CH625126A5 - Process for the production of tin-containing human serum albumin particles suitable for binding technetium - Google Patents

Description

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2 2nd

PATENTANSPRÜCHE PATENT CLAIMS

1. Verfahren zur Herstellung von zur Bindung von Technetium geeigneten, zinnhaltigen Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass man Humanserumalbumin in wässriger Lösung nach Reinigung durch Dialyse auf einen pH-Wert zwischen 9,8 und 10,2 einstellt, die Lösung auf eine Temperatur zwischen 71 und 73 °C bringt, diese Temperatur 10 bis 20 Minuten lang erhält, die Lösung dann auf eine Temperatur zwischen 45 und 50 °C bringt, durch Zusatz von Säure einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,0 einstellt, 0,17 bis 0,22 Gewichtsprozent Zinn-II-Ionen, bezogen auf Humanserumalbumin, zusetzt, unter weiterem Rühren und durch Zusatz weiterer Säure einen pH-Wert zwischen 5,2 und 4,8 einstellt, danach weitere 1,53 bis 1,73 Gewichtsprozent Zinn-II-Ionen, bezogen auf Humanserumalbumin, zusetzt, anschliessend noch einmal auf eine Temperatur zwischen 71 und 73 °C erwärmt, 1. A process for the preparation of particles containing tin suitable for the binding of technetium, characterized in that human serum albumin in aqueous solution is adjusted to a pH between 9.8 and 10.2 after cleaning by dialysis, the solution to a temperature between 71 and 73 ° C, maintains this temperature for 10 to 20 minutes, then brings the solution to a temperature between 45 and 50 ° C, adjusts the pH to between 6.8 and 7.0 by adding acid, 0.17 up to 0.22 percent by weight of tin-II ions, based on human serum albumin, is added with further stirring and by adding further acid to a pH of between 5.2 and 4.8, then a further 1.53 to 1.73 percent by weight of tin II ions, based on human serum albumin, are added, then heated again to a temperature between 71 and 73 ° C,

die so erhaltene Suspension der Gegenstromsedimentation mittels physiologischer Kochsalzlösung unterwirft, subjecting the suspension thus obtained to countercurrent sedimentation using physiological saline,

die sedimentierten Teilchen nach Dekantieren der physiologischen Kochsalzlösung mit sterilem destilliertem Wasser auf einen Gehalt von 2,5 bis 3,0 mg Albumin pro Milliliter Suspension bringt und diese Suspension in Gefässen gefriertrocknet, die auf eine Temperatur unter minus 80 °C vorgekühlt sind. After decanting the physiological saline solution with sterile distilled water, the sedimented particles are brought to a content of 2.5 to 3.0 mg of albumin per milliliter of suspension and this suspension is freeze-dried in vessels which are pre-cooled to a temperature below minus 80 ° C.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Humanserumalbumin nach Reinigung durch Dialyse auf einen pH-Wert zwischen 9,8 und 10,2 durch Zusatz von Natronlauge unter Rühren einstellt. 2. The method according to claim 1, characterized in that after cleaning by dialysis human serum albumin is adjusted to a pH between 9.8 and 10.2 by adding sodium hydroxide solution with stirring.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur zwischen 45 und 50 °C einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,0 durch Zusatz von Salzsäure unter Rühren einstellt. 3. The method according to claim 1, characterized in that a pH between 6.8 and 7.0 is set at a temperature between 45 and 50 ° C by adding hydrochloric acid with stirring.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gegenstromsedimentation bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 10 und 20 ml pro cm2 Gefässquer-schnitt und pro Stunde durchgeführt wird. 4. The method according to claim 1, characterized in that the countercurrent sedimentation is carried out at a flow rate between 10 and 20 ml per cm 2 of vessel cross-section and per hour.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Rührgeschwindigkeit nach der ersten Zugabe der Zinn-II-Ionen zwischen 600 und 700 Umdrehungen pro Minute liegt. 5. The method according to claims 1 and 2, characterized in that the stirring speed after the first addition of the tin-II ions is between 600 and 700 revolutions per minute.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspension in Gefässen gefriertrocknet, die Mengen von 0,5 bis 5 ml der Suspension aufnehmen. 6. The method according to claim 1, characterized in that the suspension is freeze-dried in vessels, absorbing the amounts of 0.5 to 5 ml of the suspension.

Es ist bekannt, zur szintigrafischen Darstellung der Lunge zum Zwecke der Diagnose Humanserumalbumin (HSA)-Par-tikel zu verwenden, die einen Durchmesser von mehr als 10 Mikrometer haben. Solche Partikel werden in den peripheren Blutkreislauf gebracht und bleiben auf ihrem Weg durch die Lungen in den Kapillargefässen stecken. Sind die Partikel durch einen Gamma-Strahler radioaktiv markiert, so erlauben sie die Darstellung der Lunge in einem Perfusionsszintigramm. In ähnlicher Weise ist die Darstellung anderer Teilgebiete des Kreislaufs nach Injektion in das zuführende Blutgefäss möglich. It is known to use human serum albumin (HSA) particles larger than 10 microns in diameter for scintigraphic imaging of the lungs for the purpose of diagnosis. Such particles are brought into the peripheral blood circulation and get stuck in the capillaries on their way through the lungs. If the particles are radioactively marked by a gamma emitter, they allow the lungs to be displayed in a perfusion scintigram. In a similar way, it is possible to display other subregions of the circulation after injection into the blood vessel.

HSA-Partikel sind gut verträglich. Sie werden in der Lunge enzymatisch abgebaut. Zur radioaktiven Markierung verwendete man zunächst Jod-131, später Technetium-99m [vgl. P. V. Harper et al., Radiology 85, 101 (1965)]. Die Markierung mit Technetium kann unmittelbar vor der Verwendung zur Injektion mit Hilfe des Eluats eines Technetium-99m-Generators erfolgen. Vorher sind die lyophilisierten HSA-Partikel monatelang haltbar. Weitere Vorteile der Verwendung von Technetium zum Markieren der HSA-Partikel sind dessen wesentlich geringere Halbwertszeit (Tc-99m: 6 Stunden, J-131: 8 Tage), was die Strahlenbelastung des Patienten verringert, sowie die bessere Messbarkeit infolge seiner Gamma-Strahlung in einem eng umschriebenen messtechnisch günstigen Energiebereich, s Zum Markieren der HSA-Partikel mit Technetium ist ein Reduktionsmittel erforderlich, das die Pertechnetat-Anionen aus dem Generatoreluat in Technetium niedriger Oxidationsstufe überführt, welches sich an die HSA-Partikel bei saurer Fällung am isoelektrischen Punkt anlagert. Als Reduktionsmittel wer-io den vorwiegend Metallsalze, insbesondere Zinn-II-chlorid, verwendet (vgl. DOS 2 235 681). HSA particles are well tolerated. They are broken down enzymatically in the lungs. Iodine-131, later technetium-99m [cf. P.V. Harper et al., Radiology 85, 101 (1965)]. Technetium labeling can be done immediately before use for injection using the eluate of a Technetium 99m generator. Before that, the lyophilized HSA particles can be kept for months. Other advantages of using technetium to label the HSA particles are its significantly lower half-life (Tc-99m: 6 hours, J-131: 8 days), which reduces the patient's radiation exposure, and better measurability due to his gamma radiation in a narrowly defined, technologically favorable energy range, s To mark the HSA particles with technetium, a reducing agent is required that converts the pertechnetate anions from the generator eluate into technetium at a low oxidation level, which accumulates on the HSA particles during acidic precipitation at the isoelectric point. Mainly metal salts, in particular tin (II) chloride, are used as reducing agents (cf. DOS 2 235 681).

Dieses bekannte Verfahren zur Herstellung von zur Bindung von Technetium geeigneten zinnhaltigen HSA-Partikeln hat verschiedene Nachteile. Die Säuredenaturierung der zinn-i5 haltigen HSA-Partikel bei 80 °C führt zu harten Albuminteilchen, die nur schwer abgebaut werden können und deren Grösse zwischen 5 und 100 Mikrometer liegt. Der Zinngehalt liegt sehr hoch und führt zu einer unnötigen Zinnbelastung des Organismus. This known method for producing tin-containing HSA particles suitable for binding technetium has various disadvantages. The acid denaturation of the tin-i5-containing HSA particles at 80 ° C leads to hard albumin particles that are difficult to degrade and whose size is between 5 and 100 micrometers. The tin content is very high and leads to an unnecessary tin load on the organism.

20 Das Arbeiten mit Agglomerisationshemmern wie Propy-lenglykol, Konservierungsmitteln wie Benzylalkohol und mit Antischaummitteln, welche Zusatzstoffe ebenfalls redioaktiv markiert werden, führt zu Präparaten, die auch in anderen Organen, wie Leber, Milz und Knochenmark, in nicht erwünsch-25 ter Weise angereichert werden. 20 Working with agglomeration inhibitors such as propylene glycol, preservatives such as benzyl alcohol and with anti-foaming agents, which additives are also redio-labeled, leads to preparations that are also undesirably enriched in other organs, such as the liver, spleen and bone marrow .

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von zur Bindung von Technetium geeigneten, zinnhaltigen Humanserumalbumin-Partikeln gefunden, das die obigen Nachteile vermeidet und das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Human-30 serumalbumin in wässriger Lösung nach Reinigung durch Dialyse, zweckmässig durch Zusatz von Natronlauge und zweckmässig unter Rühren, auf einen pH-Wert zwischen 9,8 und 10,2 einstellt, die Lösung auf eine Temperatur zwischen 71 und 73 °C bringt, diese Temperatur 10 bis 20 Minuten lang 35 erhält, die Lösung dann auf eine Temperatur zwischen 45 und 50 °C bringt und in der Regel unter weiterem Rühren durch Zusatz von Säure, vorzugsweise von Salzsäure, einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,0 einstellt, 0,17 bis 0,22 Gewichtsprozent Zinn-II-Ionen, bezogen auf Humanserumalbumin, zusetzt, un-40 ter weiterem Rühren und durch Zusatz weiterer Säure einen pH-Wert zwischen 5,2 und 4,8 einstellt, danach weitere 1,53 bis 1,73 Gewichtsprozent Zinn-II-Ionen, bezogen auf Humanserumalbumin, zusetzt, anschliessend noch einmal auf eine Temperatur zwischen 71 und 73 °C erwärmt, A process has now been found for the preparation of tin-containing human serum albumin particles suitable for binding technetium, which avoids the above disadvantages and which is characterized in that human 30 serum albumin in aqueous solution after purification by dialysis, expediently by adding sodium hydroxide solution and expediently with stirring, adjusted to a pH between 9.8 and 10.2, brings the solution to a temperature between 71 and 73 ° C, maintains this temperature for 10 to 20 minutes, then the solution to a temperature between Brings 45 and 50 ° C and usually with further stirring by adding acid, preferably hydrochloric acid, a pH between 6.8 and 7.0, 0.17 to 0.22 percent by weight of tin-II ions, based on human serum albumin, adds, under further stirring and by adding further acid, a pH of between 5.2 and 4.8, then a further 1.53 to 1.73 percent by weight of tin-II ions, based on human serum albu min, adds, then heated again to a temperature between 71 and 73 ° C,

45 die so erhaltene Suspension der Gegenstromsedimentation mittels physiologischer Kochsalzlösung, vorzugsweise bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 10 und 20 ml pro cm2 Ge-fässquerschnitt und pro Stunde, unterwirft, 45 subjecting the suspension obtained in this way to countercurrent sedimentation using physiological saline, preferably at a flow rate between 10 and 20 ml per cm 2 of vessel cross section and per hour,

die sedimentierten Teilchen nach Dekantieren der physio-50 logischen Kochsalzlösung mit sterilem destillierten Wasser auf einen Gehalt von 2,5 mg bis 3,0 mg Albumin pro Milliliter Suspension bringt und diese Suspension zweckmässig in Mengen von 0,5 bis 5 ml und vorzugsweise in Mengen von 0,5 bis 2 ml in Gefäs-55 sen gefriertrocknet, die auf eine Temperatur unter minus 80 °C vorgekühlt sind. after decanting the physio-50 logical saline solution with sterile distilled water, the sedimented particles are brought to a content of 2.5 mg to 3.0 mg of albumin per milliliter of suspension and this suspension is expediently in amounts of 0.5 to 5 ml and preferably in amounts from 0.5 to 2 ml freeze-dried in vials that have been pre-cooled to a temperature below minus 80 ° C.

Dabei ist es vorteilhaft, die Rührgeschwindigkeit nach der ersten Zugabe der Zinn-II-Ionen zwischen 600 und 700 Umdrehungen pro Minute zu halten. Mit besonderem Vorteil wird 60 ein Magnetrührer verwendet, wobei die Länge des Rührstabes zwischen einem Drittel und der Hälfte des grössten Gefäss-durchmessers liegt. It is advantageous to keep the stirring speed between 600 and 700 revolutions per minute after the first addition of the tin-II ions. A magnetic stirrer is used with particular advantage, the length of the stirring rod being between one third and half of the largest vessel diameter.

Die Gefriertrocknung erfolgt vorteilhaft in flüssigem Stickstoff. Freeze drying is advantageously carried out in liquid nitrogen.

ss Vorteilhaft werden die gefriergetrockneten HSA-Partikel unmittelbar vor Gebrauch durch Zugabe isotonischer, steriler Pertechnetatlösung und kurzes Schütteln mit Technetium-99m markiert. The freeze-dried HSA particles are advantageously marked immediately before use by adding isotonic, sterile pertechnetate solution and briefly shaking with Technetium-99m.

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Die so hergestellten HSA-Partikel haben gegenüber dem Stand der Technik folgende Vorteile: The HSA particles produced in this way have the following advantages over the prior art:

1. Die niedrige Denaturierungstemperatur von 72° liefert Partikel, die einerseits lange genug in der Lunge gespeichert werden, um mehrfache Aufnahmen (z.B. mit der Szintilla-tionskamera) machen zu können. Anderseits werden die Partikel nach kurzer Zeit abgebaut. Bei Tierversuchen (Ratte) wurden 24 Stunden nach Applikation nur noch 5 % der injizierten Partikel in der Lunge gefunden. 1. The low denaturation temperature of 72 ° provides particles that are stored in the lungs long enough to be able to take multiple pictures (e.g. with the scintillation camera). On the other hand, the particles are broken down after a short time. In animal experiments (rat), only 5% of the injected particles were found in the lungs 24 hours after application.

2. Die Fällungstemperatur zwischen 45 und 50 °C und die bevorzugte Rührgeschwindigkeit während des Fällungsvorganges führen zur reproduzierbaren Bildung makroaggregierter Partikel gleichmässiger Grössenverteilung von 20 bis 50ÌVIÌ-krometer (>90%). 2. The precipitation temperature between 45 and 50 ° C and the preferred stirring speed during the precipitation process lead to the reproducible formation of macro-aggregated particles of uniform size distribution from 20 to 50ÌVIÌ-Krometer (> 90%).

3. Der Zinngehalt der Partikel ist mit 1,70 bis 1,95 % Sn2+ (bezogen auf das Albumin) besonders niedrig; ausserdem wird das Zinn durch die in zwei Schritten erfolgende Zugabe besonders wirksam gebunden. Deshalb liegt die Markierungsausbeute, auch bei länger gelagerten Präparaten, über 99%, d.h. der Gehalt an freiem 99mTc04 ist kleiner als 1 %. 3. The tin content of the particles is particularly low at 1.70 to 1.95% Sn2 + (based on the albumin); in addition, the tin is bound particularly effectively by the addition which takes place in two steps. Therefore, the labeling yield, even with preparations stored for longer, is over 99%, i.e. the free 99mTc04 content is less than 1%.

4. Die Reinigung der ausgefällten Partikel durch Gegenstromsedimentation trennt unerwünschte kleine Teilchen leicht und vollständig ab, so dass Leber und Nieren nur sehr geringe Aktivitätsmengen aufweisen. In der Ratte wurden 15 Minuten nach der Injektion von der applizierten Dosis weniger als 4. The cleaning of the precipitated particles by countercurrent sedimentation separates unwanted small particles easily and completely, so that the liver and kidneys have only very small amounts of activity. In the rat, the administered dose was less than 15 minutes after the injection

0,3 % in der Leber und weniger als 0,6% in den Nieren gefunden. 0.3% found in the liver and less than 0.6% in the kidneys.

5. Die in physiologischer Kochsalz-Lösung erfolgende Sedimentation der Partikel verhindert ein Verkleben bzw. Zusammenbacken und damit eine Vergrösserung der Partikel. Nach der endgültigen Verdünnung und dem Gefriertrocknen enthält das Produkt pro 2,5 mg Humanserumalbumin zwischen 1,5 und 2,0 mg Kochsalz. Diese physiologisch unbedenkliche Menge an Kochsalz macht den Zusatz von Agglomerisations-hemmern bzw. Stabilisatoren überflüssig und bewirkt, dass sich die Partikel bei Zugabe des Technetium-99m-Generatoreluats leicht und gleichmässig suspendieren lassen. 5. The sedimentation of the particles in physiological saline solution prevents sticking or caking and thus an enlargement of the particles. After final dilution and freeze-drying, the product contains between 1.5 and 2.0 mg sodium chloride per 2.5 mg human serum albumin. This physiologically safe amount of table salt makes the addition of agglomeration inhibitors or stabilizers superfluous and has the effect that the particles can be easily and evenly suspended when the technetium 99m generator eluate is added.

6. Die gefriergetrockneten, nur Zinn-II-Ionen und Kochsalz enthaltenden Partikel werden durch Zugabe von isotonischer Pertechnetat-Lösung und kurzes Schütteln mit Techne-tium-99m markiert, wobei umständliche Manipulationen, wie Erwärmen o.a., nicht notwendig sind. Die Generatoreluat-Vo-Iumina sind wegen der guten Suspendierbarkeit der Partikel und wegen der vollständigen Reduktion des Pertechnetats nicht eng begrenzt; es können 1 bis 10 ml zugesetzt werden, ohne dass die Markierungsausbeute unter 99% sinkt. 6. The freeze-dried particles containing only tin (II) ions and saline are marked by adding isotonic pertechnetate solution and briefly shaking with techne-99m, whereby laborious manipulations such as heating or the like are not necessary. The generator eluate volume is not narrowly limited because of the good suspendability of the particles and because of the complete reduction of the pertechnetate; 1 to 10 ml can be added without the labeling yield falling below 99%.

Beispiel example

5 10 g gegen isotonische Kochsalz-Lösung dialysiertes Humanserumalbumin (HSA) werden mit steriler, isotonischer NaCl-Lösung auf 400 ml aufgefüllt und durch Zugabe von In NaOH auf pH 10 eingestellt. Unter Rühren wird die Albumin-Lösung schnell auf 72 °C erhitzt und 15 Minuten bei io dieser Temperatur gehalten. Die Temperatur der Lösung wird auf 45 °C gesenkt, die Rührgeschwindigkeit auf 650 U./min erhöht und langsam 0,ln HCl in isotonischer Kochsalz-Lösung bis pH 6,9 zugetropft. Dann gibt man so langsam 3,7 ml einer frisch angesetzten, 34 mg SnCl2 • 2H20 enthaltenden, salzsau-15 ren Lösung hinzu, dass keine Partikelausfällung eintritt. 5 10 g of human serum albumin (HSA) dialysed against isotonic saline solution are made up to 400 ml with sterile, isotonic NaCl solution and adjusted to pH 10 by adding In NaOH. With stirring, the albumin solution is quickly heated to 72 ° C. and held at this temperature for 15 minutes. The temperature of the solution is lowered to 45 ° C., the stirring speed is increased to 650 rpm, and 0.1 ml of HCl in isotonic sodium chloride solution are slowly added dropwise to pH 6.9. Then 3.7 ml of a freshly prepared, salt solution containing 34 mg of SnCl2 • 2H20 are added so slowly that no particle precipitation occurs.

Durch weitere Zugabe von 0,ln HCl in isotonischer Kochsalz-Lösung bis pH 5,1 erreicht man die vollständige Ausfällung des denaturierten Albumins in Form von Makroaggrega-ten mit einer Teilchengrösse bis zu 50 «m. Das restliche Zinn-20 salz, 306 mg SnCl2-2H20, gelöst in 0,02%iger Salzsäure, wird anschliessend langsam zugesetzt. Durch nachfolgende, 30mi-nutige Nachdenaturierung der Suspension bei 72 °C werden die Partikel verfestigt. The further precipitation of denatured albumin in the form of macroaggregates with a particle size of up to 50 μm is achieved by further addition of 0.1 l of HCl in isotonic sodium chloride solution up to pH 5.1. The remaining tin-20 salt, 306 mg SnCl2-2H20, dissolved in 0.02% hydrochloric acid, is then slowly added. The particles are solidified by subsequent, 30-minute groove denaturation of the suspension at 72 ° C.

Die Partikelsuspension wird über Nacht in einem Gefäss, 25 das im unteren Teil eine Fritte (Porengrösse G2) mit ca. 85 cm2 Fläche besitzt, in von unten mit einer Geschwindigkeit von ca. 11/h entgegenströmender physiologischer Kochsalz-Lösung sedimentiert. Während alle kleineren Teilchen abgeschwemmt werden, setzen sich die gewünschten 20 bis 50 fi m grossen 30 Teilchen ab. Nach dem Abdekantieren der überstehenden Flüssigkeit wird die Aufschlämmung der Partikel in der isotonischen Kochsalz-Lösung mit sterilem destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 2,5 mg HSA/ml eingestellt; die Lösung enthält 1,8 mg NaCl/ml. Je 1 ml der Suspension wird in 35 mit flüssigem Stickstoff vorgekühlte Fläschchen abgefüllt, The particle suspension is sedimented overnight in a vessel, 25 which has a frit (pore size G2) with an area of approx. 85 cm2 in the lower part, in physiological saline solution counter-flowing from below at a speed of approx. 11 / h. While all smaller particles are washed away, the desired 20 to 50 µm 30 particles settle. After decanting off the supernatant liquid, the slurry of the particles in the isotonic saline solution is adjusted to a concentration of 2.5 mg HSA / ml with sterile distilled water; the solution contains 1.8 mg NaCl / ml. 1 ml of the suspension is filled into 35 vials pre-cooled with liquid nitrogen,

worin die Partikelsuspension fast augenblicklich gefriert. Nach sorgfältiger Gefriertrocknung bilden die Partikel eine trockene, leicht bewegliche Masse, die einwandfrei suspendierbar ist und eine unveränderte Teilchengrösse von 20 bis 50 fi m be-40 sitzt. Ein Flascheninhalt von 2,5 mg HSA entspricht 1 bis 2 • 106 Teilchen. where the particle suspension freezes almost instantaneously. After careful freeze-drying, the particles form a dry, easily movable mass that is perfectly suspendable and has an unchanged particle size of 20 to 50 μm be-40. A bottle of 2.5 mg HSA corresponds to 1 to 2 • 106 particles.

Sämtliche Arbeiten werden unter aseptischen Bedingungen vorgenommen, da eine nachträgliche Sterilisation der Partikel nicht möglich ist. All work is carried out under aseptic conditions, as subsequent sterilization of the particles is not possible.

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