CH645919A5

CH645919A5 - Verfahren zur herstellung von lagerstabilen praeparationen von mikroorganismen und deren verwendung zum abbau industrieller syntheseprodukte.

Info

Publication number: CH645919A5
Application number: CH861278A
Authority: CH
Inventors: Joerg Dr Baumgarten; Werner Prof Dr Frommer; Delf Dr Schmidt; Friedrich Dr Schmidt; Douglas Marshall Dr Munnecke
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1977-12-15
Filing date: 1978-08-14
Publication date: 1984-10-31
Also published as: DE2756032C2; JPH0244507B2; IL55421A; JPH02299581A; FR2411889B1; GB2010327A; FR2411889A1; IT1098059B; DK349978A; GB2010327B; JPS5484084A; BE870359A; IL55421A0; IT7826758A0; DE2756032A1; JPH043948B2; US4391887A; NL7808586A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen und deren Verwendung zum Abbau industrieller Syntheseprodukte.

Es ist bekannt, mit organischen Syntheseprodukten ver- 40 unreinigte Abwässer in Kläranlagen nach dem Belebt-schlamm-Verfahren abzubauen. Dabei werden die Abwässer in grossen Becken belüftet, wobei sich im Laufe der Zeit bestimmte Mikroorganismen anreichern, die den gewünschten Abbau vornehmen. Es ist jedoch nicht möglich, aus den dabei 45 erhaltenen Mikroorganismenmassen stabile Präparationen zu gewinnen, mit denen bestimmte Produkte abgebaut werden können, da die Abbauaktivität dieser Mikroorganismenmassen für diese Zwecke nicht ausreicht und zudem beim Aufarbeiten mindestens teilweise verloren geht. so

Es ist ausserdem bekannt, dass Backhefe bei der Teigbereitung Stärke bzw. Zucker abbaut. Es ist jedoch schwierig,

diese Backhefen als Dauerpulver, z.B. als Trockenhefepulver, unter Erhalt ihrer vollen Aktivität haltbar zu machen. Auch Trockenbackhefe ist ohne wesentlichen Aktivitätsverlust nur 55 im Vakuum oder unter Schutzgasatmosphäre haltbar (vgl. G. Reed et al, Yeast Technology, 1973 (West Port, Avi Publication Comp.).

Es ist ferner bekannt geworden, dass im Boden lebende Mikroorganismen insektizide Wirkstoffe, insbesondere Phos- so phorsäureester und Carbamate, abbauen (vgl. Übersichtsartikel von J. Laveglia et al, Annual Review of Entomology 1977,22, S. 483 ff. und die darin angegebenen Literaturstellen).

Es ist ferner bekannt geworden, dass Mischkulturen von 65 Mikroorganismen zum Abbau von insektizidenWirkstoffen, wie Parathion, geeignet sind. Solche Kulturen sind jedoch verhältnismässig inaktiv und nur schwierig zu handhaben.

Präparationen, die bisher aus solchen Kulturen gewonnen wurden, waren selbst bei -18 °C instabil und konnten nicht in fester Form hergestellt werden (vgl. Munnecke et al, Applied Environ, Microbiology 1976,32, S. 7-13).

1. Es wurde nun gefunden, dass man neue lagerstabile Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, erfindungsgemäss erhält, indem man die Kulturbedingungen einer angereicherten aktiven Mischkultur unter Zugabe des abzubauenden Produkts nach dessen Abbaugeschwindigkeit optimiert und diese Mischkultur unter den so ermittelten optimalen Bedingungen in mindestens zweimaliger Passage in eine stabilisierte aktivierte Mischkultur überführt und die dabei erhaltene Kultur unter Erhaltung ihrer Aktivität lagerstabilisiert.

2. Es wurde ferner gefunden, dass man neue lagerstabile Präparationen von Mikroorganismen ausgehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, erfindungsgemäss erhält, indem man aus der unter 1. erhaltenen Mischkultur auf Komplexmedien Einzelstämme anzieht,

diese nach ihrer Aktivität selektioniert und die aktiven Stäme unter sterilen Bedingungen kultiviert und die erhaltene Kultur unter Erhaltung ihrer Aktivität schonend trocknet.

3. Bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung der neuen lagerstabilen Präparationen wird von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen ausgegangen und die Herstellung kann im technischen Massstab erfolgen, indem man stabilisierte aktivierte Mischkulturen, die wie unter 1. beschrieben hergestellt wurden, direkt oder soweit sie ohne Verlust ihrer Vitalität lagerstabilisiert worden sind, in Form ihrer Konserven als Impfgut verwendet und den technischen Ansatz bei den unter 1. angeführten Bedingungen durchführt und die erhaltene Kultur unter Erhaltung ihrer Aktivität schonend trocknet.

4. Es wurden ferner die neuen lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen und gemäss Verfahren 1 oder 3 erhalten werden, gefunden.

5. Es wurden ferner die neuen lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen und gemäss Verfahren 2 erhalten werden, gefunden.

6. Es wurden ferner neue Stämme von Mikroorganismen gefunden.

Die in den erfindungsgemässen herstellbaren Präparationen enthaltene Stämme von Mikroorganismen sind die folgenden:

Pseudomonas-Stamm DSM 1192 Pseudomonas-Stamm DSM 1193 Pseudomonas-Stamm DSM 1194 Pseudomonas-Stamm DSM 1195 Pseudomonas-Stamm DSM 1196 Pseudomonas-Stamm DSM 1197 Pseudomonas-Stamm DSM 1198 Pseudomonas-Stamm DSM 1199 Es war überraschend, dass es nach dem erfindungsgemässen Verfahren möglich war, zu lagerstabilen Präparationen aus Mikroorganismen zu kommen. Eine Stabilisierung solcher Präparationen war bislang nur durch Bindung solubili-sierter Enzyme an Träger, z.B. Glas, gelungen (vgl. Munnecke, Applied Environm. Microbiology, 1977,33, S. 503-507. Bei diesem Verfahren treten jedoch hohe Aktivitätsverluste auf. Erst durch das erfindungsgemässe Verfahren war es möglich, auch unter technischen Bedingungen lagerstabile

Präparationen aus Mikroorganismen herzustellen, die über lange Zeit ihre volle Aktivität behalten und einfach, schnell und preiswert angewendet werden können. Es war überraschend, dass die Aktivität dieser Präparationen erhalten bleibt, ohne dass es erforderlich ist, die für die Aktivität verantwortlichen Enzyme zu isolieren.

Es war ausserdem bekannt, dass Mischkulturen von Mikroorganismen in technischem Massstab schwer handhabbar sind. Daher war es überraschend, dass eine stabilisierte aktivierte Mischkultur erhalten werden kann, die auch in technischem Massstab handhabbar ist.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlichen Zellpräparationen dienen zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte, vor allem an Stellen, an denen diese unerwünscht sind. Sie können eingesetzt werden z.B. zur Behandlung von Abwässern, die bei der Produktion organischer Produkte anfallen, zur Reinigung von Transportbehältern sowie zur Beseitigung bzw. zum Unschädlichmachen von Verunreinigungen, die durch Unfälle hervorgerufen worden sind. Sie sind ausserdem zur Haut- und Bodendekontamination geeignet.

Unter industriellen organischen Syntheseprodukten versteht man gewöhnlich organische Verbindungen, die durch chemische Syntheseverfahren industriell hergestellt werden. (Es sollen darunter keine in industriellem Massstab aus natürlichen Quellen stammende organische Verbindungen verstanden werden). Zu den industriellen organischen Syntheseprodukten, zu deren Abbau die erfindungsgemäss herstellbaren Präparate eingesetzt werden können, zählen beispielsweise:

1) Pflanzenschutzmittel, besonders Insektizide, ferner Herbizide und Fungizide.

2) Pharmazeutika

3) Farbstoffe, besonders Azo- und Anthrachinonfarb-stoffe

4) Organische Zwischenprodukte, besonders Monomere, die zur Polymerisation Verwendung finden, wie Nitrile sowie Hilfsstoffe bei der Kautschukherstellung, wie Sulfonsäuren sowie organische Lösungsmittel, wie Aromaten.

Zu den Insektiziden gehören z.B.:

A) Carbamate und/oder

B) Carbonsäureester, einschliesslich der Pyrethroide, und/oder

C) Phosphorsäureester und/oder

D) Cycloalkane und/oder

E) Halogenalkane Dazu gehören insbesondere:

A) Carbamate der allgemeinen Formel

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oder für den Rest W-S02-N- steht, wobei W für Alkyl, Ha-

I

R4

logenalkyl oder Alkylamino, Dialkylamino oder einen gegebenenfalls bevorzugt durch Halogen, Trihalogenmethyl, Ni-5 tril, Methyl oder Nitro substituierten Arylrest steht.

Besonders bevorzugt sind Carbamate, in denen R3 für Phenyl oder Naphthyl steht, die gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylmer-capto oder Alkylthioalkylen mit jeweils 1 bis 5 Kohlenstoff-10 atomen, Dialkylamino, Dialkenylamino mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen je Alkyl- bzw. Alkenylteil, Halogen, insbesondere Chlor, Dioxolanyl oder den Rest -N=CH-N^C^-Alk-yl)2 steht.

Weiterhin sind besonders bevorzugt Carbamate, in denen 15 R3 für 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Benzodioxolyl, Benz-othienyl, Pyrimidinyl oder Pyrazolyl steht, die gegebenenfalls durch C|_4-Alkyl, insbesondere Methyl, oder Dialkylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen je Alkylteil substituiert sind. Weiterhin sind besonders bevorzugt Carbamate, in denen 20 R3 für einen Oximrest der allgemeinen Formel

-N

.R«

= C\

R7

25

35

40

45

R4

R5

>N-(

CO-OR3

in welcher

R3 für Aryl, heterocyclische Reste oder Oximrest steht, R4 für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht und

R5 für Alkyl, Alkylcarbonyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, der gegebenfalls auch durch Hydroxy oder 60 Methylthio substituiert sein kann, oder den Rest -S-Z steht, wobei

Z für einen gegebenenfalls durch Halogen substituierten aliphatischen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere CC13 und CF3 sowie für einen gegebenenfalls bevorzugt 65 durch Nitrii, Halogen, insbesondere Chlor, Methyl, Trihalogenmethyl, Trifluormethylmercapto oder Nitro substituierten Arylrest, insbesondere Phenyl, oder für Methoxycarbonyl steht, in welcher

R6 und R7 gleich oder verschieden sind und für Alkyl, Cy-cloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Alkylmercapto, Alkoxy-carbonyl, Carbonylamid, Alkylmercaptoalkyl, mit jeweils bis 30 zu 5 Kohlenstoffatomen, Nitrii, Aryl, insbesondere Phenyl, einen gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Rest oder für Alkyl, das durch einen heterocyclischen Rest substituiert ist oder gemeinsam einen gegebenenfalls durch C].4-Alkyl substituierten Dioxolanyl oder Dithiolanylrest stehen; Besonders erwähnt seien folgende Carbamate: 2-Methylphenyl-, 2-Äthylphenyl-, 2-n-Propylphenyl-, 2-Methoxyphenyl-, 2-Äthoxyphenyl-, 2-iso-Propoxyphenyl-, 4-Methylphenyl-, 4-Äthylphenyl-, 4-n-Propylphenyl-, 4-Methoxyphenyl-, 4-Äthoxyphenyl-, 4-n-Propoxyphenyl-, 3,4,5-Trimethylphenyl-, l-Naphthyl-,2.3-Dihydro-2,2-di-methyl-7-benzofuranyl-, 2-[l,3-Dioxolan(2)yl-phenyl]- bzw. 2,2-Dimethyl-1,3-benzodioxol-(4)yl-N-methyl-carbamat und die entsprechenden -N-methyl-N-acetyl-, -N-methyl-N- tri-fluormethylthio-, -N-methyl-N-dichlormonofluormethyl-thio- bzw. -N-,methyl-N-dimethylaminothiocarbamate.

B) Carbonsäureester der allgemeinen Formel

R9

I

R8_CO-0-CH-R10

in welcher

R8 für Alkyl, Aralkyl, Aryl oder Cycloalkyl steht, die gegebenenfalls substituiert sein können und

R9 für Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, Alkenyl, Alkinyl oder Nitrii steht und

R!0 für Aryl oder einen Heterocyclus steht, oder gemeinsam mit R9 einen gegebenenfalls substituierten Cyclopente-nonring bildet.

Besonders bevorzugt sind Carbonsäureester, in denen R8 für Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch gegebenenfalls substituiertes Phenyl substituiert ist, Cyclopropyl, das gegebenenfalls durch Alkyl, Alkenyl, Halogenalkyl oder Halogenalkenyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder für Phenyl, das gegebenenfalls substituiert ist, steht. Bevorzugt sind Carbonsäureester, in denen R9 für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffato-

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men, Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bis zu 3 Halogenatomen, Nitrii oder Äthinyl steht.

Weiter sind besonders bevorzugt Carbonsäureester, in denen R10 für Phenyl steht, das gegebenenfalls durch C^-Alkyl, Halogen, insbesondere Fluor oder Chlor, gegebenenfalls substituiertes Phenoxy; sowie gegebenenfalls substituiertes Benz-yl substituiert ist, ferner für Furanyl, Tetrahydrophthalimido, Benzodioxolyl, die gegebenenfalls durch Halogen, insbesondere Chlor, Alkyl oder Alkenyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder Benzyl substituiert sind, steht, und ferner für Cyclopentenon steht, das gegebenenfalls durch CM-Alkyl, Furfuryl, C^-Alkenyl substituiert ist.

Besonders erwähnt seien folgende Carbonsäureester: Essigsäure-[l-(3,4-dichlorphenyl)-2,2,2-trichloräthyl]-ester, 2,3,4,5-Tetrahydrophthalimidomethylchrysanthemat und(5-Benzyl-3-furyl)-methyl-2,2-dimethyl-3-(2-methylpro-penyl)-cyclopropan-carboxylat.

C) Phosphorsäureester der allgemeinen Formel

4

0-Äthyl-S-n-propyl-0-(4-methylthio-phenyl)-thionophos-phorsäureester,

0,0-Dimethyl-S-[4-oxo-1,2,3-benzotriazin(3)yl-methyl]-thionohiolphosphorsäureester,

5 0- Methyl-0-[2-iso-propyl-6-methoxy-pyrimidin(4)yl]-thionomethanphosphorsäureester,

0,0-Diäthyl-0-[2-iso-propyl-6-methyl-pyrimidin(4)yl]-thionophosphorsäureester,

0,0-Diäthyl-0-[3-chlor-4-methyl-cumarin(7)yl]-thiono-10 phosphorsäureester,

0,0-Dimethyl-2,2,2-trichlor-1 -hydroxy- äthan-phosphor-säureester,

0,0-Dimethyl-S-(methylcarbamoylmethyl)-thionophos-phorsäureester,

i5 D) Cycloalkane der Formel

X'

II

Rn-X'-P

II ^/X'-R12

«Y'-R13

20

Hai

Hai in welcher

X' unabhängig voneinander für O oder S steht und 25

Y' für O, S, - NH- oder für eine direkte Bindung zwischen dem zentralen P-Atom und dem Rest R13 steht und

R11 und R12 gleich oder verschieden sind und für Alkyl oder Aryl stehen und

R13 für Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl, Alkenyl, 30

Dioxanyl, oder einen Oximrest oder für den gleichen Rest steht, an den es gebunden ist.

Besonders bevorzugt sind Phosphorsäureester, in denen . R11 und R12 gleich oder verschieden sind und für CM-Alkyl oder Phenyl stehen, 35

R13 für Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, das gegebenenfalls durch Halogen, Hydroxyl, Nitrii, gegebenenfalls substituiertes Phenyl, Carbonylamid, Sulfonylalkyl, Sulfoxy-alkyl, Carbonylalkyl, Alkoxy, Alkylmercapto, Alkoxycar-bonyl, substituiert ist, für Alkenyl mit bis zu 4 Kohlenstoff- 40 atomen, das gegebenenfalls durch Halogen, gegebenenfalls halogensubstituiertes Phenyl oder Alkoxycarbonyl substituiert ist, oder für den Oximrest der allgemeinen Formel in welcher

Hai Halogen, vorzugsweise Chlor, bedeutet. Besonders erwähnt sei 1,2,3,4,5,6-Hexachlorohexan. E) Halogenalkane der Formel

-N=C< \

■R6 ■R7

45

wobei R6 und R7 die oben angegebene Bedeutung besitzen, insbesondere jedoch für Cyan oder Phenyl stehen, so

R13 steht ferner für Dioxanyl, das durch denselben Rest substituiert ist, an den R13 gebunden ist, oder R13 steht für den gleichen Rest, an den er gebunden ist, oder R13 steht für Phenyl, das gegebenenfalls durch Methyl, Nitro, Nitrii, Halogen, Methylthio substituiert ist; R13 steht ausserdem besonders be- 55 vorzugt für gegebenenfalls durch C ^4-Alkyl, Halogen substituierte Heteroaromaten, wie Pyridin, Chinolin Chinoxalin, Pyrimidin, Diazinon, Benzo-1,2,4-triazin.

Besonders erwähnt seien folgende Phosphorsäureester: 0,0-Dimethyl-bzw. 0,0-Diäthyl-0-(2,2-dichlor- bzw. so 2,2-dibrovinyl)-phosphorsäureester,

0,0-Diäthyl-0-(4-nitro-phenyl)-thionophosphormsäure-ester (= Parathion), 0,0-Dimethyl-0-(3-methyl-4-methyl-thio)-thionophosphorsäureester,

0,0-Dimethyl-0-(3-methyl-4-nitro)-thionophosphorsäure- 65 ester

0-Äthyl-S-n-propyl-0-(2,4-dichlorphenyl)-thionophos-phorsäureester,

in welcher

Hai' für Chlor oder Brom R14 für Wasserstoff oder Hydroxyl,

R15 und R16 gleich oder verschieden sind und für Halogen, Alkyl oder Alkoxy und

R17 für Wasserstoff oder Halogen stehen.

Besonders bevorzugt sind Halogenalkane, in denen R14 Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet,

R15 und R16 für gleiches Halogen, Alkyl bzw. Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen je Alkyl- bzw. Alkoxyrest stehen und

R17 Halogen bedeutet.

Besonders zu erwähnen seien folgende Halogenalkane: l,l,l-Trichlor-2,2-bis-(4-chlor- bzw. 4-methoxyphenyl)-äthan,

1,1, l-Trichlor-2-hydroxy-2,2-bis-(4-chlorphenyl)-äthan und

1,1 -Dichlor-2,2-bis-(4-äthylphenyl)-äthan.

Zu den abzubauenden Farbstoffen gehören z.B.: Anthra-chinonfarbstoffe, Azofarbstoffe, Methinfarbstoffe, Phenox-azinfarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe.

Zu den abzubauenden organischen Zwischenprodukten gehören vor allem: die einfachen Nitrile wie Acetonitril, Iso-butyronitril, die Nitrile mit einer Aminogruppe in a-Stellung, z.B. a-Aminopropionitril, a-Amino-y-methylthiobutyronitril, a-Aminobutyronitril, Amino-acetonitril, die Nitrile mit einer Hydroxyl-Gruppe in a-Stellung, z.B. Milchsäurenitril, Hydr-oxyacetonitril, a-Hydroxy-y-methylthiobutyronitril, die Nitrile mit einer Aminogruppe in ß-Stellung, z.B. Amino-3-propionitril, die Dinitrile wie Malonsäurenitril, Bernsteinsäu-renitril, Adipinsäurenitril, die a-ungesättigten Nitrile wie Acrylnitril, Methacrylnitril, die a-Aryl-Nitrile wie Homover-

atronitril, Benzonitril, die heterocyclischen Nitrile wie Nico-tinsäurenitril, Isonicotinsäurenitril.

Weiter gehören zu den organischen Zwischenprodukten z.B.: Acet(yl)gammasäure, Acet(yl)-H-Säure, Acet(yl)-I-Säure, Acet(yl)-K-Säure, Alensäure, Alphanaphtoesäure, Alphanapthylsäure, Alphamin, Alphaoxynaphthoesäure, Alphasäure, Amido-E-Säure, Amino-C-Säure, Aminochica-gosäure (148), Aminocroceinsäure, Aminoepsilonsäure, Ami-no-F-Säure, Amino-G-Säure, Amino-Geigy-Säure, Amino-I-Säure, 2,3-Aminonaphthol naphthol(säure) R, Amino-R-Säure, Amino-R,R-Säure, Amino-Schäffer-Äther(säure), Amino-Schäffersäure, Andresensäure, Armstrongsäure, Äthylbetanaphthamin, Äthylchromotropsäure, Azurinbase, Azurinsäure, B-Säure, Badische Säure, Bayer-Säure, Benzol-sulfogammasäureester Benzolsulfo-R-R-Säure, Benzoyl-H-Säure, Benzoyl-I-Säure, Benzoyl-K-Säure, Betanaphthoe-säure, Betasäure, Böniger Säure, Brönnersäure, C-Säure, Ca-sella'sche Säure, Chicagosäure SS, Chromotropsäure (4G bzw. C), Clevesäure-1,6 bzw. 1,7, Columbiasäure, Crocein-säure, D-Säure, Dahl'sche Säuren, Deltasäure, Diaminogen-säuren, Dimethylgammasäure, Dinah-Säure, Dinol, Dioxy-chicagosäure, Dioxy-F-Säure, Dioxy-G-Säure, Dioxy-I-Säure, Dressel-Säure, E-Säure, Eikonogen, Epsilonsäure, F-Säure, Flaviansäure, Freund'sche Säure 136, Freund'sche Säure 137, G-Säure, Gammasäure, Geigy-Säure, H-Säure, H-Säureester, H-Säure-Sulfamid, I-Säure, I-Säure-Harnstoff, I-Disäure, Imidazol-I-Säure, Iso-Columbiasäure, Iso-I-Säure, Isoneusalz, K-Säure, Koch'sche Säure, L-Säure, Laurentsäure, M-Säure, Melansäure, Metazolsäure, Methylamino-F-Säure, Methylbetanaphthamin, Methylparazol-I-Säure, Me-yer-Landshoff-Säure, Musizin, Naphthalindisäure F, Naphthalinsalz, Naphthamindisäure 147, Naphthamindisäure 157, Naphtaminsäure 13, Naphthamintrisäure 1247 bzw. 1248, Naphthamintrisäure 2157, Napthamintrisäure Kaphtions-äure, Napthionsäure, Naphtholdisulfonsäure C, Naphtholdi-sulfonsäure F, Naphtholdisulfonsäure S, Naphtholgelb, Naphthol-I-Säure, Naphtholsäure 13, Naphtholsäure FF, Naphtholsäure P, Naphtholsäure S, Naphtholsulfonsäure 21, Naphtholtri (sulfon)säure RR, Naphtholtri(sulfon)säure T, Naphthylamindisulfonsäure I, Naphthylamindisulfonsäure S, Naphthylensäure 125, Nekal BX, Neusalz, Nevile-Win-ther-Säure, Nitrotinsäure, Nitrodiazoamidolsäure, Nitrodia-zo-Böniger-Säure, Nitroso-R-Säure, o-Naphthionsäure, (5-)Oxy-C-Säure, Oxychicacosäure, Oxy-Koch'sche Säure, Oxy-L-Säure, Oxynaphthoesäure 21,8-Oxynaphthylsäure, Oxy-R-Säure, Oxy-Tobiassäure, Paradurol, Parazol-I-Säure, Patrol-I-Säure, Perisäure, Phenylgammasäure, Purpurin-säure, Purpurol, Purpurolsäure, R-Säure, 2R-Säure, R. G.Säure, Rhodulinsäure, RM-Säure, Rotsäure I, RR-Säure, Rudolf und Gürke, Säure von-, SS-Säure, Säure IV, Säure von Rudolf und Gürke, Schäffersäure, Schäffer-K-Säure, Scheidesalz, Schöllkopfsäure, Sulfamidinsäure, Sulfäthyl-gammasäure, Sulfogammasäure, Sulfo-I-Säure, Sulfonaph-thylsäure 6, Sulfonaphthylsäure 8, Schwarzsäure, T-Säure, Tetrasäure, Tobiassäure, Trioxy-R-Säure, Trisalz, Violettsäure (N), W-Säure, ferner Phenol, Nitrophenol, Chlorphenole, Chlornitrophenole, Benzol, Chlorbenzole, Aniline.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Präparationen geht entweder von neuen oder von bekannten Mischkulturen von Mikroorganismen aus, die die Eigenschaft haben, bestimmte organische Syntheseprodukte abzubauen.

Zu neuen Mischkulturen gelangt man gewöhnlich, indem man Proben aus Böden, Belebtschlämmen von Kläranlagen, Oberflächenwässern oder Oberflächen, die unter nichtsterilen Bedingungen ständig mit den abzubauenden Produkten in Berührung kommen (z.B. Wände und Böden von Produktionsbetrieben) entnimmt und mit den abzubauenden Pro645 919

dukten unter üblichen Bedingungen kultiviert. Die Anzucht wird dabei in mindestens zwei Passagen solange wiederholt, bis man zu einer aktiven Mischkultur gelangt, die das abzubauende Produkt spalten kann. Die Anzucht kann aber auch kontinuierlich unter Verwendung des abzubauenden Produkts im Substrat erfolgen.

Solche Mischkulturen können aus Protozoen, Algen, Blaualgen, Hefen, Pilzen und/oder Bakterien bestehen. Besonders bevorzugt sind Mischkulturen aus Pilzen und/oder Bakterien.

Zu den Pilzen gehören z.B.: Myxomyceten, Acrasiales, Phycomyceten, Ascomyceten und Hefen, Basidiomyceten sowie Deuteromyceten.

Zu den Bakterien gehören vor allem: Phototrophe Bakterien wie Rhodosspirillaceae, Chromatiaceae, Chlorobiaceae. Kriechende Bakterien wie Myxococcaceae, Archangiaceae, Cystobacteriaceae, Polyangraceae, Cystophagaceae, Beggia-toaceae, Simonsiellaceae, Leucotrichaceae. Scheidenbakterien wie Sphaerotilus, Leptothrix, Streptothrix. Knospende und gestielte Bakterien wie Hyphomicrobium, Hyphomonas, Pedomikrobiu, Caulobacter, Gallionella, Nevskia. Spiralige Bakterien wie Sperillaceae. Ausserdem: Achromatiaceae, Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Meth-ylomonadaceae, Halobacteriaceae, Alcaligenes, Acetobacter, Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Zymomonas, Chromo-bacterium, Flavobacterium, Haemophilus, Actinobacillus, Streptobacillus, Desulfovibrio, Selenomonas, Neisseriaceae, Acinetobacter, Nitrobacteraceae, Thiobacillus, Thiobacte-rium, Siderocapsaeceae, Methanobacteriaceae, Micrococca-ceae, Streptococcaceae, Peptococcaceae, Bacillaceae, Lacto-bacillaceae, Corynebacterium, Arthrobacter, Cellulomonas, Kurthia, Propionibacteriaceae, Actinomycetales, Mycobacte-riaceae, Actinoplanaceae, Nocardiaceae.

Für die so erhaltenen aktiven Mischkulturen werden nun die für den durchzuführenden Abbau optimalen Kulturbedingungen bestimmt.

Dabei ist es erforderlich folgende Parameter abzustimmen:

1. Temperatur

2. pH-Wert

3. Sauerstoffpartialdruck

4. Mineralsalzgehalt zur Regulierung des Angebotes an Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Calcium, Eisen, Schwermetallen etc.

5. Dosierung des abzubauenden Produkts, sowohl men-genmässig als auch kontinuierlich oder diskontinuierlich.

6. Kulturdauer

7. Rührgeschwindigkeit

8. Formulierungshilfsmittel für das abzubauende Produkt, insbesondere bei schwerlöslichen Produkten.

Zur Feststellung der optimalen Kulturbedingungen werden nun diese Parameter sowohl einzeln als auch in ihren Kombinationen variiert und ständig die Aktivität beim Abbau des abzubauenden Produkts kontrolliert. Die dabei ermittelten bevorzugten Kulturbedingungen der einzelnen Parameter liegen in folgenden Bereichen:

1. Temperatur 10-70 °C

2. pH-Wert 1-10

3. Sauerstoffkonzentration 0-48 mg/1

4. Phosphatgehalt P04(3) 0,01-10 g/1

Stickstoffhaltige Salze (als NH4C1) 0-50 g/1

Magnesium (als MgSO 4) 0,01-2 g/1

Eisen (als Salz) 0,01-0,1 g/1

Calcium (als CaCy 0,01-0,1 g/1

Spurenelemente wie z.B. Cu, Co, Mn, Zn, Ba u.a.

5. Das abzubauende Produkt wird entweder mit wachstumsbegrenzender Konzentration oder im Überschuss zugesetzt. Es kann auch bei wachstumsbegrenzender Konzentra-

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tion kontinuierlich mit einer dem Wachstum angepassten Die so erhaltenen Reinkulturen können in üblichen Nähr-

Fliessrate zugesetzt werden. medien kultiviert werden. Das abzubauende Produkt kann

6. Die Kulturdauer hegt zwischen 5 Stunden und 14 dabei im Substrat anwesend sein oder als Induktor in gerin-Tagen, gen Konzentrationen dem Substrat zugesetzt sein, oder es

7. Rührgeschwindigkeit im Labormassstab zwischen 0 5 kann in einzelnen Fällen ganz darauf verzichtet werden.

und 1500 Umdrehungen pro Minute. Aus den so erhaltenen Reinkulturen kann entweder durch

8. Als Emulgier- und Dispergiermittel dienen beispiels- Lagerung unter Erhalt der Vitalität Impfgut für weitere Anweise nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie sätze gewonnen werden oder die Mikroorganismenmasse von Polyoxyäthylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyäthylen- Fettalko- der Kulturbrühe abgetrennt und schonend getrocknet wer-hol-Äther, z.B. Alkylaryl-polyglykol-äther, Alkylsulfonate, 10 den, um zur erfmdungsgemässen Präparation gemäss 5. Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweisshydrolysate, z.B. (oben) zu gelangen. Die Trocknung erfolgt dabei wie bereits Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose. bei Erhalt der erfmdungsgemässen Präparation aus stabili-

Durch die Kombination dieser Massnahmen wird die sierten aktivierten Mischkulturen beschrieben.

Mischkultur so weit stabilisiert, dass unsteriles Arbeiten er- Auch die Reinkulturen können, wie oben beschrieben, im möglicht wird, ohne dass eine Aktivitätsminderung eintritt. 15 grosstechnischen Massstab batch-weise kultiviert werden.

Die aktiven Mischkulturen werden dann unter den ermit- Im Folgenden sei die vorliegende Erfindung am Beispiel telten optimalen Kulturbedingungen in mindestens zwei, im einer Präparation zum Abbau insektizider Wirkstoffe, bevor-allgemeinen zwischen 2 und 50, Passagen in eine stabilisierte zugt phosphorhaltiger Wirkstoffe, insbesondere Parathion eraktivierte Mischkultur übergeführt. läutert:

Dabei werden gewöhnlich in relativ kleinem Massstab 20 Mischkulturen zum Abbau phosphorhaltiger Wirkstoffe,

(geringes Ansatzvolumen) so viele Passagen durchgeführt wie insbesondere Parathion, sind bekannt (vgl. Munnecke et al.,

erforderlich sind, um eine Mischkultur zu erhalten, bei der in Applied Microbiology, 1974,2^ S. 212-217).

weiteren Passagen keine Steigerung der den Abbau organi- Nach dem erfmdungsgemässen Verfahren kann daraus scher Syntheseprodukte bewirkenden Eigenschaften mehr eine stabilisierte aktivierte Mischkultur erhalten werden,

stattfindet. Bei der so erhaltenen Mischkultur spricht man 25 Dazu arbeitet man in mindestens 2 Passagen unter folgenden von einer stabilisierten aktivierten Mischkultur. bevorzugten Bedingungen:

Die so erhaltenen stabilisierten aktivierten Mischkulturen In einem Temperaturbereich zwischen 20 und 35 °C, be-

werden lagerstabilisiert. Dies kann geschehen, indem man die vorzugt zwischen 24 und 30 °C, besonders zwischen 25 und

Kultur einfriert oder schonend trocknet, z.B. durch Lyophili- 28 °C.

sation, Entwässerung mit organischen Lösungsmitteln, 30 Zu einem pH-Bereich zwischen 6,5 und 9,0, bevorzugt

Sprühtrocknen oder durch Zugabe konservierender Chemi- zwischen 7,5 und 7,9, insbesondere zwischen 7,5 und 7,6.

kalien wie Zitronensäure, Benzoesäure, Ameisensäure, Sali- Bei der Kultur wird kontinuierlich der abzubauende phos-zylsäure, Zucker oder Kochsalz haltbar macht. , phorhaltige Wirkstoff als einzige Kohlenstoff- und Energie-

Eine bevorzugte Form der Lagerstabilisierung, vor allem quelle mit einer dem Wachstum angepassten diskontinuier-

im grosstechnischen Massstab ist es, die Mikroorganismen- 35 liehen Fliessrate so zugeführt, dass die Konzentration des masse von der Kulturbrühe abzutrennen und durch Lyophili- Wirkstoffes nicht über 10 ppm und des Spaltproduktes p-Ni-

sation oder durch Entwässern mit organischen Lösungsmit- trophenol nicht über 30 ppm steigt. Durch die Kombination teln zu trocknen. dieser Massnahmen wird die Mischkultur so stabilisiert, dass

Wählt man eine Form der Lagerstabilisierung der wie unsteriles Arbeiten ermöglicht wird, ohne dass sich die wirk-

oben beschrieben erhaltenen stabilisierten aktivierten Misch- 40 stoffabbauende Aktivität ändert.

kultur, bei der die Vitalität nicht verlorengeht, kann sie als Die so gewonnenen Mischkulturen sind als Impfgut für

Impfgut für weitere z.B. grosstechnische Ansätze aufbewahrt neue Fermentationen verwendbar und bei -18 °C ohne Vitali-

und verwendet werden. Solche Arten der Lagerstabilisierung tätsverlust über lange Zeit haltbar. Die durch diese Massnah-

ohne Verlust der Vitalität sind z.B. Einfrieren der Kultur- men erhaltenen Aktivitätsausbeuten hegen für Parathion um brühe und Aufbewahren bei Temperaturen unter 0 °C, mit 45 den Faktor 10-20 höher als die, der dem Stand der Technik und ohne Zusatz von Schutzstoffen wie z.B. Glycerin oder entsprechende Kultur. Gewinnt man aus so gewonnenen Fer-

Dimethylsulfoxid, Lyophilisation oder Konservierung in mentationen durch geeignete Trocknung, z.B. Lyophilisa-

flüssigem Stickstoff. Die so erhaltenen Konserven von stabili- tion, Präparate, so ist deren Aktivität, bezogen auf mg Pro-

sierten aktivierten Mischkulturen können dann jederzeit als tein, um den Faktor 10 höher als die bisher beschriebenen.

Impfgut für grosstechnische Ansätze verwendet werden. so Überraschenderweise sind derartige Präparate auch ohne

Solche grosstechnischen Ansätze erfolgen gewöhnlich Bindung an einen Träger über lange Zeit auch bei Raumtem-

batch-weise in üblicher Weise unter den oben angegebenen peratur haltbar.

optimalen Bedingungen, wobei als Impfgut die wie oben be- Aus solchen Mischkulturen können Reinkulturen isoliert schrieben erhaltene stabilisierte aktivierte Mischkultur direkt werden, die phosphorhaltige Wirkstoffe, insbesondere Para-

bzw. in Form ihrer Konserven eingesetzt wird. 55 thion, abbauen.

Bei der bevorzugten Kultivierung der stabilisierten akti- Solche Reinkulturen können überraschenderweise in ge-vierten Mischkulturen im grosstechnischen Massstab kann es bräuchlichen Komplex-Nährmedien, z.B. Hefeextrakt, ohne vorteilhaft sein, das abzubauende Produkt je nach Eigen- zusätzlichen phosphorhaltigen Wirkstoff als Wachstumssub-schaften entweder direkt oder in Form einer Formulierung, strat und phosphorhaltige Wirkstoffe spaltender Aktivator die eine gute gleichmässige Vermischung des Produktes im ge- «o kultiviert werden. Ihre den Abbau phosphorhaltiger Wirksamten Ansatz erlaubt, oder zusammen mit geeigneten Emul- stoffe bewirkende Aktivität bleibt überraschenderweise er-gier- bzw. Dispergiermitteln einzusetzen. halten.

Aus den wie oben beschrieben erhaltenen stabilisierten ak- Aus diesen Reinkulturen kann ebenfalls durch schonende tivierten Mischkulturen lassen sich auf übliche Weise durch Trocknung, z.B. Lyophilisation der Biomasse zu einem tech-

Auslese nach ihrer spaltenden Aktivität Reinkulturen gewin- 65 nisch geeigneten hochaktiven Streupulver gelangen. Dieses nen (vgl. Methods in Mikrobiology, Band 3a, Seiten 305-361, Pulver ist im Gegensatz zu den bisher verwendeten Enzymlö-

Band 3b, Seiten 1-329, Band 4, Seiten 1-460). Es wurden so sungen selbst bei Raumtemperatur über Jahre haltbar. Durch z.B. die Stämme DSM 1192 und DSM 1193 isoliert. Behandlung einer wässrigen Suspension dieses Präparates mit

organischen Lösungsmitteln oder Detergentien kann man zu stabilen voll wasserlöslichen Enzympräparationen gelangen. Zur Darstellung des löslichen Enzympräparates kann man auch direkt von feuchten Zellen ausgehen, die mit organischen Lösungsmitteln bzw. Detergentien behandelt werden.

Soll z.B. eine Parathion-abbauende Präparation gewonnen werden, kann ausgehend von der oben erwähnten bekannten Mischkultur (s. loc. cit.) im einzelnen wie folgt vorgegangen werden:

1. Für die Aktivierung der bekannten Mischkultur nimmt man anorganische Stickstoff enthaltende Salze wie z.B. (NH4)2S04 und übliche Nährsalze enthaltendes Medium. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten Grenzen schwanken. Bevorzugt werden Konzentrationen in den Bereichen:

MgS04

CaCl2

(nh4)2s04

Eisensalze k2hp04

kh2po4

0,05

0,01

0,1

0,001

0,5

0,1

- 0,2 g/1

- 0,05 g/1

- 1,0 g/1

- 0,01 g/1

- 5,0 g/1

- 1,0 g/1

Der pH-Wert wird durch Pufferlösung zwischen 6,5 und 9,0, insbesondere mit Phosphatpuffer auf 7,5-7,9 gestellt. Besonders günstig ist es, den pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf pH 7,6 konstant zu halten. Solche Lösungen werden mit Zellen aus Konserven beimpft. Die Impfmenge kann in weiten Grenzen schwanken. Optimal sind 0,1-5,0 g, besonders 0,5-1,0 g Zelltrockenmasse je 101 Kulturlösung. Diese Kulturen werden bei 20-37 °C bevorzugt bei 24-30 °C inkubiert, wobei 25-28 °C einen besonders bevorzugten Temperaturbereich darstellt.

Für die Anzucht der Mischkultur wird das Parathion mit einer Pumpe kontinuierlich so dosiert, dass während der Fermentation kein oder nur Spuren von Nitrophenol (Spaltprodukt aus Parathion) nachweisbar sind. Die Dosierungsmenge pro Stunde richtet sich nach dem Wachstum der Kultur und wird der Konzentrationserhöhung der Biomasse entsprechend ständig erhöht. Es werden z.B. anfangs 0,1 ml pro Stunde und zuletzt 0,75 ml Parathion pro Stunde einer 10 Ltr.-Kultur zugeführt, wobei die Parathionkonzentration im Fermenter stets unter 10 ppm bleiben soll. Die Fermentationsdauer beträgt 5-7 Tage, vorzugsweise 6 Tage. Bei einem Verbrauch von 50 ml reinem Parathion werden Zelldichten von etwa 1 g Trockengewicht pro Liter Kulturmedium erreicht.

Bei Fermentationsansätzen, bei denen nur mit geringen Durchmischungsraten gearbeitet werden kann, empfiehlt sich der Einsatz einer Parathionformulierung als Kohlenstoffquelle, durch die eine bessere Verteilungsgeschwindigkeit im Fermenter erzielt wird. Es können z.B. Formulierungen mit organischen Lösungsmitteln und Emulgatoren eingesetzt werden. Eine geeignete Formulierung ist z.B.:

7 645 919

nische Säuren, z.B. Succinat, aber auch Nitrophenol, gegeben werden. Die Fermentationszeit bei gleichen oder wesentlich erhöhten Aktivitätsausbeuten verkürzt sich bei Verwendung von Reinkulturen wesentlich gegenüber den Fermentationen 5 mit Mischkulturen und Parathion als organische Kohlenstoffquelle. Die Verwendung der Reinkulturen zur Herstellung von P-Ester spaltenden Zellpräparationen erfordert jedoch steriles Arbeiten.

Die Endpunkte der Fermentationen ergeben sich aus den io Zunahmeraten der Phosphorsäureester-spaltenden Aktivität der Kultur. Die Kultur wird abgebrochen, wenn keine deutliche Zunahme der Aktivität mehr messbar ist.

Zur Herstellung von Phosphorsäureester-spaltenden Präparationen kann die Mikroorganismenmasse durch Zentrifu-i5 gation gewonnen werden. Sie wird z.B. in 1/10 bis 1 /20 des Ausgangsvolumens dest. aufgenommen und durch Rühren homogen verteilt. Die Suspension wird gewöhnlich erneut zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment erneut in z.B. 1/50—1/100 des Ausgangsvolumens dest. Wasser 20 aufgenommen. Man friert diese Suspension bevorzugt ein und lyophilisiert sie anschliessend. Das erhaltene Trockenprodukt ist wasserunlöslich, aber gut suspendierbar. Es enthält die gesamte phosphorsäureesterspaltende Aktivität.

Eine einfachere bevorzugte Methode der Trocknung, die 25 jedoch mit gewissen Aktivitätseinbussen verbunden ist, ist die Entwässerung des mit dest. H20 gewonnenen Mikroorganismensediments durch zweimalige Extraktion mit z.B. 10 Volumenteilen (bezogen auf das gepackte Zellvolumen) organischen Lösungsmitteln, insbesondere mit Aceton oder Äth-30 anol. Das entwässerte Mikroorganismensediment kann dann bei 20-30 °C im Vakuumtrockenschrank bei 20 Torr getrocknet werden.

Zur Herstellung eines trockenen, aber wasserunlöslichen Enzympräparates geht man am besten von einer Suspension 35 frischer oder eingefrorener und aufgetauter Mikroorganis-menzellen in Wasser oder Puffer (z.B. 0,1 m, pH 6-9) aus. Es kann aber auch eine entsprechende Suspension lyophilisierter Mikroorganismenzellen verwendet werden. Die Mikroorga-nismenzellsuspension wird z.B. mit 1-5% einer oberflächen-40 aktiven Substanz, wie z.B. Na-Desoxicholat, Triton X 100 etc. oder mit 2-10 Vol-% Butanol, bei 25-27 °C 0,5 bis 8 Stunden inkubiert, der Ansatz anschliessend zentrifugiert und der Überstand direkt (bei Butanol als solubilisierendem Agens) oder nach vorheriger Dialyse gegen dest. Wasser (bei 45 Verwendung der oberflächenaktiven Substanzen) lyophilisiert. Die erhaltenen Testpräparate enthalten etwa 50% der eingesetzten Aktivität, ihre spezifische Aktivität ist 2-3 mal so hoch wie die des verwendeten Ausgangsmaterials, und sie sind in Wasser oder Puffer klar löslich.

so Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern ohne eine Einschränkung ihrer universellen Durchführbarkeit zu geben. Dies geschieht anhand von Parathion-abbauenden Mikroorganismen.

55 Test zur Bestimmung der parathionabbauenden Aktivität

3 Teile Isopropanol

1 Teil Parathion

0,01 Teil Alkylarylpolyglykoläther

Die Phosphorsäureester-spaltende Aktivität der auf diese Weise gewonnenen Kulturbrühen liegt bei etwa gleicher Fermentationsdauer und Parathiondosierung um 50-100% höher als bei Kulturen, die mit reinem Parathion angezogen werden.

Zur Herstellung einer aktiven Zellkultur aus Reinkulturen verwendet man am besten übliche Komplexmedien, z.B. Hefeextrakt-, Hefeautolysat- oder Fleischextrakt-Medien. Zusätzlich können noch andere Kohlenstoffquellen wie orga-

Beispiel 1

Benötigt werden ein 0,1 m Kaliumphosphatpuffer pH 6o 8,2,eine 10%ige Lösung von Aryloxypolylglykoläther in Wasser sowie eine 1 %ige Lösung von Parathion in Äthanol. Zur Herstellung der Substratlösung werden 50 ml Pufferlösung unter Rühren mit 0,3 ml der wässrigen Emulgatorlösung versetzt, dann werden langsam 2 ml der äthanolischen Para-65 thionlösung hinzugegeben.

Zur Testung gibt man in eine auf 25 °C temperierte Kü-vette 2,4 ml obiger Substratlösung. Die gleiche Substratlösung dient auch als Leerwert. Nach Temperierung gibt man in

645 919

die Leerwertküvette 100 jxl Pufferlösung, in die Messküvette 100 nl der zu testenden Enzymlösung, Suspension oder Kulturbrühe, letztere nach Vorbehandlung mit Toluol (s.u.), registriert die Extinktionsänderung bei 410 nm und rechnet auf gebildete jiMol Paranitrophenol bzw. gespaltenes Parathion um.

1 Enzymeinheit /U/ ist definiert als Spaltung von 1 (iMol Parathion pro Minute bzw. die Freisetzung von 1 jiMol Paranitrophenol pro Minute unter obigen Testbedingungen.

Zur Testung von frischen Zellen in der Kulturlösung oder frischen Zellsuspensionen müssen diese zunächst aufgeschlossen werden. Dazu versetzt man die zur Prüfung kommende Probe mit 0,2% Toluol und inkubiert unter Umschütteln 30 Minuten bei 30 °C. 10 bis 100 |il der derartig vorbehandelten Probe werden getestet. Bei lyophilisierten bzw. eingefrorenen und wieder aufgetauten Zellen ist die Toluolbehandlung überflüssig und bringt keine Aktivitätsänderung der zu prüfenden Probe.

Bei den folgenden Beispielen wird die Aktivität in U wie oben bestimmt angegeben.

Beispiel 2

Herstellung einer aktivierten, stabilisierten Mischkultur aus der nach dem Stand der Technik bekannten P-Ester-spal-tenden Mischkultur.

Zur Herstellung einer aktivierten, stabilisierten Mischkultur wurden zunächst folgende Stammlösungen angesetzt:

Stammlösung 1 1 M K-Phosphatpuffer pH 7,6

Stammlösung 2 Ammoniumsulfat 10,0 g

Calciumchlorid 0,6g

Magnesiumsulfat 4,0 g

Wasser 1000 ml

Stammlösung 3 Eisen II Sulfat 3,0g

Wasser 1000 ml

Stammlösung 4 übliche Spurenelementelösung

Zur Anzucht wurde ein Mineralsalz-Medium verwendet, das in 10 Ltr. Wasser

100 ml Stammlösung 1 200 ml Stammlösung 2 10 ml Stammlösung 3 und 4 enthielt.

Als Ausgangskultur diente die von Munnecke et al in Applied Microbiology 1974,28^ S. 212-217 beschriebene para-thionsspaltende Mischkultur.

Die Anzucht der Kultur wurde in einem 10 Liter Fermenter mit 9 Liter Mineralmedium durchgeführt. Es wurde mit 1 g Biomasse (bezogen auf das Trockengewicht) der aktiven Mischkultur, die wie von Munnecke et al beschrieben angezogen wurde, angeimpft. Die Fermenterkultur wurde unter Rührung (1200 U/Min.) bei 25-28 °C mit 10 Liter Luft pro Minute begast. Der pHWert wurde mit einem Titrator mit 2,5 n NaOH zwischen 7,5 und 7,6 eingestellt. Als Wachstumssubstrat diente Parathion; es wurde dem Fermentationsansatz kontinuierlich so zugesetzt, dass die Parathionskonzentration im Fermenter wachstumsbegrenzend war. Diese Bedingung war dann gegeben, wenn die aktuelle Parathionkonzentration unter 10 ppm lag und kein Nitrophenol nachweisbar war. Die Kultivierung wurde in 4 aufeinanderfolgenden Passagen durchgeführt, wobei 1 Liter der vorhergehenden Anzucht als Impfmaterial der folgenden diente. Die Kulturdauer betrug 3 bis 6 Tage. Die Kultivierung wurde dann beendet, und es wurde mit der nächsten Passage begonnen, wenn nur noch geringe oder keine Aktivitätserhöhungen im Fermenteransatz messbar waren. Die Aktivitätssteigerung der Mischkultur über die 4 Passagen ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Passagen- Kulturdauer Aktivität bei Fermen-

Nr. (Tage) tationsende (U/Ltr.)

1 3 31,5

2 3 240

3 5 820

4 6 1140

Mit der Anzucht der Mischkultur in einer fünften Passage konnte die Aktivität nicht weiter gesteigert werden. Dies geht aus Tab. 2 hervor, in der neben der Aktivitätszunahme in Abhängigkeit von der Fermentationszeit auch die Dosierung des Parathions, die während der Fermentation verbrauchte Para-thionmenge sowie die Zunahme der Biomasse dargestellt ist. Die Fermentationsdauer betrug 123 Stunden. Bei einem Gesamtverbrauch von 4,4 ml Parathion pro Ltr. wurden Zelldichten von 480 mg Trockengewicht pro Ltr. Kulturmedium mit einer parathionspaltenden Aktivität von 1340 U/Ltr. Kulturmedium erreicht; das entspricht einer Aktivität von 2800 U pro g Trockenzellen.

Tabelle 2

Zeitlicher Verlauf der Parathionfermentation

Fermenta- Aktivität Trocken- Kontin. Parathion-tionsdauer (U/Ltr.) gewicht Dosierung Verbrauch

(Std.)

(g/Ltr.)

(ml/Std.)

(ml)

0

119

0,045

25

0,15

3,80

56,5

0,20

10,00

71,5

375

0,29

0,375

15,90

955,

820

0,500

27,90

119,5

1340

0,48

0,500

39,90

123

geerntet

0,750

42,50

Die so gewonnene aktivierte, stabilisierte Mischkultur wurde durch Zentrifugation auf 1/10 Ausgangsvolumen eingeengt und bei -18 °C konserviert. Sie diente als Ausgangskultur für die weiteren Fermentationsansätze.

Beispiel 3

Herstellung von aktivem Zellmaterial mit einer Para-thion-Formulierung.

Die Kulturbedingungen entsprachen weitgehend denen unter Beispiel 2 beschriebenen. Anstelle des reinen Parathions wurde eine Parathionformulierung folgender Zusammensetzung benutzt:

Isopropanol 150 ml

Parathion 50 ml

Alkylarylpoly-

glykoläther 0,5 ml

8,5 Liter Kulturmedium wurden mit 80 ml der in Beispiel 2 beschriebenen konservierten Mischkultur angeimpft und über 123 Stunden kultiviert. Die Dosierung der Parathionformulierung erfolgte kontinuierlich. Die Fermentation wurde unsteril durchgeführt. Die zu den angegebenen Zeiten erhaltenen Aktivitäten der Kulturbrühe, der Verbrauch an Parathion und andere Fermentationsdaten sind der Tabelle 3 zu entnehmen.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabelle 3

9

Fermen

Akti

Trocken

Kontin.

Formu

Para-

tations vität gewicht

Dosierung lierver thionver-

dauer

(U/Ltr)

(g Zellen/Ltr)

(ml/Std.)

brauch brauch

(Std.)

(ml)

0

116

0,147

0

25

0,7

20

5

56,5

0,95

50

12,5

71,5

765

0,096

1,3

75

17

95,5

1030

1,5

110

27

119,5

2500

1,085

1,8

150

38

123

geerntet

2,1

165

41

645 919

Bei einem Gesamtverbrauch von 4,2 ml reinem Parathion pro Liter Kulturmedium wurde mit der Parathionformulie-rung eine spezifische Aktivität von 2300 U pro Gramm Trok-kenzellen erreicht.

Tabelle 4:

Zeitlicher Verlauf der Parathionfermentation im 2000 Liter Massstab

Beispiel 4

Herstellung der aktivierten Mischkultur im 2000 Liter Massstab mit reinem Parathion als Substrat Zu 2000 Liter entionisiertem Wasser wurden

Fermen-20 tations-dauer (Std.)

0

Aktivität (U/Ltr)

75

Trockengewicht (g/Ltr.)

25

Kontin-Parathion-Dosierung (ml/Std.)

20

Parathion. Verbrauch (ml)

0 160

(NH4)2S04

1000 g

72

103

0,17

30 2080

CaCl2

30 g

120

334

40 4000

MgS04

200 g

148

384

60 5680

k2hpo4)

3100 g

168

500

0,537

100 7680

kh2po4

600 g

30

FeCl2 und

6g

Bei einem Verbrauch von 3,8

! ml Parathion pro Liter Kul-

Lösung von

turmedium wurde eine spezifische Aktivität von 940 U/g

Spurenelementen

2000 ml

. Trockenzellen erreicht.

gegeben.

Der 2000 Liter Fermentationsansatz wurde mit 200 Liter Vorkultur beimpft, die ausgehend von der im Beispiel 2 beschriebenen konservierten Kultur in Passagen über 1 Liter, 20 Liter und 200 Liter unter den im Beispiel 2 beschriebenen Kultivierungsbedingungen gewonnen wurde. Es wurde 138 Stunden mit 240 Umdrehungen pro Minute, danach bis zum Ende der Fermentation mit 350 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit 2000 Liter Luft pro Minute begast. Die Temperatur betrug 27-28 °C. Der pH-Wert wurde mit 2,5 n NaOH auf 7,5-7,7 konstant gehalten. Die Parathionzugabe erfolgte kontinuierlich mit den in der Tabelle angegebenen Dosierungen. Der Verlauf der Fermentation ist ebenfalls aus der Tabelle 4 zu entnehmen.

35 Beispiel 5

Herstellung von aktivem Zellmaterial mit einer Isopropa-nolformulierung bei geringer Fermenterdurchmischung (200 Upm)

In einem 7 Liter Fermenter wurden 5 Liter Nährlösung 40 mit 10 ml eingeengter und bei -18 °C über 7 Tage gelagerter aktivierter Mischkultur aus Beispiel 2 beimpft, mit 200 u/Min gerührt und mit 6 Liter Luft/Minute begast. Die Kultivierungstemperatur betrug 27 °C; der pH-Wert 7,6. Es wurde zunächst 0,5 ml Isopropanol-Parathion-Formulierung (Zusam-45 mensetzung: siehe Beispiel 3) diskontinuierlich zugesetzt und 15 Stunden inkubiert. Danach wurde mit in der Tabelle 5 angegebenen Dosierung kontinuierlich die Parathionformulie-rung zugesetzt. Die Zunahme der Aktivität und das Trockengewicht der Biomasse ist ebenfalls aus der Tabelle 5 zu ent-50 nehmen.

Tabelle 5:

Zeitlicher Verlauf der Parathionfermentation bei geringer

Durchmischung

Fermen

Akti

Trocken

Kontin. Parathion

Parathion-

tations-

vität gewicht

Formulierungs-

verbrauch dauer

(U/Ltr)

(g/Liter)

Dosierg.

Verbrauch

(ml)

(Std.)

(ml/Std.)

(ml)

15,0

0,5

0,1

30,5

343

0,7

21,0

5,2

48,0

580

0,45

1,15

41,1

10,3

57,5

1,3

54,0

13,5

72,0

860

0,98

1,5

75,8

19,0

645919

Bei einem Verbrauch von 3,8 ml reinem Parathion pro Liter Kulturmedium wurde eine spezifische Aktivität von 880 U/g Trockenzellen erreicht.

Beispiel 6

Herstellung von aktivem Zellmaterial aus Reinkulturen

9 Liter Komplexmedium mit einer Zusammensetzung NaHC03 1 g

Hefeautolysat 8 g

Fleischhydrolysat (Danimex) 3 g

H20 1000 ml wurden mit 500 ml einer 3 Tage in Komplexmedium gewachsenen Vorkultur des P-Ester spaltenden Pseudomonas-Isolats Pseudomonas spec. (DSM-Göttingen Nr. 1193) beimpft, bei 28 °C mit 1000 Upm gerührt und 9 Ltr./Min. belüftet. Der i pH-Wert betrug 7,6. Die Fermentationsdauer war 21 Std.

Nach dieser Zeit betrug die Parathion spaltende Aktivität des Fermentationsansatzes 5200 U/Ltr. Kulturmedium. Die spezifische Aktivität der Zellen war 1620 U/g Trockengewicht.

Beispiel 7

Die in der Deutschen Sammlung Mikroorganismen unter den Nummern 1193,1195,1196,1197,1194 hinterlegten Pseudomonas-Stämme wurden in Nutrient Broth (Difco) als Schüttelkulturen herangezogen und nach Erreichen der Höchstaktivität die Parathionhydrolaseaktivität gemessen.

Die Hydrolyseaktivitäten in U/mg Zellprotein sind in der Tabelle 6 zusammengefasst.

10

20

25

Tabelle 6

Stamm-Nr.

spez. Aktivität

(DSM)

U/mg Protein1

1193

0,42

1195

0,83

1196

1,21

1197

2,04

1194

0,2

35

40

1 Die Zellen wurden mit Ultraschall aufgeschlossen; Test nach Ultraschallbehandlung wie unter Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 8

Die in der Deutschen Sammlung Mikroorganismen hin- 45 terlegten Pseudomonas Stämme Nr. DSM 1192, DSM 1198 und DSM 1199 wurden im unter Beispiel 6 beschriebenen Komplexmedium unter Schütteln über 2 Tage bei 30 °C inkubiert. Die Parathion spaltenden Aktivitäten der Stämme pro Liter Kulturmedium sind in der Tabelle 7 zusammengefasst. so

Tabelle 7

Stamm-Nr. (DSM)

1192

1198

1199

Aktivität U'/Ltr.

1240 785 520

55

Beispiel 9

5 Ltr. aktivierter Mischkultur mit 890 U/Liter, die wie im Beispiel 2 beschrieben kultiviert worden war, wurden bei 4000 Upm in einer Kühlzentrifuge der Fa. Hettich bei 4 °C für 30 « Min. zentrifugiert. Der inaktive Überstand wurde abgegossen und das Sediment mit 500 ml dest. HzO versetzt und 10 Min. mit einem Magnetrührer gerührt. Die homogene Zellsuspension (550 ml, 7100 U/Ltr.) wurde erneut wie oben zentrifugiert, der inaktive Überstand verworfen und das Sediment dieses Mal mit 100 ml dest. H20 versetzt und wie oben gerührt. Die erhaltenen 130 ml Zellsuspension (27 300 U/Ltr.) wurden bei-18 °C eingefroren und anschliessend gefriergetrocknet. Ausbeute 3,3 g Präparation mit 750 U/g.

Beispiel 10

Aus 4000 Ltr. Kulturbrühe, die in 2 Ansätzen nach Beispiel 4 hergestellt wurde, wurde in einem Separator der Fa. Westfaha der Zellschlamm angereichert (200-300 Ltr.), der inaktive Klarlauf wurde verworfen. Aus dem Schlamm wurde die Zellmasse in einer Korbzentrifuge bei 2500 Upm sedimen-tiert. Das Sediment wurde in 300 Ltr. destilliertem Wasser aufgenommen und durch Rühren in Suspension gebracht. Man schleuderte nochmals in der Korbzentrifuge ab, nahm das gewaschene Zellsediment in 30-40 Ltr. destilliertem Wasser auf, brachte in Suspension, fror die Suspension bei -40 "C ein und lyophilisierte anschliessend. Ausbeute: 981 g mit 700

U/g.

Beispiel 11

100 ml eines gewaschenen, dann eingefrorenen und 1 Monat bei -18 °C gelagerten Zellsuspension, die wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, wurden aufgetaut und 20 Minuten bei 10 000 Upm (4°) zentrifugiert. Der Überstand (200 U/Ltr.) wurde verworfen. Das Zellsediment wurde in 100 ml Wasser resuspendiert und geteilt (6830 U/Ltr.). Die eine Hälfte wurde direkt lyophilisiert. Ausbeute: 1,25 g mit 175 U/g.

Die andere Hälfte wurde erneut bei 10 000 Upm zentrifugiert und das Bakteriensediment mit 2 x 50 ml Aceton p.a. bei 4 °C extrahiert. Die Acetonextrakte wurden verworfen, der Rückstand bei Raumtemperatur im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Ausbeute: 0,9 g mit 150 U/g.

Beispiel 12

12 Liter Kulturbrühe, nach Beispiel 2 hergestellt mit 125 U/Ltr. wurden bei 4000 Upm 30 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment in 500 ml Wasser aufgenommen und suspendiert (3000 U/Ltr.). Man zentrifugierte erneut ab, verwarf den Überstand und resuspendierte das Sediment ab 120 ml in Wasser. Diese Lösung diente als Ausgangslösung für die Solubilisierungsversuche in Beispiel 6 und 7.

Beispiel 13

Man versetzte 30 ml der Suspension aus Beispiel 4 mit 30 ml 0,1 m K Phosphatpuffer pH 8,2 (Test-Suspension 4800 U/ Ltr.), 10 000 g Überstand: U/Ltr. = 0). Man versetzte nun mit 3 g Natriumdesoxycholat und inkubierte 30 Minuten bei 30 °C im Schüttelwasserbad. Der Ansatz wurde dann 30 Minuten bei 40 und 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand enthielt jetzt 10 930 U/Ltr. Man gab den Überstand in einen Dialyseschlauch und dialysierte bei 4 °C gegen destilliertes Wasser. Die ursprünglich viskose Lösung wurde dabei klar, man zentrifugierte das Retentat bei 19 000 Upm und lyophilisierte den klaren Überstand. Ausbeute: 1,4 g wasserlösliches Enzym mit 320 U/g.

Beispiel 14

Man versetzte 30 ml der Suspension aus Beispiel 4 mit 30 ml 0,1 m K-Phosphatpuffer pH 8,2 (Test-Suspension 4800 U/ Ltr., 10 000 g Überstand U/Ltr.=0. Dann gab man 6 ml n-Butanol hinzu und schüttelte 30 Minuten bei 30 °C im Schüttelwasserbad.

Man zentrifugierte den Ansatz 30 Minuten bei 10 000 g. Der Überstand enthielt jetzt 13 700 U/Ltr.

25 ml des Überstandes wurden direkt lyophilisiert. Ausbeute: 330 mg wasserlösliche Präparation mit 890 U/g. 25 ml des Überstandes wurden zunächst gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Ausbeute: 120 mg mit 1760 U/g.

Beispiel 15

16 Liter Kulturbrühe, wie unter Beispiel 2 beschrieben gewonnen mit 120 U/Ltr., wurden bei 4000 Upm zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment in 500 ml Wasser aufgenommen und resuspendiert. Man zentrifugierte erneut und nahm das Sediment in 100 ml destilliertes Wasser auf. Zu dieser Zellsuspension wurden 100 ml 0,1 m Glycin/Na OH-Puffer pH 8,5 gegeben und der Ansatz kurz am Ultraturax-Homogenisator homogenisiert (Test-Suspension 956 U/Ltr., 10 000 g Überstand 550 U/Ltr.). Man gab nun 15 ml (= 7,5 Vol.-%) Butanol zum Ansatz und inkubierte 1 Stunde unter Rühren bei 37 °C. Der Ansatz wurde anschliessend auf 4 °C abgekühlt und dann bei 19 000 Upm 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand enthielt 9150 U/Ltr. Das Sediment wurde in 100 ml Wasser aufgenommen und nochmals zentrifugiert. Dieser zweite Überstand (2860 U/Ltr.) wurde mit dem ersten vereinigt (280 ml 7650 U/Ltr.). 190 ml dieser Lösung wurden direkt lyophilisiert. Ausbeute 1,4 g lösliche Prä-paration mit 1090 U/g. 90 ml wurden zunächst gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Ausbeute: 0,5 g lösliche Präparation mit 1370 U/g.

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Beispiel 16

6 Liter Fermentationsbrühe aus einem Fermentationsansatz nach Beispiel 6 wurden bei 4000 Upm und 40 °C 30 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wurde in 500 ml Wasser re-s suspendiert und nochmals wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das derart gewaschene Sediment in 100 ml Wasser suspendiert, die Suspension eingefroren und lyophilisiert. Ausbeute: 8,1 g mit 770 U/g.

io Beispiel 17

Abbau von Parathion in Containern In einem 120 Liter Metallcontainer zur Aufbewahrung von Parathion, der nach Entleerung 40-60 g Parathion als Restverunreinigung enthielt, wurde 30 Liter Wasser gegeben, 15 gut durchgemischt und der pH-Wert auf 8,3 eingestellt. Der Abbau des Parathions wurde mit 400 mg der gemäss Beispiel 10 erhaltenen Präparation gestartet. Mit einer Umsatzrate von 90-120 mg pro Minute war der Abbau des Parathions in 10 Stunden beendet.

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Beispiel 18

Enzymatischer Abbau von Parathion in nassem Stand 500 g Sand (0,76% Trockenverlust bei 140 °C) wurde mit 200 ml destilliertem Wasser und 1 g MaHC03 p.a. versetzt. Es 25 wurden 425,5 mg einer 47%igen Parathionformulierung zugegeben, gemischt und 20 mg Präparation hergestellt gemäss Beispiel 10 zugesetzt. Nach einer Mischzeit von 25 Stunden wurde alkalisiert, filtriert und im Filtrat das p-Nitrophenol sofort photometrisch bestimmt. Gehalt: 490 g p-Nitrophenol/ 30 Ltr., das heisst, es erfolgte ein Abbau von 100% der Theorie.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturbedingungen einer angereicherten aktiven Mischkultur unter Zugabe des abzubauenden Produkts nach dessen Abbaugeschwindigkeit optimiert werden und diese Mischkultur unter den so ermittelten optimalen Bedingungen in mindestens zweimaliger Passage in i0 eine stabilisierte aktivierte Mischkultur überführt wird und die dabei erhaltene Kultur unter Erhaltung ihrer Aktivität lagerstabilisiert wird.
2. Verfahren zur Herstellung von lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von aktivierten 15 Reinkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einer gemäss Anspruch 1 erhaltenen Mischkultur auf Komplexmedien Einzelstämme anzieht, sie nach ihrer Aktivität selektioniert und die aktiven Stämme 20 unter sterilen Bedingungen kultiviert und die erhaltene Kultur schonend trocknet.
3. Lagerstabile Präparationen aus Mikroorganismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die gemäss Anspruch 1 erhalten werden. 25
4. Lagerstabile Präparationen aus Mikroorganismen, ausgehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die gemäss Anspruch 2 erhalten werden.
5. Verwendung von Präparationen gemäss Anspruch 3 zum Abbau industrieller Syntheseprodukte. 30
6. Verwendung von Präparationen gemäss Anspruch 4 zum Abbau industrieller Syntheseprodukte.

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