CH646442A5

CH646442A5 - MICROBIAL METHOD FOR PRODUCING CHOLANIC ACID DERIVATIVES AND MICROORGANISMS USED IN SUCH A METHOD.

Info

Publication number: CH646442A5
Application number: CH628980A
Authority: CH
Inventors: Masao Tsuji; Yoshihiro Ichihara
Original assignee: Kuraray Co
Priority date: 1979-08-21
Filing date: 1980-08-20
Publication date: 1984-11-30
Also published as: NL8004741A; IT8068301A0; NL185731C; IT1166482B; DE3031334A1; GB2057447A; GB2057447B; DE3031334C2; FR2463809A1; NL185731B; FR2463809B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrobielles Verfahren für die Herstellung von Cholansäurederivaten der folgenden allgemeinen Formel: The present invention relates to a microbial process for the preparation of cholanic acid derivatives of the following general formula:

(I) (I)

COOR COOR

worin X where X

OH oder =0 'H OH or = 0 'H

und R das Wasserstoffatom, ein Alkalimetall oder ein Erdalkalimetall bedeuten, sowie auf in diesem Verfahren verwendete Mikroorganismen. Insbesondere lassen sich gemäss vorliegender Erfindung die Cholansäurederivate der obigen allgemeinen Formel I in hoher Ausbeute innerhalb kurzer Zeit herstellen, indem man einen spezifischen Mikroorganismus in einem Cholsäure oder ein Salz davon als Substrat enthaltenden Kulturmedium züchtet. and R represents the hydrogen atom, an alkali metal or an alkaline earth metal, and microorganisms used in this method. In particular, according to the present invention, the cholanic acid derivatives of the general formula I above can be produced in high yield in a short time by culturing a specific microorganism in a culture medium containing a cholic acid or a salt thereof as a substrate.

3 3rd

646 442 646 442

Die Cholansäurederivate der obigen Formel I, worin X die Gruppierung t--OH The cholanic acid derivatives of the above formula I, wherein X is t - OH

H H

bedeutet, nämlich die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholan-säure oder ein Salz davon, sind wertvolle Zwischenprodukte für die Herstellung eines Gallensteine aufzulösen vermögenden Mittels, nämlich der Chenodesoxycholsäure (CDCA), auch 3ot,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure genannt. Die Cholansäurederivate der obigen Formel I, worin X das Sauerstoffatom bedeutet, nämlich die 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cho-lansäure oder deren Salze sind wertvolle Zwischenprodukte für die Herstellung der Desoxycholsäure, welche ihrerseits wiederum ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Herstellung des Progesterons und von Nebennierenrindensteroiden (Corticosteroiden) darstellt. means, namely 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid or a salt thereof, are valuable intermediates for the preparation of an agent capable of dissolving gallstones, namely chenodeoxycholic acid (CDCA), also 3ot, 7a-dihydroxy- Called 5ß-cholic acid. The cholanoic acid derivatives of formula I above, wherein X represents the oxygen atom, namely 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cho-lanoic acid or its salts, are valuable intermediates for the preparation of deoxycholic acid, which in turn is a valuable starting material for the Production of progesterone and adrenal cortex steroids (corticosteroids).

Bekanntlich lassen sich die Cholansäurederivate der obigen Formel I auf mikrobiellem Wege unter Verwendung von Cholsäure oder einem Salz davon als Substrat herstellen. So beschreiben beispielsweise Hayakawa et al. ein Verfahren zur Herstellung der 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure unter Verwendung des Stammes Streptomyces gelaticus 1164 [The Journal of Biochemistry (Japan), Bd. 44, Nr. 2, Seiten 109 bis 113 (1957); und Proceedings of Japan Academy, Bd. 32, Seiten 519 bis 522 (1956)]. Ferner beschreiben Hasegawa et al. Verfahren zur Herstellung der 3a,7ct-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure unter Verwendung des Stammes Aspergillus cinnamomeus HUT 2026 [Hiroshima Journal of Medicai Science, Bd. 8, Nr. 3, Seiten 277 bis 283 (1959)]. Kikuchi et al. beschreiben ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure unter Verwendung des Stammes Staphylococcus epidermidis H-l [Journal of Biochemistry, Bd. 72, Nr. 1, Seiten 165 bis 172 (1972)]. Ferner beschreiben Hayakawa et al. ein Verfahren zur Herstellung der 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure unter Verwendung des Stammes Streptomyces gelaticus 1164 [Proceedings of Japan Academy, Bd. 32, Seiten 519 bis 522 (1956)]. As is known, the cholanic acid derivatives of the above formula I can be produced microbially using cholic acid or a salt thereof as a substrate. For example, Hayakawa et al. a method for producing 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid using the strain Streptomyces gelaticus 1164 [The Journal of Biochemistry (Japan), Vol. 44, No. 2, pages 109-113 (1957); and Proceedings of Japan Academy, vol. 32, pages 519 to 522 (1956)]. Furthermore Hasegawa et al. Process for the preparation of 3a, 7ct-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid using the strain Aspergillus cinnamomeus HUT 2026 [Hiroshima Journal of Medicai Science, Vol. 8, No. 3, pages 277 to 283 (1959)]. Kikuchi et al. also describe a process for the preparation of 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid using the Staphylococcus epidermidis H-1 strain [Journal of Biochemistry, Vol. 72, No. 1, pages 165 to 172 (1972)]. Furthermore, Hayakawa et al. a method of producing 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid using the strain Streptomyces gelaticus 1164 [Proceedings of Japan Academy, vol. 32, pages 519 to 522 (1956)].

Diese Verfahren bedingen aber eine niedrige Konzentration an Cholsäure als Substrat in einem Kulturmedium, und zwar von nicht mehr als 10 g/1. Aufgrund von Versuchen der Patentinhaberin konnte festgestellt werden, dass die Cholsäure tatsächlich in einer geringen Konzentration beim Arbeiten nach den bekannten mikrobiellen Verfahren für die Herstellung von Cholansäurederivaten zur Anwendung gelangen muss, da die zu verwendenden Mikroorganismen bei einer Konzentration von nicht weniger als 20 g/1 Cholsäure kaum wachsen oder überhaupt nicht wachsen. Hinzu kommt, dass diese bekannten Methoden eine allzu lange Züchtungsdauer erfordern. Daraus ergibt sich der Wunsch zur Entwicklung eines Verfahrens für die Herstellung von Cholansäurederivaten, welches innerhalb einer kurzen Zeitdauer die gewünschten Produkte in hoher Ausbeute liefert. Es wurde nun gefunden, dass gewisse Mikroorganismen, die zu den Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium und Corynebacterium gehören, in einem Cholsäure oder ein Salz davon als Substrat enthaltenden Medium in einer stark gestreuten Konzentration zu wachsen fähig sind und die besagten Cholansäurederivate in hoher Ausbeute innerhalb einer kurzen Zeitdauer zu liefern vermögen. However, these methods require a low concentration of cholic acid as a substrate in a culture medium, namely no more than 10 g / l. Based on experiments by the patent owner, it was found that the cholic acid actually has to be used in a low concentration when working according to the known microbial processes for the production of cholanic acid derivatives, since the microorganisms to be used are at a concentration of not less than 20 g / l Cholic acid hardly grow or not grow at all. In addition, these known methods require too long a breeding period. This results in the desire to develop a process for the production of cholanic acid derivatives which delivers the desired products in high yield within a short period of time. It has now been found that certain microorganisms belonging to the genera Arthrobacter, Brevibacterium and Corynebacterium are capable of growing in a medium in a highly dispersed concentration in a medium containing cholic acid or a salt thereof, and the said cholanic acid derivatives in high yield within a short time Time to deliver.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines mikrobiellen Verfahrens für die Herstellung von Cholansäurederivaten der obigen allgemeinen Formel I, dank welchem man diese Verbindungen in hoher Ausbeute innerhalb kurzer Zeit erhält. Als Mittel zur Ausführung dieses Verfahrens eignen sich gewisse neue Mikroorganismen, welche in einem Cholsäure oder ein Salz davon als Substrat enthaltenden Medium zu wachsen fähig sind. Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehende Beschreibung erläutert. An object of the present invention is to provide a microbial process for the preparation of cholanic acid derivatives of the general formula I above, thanks to which these compounds can be obtained in high yield in a short time. Certain new microorganisms which are capable of growing in a medium containing cholic acid or a salt thereof as a substrate are suitable as means for carrying out this method. The present invention is illustrated by the description below.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein mikrobielles Verfahren für die Herstellung von Cholansäurederivaten der obigen allgemeinen Formel I, welches Verfahren darin besteht, dass man einen Mikroorganismus, welcher unter Bildung der Cholansäurederivate in einem Cholsäure oder ein Salz davon als Substrat enthaltenden Medium zu wachsen fähig ist, züchtet, wobei man als Mikroorganismen solche der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium und Corynebacterium einsetzt und die Züchtung in einem das Substrat enthaltenden Kulturmedium vornimmt und daraus das entstandene Derivat gewinnt. The present invention therefore relates to a microbial process for the preparation of cholanic acid derivatives of the general formula I above, which process consists in that a microorganism capable of growing to form the cholanic acid derivatives in a medium containing cholic acid or a salt thereof as a substrate is, where the microorganisms used are those of the genera Arthrobacter, Brevibacterium and Corynebacterium and cultivation is carried out in a culture medium containing the substrate and the resulting derivative is obtained therefrom.

Die für die vorliegende Erfindung in Frage kommenden Mikroorganismen sind aus dem Boden isolierte Mikroorganismen und Mutanten davon, welche man durch natürliche Mutation oder beispielsweise durch Röntgenstrahlenbehand-lung, Ultraviolettbestrahlung, mit Hilfe eines mutationsauslö-sen'den Agens, wie z.B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-din, 4-Nitrochinolin-N-oxid, Acriflavin oder Äthylmethansul-fonat, oder einer Kombination davon und dergleichen erhält. The microorganisms in question for the present invention are soil-isolated microorganisms and mutants thereof which can be obtained by natural mutation or, for example, by X-ray treatment, ultraviolet radiation, with the aid of a mutation-triggering agent, such as e.g. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, 4-nitroquinoline N-oxide, acriflavine or ethyl methanesulfonate, or a combination thereof and the like.

Die neuen, in einem Cholsäure oder ein Salz davon enthaltenden Kulturmedium Cholansäurederivate der allgemeinen Formel I zu erzeugen vermögenden Mikroorganismen wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, 8-1 Inage-Igashi 5 chôme, Chiba City, Japan (nachstehend mit FERM bezeichnet) und am 17. Juni 1980 bei American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA (nachstehend mit ATCC bezeichnet) hinterlegt, und zwar der Stamm Arthrobacter CA-35 (FERM-P Nr. 5145; ATCC Nr. 31651), der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P Nr. 5522; ATCC Nr. 31652), der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P Nr. 5523; ATCC Nr. 31653), der Stamm Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P Nr. 5524; ATCC Nr. 31654), der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P Nr. 5525; ATCC Nr. 31655), der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P Nr. 5526; ATCC Nr. 31656), der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P Nr. 5527; ATCC Nr. 31657), der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P Nr. 5528; ATCC Nr. 31658), der Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P Nr. 5529; ATCC Nr. 31659), der Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P Nr. 5530; ATCC Nr. 31660), der Stamm Brevibacterium CA-6 (FERM-P Nr. 5144; ATCC Nr. 31661) und der Stamm Corynebacterium CA-53 (FERM-P Nr. 5532; ATCC Nr. 31662). Die Stämme Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 und Corynebacterium CA-53 sind wilde Stämme, während die übrigen neun Arthrobacter-Stämme Mutanten vom Stamm Arthrobacter CA-35 sind. Der Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12 wird durch Ultraviolettbestrahlung erzeugt. Die übrigen acht Mutanten des Stammes Arthrobacter CA-35 werden durch Behandlung des Ausgangs-Stammes mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten. The new microorganisms capable of producing cholanic acid derivatives of the general formula I in a cholic acid or a salt thereof have been obtained from the Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, 8-1 Inage-Igashi 5 chôme, Chiba City, Japan (hereinafter referred to as FERM) and deposited on June 17, 1980 with American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA (hereinafter referred to as ATCC), namely the strain Arthrobacter CA-35 (FERM-P No. 5145; ATCC No. 31651), the strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522; ATCC No. 31652), the strain Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5523; ATCC No. 31653), the strain Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P No. 5524; ATCC No. 31654), the strain Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P No. 5525; ATCC No. 31655), the strain Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P No. 5526; ATCC No. 31656), the strain Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P No. 5527; ATCC No. 31657) , the stam m Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528; ATCC No. 31658), the strain Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P No. 5529; ATCC No. 31659), the strain Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P No. 5530; ATCC No. 31660), the strain Brevibacterium CA-6 (FERM-P No. 5144; ATCC No. 31661) and the strain Corynebacterium CA-53 (FERM-P No. 5532; ATCC No. 31662). The Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 and Corynebacterium CA-53 strains are wild strains, while the remaining nine Arthrobacter strains are mutants of the Arthrobacter CA-35 strain. The Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain is produced by ultraviolet radiation. The remaining eight mutants of the Arthrobacter CA-35 strain are obtained by treating the parent strain with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine.

Die morphologischen Eigenschaften, die Züchtungseigenschaften und die physiologischen Eigenschaften dieser Stämme finden sich in der folgenden Tabelle 1. Zu Vergleichszwecken finden sich in der folgenden Tabelle 1 auch die Eigenschaften des Stammes Arthrobacter simplex IAM 1660, welcher mit dem Stamm Arthrobacter CA-35 verwandt ist. The morphological properties, the breeding properties and the physiological properties of these strains can be found in Table 1 below. For comparison purposes, Table 1 also shows the properties of the strain Arthrobacter simplex IAM 1660, which is related to the strain Arthrobacter CA-35.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

o5 o5

646442 646442

4 4th

Tabelle 1 Table 1

Eigenschaften properties

Stamm Arthrobacter simplex IAM 1660 Strain Arthrobacter simplex IAM 1660

Stamm Arthrobacter CA-35 Strain Arthrobacter CA-35

Mikroskopische Beobachtung Form Microscopic observation form

Zellteilung Cell division

Grösse (ji) Size (ji)

Flagellen Flagella

Sporen Spores

Gram-Färbung Färbung der säurefesten Bakterien Beobachtung des Züchtungsmediums Bouillon-Agar-Platte Gram staining Staining of the acid-resistant bacteria Observation of the broth agar plate

Gelatine-Stichkultur Gelatin prick culture

Lackmus-Milch Litmus milk

BCP-Milch BCP milk

Stäbchenförmig (manchmal angeschwollen Stäbchenförmig (manchmal aufgebrochen oder gekrümmt) im engl. Sprachgebrauch mit «rods (sometimes swollen or curved)» bezeichnet Rod-shaped (sometimes swollen rod-shaped (sometimes broken or curved) in English usage called "rods (sometimes swollen or curved)"

0,4 bis 0,5 x 1 bis 3 0.4 to 0.5 x 1 to 3

Keine No

Positiv-variabel Keine Positive variable None

Kreisförmig, schwach erhöht, farblos, glatt, glitzernd, transparent (im engl, mit «circular, slightly raised, colorless, smooth, glistening, transparent» bezeichnet) Circular, slightly raised, colorless, smooth, glittering, transparent (in English, called «circular, slightly raised, colorless, smooth, glistening, transparent»)

Taschenförmige Verflüssigung (im engl. Sprachgebrauch mit «saccate liquéfaction» bezeichnet) Bag-shaped liquefaction (referred to as «saccate liquéfaction» in English)

Lackmus reduziert, Milch geklärt (im engl, mit «litmus reduced, milk cleared» bezeichnet) Litmus reduced, milk clarified (called litmus reduced, milk cleared)

Klar werdend, alkalisch werdend (im engl, als «Clearing, becoming alkaline» Becoming clear, becoming alkaline (as «clearing, becoming alkaline»)

bezeichnet) designated)

oder gekrümmt) im engl. Sprachgebrauch mit «rods (sometimes snapped or curved)» bezeichnet or curved) in English. Commonly used with «rods (sometimes snapped or curved)»

Aufbrechend (im engl. Sprachgebrauch mit Breaking up (in English with

«snapping» bezeichnet) Referred to as "snapping")

0,8 bis 0,9 x 1,7 bis 2,2 0.8 to 0.9 x 1.7 to 2.2

Keine No

Positiv positive

Keine No

Kreisförmig, schwach erhöht, gelb bis creme-farbig, glatt, glitzernd, opak (im engl. Sprachgebrauch mit «circular, slightly raised, yellow to cream-colored, smooth, glistening, opaque» bezeichnet) Circular, slightly raised, yellow to cream-colored, smooth, glittering, opaque (in English usage with «circular, slightly raised, yellow to cream-colored, smooth, glistening, opaque»)

Keine Verflüssigung No liquefaction

Lackmus reduziert, Milch unverändert (im engl, mit «litmus reduced, milk unchanged» bezeichnet) Litmus reduced, milk unchanged (called litmus reduced, milk unchanged)

Alkalisch, nicht koaguliert und nicht peptonisiert Alkaline, not coagulated and not peptonized

Nitratreduktion Nitrate reduction

+ +

Denitrifizierung Denitrification

- -

Methylrot-Test Methyl red test

- -

Voges-Proskauer-Test Voges-Proskauer test

- -

Indolerzeugung Indole production

- -

FhS-Erzeugung FhS generation

+ +

Stärkehydrolyse Starch hydrolysis

- -

Citratverwertung Citrate utilization

+ +

Assimilation anorgani Assimilation inorganic

scher Stickstoffquellen nitrogen sources

+ +

Urease Urease

— -

- -

Oxidase Oxidase

— -

+ bis — + to -

Catalase Catalase

+ +

Sauerstoffbedarf Oxygen demand

Aerob Aerobic

Oxidations-Fermentations-Test Oxidation-fermentation test

— -

Oxidativ Oxidative

Erzeugung von Säuren und Production of acids and

Gasen aus Kohlehydraten2 Gases from carbohydrates2

Wachstum Säuren Growth acids

Gase Gases

Assimilation assimilation

Wachstum Säuren Growth acids

Gase Gases

Assimilation assimilation

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

+ +

— -

- -

± ±

- -

+ + + + + +

2. D-Xylose 2. D-xylose

+ +

- -

+ +

- -

+ bis — + to -

3. D-Glucose 3. D-glucose

+ +

— -

+ + + +

+ +

— -

+ + + + + +

4. D-Mannose 4. D-mannose

+ +

- -

+ +

- -

+ + + +

5. Fructose 5. Fructose

+ +

- -

+ +

- -

+ + + + + +

6. D-Galactose 6. D-galactose

+ +

- -

+ +

- -

+ + + + + +

7. Maltose 7. Maltose

+ +

- -

+ +

- -

+ + + + + +

8. Saccharose 8. Sucrose

+ +

- -

± ±

+ +

- -

+ +

9. Lactose 9. Lactose

+ +

- -

+ +

- -

10. Trehalose 10. Trehalose

+ +

— -

- -

+ +

- -

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

+ +

- -

— -

- -

+ +

- -

12. D-Mannit 12. D-mannitol

+ +

- -

+ +

- -

13. Inosit 13. Inositol

+ +

- -

— -

- -

+ +

- -

14; Glycerin 14; Glycerin

+ +

- -

+ +

- -

+ + + + + +

15. Stärke 15. Strength

+ +

— -

+ +

— -

5 5

Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)

646 442 646 442

Eigenschaften properties

Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32 Strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32

Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47 Strain Arthrobacter CA-35-A589-47

Mikroskopische Beobachtung Microscopic observation

Form shape

Kurze Stäbchen Short chopsticks

Zellteilung Cell division

- -

Grösse (ji) Size (ji)

0,8 bis 1,0 x 1,3 bis 2,0 0.8 to 1.0 x 1.3 to 2.0

0,8 bis 1,0 x 1,3 bis 2,3 0.8 to 1.0 x 1.3 to 2.3

Flagellen Flagella

Polare Flagellen Polar flagella

Flagellen Flagella

Sporen Spores

Keine No

Gram-Färbung Gram stain

Positiv positive

Färbung säurefester Bakterien Coloring of acid-resistant bacteria

Keine No

Beobachtung des Observation of the

Züchtungsmediums Breeding medium

Bouillon-Agar-Platte Bouillon agar plate

Kreisförmig, flach, gelb, glatt, glitzernd, Circular, flat, yellow, smooth, glittering,

Kreisförmig, flach, gelb, glatt, glitzernd, opak Circular, flat, yellow, smooth, sparkling, opaque

opak opaque

Cholsäure (10 g/1) enthaltende Containing cholic acid (10 g / 1)

Kreisförmig, flach, weiss bis blass Circular, flat, white to pale

Bouillon-Agar-Platte opak cremefarbig, glatt, glitzernd, opak Bouillon agar plate opaque, cream-colored, smooth, glittering, opaque

Gelatine-Stichkultur Gelatin prick culture

Verflüssigung liquefaction

Lackmus-Milch Litmus milk

Lackmus reduziert, Milch nicht koaguliert Litmus reduced, milk not coagulated

und nicht peptonisiert und nicht peptonisiert and not peptonized and not peptonized

BCP-Milch BCP milk

Alkalisch, nicht koaguliert und nicht Alkaline, not coagulated and not

peptonisiert peptonisiert peptonized peptonized

Physiologische Eigenschaften1 Physiological properties 1

Nitratreduktion Nitrate reduction

± ±

+ +

Denitrifizierung Denitrification

- -

— -

Methylrot-Test Methyl red test

- -

— -

Voges-Proskauer-Test Voges-Proskauer test

— -

Indolerzeugung Indole production

- -

FhS-Erzeugung FhS generation

+ +

Stärkehydrolyse Starch hydrolysis

- -

Citratverwertung Citrate utilization

+ +

Assimilation anorganischer Assimilation of inorganic

Stickstoffquellen Nitrogen sources

Ammonium ammonium

+ +

Nitrat nitrate

+ +

Urease Urease

— -

Oxidase Oxidase

— -

Catalase Catalase

+ +

Sauerstoffbedarf Oxygen demand

Aerob Aerobic

Oxidations-Fermentations-Test Oxidation-fermentation test

Oxidativ Oxidative

— -

Erzeugung von Säuren und Production of acids and

Gasen aus Kohlehydraten2 Gases from carbohydrates2

Säuren Gase Acids gases

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

+ +

2. D-Xylose 2. D-xylose

- - - -

_ - _ -

3. D-Glucose 3. D-glucose

+ +

— — - -

4. D-Mannose 4. D-mannose

— — - -

5. D-Fructose 5. D-fructose

+ - + -

+ +

6. D-Galactose 6. D-galactose

— — - -

— _ - _

7. Maltose 7. Maltose

+ +

+ - + -

8. Saccharose 8. Sucrose

— — - -

9. Lactose 9. Lactose

— — - -

10. Trehalose 10. Trehalose

— — - -

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

— — - -

12. D-Mannit 12. D-mannitol

— — - -

„ _ "_

13. Inosit 13. Inositol

— — - -

_ — _ -

14. Glycerin 14. Glycerin

- - - -

15. Stärke 15. Strength

— — - -

646 442 646 442

Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)

Eigenschaften properties

Stamm Arthrobacter CA-35-A 849 Strain Arthrobacter CA-35-A 849

Stamm Arthrobacter CA-35-A-1071-15 Strain Arthrobacter CA-35-A-1071-15

Mikroskopische Beobachtung Form Microscopic observation form

Zellteilung Grösse (u.) Cell division size (below)

Flagellen Sporen Flagella spores

Gram-Färbung Gram stain

Färbung säurefester Bakterien Coloring of acid-resistant bacteria

Beobachtung des Observation of the

Züchtungsmediums Breeding medium

Bouillon-Agar-Platte Bouillon agar plate

Cholsäure (10 g/1) enthaltende Bouillon-Agar-Platte Gelatine-Stichkultur Lackmus-Milch Bouillon agar plate containing cholic acid (10 g / 1) gelatin prick culture litmus milk

BCP-Milch BCP milk

Physiologische Eigenschaften1 Physiological properties 1

Nitratreduktion Nitrate reduction

Denitrifizierung Denitrification

Methylrot-Test Methyl red test

Voges-Proskauer-Test Voges-Proskauer test

Indolerzeugung Indole production

FLS-Erzeugung FLS generation

Stärkehydrolyse Starch hydrolysis

Citratverwertung Citrate utilization

Assimilation anorganischer Assimilation of inorganic

Stickstoffquellen Nitrogen sources

Ammonium ammonium

Nitrat nitrate

Urease Urease

Oxidase Oxidase

Catalase Catalase

Sauerstoffbedarf Oxygen demand

Oxidations-Fermentations-Test Oxidation-fermentation test

Erzeugung von Säuren und Production of acids and

Gasen aus Kohlehydraten2 Gases from carbohydrates2

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

2. D-Xylose 2. D-xylose

3. D-Glucose 3. D-glucose

4. D-Mannose 4. D-mannose

5. D-Fructose 5. D-fructose

6. D-Galactose 6. D-galactose

7. Maltose 7. Maltose

8. Saccharose 8. Sucrose

9. Lactose 9. Lactose

10. Trehalose 10. Trehalose

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

12. D-Mannit 12. D-mannitol

13. Inosit 13. Inositol

14. Glycedrin 14. Glycedrin

15. Stärke 15. Strength

Kurze Stäbchen Short chopsticks

0,7 bis 1,0 x 1,3 bis 2,3 0.7 to 1.0 x 1.3 to 2.3

Keine No

Positiv positive

Keine No

Kreisförmig, flach, weiss bis blass cremefarbig, glatt, glitzernd, opak Verflüssigung Circular, flat, white to pale cream-colored, smooth, glittering, opaque liquefaction

Lackmus reduziert, Milch nicht koaguliert und nicht peptonisiert Alkalisch, nicht koaguliert und nicht peptonisiert Litmus reduced, milk not coagulated and not peptonized. Alkaline, not coagulated and not peptonized

+ + + +

+ +

Aerob Oxidativ Aerobic oxidative

Säuren Acids

+ + + + + +

Gase Gases

Kurze Stäbchen Short chopsticks

0,8 bis 1,0 x 1,3 bis 2,5 0.8 to 1.0 x 1.3 to 2.5

Keine No

Positiv positive

Keine No

+ + + +

4* 4 *

Aerob Oxidativ Aerobic oxidative

Säuren + Acids +

+ + + + + +

Gase Gases

7 646 442 7,646,442

Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)

Eigenschaften Stamm Arthrobacter CA-35-A-1448 Stamm Arthrobacter CA-35-A-1475 Properties Arthrobacter CA-35-A-1448 strain Arthrobacter CA-35-A-1475 strain

Mikroskopische Beobachtung Microscopic observation

Form shape

Kurze Stäbchen Short chopsticks

Kurze Stäbchen bis «Coccus»-ähnlich (im Short chopsticks similar to "coccus" (in

engl, als «short rod to coccus» bezeichnet) English, called "short rod to coccus")

Zellteilung Cell division

- -

- - - -

Grösse (p.) Size (p.)

0,7 bis 1,0 x 1,2 bis 2,0 0.7 to 1.0 x 1.2 to 2.0

1,0 bis 1,3 x 1,2 bis 1,8 1.0 to 1.3 x 1.2 to 1.8

Flagellen Flagella

Sporen Spores

Keine No

Gram-Färbung Gram stain

Positiv positive

Färbung säurefester Bakterien Coloring of acid-resistant bacteria

Keine No

Beobachtung des Observation of the

Züchtungsmediums Breeding medium

Bouillon-Agar-Platte Bouillon agar plate

opak opaque

Cholsäure (10 g/1) enthaltende Containing cholic acid (10 g / 1)

Kreisförmig, flach, weiss bis blass Circular, flat, white to pale

Bouillon-Agar-Platte cremefarbig, glatt, glitzernd, opak cremefarbig, glatt, glitzernd, opak Bouillon agar plate cream-colored, smooth, glittering, opaque cream-colored, smooth, glittering, opaque

Gelatine-Stichkultur Gelatin prick culture

Verflüssigung liquefaction

Lackmus-Milch Litmus milk

Lackmus reduziert, Milch nicht koaguliert Litmus reduced, milk not coagulated

BCP-Milch BCP milk

Alkalisch, nicht koaguliert und nicht Alkaline, not coagulated and not

peptonisiert peptonisiert peptonized peptonized

Physiologische Eigenschaften1 Physiological properties 1

Nitratreduktion Nitrate reduction

+ +

Denitrifizierung Denitrification

- -

Methylrot-Test Methyl red test

- -

j- j-

Voges-Proskauer-Test Voges-Proskauer test

— -

- -

Indolerzeugung Indole production

- -

FhS-Erzeugung FhS generation

+ +

Stärkehydrolyse Starch hydrolysis

- -

Citratverwertung Citrate utilization

+ +

Assimilation anorganischer Assimilation of inorganic

Stickstoffquellen Nitrogen sources

Ammonium ammonium

+ +

Nitrat nitrate

+ +

Urease Urease

— -

Oxidase Oxidase

— -

Catalase Catalase

+ +

— -

Sauerstoffbedarf Oxygen demand

Aerob Aerobic

Oxidations-Fermentations-Test Oxidation-fermentation test

Oxidativ Oxidative

— -

Erzeugung von Säuren und Production of acids and

Gasen aus Kohlehydraten2 Gases from carbohydrates2

Säuren Gase Acids gases

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

+ +

- - - -

2. D-Xylose 2. D-xylose

- - - -

3. D-Glucose 3. D-glucose

+ - + -

— — - -

4. D-Mannose 4. D-mannose

— — - -

5. D-Fructose 5. D-fructose

+ +

6. D-Galactose 6. D-galactose

— — - -

7. Maltose 7. Maltose

+ +

— — - -

8. Saccharose 8. Sucrose

— _ - _

— — - -

9. Lactose 9. Lactose

— — - -

10. Trehalose 10. Trehalose

— — - -

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

— — - -

12. D-Mannit 12. D-mannitol

— — - -

13. Inosit 13. Inositol

— — - -

14. Glycerin 14. Glycerin

+ +

- - - -

15. Stärke 15. Strength

- - - -

— — - -

646 442 8 646 442 8

Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)

Eigenschaften properties

Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15 Strain Arthrobacter CA-35-A-1766-15

Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3 Strain Arthrobacter CA-35-M-965-3

Mikroskopische Beobachtung Microscopic observation

Form shape

Kurze Stäbchen Short chopsticks

engl, «short rod to coccus» bezeichnet) short rod to coccus)

Zellteilung Cell division

- -

Grösse (|x) Size (| x)

0,6 bis 1,2 x 1,0 bis 2,3 0.6 to 1.2 x 1.0 to 2.3

1,0 bis 1,2x0,8 bis 1,6 1.0 to 1.2x0.8 to 1.6

Flagellen Flagella

Sporen Spores

Keine No

Gram-Färbung Gram stain

Positiv positive

Färbung säurefester Bakterien Coloring of acid-resistant bacteria

Keine No

Beobachtung des Observation of the

Züchtungsmediums Breeding medium

Bouillon-Agar-Platte Bouillon agar plate

opak opaque

Cholsäure (10 g/1) enthaltende Containing cholic acid (10 g / 1)

Kreisförmig, flach, weiss bis blass Circular, flat, white to pale

Gelatine-Stichkultur Gelatin prick culture

Verflüssigung liquefaction

Keine Verflüssigung No liquefaction

Lackmus-Milch Litmus milk

Lackmus reduziert, Milch nicht koaguliert Litmus reduced, milk not coagulated

BCP-Milch BCP milk

Alkalisch, nicht koaguliert und nicht Alkaline, not coagulated and not

peptonisiert peptonisiert peptonized peptonized

Physiologische Eigenschaften1 Physiological properties 1

Nitratreduktion Nitrate reduction

+ +

Denitrifizierung Denitrification

- -

Methylrot-Test Methyl red test

- -

— -

Voges-Proskauer-Test Voges-Proskauer test

- -

— -

Indolerzeugung Indole production

- -

— -

FhS-Erzeugung FhS generation

+ +

Stärkehydrolyse Starch hydrolysis

- -

— -

Citratverwertung Citrate utilization

+ +

Assimilation anorganischer Assimilation of inorganic

Stickstoffquellen Nitrogen sources

Ammonium ammonium

+ +

Nitrat nitrate

- -

+ +

Urease Urease

- -

— -

Oxidase Oxidase

- -

— -

Catalase Catalase

+ +

Sauerstoffbedarf Oxygen demand

Aerob Aerobic

Oxydations-Fermentations-T est Oxidation-fermentation test

Oxidativ Oxidative

Erzeugung von Säuren und Production of acids and

Säuren Gase Acids gases

Gasen aus Kohlehydraten2 Gases from carbohydrates2

Säuren Gase Acids gases

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

- - - -

+ - + -

2. D-Xylose 2. D-xylose

- -

— — - -

3. D-Glucose 3. D-glucose

+ - + -

4. D-Mannose 4. D-mannose

- - - -

— — - -

5. D-Fructose 5. D-fructose

+ - + -

6. D-Galactose 6. D-galactose

- - - -

— — - -

7. Maltose 7. Maltose

+ +

8. Saccharose 8. Sucrose

- - - -

— — - -

9. Lactose 9. Lactose

_ — _ -

— ~ - ~

10. Trehalose 10. Trehalose

- - - -

— — - -

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

- - - -

— — - -

12. D-Mannit 12. D-mannitol

- - - -

— — - -

13. Inosit 13. Inositol

_ - _ -

— — - -

14. Glycerin 14. Glycerin

+ - + -

— — - -

15. Stärke 15. Strength

— — - -

646 442 646 442

Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)

Eigenschaften properties

Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12 Strain Arthrobacter CA-35-Y-37-12

Stamm Brevibacterium CA-6 Strain Brevibacterium CA-6

Mikroskopische Beobachtung Form Microscopic observation form

Zellteilung Grösse (ji) Cell division size (ji)

Flagellen Sporen Flagella spores

Gram-Färbung Gram stain

Färbung säurefester Bakterien Coloring of acid-resistant bacteria

Beobachtung des Observation of the

Züchtungsmediums Breeding medium

Bouillon-Agar-Platte Bouillon agar plate

BCP-Milch BCP milk

Physiologische Eigenschaften1 Nitratreduktion Denitrifizierung Methylrot-Test Voges-Proskauer-Test Indolerzeugung HîS-Erzeugung Stärkehydrolyse Citratverwertung Assimilation anorganischer Stickstoffquellen Ammonium Nitrat Urease Oxidase Catalase Physiological properties1 Nitrate reduction Denitrification Methyl red test Voges-Proskauer test Indole production HîS production Starch hydrolysis Citrate utilization Assimilation of inorganic nitrogen sources Ammonium nitrate urease oxidase catalase

Sauerstoffbedarf Oxydations-Fermentations-Test Erzeugung von Säuren und Gasen aus Kohlehydraten2 Oxygenation-Fermentation-Test Generation of acids and gases from carbohydrates2

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

2. D-Xylose 2. D-xylose

3. D-Glucose 3. D-glucose

4. D-Mannose 4. D-mannose

5. D-Fructose 5. D-fructose

6. D-Galactose 6. D-galactose

7. Maltose 7. Maltose

8. Saccharose 8. Sucrose

9. Lactose 9. Lactose

10. Trehalose 10. Trehalose

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

12. D-Mannit 12. D-mannitol

13. Inosit 13. Inositol

14. Glycerin 14. Glycerin

15. Stärke 15. Strength

Kurze Stäbchen Short chopsticks

0,8 bis 1,0 x 1,5 bis 2,5 0.8 to 1.0 x 1.5 to 2.5

Flagellen Flagella

Keine No

Positiv positive

Keine No

Kreisförmig, flach, cremefarbig, glatt, Circular, flat, cream-colored, smooth,

flitzernd, opak flickering, opaque

Verflüssigung liquefaction

+ + + +

+ +

Aerob Oxidativ Aerobic oxidative

Säuren Gase + Acids gases +

+ +

+ + + +

Wachstum + Growth +

+ +

4- 4-

Stäbchen rod

1,0x2,5 bis 4,0 Polare Flagellen Keine Positiv Keine 1.0x2.5 to 4.0 polar flagella None Positive None

Wellenförmig, leicht aufgerichtet, farblos, glatt, glitzernd, durchscheinend Wavy, slightly erect, colorless, smooth, glittering, translucent

Verflüssigung liquefaction

Peptonisiert und alkalisch geworden Peptonisiert und alkalisch geworden Peptonized and alkaline Peptonized and alkaline

+ + + + + +

+ +

Aerob Aerobic

Säuren + Acids +

+ +

Gase Gases

Assimilation + + + Assimilation + + +

± ±

+ + + + + +

+ +

+ + + + + + + + + + + +

+ 4- + + 4- +

-I- + + 4- + -I- -I- + + 4- + -I-

646 442 646 442

10 10th

Tabelle 1 (Fortsetzung) Table 1 (continued)

Eigenschaften properties

Stamm Corynebacterium CA-53 Strain Corynebacterium CA-53

Mikroskopische Beobachtung Form Microscopic observation form

Zellteilung Grösse (u.) Cell division size (below)

Flagellen Sporen Flagella spores

Gram-Färbung Gram stain

Färbung säurefester Bakterien Coloring of acid-resistant bacteria

Beobachtung des Observation of the

Züchtungsmediums Breeding medium

Nähr-Agar-Platte Nutrient agar plate

Gelatine-Stichkultur Gelatin prick culture

Lackmus-Milch Litmus milk

BCP-Milch BCP milk

Physiologische Eigenschaften1 Physiological properties 1

Nitratreduktion Nitrate reduction

Denitrifizierung Denitrification

Methylrot-Test Methyl red test

Voges-Proskauer-Test Voges-Proskauer test

Indolerzeugung hhS-Erzeugung Indole generation hhS generation

Stärkehydrolyse Starch hydrolysis

Citratverwertung Citrate utilization

Assimilation anorganischer Assimilation of inorganic

Stickstoffquellen Nitrogen sources

Urease Urease

Oxidase Oxidase

Catalase Catalase

Sauerstoffbedarf Oxidations-Fermentations-Test Erzeugung von Säuren und Gasen aus Kohlehydraten2 Oxygen demand Oxidation-fermentation test Generation of acids and gases from carbohydrates2

1. L-Arabinose 1. L-arabinose

2. D-Xylose 2. D-xylose

3. D-Glucose 3. D-glucose

4. D-Mannose 4. D-mannose

5. D-Fructose 5. D-fructose

6. D-Galactose 6. D-galactose

7. Maltose 7. Maltose

8. Saccharose 8. Sucrose

9. Lactose 9. Lactose

10. Trehalose 10. Trehalose

11. D-Sorbit 11. D-sorbitol

12. D-Mannit 12. D-mannitol

13. Inosit 13. Inositol

14. Glycerin 14. Glycerin

15. Stärke stabförmig, «coryneförmig» 15. Star-shaped, «coryne-shaped»

«snapping», d.h. aufbrechend «Snapping» breaking up

1,3 bis 2,4 x 1,0 bis 1,2 1.3 to 2.4 x 1.0 to 1.2

Keine No

Positiv positive

Keine No

Keine Verflüssigung No liquefaction

Lackmus reduziert mit braunem Sediment Alkalisch Litmus reduced alkaline with brown sediment

+ +

Aerob Säuren Aerobic acids

Gase Gases

Wie nachstehend erwähnt, sind die englischen Bezeichnungen und die Kurvenbezeichnungen dem Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. und 8. Auflagen, zu entnehmen. As mentioned below, the English names and the curve names can be found in the Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th and 8th editions.

Bemerkungen: Remarks:

1. Die im Zusammenhang mit den physiologischen Eigenschaften zur Anwendung gelangten Symbole bedeuten folgendes: 1. The symbols used in connection with the physiological properties mean the following:

+ Der Stamm besitzt die entsprechenden Eigenschaften oder erzeugt das entsprechende Produkt + Es ist schwierig zu bestimmen, ob der Stamm die entsprechenden Eigenschaften aufweist oder das entsprechende Produkt erzeugt oder nicht — Der Stamm besitzt nicht die entsprechenden + The strain has the corresponding properties or produces the corresponding product + It is difficult to determine whether the strain has the corresponding properties or produces the corresponding product or not - The strain does not have the corresponding

55 Eigenschaften oder erzeugt nicht das entsprechende Produkt. 55 properties or does not produce the corresponding product.

2. Die bei der Erzeugung von Säuren und Gasen aus Kohlehydraten verwendeten Symbole bedeuten folgendes: i) Wachstum, Säuren und Gase: 2. The symbols used in the generation of acids and gases from carbohydrates mean the following: i) Growth, acids and gases:

60 Der Stamm wurde in einem Hugh- und Leifson-Medium gezüchtet, mit der Bedingung, dass jedes der Kohlehydrate 1 bis 15 als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurde, wobei dessen Wachstum und die Erzeugung von Säuren und Gasen beobachtet wurden. 60 The strain was grown in Hugh and Leifson medium, provided that each of carbohydrates 1 to 15 was used as a carbon source, and its growth and generation of acids and gases were observed.

o5 + Der Stamm wächst oder eine Säure oder ein Gas wird erzeugt o5 + The trunk grows or an acid or a gas is generated

± Es ist schwierig festzustellen, ob der Stamm wächst oder eine Säure oder ein Gas erzeugt wird oder nicht ± It is difficult to determine whether the strain is growing or whether an acid or a gas is being produced or not

11 11

646 442 646 442

— Der Stamm wächst nicht oder es wird keine Säure oder kein Gas erzeugt ii) Assimilation: - The strain does not grow or no acid or gas is generated ii) Assimilation:

Das NH4NO3 (2 g/1), KH2PO4 (2 g/1), K2HPO4 (5 g/I), MgS04-7H20 (0,2 g/1), Hefeextrakt (0,1 g/1) und eines der Kohlehydrate 1 bis 15 (5 g/1) enthaltende Kulturmedium wurde in ein Rohr mit einem Durchmesser von 21 mm eingebracht, der Stamm unter Schütteln darin gezüchtet und dessen Assimilation (Wachstum) beobachtet. The NH4NO3 (2 g / 1), KH2PO4 (2 g / 1), K2HPO4 (5 g / I), MgS04-7H20 (0.2 g / 1), yeast extract (0.1 g / 1) and one of the carbohydrates Culture medium containing 1 to 15 (5 g / 1) was put in a tube with a diameter of 21 mm, the strain was grown therein with shaking, and its assimilation (growth) was observed.

- Es findet kein Wachstum des Stammes statt ± Der Stamm wächst schwach - The trunk does not grow ± The trunk grows weakly

+ Der Stamm wächst + + Der Stamm wächst gut + + -tDer Stamm wächst sehr gut + The trunk grows + + The trunk grows well + + -tThe trunk grows very well

Aufgrund der obigen morphologischen, Züchtungs- und physiologischen Eigenschaften wurde die Klassifikation der Stämme nach dem Bergey's Manual of Determinative Bacte-riology 7. und 8. Auflagen bestimmt. On the basis of the above morphological, breeding and physiological properties, the classification of the strains was determined according to the Bergey's Manual of Determinative Bacte-riology 7th and 8th editions.

Es kann festgestellt werden, dass der Stamm Arthrobacter CA-35 aufgrund der mikroskopischen Beobachtungen, wie z.B. Form, Gram-Färbung usw., sowie aufgrund dessen physiologischen Eigenschaften eine Beziehung zu Arthrobacter simplex besitzt. Der Stamm Arthrobacter CA-35 ist aber bezüglich der Pigmenterzeugung, der Assimilation von Kohlehydraten und dem Wachstum in einem Cholsäure enthaltenden Medium vom Stamm Arthrobacter simplex IAM 1660 verschieden. Der Stamm Arthrobacter CA-35 kann in einem Natriumcholat als alleinige Kohlenstoffquelle enthaltendem Medium bei hoher Konzentration von beispielsweise ungefähr 20 bis 500 g/1 wachsen, wobei als hauptsächlichste metabolische Produkte die 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholan-säure, 3cc,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Di-hydroxy-3-keto-5ß-cholansäure und/oder deren Natriumsalze erzeugt werden, während der Stamm Arthrobacter simplex IAM 1660 in einem Natriumcholat als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium bei einer Konzentration von 10 g/1 kaum wachsen kann. It can be seen that the Arthrobacter CA-35 strain is based on microscopic observations such as e.g. Form, Gram stain, etc., and because of its physiological properties has a relationship with Arthrobacter simplex. The strain Arthrobacter CA-35 is different from the strain Arthrobacter simplex IAM 1660 in terms of pigment production, assimilation of carbohydrates and growth in a medium containing cholic acid. The strain Arthrobacter CA-35 can grow in a medium containing sodium cholate as the sole carbon source at a high concentration of, for example, about 20 to 500 g / l, the main metabolic products being 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid , 3cc, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid, 7a, 12a-di-hydroxy-3-keto-5β-cholic acid and / or their sodium salts are produced, while the strain Arthrobacter simplex IAM 1660 is the only one in a sodium cholate Medium containing carbon source can hardly grow at a concentration of 10 g / 1.

Der Stamm Arthrobacter CA-35 erzeugt gelbe bis cremefarbene Pigmente. Andererseits existieren als Mikroorganismen, welche zur Gattung Arthrobacter gehören und eine Pigmentproduktivität aufweisen, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens und Arthrobacter ureafaciens. Der Stamm Arthrobacter CA-35 unterscheidet sich aber ebenfalls von diesen Mikroorganismen, denn Arthrobacter oxydans und Arthrobacter aurescens sind gewöhnlich gramnegativ und hydroly-sieren Stärke, während Arthrobacter ureafaciens im allgemeinen gram-negativ ist und Nitrat nicht reduziert. Es darf daher angenommen werden, dass der Stamm Arthrobacter CA-35 eine neue Art darstellt, welche zur Gattung Arthrobacter gehört und dies deshalb, weil er sich von den üblichen zur Gattung Arthrobacter gehörenden Arten unterscheidet. The Arthrobacter CA-35 strain produces yellow to off-white pigments. On the other hand, as microorganisms belonging to the genus Arthrobacter and having pigment productivity, there are Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens and Arthrobacter ureafaciens. The Arthrobacter CA-35 strain also differs from these microorganisms, because Arthrobacter oxydans and Arthrobacter aurescens are usually gram-negative and hydrolyzed starch, while Arthrobacter ureafaciens is generally gram-negative and does not reduce nitrate. It can therefore be assumed that the strain Arthrobacter CA-35 represents a new species which belongs to the genus Arthrobacter and this because it differs from the usual species belonging to the genus Arthrobacter.

Wenn auch gewisse Mutanten des Stammes Arthrobacter CA-35 sich vom Ausgangs-Stamm wegen des Vorliegens von Flagellen grundsätzlich unterscheiden, wird festgestellt, dass diese Mutanten zur Gattung Arthrobacter gehören, weil eine Mutante im allgemeinen in der gleichen Art ihres Ausgangs-Stammes klassifiziert wird. Although certain mutants of the Arthrobacter CA-35 strain differ fundamentally from the parent strain due to the presence of flagella, it is found that these mutants belong to the genus Arthrobacter because a mutant is generally classified in the same manner as its parent strain.

Es wird festgestellt, dass der Stamm Brevibacterium CA-6 angesichts der mikroskopischen Beobachtungen, wie z.B. der Gram-Färbung und dergleichen, und wegen seiner physiologischen Eigenschaften zur Gattung Brevibacterium gehört. Der Stamm Brevibacterium CA-6 ist allerdings etwas verschieden von den anderen Mikroorganismen, die zur Gattung Brevibacterium gehören, weil die anderen Mikroorganismen zu den Peritrichen gehörige (bewimperte) Flagellen aufweisen, während der Stamm Brevibacterium CA-6 ein polares Flagellum aufweist usw. It is found that the strain Brevibacterium CA-6 in view of the microscopic observations such as e.g. the Gram stain and the like, and because of its physiological properties belongs to the genus Brevibacterium. However, the Brevibacterium CA-6 strain is somewhat different from the other microorganisms belonging to the genus Brevibacterium because the other microorganisms have (ciliated) flagella belonging to the Peritrichen, while the Brevibacterium CA-6 strain has a polar flagellum, etc.

Ferner wird festgestellt, dass der Stamm Corynebacterium CA-53 mit Corynebacterium equi nahe verwandt ist. It is also found that the strain Corynebacterium CA-53 is closely related to Corynebacterium equi.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch Züchtung eines Mikroorganismus durchgeführt, welcher in einem Cholsäure oder ein Salz davon als Substrat enthaltenden Medium zu wachsen fähig ist, wobei die Mikroorganismen den Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium und Corynebacterium entnommen werden, wobei die Züchtung in einem Medium erfolgt, welches Cholsäure oder ein Salz davon als Substrat enthält. The method according to the invention is carried out by culturing a microorganism which is capable of growing in a medium containing cholic acid or a salt thereof as a substrate, the microorganisms being taken from the genera Arthrobacter, Brevibacterium and Corynebacterium, the cultivation taking place in a medium which is cholic acid or contains a salt thereof as a substrate.

Gemäss vorliegender Erfindung kann die Cholsäure als solche als Substrat eingesetzt werden. Man kann aber auch ein Alkalimetallsalz der Cholsäure, wie z.B. Natriumcholat, Kaliumcholat oder dergleichen, oder ein Erdalkalimetallsalz der Cholsäure, wie z.B. Calciumcholat, Magnesiumcholat oder dergleichen, vorzugsweise aber ein Alkalimetallsalz davon, verwenden. Verwendet man ein Cholat, so wird dieses in Wasser gelöst, um eine wässrige Lösung zu erhalten, welche das Cholat in einer vorbestimmten Konzentration enthält. Andererseits kann man eine gewisse Menge einer Alkalimetallverbindung oder einer Erdalkalimetallverbindung, welche mit Cholsäure ein Salz bildet, zuvor in Wasser lösen und dann dieser Lösung Cholsäure zusetzen, wobei man eine wässrige, ein Cholat in einer vorbestimmten Konzentration enthaltende Lösung erhält. Die Konzentration der Cholsäure oder ihres Salzes kann in einem grossen Bereich von ungefähr 1 bis 500 g/1, als Cholsäure berechnet, schwanken. Jenach der gewünschten Ausbeute an einem der Cholansäurederivate der Formel I, je nach den Züchtungsbedingungen und je nach der wirtschaftlichen Effizienz, wie z.B. Handhabung und Bearbeitungsmöglichkeiten und dergleichen, ist es empfehlenswert, die Cholsäure oder ein Salz davon in einer Konzentration von ungefähr 5 bis 300 g/1 und vorzugsweise von ungefähr 10 bis 200 g/1, berechnet als Cholsäure, zu verwenden. According to the present invention, the cholic acid as such can be used as a substrate. However, an alkali metal salt of cholic acid, e.g. Sodium cholate, potassium cholate or the like, or an alkaline earth metal salt of cholic acid such as e.g. Calcium cholate, magnesium cholate or the like, but preferably an alkali metal salt thereof. If a cholate is used, it is dissolved in water to obtain an aqueous solution which contains the cholate in a predetermined concentration. On the other hand, a certain amount of an alkali metal compound or an alkaline earth metal compound which forms a salt with cholic acid can be previously dissolved in water and then cholic acid can be added to this solution to obtain an aqueous solution containing a cholate in a predetermined concentration. The concentration of cholic acid or its salt can vary within a wide range from approximately 1 to 500 g / l, calculated as cholic acid. Depending on the desired yield of one of the cholanic acid derivatives of the formula I, depending on the growing conditions and on the economic efficiency, e.g. Handling and processing facilities and the like, it is recommended to use the cholic acid or a salt thereof in a concentration of about 5 to 300 g / 1, and preferably about 10 to 200 g / 1, calculated as cholic acid.

Die Züchtung kann in an sich bekannter Weise geschehen, wobei man gewöhnlich eine Schüttelkultur oder eine submerse Kultur unter Verwendung eine flüssigen Mediums anwendet. The cultivation can be carried out in a manner known per se, usually using a shake culture or a submerged culture using a liquid medium.

Als Medium kann man ein solches verwenden, welches durch den zur Anwendung gelangenden Mikroorganismus assimilierbare Nährstoffe enthält. Das Medium kann Cholsäure oder ein Salz davon als einzige Kohlenstoffquelle oder eine zusätzliche Kohlenstoffquelle, wie z.B. eine Pentose, z.B. Arabinose usw., eine Hexose, wie z.B. Glucose, Mannose, Fructose, Galactose usw., ein Disaccharid, wie z.B. Maltose usw., ein Stärkezersetzungsprodukt, wie z.B. Dextrin usw., einen Zuckeralkohol, wie z.B. Sorbit usw., einen mehrwertigen Alkohol, wie z.B. Glycerin usw., eine Mischung davon oder dergleichen und/oder andere Nährstoffe, wie z.B . ein Polypepton, ein Pepton, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, eine Aminosäure, ein Gemisch davon oder dergleichen, enthalten. Im allemeinen kann man dem Medium eine zusätzliche Kohlenstoffquelle und/oder einen anderen Nährstoff in einer Konzentration von 0,1 bis 10 g/1 zusetzen. Als Stickstoffqueilen kommen beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Mischungen davon und dergleichen in Frage. Im allgemeinen kann die Stickstoffquelle einem solchen Medium in einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis 5 g/1 zugesetzt werden. Dem Medium kann man ferner auch anorganische Salze, z.B. Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat oder dergleichen, üblicherweise in einer Menge von ungefähr 0,1 bis 10 g/1 zugeben. Die Züchtung kann in einer Schüttelkultur oder in einer submersen Kultur während 6 Stunden bis 5 Tagen bei 25 bis 35 °C erfolgen. The medium used can be one which contains assimilable nutrients due to the microorganism used. The medium can be cholic acid or a salt thereof as the sole carbon source or an additional carbon source such as e.g. a pentose, e.g. Arabinose, etc., a hexose such as e.g. Glucose, mannose, fructose, galactose, etc., a disaccharide such as e.g. Maltose, etc., a starch decomposition product such as Dextrin, etc., a sugar alcohol, e.g. Sorbitol, etc., a polyhydric alcohol, e.g. Glycerin etc., a mixture thereof or the like and / or other nutrients such as e.g. a polypeptone, a peptone, meat extract, malt extract, corn steep liquor, yeast extract, an amino acid, a mixture thereof, or the like. In general, an additional carbon source and / or another nutrient can be added to the medium in a concentration of 0.1 to 10 g / l. Examples of suitable nitrogen sources are ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrate, mixtures thereof and the like. Generally, the nitrogen source can be added to such a medium at a concentration of about 0.5 to 5 g / l. Inorganic salts, e.g. Dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate or the like, usually in an amount of about 0.1 to 10 g / 1. The cultivation can take place in a shaking culture or in a submerged culture for 6 hours to 5 days at 25 to 35 ° C.

Verwendet man den Stamm Arthrobacter CA-35, so wird beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren die als If the strain Arthrobacter CA-35 is used, then the as

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

o5 o5

646442 646442

12 12

Substrat verwendete Cholsäure oder deren Salz in ein Chol-ansäurederivat der allgemeinen Formel I übergeführt, wobei man auch eine kleine Menge der 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure erhält. Es wurde ferner festgestellt, dass die Cholansäurederivate der allgemeinen Fomel I, worin X die Gruppierung sr-OH Cholic acid or its salt used in the substrate was converted into a cholic acid derivative of the general formula I, a small amount of 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5β-cholic acid also being obtained. It was also found that the cholanic acid derivatives of the general formula I, in which X is the grouping sr-OH

bedeutet, nämlich die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholan-säure oder ein Salz davon, vorwiegend anfallen, wenn man die obigen Mutanten von Arthrobacter CA-35 verwendet. Wünscht man somit die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholan-säure oder ein Salz davon zu erhalten, so wird man vorzugsweise diese Mutanten und insbesondere den Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P Nr. 5522; ATCC Nr. 31652), Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P Nr. 5523; ATCC Nr. 31653) und Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P Nr. 5528; ATCC Nr. 31658) verwenden. Insbesondere werden die Stämme Arthrobacter CA-35-A589-29-32 und Arthrobacter CA-35-A589-47 bevorzugt. Verwendet man den Stamm Brevibacterium CA-6, so wird die Cholsäure bzw. deren Salz in ein Cholansäurederivat der Formel I übergeführt, wobei man auch noch eine kleine Menge der 7ct-Hydroxy-3,12-diketo-A4-cholensäure bzw. ein Salz davon erhält. Verwendet man den Stamm Corynebacterium CA-53, so wird Cholsäure oder ein Salz davon in ein Cholansäurederivat der Formel I übergeführt, wobei man überdies 7a-Hydroxy-3,12-diketo-A4-cholensäure oder ein Salz davon erhält. means, namely 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid or a salt thereof, predominantly occur when the above mutants of Arthrobacter CA-35 are used. If one wishes to obtain the 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid or a salt thereof, these mutants and in particular the strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522; ATCC No. 31652), strain Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5523; ATCC No. 31653) and strain Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528; ATCC No. 31658). In particular, the strains Arthrobacter CA-35-A589-29-32 and Arthrobacter CA-35-A589-47 are preferred. If the strain Brevibacterium CA-6 is used, the cholic acid or its salt is converted into a cholanic acid derivative of the formula I, a small amount of 7ct-hydroxy-3,12-diketo-A4-cholenic acid or a salt also being converted of it receives. If the strain Corynebacterium CA-53 is used, cholic acid or a salt thereof is converted into a cholanic acid derivative of the formula I, 7a-hydroxy-3,12-diketo-A4-cholenic acid or a salt thereof also being obtained.

Nach beendeter Züchtung werden die im Medium angereicherten Produkte aus dem Medium abgetrennt und gereinigt. Zuerst werden in an sich bekannter Weise, z.B. durch Filtrieren, Zentrifugieren oder dergleichen, aus dem Medium die darin vorhandenen unlöslichen Materialien, wie z.B. die mikrobiellen Zellen und dergleichen, entfernt. Dann wird das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit durch Zugabe einer Säure, wie z.B. Salzsäure, angesäuert, um die darin vorhandenen Produkte auszufällen. Gleichzeitig wird die als Substrat verwendete und noch vorhandene Cholsäure oder eines ihrer Salze auch als Cholsäure ausgefällt. Nach dem Abtrennen des entstandenen Niederschlages wird das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit mit einem inerten, organischen Lösungsmittel, wie z.B. Äthylacetat oder dergleichen, extrahiert und das Lösungsmittel dann aus dem Extrakt abdestilliert, wobei man einen Rückstand erhält. Auf diese Weise werden die verbleibenden Produkte und das Substrat beinahe vollständig zurückgewonnen. Der entstandene Rückstand wird mit dem nach den obigen Angaben erhaltenen Niederschlag vereinigt. After the cultivation has ended, the products enriched in the medium are separated from the medium and cleaned. First, in a manner known per se, e.g. by filtering, centrifuging or the like, the insoluble materials present in the medium, e.g. the microbial cells and the like are removed. Then the filtrate or the supernatant liquid is added by adding an acid such as e.g. Hydrochloric acid, acidified to precipitate the products in it. At the same time, the cholic acid or one of its salts which is still used as the substrate and is also precipitated as cholic acid. After the resulting precipitate has been separated off, the filtrate or the supernatant liquid is washed with an inert organic solvent, such as e.g. Ethyl acetate or the like is extracted, and then the solvent is distilled off from the extract to obtain a residue. In this way, the remaining products and the substrate are almost completely recovered. The resulting residue is combined with the precipitate obtained according to the above information.

Ein Gemisch der so erhaltenen Produkte und Cholsäure wird dann chromatographiert, um das gewünschte Produkt zu isolieren. So kann man beispielsweise die bei Verwendung des Stammes Arthrobacter CA-35 erhaltenen Produkte oder die mit einer Mutante davon erzielten Produkte in folgender Weise isolieren: Die Produkte und die Cholsäure werden in die entsprechenden Methylester übergeführt, und die so erhaltenen Methylester in einer Kieselgelsäule Chromatographien, wobei man nacheinander mit Chloroform, einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 90:1 Vol.-Teilen und schliesslich einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 93:3 Vol.-Teilen eluiert. Der erwünschte Methylester der 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure wird dann mit Chloroform eluiert. Durch Eluieren mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 99:1 Vol.-Teilen erhält man zuerst als Nebenprodukt den Methylester der 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure und hierauf durch weiteres Eluieren den gewünschten Methylester der 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure. Der Cholsäureme-thylester wird mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 97:3 Vol.-Teilen eluiert. Alle diese Methylester lassen sich durch Hydrolyse nach bekannten Methoden in die entsprechenden Säuren überführen. Andererseits können die bei Verwendung des Stammes Brevibacterium CA-6 oder Corynebacterium CA-53 erhaltenen Produkte beispielsweise in folgender Weise isoliert werden. Ein Gemisch der Produkte und der Cholsäure wird unmittelbar der Chromatographie über Kieselgel unterworfen, wobei man nacheinander mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 98:2 Vol.-Teilen und hierauf mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 97:3 Vol.-Teilen eluiert. Die erwünschte 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure wird dabei mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 98:2 Vol.-Teilen eluiert. Durch Eluieren mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 97:3 Vol.-Teilen erhält man zuerst als Nebenprodukt die 7a-Hydroxy-3,12-diketo-A4-cholen-säure und durch weiteres Eluieren anschliessend die gewünschte 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure. A mixture of the products so obtained and cholic acid is then chromatographed to isolate the desired product. For example, the products obtained using the Arthrobacter CA-35 strain or the products obtained with a mutant thereof can be isolated in the following manner: the products and the cholic acid are converted into the corresponding methyl esters, and the methyl esters thus obtained are chromatographed in a silica gel column, wherein eluting successively with chloroform, a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 90: 1 parts by volume and finally a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 93: 3 parts by volume. The desired methyl ester of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid is then eluted with chloroform. By eluting with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 99: 1 parts by volume, the methyl ester of 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid is obtained as a by-product and then the desired methyl ester of 3a is obtained by further elution , 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid. The methyl cholic acid is eluted with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 97: 3 parts by volume. All of these methyl esters can be converted into the corresponding acids by hydrolysis using known methods. On the other hand, the products obtained using the Brevibacterium CA-6 or Corynebacterium CA-53 strain can be isolated, for example, in the following manner. A mixture of the products and the cholic acid is immediately subjected to chromatography on silica gel, one after the other with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 98: 2 parts by volume and then with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 97: 3 Vol. Parts eluted. The desired 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholic acid is eluted with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 98: 2 parts by volume. By eluting with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 97: 3 parts by volume, 7a-hydroxy-3,12-diketo-A4-cholic acid is obtained as a by-product and then the desired 3a, 7a is obtained by further elution -Dihydroxy-12-keto-5ß-cholic acid.

Die erfindungsgemäss erhaltene 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure oder deren Salze lassen sich leicht nach der Huang-Minlon-Reduktionsmethode reduzieren, wobei man ein wertvolles Gallenstein auflösendes Mittel, nämlich die Chenodesoxycholinsäure (CDCA), erhält. The 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid or its salts obtained according to the invention can easily be reduced by the Huang-Minlon reduction method, whereby a valuable gallstone-dissolving agent, namely the chenodeoxycholic acid (CDCA), is obtained.

Die 7<x-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure oder deren Salze lassen sich leicht in die Desoxycholsäure überführen, welche ihrerseits ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Herstellung von Progesteron und von Nebennierenrindensteroi-den (Corticosteroiden) ist. Dies geschieht durch Dehydratisie-rung und anschliessende Hydrierung nach bekannten Methoden. The 7 <x-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholanic acid or its salts can easily be converted into the deoxycholic acid, which in turn is a valuable starting material for the production of progesterone and adrenal cortex steroids (corticosteroids). This is done by dehydration and subsequent hydrogenation according to known methods.

Die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele erläutern die vorliegende Erfindung in ausführlicher Weise. Die Beispiele sollen aber keineswegs einschränkenden Charakter aufweisen. The following examples and reference examples illustrate the present invention in detail. However, the examples are in no way intended to be restrictive.

Herstellung von Mutanten Production of mutants

Eine Öse des Stammes Arthrobacter CA-35 (FERM-P Nr. 5145; ATCC Nr. 31651), die in einer Schrägkultur (Medium A: NaOH 0,5%, Cholsäure 5,0%, Pepton 0,5%, Hefeextrakt 0,5%, NaCl 0,5% und Agar 1,5%) gezüchtet worden war, An eyelet of the Arthrobacter CA-35 strain (FERM-P No. 5145; ATCC No. 31651), which was grown in a slant culture (medium A: NaOH 0.5%, cholic acid 5.0%, peptone 0.5%, yeast extract 0 , 5%, NaCl 0.5% and agar 1.5%) had been grown,

wurde in ein Medium (10 ml, Medium B: NaOH 1%, Cholsäure 10%, NH4NO3 0,2%, KH2PO4 0,2%, K2HPO4 0,5%, MgS04-7H20 0,02% und Hefeextrakt 0,01%) in einem Reagenzglas von 200 x 21 mm Durchmesser inokuliert und unter Schütteln während 24 Stunden bei 30 0 C inkubiert. Die so erhaltene Kultur (0,3 ml) wurde einem Medium (10 ml Medium C: NaOH 0,05%, Cholsäure 0,5%, Glucose 0,5%, NH4NO3 0,2%, KH2PO4 0,2%, K2HPO4 0,5%, MgS04-7Ha0 0,02% und Hefeextrakt 0,01%) in einem Reagenzglas von 200 x 21 mm Durchmesser eingebracht und unter Schütteln während 15 bis 16 Stunden bei 300 C inkubiert. Die mikrobiellen Zellen wurden mit Hilfe eines Membranfilters (Poren-grösse 0,45 u) unter aseptischen Bedingungen geerntet, mit einer 0,lmolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0,20 ml) gewaschen und in der gleichen Pufferlösung (25 ml) suspendiert. was placed in a medium (10 ml, medium B: NaOH 1%, cholic acid 10%, NH4NO3 0.2%, KH2PO4 0.2%, K2HPO4 0.5%, MgS04-7H20 0.02% and yeast extract 0.01% ) inoculated in a test tube of 200 x 21 mm diameter and incubated with shaking at 30 0 C for 24 hours. The culture (0.3 ml) thus obtained was subjected to a medium (10 ml medium C: NaOH 0.05%, cholic acid 0.5%, glucose 0.5%, NH4NO3 0.2%, KH2PO4 0.2%, K2HPO4 0.5%, MgS04-7Ha0 0.02% and yeast extract 0.01%) in a test tube of 200 x 21 mm diameter and incubated with shaking at 300 C for 15 to 16 hours. The microbial cells were harvested using a membrane filter (pore size 0.45 u) under aseptic conditions, washed with a 0.1 molar phosphate buffer solution (pH 7.0.20 ml) and suspended in the same buffer solution (25 ml).

Eine Mutationsbehandlung erfolgte durch Zugabe von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Endkonzentration von 50 |ig/ml zur obigen Zellensuspension (4 ml) in einem Reagenzglas von 200 x 21 mm Durchmesser, wobei die Inkubation des Gemisches während 45 Minuten unter Schütteln bei 30 °C bewirkt wurde. Unter diesen Bedingungen betrug die letale Rate des Stammes Arthrobacter CA-35 ungefähr 80%. A mutation treatment was carried out by adding N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in a final concentration of 50 μg / ml to the above cell suspension (4 ml) in a test tube of 200 × 21 mm diameter, the mixture being incubated during Was effected with shaking at 30 ° C for 45 minutes. Under these conditions, the lethal rate of the Arthrobacter CA-35 strain was approximately 80%.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

o5 o5

13 13

646 442 646 442

Die so behandelten Zellen wurden durch einen Membranfilter mit einer Porengrösse von 0,45 ji unter aseptischen Bedingungen geerntet, mit einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0,20 ml) gewaschen und in der gleichen Pufferlösung (25 ml) suspendiert. Die so erhaltene Zellensuspension 5 wurde mit einer sterilisierten, normalen Kochsalzlösung verdünnt und über Agarplatten (Medium D: NaOH 0,1%, Cholsäure 1,0%, NH4NO3 0,2%, KH2PO4 0,2%, K2HPO4 0,5%, MgS04-7H20 0,02%, Hefeextrakt 0,01% und Agar 1,5%) so ausgebreitet, dass pro Platte 300 bis 500 Kolonien gebildet 10 wurden. Die Platten wurden während 4 Tagen bei 30 °C inkubiert. Jede so gebildete Kolonie wurde isoliert und auf einer Platte (Medium E: Pepton 0,5%, Hefeextrakt 0,5%, Natriumchlorid 0,5% und Agar 1,5%) während 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Jede auf der Platte des Mediums E gebildete Kolo- 15 nie wurde auf eine Platte des Mediums D übertragen und während 20 Stunden bei 30 °C inkubiert. The cells treated in this way were harvested through a membrane filter with a pore size of 0.45 ji under aseptic conditions, washed with a 0.1 molar phosphate buffer solution (pH 7.0.20 ml) and suspended in the same buffer solution (25 ml). The cell suspension 5 thus obtained was diluted with a sterilized, normal saline solution and agar plates (medium D: NaOH 0.1%, cholic acid 1.0%, NH4NO3 0.2%, KH2PO4 0.2%, K2HPO4 0.5%, MgS04-7H20 0.02%, yeast extract 0.01% and agar 1.5%) so that 300 to 500 colonies were formed per plate 10. The plates were incubated at 30 ° C for 4 days. Each colony so formed was isolated and incubated on a plate (medium E: peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 0.5% and agar 1.5%) for 24 hours at 30 ° C. Each colony formed on the medium E plate was transferred to a medium D plate and incubated at 30 ° C for 20 hours.

Jede Kolonie auf der obigen Platte des Mediums E, bei welcher die übertragene Kolonie auf der Platte des Mediums D nicht wuchs, wurde in einem Schrägkulturmedium 20 Each colony on the above medium E plate where the transferred colony on the medium D plate did not grow was in a slant culture medium 20

(Medium F: NaOH 0,1%, Cholsäure 1,0%, Pepton 0,5%, Hefeextrakt 0,5%, NaCl 0,5% und Agar 1,5%) während 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Eine Öse voll dieser Schrägkultur wurde dann in ein Medium (10 ml, Medium G: NaOH 0,5%, Cholsäure 5,0%, Glucose 0,5%, NH4NO3 0,2%, KH2PO4 0,2%, 25 K2HPO4 0,5%, MgS04-7H20 0,02% und Hefeextrakt 0,01%) in einem Reagenzglas (200 x 21 mm Durchmesser) inokuliert und unter Schütteln während 3 Tagen bei 30 °C inkubiert. (Medium F: NaOH 0.1%, cholic acid 1.0%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5% and agar 1.5%) incubated at 30 ° C for 24 hours. An eyelet full of this slant culture was then placed in a medium (10 ml, medium G: NaOH 0.5%, cholic acid 5.0%, glucose 0.5%, NH4NO3 0.2%, KH2PO4 0.2%, 25 K2HPO4 0 , 5%, MgS04-7H20 0.02% and yeast extract 0.01%) in a test tube (200 x 21 mm diameter) and incubated with shaking at 30 ° C for 3 days.

Beim Prüfen durch Dünnschichtchromatographie der in jedem Medium G angereicherten Produkte fand man einen 30 Mikroorganismus, welcher in selektiver Weise die 3a,7a-Di-hydroxy-12-keto-5ß-cholansäure oder ein Salz davon erzeugte. Diesem Mikroorganismus gab man den Namen Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3. When the products enriched in each medium G were checked by thin layer chromatography, a microorganism was found which selectively produced the 3a, 7a-di-hydroxy-12-keto-5β-cholanic acid or a salt thereof. This microorganism was given the name strain Arthrobacter CA-35-M-965-3.

Die obige Arbeitsmethode wird nachstehend als 35 The above working method is hereinafter referred to as 35

«Methode M» bezeichnet. Gemäss dieser Methode M wurde eine Mutationsbehandlung unter Verwendung des Stammes Arthrobacter CA-35-M-965-3 als Ausgangs-Stamm durchgeführt. Es ergaben sich drei Stämme, welche in selektiver Weise die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure oder ein 40 Salz davon bildeten. Diesen Stämmen wurden die Bezeichnungen Arthrobacter CA-35-A589, Arthrobacter CA-35-A849 bzw. Arthrobacter CA-35-A-1071-Stämme gegeben. "Method M" called. According to this method M, mutation treatment was carried out using the strain Arthrobacter CA-35-M-965-3 as the starting strain. There were three strains which selectively formed the 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid or a salt thereof. These strains were given the names Arthrobacter CA-35-A589, Arthrobacter CA-35-A849 and Arthrobacter CA-35-A-1071 strains.

Aus der Kolonie des Stammes Arthrobacter CA-35-A589 wurden zwei überlegene Stämme isoliert und ihnen die 45 Two superior strains were isolated from the colony of the strain Arthrobacter CA-35-A589 and the 45

Namen Arthrobacter CA-35-A589-29-32 und Arthrobacter CA-35-A589-47-Stämme gegeben. Ein überlegener Stamm wurde gleichfalls aus der Kolonie des Stammes Arthrobacter CA-35-A-1071 isoliert und als Stamm Arthrobacter CA-35-A1071-15 bezeichnet. 50 Given names Arthrobacter CA-35-A589-29-32 and Arthrobacter CA-35-A589-47 strains. A superior strain was also isolated from the colony of the Arthrobacter CA-35-A-1071 strain and referred to as the Arthrobacter CA-35-A1071-15 strain. 50

Ein weiterer überlegener Stamm wurde unter Verwendung des Stammes Artrhobacter CA-35-A849 als Ausgangs-Stamm nach der Methode M erzeugt und bekam den Namen Stamm Arthrobacter CA-35-A-1448. Arthrobacter CA-35-A-1475-Stamm wurde unter Verwendung des Stammes Arthro- 55 bacter CA-35-A-1448 als Ausgangs-Stamm nach der Methode M erzeugt. Der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766 wurde unter Verwendung des Stammes Arthrobacter CA-35-A-1766 wurde unter Verwendung des Stammes Arthrobacter CA-35-A-1071 als Ausgangs-Stamm nach der Methode M erzeugt 60 und aus der Kolonie des entstandenen Stammes Arthrobacter CA-35-A-1766 wurde Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15 isoliert. Another superior strain was generated using the Artrhobacter CA-35-A849 strain as the starting strain using Method M and was named the Arthrobacter CA-35-A-1448 strain. Arthrobacter CA-35-A-1475 strain was generated using the Arthro-55 bacter CA-35-A-1448 strain as a starting strain using Method M. The strain Arthrobacter CA-35-A-1766 was generated using the strain Arthrobacter CA-35-A-1766 using the strain Arthrobacter CA-35-A-1071 as a starting strain according to method M 60 and from the colony the Arthrobacter CA-35-A-1766-15 strain was isolated from the resulting strain Arthrobacter CA-35-A-1766.

Der Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12 wurde nach der folgenden Methode erzeugt. 05 The Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain was generated by the following method. 05

Eine Öse voll vom Stamm Arthrobacter CA-35 (FERM-P Nr. 5145; ATCC Nr. 31651), welcher auf einer Schrägkultur in Medium A gezüchtet worden war, wurde in das Medium B A loop full of the strain Arthrobacter CA-35 (FERM-P No. 5145; ATCC No. 31651), which had been grown on a slant culture in medium A, was placed in medium B

(10 ml) in einem Reagenzglas (200 x 21 mm Durchmesser) inokuliert und während 20 Stunden unter Schütteln bei 30 °C inkubiert. Mikrobielle Zellen wurden durch Zentrifugieren (10 000 Umdrehungen pro Minute) während 5 Minuten bei 5 °C unter aseptischen Bedingungen geerntet. Dann wurden die Zellen in 10 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in eine Petrischale (Durchmesser 7,5 cm) gefüllt und diese in einem Abstand von ungefähr 27 cm unter einer 15 Watt Ultraviolettlampe (2537 À) in einen keimfreien Behälter gestellt, worauf man die Bestrahlung mit den Ultraviolettstrahlen während 10 Minuten vornahm. Unter diesen Bedingungen gelangte man zu einer letalen Rate des Stammes Arthrobacter CA-35 von ungefähr 99,9%. (10 ml) in a test tube (200 x 21 mm diameter) and incubated for 20 hours with shaking at 30 ° C. Microbial cells were harvested by centrifugation (10,000 revolutions per minute) for 5 minutes at 5 ° C under aseptic conditions. Then the cells were suspended in 10 ml of sterilized water. The suspension was placed in a petri dish (7.5 cm in diameter) and placed in a sterile container at a distance of approximately 27 cm under a 15 watt ultraviolet lamp (2537 À), after which the ultraviolet rays were exposed for 10 minutes. Under these conditions, the lethal rate of the Arthrobacter CA-35 strain was approximately 99.9%.

Nach erfolgter Bestrahlung wurden die mikrobiellen Zellen mit einem Membranfilter geerntet, mit einer 0,lmolaren Phosphatpufferlösung gewaschen und in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Die entstandene Suspension wurde mit einer normalen Kochsalzlösung verdünnt und die obige Züchtung unter Verwendung der Medien D bis G wiederholt, um einen überlegenen Stamm zu erhalten, welcher in selektiver Weise die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure oder ein Salz davon erzeugte. After irradiation, the microbial cells were harvested with a membrane filter, washed with a 0.1 molar phosphate buffer solution and suspended in the same buffer solution. The resulting suspension was diluted with a normal saline solution and the above cultivation repeated using media D to G to obtain a superior strain which selectively obtained the 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid or a salt generated from it.

Beispiel 1 example 1

Der Stamm Arthrobacter CA-35 (FERM-P Nr. 5145; ATCC Nr. 31651) wurde wie folgt gezüchtet: The Arthrobacter CA-35 strain (FERM-P No. 5145; ATCC No. 31651) was grown as follows:

Zusammensetzung des Züchtungsmediums : Composition of the growth medium:

Cholsäure 100 g Cholic acid 100 g

Ammoniumnitrat 2,0 g Ammonium nitrate 2.0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 2,0 g Potassium dihydrogen phosphate 2.0 g

Dikaliumhydrogenphosphat 5,0 g Dipotassium hydrogen phosphate 5.0 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,2 g Magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g

Hefeextrakt 0,1 g Yeast extract 0.1 g

Natriumhydroxyd 10 g destilliertes Wasser bis 1 Liter Sodium hydroxide 10 g distilled water up to 1 liter

Die obigen Bestandteile wurden miteinander vermischt, um ein Kulturmedium in einer Menge von 1 Liter zu erhalten. Jeweils 100-ml-Portionen dieses Kulturmediums wurden in zehn Sakaguchi-Kolben (Volumen 500 ml) verteilt und während 15 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven behandelt. Jeder Kolben wurde jeweils mit 10 ml Impfkultur versehen, welche durch vorgängiges Züchten des Stammes im gleichen Medium unter Schütteln bei 30 °C während 2 Tagen erhalten worden war. Jeder Kolben wurde auf einer Schüttelvorrichtung während 2 Tagen bei 30 °C inkubiert. The above ingredients were mixed together to obtain a culture medium in an amount of 1 liter. 100 ml portions of this culture medium were distributed into ten Sakaguchi flasks (volume 500 ml) and treated in an autoclave at 120 ° C. for 15 minutes. Each flask was provided with 10 ml inoculum, which had been obtained by previously growing the strain in the same medium with shaking at 30 ° C for 2 days. Each flask was incubated on a shaker at 30 ° C for 2 days.

Nach beendeter Züchtung wurden die Kulturbrühen vereinigt und zentrifugiert, um mikrobielle Zellen zu entfernen. Die entstandene, überstehende Flüssigkeit wurde durch Zugabe von 600 ml einer wässrigen ln-Salzsäurelösung sauer gestellt, wodurch ein Neiderschalg gebildet wurde. Dieser Niederschlag wurde abgetrennt und die verbleibende Lösung mit 1 Liter Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wurde aus dem Extrakt mit Hilfe eines Rotationsverdampfers abdestilliert und der Rückstand mit dem obigen Niederschlag vereinigt, wobei man ein Gemisch von Cholansäurederivaten und Cholsäure (85 g) erhielt. After the cultivation was completed, the culture broths were combined and centrifuged to remove microbial cells. The resulting supernatant liquid was acidified by adding 600 ml of an aqueous solution of 1N hydrochloric acid, thereby forming a jealousy. This precipitate was separated and the remaining solution extracted with 1 liter of ethyl acetate. The ethyl acetate was distilled off from the extract using a rotary evaporator, and the residue was combined with the above precipitate to obtain a mixture of cholanic acid derivatives and cholic acid (85 g).

Eine kleine Menge dieser Mischung wurde in Methanol in einer Konzentration von 1% gelöst. Dann wurde die Lösung (10 1J.1) in eine mit hoher Geschwindigkeit arbeitende Flüssigchromatographievorrichtung injiziert, welche mit einer Li-Bondapak-C-18-Säule (vom HLC-GPC-244-Typus der Fa. Waters in USA) ausgerüstet war. A small amount of this mixture was dissolved in methanol at a concentration of 1%. The solution (10 1J.1) was then injected into a high-speed liquid chromatography device equipped with a Li-Bondapak C-18 column (HLC-GPC-244 type from Waters in the USA).

Die Säule wurde mit einer Mischung von Wasser und Methanol im Mischungsverhältnis von 30:70 Vol.-Teilen und einem pH-Wert von 2,5 mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/ min eluiert und der Refraktionsindex des Eluates gemessen. The column was eluted with a mixture of water and methanol in a mixing ratio of 30:70 parts by volume and a pH of 2.5 at a rate of 1 ml / min and the refractive index of the eluate was measured.

646442 646442

14 14

Die beiliegende Fig. 1 zeigt das erhaltene Chromato-gramm. Die Peaks A, B, C und D in Fig. 1 entsprechen jenen der Referenzstandardsverbindungen 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The attached Fig. 1 shows the chromatogram obtained. Peaks A, B, C and D in Fig. 1 correspond to those of the reference standard compounds 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a, 12a-dihydroxy -3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Beim Isolieren der Verbindungen in den Fraktionen, welche den Peaks A, B und C entsprachen, und bei der Bestimmung ihrer chemischen Konstitutionen aufgrund der Massenspektren, Infrarotspektren und magnetischen Kernresonanzspektren davon ergab sich, dass es sich um die 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure bzw. 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholan-säure handelte. Die beiliegenden Fig. 2,3 und 4 zeigen die Infrarotspektren (A, B und C) der Methylester der Verbindungen, welche den Peaks A, B und C entsprechen, im Vergleich mit jenen der Referenzstandardverbindungen (A', B' und C'). Isolation of the compounds in the fractions corresponding to peaks A, B and C and determination of their chemical constitutions based on the mass spectra, infrared spectra and nuclear magnetic resonance spectra thereof revealed that they were 7a-hydroxy-3.12- diketo-5ß-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid or 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5ß-cholanic acid. The accompanying FIGS. 2, 3 and 4 show the infrared spectra (A, B and C) of the methyl esters of the compounds which correspond to peaks A, B and C in comparison with those of the reference standard compounds (A ', B' and C ') .

Die Schmelzpunkte der Verbindungen und ihrer Methylester, welche den Peaks A, B und C entsprechen, finden sich in der folgenden Tabelle 2. The melting points of the compounds and their methyl esters, which correspond to peaks A, B and C, can be found in Table 2 below.

Tabelle 2 Table 2

Verbin- Schmelzpunkte der Schmelzpunkte der düngen Methylester (°C) freien Säuren (°C) Melting points of the melting points of the fertilized methyl esters (° C) free acids (° C)

Gefunden Found

Literatur literature

Gefunden Found

Literatur literature

Peak A Peak A

150-152 150-152

152-154 152-154

- -

Peak B Peak B

154-156 154-156

156-157 156-157

219-220 219-220

221-222 221-222

Peak C Peak C

168-169 168-169

169-172 169-172

185-186 185-186

186-188 186-188

Die Ausbeute an Produkten und die Menge an Cholsäure, welche unverändert zurückblieb, wurden berechnet aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromatogramms von Fig. 1. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 3. The yield of products and the amount of cholic acid which remained unchanged were calculated based on the area ratio of the chromatogram of Fig. 1. The results are shown in Table 3 below.

Tabelle 3 Table 3

Verbindungen Flächen- Umwand- Ausbeute Connections area-conversion-yield

Verhältnis lungsrate bzw. Menge Ratio lungsrate or quantity

(%) (g) (%) (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo- 7a-hydroxy-3,12-diketo-

5ß-cholansäure (Peak A) 5ß-cholic acid (peak A)

28,54 28.54

24,3 24.3

3a,7a-Dihydroxy-12-keto- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-

5ß-cholansäure (Peak B) 5ß-cholic acid (peak B)

63,06 63.06

53,6 53.6

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-

5ß-cholansäure (Peak C) 5ß-cholic acid (peak C)

1,54 1.54

1,30 1.30

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

6,86 6.86

5,80 5.80

Beispiel 2 Example 2

Es wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gearbeitet mit dem Unterschied, dass dem Medium überdies 5,0 g/1 Glucose zugesetzt wurde, um eine Mischung von Produkten und nicht umgesetzter Cholsäure zu erhalten. Die Menge des Gemisches betrug 91,0 g. Dieses Gemisch von 91,0 g wurde dann in 270 ml Methanol gelöst und mit 9 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wurde während 20 Minuten unter Rückfluss zum Sieden erhitzt, um die Produkte und die Cholsäure in die entsprechenden Methylester überzuführen. The procedure was the same as in Example 1, except that 5.0 g / 1 glucose was further added to the medium to obtain a mixture of products and unreacted cholic acid. The amount of the mixture was 91.0 g. This mixture of 91.0 g was then dissolved in 270 ml of methanol and 9 ml of concentrated hydrochloric acid were added. The resulting solution was refluxed for 20 minutes to convert the products and cholic acid to the corresponding methyl esters.

Dann wurde eine Säule von 1200 x 70 mm Durchmesser mit 1500 g Kieselgel C-200 beschickt, worauf die nach den obigen Angaben erhaltenen Methylester darin adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit Chloroform eluiert, wobei man 25,1 g 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäuremethylester erhielt. Hierauf wurde die Säule mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 99:1 Then a column of 1200 x 70 mm diameter was charged with 1500 g of silica gel C-200, whereupon the methyl esters obtained as described above were adsorbed therein. The column was eluted with chloroform to obtain 25.1 g of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanoic acid, methyl ester. The column was then mixed with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 99: 1

Vol.-Teilen eluiert, wobei man zuerst 1,40 g 7a,12a-Di-hydroxy-3-keto-5ß-cholansäuremethylester und hierauf 56,4 g 3cc,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäuremethylester erhielt. Vol.-parts eluted, firstly 1.40 g of 7a, 12a-di-hydroxy-3-keto-5β-cholanic acid methyl ester and then 56.4 g of 3cc, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanoic acid methyl ester being obtained.

Diese Methylester wurden hydrolysiert, wobei man 24,8 g 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 1,38 g 7a,I2ct-Di-hydroxy-3-keto-5ß-cholansäure und 56,0 g 3a,7a-Dihydro-xy-12-keto-5ß-cholansäure erhielt. These methyl esters were hydrolyzed to give 24.8 g of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid, 1.38 g of 7a, I2ct-di-hydroxy-3-keto-5β-cholic acid and 56.0 g of 3a , 7a-dihydro-xy-12-keto-5β-cholic acid was obtained.

Beispiel 3 Example 3

Man wiederholte das Verfahren gemäss Beispiel 1 mit dem Unterschied, dass die Konzentration an Cholsäure variiert und 10 Gew.-% Natriumhydroxyd, bezogen auf die verwendete Cholsäure, dem Medium zugegeben wurde. Die Aus' beute an Produkten und die Menge an nicht umgesetzter Cholsäure bei verschiedenen Konzentrationswerten des Substrates (Cholsäure) finden sich in der folgenden Tabelle 4. The procedure according to Example 1 was repeated with the difference that the concentration of cholic acid varies and 10% by weight sodium hydroxide, based on the cholic acid used, was added to the medium. The yield of products and the amount of unreacted cholic acid at different concentration values of the substrate (cholic acid) can be found in Table 4 below.

Tabelle 4 Table 4

Verbindungen Ausbeuten Yield compounds

Substratkonzentration (g/1) 50 200 300 Substrate concentration (g / 1) 50 200 300

3a,7a-Dihydroxy-12-keto- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-

5ß-cholansäure 5β-cholic acid

27,1g 27.1g

108,3 g 108.3 g

47,4 g 47.4 g

7 a-Hydroxy-3,12-diketo- 7 a-hydroxy-3,12-diketo

5ß-cholansäure 5β-cholic acid

12,3 g 12.3 g

49,0 g 49.0 g

21,4 g 21.4 g

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-

5ß-cholansäure 5β-cholic acid

0,7 g 0.7 g

2,65 g 2.65 g

1,20 ! 1.20!

Cholsäure kleine Cholic acid small

20,1g 20.1g

230 g 230 g

Menge amount

Beispiel 4 Example 4

Man wiederholte das Verfahren gemäss Beispiel 2 mit dem Unterschied, dass jeder Kolben während 24 Stunden bei 30 °C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert wurde, um ein Gemisch von Produkten und nicht umgesetzter Cholsäure zu erhalten. Auf diese Weise erhielt man 98,0 g Material. Dieses Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 der Flüssigchromatographie mit hoher Geschwindigkeit unterworfen, um die Zusammensetzung festzustellen. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 5. The procedure according to Example 2 was repeated with the difference that each flask was incubated for 24 hours at 30 ° C. on a shaker in order to obtain a mixture of products and unreacted cholic acid. In this way, 98.0 g of material were obtained. This mixture was subjected to high-speed liquid chromatography under the same conditions as in Example 1 to determine the composition. The results can be found in Table 5 below.

Tabelle 5 Table 5

Verbindungen links

Verhältnis relationship

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid

67,7 67.7

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid

8,3 8.3

7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5β-cholic acid

4,0 4.0

Cholsäure Cholic acid

20,0 20.0

Beispiel 5 Example 5

Man arbeitete in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 mit dem Unterschied, dass man 20 ml Portionen der Impfkultur, wie sie durch Züchten während 24 Stunden bei 30 °C erhalten worden war, einem jeden Kolben hinzugab, um eine Mischung von Produkten und nicht umgesetzter Cholsäure zu erhalten. Auf diese Weise erhielt man 117,0 g eines Gemisches, das man der Chromatographie mit hoher Geschwindigkeit unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzog, um die Zusammensetzung festzustellen. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 6. The same procedure as in Example 2 was followed, except that 20 ml portions of the seed culture obtained by culturing for 24 hours at 30 ° C were added to each flask to produce a mixture of products and unreacted To get cholic acid. There was thus obtained 117.0 g of a mixture which was subjected to high-speed chromatography under the same conditions as in Example 1 to determine the composition. The results can be found in Table 6 below.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

05 05

15 15

646 442 646 442

Tabelle 6 Table 6

Verbindungen links

Verhältnis relationship

3ct,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure 3ct, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid

63,3 63.3

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid

23,5 23.5

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5β-cholic acid

2,0 2.0

Cholsäure Cholic acid

11,2 11.2

Beispiel 6 Example 6

Der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P Nr. 5521 ; ATCC Nr. 31652) wurde wie folgt gezüchtet: The strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5521; ATCC No. 31652) was grown as follows:

Die Zusammensetzung des Kulturmediums war die folgende: The composition of the culture medium was as follows:

Cholsäure 100 g Ammoniumnitrat 2,0 g Kaliumdihydrogenphosphat 2,0 g Dikaliumhydrogenphosphat 5,0 g Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,2 g Hefeextrakt 0,1 g Cholic acid 100 g ammonium nitrate 2.0 g potassium dihydrogen phosphate 2.0 g dipotassium hydrogen phosphate 5.0 g magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g yeast extract 0.1 g

Natriumhydroxyd 10 g Glucose 5,0 g Leitungswasser bis 1 Liter Sodium hydroxide 10 g glucose 5.0 g tap water up to 1 liter

Die obigen Ingredienzien mit Ausnahme der Glucose wurden in Leitungswasser gemischt, um ein Volumen von 800 ml zu erreichen, und dann während 15 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven behandelt. Getrennt davon wurde die Glucose in 200 ml Leitungswasser gelöst und während 30 Minuten bei 110 °C im Autoklaven behandelt. Nach dem Kühlen wurden beide Lösungen miteinander vereinigt, wobei man ein Kulturmedium (1 Liter) erhielt. Jeweils 100-ml-Portionen dieses Kulturmediums wurden auf zehn Sakaguchi-Kolben (Volumen 500 ml) unter aseptischen Bedingungen verteilt. Jeder Kolben wurde mit 2 ml der Impfkultur versetzt, die man dadurch erhielt, dass man zuvor den Stamm in dem gleichen Medium unter Schütteln während 14 Stunden bei 30 °C züchtete. Jeder Kolben wurde während 3 Tagen bei 30 °C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. The above ingredients except for the glucose were mixed in tap water to reach a volume of 800 ml, and then treated in an autoclave at 120 ° C for 15 minutes. Separately, the glucose was dissolved in 200 ml of tap water and treated in an autoclave at 110 ° C. for 30 minutes. After cooling, both solutions were combined to give a culture medium (1 liter). 100 ml portions of this culture medium were distributed to ten Sakaguchi flasks (volume 500 ml) under aseptic conditions. Each flask was added with 2 ml of the inoculum obtained by growing the strain in the same medium with shaking at 30 ° C for 14 hours beforehand. Each flask was incubated on a shaker at 30 ° C for 3 days.

Nach beendeter Züchtung wurden die Kulturbrühen vereinigt und zentrifugiert, um mikrobielle Zellen zu entfernen. Die erhaltene, überstehende Flüssigkeit wurde durch Zugabe von 600 ml einer wässrigen ln-Salzsäurelösung angesäuert, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Dieser Niederschlag wurde abgetrennt und die verbleibende Lösung mit 1 Liter Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wurde aus dem Extrakt mit Hilfe eines Rotationsverdampfers abdestilliert und der Rückstand mit dem obigen Niederschlag vereinigt, wobei man eine Mischung von Cholansäurederivaten und Cholsäure (99,3 g) erhielt. After the cultivation was completed, the culture broths were combined and centrifuged to remove microbial cells. The obtained supernatant liquid was acidified by adding 600 ml of an aqueous 1N hydrochloric acid solution, whereby a precipitate was formed. This precipitate was separated and the remaining solution extracted with 1 liter of ethyl acetate. The ethyl acetate was distilled off from the extract using a rotary evaporator, and the residue was combined with the above precipitate to obtain a mixture of cholanic acid derivatives and cholic acid (99.3 g).

Eine kleine Menge dieser Mischung wurde in Methanol in einer Konzentration von 2% gelöst. Die Lösung (10 jil) wurde in eine rasch arbeitende Flüssigchromatographievorrichtung, die mit einer ji-Bondapak- C-18-Säule (vom HLC-GPC-244-Typus) ausgerüstet war, injiziert. A small amount of this mixture was dissolved in methanol at a concentration of 2%. The solution (10 jil) was injected into a high-speed liquid chromatography device equipped with a ji-Bondapak C-18 column (of the HLC-GPC-244 type).

Die Säule wurde mit einer Mischung von Wasser und Methanol im Mischungsverhältnis von 30:70 Vol.-Teilen bei einem pH-Wert von 4,0 mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/ min eluiert und der Refraktionsindex des Eluates gemessen. The column was eluted with a mixture of water and methanol in a mixing ratio of 30:70 parts by volume at a pH of 4.0 at a rate of 1 ml / min and the refractive index of the eluate was measured.

Die beiliegende Fig. 5 zeigt das erhaltene Chromato-gramm. Die Peaks B und D in Fig. 5 entsprechen jenen der Bezugssubstanzen 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The enclosed FIG. 5 shows the chromatogram obtained. The peaks B and D in Fig. 5 correspond to those of the reference substances 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid and cholic acid, respectively.

Beim Isolieren der Verbindung der dem Peak B entsprechenden Fraktion und bei der Bestimmung ihrer chemischen Konstitution mit Hilfe des Massenspektrums, Infrarotspektrums und magnetischen Kernresonanzspektrums bewiesen die Spektren, dass es sich bei dieser Verbindung um die 3ct,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure handelt. When isolating the compound of the fraction corresponding to Peak B and determining its chemical constitution with the aid of the mass spectrum, infrared spectrum and magnetic resonance spectrum, the spectra proved that this compound is the 3ct, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß- cholic acid.

Die Ausbeute an den Produkten und die Menge an Cholsäure, welche ohne irgendwelche Änderungen zurückblieb, wurden aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromato-gramms von Fig. 5 berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 7. The yield of the products and the amount of cholic acid remaining without any changes were calculated based on the area ratio of the chromatogram of FIG. 5. The results can be found in Table 7 below.

Tabelle 7 Table 7

Verbindungen Umwandlungs- Ausbeute bzw. Compounds conversion yield or

rate* (%) Menge (g) rate * (%) quantity (g)

3a,7a-Dihydroxy-12-keto- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-

5ß-cholansäure (Peak B) 98,85 98,16 5β-cholic acid (peak B) 98.85 98.16

andere aus Cholsäure erhaltene Derivate 0,59 0,59 other derivatives obtained from cholic acid 0.59 0.59

Cholsäure (Peak D) 0,56 0,55 Cholic acid (Peak D) 0.56 0.55

* Die Umwandlungsrate wurde aufgrund des Flächenverhältnisses berechnet. * The conversion rate was calculated based on the area ratio.

Beispiel 7 Example 7

Es wurde in gleicher Weise vorgegangen wie in Beispiel 6 mit dem Unterschied, dass man eine mikrobielle Zellensuspension, die man herstellte, indem man mikrobielle Zellen aus 10 ml der Impfkultur durch Zentrifugieren isolierte und sie in 10 ml sterilisiertem Wasser suspendierte, jedem Kolben anstelle von 2 ml Impfkultur hinzugab, wodurch man eine Mischung von Produkten und verbliebener Cholsäure (99,5 g) erhielt. Diese 99,5 g der Mischung wurden in 270 ml Methanol gelöst und mit 9 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Die so erhaltene Lösung wurde hierauf während 20 Minuten unter Rückfluss zum Sieden erhitzt, um die Produkte und die Cholsäure in die entsprechenden Methylester überzuführen. The procedure was the same as in Example 6, with the difference that a microbial cell suspension, which was prepared by isolating microbial cells from 10 ml of the seed culture by centrifugation and suspending them in 10 ml of sterilized water, was used in each flask instead of 2 ml of seed culture was added to give a mixture of products and remaining cholic acid (99.5 g). This 99.5 g of the mixture was dissolved in 270 ml of methanol and 9 ml of concentrated hydrochloric acid were added. The solution thus obtained was then heated to boiling under reflux for 20 minutes in order to convert the products and the cholic acid into the corresponding methyl esters.

Eine Säule von 1200 x 70 mm Durchmesser wurde mit 1500 g Kieselgel C-200 beschickt, und dann wurden die obigen Methylester darin adsorbiert. Die Säule wurde mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 99:1 Vol.-Teilen eluiert, wobei man 102,0 g 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäuremethylester erhielt, den man zur Bildung von 98,5 g 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure hydrolysierte. A column of 1200 x 70 mm in diameter was charged with 1500 g of C-200 silica gel, and then the above methyl esters were adsorbed therein. The column was eluted with a mixture of chloroform and ethanol in a mixing ratio of 99: 1 parts by volume to give 102.0 g of methyl 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanoic acid, which was used to form 98, 5 g of 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid hydrolyzed.

Beispiel 8 Example 8

Man wiederholte das Verfahren gemäss Beispiel 6 mit dem Unterschied, dass die Konzentration an Cholsäure variiert wurde, dass man ferner dem Medium 10 Gew.-% Natriumhydroxyd, bezogen auf die verwendete Cholsäure, hinzugab und überdies wässrige ln-Salzsäurelösung in einer Menge von 60 ml pro 1 g Natriumhydroxyd hinzugab, wodurch man einen Niederschlag erhielt. Die Umwandlungsrate bzw. die Ausbeute an Produkt und die Menge an verbliebener Cholsäure bei der jeweiligen Konzentration des Substrates (Cholsäure) sind aus der Tabelle 8 ersichtlich. The procedure according to Example 6 was repeated, with the difference that the concentration of cholic acid was varied, that 10% by weight sodium hydroxide, based on the cholic acid used, was further added to the medium and, moreover, aqueous ln-hydrochloric acid solution in an amount of 60 ml per 1 g of sodium hydroxide was added, thereby obtaining a precipitate. The conversion rate or the yield of product and the amount of cholic acid remaining at the respective concentration of the substrate (cholic acid) are shown in Table 8.

Tabelle 8 Table 8

Verbindungen Umwandlungsrate bzw. Ausbeute Substratkonzentration (g/I) 1 5 10 20 50 100 200 Compounds Conversion rate or yield substrate concentration (g / I) 1 5 10 20 50 100 200

3cc,7ct-Dihydroxy--12- 3cc, 7ct dihydroxy - 12-

keto-5ß-cholan- 96,7- 98,0- 9,3 g 19,5 g 49,6 g 98,2 g 129,2 keto-5β-cholane 96.7- 98.0- 9.3 g 19.5 g 49.6 g 98.2 g 129.2

säure %* %* g Cholsäure 0,4- 0,7- 0,1g 0,2 g 0,1g 0,6 g 70,0 acid% *% * g cholic acid 0.4-0.7-0.1 g 0.2 g 0.1 g 0.6 g 70.0

%* %* g % *% * g

* Umwandlungsrate * Conversion rate

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

03 03

646 442 646 442

16 16

Beispiel 9 Example 9

Man arbeitete gemäss den Angaben in Beispiel 6 mit dem Unterschied, dass man den Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P Nr. 5523; ATCC Nr. 31653) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-29-32 einsetzte, die Konzentrationen an Cholsäure und Natriumhydroxyd im Medium mit 50 g/1 bzw. 5 g/1 einsetzte und jeden Kolben während 35 Stunden bei 30 °C inkubierte. Auf diese Weise gelangte man zu einer Mischung von Produkten und verbliebener Cholsäure (49,31 g). The procedure was as described in Example 6, with the difference that the Arthrobacter CA-35-A589-47 strain (FERM-P No. 5523; ATCC No. 31653) was used instead of the Arthrobacter CA-35-A589-29-32 strain used, the concentrations of cholic acid and sodium hydroxide in the medium with 50 g / 1 or 5 g / 1 and incubated each flask for 35 hours at 30 ° C. In this way, a mixture of products and remaining cholic acid (49.31 g) was obtained.

Das Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 der raschen Flüssigchromatographie unterworfen. The mixture was subjected to rapid liquid chromatography under the same conditions as in Example 6.

Die beiliegende Fig. 6 zeigt das so erhaltene Chromato-gramm. Die Peaks A, B, C und D in Fig. 6 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, d.h. 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The enclosed FIG. 6 shows the chromatogram thus obtained. Peaks A, B, C and D in Fig. 6 correspond to those of the reference compounds, i.e. 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid, 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Wurden die den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen getrennt und der Dünnschichtchromatographie unterworfen, so enthielt jede den Peaks B, C bzw. D entsprechende Fraktion eine einzige Verbindung. Die dem Peak A entsprechende Fraktion bestand aus einer Mischung von 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure und anderem nicht-identifiziertem Material. When the fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography, each fraction corresponding to peaks B, C and D contained a single compound. The fraction corresponding to Peak A consisted of a mixture of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholic acid and other unidentified material.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge an Cholsäure, welche unverändert verblieb, wurden aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromatogramms gemäss Fig. 6 berechnet. Die Resultate finden sich in Tabelle 9. The yield of products and the amount of cholic acid which remained unchanged were calculated on the basis of the area ratio of the chromatogram according to FIG. 6. The results can be found in Table 9.

Tabelle 9 Table 9

Verbindungen links

Umwandlungs Conversion

Ausbeute bzw. Yield or

rate (%) rate (%)

Menge (g) Quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo- 5ß- 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-

cholansäure und nicht iden cholic acid and not iden

tifiziertes Material (Peak A) certified material (peak A)

0,80 0.80

0,39 0.39

3a,7a-Dihydroxy-12-keto- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-

5ß-cholansäure (Peak B) 5ß-cholic acid (peak B)

98,01 98.01

48,33 48.33

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-

5ß-cholansäure (Peak C) 5ß-cholic acid (peak C)

0,25 0.25

0,13 0.13

andere Derivate other derivatives

0,24 0.24

0,12 0.12

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

0,70 0.70

0,35 0.35

Beispiel 10 Example 10

Die Arbeitsweise war die gleiche wie in Beispiel 9 mit dem Unterschied, dass man den Stamm Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P Nr. 5524; ATCC Nr. 31654) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 einsetzte, wobei man zu einer Mischung von Produkten und verbliebener Cholsäure (49,34 g) gelangte. The procedure was the same as in Example 9 with the difference that the strain Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P No. 5524; ATCC No. 31654) was used instead of the strain Arthrobacter CA-35-A589-47, whereby a mixture of products and remaining cholic acid (49.34 g) was obtained.

Dieses Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 der raschen Flüssigchromatographie unterworfen. This mixture was subjected to rapid liquid chromatography under the same conditions as in Example 6.

Die beiliegende Fig. 7 gibt das erhaltene Chromatogramm wieder. Die Peaks A, B, C und D in Fig. 7 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7<x-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The enclosed FIG. 7 shows the chromatogram obtained. The peaks A, B, C and D in Fig. 7 correspond to those of the reference compounds, namely 7 <x-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a , 12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Wurden die den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen getrennt und der Dünnschichtchromatographie unterworfen, so enthielt jede Fraktion eine einzige Verbindung. When the fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography, each fraction contained a single compound.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge an Cholsäure, welche ohne verändert zu werden, darin verblieb, wurden aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromatogramms gemäss Fig. 7 berechnet. Die Resutlate finden sich in der folgenden Tabelle 10. The yield of products and the amount of cholic acid which remained therein without being changed were calculated on the basis of the area ratio of the chromatogram according to FIG. 7. The results are shown in Table 10 below.

Tabelle 10 Table 10

Verbindungen links

Umwandlungs Conversion

Ausbeute bzw. Yield or

rate (%) rate (%)

Menge (g) Quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo- 7a-hydroxy-3,12-diketo-

5ß-cholansäure (Peak A) 5ß-cholic acid (peak A)

3,2 3.2

1,58 1.58

3a,7a-Dihydroxy-12-keto- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-

5ß-cholansäure (Peak B) 5ß-cholic acid (peak B)

83,5 83.5

41,20 41.20

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-

5ß-cholansäure (Peak C) 5ß-cholic acid (peak C)

7,9 7.9

3,90 3.90

andere Derivate other derivatives

2,8 2.8

1,38 1.38

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

2,6 2.6

1,28 1.28

Beispiel 11 Example 11

Es wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 gearbeitet mit dem Unterschied, dass man den Stamm Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM.P Nr. 5525; ATCC Nr. 31655) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 einsetzte. Auf diese Weise gelangte man zu einem Gemisch von Produkten und verbleibender Cholsäure (49,1 g). The procedure was the same as in Example 9, with the difference that the strain Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM.P No. 5525; ATCC No. 31655) was used instead of the strain Arthrobacter CA-35-A589 -47 started. In this way a mixture of products and remaining cholic acid (49.1 g) was obtained.

Dieses Gemisch wurde der raschen Flüssigkeitschromatographie unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 unterzogen. This mixture was subjected to rapid liquid chromatography under the same conditions as in Example 6.

Die beiliegende Fig. 8 zeigt das erhaltene Chromatogramm. Die Peaks A, B, C und D in Fig. 8 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The enclosed FIG. 8 shows the chromatogram obtained. Peaks A, B, C and D in Fig. 8 correspond to those of the reference compounds, namely 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a, 12a -Dihydroxy-3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Beim Trennen der den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen und nach erfolgter Flüssigchromatographie enthielt jede der den Peaks B, C oder D entsprechende Fraktion eine einzige Verbindung. Die dem Peak A entsprechende Fraktion bestand aus einer Mischung der 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure und einem anderen nicht identifizierten Material. When the fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and after liquid chromatography, each fraction corresponding to peaks B, C or D contained a single compound. The fraction corresponding to Peak A consisted of a mixture of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholic acid and another unidentified material.

Die Ausbeuten dieser Produkte und die Mengen der verbliebenen Cholsäure wurden aufgrund des Oberflächenverhältnisses des Chromatogramms gemäss Fig. 8 berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 11. The yields of these products and the amounts of remaining cholic acid were calculated on the basis of the surface ratio of the chromatogram according to FIG. 8. The results can be found in Table 11 below.

Tabelle 11 Table 11

Verbindungen Umwandlungs- Ausbeute bzw. Compounds conversion yield or

rate (%) Menge (g) rate (%) quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure und nicht identi- 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholic acid and not identi-

fiziertes Material (Peak A) material (Peak A)

5,2 5.2

2,56 2.56

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-

cholansäure (Peak B) cholic acid (peak B)

93,9 93.9

46,30 46.30

7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5ß-

cholansäure (Peak C) cholic acid (peak C)

0,2 0.2

0,10 0.10

andere Derivate other derivatives

0,2 0.2

0,10 0.10

Cholsäure Cholic acid

0,5 0.5

0,25 0.25

Beispiel 12 Example 12

Es wurde nach den Angaben gemäss Beispiel 9 gearbeitet mit dem Unterschied, dass der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P Nr. 5526; ATCC Nr. 31656) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 verwendet wurde, wobei man zu einer Mischung von Produkten und verbliebener Cholsäure (49,30 g) gelangte. The procedure described in Example 9 was followed, with the difference that the Arthrobacter CA-35-A-1448 strain (FERM-P No. 5526; ATCC No. 31656) was used instead of the Arthrobacter CA-35-A589-47 strain , whereby a mixture of products and remaining cholic acid (49.30 g) was obtained.

Dieses Gemisch wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 der raschen Flüssigchromatographie unterworfen. This mixture was subjected to rapid liquid chromatography in the same manner as in Example 6.

Die beiliegende Fig. 9 zeigt das erhaltene Chromato- The enclosed FIG. 9 shows the chromato-

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

o5 o5

17 17th

646 442 646 442

gramm. Die Peaks A, B, C und D gemäss Fig. 9 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7ct-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. grams. The peaks A, B, C and D according to FIG. 9 correspond to those of the reference compounds, namely 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7ct-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a, 12a -Dihydroxy-3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Wurden die den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen getrennt und der Dünnschichtchromatographie unterzogen, so enthielt jede der den Peaks B, C oder D entsprechende Fraktion eine einzige Verbindung. Die dem Peak A entsprechende Fraktion bestand aus einer Mischung der 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure und anderem nicht identifiziertem Material. When the fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography, each fraction corresponding to peaks B, C or D contained a single compound. The fraction corresponding to Peak A consisted of a mixture of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholic acid and other unidentified material.

Die Ausbeuten an Produkten und die Mengen an Cholsäure, welche unveränderlich verblieb, wurden aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromatogramms gemäss Fig. 9 berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 12. The yields of products and the amounts of cholic acid which remained unchanged were calculated on the basis of the area ratio of the chromatogram according to FIG. 9. The results can be found in Table 12 below.

Tabelle 12 Table 12

Verbindungen Umwandlungs- Ausbeute bzw. Compounds conversion yield or

rate (%) Menge (g) rate (%) quantity (g)

fiziertes Material (Peak A) material (Peak A)

6,5 6.5

3,20 3.20

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-

cholansäure (Peak B) cholic acid (peak B)

88,0 88.0

43,39 43.39

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto-5ß- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5ß-

cholansäure (Peak C) cholic acid (peak C)

0,3 0.3

0,15 0.15

andere Derivate other derivatives

0,1 0.1

0,05 0.05

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

5,1 5.1

2,51 2.51

Beispiel 13 Example 13

Es wurde nach den gleichen Angaben wie in Beispiel 9 gearbeitet mit dem Unterschied, dass man den Stamm Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P Nr. 5527; ATCC Nr. 31657) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 einsetzte. Auf diese Weise erhielt man eine Mischung von Produkten und Cholsäure, welche unverändert blieb (49,35 g). The procedure was the same as in Example 9, with the difference that the strain Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P No. 5527; ATCC No. 31657) was used instead of the strain Arthrobacter CA-35-A589- 47 started. In this way a mixture of products and cholic acid was obtained which remained unchanged (49.35 g).

Dieses Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen, wie dies in Beispiel 6 beschrieben worden ist, einer rasch verlaufenden Flüssigchromatographie unterworfen. This mixture was subjected to rapid liquid chromatography under the same conditions as described in Example 6.

Die beiliegende Fig. 10 zeigt das erhaltene Chromato-gramm. Die Peaks A, B, C und D in Fig. 10 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The attached FIG. 10 shows the chromatogram obtained. The peaks A, B, C and D in Fig. 10 correspond to those of the reference compounds, namely 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a, 12a -Dihydroxy-3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Die Ausbeuten an Produkten und die Mengen an Cholsäure wurden aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromatogramms gemäss Fig. 10 berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 13. The yields of products and the amounts of cholic acid were calculated on the basis of the area ratio of the chromatogram according to FIG. 10. The results can be found in Table 13 below.

Tabelle 13 Table 13

Verbindungen links

Umwandlungs Conversion

Ausbeute bzw. Yield or

rate (%) rate (%)

Menge (g) Quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß- 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-

cholansäure (Peak A) cholic acid (peak A)

3,26 3.26

1,61 1.61

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-

cholansäure (Peak B) cholic acid (peak B)

92,0 92.0

45,40 45.40

7a, 12a-Dihydroxy-3-keto-5ß- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5ß-

cholansäure (Peak C) cholic acid (peak C)

0,20 0.20

0,10 0.10

andere Derivate geringe Menge other derivatives small amount

- -

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

4,54 4.54

2,24 2.24

Beispiel 14 Example 14

Man arbeitete nach den Angaben gemäss Beispiel 9 mit dem Unterschied, dass der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P Nr. 5528; ATCC Nr. 31658) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 verwendet wurde. Auf diese Weise erhielt man eine Mischung von Produkten und Cholsäure (49,27 g). One worked according to the information according to Example 9 with the difference that the strain Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528; ATCC No. 31658) used instead of the strain Arthrobacter CA-35-A589-47 has been. A mixture of products and cholic acid (49.27 g) was obtained in this way.

Dieses Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 der Flüssigchromatographie mit grosser Geschwindigkeit unterworfen. This mixture was subjected to high-speed liquid chromatography under the same conditions as in Example 6.

Die beiliegende Fig. 11 zeigt das erhaltene Chromato-gramm. Die Peaks A, B und D in der Fig. 11 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, d.h. der 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure bzw. Colsäure. The enclosed FIG. 11 shows the chromatogram obtained. Peaks A, B and D in Fig. 11 correspond to those of the reference compounds, i.e. 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholic acid or colic acid.

Wurden die den Peaks A, B und D entsprechenden Fraktionen getrennt und der Dünnschichtchromatographie unterworfen, so enthielt jede der Fraktionen eine einzige Verbindung. When the fractions corresponding to peaks A, B and D were separated and subjected to thin layer chromatography, each of the fractions contained a single compound.

Die Ausbeuten an Produkten und die Menge an verbleibender Cholsäure wurden aufgrund des Flächenverhältnisses des Chromatogramms gemäss Fig. 10 berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 14. The yields of products and the amount of cholic acid remaining were calculated on the basis of the area ratio of the chromatogram according to FIG. 10. The results can be found in Table 14 below.

Tabelle 14 Table 14

Verbindungen links

Umwandlungs Conversion

Ausbeute bzw. Yield or

rate (%) rate (%)

Menge (g) Quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß- 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-

cholansäure (Peak A) cholic acid (peak A)

0,23 0.23

0,11 0.11

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-

cholansäure (Peak B) cholic acid (peak B)

97,02 97.02

47,80 47.80

andere Derivate other derivatives

0,75 0.75

0,37 0.37

Colsäure (Peak D) Colic acid (peak D)

2,0 2.0

0,99 0.99

Beispiel 15 Example 15

Es wurde nach den gleichen Angaben wie in Beispiel 9 gearbeitet mit dem Unterschied, dass man den Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P Nr. 5529; ATCC Nr. 31659) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 einsetzte, wobei man zu einem Gemisch von Produkten und Cholsäure (49,36 g) gelangte. The procedure was the same as in Example 9, with the difference that the strain Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P No. 5529; ATCC No. 31659) was used instead of the strain Arthrobacter CA-35- A589-47 was used, resulting in a mixture of products and cholic acid (49.36 g).

Dieses Gemisch wurde der raschen Flüssigchromatographie unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 unterzogen. This mixture was subjected to rapid liquid chromatography under the same conditions as in Example 6.

Die beiliegende Fig. 12 zeigt das erhaltene Chromato-gramm. Die Peaks A, B und D gemäss Fig. 12 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. The enclosed FIG. 12 shows the chromatogram obtained. The peaks A, B and D according to FIG. 12 correspond to those of the reference compounds, namely 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholic acid and cholic acid, respectively.

Wurden die den Peaks A, B und D entsprechenden Fraktionen getrennt und der Dünnschichtchromatographie unterworfen, so enthielt jede den Peaks B oder D entsprechende Fraktion eine einzige Verbindung. Die dem Peak A entsprechende Fraktion bestand aus einem Gemisch der 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure und einem anderen nicht identifizierten Material. When the fractions corresponding to peaks A, B and D were separated and subjected to thin layer chromatography, each fraction corresponding to peaks B or D contained a single compound. The fraction corresponding to Peak A consisted of a mixture of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholic acid and another unidentified material.

Die Ausbeuten an Produkten und die Menge an verbleibender Cholsäure wurden aufgrund des Flächenverhältnsises des Chromatogramms gemäss Fig. 12 berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 15. The yields of products and the amount of cholic acid remaining were calculated on the basis of the area ratio of the chromatogram according to FIG. 12. The results can be found in Table 15 below.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

DD DD

646 442 646 442

18 18th

Tabelle 15 Table 15

Verbindungen links

Umwandlungs Conversion

Ausbeute bzw. Yield or

rate (%) rate (%)

Menge (g) Quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß- 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-

cholansäure und nicht iden cholic acid and not iden

tifiziertes Material (Peak A) certified material (peak A)

8,6 8.6

4,24 4.24

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-

cholansäure (Peak B) cholic acid (peak B)

85,3 85.3

42,11 42.11

andere Derivate other derivatives

2,0 2.0

0,99 0.99

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

4,1 4.1

2,02 2.02

Beispiel 16 Example 16

Man arbeitete in gleicher Weise wie in Beispiel 9 mit dem 15 Unterschied, dass man den Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P Nr. 5530; ATCC Nr. 31660) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A589-47 einsetzte. Auf diese Weise erhielt man ein Gemisch von Produkten und Cholsäure (49,33 g). 20 The procedure was the same as in Example 9, with the difference that the Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain (FERM-P No. 5530; ATCC No. 31660) was used instead of the Arthrobacter CA-35-A589 strain -47 started. In this way a mixture of products and cholic acid (49.33 g) was obtained. 20th

Dieses Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 einer raschen Flüssigchromatographie unterworfen. This mixture was subjected to rapid liquid chromatography under the same conditions as in Example 6.

Beiliegende Fig. 13 zeigt das erhaltene Chromatogramm. Die Peaks A, B, C und D gemäss Fig. 13 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß-cholansäure bzw. Cholsäure. Enclosed Fig. 13 shows the chromatogram obtained. The peaks A, B, C and D according to FIG. 13 correspond to those of the reference compounds, namely 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a, 12a -Dihydroxy-3-keto-5ß-cholic acid or cholic acid.

Beim Trennen der den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen und nach erfolgter Dünnschichtchromatographie erhielt man in jeder Fraktion eine einzige Verbindung. When the fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and after thin-layer chromatography, a single compound was obtained in each fraction.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge an verbleibender Cholsäure wurden aufgrund des Flächenverhältnisses gemäss Fig. 13 berechnet. Die Resultate finden sich in der Tabelle 16. The yield of products and the amount of cholic acid remaining were calculated based on the area ratio shown in FIG. 13. The results can be found in Table 16.

Tabelle 16 Table 16

25 25th

30 30th

Verbindungen links

Umwandlungs Conversion

Ausbeute bzw. Yield or

rate (%) rate (%)

Menge (g) Quantity (g)

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß- 7a-hydroxy-3,12-diketo-5ß-

40 40

cholansäure (Peak A) cholic acid (peak A)

7,7 7.7

3,80 3.80

3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß- 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-

cholansäure (Peak B) cholic acid (peak B)

90,0 90.0

44,40 44.40

7a,12a-Dihydroxy-3-keto-5ß- 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5ß-

45 45

cholansäure (Peak C) cholic acid (peak C)

0,3 0.3

0,15 0.15

Cholsäure (Peak D) Cholic acid (peak D)

2,0 2.0

0,98 0.98

Beispiel 17 Example 17

Es wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gearbei- so tet, wobei man aber den Stamm Brevibacterium CA-6 (FERM-P Nr. 5144; ATCC Nr. 31661) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35 zur Anwendung brachte. It was operated in the same manner as in Example 1, but using the strain Brevibacterium CA-6 (FERM-P No. 5144; ATCC No. 31661) instead of the strain Arthrobacter CA-35.

Das so erhaltene Gemisch von Produkten und verbleibender Cholsäure wurde mit hoher Geschwindigkeit der Flüssig- 55 Chromatographie gemäss Angaben in Beispiel 1 unterworfen. The mixture of products and remaining cholic acid thus obtained was subjected to liquid chromatography at a high speed as described in Example 1.

Die beiliegende Fig. 14 zeigt das erhaltene Chromatogramm. The enclosed Fig. 14 shows the chromatogram obtained.

Wurden die den Verbindungen in den Peaks E, A, B und D entsprechenden Fraktionen isoliert und ihre chemischen Konstitutionen mittels Massenspektren, Infrarotspektren und «o magnetischen Kernresonanzspektren bestimmt, so ergaben diese Spektren, dass es sich bei diesen Verbindungen um die 7 a-Hydroxy-3,12-diketo-A4-cholensäure, 7a-Hydroxy-3,12-diketo- If the fractions corresponding to the compounds in peaks E, A, B and D were isolated and their chemical constitutions were determined by means of mass spectra, infrared spectra and magnetic nuclear magnetic resonance spectra, these spectra showed that these compounds were the 7 a-hydroxy 3,12-diketo-A4-cholenic acid, 7a-hydroxy-3,12-diketo-

5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure »5 bzw. Cholsäure handelte. Die Verbindungen in den den Peaks X und Y entsprechenden Fraktionen wurden nicht identifiziert. 5ß-cholic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholic acid »5 or cholic acid. The compounds in the fractions corresponding to peaks X and Y were not identified.

Im Chromatogramm gemäss Fig. 14 ist das Flächenverhältnis der Peaks mit Ausnahme der Peaks X und Y (d.h. das Flächenverhältnis E :A:B;D) = 12,2:22,2:44,9:20,7. In the chromatogram according to FIG. 14, the area ratio of the peaks with the exception of peaks X and Y (i.e. the area ratio E: A: B; D) = 12.2: 22.2: 44.9: 20.7.

Beispiel 18 Example 18

Es wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gearbeitet mit dem Unterschied, dass man den Stamm Corynebacterium CA-53 (FERM-P Nr. 5532; ATCC Nr. 31662) anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35 verwendete, wobei man zu einem Gemisch von Produkten und Cholsäure (82 g) gelangte. The procedure was the same as in Example 1, with the difference that the strain Corynebacterium CA-53 (FERM-P No. 5532; ATCC No. 31662) was used instead of the strain Arthrobacter CA-35, whereby a mixture of Products and cholic acid (82 g) arrived.

Das so erhaltene Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 der rasch verlaufenden Flüssigchromatographie unterworfen, mit dem Unterschied jedoch, dass man anstelle der Mischung von Wasser und Methanol im Mischungsverhältnis von 30:70 Vol.-Teilen bei einem pH-Wert von 2,5 eine Mischung von Wasser und Methanol im Mischungsverhältnis von 30:70 Vol.-Teilen bei einem pH-Wert von 4,0 einsetzte. The mixture thus obtained was subjected to the rapid liquid chromatography under the same conditions as in Example 1, with the difference, however, that instead of the mixture of water and methanol in a mixing ratio of 30:70 parts by volume at a pH of 2 , 5 used a mixture of water and methanol in a mixing ratio of 30:70 parts by volume at a pH of 4.0.

Die beiliegende Fig. 15 zeigt das erhaltene Chromatogramm. Die Peaks A, B, C und D in Fig. 15 entsprechen jenen der Referenzverbindungen, nämlich 7cc-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure, 7a-Hydroxy-3,12-diketo-A4-cholensäure bzw. Cholsäure. The enclosed FIG. 15 shows the chromatogram obtained. The peaks A, B, C and D in Fig. 15 correspond to those of the reference compounds, namely 7cc-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholanic acid, 7a-hydroxy -3,12-diketo-A4-cholenic acid or cholic acid.

Wurden die Verbindungen in den den Peaks A, B und C entsprechenden Fraktionen isoliert und ihre chemischen Konstitutionen mittels Massenspektren, Infrarotspektren und magnetischen Kernresonanzspektren bestimmt, so zeigten diese Spektren, dass es sich bei diesen Verbindungen um die 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure, 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cholansäure bzw. 7a-Hydroxy-3,12-diketo-A4-cho-lensäure handelte. If the compounds in the fractions corresponding to peaks A, B and C were isolated and their chemical constitutions were determined by means of mass spectra, infrared spectra and magnetic nuclear magnetic resonance spectra, these spectra showed that these compounds were 7a-hydroxy-3,12-diketo -5ß-cholic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cholic acid or 7a-hydroxy-3,12-diketo-A4-cho-lenseic acid.

Referenzbeispiel 1 Reference example 1

10 g der so erhaltenen 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5ß-cho-lansäure wurden in einen Dreihalsrundkolben eingetragen und langsam mit 100 ml Äthylenglycol und einer wässrigen Kaliumhydroxydlösung (10 g Kaliumhydroxyd + 20 ml Wasser) versetzt. Hierauf gab man 10 ml 85%iges Hydrazinhydrat hinzu und erhitzte das erhaltene Gemisch während 2 Stunden bei 100 °C unter Rückfluss. Hierauf wurde die Temperatur allmählich erhöht und das Gemisch während 4 Stunden bei einer Rückflusstemperatur von 185 bis 190 °C behandelt, um das Hydrazinhydrat abzudestillieren. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch mit einem Überschuss von Wasser verdünnt und der pH-Wert auf 3 eingestellt. Dabei bildete sich ein Niederschlag. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 8,5 g 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure (CDCA) bei einer Ausbeute von 8,5 g erhielt. 10 g of the 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5ß-cho-lanoic acid thus obtained were introduced into a three-necked round bottom flask and slowly mixed with 100 ml of ethylene glycol and an aqueous potassium hydroxide solution (10 g of potassium hydroxide + 20 ml of water). Then 10 ml of 85% hydrazine hydrate were added and the mixture obtained was heated under reflux at 100 ° C. for 2 hours. Thereafter, the temperature was gradually raised and the mixture was treated at a reflux temperature of 185 to 190 ° C for 4 hours to distill off the hydrazine hydrate. After cooling, the reaction mixture was diluted with an excess of water and the pH was adjusted to 3. A precipitate formed. The precipitate was collected by filtration, washed with water and air dried to give 8.5 g of 3a, 7a-dihydroxy-5β-cholanic acid (CDCA) with a yield of 8.5 g.

Referenzbeispiel 2 Reference example 2

In einem Dreihalsrundkolben wurden 3 g der nach den obigen Beispielen erhaltenen 7cc-Hydroxy-3,12-diketo-5ß-cholansäure in 70 ml Pyridin gelöst und diese Lösung dann mit 1 Mol Tosylchlorid versetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde während 1 Stunde bei 0 °C umgesetzt und hierauf während 5 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Anschliessend wurde wässrige 3n-Salzsäure hinzugegeben und das Reaktionsgemisch mit 100 ml Äther extrahiert. Der Äther wurde unter vermindertem Druck aus dem Extrakt abdestilliert, wobei man 2,5 g A6- und/oder A7-Diketo-cho-lensäure erhielt. 2 g des so erhaltenen Produktes wurden in 10 ml einer wässrigen ln-Natriumhydroxydlösung gelöst und diese Lösung mit 0,1 g Raneynickel versetzt. Nach der Zugabe von 0,01 Mol Wasserstoff wurde das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht, wobei man 3a,12a-Di-hydroxy-5ß-cholansäure (Desoxycholinsäure) und 3<x,12ß-Di-hydroxy-5ß-cholansäure in einer Ausbeute von 90% erhielt. In a three-necked round bottom flask, 3 g of the 7cc-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid obtained according to the above examples were dissolved in 70 ml of pyridine and then 1 mol of tosyl chloride was added to this solution. The mixture thus obtained was reacted at 0 ° C. for 1 hour and then heated to boiling under reflux for 5 hours. Aqueous 3N hydrochloric acid was then added and the reaction mixture was extracted with 100 ml of ether. The ether was distilled off from the extract under reduced pressure, whereby 2.5 g of A6- and / or A7-diketo-cho-llenic acid were obtained. 2 g of the product thus obtained were dissolved in 10 ml of an aqueous sodium hydroxide solution and 0.1 g of Raney nickel was added to this solution. After the addition of 0.01 mol of hydrogen, the mixture was reacted overnight, giving 3a, 12a-di-hydroxy-5β-cholanic acid (deoxycholic acid) and 3 <x, 12ß-di-hydroxy-5ß-cholanic acid in one Yield of 90% was obtained.

8 Blatt Zeichnungen 8 sheets of drawings

Claims

646442646442

1 1

PATENTANSPRÜCHE 1. Mikrobielles Verfahren für die Herstellung von Cholan-säurederivaten der folgenden allgemeinen Formel : PATENT CLAIMS 1. Microbial process for the preparation of cholic acid derivatives of the following general formula:

COOR COOR

worin X where X

t—OH t-OH

\ \

oder or

:0 : 0

und R das Wasserstoffatom, ein Alkalimetall oder ein Erdal- 20 kalimetall bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, welcher in einem Cholsäure oder ein Salz davon enthaltenden Medium als Substrat unter Bildung eines oben erwähnten Cholansäurederivates zu wachsen vermag und welcher aus den Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium25 oder Corynebacterium entnommen ist, in einem ein solches Substrat enthaltenden Kulturmedium züchtet und schliesslich das so erhaltene Derivat sammelt. and R represents the hydrogen atom, an alkali metal or an alkaline earth metal, characterized in that a microorganism which can grow as a substrate in a medium containing cholic acid or a salt thereof to form a cholanic acid derivative mentioned above and which is of the genera Arthrobacter , Brevibacterium25 or Corynebacterium is taken, grown in a culture medium containing such a substrate and finally collecting the derivative thus obtained.

2. Mikrobielles Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen solchen30 vom Stamm Arthrobacter CA-35, ATCC Nr. 31651 ; Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32, ATCC Nr. 31652; Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47, ATCC Nr. 31653; Stamm Arthrobacter CA-35-A849, ATCC Nr. 31654; Stamm Arthrobacter CA-35-A-1071-15, ATCC Nr. 31655; Stamm Arthro- 35 bacter CA-35-A-1448, ATCC Nr. 31656; Stamm Arthrobacter CA-35-A-1475, ATCC Nr. 31657; Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15, ATCC Nr. 31658; Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3, ATCC Nr. 31659; Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12, ATCC Nr. 31660; Stamm Brevibacterium CA-6, 40 ATCC Nr. 31661 ; oder vom Stamm Corynebacterium CA-53, ATCC Nr. 31662, einsetzt. 2. Microbial method according to claim 1, characterized in that the microorganism is one such from the Arthrobacter CA-35 strain, ATCC No. 31651; Strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32, ATCC No. 31652; Strain Arthrobacter CA-35-A589-47, ATCC No. 31653; Strain Arthrobacter CA-35-A849, ATCC No. 31654; Strain Arthrobacter CA-35-A-1071-15, ATCC No. 31655; Strain Arthro-35 bacter CA-35-A-1448, ATCC No. 31656; Strain Arthrobacter CA-35-A-1475, ATCC No. 31657; Strain Arthrobacter CA-35-A-1766-15, ATCC No. 31658; Strain Arthrobacter CA-35-M-965-3, ATCC No. 31659; Strain Arthrobacter CA-35-Y-37-12, ATCC No. 31660; Strain Brevibacterium CA-6, 40 ATCC No. 31661; or from the strain Corynebacterium CA-53, ATCC No. 31662.

3. Mikrobielles Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Cholansäurederivat die 3a,7a-Di-hydroxy-12-keto-5ß-cholansäure erzeugt wird. 45 3. Microbial method according to claim 1, characterized in that the 3a, 7a-di-hydroxy-12-keto-5β-cholic acid is produced as the cholanic acid derivative. 45

4. Mikrobielles Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen solchen vom Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32, ATCC Nr. 31652; Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47, ATCC Nr. 4. Microbial method according to claim 3, characterized in that the microorganism is one of the strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32, ATCC No. 31652; Strain Arthrobacter CA-35-A589-47, ATCC no.

31653 ; Stamm Arthrobacter CA-3 5-A849, ATCC Nr. 31654 ; 50 Stamm Arthrobacter CA-35-A-1071-15, ATCC Nr. 31655; 31653; Strain Arthrobacter CA-3 5-A849, ATCC No. 31654; 50 strain Arthrobacter CA-35-A-1071-15, ATCC No. 31655;

Stamm Arthrobacter CA-35-A-1448, ATCC Nr. 31656; Strain Arthrobacter CA-35-A-1448, ATCC No. 31656;

Stamm Arthrobacter CA-35-A-1475, ATCC Nr. 31657; Strain Arthrobacter CA-35-A-1475, ATCC No. 31657;

Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15, ATCC Nr. 31658; Strain Arthrobacter CA-35-A-1766-15, ATCC No. 31658;

Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3, ATCC Nr. 31659; oder 55 vom Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12, ATCC Nr. 31660, verwendet. Strain Arthrobacter CA-35-M-965-3, ATCC No. 31659; or 55 from the Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain, ATCC No. 31660.

5. Mikrobielles Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Cholsäure in einer Konzentration von 1 bis 500 g/1 als Substrat verwendet. 60 5. Microbial method according to claim 1, characterized in that cholic acid is used in a concentration of 1 to 500 g / 1 as the substrate. 60

6. Mikrobielles Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man Cholsäure in einer Konzentration von 5 bis 300 g/1 als Substrat verwendet. 6. Microbial method according to claim 5, characterized in that cholic acid is used in a concentration of 5 to 300 g / 1 as the substrate.

7. Mikrobielles Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Cholsäure in einer Konzentration 65 von 10 bis 200 g/1 als Substrat verwendet. 7. Microbial method according to claim 6, characterized in that cholic acid is used in a concentration 65 of 10 to 200 g / 1 as the substrate.

8. Mittel zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1 in Form eines Mikroorganismus der Art Arthrobacter. 8. Means for carrying out the method according to claim 1 in the form of a microorganism of the type Arthrobacter.

9. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35, ATCC Nr. 31651 ist. 9. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35, ATCC No. 31651.

10. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32, ATCC Nr. 31652 ist. 10. Agent according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A589-29-32, ATCC No. 31652.

11. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47, ATCC Nr. 11. Agent according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A589-47, ATCC No.

31653 ist. 31653 is.

12. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A849, ATCC Nr. 12. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A849, ATCC No.

31654 ist. 31654 is.

13. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1071-15, ATCC Nr. 13. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A-1071-15, ATCC no.

31655 ist. 31655 is.

14. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1448, ATCC Nr. 14. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A-1448, ATCC No.

31656 ist. 31656 is.

15. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1475, ATCC Nr. 15. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A-1475, ATCC No.

31657 ist. 31657 is.

16. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-A-1766-15, ATCC Nr. 16. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-A-1766-15, ATCC no.

31658 ist. 31658 is.

17. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3, ATCC Nr. 17. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-M-965-3, ATCC No.

31659 ist. 31659 is.

18. Mittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Arthrobacter CA-35-Y-37-12, ATCC Nr. 18. Composition according to claim 8, characterized in that it is the strain Arthrobacter CA-35-Y-37-12, ATCC No.

31660 ist. 31660 is.

19. Mittel zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1 in Form eines Mikroorganismus der Art Brevibacterium. 19. Means for performing the method according to claim 1 in the form of a microorganism of the brevibacterium type.

20. Mittel gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Brevibacterium CA-6, ATCC Nr. 31661 ist. 20. Composition according to claim 19, characterized in that it is the strain Brevibacterium CA-6, ATCC No. 31661.

21. Mittel zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1 in Form eines Mikroorganismus der Art Corynebacterium. 21. Means for carrying out the method according to claim 1 in the form of a microorganism of the type Corynebacterium.

22. Mittel gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es der Stamm Corynebacterium CA-53, ATCC Nr. 31662 ist. 22. Agent according to claim 21, characterized in that it is the strain Corynebacterium CA-53, ATCC No. 31662.