CH638050A5 - Verfahren und reagens zur bestimmung von ascorbinsaeure. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure oder Dehydroascorbinsäure und ein zur Durchführung des Verfahrens geeignetes Reagens.
Die Bestimmung von Ascorbinsäure ist vor allem in der Lebensmittelchemie von grosser Bedeutung. Sie wird zur Beurteilung der Qualität verschiedener Nahrungsmittel benötigt, wie z.B. die von Obstsäften, Frischgemüse, Tiefkühlgemüse und anderen Proben. Oft wird gerade bei Erfrischungsgetränken ein bestimmter Vitamin C-gehalt deklariert, der dann auch gehalten werden muss. Aber auch als Antoxidans und als Schönungsmittel wird Ascorbinsäure zugesetzt und muss dann bestimmt werden. Im klinisch-diagnostischen Bereich ist der Ascorbinsäuregehalt von allem im Urin von Interesse, wo er zu Störungen in den verschiedenen, auf Red-Ox-Reaktionen beruhenden Schnelldiagnostika Anlass gibt. Die Ascorbatbestimmung im Serum ist in tropischen Ländern von Interesse, da hier Avitaminosen (Skorbut) oft von den Symptomen anderer Krankheiten so überdeckt sind, dass sie nicht zu diagnostizieren sind. Aufgrund der Bedeutung der Ascorbinsäurebestimmung sind schon verschiedene Verfahren entwickelt und publiziert worden, deren Spezifität aber in der Regel gering ist und die einen zum Teil erheblichen Aufwand erfordern. Eine Zusammenfassung der bekannten Verfahren, ihrer Spezifität und ihrer Praktikabilität findet sich in Handbuch der Lebensmittelchemie, Hr. J. Schormüller, Bd. II, 2, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg, 1967, 764-789.
Die obigen Ausführungen gelten auch für die Dehydroascorbinsäure. Ascorbinsäure wird nämlich durch Luftsauerstoff leicht in Dehydroascorbinsäure überführt. Im Probenmaterial liegt daher häufig eine Mischung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure vor. Da Dehydroascorbinsäure die gleiche Vitaminwirkung besitzt wie Vitalin C, ist es zumeist sinnvoll zu prüfen, wie gross der Dehydroascorbatgehalt der Probe ist.
Es sind auch bereits Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Tetrazoliumsalzen bekannt geworden. Diese Reaktionen verlaufen entsprechend der Gleichung:
Tetrazoliumsalz + Ascorbat-»- Formazan + Dehydroascorbat + H+
Diese Verfahren, die in alkalischem Milieu durchgeführt werden müssen, werden jedoch durch zahlreiche Substanzen stark gestört und wurden daher auch von den Entwicklern nur zur Bestimmung von Reinsubstanzen bzw. für pharmazeutische Zubereitungen, die keine grösseren Mengen an Störsubstanzen enthalten, vorgeschlagen. In eigenen Versuchen konnte die Brauchbarkeit dieser Methoden nicht bestätigt werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure zu schaffen, welches die oben angegebenen Nachteile nicht aufweist, spezifischer als die bekannten Verfahren ist und insbesondere nicht die Störungsanfälligkeit gegenüber Fremdsubstanzen aufweist, die bisher bei Verwendung von Tetrazoliumsalzen auftrat. Ein Ziel der Erfindung ist auch die Schaffung eines Verfahrens der vorstehend bezeichneten Art, welches auch auf Dehydroascorbinsäure angewendet werden kann.
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Es wurde nunmehr gefunden, und hierauf beruht die Erfindung, dass in schwach saurem pH-Wert mit ganz bestimmten Tetrazoliumsalzen in Gegenwart eines bestimmten Elektronenüberträgers und eines oberflächenaktiven Mittels die Störung durch Fremdsubstanzen praktisch vollständig aus- 3 geschaltet wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Tetrazoliumsalz unter Messung der erhaltenen Färbung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Gegenwart von 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl- 10 2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlorid oder Distyryl-nitroblau-tetrazolium-chlorid zusammen mit Phenazinmethosulfat und einem Detergenz bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt wird.
Unter den verwendbaren Tetrazoliumsalzen ergibt das 3- 15 (4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid, im folgenden als MTT bezeichnet, die besten Ergebnisse und wird daher im Rahmen der Erfindung bevorzugt. Das Tetrazoliumsalz wird vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 1 m/Mol/1 Testlösung, besonders bevorzugt von 0,05 bis 0,15 20 mMol/1 verwendet.
Wie oben erwähnt, ist es wesentlich für das Verfahren der Erfindung, dass bei schwach sauren pH-Werten gearbeitet wird. In diesem pH-Wertbereich findet keine Reaktion mit den meisten Störsubstanzen statt bzw. wird die Reaktion so 25 verlangsamt, dass sie praktisch bedeutungslos wird. Allerdings ist bei diesem sauren pH-Wert auch die Umsetzungsgeschwindigkeit mit der Ascorbinsäure so gering, dass ein praktisches Bestimmungsverfahren hierauf nicht aufgebaut werden könnte. Durch das Phenazinmethosulfat in Kombination mit 30 dem Detergenz wird jedoch spezifisch die Umsetzung der Ascorbinsäure so beschleunigt, dass trotzdem befriedigende Reaktionsgeschwindigkeiten erzielt werden. Überraschenderweise wird die Reaktion mit den Störsubstanzen jedoch durch die genannten Zusätze nicht beschleunigt. 35
Zur Einstellung des schwach sauren pH-Wertbereichs, vorzugsweise eines pH-Werts zwischen 4,0 und 6,0 und besonders bevorzugt zwischen 4,8 und 5,3, eignen sich verschiedene Puffersysteme. Diejenigen Puffersysteme, die im genannten pH-Bereich puffern, sind dem Fachmann bekannt. Gute Reak-40 tionsgeschwindigkeiten wurden mit Phosphatpuffer, TRA-Puffer und Phosphat/Citrat-Puffer erzielt und diese Puffer werden daher bevorzugt. Besonders gute Ergebnisse liefert der Phosphat/Citrat-Puffer, da mit diesem Puffer die Proportionalität der Extinktionsänderung durch den gebildeten Farbstoff 45 bei allen Ascorbatmengen am besten erfüllt wird. Die zweckmässige Pufferkonzentration liegt zwischen 0,05 und 1 molar, bevorzugt werden 0,1 bis 0,5 Mol/1.
Das jeweils geeignete Detergenz kann leicht durch einige Versuche festgestellt werden. Die höchsten Reaktionsge- 50 schwindigkeiten wurden mit Benzalkoniumchlorid (Zephirol) erzielt. Bei manchen Proben führte dieses Detergenz jedoch zur Bildung von Niederschlägen, welche die Bestimmung stören können. Als bester Kompromiss zwischen Reaktionsbeschleunigung und Klarhaltung der Probelösungen erwiesen 55 sich die Alkylaryl-polyäthylenglykolester. Andere Beispiele für gut geeignete Detergentien sind Polyoxyäthylensorbitane-ster, wie Sorbimacrogol-stearat oder Polyäthylenglykollauryl-äther. Als Gruppe werden daher die nichtionogenen Polyäthy-lenglykolester und -äther im Rahmen der Erfindung bevor- «> zugt, ganz besonders bevorzugt wird der Octyl-phenol-poly-äthylenglykolester (Triton X100).
Für die Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit reichen im allgemeinen Konzentrationen zwischen 0,1 und 1% des Detergenz aus. Oberhalb von 1% wurde eine weitere Zunahme 65 der Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr festgestellt. Da im Rahmen der Erfindung das Detergenz jedoch nicht nur als Reaktionsbeschleuniger wirkt, sondern auch die Löslichkeit des gebildete Formazans verbessert, werden Zusätze zwischen 1 und 2% bevorzugt.
Die Beschleunigung der Reaktion wird ausserdem durch das Phenazinmethosulfat (PMS) bewirkt, welches die Reaktionsgeschwindigkeit vervielfacht und vor allem einen quantitativen Umsatz bewirkt. Mit anderen, bekannten Elektronenüberträgern wurde diese Beschleunigungswirkung nicht festgestellt. Die Konzentrationen können zwischen 0,01 und 1 mMol/1 liegen, in Ausnahmefällen auch darüber und darunter. Als besonders geeignet erwies sich eine Konzentration zwischen 0,05 und 0,15 mMol/1, da hierbei noch keine Reaktion mit SH-gruppenhaltigen Verbindungen, wie Homocystein, eintritt. Derartige SH-gruppenhaltige Verbindungen können zugesetzt werden, wenn vorhandenes Dehydroascor-bat gleichzeitig zu Ascorbat reduziert werden soll. Hierauf wird weiter unten noch eingegangen.
Wenn die zu untersuchende Probe zur Chelatbildung neigende, zweiwertige Metallionen enthält, so können Chelate mit dem gebildeten Formazanfarbstoff entstehen, welche die Messwerte beeinflussen können. Die Chelatbildung wird zwar durch den bevorzugt verwendeten Citrat/Phosphat-Puffer weitgehend ausgeschaltet. Es erwies sich jedoch als zweckmässig, ausserdem noch kleine Mengen von Sequestrierungsmitteln, wie Äthylendiamintetraessigsäure u.ä., zuzusetzen. Geeignete Mengen liegen im allgemeinen zwischen 0,1 und 5 mMol/1. Für besondere Zwecke, insbesondere bei der Analyse von Proben mit sehr hohem Gehalt an zweiwertigen Metallionen, können jedoch auch grössere Zusätze zweckmässig sein.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsge-mässen Verfahrens wird eine Parallelprobe mitgeführt, welche das gleiche Reagens enthält wie der Bestimmungsansatz, zusätzlich jedoch noch Ascorbatoxidase enthält. Die Ascorbatoxidase oxidiert spezifisch das in dem Parallelansatz enthalten Ascorbat. Nach Ablaufen dieser Oxidationsreaktion wird diese Parallelprobe dann als Leerwert für die eigentliche Ascorbinsäurebestimmung verwendet. Dies heisst, dass die Extinktion des Leerwerts von der Extinktion der eigentlichen Messreaktionslösung subtrahiert wird und die Differenz der . Berechnung der Ascorbinsäuremenge zugrunde gelegt wird.
Diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung steigert die Spezifität der Methode noch weiter, insbesondere dann, wenn in der Probelösung noch andere Substanzen vorhanden sind, bei denen eine Reaktion mit dem Tetrazoliumsalz nicht auszuschliessen ist. Die Ascorbatoxidase wird zweckmässig in Mengen zwischen 1 und 50 U/ml Testlösung eingesetzt. Für Reihenanalysen bestimmter, weitgehend gleich zusammengesetzter Proben, insbesondere von Nahrungsmitteln, lässt sich leicht durch wenige Vorversuche feststellen, welche Ascorba-toxidasemenge in der Regel ausreicht, um vorhandenes Ascorbat quantitativ zu oxidieren.
Wie bereits erwähnt lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren auch zur Bestimmung der Dehydroascorbinsäre einsetzen. Zu diesem Zweck wird die Dehydroascorbinsäure zuerst in Ascorbinsäure überführt und diese dann in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Die Reduktion erfolgt zweckmässig mit einer organischen Sulfhydrylverbindung. Bevorzugt wird Homocystein. Das Reduktionsmittel wird dabei im Überschuss verwendet und die Reduktion in neutralem oder schwach alkalischem Medium durchgeführt. Wird eine Sulfhydrylverbindung verwendet, so erweist sich eine Reduktion bei pH-Werten zwischen 7 und 8 als vorteilhaft. Bei dem bevorzugten Homocystein werden bei pH-Werten um etwa 7,5 beste Ergebnisse erzielt. Wenn anschliessend für die Bestimmung der gebildeten Ascorbinsäure der schwach saure pH-Wert, vorzugsweise 4,8 bis 5,3, eingestellt wird, läuft die Umsetzung mit der Ascorbinsäure glatt ab, ohne dass die überschüssige Sulfhydrylverbindung im Laufe der Reaktion neu gebildete Dehrydroascorbinsäure wieder zurückreduziert «und damit das
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Ergebnis verfälscht.
Diese Ausführungsweise des erfindungsgemässen Verfahrens lässt sich auch zur Bestimmung von Dehydroascorbinsäure neben Ascorbinsäure einsetzen. Hierzu ist es lediglich notwendig, in einer Probe in der vorstehend beschriebenen Weise Ascorbinsäure zu bestimmen und in einer zweiten Probe zuerst die Dehydroascorbinsäure, wie oben angegeben, zu reduzieren und danach die Bestimmung durchzuführen. Aus der Differenz der beiden Werte ergibt sich dann die Dehydroascorbinsäuremenge. i
Unter den bevorzugten Bedingungen läuft das Verfahren der Erfindung in etwa 30 Minuten quantitativ ab, d.h. die Reaktion kommt nach ungefähr einer halben Stunde zum Stillstand. Die Messung kann beispielsweise in einem handelsüblichen Photometer bei einer für die Bestimmung des gebildeten i Farbstoffs geeigneten Wellenlänge, wie 578 nm durchgeführt werden. Es lassen sich jedoch auch die anderen bekannten Methoden zur Bestimmung der Stärke einer entwickelten Färbung einsetzen. Auch die Auswertung durch Farbvergleich führt zu befriedigenden Ergebnissen, insbesondere wenn das 20 erfindungsgemässe Verfahren auf einem Teststreifen durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure mit einem Gehalt an Tetrazoliumsalz und Puffer, welches 25 dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Tetrazoliumsalz eine Verbindung aus der Gruppe 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyI-2)-2,5--diphenyl-tetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoli-umblauchlorid oder Distyrylnitroblau-tetrazoliumchlorid und ausserdem Phenazinmethosulfat, Detergenz und schwach 30 saure Puffersubstanz sowie gegebenenfalls ein Sequestrierungsmittel für zweiwertige Metallionen oder/und Ascorbatoxidase oder/und eine Sulfhydrylverbindung enthält.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemässe Reagens als Puffersubstanz Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,0 bis 6. Die 35 bevorzugte Tetrazoliumsalzverbindung ist MTT.
Ein bevorzugtes Reagens der oben genannten Art enthält: 0,01 bis 1 mMol/1 Tetrazoliumsalz,
0,01 bis 1 mMol/1 PMS,
0,1 bis 2% V/V Detergenz, 40
0,1 bis 1 Mol/1 Puffersubstanz,
1 bis 50 U/ml Ascorbatoxidase und 0,1 bis 10 mMol/1 Sequestrierungsmittel,
jeweils bezogen auf die Konzentration in der fertigen Testlösung. Das erfindungsgemässe Reagens kann in trockener oder 45 flüssiger Form, als Konzentrat oder gebrauchsfertige Lösung vorliegen. Sämtliche Bestandteile, ausgenommen die Ascor-binoxidase, können vorgemischt vorliegen.
Ein besonders bevorzugtes Reagens der obigen Art enthält: 50
0,05 bis 0,15 mMol/1 MTT,
0,05 bis 0,15 mMol/1 PMS,
0,5 bis 1,5% V/V Octylphenol-polyäthylenglykolester,
0,5 bis 5 mMol EDTA,
0,1 bis 0,4 mMol/1 Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,5 bis 5,3 und 55 1 bis 10 U/ml Ascorbatoxidase.
Die Erfindung schafft eine einfache und spezifische Methode zur Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) und Dehydroascorbinsäure, die gegenüber bekannten Verfahren wesentlich spezifischer und weniger störungsanfällig ist und 60 mit einfachen Mitteln durchgeführt werden kann. Die Erfindung schafft auch zur Durchführung des Verfahrens geeignete Reagentien, die auch in Form eines Teststreifens angewendet werden können. Bei derartigen Teststreifen wird ein entsprechendes, vorzugsweise blattförmiges Trägermaterial, beispiels- 65 weise saugfähiges Papier, wie Filterpapier oder Kunststoffolie, mit dem Reagens imprägniert und dann entweder in die zu untersuchende Probe eingebracht oder diese Probe aufgetropft. Die Auswertung kann dann durch Farbvergleich erfolgen. Herstellung und Aufbau von Teststreifen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Beschreibung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Phosphat/Citrat-puffer, oberflächenaktives Mittel, Sequestrierungsmittel, Tetrazoliumsalz, PMS sowie Wasser und Probe wurden in die Küvette eines handesüblichen Photometers eingebracht, die Reaktion ablaufen gelassen und die Extinktionsdifferenz gegen Luft oder Wasser gemessen. In einer parallelen Leerwertprobe wurde ausserdem Ascorbatoxidase eingesetzt. Die gleiche Ascorbatoxidasemenge wurde der Messwertprobe nach Beendigung der Reaktion zugesetzt, um durch die Ascorbatoxidase selbst etwa hervorgerufene Extinktionsdifferenzen auszugleichen.
Die Einzelheiten des Verfahrens, die verwendeten Reagentien und ihre Mengen ergeben sich aus der nachstehenden Tabelle.
Tabelle
Leerwert Probe (ml) (ml)
Konzentration im Test
Na2HP04 0,4 1,5
Mol/l/Citronensäure 0,2 Mol/1, pH 5 +
3% Triton XI00 + 2 mMol/1 ETDA Wasser 1,0
Probe 0,1
AAO 500 U/ml 0,02 2 min inkubieren, dann MTT 1,5 mMol/1 0,2 PMS 1,5 mMol/1 0,2 inkubieren, bis die Reaktion (etwa 30 min)
AAO 500 U/1
1,5
1,0 0,1
0,2 0,2
NazHP04 0,2 Mol/1 Citronensäure 0,2 Mol/1, Triton XI00 1,5% EDTA/1 mMol/1
1-50 nMol/1 = 0,176 - 8,8 mg/1 Ascorbat 3,3 U/ml Testlösung
0,1 mMol/1 0,1 mMol/1
zum Stillstand gekommen ist 0,02 3,3 U/1
Die oben angegebene Zusammensetzung eignet sich zur Bestimmung von 5 bis 250 mg Ascorbat pro Liter Probeflüssigkeit. Bei höheren Konzentrationen ist die Probe entsprechend zu verdünnen.
Bei geringeren Konzentrationen kann die Probemenge erhöht werden. Der Wassergehalt wird dann entsprechend erniedrigt.
Beispiel 2
Ascorbatbestimmung in Orangensaft.
Von einem käuflichen Orangensaft wurde 0,1 ml direkt als Probe wie in Beispiel 1 beschrieben, eingesetzt. Es fanden sich 305 mg Vitamin C/l. Das entspricht der Deklaration von 4 Pfund reifen Orangen ( = 300 mg/1). Zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 100% wiedergefunden. Schleichreaktionen traten nicht auf und die geringe Trübung des Orangensafts blieb ohne Einfluss auf die Bestimmung.
Beispiel 3
2,0 g eines Citronenteegetränks (Nestea) wurden in 20 ml H2O gelöst und 0,1 ml dieser Lösung in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Gefunden wurden 96 mg Vitamin C/l00 g Trok-kenmasse. Schleichreaktionen wurden nicht festgestellt. Der Probe vor dem Auflösen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 99,2% wiedergefunden. Die geringe Trübung der Lösung war ohne Einfluss auf den Test.
Beipiel 4
Bestimmung in Hagebutten.
5 ml Hagebuttenkonzentrat wurden in 100 ml H2O gelöst. Davon wurden nach dem Zentrifugieren 0,1 ml in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Es fanden sich 1770 Vitamin C/l Konzentrat. Ein leichter Schleich trat in Probe und Leerwert auf. Er wurde durch Extrapolation berücksichtigt. Vor dem Verdünnen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 100,9% wiedergefunden. Die leichte Färbung des so verdünnten Extrakts störte die Bestimmung nicht.
Beispiel 5
Bestimmung in Johannisbeersaft.
1 ml schwarzer Johannisbeersaft wurde mit Wasser auf 10 ml verdünnt und davon 0,1 ml in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Es fanden sich 305 mg Vitamin C/l. Vor dem Verdünnen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 100% wiedergefunden. Schleichreaktionen konnten nicht beobachtet werden. Um zu prüfen, ob der unverdünnte, stark gefärbte Saft zu Störungen Anlass gab, wurde er 4 Wochen offen im Kühlschrank gelagert, um den Ascorbatgehalt zu senken. Dann wurde 0,1 ml Saft unverdünnt in den Test eingesetzt. Es fanden sich noch 93 mg Vitamin C/l. Die starke Probenfärbung störte nicht. Auch Schleichreaktionen traten nicht auf. Zugesetzte Ascorbinsäure wurde vollständig wiedergefunden.
Beispiel 6
Bestimmung in Bier.
Bier, das ausserhalb Bayerns gebraut ist, darf zu Schö-nungszwecken und zur Haltbarmachung Ascorbinsäure enthalten. Dagegen ist der Zusatz nach dem bayerischen Reinheitsgebot verboten. Weder in hellem oder dunklem Fassbier noch in Dosenbier wurde bei der Durchführung des Verfahrens von Beispiel 1 Ascorbinsäure gefunden. Störungen konnten nicht festgestellt werden und zugesetzte Ascorbinsäure wurde vollständig wiedergefunden.
Beispiel 7
Bestimmung in Spinat.
Blanchierter, tiefgefrorener Spinat wurde aufgetaut und gründlich gemischt. 50 g davon wurden nach dem Verfahren von Marchesini et al (J. Food Science 39 [1974], 568 bis 571) aufgearbeitet, nur dass anstelle von HPO3 Metaphosphorsäure eingesetzt wurde. Bei einem Einsatz von 0,2 ml des auf pH 5 gestellten Extrakts wurden bei der Durchführung des Verfahrens von Beispiel 1 22 mg Ascorbat/100 g tiefgefrorenen Spinat gefunden. Bei einem Trockengewicht von 8% entspricht das 275 mg Ascorbat/100 g Trockenmasse und somit den Befunden für blanchierten Spinat verschiedener Sorten. Vor der Extraktion zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 98,8% wiedergefunden. Schleichreaktionen konnten nicht beobachtet werden.
Beispiel 8
Bestimmung in Kartoffeln.
50 g Kartoffeln wurden gewaschen, zerkleinert und in glei-
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eher Weise wie der Spinat in Beispiel 7 aufgearbeitet. Der Extrakt wurde auf pH 5 gestellt und auf 100 ml aufgefüllt. Nach dem Zentrifugieren wurden 500 ml in den Test eingesetzt. Es fanden sich 18,9 mg Ascorbat/kg Kartoffeln. Normal sind etwa 150 mg/kg. Es handelte sich jedoch um alte Ware, die schon sehr ausgetrocknet und teilweise gekeimt war. Unter diesen Bedingungen sinkt der Vitamin-C-Gehalt stark ab und kann sogar völlig verschwinden. Zur Prüfung wurde den Kartoffeln vor der Extraktion 75 mg Ascorbinsäure zugesetzt und das Extraktionsverfahren durchgeführt. Es fanden sich 97% dieses inneren Standards wieder. Schleichreaktionen traten nicht auf.
Beispiel 9
Bestimmung in Serum.
Der Gehalt von Ascorbinsäure im Serum soll zwischen 2 und 15 mg/1 betragen. Daher wurde 1 ml mit Trichloressig-säure enteiweisstes Probenmaterial in den Test eingesetzt. In 6 verschiedenen Seren fanden sich 1,5 bis 2,64 mg Ascorbat/1. Schleichreaktionen traten nicht auf. Die Wiederfindung zugesetzter Ascorbinsäure betrug praktisch 100% bei Zugabe von 17,2 mg Ascorbat /I Serum.
Beispiel 10
Bestimmung in Urin.
Der Gehalt an Ascorbat im Harn kann erhebliche Werte erreichen. Bei normaler Ernährung beträgt die Ausscheidung im Urin 10 bis 100 mg/1. Bei Einnahme höherer Dosen al 100 mg werden 60 bis 80% der eingenommenen Menge im Urin wiedergefunden, so dass bei der heute vielfach üblichen Einnahme grösserer Ascorbinsäuremengen im Harn auch grössere Werte als 100 mg/1 zu erwarten sind. In einem frischen Urin wurden beim Einsatz von 0,1 ml 257 mg Ascorbat/1 bei einer Wiederfindung von 98,3% gefunden, ohne dass Schleichreaktionen oder andere Störungen beobachtet wurden.
Beipiel 11
So hohe Vitamin C-gehalte im Urin, wie sie in Beispiel 10 gefunden wurden, können die Farbstoffbildung üblicher Teststreifen für Glucose, Blut oder Bilirubin usw., die auf Oxida-tion verschiedener Leucofarbstoffe beruhen, ganz oder teilweise unterdrücken und zu falschen Resultaten führen. Ob diese Gefahr besteht, kann durch einen Teststreifen festgehalten werden. Ein Rundfilter aus Testpapier wurde hierzu gründlich mit 0,2 Mol Na2HP04/0,l Mol/1 Citronensäurepuf-fer von pH 5 gewaschen, abgesaugt und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Anschliessend wurde das Leerwertgemisch von Beispiel 1, jedoch ohne Probe und Ascorbatoxidase, über das in einer Petrischale liegende Filter gegossen und erneut unter Vakuum und Lichtabschluss bei Raumtemperatur getrocknet. Auf das so vorbereitete Filter wurde je ein Tropfen von Lösungen, enthaltend 2, 5, 10,25 und 50 mg Ascorbat/100 ml, aufgetropft. Innerhalb einer Minute bildeten sich blauviolette Flecken, deren Farbintensität mit steigender Ascorbatmenge zunahm. Wasser ergab lediglich eine leichte Gelbfärbung.
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Claims (15)
- 638 0502PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure oder Dehydroascorbinsäure mit Tetrazoliumsalz durch Auswertung der erhaltenen Färbung, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Gegenwart von 3- (4,5-DimethyI-thiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazolium-blau-chlorid, oder Distyryl-nitroblau-tetrazolium-chlorid zusammen mit Phenazinmethosulfat und einem Deter-genz bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert durch Phosphat/Citrat-puffer eingestellt wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Alkylaryl-polyäthylenglykolester als Deter-genz verwendet wird.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein pH-Wert zwischen 4,0 und 6,0 eingestellt wird.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Sequestrierungsmittel zugesetzt wird.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass einem Leerwertansatz mit Probelösung Ascorbatoxidase zugesetzt und die Leerwertextinktion nach Beendigung der Oxidationsreaktion von der Extinktion der eigentlichen Bestimmungsreaktion substrahiert wird.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung von Dehydroascorbat der Probelösung überschüssige Sulfhydrylverbindung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 zugesetzt und nach Beendigung der Oxidation auf pH 4,8 bis 5,3 gebracht und die Ascorbinsäure bestimmt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Sulfhydrylverbindung Homocystein verwendet wird.
- 9. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Verbindung aus der Gruppe 3- (4,5-Dimethyl-thiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazo-liumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlorid oder Distyrilnitroblau-tetrazoliumchlorid und ausserdem Phenazinmethosulfat, Detergenz und schwach saure Puffersubstanz enthält.
- 10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Sulfhydrylverbindung und/oder Ascorbatoxidase und/oder ein Sequestrierungsmittel enthält.
- 11. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz aus Phosphat-Citrat-puffer, pH 4,0 bis 6,0 besteht.
- 12. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid enthält.
- 13. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es als Detergenz einen Alkylarylpolyäthylengly-kolester enthält.
- 14. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es0,01 bis 1 mMol pro Liter 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid,0,01 bis 1 mMol pro Liter Phenazinmethosulfat,0,1 bis 1 Mol pro Liter Puffersubstanz,0,1 bis 2 Gew.-% Detergenz,1 bis 50 U pro ml Ascorbatoxidase,0,1 bis 10 mMol pro Liter Sequestrierungsmittel,bezogen auf die fertige Testlösung, enthält.
- 15. Reagens nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es aus0,05 bis 0,15 mMol pro ml 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid,0,05 bis 0,15 mMol pro Liter Phenazinmethosulfat,0,5 bis 1,5 % Octylphenyl-polyäthylenoxidäther,0,5 bis 5 mMol pro Liter Aethylendiamin-tetraessigsäure, 0,1 bis 0,4 mMol pro Liter Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,8 bis 5,3,1 bis 10 U pro ml Ascorbatoxidase,jeweils bezogen auf fertige Testlösung, besteht oder diese enthält.
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