CH642682A5 - Peptide substance obtained from a trematode and its use as a medicinal product - Google Patents

Description

La présente invention a pour objet un nouveau peptide obtenu à partir d'incubats de schistosome. The present invention relates to a new peptide obtained from schistosome incubates.

Elle a spécifiquement pour objet un peptide provenant de Schistosoma monsoni, de poids moléculaire compris entre 500 et 1000, soluble dans l'eau, thermostable, non précipitable par les réactifs des protéines, dialysant à travers une membrane de dextrane réticulé du type Amicon X-100. It specifically relates to a peptide originating from Schistosoma monsoni, of molecular weight ranging between 500 and 1000, soluble in water, thermostable, not precipitable by the reagents of proteins, dialyzing through a membrane of cross-linked dextran of the type Amicon X- 100.

Selon l'invention, ce peptide est obtenu par un procédé caractérisé en ce qu'on fait incuber des Schistosoma monsoni adultes dans l'eau, sépare les corps des nématodes et les débris particulaires du milieu liquide, soumet le milieu liquide à une dialyse vis-à-vis d'eau, recueille la fraction dialysée et lyophilise ladite fraction. According to the invention, this peptide is obtained by a process characterized in that adult Schistosoma monsoni is incubated in water, separates the bodies of the nematodes and the particulate debris from the liquid medium, subjects the liquid medium to a screw dialysis -with water, collects the dialyzed fraction and lyophilizes said fraction.

Suivant un mode d'exécution avantageux du procédé, le peptide est obtenu par incubation de Schistosoma monsoni dans l'eau bidis-tillée, décantation puis centrifugation, puis le surnageant est filtré sur filtre Millipore et mis en dialyse dans une cellule de dialyse équipée d'un filtre Amicon X-100; finalement, le liquide de dialyse est lyophilisé, puis concentré 10 fois. According to an advantageous embodiment of the method, the peptide is obtained by incubating Schistosoma monsoni in double-distilled water, decanting then centrifuging, then the supernatant is filtered on a Millipore filter and put into dialysis in a dialysis cell equipped with '' an Amicon X-100 filter; finally, the dialysis liquid is lyophilized, then concentrated 10 times.

Cette protéine possède des propriétés pharmacologiques très intéressantes qui se manifestent en inhibant la dégranulation des mas-tocytes de rats. Cette inhibition de la dégranulation laisse prévoir que cette substance biologique pourra inhiber la mise en liberté de l'histamine et des catécholamines contenues dans les mastocytes et évitera ainsi les phénomènes de bronchospasme, les manifestations d'anaphylaxie ou les risques de syncope dans les états d'allergie ou de choc, les urticaires et les allergies digestives. This protein has very interesting pharmacological properties which are manifested by inhibiting the degranulation of the mas-tocytes of rats. This inhibition of degranulation suggests that this biological substance can inhibit the release of histamine and catecholamines contained in mast cells and thus avoid the phenomena of bronchospasm, manifestations of anaphylaxis or the risks of syncope in the states of allergy or shock, hives and digestive allergies.

L'activation des mastocytes par des facteurs allergisants, comme des anticorps ou des substances chimiques, conduit à la mise en liberté des aminés biologiques vaso-actives et peut de ce fait être rendue responsable de l'hypersensibilité immédiate ou des phénomènes de bronchoconstriction propres à l'allergie. La substance pepti-dique selon l'invention permet d'envisager le traitement des manifestations d'allergies par dépression des réactions d'immunité des substances vasomotrices associées à l'apparition des phénomènes d'allergie. Activation of mast cells by allergenic factors, such as antibodies or chemicals, leads to the release of vasoactive biological amines and can therefore be made responsible for immediate hypersensitivity or bronchoconstriction phenomena specific to allergy. The peptide substance according to the invention makes it possible to envisage the treatment of allergy manifestations by depression of the immunity reactions of vasomotor substances associated with the appearance of allergy phenomena.

La substance peptidique selon l'invention peut être administrée à l'homme sous forme de compositions pharmaceutiques en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable. La substance peptidique peut être administrée par voie parentérale, perlinguale, permuqueuse ou rectale. The peptide substance according to the invention can be administered to humans in the form of pharmaceutical compositions in combination or in mixture with an inert, non-toxic, pharmaceutically acceptable excipient or vehicle. The peptide substance can be administered parenterally, perlingually, permucosally or rectally.

Produits d'incubation du schistosome Schistosome incubation products

Dix mille vers adultes obtenus par perfusion de hamsters infectés depuis 40 d sont incubés dans 10 ml d'eau bidistillée à 30° C pendant 3 h. Après décantation, le surnageant obtenu constitue l'incubât. Celui-ci est centrifugé 10 min à 1000 g pour éliminer les débris particulaires, filtré sur filtre Millipore 0,45 jim et mis en dialyse 24 h à 4° C. Le liquide de dialyse ainsi que la fraction non dialysable sont lyophilisés et concentrés 10 fois lors de leur utilisation. Ten thousand adult worms obtained by infusion of hamsters infected from 40 d are incubated in 10 ml of double-distilled water at 30 ° C for 3 h. After decantation, the supernatant obtained constitutes the incubate. This is centrifuged for 10 min at 1000 g to remove particulate debris, filtered on a 0.45 jim Millipore filter and put into dialysis for 24 h at 4 ° C. The dialysis liquid and the non-dialyzable fraction are lyophilized and concentrated 10 times when in use.

Etude pharmacologique du nouveau peptide Techniques d'anaphylaxie cutanée passive (PCA) Pharmacological study of the new peptide Passive skin anaphylaxis techniques (PCA)

A — Principe A - Principle

Cette technique consiste à sensibiliser passivement l'animal par injection intradermique du sérum. L'injection simultanée d'Ag et de colorant (après un délai variable tenant compte de la demi-vie tissu-laire des IgG et IgE) permet d'apprécier au niveau du point d'injection intradermique l'importance de la réaction anaphylactique par l'apparition d'une tache colorée, de surface proportionnelle à la dose d'Ag injectée [Ovary, «Progr. Allergy», (1958), 459]. Le titre PCA d'un sérum correspond à la plus grande dilution donnant une tache bleue d'au moins 5 mm. Nous avons utilisé cette technique, d'une part, pour évaluer le titre en réagines des sérums antiovalbumine, d'autre part, pour étudier l'effet inhibiteur des produits d'incubation du schistosome sur cette réaction. This technique consists in passively sensitizing the animal by intradermal injection of the serum. The simultaneous injection of Ag and dye (after a variable delay taking into account the tissue-milk half-life of IgG and IgE) makes it possible to appreciate at the level of the intradermal injection point the importance of the anaphylactic reaction by the appearance of a colored spot, of area proportional to the dose of Ag injected [Ovary, “Progr. Allergy ”, (1958), 459]. The PCA titer of a serum corresponds to the greatest dilution giving a blue spot of at least 5 mm. We used this technique, on the one hand, to evaluate the reagin titer of antiovalbumin sera, on the other hand, to study the inhibitory effect of the schistosome incubation products on this reaction.

B — Titration des sérums B - Titration of sera

Ces réactions ont été effectuées chez les rats Wistar mâles (180-200 g). On injecte par voie intradermique, dans le dos rasé du rat receveur, 0,1 ml des différentes dilutions du sérum à doser. Après une période de latence de 48 à 72 h, on injecte dans la veine caudale 5 mg d'ovalbumine additionnée de 4 mg de bleu d'Evans en solution dans 0,5 ml d'eau physiologique. 30 min plus tard, les rats sont sacrifiés et les réactions sont examinées du côté interne de la peau. C — Inhibition de la réaction d'anaphylaxie cutanée passive These reactions were carried out in male Wistar rats (180-200 g). 0.1 ml of the various dilutions of the serum to be assayed is injected intradermally into the shaved back of the recipient rat. After a latency period of 48 to 72 h, 5 mg of ovalbumin with 4 mg of Evans blue in solution in 0.5 ml of physiological water are injected into the caudal vein. 30 min later, the rats are sacrificed and the reactions are examined on the internal side of the skin. C - Inhibition of the passive cutaneous anaphylaxis reaction

La fraction dialysable des produits d'incubation du schistosome (100 |il) est injectée par voie intradermique 15 min avant l'injection intraveineuse de bleu d'Evans. Les témoins sont constitués par une injection d'eau physiologique. The dialysable fraction of the schistosome incubation products (100 µl) is injected intradermally 15 min before the intravenous injection of Evans blue. The controls consist of an injection of physiological water.

1. Action de composés chimiques 1. Action of chemical compounds

Les substances ayant une action de dégranulation sur les mastocytes in vitro peuvent également induire une réaction positive in vivo. Deux substances ont été utilisées: le composé 48/80 (produit de condensation de la p-méthoxyphényléthylméthylamine avec le formal-déhyde) à une concentration de 1 et 0,1 Hg/ml, et la polymyxine-B-sulfate à une concentration de 10 |ig/ml. Ces substances (100 ni) ayant une action immédiate doivent être injectées par voie intradermique en même temps que l'injection intraveineuse de 4 mg de bleu d'Evans en solution dans 0,5 ml d'eau physiologique. Substances having a degranulating action on mast cells in vitro can also induce a positive reaction in vivo. Two substances were used: compound 48/80 (condensation product of p-methoxyphenylethylmethylamine with formaldehyde) at a concentration of 1 and 0.1 Hg / ml, and polymyxin-B-sulfate at a concentration of 10 | ig / ml. These substances (100 nl) with immediate action must be injected intradermally at the same time as the intravenous injection of 4 mg of Evans blue in solution in 0.5 ml of physiological water.

2. Inhibition de la dégranulation induite par un système anticorps-antigène 2. Inhibition of degranulation induced by an antibody-antigen system

100 ni de sérum réaginique (antiovalbumine ou sérum de rat infecté par S. monsoni) sont injectés par voie intradermique et les points d'injection sont soigneusement repérés. 48 h plus tard, 100 ni de dialysat ou d'eau physiologique sont injectés aux mêmes points de sensibilisation. Puis, 15 min plus tard, on injecte le bleu d'Evans (4 mg) et l'ovalbumine (5 mg) ou l'Ag hydrosoluble de 5. monsoni 1 % (2 mg) en solution dans 5001*1 d'eau physiologique. (Ag: antigène hydrosoluble de Schistosoma.) 100 μl of reaginic serum (antiovalbumin or rat serum infected with S. monsoni) are injected intradermally and the injection points are carefully identified. 48 h later, 100 μl of dialysate or physiological water are injected at the same sensitization points. Then, 15 min later, we inject Evans blue (4 mg) and ovalbumin (5 mg) or the water-soluble Ag of 5. 1% monsoni (2 mg) dissolved in 5001 * 1 of water physiological. (Ag: water-soluble Schistosoma antigen.)

Techniques de culture cellulaire A — Culture de lymphocytes Cell culture techniques A - Culture of lymphocytes

1. Récupération des cellules 1. Recovery of cells

L'action inhibitrice du dialysat a été testée vis-à-vis de lymphocy5 The inhibiting action of the dialysate has been tested against lymphocy5

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tes spléniques de souris CBA femelles (CNRS, Orléans). Les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale. La rate est prélevée stérilement et dilacérée au moyen de pinces courbes dans du milieu RPMI additionné extemporanément de glutamine (2 nmol) et de tripeptide Gly-His-Lys acétate (Eurobio) (20 |ig/ml) [Pickart et al., «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 54 (1973), 562], Afin d'obtenir une meilleure stimulation, on élimine les cellules adhérentes. Les cellules sont placées dans des boîtes de Pétri à 37° C pendant 2 h de façon à séparer les cellules adhérentes. Le surnageant est prélevé et centrifugé. Les cellules sont comptées dans un hémocytomètre de Thomas par un test d'exclusion du bleu Trypan en solution à 0,02% en tampon Véronal pH 8,7. La suspension est ajustée à une concentration de 107 lymphocytes/ml. your female CBA mouse spleen (CNRS, Orléans). Mice are sacrificed by cervical dislocation. The spleen is removed sterile and dilated by means of curved forceps in RPMI medium supplemented extemporaneously with glutamine (2 nmol) and tripeptide Gly-His-Lys acetate (Eurobio) (20 | ig / ml) [Pickart et al., « Biochem. Biophys. Res. Commun. ”, 54 (1973), 562], In order to obtain better stimulation, the adherent cells are eliminated. The cells are placed in petri dishes at 37 ° C for 2 h so as to separate the adherent cells. The supernatant is removed and centrifuged. The cells are counted in a Thomas hemocytometer by an exclusion test of Trypan blue in 0.02% solution in Veronal buffer pH 8.7. The suspension is adjusted to a concentration of 107 lymphocytes / ml.

2. Mitogènes 2. Mitogens

Les mitogènes utilisés pour induire une stimulation lymphocy-taire sont la concanavaline A extraite de Concanavalia ensiformis aux doses de 0,5 et 1 p.g/100 ni et la phytohémaglutinine extraite de Phaseolus vulgaris (Wellcome) diluée au 1:100. The mitogens used to induce lymphocyte stimulation are concanavalin A extracted from Concanavalia ensiformis at doses of 0.5 and 1 pg / 100 ni and phytohemaglutinin extracted from Phaseolus vulgaris (Wellcome) diluted to 1: 100.

3. Culture 3. Culture

La culture est réalisée en plaques de microtitration (Nunclon, Danemark). Les cellules sont réparties dans chaque puits à raison de 0,5-106 cellules/puits. La fraction dialysable de l'incubât de vers adultes est ajoutée sous un volume de 10 ni. On ajoute également les mitogènes, le volume final étant dans chaque puits de 200 ni. The culture is carried out in microtitration plates (Nunclon, Denmark). The cells are distributed in each well at the rate of 0.5-106 cells / well. The dialyzable fraction of the adult worms incubate is added in a volume of 10 µl. The mitogens are also added, the final volume being in each well of 200 μl.

48 h plus tard, 1 nCi de 3H Thymidine tritiée est ajouté dans chaque puits. On mesure l'incorporation de la thymidine après une nuit de contact. Les cellules sont lavées, puis lysées par de la soude IN pendant 10 min à 56°C. Le matériel acidoprécipitable est obtenu après addition de 2 ml d'acide trichloracétique froid. Après incubation de 15 min à 4°C et centrifugation, le précipité est dissous dans la soude IN et les échantillons sont placés dans des fioles de comptage. Le liquide scintillant utilisé est du Picofluor15 (Hewlett-Packard). Les échantillons sont comptés dans un spectomètre à scintillation Nuclear Chicago (Isocap 300). 48 h later, 1 nCi of 3H tritiated Thymidine is added to each well. The incorporation of thymidine is measured after a night of contact. The cells are washed, then lysed with IN sodium hydroxide solution for 10 min at 56 ° C. The acid-precipitable material is obtained after the addition of 2 ml of cold trichloroacetic acid. After incubation for 15 min at 4 ° C and centrifugation, the precipitate is dissolved in IN sodium hydroxide solution and the samples are placed in counting flasks. The scintillating liquid used is Picofluor15 (Hewlett-Packard). The samples are counted in a Nuclear Chicago scintillation spectometer (Isocap 300).

B — Cultures de cellules en lignée continue B - Cultures of cells in continuous line

Les lignées utilisées pour les tests de cytotoxicité sont: une lignée monocytaire humaine J111 (American culture type collection) (CCL 24) et une lignée Hela. Les cellules sont cultivées en boîtes de Pétri dans du MEM (Minimum essential medium) additionné de 15% de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage. Après 24 h de culture en présence de dialysat, les cellules sont remises en suspension par action de versene-trypsine et centrifugées. Le culot est repris dans du MEM et compté. On mesure aussi la viabilité cellulaire par test d'exclusion du bleu Trypan (0,02%). The lines used for the cytotoxicity tests are: a human monocytic line J111 (American culture type collection) (CCL 24) and a Hela line. The cells are cultured in Petri dishes in MEM (Minimum essential medium) added with 15% of fetal calf serum inactivated by heating. After 24 h of culture in the presence of dialysate, the cells are resuspended by the action of versene-trypsin and centrifuged. The pellet is taken up in MEM and counted. Cell viability is also measured by exclusion test for Trypan blue (0.02%).

L'incorporation de thymidine est mesurée de la même façon que pour les cultures de lymphocytes. The incorporation of thymidine is measured in the same way as for lymphocyte cultures.

Cytotoxicité mastocyte-éosinophile dépendante Mast-eosinophil-dependent cytotoxicity

A — Préparation des schistosomules A - Preparation of schistosomules

Les schistosomules sont récoltés in vitro après passage des cercai-res à travers la peau abdominale isolée de souris Swiss. The schistosomules are harvested in vitro after passage of the cercai-res through the abdominal skin isolated from Swiss mice.

B — Milieu de culture B - Culture medium

Le milieu de culture utilisé est le MEM : Eagle's minimum essential medium (production Institut Pasteur, Paris) auquel on rajoute 1 % de sérum de veau inactivé par chauffage et 20 ng/ml de tripeptide glycyl/histidyl/lysine (Calbiochem., San Diego, Ca.). The culture medium used is MEM: Eagle's minimum essential medium (production Pasteur Institute, Paris) to which 1% of calf serum inactivated by heating and 20 ng / ml of tripeptide glycyl / histidyl / lysine (Calbiochem., San Diego) are added. , Ca.).

C — Préparation des cellules C - Preparation of cells

10 ml d'eau physiologique sont injectés par voie intrapéritonéale à des rats Fischer mâles (Iffa Credo, l'Arbresle, France). 48 à 72 h plus tard, les cellules sont prélevées par lavage de la cavité périto-néale avec 20 ml de milieu de culture contenant 25 UI/ml d'hépari-nate de calcium. Les cellules péritonéales sont centrifugées à 10 ml of physiological water are injected intraperitoneally into male Fischer rats (Iffa Credo, l'Arbresle, France). 48 to 72 h later, the cells are removed by washing the peritoneal cavity with 20 ml of culture medium containing 25 IU / ml of calcium hepararate. The peritoneal cells are centrifuged at

1800 tr/min et lavées deux fois dans le milieu de culture. On enrichit cette population en éosinophiles en laissant adhérer les cellules dans des boîtes de Pétri (7-106 cellules/ml dans des boîtes de 3 cm de diamètre). Après 2 h, les cellules non adhérentes sont prélevées et comptées. La population obtenue contient environ 45% d'éosino-philes et 10% de mastocytes. 1800 rpm and washed twice in the culture medium. This population is enriched in eosinophils by allowing the cells to adhere in Petri dishes (7-106 cells / ml in dishes 3 cm in diameter). After 2 h, non-adherent cells are removed and counted. The population obtained contains approximately 45% of eosino-philes and 10% of mast cells.

D — Purification des cellules D - Purification of cells

Pour éliminer la contamination due aux mastocytes, la population cellulaire obtenue est déposée sur une solution de Ficoll 35% (Pharmacia, Uppsala, Suède). Après centrifugation à 1000 g pendant 15 min, les cellules de l'interface sont prélevées et lavées dans le milieu. Cette population contient environ 50% d'éosinophi-les et moins de 1% de mastocytes. To eliminate contamination due to mast cells, the cell population obtained is deposited on a 35% Ficoll solution (Pharmacia, Uppsala, Sweden). After centrifugation at 1000 g for 15 min, the interface cells are removed and washed in the medium. This population contains approximately 50% eosinophils and less than 1% mast cells.

La technique de purification des mastocytes sera décrite ultérieurement. The mast cell purification technique will be described later.

E — Test de cytotoxicité E - Cytotoxicity test

50 schistosomules en suspension dans 100 ni de milieu de culture sont déposés dans les alvéoles d'une plaque de microtitration (Nunclon) et sont incubés une nuit avec 100 ni de sérum de rat infecté par Schistosoma monsoni, inactivé par chauffage, à une dilution finale de 1:16. Les schistosomules sont ensuite lavés avec le milieu de culture et remis en suspension dans 100 ni de milieu. On ajoute 100 ni de la suspension cellulaire effectrice de façon à obtenir un rapport de 4000-6000 cellules effectrices pour un schistosomule. Le pourcentage de cytotoxicité est déterminé par observation microscopique après une incubation de 48 h. 50 schistosomules suspended in 100 μl of culture medium are deposited in the cells of a microtiter plate (Nunclon) and are incubated overnight with 100 μl of rat serum infected with Schistosoma monsoni, inactivated by heating, at a final dilution 1:16. The schistosomules are then washed with the culture medium and resuspended in 100 µl of medium. 100 μl of the effector cell suspension are added so as to obtain a ratio of 4000-6000 effector cells for a schistosomule. The percentage of cytotoxicity is determined by microscopic observation after an incubation of 48 h.

Test de dégranulation Degranulation test

A — Obtention des cellules péritonéales de rat A - Obtaining rat peritoneal cells

Les cellules utilisées pour le test sont obtenues par lavage de la cavité péritonéale de rats Wistar mâles (180-200 g) (Janvier, Le Genest, 200 g) avec 20 ml de milieu de Eagle (MEM) (production Institut Pasteur, Paris). A ce milieu ont été ajoutés préalablement de la glutamine (2 mmol), de l'héparinate de calcium 50 U/ml et le tripeptide Gly-His-Lys acétate 20 ng/ml- L'exsudat péritonéal contient en moyenne 10e mastocytes, ce qui représente 2 à 5% des cellules totales. Les cellules sont centrifugées 5 min à 1000 g. Les mastocytes sont colorés au bleu de toluidine et comptés dans un hémocytomètre de Fuchs Rosenthal. The cells used for the test are obtained by washing the peritoneal cavity of male Wistar rats (180-200 g) (Janvier, Le Genest, 200 g) with 20 ml of Eagle medium (MEM) (production Institut Pasteur, Paris) . To this medium were added beforehand glutamine (2 mmol), calcium heparinate 50 U / ml and the tripeptide Gly-His-Lys acetate 20 ng / ml- The peritoneal exudate contains on average 10th mast cells, this which represents 2 to 5% of the total cells. The cells are centrifuged for 5 min at 1000 g. The mast cells are stained with toluidine blue and counted in a Fuchs Rosenthal hemocytometer.

B — Incorporation de 3H sérotonine B - Incorporation of 3H serotonin

Une solution de 5-hydroxy-[3H]-tryptaminecréatininesulfate (10 Ci/mmol) (Amersham) a été utilisée pour le marquage des cellules. L'exsudat péritonéal est incubé 30 min à 37° C avec 2 nCi de 3H sérotonine pour 106 mastocytes. La suspension cellulaire est ensuite lavée 4 fois dans 5 ml de milieu pour éliminer l'excès de sérotonine marquée. A solution of 5-hydroxy- [3H] -tryptaminecreatininesulfate (10 Ci / mmol) (Amersham) was used for labeling the cells. The peritoneal exudate is incubated for 30 min at 37 ° C. with 2 nCi of 3H serotonin per 106 mast cells. The cell suspension is then washed 4 times in 5 ml of medium to remove the excess of labeled serotonin.

C — Mesure de la libération de sérotonine C - Measurement of serotonin release

La réaction est réalisée en plaques de microtitration à fond plat (Linbro, Flow Lab.). Les différentes substances testées activatrices ou inhibitrices sont mises en contact avec 50 ni de la suspension cellulaire à 106 mastocytes/ml. Après un temps d'incubation variable suivant le cas étudié, la plaque est centrifugée 5 min à 1000 g. 50 ni de surnageant sont transférés dans une fiole de comptage. Le traitement des cellules par 50 ni de digestine (Merck) permet de mesurer la quantité totale de radioactivité incorporée dans les cellules. The reaction is carried out in microtiter plates with flat bottom (Linbro, Flow Lab.). The different activating or inhibiting tested substances are brought into contact with 50 μl of the cell suspension at 106 mast cells / ml. After a variable incubation time depending on the case studied, the plate is centrifuged for 5 min at 1000 g. 50 µl of supernatant are transferred to a counting flask. Treatment of the cells with 50 μl of digestin (Merck) makes it possible to measure the total amount of radioactivity incorporated into the cells.

D — Mesure de la radioactivité D - Measurement of radioactivity

10 ml de liquide scintillant (toluène Triton 1:1 (v/v) butyle PBD 7 g/1) sont ajoutés dans chaque fiole de comptage. La radioactivité est mesurée dans un spectromètre à scintillation (Isocap 300, 10 ml of scintillating liquid (toluene Triton 1: 1 (v / v) butyl PBD 7 g / 1) are added to each counting flask. Radioactivity is measured in a scintillation spectrometer (Isocap 300,

Nuclear Chicago, Illinois) avec une efficacité de 50,1 % pour le 3H. L'extinction de fluorescence (quenching) est corrigée par la méthode Nuclear Chicago, Illinois) with an efficiency of 50.1% for 3H. Fluorescence quenching (quenching) is corrected by the method

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des rapports de canaux, à partir de courbes étalons obtenues avec des échantillons d'activité constante. channel reports, from standard curves obtained with samples of constant activity.

E — Produits utilisés E - Products used

Le composé 48/80, la polymyxine-B-sulfate, l'ATP, l'a-chymo-trypsine, la L-a-lysophosphatidylcholine, le dicoumarol et la papa-vérine, le cromoglycate de sodium et l'ovalbumine sont des produits commerciaux. Compound 48/80, polymyxin-B-sulfate, ATP, a-chymo-trypsin, La-lysophosphatidylcholine, dicoumarol and papa-verine, sodium cromoglycate and ovalbumin are commercial products .

F — Contrôle morphologique de la dégranulation F - Morphological control of degranulation

50 jj.1 de bleu de toluidine 0,1% (I.C.N. Laboratories, Cleveland) sont ajoutés aux cellules activées. Le pourcentage de mastocytes dégranulés est déterminé par observation microscopique avec un grossissement de 40 x 10 (modèle Reichert, Autriche). Pour chaque détermination, trois cents cellules au moins ont été observées. 50 dj.1 of 0.1% toluidine blue (I.C.N. Laboratories, Cleveland) are added to the activated cells. The percentage of degranulated mast cells is determined by microscopic observation with a magnification of 40 × 10 (Reichert model, Austria). For each determination, at least three hundred cells were observed.

G — Etude ultrastructurale G - Ultrastructural study

Les cellules sont fixées par une solution de glutaraldéhyde 2,5% en tampon cacodylate de sodium 0,1 M, pH 7,2 à 4°C, puis lavées en tampon cacodylate. On postfixe les cellules par le tétroxyde d'osmium à 1 % dans l'eau distillée pendant 1 h. Une déshydratation à l'acétone suivie d'une inclusion en Araldite est ensuite réalisée. L'observation est faite avec un microscope électronique Hitachi HU 12. The cells are fixed with a 2.5% glutaraldehyde solution in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2 at 4 ° C., then washed in cacodylate buffer. The cells are postfixed with 1% osmium tetroxide in distilled water for 1 h. Dehydration with acetone followed by inclusion in Araldite is then carried out. The observation is made with a Hitachi HU 12 electron microscope.

H — Purification des mastocytes H - Purification of mast cells

La technique utilisée a été décrite par Sullivan et al. dans «J. Immunol.», 114 (1975), 1480. Les cellules sont déposées sur une solution de sérumalbumine bovine (SAB) 38% (poids/volume). The technique used has been described by Sullivan et al. in "J. Immunol. ”, 114 (1975), 1480. The cells are deposited on a solution of bovine serum albumin (BSA) 38% (weight / volume).

Après 30 min à température ambiante, les cellules sont centrifugées 20 min à 450 g. Les mastocytes se trouvent alors dans la couche de SAB. Le surnageant et l'interface sont éliminés et la couche inférieure est lavée plusieurs fois avec le milieu de culture. La préparation de mastocytes obtenue est pure à 99% avec un rendement d'environ 75%. L'observation microscopique confirme l'intégrité structurale des mastocytes purifiés. After 30 min at room temperature, the cells are centrifuged for 20 min at 450 g. The mast cells are then in the SAB layer. The supernatant and the interface are removed and the lower layer is washed several times with the culture medium. The mast cell preparation obtained is 99% pure with a yield of approximately 75%. Microscopic observation confirms the structural integrity of the purified mast cells.

Résultats et discussion Results and discussion

I— Mise au point du test de dégranulation A — Incorporation de sérotonine par la suspension cellulaire I— Development of the degranulation test A - Incorporation of serotonin by the cell suspension

1. Localisation de la sérotonine marquée au niveau des mastocytes 1. Localization of marked serotonin in mast cells

Seuls les mastocytes et les plaquettes ont la propriété d'incorporer la sérotonine exogène. Les plaquettes en faible proportion dans l'exsudat péritonéal sont éliminées par le premier lavage des cellules, cela étant confirmé lors de l'observation microscopique. Cependant, pour démontrer la localisation de la sérotonine marquée au niveau des mastocytes, une préparation de mastocytes purifiés a été comparée à la population péritonéale totale. L'exsudat péritonéal est marqué par la sérotonine tritiée, puis un aliquot est prélevé en vue de la purification. A concentration égale en mastocytes, la quantité totale de radioactivité incorporée est la même dans la préparation contenant 5% de mastocytes et dans celle contenant 95% de mastocytes. La courbe de libération de sérotonine sous l'action du composé 48/80 est rigoureusement identique pour les deux préparations (fig. 1). Ces faits expérimentaux démontrent l'incorporation sélective de la sérotonine au niveau des mastocytes. Cela renforce l'intérêt de la méthode en permettant l'utilisation de populations non purifiées. Only mast cells and platelets have the property of incorporating exogenous serotonin. Platelets in small proportion in the peritoneal exudate are eliminated by the first washing of the cells, this being confirmed during microscopic observation. However, to demonstrate the localization of labeled serotonin in the mast cells, a preparation of purified mast cells was compared to the total peritoneal population. The peritoneal exudate is marked with tritiated serotonin, then an aliquot is taken for purification. At an equal mast cell concentration, the total amount of radioactivity incorporated is the same in the preparation containing 5% mast cells and in that containing 95% mast cells. The serotonin release curve under the action of compound 48/80 is strictly identical for the two preparations (FIG. 1). These experimental facts demonstrate the selective incorporation of serotonin in the mast cells. This reinforces the interest of the method by allowing the use of unpurified populations.

2. Intégrité structurale après marquage 2. Structural integrity after marking

L'observation microscopique ainsi que l'étude en microscopie électronique montrent que le marquage par la sérotonine tritiée n'affecte pas l'intégrité structurale des membranes et des granules mastocytaires. Microscopic observation as well as study by electron microscopy show that labeling with tritiated serotonin does not affect the structural integrity of membranes and mast cells.

B — Action du composé 48/80 B - Action of compound 48/80

Ce composé a été choisi pour son aptitude à faire dégranuler les mastocytes avec une amplitude importante, ce qui facilite l'observation morphologique et la détermination optique du pourcentage de mastocytes dégranulés. This compound was chosen for its ability to degranulate mast cells with a large amplitude, which facilitates morphological observation and optical determination of the percentage of degranulated mast cells.

Les cellules sont incubées 15 min à 37° C avec des concentrations de composé 48/80 allant de 1 mg à 0,1 (ig/ml. On mesure, d'une part, la libération de sérotonine tritiée, d'autre part, le pourcentage de mastocytes dégranulés obtenu par observation microscopique. The cells are incubated for 15 min at 37 ° C. with concentrations of compound 48/80 ranging from 1 mg to 0.1 (μg / ml. On the one hand, the release of tritiated serotonin is measured, on the other hand, the percentage of degranulated mast cells obtained by microscopic observation.

La libération spontanée de sérotonine tritiée représente 1 à 5% de la radioactivité totale incorporée dans les mastocytes. Chaque concentration est testée en triple exemplaire et le pourcentage de libération de sérotonine est calculée d'après la formule suivante: The spontaneous release of tritiated serotonin represents 1 to 5% of the total radioactivity incorporated into mast cells. Each concentration is tested in triplicate and the percentage of serotonin release is calculated according to the following formula:

%=^5|xl00 % = ^ 5 | xl00

X: radioactivité totale de l'échantillon S : radioactivité libérée spontanément X: total radioactivity of the sample S: radioactivity released spontaneously

T : radioactivité totale incorporée (libérée après action de la digestine) T: total incorporated radioactivity (released after digestin action)

Le composé 48/80 présente une activité à partir d'une concentration de 1 |ig/ml. La courbe dose-réponse présente une allure sigmoide. L'activité maximale correspondant à 75-86% de sérotonine libérée est obtenue pour une concentration de 100 ng/ml de composé 48/80. Compound 48/80 exhibits activity from a concentration of 1 µg / ml. The dose-response curve has a sigmoid appearance. The maximum activity corresponding to 75-86% of serotonin released is obtained for a concentration of 100 ng / ml of compound 48/80.

Un parallélisme étroit s'établit entre les résultats obtenus par la méthode isotopique et l'observation microscopique. L'étude de corrélation donne un coefficient r = 0,9935 (p < 0,001). A close parallelism is established between the results obtained by the isotopic method and microscopic observation. The correlation study gives a coefficient r = 0.9935 (p <0.001).

C — Action d'autres activateurs chimiques C - Action of other chemical activators

Plusieurs composés ayant la propriété d'induire une dégranulation mastocytaire ont été testés dans les mêmes conditions que le composé 48/80. La polymyxine-B-sulfate, l'a-chymotrypsine, la L-a-lysophosphatidylcholine et l'ATP induisent une libération de sérotonine. Les courbes doses-réponses sont concordantes avec celles observées par les méthodes classiques. Les doses nécessaires pour induire une dégranulation sont plus importantes qu'avec le composé 48/80. La polymyxine-B-sulfate induit une libération de sérotonine à partir de 10 Hg/ml, la chymotrypsine 100 ng/ml et l'ATP 500 |ig/ml. Avec l'ATP, le pourcentage de sérotonine libérée reste limitée à 20% dans la gamme de concentrations étudiées. Several compounds having the property of inducing mast cell degranulation were tested under the same conditions as compound 48/80. Polymyxin-B-sulfate, a-chymotrypsin, L-a-lysophosphatidylcholine and ATP induce a release of serotonin. The dose-response curves are consistent with those observed by conventional methods. The doses necessary to induce degranulation are greater than with compound 48/80. Polymyxin-B-sulfate induces release of serotonin from 10 Hg / ml, chymotrypsin 100 ng / ml and ATP 500 | ig / ml. With ATP, the percentage of serotonin released remains limited to 20% in the range of concentrations studied.

D — Inhibition de la dégranulation par des agents chimiques D - Inhibition of degranulation by chemical agents

Deux types d'inhibiteurs de la dégranulation ont été décrits. Le premier type d'inhibiteur inhibe l'étape d'activation membranaire. Ce sont des substances qui interviennent au niveau des nucléotides cycliques en provoquant une augmentation de l'AMPc intracellulaire par inhibition de la phosphodiestérase. C'est par ce mécanisme qu'agissent par exemple le dicoumarol ou le cromoglycate de sodium. Two types of degranulation inhibitors have been described. The first type of inhibitor inhibits the membrane activation step. These are substances which intervene at the level of cyclic nucleotides by causing an increase in intracellular cAMP by inhibition of phosphodiesterase. It is by this mechanism that act for example dicoumarol or sodium cromoglycate.

Le second type d'inhibiteur agit directement au niveau du métabolisme intracellulaire. C'est le cas par exemple de la papavérine. The second type of inhibitor acts directly at the level of intracellular metabolism. This is the case, for example, with papaverine.

On a testé l'effet du dicoumarol et de la papavérine sur une dé-granulation induite par la polymyxine-B. Les cellules sont d'abord incubées 30 min à 37°C avec les inhibiteurs; la dégranulation est induite par action de polymyxine-B-sulfate (100 (ig/ml) 15 min à 37° C. Avec une dose de 100 |imol/l de papavérine, l'inhibition est de 75% ; avec 10 p.mol/1 de dicoumarol, elle est de 89%. Ces composés sont donc actifs sur la dégranulation mastocytaire et la libération de sérotonine tritiée. We tested the effect of dicoumarol and papaverine on a de-granulation induced by polymyxin-B. The cells are first incubated for 30 min at 37 ° C. with the inhibitors; degranulation is induced by action of polymyxin-B-sulfate (100 (ig / ml) 15 min at 37 ° C. With a dose of 100 | imol / l of papaverine, the inhibition is 75%; with 10 p. mol / 1 of dicoumarol, it is 89%, so these compounds are active on mast cell degranulation and the release of tritiated serotonin.

E — Dégranulation induite par une réaction antigène-anticorps E - Degranulation induced by an antigen-antibody reaction

L'interaction des mastocytes avec un allergène et l'Ac réaginique correspondant induit une dégranulation, mais les altérations cellulaires sont beaucoup moins importantes que sous l'action de composés chimiques, ce qui renforce l'intérêt d'une méthode plus précise que l'observation microscopique. Nous avons donc recherché les conditions optimales de dégranulation induite par un sérum réaginique antiovalbumine et l'antigène correspondant. The interaction of mast cells with an allergen and the corresponding reactin Ac induces degranulation, but cellular alterations are much less important than under the action of chemical compounds, which reinforces the interest of a more precise method than microscopic observation. We therefore sought the optimal conditions for degranulation induced by an anti-albumin reagent serum and the corresponding antigen.

1. Recherche du temps optimal de sensibilisation 1. Finding the optimal awareness time

La fixation des IgE à la surface du mastocyte nécessite un temps de contact avant que la dégranulation puisse être induite par addi- The binding of IgE to the surface of the mast cell requires a contact time before degranulation can be induced by addi-

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

642 682 642 682

tion de l'antigène. Nous avons donc recherché le temps optimal nécessaire pour obtenir la sensibilisation des mastocytes. tion of the antigen. We therefore sought the optimal time necessary to obtain mast cell sensitization.

Les mastocytes marqués sont incubés avec l'antisérum antiovalbumine pendant des périodes variables de 15 min à 2 h, puis mis en contact avec l'antigène pendant 15 min. Ni l'antigène ni l'antisérum n'induisent de libération de sérotonine supérieure au témoin. Quand l'antigène est ajouté simultanément à l'antisérum, aucune dégranulation n'est induite même si l'on prolonge les temps d'incubation, ce qui rend l'étape de sensibilisation absolument nécessaire. Elle peut être cependant de courte durée puisqu'on obtient le maximum de libération de sérotonine avec un temps de contact de 15 min. The labeled mast cells are incubated with the antiovalbumin antiserum for variable periods of 15 min to 2 h, then brought into contact with the antigen for 15 min. Neither the antigen nor the antiserum induces serotonin release greater than the control. When the antigen is added simultaneously to the antiserum, no degranulation is induced even if the incubation times are extended, which makes the sensitization step absolutely necessary. However, it can be short-lived since the maximum release of serotonin is obtained with a contact time of 15 min.

2. Influence de la concentration en antigène 2. Influence of the antigen concentration

Nous avons étudié une gamme de concentrations de 1 à 1000 (xg/ml, soit en concentrations finales de 0,05 à 50 |ig. Les cellules sont mises en contact 15 min avec les différentes concentrations d'antigène. Dans la gamme de concentrations testées, la libération de sérotonine s'accroît avec la concentration en antigène. Pour l'ensemble des expériences, nous avons donc utilisé la concentration la plus forte, soit 50 \ig par puits. We have studied a range of concentrations from 1 to 1000 (xg / ml, ie in final concentrations of 0.05 to 50 µg. The cells are brought into contact for 15 min with the different concentrations of antigen. In the range of concentrations tested, the release of serotonin increases with the antigen concentration, so for all the experiments, we used the highest concentration, 50 µg per well.

3. Sensibilité de la méthode 3. Sensitivity of the method

Les sérums des rats Hooded-Lister immunisés contre l'ovalbu-mine présentent des titres en PCA variant de 64 à 512. On a testé un sérum de titre 128 à différentes dilutions. On peut induire une libération de sérotonine avec ce sérum jusqu'à une dilution de 54, mais dans ce cas seulement 5% de la sérotonine incorporée se retrouve dans le surnageant. Le sérum pur induit la libération de 20% de la sérotonine, ce qui reste faible et nécessite l'utilisation du sérum non dilué pour toutes les expériences. Les sérums utilisés pour la sensibilisation passive devront avoir un titre PCA supérieur à 128. Cette limite n'est pas imputable au test lui-même, mais à la difficulté de sensibiliser passivement des mastocytes in vitro. The sera of Hooded-Lister rats immunized against ovalbu-mine have PCA titers varying from 64 to 512. A serum of title 128 was tested at different dilutions. We can induce a release of serotonin with this serum up to a dilution of 54, but in this case only 5% of the incorporated serotonin is found in the supernatant. Pure serum induces the release of 20% of serotonin, which remains low and requires the use of undiluted serum for all experiments. The sera used for passive sensitization must have a PCA titer greater than 128. This limit is not due to the test itself, but to the difficulty of passively sensitizing mast cells in vitro.

4. Caractéristiques de la dégranulation anaphylactique 4. Characteristics of anaphylactic degranulation

Deux propriétés des IgE ont été utilisées pour vérifier que la libération de sérotonine fait suite à l'interaction des IgE avec les récepteurs mastocytaires: ce sont la thermolabilité des IgE et la forte affinité de l'IgE pour le récepteur mastocytaire. Two properties of IgE were used to verify that the release of serotonin follows the interaction of IgE with mast cell receptors: these are the thermolability of IgE and the high affinity of IgE for the mast cell receptor.

Thermolabilité: le sérum antiovalbumine de titre PCA 128 est chauffé 3 h à 56° C. Ce sérum pur est incubé 15 min à 37° C avec des mastocytes marqués dans les conditions de sensibilisation passive. Après addition d'antigène, il n'y a aucune libération de sérotonine alors que le même sérum non chauffé induit une libération de 21,9% de sérotonine tritiée. Thermolability: the PCA 128 anti-albumin serum is heated for 3 h at 56 ° C. This pure serum is incubated for 15 min at 37 ° C. with labeled mast cells under the conditions of passive sensitization. After addition of antigen, there is no release of serotonin whereas the same unheated serum induces a release of 21.9% of tritiated serotonin.

Tableau 1 : Table 1:

Influence de la concentration en antigène sur la libération de sérotonine Influence of antigen concentration on serotonin release

Concentration en ovalbumine (ng/ml)1 Ovalbumin concentration (ng / ml) 1

% sérotonine libérée2 % serotonin released2

1000 1000

45,8 ±7,3 45.8 ± 7.3

100 100

14,9+3,8 14.9 + 3.8

10 10

5,6 ±1,4 5.6 ± 1.4

1 1

NS3 NS3

1 50 jj.1 de la suspension cellulaire sont incubés 15 min à 37° C avec 50 |il d'un sérum antiovalbunine (titre PCA 1:512), puis on ajoute 50 |xl de chacune des solutions d'ovalbumine indiquées. On mesure la libération de sérotonine après 15 min d'incubation à 37° C. 150 μl of the cell suspension are incubated for 15 min at 37 ° C. with 50 μl of an antiovalbunin serum (PCA titer 1: 512), then 50 μl of each of the solutions of ovalbumin indicated are added. The release of serotonin is measured after 15 min of incubation at 37 ° C.

2 Moyenne de trois expériences. 2 Average of three experiences.

3 Non significativement différent de la libération spontanée. 3 Not significantly different from spontaneous release.

La destruction des IgE par chauffage inhibe totalement la dégranulation ultérieure, ce qui confirme que c'est un phénomène dépendant des IgE fixées à la surface du mastocyte. The destruction of IgE by heating completely inhibits subsequent degranulation, which confirms that it is a phenomenon dependent on IgE attached to the surface of the mast cell.

Affinité de l'IgE: les IgE présentent pour le récepteur mastocytaire une forte affinité. La fixation de l'IgE est irréversible par lavage des cellules. On peut donc, après la sensibilisation passive, laver les cellules et induire une dégranulation avec l'antigène. Affinity of IgE: IgE has a strong affinity for the mast cell receptor. The binding of IgE is irreversible by washing the cells. It is therefore possible, after passive sensitization, to wash the cells and induce degranulation with the antigen.

Les cellules marquées sont incubées avec un sérum antiovalbumine de titre PCA 128 15 min à 37° C puis sont lavées 3 fois dans le milieu de culture. 50 |ig d'antigène sont ensuite ajoutés. On mesure la libération de sérotonine après 15 min d'incubation (tableau 3). Sans étape de lavages, ce sérum induit une libération de 23,7%. Après 3 lavages entre la sensiblisation par l'IgE et l'addition de l'antigène, 20,2% de la sérotonine est libérée; on préserve donc la sensibilisation des mastocytes par lavage, ce qui confirme l'interaction d'IgE avec le mastocyte. The labeled cells are incubated with an PCV 128 anti-albumin serum for 15 min at 37 ° C. and are then washed 3 times in the culture medium. 50 µg of antigen are then added. The release of serotonin is measured after 15 min of incubation (Table 3). Without washing step, this serum induces a release of 23.7%. After 3 washes between sensitization with IgE and the addition of the antigen, 20.2% of the serotonin is released; the sensitization of the mast cells is therefore preserved by washing, which confirms the interaction of IgE with the mast cell.

F — Discussion F - Discussion

Cette méthode permet d'apprécier d'une manière quantitative l'importance de la dégranulation induite, d'une part, par des activa-teurs chimiques, d'autre part, par un système anaphylactique. This method makes it possible to appreciate quantitatively the importance of degranulation induced, on the one hand, by chemical activators, on the other hand, by an anaphylactic system.

La rapidité d'incorporation de la sérotonine marquée permet d'éviter des altérations de la structure cellulaire. L'étude en micros-copie électronique nous a permis de confirmer l'intégrité structurale des cellules. The rapid incorporation of the labeled serotonin makes it possible to avoid alterations of the cellular structure. The electron microscopy study allowed us to confirm the structural integrity of the cells.

Après 3 lavages, tous l'excès de sérotonine est éliminé. La libération spontanée de sérotonine par les mastocytes correspond à environ 1-5% de la sérotonine incorporée [Bach et al., «J. exp. Med.», 133 (1971A), 752, obtiennent, par dosage d'histamine, une libération spontanée de 0 à 5%]. Le bruit de fond mesuré est donc tout à fait normal et confirme que les conditions expérimentales utilisées pour marquer les cellules respectent leur intégrité et ne perturbent pas leur activation ultérieure. After 3 washes, all excess serotonin is eliminated. The spontaneous release of serotonin by mast cells corresponds to approximately 1-5% of the incorporated serotonin [Bach et al., “J. exp. Med. ”, 133 (1971A), 752, obtain, by assaying histamine, a spontaneous release of 0 to 5%]. The background noise measured is therefore completely normal and confirms that the experimental conditions used to mark the cells respect their integrity and do not disturb their subsequent activation.

L'incorporation sélective du marqueur au niveau des mastocytes permet d'éviter la purification des cellules, tout au moins dans le cas où les interactions avec les autres types cellulaires n'interfèrent pas dans la libération des médiateurs. Cette possibilité d'éviter l'étape de purification des cellules représente à la fois un gain de temps et une garantie de meilleur état des cellules. La mesure de la libération de sérotonine semble être une bonne technique de mesure de la dégranulation. The selective incorporation of the marker at the mast cell level makes it possible to avoid cell purification, at least in the case where interactions with other cell types do not interfere with the release of mediators. This possibility of avoiding the cell purification step represents both a saving of time and a guarantee of better state of the cells. Measuring the release of serotonin seems to be a good technique for measuring degranulation.

La destruction des IgE par chauffage abolit complètement la libération de sérotonine. Par contre, elle est maintenue si les cellules sont lavées après la sensibilisation passive par le sérum réaginique. Ces deux faits expérimentaux confirment qu'il s'agit d'une dégranu-lation anaphylactique dont le signal est l'interaction de l'IgE avec son récepteur sur le mastocyte. L'inhibition de la dégranulation par le cromoglycate de sodium confirme que la mesure de la libération de sérotonine est dans nos conditions une bonne méthode d'évaluation de la dégranulation, aussi bien en anaphylaxie active qu'après sensibilisation passive. The destruction of IgE by heating completely abolishes the release of serotonin. On the other hand, it is maintained if the cells are washed after passive sensitization by the reagent serum. These two experimental facts confirm that it is an anaphylactic degranu-lation whose signal is the interaction of IgE with its receptor on the mast cell. The inhibition of degranulation by sodium cromoglycate confirms that the measurement of the release of serotonin is in our conditions a good method of evaluation of degranulation, both in active anaphylaxis and after passive sensitization.

II— Production par Schistosoma mansoni d'un facteur inhibiteur de la dégranulation mastocytaire II— Production by Schistosoma mansoni of a factor inhibiting mast cell degranulation

A — Inhibition de la dégranulation in vitro A - Inhibition of degranulation in vitro

1. Inhibition de la dégranulation induite par un système anaphylactique 1. Inhibition of degranulation induced by an anaphylactic system

Des mastocytes péritonéaux de rat marqués à la sérotonine sont incubés avec la fraction dialysable et non dialysable de l'incubât à différentes concentrations. Après 45 min de contact, on induit une dégranulation par action d'un sérum réaginique antiovalbumine et ovalbumine dans les conditions habituelles. Des doses de dialysat de 10-50 (il sont testées. On mesure, d'une part, la libération de sérotonine en présence de dialysat seul de façon à contrôler l'effet cytotoxi-que de cette substance, d'autre part, la libération de sérotonine après activation par le système anaphylactique. A de faibles concentrations (10-30 (il), la fraction dialysable de l'incubât inhibe de façon significative la dégranulation mastocytaire. Cette inhibition est fonction de la dose puisqu'on obtient 54% avec 10 (il et 70% avec 20 (il. Avec 30 |il l'inhibition est de 49%, mais une libération spontanée de sérotonine commence à apparaître à cette dose, ce qui peut expliquer la plus faible inhibition obtenue avec cette concentration. Aux plus fortes concentrations (40 et 50 jj.1), la libération spontanée de sérotonine augmente de façon considérable. Elle est presque totale avec s Serotonin-labeled rat peritoneal mast cells are incubated with the dialyzable and non-dialyzable fraction of the incubate at different concentrations. After 45 min of contact, degranulation is induced by the action of an anti-albumin and ovalbumin reactin serum under the usual conditions. Doses of dialysate of 10-50 (they are tested. On the one hand, the release of serotonin in the presence of dialysate alone is measured so as to control the cytotoxic effect of this substance, on the other hand, the release of serotonin after activation by the anaphylactic system. At low concentrations (10-30 (il), the dialysable fraction of the incubate significantly inhibits mast cell degranulation. This inhibition is dose-dependent since 54% is obtained with 10 (il and 70% with 20 (il. With 30 | il the inhibition is 49%, but a spontaneous release of serotonin begins to appear at this dose, which can explain the weakest inhibition obtained with this concentration. At the highest concentrations (40 and 50 days 1), the spontaneous release of serotonin increases considerably, and is almost complete with s

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

642 682 642 682

6 6

50 (il de dialysat (87%), ce qui correspond non pas à un processus actif, mais très certainement à une cytotoxicité du dialysat à ces concentrations. La fraction non dialysable ne présente pas d'action inhi-bitrice. 50 (il of dialysate (87%), which corresponds not to an active process, but most certainly to a cytotoxicity of the dialysate at these concentrations. The non-dialysable fraction does not exhibit any inhibiting action.

2. Inhibition de la dégranulation induite par des agents chimiques 2. Inhibition of degranulation induced by chemical agents

Il était intéressant de voir si cette substance a la propriété d'inhiber de façon très générale le processus de dégranulation, ou si cette inhibition est spécifique d'une dégranulation induite par des réactions antigène-anticorps. Pour cela, nous avons mis en contact des mastocytes marqués avec l'incubât, puis nous avons induit une dégranulation par action de composé 48/80 ou de polymyxine-B-sulfate. It was interesting to see if this substance has the property of very generally inhibiting the degranulation process, or if this inhibition is specific to a degranulation induced by antigen-antibody reactions. For this, we put labeled mast cells into the incubate, then we induced degranulation by the action of compound 48/80 or polymyxin-B-sulfate.

Les doses de ces composés utilisées pour faire dégranuler les mastocytes sont des doses infra-optimales, de façon à limiter la lyse cellulaire qui résulte d'une dégranulation explosive. Avec le composé 48/80 (5 (ig/ml), le pourcentage de libération de sérotonine est de 17,1 %. La préincubation avec 10 |il de fraction dialysable réduit ce pourcentage à 15,1%; avec 20 ni, on obtient 10,4%. L'inhibition obtenue avec 20 |il est de 39%. Bien que statistiquement significative (p < 0,05), elle reste cependant limitée. The doses of these compounds used to degranulate mast cells are sub-optimal doses, so as to limit cell lysis which results from explosive degranulation. With compound 48/80 (5 (μg / ml), the percentage of serotonin release is 17.1%. Preincubation with 10 μl of dialyzable fraction reduces this percentage to 15.1%; with 20 μl, obtains 10.4%, the inhibition obtained with 20 | it is 39%, although statistically significant (p <0.05), it nevertheless remains limited.

Avec la polymyxine-B-sulfate (5 (ig/ml), on obtient 29,8%. En préincubant avec 10 (il de dialysat, on a 19,5%, avec 20 (il 13,5%, ce qui correspond respectivement à 35 et 55% d'inhibition. On peut donc inhiber plus facilement une dégranulation induite par de la po-lymyxine-B- que par le composé 48/80. With polymyxin-B-sulfate (5 (ig / ml), 29.8% is obtained. By preincubating with 10 (11 of dialysate, 19.5%, with 20 (13.5%, which corresponds respectively at 35 and 55% inhibition, it is therefore easier to inhibit degranulation induced by po-lymyxin-B- than by compound 48/80.

3. Caractéristiques du facteur inhibiteur a) Thermostabilité 3. Characteristics of the inhibitory factor a) Thermostability

La fraction dialysable de l'incubât de vers adultes est chauffée • 1 h à 100° C puis mise en contact avec les mastocytes marqués. On compare l'inhibition de la dégranulation anaphylactique obtenue avec les fractions chauffée et non chauffée. On obtient, avec 10 jj.1 de dialysat, respectivement 54 et 56% d'inhibition. Il s'agit donc d'un composé thermostable. The dialyzable fraction of the adult worms incubate is heated for 1 hour at 100 ° C. and then brought into contact with the labeled mast cells. The inhibition of anaphylactic degranulation obtained with the heated and unheated fractions is compared. Obtained, with 10 dj.1 of dialysate, respectively 54 and 56% inhibition. It is therefore a thermostable compound.

b) Caractère irréversible de l'inhibition par lavage b) Irreversible nature of inhibition by washing

On a recherché si l'inhibition de la dégranulation pouvait être levée par lavage des cellules après leur mise en contact avec la fraction inhibitrice. It was investigated whether the inhibition of degranulation could be removed by washing the cells after they have been brought into contact with the inhibiting fraction.

Les cellules marquées sont incubées 45 min avec 10 jxl de dialysat puis lavées 3 fois dans le milieu de culture. On induit une dégranulation soit par action de polymyxine-B-sulfate, soit par action d'un sérum antiovalbumine et d'ovalbumine. The labeled cells are incubated for 45 min with 10 μl of dialysate and then washed 3 times in the culture medium. Degranulation is induced either by the action of polymyxin-B-sulfate, or by the action of an anti-albumin and ovalbumin serum.

Avec le système anaphylactique, on obtient 30,3% de libération de sérotonine. Avec 10 (il de dialysat, on obtient 13,3% s'il n'y a pas d'étape de lavages et 19,5% lorsque les cellules sont lavées entre l'incubation avec le dialysat et la sensibilisation passive avec le sérum réaginique. On ne peut donc pas restaurer la réponse normale par ces lavages. With the anaphylactic system, 30.3% serotonin release is obtained. With 10 (11 of dialysate, 13.3% is obtained if there is no washing step and 19.5% when the cells are washed between incubation with the dialysate and passive sensitization with the serum It is therefore impossible to restore the normal response by these washes.

Avec la polymyxine-B-sulfate (10 |ig/ml), la dégranulation est de 23,9%. En prêincubant avec le dialysat, on obtient sans lavage 19,9% ; avec l'étape de lavages, on obtient 22,0% pour le témoin et 12,7% avec le dialysat, ce qui correspond à 34 et 42% d'inhibition. On obtient le même résultat que précédemment avec la réaction anaphylactique. Il semble que le dialysat induise un signal inhibiteur irréversible même lorsqu'il est ensuite éliminé par lavages. With polymyxin-B-sulfate (10 µg / ml), degranulation is 23.9%. By preincubating with the dialysate, 19.9% is obtained without washing; with the washing step, 22.0% is obtained for the control and 12.7% with the dialysate, which corresponds to 34 and 42% inhibition. The same result is obtained as above with the anaphylactic reaction. The dialysate appears to induce an irreversible inhibitory signal even when it is then washed away.

c) Non-cytotoxicité de la substance protidique selon l'invention c) Non-cytotoxicity of the protein substance according to the invention

L'action de la fraction dialysable de l'incubât de vers a été The action of the dialyzable fraction of the worm incubate was

étudiée vis-à-vis de lymphocytes stimulés par des mitogènes. Cette fraction s'est montrée inhibitrice de la prolifération lymphocytaire. Bien que les tests de cytotoxicité réalisés sur les cultures de lymphocytes aient été négatifs, il était nécessaire de voir si cette fraction possède un caractère de toxine cellulaire, c'est-à-dire si elle induit une cytotoxicité ou cytostaticité des cellules, quelle que soit la lignée choisie. studied against lymphocytes stimulated by mitogens. This fraction was shown to inhibit lymphocyte proliferation. Although the cytotoxicity tests carried out on the lymphocyte cultures were negative, it was necessary to see if this fraction has a character of cellular toxin, that is to say if it induces a cytotoxicity or cytostaticity of the cells, whatever either the line chosen.

On a étudié deux lignées de cellules en culture continue. La première est la lignée Hela. Ce sont des cellules tumorales du col utérin n'ayant pas de compétence immunologique particulière. La seconde est la lignée monocytaire humaine J111. On a étudié l'action du dialysat sur des lymphocytes stimulés par des mitogènes ainsi que sur ces deux lignées cellulaires. La cytotoxicité est mesurée par test d'exclusion au bleu Trypan accompagnée d'une numération en hémocytomètre de Thomas. L'inhibition de croissance est évaluée par la mesure de l'incorporation de 3H thymidine (Thy). Two cell lines in continuous culture were studied. The first is the Hela line. These are cervical tumor cells with no particular immunological competence. The second is the human J111 monocytic line. The action of the dialysate has been studied on lymphocytes stimulated by mitogens as well as on these two cell lines. Cytotoxicity is measured by a Trypan blue exclusion test accompanied by a Thomas hemocytometer count. The growth inhibition is evaluated by measuring the incorporation of 3H thymidine (Thy).

Les lymphocytes spléniques de souris CBA sont mis en culture conformément à la technique décrite précédemment en présence de 10 (il de dialysat et de mitogènes PHA (dilution 1/100) et Con A (1 (ig). On mesure l'incorporation de 3H Thy au bout de 72 h de culture. La dose de 10 (il de dialysat se révèle extrêmement efficace vis-à-vis de lymphocytes stimulés par des mitogènes. L'inhibition est de 96%, c'est-à-dire que la stimulation mitogénique est totalement abolie. L'incorporation de base de la thymidine en présence ou en absence de dialysat est la même, ce qui suggère qu'il ne s'agit pas d'une action cytotoxique. The spleen lymphocytes of CBA mice are cultured according to the technique described above in the presence of 10 μl of dialysate and mitogens PHA (dilution 1/100) and Con A (1 (ig). The incorporation of 3 H is measured. Thy after 72 h of culture. The dose of 10 (il of dialysate proves to be extremely effective with respect to lymphocytes stimulated by mitogens. The inhibition is 96%, that is to say that the mitogenic stimulation is completely abolished The basic incorporation of thymidine in the presence or absence of dialysate is the same, which suggests that it is not a cytotoxic action.

Les cellules Hela et les monocytes sont mis en culture conformément à la technique décrite précédemment. Le test au bleu Trypan permet d'évaluer le pourcentage de cellules mortes lorsque celles-ci ne sont pas lysées. Un effet toxique pourrait entraîner une lyse cellulaire, c'est pourquoi il est nécessaire de faire également une numération de façon à conaître le nombre de cellules viables. Avec les cellules Hela, aucune différence de comportement n'est observée entre les cellules témoins et les cellules cultivées en présence de dialysat. Après 72 h de culture, les cellules se sont multipliées et forment un tapis confluent; l'inhibition de contact limite la prolifération cellulaire, ce qui explique la plus faible incorporation de thymidine en fin de culture (tableau 2). Hela cells and monocytes are cultured according to the technique described above. The Trypan blue test makes it possible to evaluate the percentage of dead cells when these are not lysed. A toxic effect could lead to cell lysis, which is why it is necessary to also do a count in order to know the number of viable cells. With Hela cells, no difference in behavior is observed between the control cells and the cells cultured in the presence of dialysate. After 72 h of culture, the cells have multiplied and form a confluent carpet; contact inhibition limits cell proliferation, which explains the lower incorporation of thymidine at the end of culture (Table 2).

Tableau 2: Table 2:

Incorporation de thymidine par des lymphocytes stimulés en présence de dialysat Incorporation of thymidine by stimulated lymphocytes in the presence of dialysate

Stimulation Stimulation

Incorporation de 3H Thy par les lymphocytes de souris Incorporation of 3H Thy by Mouse Lymphocytes

Témoin cpm+ET1 Witness cpm + ET1

Dialysat 10 (il cpm1 ± ET Dialysate 10 (it cpm1 ± ET

— -

15848+4463 15848 + 4463

15850 ± 2421 15850 ± 2421

Con A 1 (ig Con A 1 (ig

237643 + 8632 (IT2 = 15) 237643 + 8632 (IT2 = 15)

24896 ±9235 (IT =16) 24896 ± 9235 (IT = 16)

PHA Yioo PHA Yioo

206224+58231 (IT =13) 206224 + 58231 (IT = 13)

22469 ±3656 (IT =14) 22469 ± 3656 (IT = 14)

1 Nombre de coups par minute (cpm)± écart type (ET). 1 Number of strokes per minute (cpm) ± standard deviation (SD).

2 IT : index de transformation. 2 IT: transformation index.

(Tableau en tête de la page suivante) (Table at the top of the next page)

Le même résultat a été obtenu avec la lignée monocytaire J111. La multiplication cellulaire est plus lente mais, en 48 h, on observe cependant une augmentation du nombre de cellules, cette augmentation étant identique avec et sans dialysat. The same result was obtained with the J111 monocytic line. Cell multiplication is slower, but within 48 hours an increase in the number of cells is observed, this increase being identical with and without dialysate.

Aux doses couramment utilisées pour mettre en évidence des effets inhibiteurs, la fraction dialysable de l'incubât ne présente pas d'action toxique sur les cellules, quelle que soit leur origine. At the doses commonly used to demonstrate inhibitory effects, the dialyzable fraction of the incubate has no toxic action on the cells, whatever their origin.

B — Inhibition de la dëgranulation in vivo B - In vivo inhibition of degranulation

I. PCA induite par des agents chimiques I. PCA induced by chemical agents

Le composé 48/80 et la polymyxine sont capables d'induire in vivo une réaction positive lorsqu'ils sont injectés par voie intradermique. La réaction est instantanée, c'est pourquoi l'injection intraveineuse de bleu d'Evans doit être faite simultanément. La dilution limite donnant une réaction positive est déterminée pour chacun de ces composés sur une série de rats témoins. Pour le composé 48/80, il s'agit de 0,1 |ig/ml pour la polymyxine de 10 |ig/ml. Compound 48/80 and polymyxin are capable of inducing a positive reaction in vivo when injected intradermally. The reaction is instantaneous, which is why the intravenous injection of Evans blue must be done simultaneously. The limiting dilution giving a positive reaction is determined for each of these compounds on a series of control rats. For compound 48/80, this is 0.1 µg / ml for the polymyxin 10 µg / ml.

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

642 682 642 682

7 7

Tableau 3: Table 3:

Action du dialysat sur la viabilité et la croissance de cellules Hela Action of the dialysate on the viability and growth of Hela cells

Temps Time

Témoin Witness

Dialysat 10 |il Dialysate 10 | il

3H 3H

Numération1 3 H Thy (cpm + ET) Numeration1 3 H Thy (cpm + ET)

4,6- 10s ± 0,5 • 10s 23114+9477 4.6- 10s ± 0.5 • 10s 23114 + 9477

4,9-105 + 0,9-105 30040± 11177 4.9-105 + 0.9-105 30040 ± 11177

8H 8H

Numération 3 H Thy (cpm ± ET) Numeration 3 H Thy (cpm ± ET)

4,1 • 105± 1,0-105 17847 + 1675 4.1 • 105 ± 1.0-105 17847 + 1675

3,0-105 + 0,4-105 19629+977 3.0-105 + 0.4-105 19,629 + 977

24H 24h

Numération 3H Thy (cpm + ET) 3H Thy number (cpm + ET)

7,7-105 + 0,4-105 22719 + 651 7.7-105 + 0.4-105 22,719 + 651

5,6-105 + 0,5- 10s 21873 + 1550 5.6-105 + 0.5-10s 21873 + 1550

72H 72H

Numération 3H Thy (cpm ± ET) 3H Thy count (cpm ± ET)

21,6- 10s ±3,8-105 5726 + 386 21.6- 10s ± 3.8-105 5,726 + 386

22,0 -105± 3,0 -105 6015 + 1764 22.0 -105 ± 3.0 -105 6,015 + 1,764

1 Numération en hémocytomètre de Thomas après test d'exclusion du bleu Trypan. 1 Thomas hemocytometer count after exclusion test for Trypan blue.

2 Incorporation de 3 H Thy exprimée en coups par minute (cpm)± écart type (ET). 2 Incorporation of 3 H Thy expressed in counts per minute (cpm) ± standard deviation (SD).

Le dialysat est injecté 10 min avant l'induction de la dégranulation à raison de 100 |il par injection, par voie intradermique. Simultanément, on injecte le bleu d'Evans par voie intraveineuse et le 48/80 ou la polymyxine par voie intradermique. Les témoins positifs sont constitués par une première injection d'eau physiologique puis une seconde de 48/80 ou de polymyxine. On observe après injection du dialysat une nette diminution de l'intensité de la réaction, que ce soit avec le composé 48/80 ou avec la polymyxine. The dialysate is injected 10 min before the induction of degranulation at the rate of 100 μl by injection, intradermally. Simultaneously, Evans blue is injected intravenously and 48/80 or polymyxin intradermally. The positive controls consist of a first injection of physiological water then a second of 48/80 or of polymyxin. After injection of the dialysate, a marked reduction in the intensity of the reaction is observed, whether with compound 48/80 or with polymyxin.

2. PCA induite par une réaction anaphylactique a) Sérum antiovalbumine et ovalbumine 2. PCA induced by an anaphylactic reaction a) Anti-albumin and ovalbumin serum

On a induit une réaction d'anaphylaxie cutanée passive en utilisant un sérum antiovalbumine de titre PCA 1:128. Les animaux sont sensibilisés par le sérum réaginique dilué au 1:64. Après 48 h de sensibilisation, le dialysat est injecté au même point, une injection d'eau physiologique constituant le témoin positif. L'ovalbumine est injectée par voie intraveineuse avec le bleu d'Evans. Une forte réaction positive est obtenue avec le sérum réaginique. Cette réaction est pratiquement totalement abolie si le dialysat a été injecté au préalable. A passive cutaneous anaphylaxis reaction was induced using an anti-albumin serum of PCA 1: 128 titer. The animals are sensitized by reactin serum diluted 1:64. After 48 h of sensitization, the dialysate is injected at the same point, an injection of physiological water constituting the positive control. Ovalbumin is injected intravenously with Evans blue. A strong positive reaction is obtained with reactin serum. This reaction is practically completely abolished if the dialysate has been injected beforehand.

b) Sérum de rat infecté et antigène hydrosoluble de S. monsoni b) Infected rat serum and water-soluble antigen of S. monsoni

Un deuxième système anaphylactique a été choisi: contrairement aux expériences in vitro, il est possible d'obtenir une réaction positive avec un sérum de rat infecté par S. monsoni lorsqu'on utilise la technique de PCA. Le sérum de rat infecté est pris au 45e d de l'infection, c'est-à-dire à la période la plus favorable pour l'obtention d'IgE spécifiques anti-S. monsoni. Le sérum (titre PCA 1:8) est injecté pur par voie intradermique 48 h avant l'injection de dialysat. L'injection intraveineuse d'Ag hydrosoluble S. monsoni et de bleu d'Evans amène une forte réaction positive pour le témoin. Celle-ci est totalement abolie avec le dialysat. On confirme les résultats obtenus avec les composés chimiques, l'inhibition étant même plus marquée dans le cas de la réaction anaphylactique. A second anaphylactic system was chosen: unlike in vitro experiments, it is possible to obtain a positive reaction with a rat serum infected with S. monsoni when the PCA technique is used. The infected rat serum is taken at the 45th d of the infection, that is to say at the most favorable period for obtaining specific anti-S IgE. monsoni. The serum (PCA titer 1: 8) is injected pure intradermally 48 hours before the injection of dialysate. The intravenous injection of water-soluble Ag S. monsoni and Evans blue produced a strong positive reaction for the control. This is completely abolished with the dialysate. The results obtained with the chemical compounds are confirmed, the inhibition being even more marked in the case of the anaphylactic reaction.

C — Inhibition du système de cytotoxicité mastocyte/éosinophile dépendant C - Inhibition of the dependent mast cell / eosinophil cytotoxicity system

Le mécanisme de cette réaction de cytotoxicité a été décrit par Capron et al. Les éosinophiles mis en contact avec des schistosomules sensibilisés par des Ac IgGa sont capables d'enrober et de tuer ceux-ci. La présence de mastocytes ou de surnageants de mastocytes dégranulés est indispensable pour qu'il y ait cytotoxicité. Il est probable que les mastocytes activés par des complexes à IgE ou IgGa libèrent des produits d'activation des éosinophiles. Ceux-ci sont alors capables de détruire les schistosomules. Il était donc intéressant de voir si la fraction dialysable de l'incubât de vers adultes était capable en bloquant les mastocytes d'inhiber cette réaction de cytotoxicité. The mechanism of this cytotoxicity reaction has been described by Capron et al. Eosinophils brought into contact with schistosomules sensitized by IgGa Ab are capable of coating and killing these. The presence of mast cells or degranulated mast cell supernatants is essential for cytotoxicity. It is likely that mast cells activated by IgE or IgGa complexes release eosinophil activation products. These are then able to destroy the schistosomules. It was therefore interesting to see if the dialyzable fraction of the adult worm incubate was capable, by blocking mast cells, of inhibiting this cytotoxicity reaction.

10 |il de fraction dialysable sont déposés au contact des schistosomules sensibilisés en même temps que les cellules obtenues après adhérence de 2 h. Le pourcentage de schistosomules morts après 25 48 h de culture est déterminé. La présence de la fraction dialysable de l'incubât fait tomber le pourcentage de cytotoxicité de 63 à 17%, soit une inhibition de 74%. La fraction dialysable agit très probablement au niveau des mastocytes, mais il est également possible qu'elle agisse sur les éosinophiles. C'est pourquoi une deuxième expérience 30 a consisté à incuber préalablement des mastocytes purifiés avec la fraction dialysable puis à ajouter ces mastocytes à des éosinophiles purifiés et des schistosomules sensibilisés. Le pourcentage de cytotoxicité qui était de 14% tombe à 3% lorsque les mastocytes ont été préincubés avec la fraction dialysable. On retrouve le même pour-35 centage d'inhibition, bien que le témoin positif soit beaucoup plus faible. Cela suggère que l'action de la fraction dialysable se situe au niveau des mastocytes. 10 μl of dialysable fraction are deposited in contact with the sensitized schistosomules at the same time as the cells obtained after adhesion for 2 h. The percentage of schistosomules dead after 48 h of culture is determined. The presence of the dialysable fraction of the incubate drops the percentage of cytotoxicity from 63 to 17%, ie an inhibition of 74%. The dialyzable fraction most likely acts on mast cells, but it is also possible that it acts on eosinophils. This is why a second experiment 30 consisted in incubating beforehand purified mast cells with the dialysable fraction and then adding these mast cells to purified eosinophils and sensitized schistosomules. The percentage of cytotoxicity which was 14% drops to 3% when the mast cells have been preincubated with the dialyzable fraction. The same percentage of inhibition is found, although the positive control is much weaker. This suggests that the action of the dialysable fraction is located at the mast cell level.

D — Conclusion D - Conclusion

40 La fraction dialysable de l'incubât de vers adultes S. monsoni présente vis-à-vis de la dégranulation mastocytaire une action inhibitrice. Les expériences effectuées in vitro ont montré que cette fraction est capable d'inhiber la dégranulation, qu'elle soit induite par un système anaphylactique ou par des agents chimiques. L'utilisation 45 de la méthode isotopique de mesure de la dégranulation permet d'apprécier très exactement l'inhibition. Lorsque la dégranulation est induite par l'action d'un sérum antiovalbumine et de l'antigène correspondant, des doses de 10 à 30 jj.1 sont responsables d'une inhibition croissante de la libération de sérotonine. Avec de plus fortes 50 concentrations, un effet cytotoxique apparaît. La lyse cellulaire ou tout au moins l'altération de la membrane cellulaire entraîne une libération spontanée de sérotonine. Cette mesure de la libération spontanée de sérotonine constitue ainsi un bon indicateur de la cytotoxicité éventuelle du dialysat. Il est à noter que cette cytotoxicité 55 aux fortes concentrations n'est pas surprenante et correspond aux caractéristiques d'un grand nombre de substances biologiques. Le même effet inhibiteur est observé lorsque la dégranulation est induite par la polymyxine-B. Cet effet est beaucoup plus difficile à mettre en évidence lorsqu'il s'agit du composé 48/80. Cela peut s'expliquer par 60 le fait que la dégranulation induite par le composé 48/80 serait la conséquence d'un mécanisme différent de celui de l'activation classique. Par exemple, la dépendance de la dégranulation vis-à-vis du taux de nucléotides cycliques intracellulaires n'a pu être démontrée lorsqu'elle est induite par le composé 48/80 [Johnson et al., 65 «J. Immunol.», 112 (1974), 511 ; Diamant, «Acta Physiol. Scand.», 71 (1967), 283], alors qu'elle a été clairement démontrée dans le mécanisme général de la dégranulation [Kaliner et Austen, «J. Immunol.», 112 (1974), 664]. La possibilité d'inhiber une dégra 40 The dialyzable fraction of the incubate of adult worms S. monsoni has an inhibitory action with respect to mast cell degranulation. Experiments carried out in vitro have shown that this fraction is capable of inhibiting degranulation, whether it is induced by an anaphylactic system or by chemical agents. The use 45 of the isotopic method of measuring degranulation makes it possible to very precisely assess the inhibition. When degranulation is induced by the action of an anti-albumin serum and the corresponding antigen, doses of 10 to 30 days are responsible for an increasing inhibition of the release of serotonin. With higher 50 concentrations, a cytotoxic effect appears. Cell lysis or at least alteration of the cell membrane leads to a spontaneous release of serotonin. This measurement of the spontaneous release of serotonin thus constitutes a good indicator of the possible cytotoxicity of the dialysate. It should be noted that this cytotoxicity 55 at high concentrations is not surprising and corresponds to the characteristics of a large number of biological substances. The same inhibitory effect is observed when degranulation is induced by polymyxin-B. This effect is much more difficult to demonstrate when it comes to compound 48/80. This can be explained by the fact that the degranulation induced by compound 48/80 is the consequence of a mechanism different from that of conventional activation. For example, the dependence of degranulation on the level of intracellular cyclic nucleotides could not be demonstrated when it is induced by compound 48/80 [Johnson et al., 65 "J. Immunol. ”, 112 (1974), 511; Diamond, "Acta Physiol. Scand. ", 71 (1967), 283], while it has been clearly demonstrated in the general mechanism of degranulation [Kaliner and Austen," J. Immunol. ”, 112 (1974), 664]. The possibility of inhibiting a degra

642 682 642 682

8 8

nulation induite par un agent chimique tel que la polymyxine-B suggère que le dialysat agit par inhibition d'un signal d'activation intracellulaire plutôt que par des phénomènes de compétition au niveau des récepteurs pour l'IgE. Cancellation induced by a chemical agent such as polymyxin-B suggests that the dialysate acts by inhibition of an intracellular activation signal rather than by competition phenomena at the level of IgE receptors.

Une caractéristique de la substance inhibitrice est d'être thermostable (1 h-100°C), ce qui est propre aux substances de poids moléculaire < 10000. L'inhibition est irréversible par lavage des cellules. Ce résultat suggère que le dialysat induit au niveau de la cellule un signal intracellulaire qui empêche l'activation ultérieure, par exemple en bloquant une étape du métabolisme nécessaire au processus de la dégranulation. On ne peut toutefois exclure pour expliquer ce phénomène irréversible la possibilité d'une liaison de forte affinité entre le mastocyte et le facteur inhibiteur. A characteristic of the inhibitory substance is that it is thermostable (1 h-100 ° C), which is specific to substances with a molecular weight <10,000. The inhibition is irreversible by washing the cells. This result suggests that the dialysate induces an intracellular signal at the cell level which prevents further activation, for example by blocking a stage of metabolism necessary for the process of degranulation. To explain this irreversible phenomenon, however, we cannot exclude the possibility of a strong affinity bond between the mast cell and the inhibiting factor.

Les tests effectués sur des cellules Hela et les monocytes humains en culture continue ont montré que le dialysat ne présente aucune activité cytotoxique ou cytostatique sur ces cellules, aux doses utilisées pour mettre en évidence un effet inhibiteur sur les lymphocytes ou les mastocytes. Le dialysat dans les conditions utilisées n'est pas une toxine cellulaire, mais possède une action spécifique vis-à-vis de certains types cellulaires dont les lymphocytes et les mastocytes. Tests carried out on Hela cells and human monocytes in continuous culture have shown that the dialysate has no cytotoxic or cytostatic activity on these cells, at the doses used to demonstrate an inhibitory effect on lymphocytes or mast cells. The dialysate under the conditions used is not a cellular toxin, but has a specific action vis-à-vis certain cell types including lymphocytes and mast cells.

L'utilisation de la technique de PCA a permis de confirmer in vivo le rôle inhibiteur joué par le dialysat. Les composés chimiques 48/80 et polymyxine-B présentent l'avantage d'induire une réaction positive immédiate sans période de sensibilisation, ce qui a facilité les expériences dans un premier temps. Le même nombre d'injections est effectué pour chaque point (eau physiologique ou dialysat), ce qui permet d'éliminer l'hypothèse d'une inhibition due au traumatisme de l'injection intradermique. Le dialysat seul n'induit pas de réaction positive. Si l'action du dialysat consistait en une lésion tis- The use of the PCA technique has made it possible to confirm in vivo the inhibitory role played by the dialysate. The chemical compounds 48/80 and polymyxin-B have the advantage of inducing an immediate positive reaction without an awareness period, which facilitated the experiments at first. The same number of injections is made for each point (physiological water or dialysate), which eliminates the hypothesis of an inhibition due to the trauma of the intradermal injection. The dialysate alone does not induce a positive reaction. If the action of the dialysate consisted of a tissue injury

sulaire au point d'injection, il est probable qu'il en résulterait une lyse des mastocytes avec libération de médiateurs et vasodilatation, donc une réaction positive avec le dialysat seul. L'absence de réaction avec le dialysat permet de dire qu'il ne s'agit pas d'une simple s réaction cytotoxique. La présence du dialysat entraîne une forte atténuation de la réaction provoquée par le 48/80 ou la polymyxine. Une inhibition presque totale est observée dans le système anaphylactique, qu'il s'agisse d'un sérum antiovalbumine ou d'un sérum de rat infecté par S. monsoni. Le fait que le dialysat soit injecté après ou io par des agents chimiques suggère une intervention au niveau du métabolisme cellulaire dans l'une des étapes de l'activation conduisant à la dégranulation. On pourrait penser que l'action du dialysat se situe non pas au niveau du mastocyte, mais agit par destruction des médiateurs libérés. L'utilisation de la mesure de la sérotonine tritiée 15 libérée écarte cette hypothèse, car la radioactivité est de toute façon mesurée, même si la sérotonine libérée a été ultérieurement dégradée. sular at the injection site, it is likely that this would result in mast cell lysis with release of mediators and vasodilation, therefore a positive reaction with the dialysate alone. The absence of a reaction with the dialysate makes it possible to say that it is not a simple cytotoxic reaction. The presence of the dialysate leads to a strong attenuation of the reaction caused by 48/80 or polymyxin. Almost total inhibition is observed in the anaphylactic system, whether it is an antiovalbumin serum or a rat serum infected with S. monsoni. The fact that the dialysate is injected after or io by chemical agents suggests an intervention at the level of cellular metabolism in one of the stages of activation leading to degranulation. One might think that the action of the dialysate is not located at the mast cell level, but acts by destruction of the released mediators. The use of measurement of released tritiated serotonin rules out this assumption, since radioactivity is anyway measured, even if the released serotonin has been further degraded.

La purification de cette substance apporte des renseignements importants sur sa nature, son mécanisme d'action et son identification in vivo. D'autre part, elle permet de déterminer l'intérêt phar-macologique du produit de l'invention dans le traitement des phénomènes allergiques. The purification of this substance provides important information on its nature, its mechanism of action and its identification in vivo. On the other hand, it makes it possible to determine the pharmacological interest of the product of the invention in the treatment of allergic phenomena.

On signalera, pour terminer, que la schistosomiase sévit dans les régions de la vallée du Yang Tse qui sont un très important siège d'endémie hépatitique cirrhogène aboutissant à l'un des foyers mondiaux du cancer du foie. Il y a une relative protection des populations infestées par Schistosoma. On peut donc en inférer à l'existence dans les extraits de Schistosoma d'un facteur chimique de protection de l'hôte vis-à-vis du virus responsable. Finally, it should be noted that schistosomiasis is rife in the regions of the Yangtze valley which are a very important site of cirrhogenic hepatitis endemic leading to one of the world foci of liver cancer. There is relative protection for populations infested with Schistosoma. It can therefore be inferred from the existence in Schistosoma extracts of a chemical factor protecting the host against the responsible virus.

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Claims (4)

642 682642 682 1. Peptide provenant de Schistosoma monsoni, de poids moléculaire compris entre 500 et 1000, soluble dans l'eau, thermostable, non précipitable par les réactifs des protéines, dialysant à travers une membrane de dextrane réticulé du type Amicon X-100. 1. Peptide originating from Schistosoma monsoni, of molecular weight ranging between 500 and 1000, soluble in water, thermostable, not precipitable by the reagents of proteins, dialyzing through a membrane of cross-linked dextran of the type Amicon X-100. 2. Procédé d'obtention du peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait incuber des Schistosoma monsoni adultes dans l'eau, sépare les corps des nématodes et les débris particulaires du milieu liquide, soumet le milieu liquide à une dialyse vis-à-vis d'eau, recueille la fraction dialysée et lyophilise ladite fraction. 2. Method for obtaining the peptide according to claim 1, characterized in that adult Schistosoma monsoni is incubated in water, separates the bodies of the nematodes and the particulate debris from the liquid medium, subjects the liquid medium to dialysis vis-à-vis water, collects the dialyzed fraction and lyophilizes said fraction. 2 2 REVENDICATIONS 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on fait incuber des Schistosoma monsoni adultes dans l'eau pendant 3 h, sépare les corps des nématodes, soumet le filtrat à une centrifuga-tion, sépare le surnageant, le filtre sur un filtre Millipore, soumet le filtrat à une dialyse vis-à-vis d'eau distillée dans une cellule à dialyse équipée d'un filtre Amicon X-100 pendant 24 h, recueille la fraction dialysée que l'on lyophilise. 3. Method according to claim 2, characterized in that adult Schistosoma monsoni is incubated in water for 3 h, separates the bodies of the nematodes, subjects the filtrate to centrifugation, separates the supernatant, the filter on a Millipore filter, subjects the filtrate to dialysis against distilled water in a dialysis cell equipped with an Amicon X-100 filter for 24 h, collects the dialyzed fraction which is lyophilized. 4. Compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif le peptide de la revendication 1 en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte non toxique pharmaceuti-quement acceptable. 4. Pharmaceutical compositions containing as active ingredient the peptide of claim 1 in association or in mixture with an excipient or an inert non-toxic carrier pharmaceutically acceptable.