätsspezifischen Auftrennung von Nukleinsäuren durch Affinitätschromatographie.
  21. 22. Verwendung nach Anspruch 21 von Adsorbentien nach einem der Ansprüche 2 bis 10.
    30 23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 zur Auftrennung von Gemischen einsträngiger und/oder zweisträngiger Nukleinsäuren, insbesondere von DNA-Gemischen.
CH2106/78A 1977-03-02 1978-02-27 Adsorbens fuer die affinitaetsspezifische trennung von nukleinsaeuren. CH651222A5 (de)

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