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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung der antibiotischen Substanz Nr. 3008B, dadurch gekennzeichnet, dass man einen die Substanz Nr. 3008B erzeugenden Mikroorganismus, welcher der Gattung Streptomyces angehört, züchtet und aus der Kulturbrühe die Substanz Nr. 3008B gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptomyces jumonjinensis verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung durch Schüttelkultur oder durch submerse Kultur in einem flüssigen Medium durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung in einem praktisch neutralen pH Bereich und einer Temperatur von 25 bis 300 C während 80 bis 120 Stunden durchführt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Substanz, nämlich der Substanz Nr. 3008B, welches darin besteht, dass man einen die Substanz Nr. 3008B erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptomyces gehört, züchtet und aus der Kulturbrühe die Substanz Nr. 3008B gewinnt.
Es wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Substanz, nämlich Cephemimycin, mit breitem antibakteriellem Spektrum entwickelt, welches darin besteht, dass man einen die antibiotische Substanz Cephemimycin erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptomyces gehört, züchtet und aus der Kulturbrühe das Cephemimycin gewinnt (vgl. Schweizerpatent Nr. 578 620).
Aufgrund von weiteren Versuchen mit antibiotischen Substanzen, welche mittels eines Stammes von Cephemimycin erzeugenden Mikroorganismen, nämlich Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. 3008 (unter Nr. 1545 im Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, und auch unter Nr. NRRL 5741 am 8. Juni 1973 im Northern Regional Research Laboratory, Northern Central Region, Agricultural Research Service, U. S. Departement of Agriculture hinterlegt) erzeugt werden, wurde festgestellt, dass man auch eine andere antibiotische Substanz, nämlich die Substanz Nr. 3008B, in einer Kulturbrühe des Mikroorganismus erhält, wobei man diese Substanz Nr. 3008B erfolgreich isolieren und reinigen kann.
Die erfindungsgemäss erhältliche antibiotische Substanz übt eine Hemmwirkung auf grampositive und gramnegative Bakterien und insbesondere auf klinisch isolierte Stämme solcher grampositiver und gramnegativer Bakterien aus, welche gegenüber den handelsüblichen antibiotischen Substanzen, wie z. B. Penicillinen, Cephalosporinen, Chloramphenicol, Tetracyclin, Kanamycin, Makrolid-Antibiotika usw., resistent sind, wobei bekannt ist, dass die antibiotischen Substanzen zurzeit Probleme aufwerfen, weil sie resistente Stämme entwickeln.
Unter den die Substanz Nr. 3008B erzeugenden Mikroorganismen, welche man erfindungsgemäss verwenden kann, werden die Eigenschaften der Actinomyceten, Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. 3008, welcher aus einer Bodenprobe, die bei Jumonjitoge, Chichibut, Saitama Prefecture, Japan, gesammelt worden ist, im oben erwähnten Patent offenbart. Nun ist es aber bestens bekannt, dass verschiedene Eigenschaften von Actinomyceten nicht eindeutig sind und sich sowohl natürlich als auch künstlich leicht verändern lassen. Die beim vorliegenden Verfahren verwendbaren Stämme umfassen sämtliche Stämme, welche zur Gattung Streptomyces gehören und dazu befähigt sind, die Substanz Nr. 3008B zu erzeugen. Insbesondere die Art Streptomyces jumonjinensis wird mit Vorteil verwendet.
Die Züchtung gemäss vorliegender Erfindung erfolgt nach der allgemein für Actinomyceten bekannten Methode.
Schüttelkulturen und submerse Kulturen in einem flüssigen Medium werden bevorzugt.
Als Komponenten des Mediums kann man beliebige bestens bekannte Nährstoffe für Actinomyceten verwenden.
So kommen beispielsweise als assimilierbare Kohlenstoffquellen Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin, lösliche Stärke, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Specköl usw. und als assimilierbare Stickstoffquelle entfettetes Sojabohnenmehl, entfettetes Erdnussmehl, entfettetes Baumwollsamenmehl, Kleie, Fischmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Caseinhydrolysat, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat usw., in Frage. Als anorganische Salze kommen Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat usw. in Frage. Eine kleine Menge eines Metallsalzes kann gleichfalls nötigenfalls zugesetzt werden. Bei der Durchführung der Züchtung in flüssigem Medium unter Belüftung und Rühren kann man gegebenenfalls Antischaumkörper, z. B. Silikonöl, vegetabilische Öle, oberflächenaktive Mittel usw. verwenden.
Der pH-Wert des Mediums kann innerhalb des Neutralbereiches liegen, während die Züchtung gewöhnlich bei Temperaturen von 25 bis 300 C und insbesondere bei ungefähr 280 C durchgeführt wird.
Die maximale Produktion an Substanz Nr. 3008B kann dadurch bewirkt werden, dass man das Züchten während 80 bis 120 Stunden unter den oben erwähnten Züchtungsbedingungen durchführt.
Die Substanz Nr. 3008B ist in Wasser leicht löslich und liegt zur Hauptsache im Filtrat der Kulturbrühe vor. Nach beendeter Züchtung können das Mycel und die übrige feste Masse durch Filtrieren unter Verwendung von Diatomeenerde oder dergleichen, welche als Filterhilfsmittel verwendet wird, oder durch Zentrifugieren abgetrennt werden, wobei die Substanz Nr. 3008B, welche im einen Falle im Filtrat und im anderen Falle in der überstehenden Flüssigkeit vorhanden ist, durch Ausnützung ihrer physikochemisohen Eigenschaften isoliert und gereinigt werden kann.
So kann man beispielsweise die Substanz Nr. 3008B in einem Kulturfiltrat aus der Kulturbrühe durch Verwendung eines Adsorptionsmittels gewinnen. Als Adsorptionsmittel kann man beispielsweise Aktivkohle verwenden, wobei die Substanz Nr. 3008B auf der Aktivkohle adsorbiert wird und mit einem geeigneten Lösungsmittelsystem, z. B. einer Misehung von Methanol und Wasser, einer Mischung von n Butanol und Wasser, wässrigem Aceton und dergleichen, eluiert werden kann. Die Substanz Nr. 3008B ist eine saure Substanz und kann daher auch durch ein Anionenaustauschharz, eine Anionenaustauschcellulose oder ein Anionenaustauschdextrangel adsorbiert und daraus eluiert werden.
Als Anionenaustauschharze kommen beispielsweise starke basische Anionenaustauschharze, z. B. Dowex 21K der Firma Dow Chemical Co, USA, und schwache basische Anionenaustauscherharze, z. B. Duolite A-2 der Firma Diamond Alkali Co., USA, in Frage.
Als Anionenaustauschcellulose seien beispielsweise Di äthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose der Firma Brown Co., USA) und als Anionenaustauschdextrangele beispielsweise Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 (DEAE-Sephades A-25 der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) usw. erwähnt.
Ferner kann man zur Reinigung der Substanz Nr. 3008B sich der Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel, Avicel (mikrokristalline Form von Cellulose der Firma Asahi Kasei Kogyo K. K., Japan), Sephadex LH-20 der Firma
Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) bedienen.
Die Substanz Nr. 3008B kann mit einem Ester, z. B.
Äthylacetat, oder einem Alkohol, z. B. n-Propanol, extrahiert werden, wobei man sich deren Eigenschaft, sauer zu sein, zunutze macht. Ein weiterer Vorteil für die Möglichkeit der Extrahierung liegt darin, dass sich diese Substanz mit einem Lösungsmittel aus deren sauren Lösung extrahieren lässt.
Die mit einem Lösungsmittel in saurem Zustande extrahierte Substanz Nr. 3008B kann leicht in eine wässrige Schicht übergeführt werden, indem man mit destilliertem Wasser oder dergleichen erneut extrahiert.
Die Substanz Nr. 3008B kann durch Dünnschichtchromatographie in an sich bekannter Weise oder durch wiederholte Anwendung derselben oder durch eine Kombination solcher Massnahmen in Form der gereinigten Verbindung isoliert werden. Die so erhaltene Substanz Nr. 3008B ist farblos und stellt eine ölige und saure Substanz dar, welche durch Gefriertrocknung in einer geeigneten Salzform, z. B. in Form des Natriumsalzes, als blassgelbes Pulver erhalten werden kann.
Zum Reinigen der Substanz Nr. 3008B kann man auch so vorgehen, dass man die Substanz in den entsprechenden Methylester überführt. Für die Veresterung kann man ein übliches Veresterungsmittel, z. B. Diazomethan oder dergleichen, verwenden.
Der Methylester der Substanz Nr. 3008B ist eine beständigere Substanz als die Substanz Nr. 3008B selbst und besitzt überdies eine höhere Löslichkeit in einem niedrigeren polaren Lösungsmittel, so dass sie mit Kieselgel oder dergleichen leicht gereinigt werden kann. Man kann daher die Substanz Nr. 3008B durch Anwendung der Methylveresterung während der Reinigungsmethoden der Substanz Nr. 3008B leicht reinigen. Der so gereinigte Methylester der Substanz Nummer 3008B kann hierauf in an sich bekannter Weise, beispieles.
weise durch Hydrolyse mit einer verdünnten Alkalilösung oder durch eine Esterase, z. B. Serumesterase von Mäusen, verseift werden, wobei man die während der Verseifung gebildeten Verunreinigungen durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, durch Säulenchromatographie mit Cephadex LH-20 oder dergleichen beseitigt, um auf diese Weise zur reinen Substanz Nr. 3008B zu gelangen.
Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz Nummer 3008B finden sich weiter unten. Die Elementaranalyse, das Molekulargewicht und die spezifische Drehung der Substanz Nr. 3008B wurden in der Methylesterform bestimmt, weil die Substanz selbst unbeständig ist. Die Infrarot- und magnetischen Kernresonanzspektren des Methylesters der Substanz Nr. 3008B deuten, wie weiter unten ersichtlich ist, darauf hin, dass die Substanz Nr. 3008B eine Monocarboxylgruppe enthält, welche zum Methylester verestert wird. In der beiliegenden Zeichnung zeigt Fig. 1 das Infrarotspektrum der Substanz Nr. 3008B und Fig. 2 zeigt in ähnlicher Weise das magnetische Kernresonanzspektrum davon.
Die Fig. 3 zeigt das Infrarotspektrum des Methylesters der Substanz Nr. 3008B und die Fig. 4 zeigt in ähnlicher Weise das magnetische Kernresonanzspektrum dieses Esters.
(1) Elementaranalyse:
Bestimmt als Methylester, weil die Substanz Nr. 3008B selbst unbeständig ist.
Analyse für den entsprechenden Methylester:
C = 50,31 010, H = 5,4 O/o, N = 6,39 0/o.
(2) Molekulargewicht:
Bestimmt als Methylester und zwar aus den oben erwähnten Gründen.
Das Molekulargewicht des Methylesters, gemessen mit einem hochqualifizierten Massenspektrometer, beträgt 213.
Die Molekularformel des Methylesters kann daher durch die folgende Summenformel CeH1105N wiedergegeben werden.
(3) Schmelzpunkt:
Wurde nicht bestimmt, weil die Substanz bei Zimmertemperatur ölig ist. Ein konstanter Schmelzpunkt wird nicht angegeben, weil das Natriumsalz der Substanz ebenfalls unbeständig ist.
(4) Spezifische Drehung: Bestimmt als entsprechender Methylester [a] D0 = +49,4 (c = 1 /o, Methanol).
(5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum:
Eine spezifische Absorption konnte jenseits von 220 mu nicht beobachtet werden; lediglich die Endabsorption wurde beobachtet.
(6) Infrarotabsorptionsspektrum:
Gemessen mit KBr-Pressling, wird in Fig. 1 gezeigt.
(7) Magnetisches Kernspektrum:
Das magnetische Kernresonanzspektrum, gemessen mit schwerem Wasser als Lösungsmittel und mit Natrium-2,2dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat als interne Referenzsubstanz, findet sich in Fig. 2, während die Werte (ppm) nachstehend wiedergegeben werden:
5,20 (1H, Dublett, J = 3 cps), 4,75-4,80 (1H),
4,40 (2H),
4,10 (1H, AB Quartett, J = 16,6/3 cps),
3,90 (1H, AB Dublett, J = 16,5).
(8) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Löslich in Wasser, Alkohol, Dioxan, Tetrahydrofuran usw., spärlich löslich in Äthylacetat und unlöslich in Chloroform, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Äther, Hexan usw.
(9) Farbreaktion (Farbe auf der entwickelten Platte einer Kieseldünnschicht chromatographie gemäss nachstehenden Angaben):
Positiv auf Jod-, Kaliumpermanganat- und 2,4-Dinitrophenylhydrazinreaktionen und negativ in bezug auf Ninhydrin-, Schwefelsäure- (unter Erhitzen) und Silbernitratreaktionen.
(10) Neutralität, Basizität oder Azidität:
Saure Substanz.
(11) Farbe der Substanz:
Die freie Form der Substanz Nr. 3008B ist eine farblose, ölige Substanz, während deren Natriumsalz ein blassgelbes Pulver darstellt.
(12) Dünnschichtchromatographie:
Durch Dünnschichtchromatographie (hinauffliessende Methode) unter Verwendung von Kieselgel-Chromatogramm Folie 6060 der Firma Eastman Kodak Co., USA, und einem Entwicklerlösungsmittel, bestehend aus einer Mischung von Aceton, Äthylacetat und Wasser im Mischungsverhältnis von 65:25:15, Rf-Wert = 0,5. Die Feststellung erfolgt gewöhnlich durch Bioautographie mit Pseudomonas aeruginosa SANK 73 860 oder Färbung mit Jod.
(13) Beständigkeit:
Die Substanz Nr. 3008B ist wesentlich unbeständig, jedoch in Form einer wässrigen Lösung relativ beständig. In einer Mcllvaine-Pufferlösung ist eine Restaktivität von 60 bis 80 O/o selbst beim Erwärmen während 1 Stunde bei 600 C feststellbar. Der Wirkungsgrad wird mit Hilfe einer Zylinderplattenmethode unter Verwendung des oben erwähnten Pseudomonas aeruginosa SANK 73 860 als Testorganismus durchgeführt.
Ztf Vergleichszwecken werden die Infrarot- und magnetische9 Kernresonanzspektren des Methylesters der Substanz Nr; 3008B nachstehend wiedergegeben.
(1) Infrarotabsorptionsspektrum:
Infrarotspektrum gemessen mit KBr-Presslingen gemäss Figur 3.
(2) Magnetisches Kernresonanzspektrum:
Das magnetische Kernresonanzspektrum wurde mit Deuterochloroform als Lösungsmittel und Tetramethylsilan als interne Referenzverbindung gemessen. Die Werte finden sich in Fig; 4, während die < S-Werte (ppm) sich nachstehend wiederfinden: 5,70 (1H, Quartett, J = 3/1 cps),
5,05 (1H),
4,93 (1H),
4,28 (1H),
4,18 (1H), 3,78 (311, -CO2CH3),
3,51 (1H, AB Quartett, J = 16,5/3 cps),
3,06 (1H, AB Quartett, J = 16,5/1 cps).
(3) 13C magnetisches Kernresonanzspektrum:
Werte des 13C NMR-Spektrums, gemessen mit Deutero Chloroform, finden sich nachstehend: - 174,96S 60,45d
167,91S 56,84t
152,05S 53,03q
100,53d 46,28t
Die biologischen Eigenschaften der Substanz Nr. 3008B finden sich nachstehend: (1) Antimikrobielles Spektrum:
Minimale Hemmkonzentraüonen der Substanz Nr. 3008B in bezug auf verschiedene Mikroorganismen finden sich in der nachstehenden Tabelle 1.
Tabelle 1 Testorganismus Medium* MIC (g/ml) Straphylococcus aureus 209P JC-1 G 6,25 S. aureus 1557 (PC, TC, resistent) G 12,5 S. aureus 42 (multiresistent) G 12,5 Bacillus subtilis PCI 219 G 12,5 SarcinaluteaPCI 1001 G 50 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 G > 100 Escherichia coli NIHJ JC-2 G 25 E. coli B G 25 E. coli 640 (PC, TC, CM, resistent) G 25 Proteus vulgaris OX 19 G 25 P. rettgeri 1603 G 100 Pseudomonas aeruginosa SANK 73860 G 3.12
Tabelle 1 (Fortsetzung) Testorganismus Medium:
MIC g/ml) Pseudomonas aeruginosa SC 8753 G > 100 (multiresistent) Klebsiella pneumoniae PCI 602 G 6,25 Klebsiella pneumoniae 846 G 25 (PC, Cephaloridin, resistent) Candida alubicans YU 1200 S )100 Trichophyton mentagrophytes S > 100
SANK 11868 Penicillium chrysogenum Q 176 P > 100 Aspergillus oryzae IAM 2630 P )100 Piricularia oryzae IAM 5087 P )100 * Medium G: Nähragar mit 1 0/0 Glycerin
S: Sabouraud-Dextrose-Agar
P: Kartoffel-Dextrose-Agar
Züchtung:
Die Mindesthemmkonzentration wurde nach den Züchtungen während 24 Stunden bei 370 C mit!Bakterien und während 48 Stunden bei 280 C mit Hefen und Pilzen bestimmt. Als Resultat der Mindesthemmkonzentration gegenüber Bakterien bei Herzinfusionagar mit 400/obigem Pferdeserum konnte keine Wirkung nach der Zugabe des Pferdeserums festgestellt werden.
(2) Toxizität:
Es konnten keine abnormalen Erscheinungen nach Ablauf von 14 Tagen nach Verabreichung von 200 mg bzw.
600 mg/kg Substanz Nr. 3008B durch intravenöse Injektion bei Mäusen festgestellt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren sei durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Je nach den Eigenschaften der Substanz Nr. 3008B kann man das erfindungsgemässe Verfahren gestalten. Die Erfindung sei ferner nicht auf die nachstehenden Beispiele eingeschränkt, sondern umfasst auch sämtliche Methoden der Reinigung, der Extraktion und der Reinigung der Substanz Nr. 3008B mit bekannten Mitteln.
Beispiel 1
Ein Medium, welches vor der Sterilisierung einen pH Wert von 7,2 aufweist und 1,5 o/o (Gew./Vol.) Glycerin, 1,5 /0 (Gew./Vol.) lösliche Stärke, 2,0 /0 (Gew./Vol.) Fischmehl, 0,2 0/o (Gew./Vol.) Calciumcarbonat und 0,01 o/o (Gew./ Vol.) Antischaummittel (Nissan Disfoam CB-442, der Firma Nippon Oils & Fats Co., Ltd., Japan) enthält, wird jeweils in Form von 100 ml Portionen in 500 ml Sakaguchi-Kolben gegossen und der Kolbeninhalt während 45 Minuten bei 1200 Celsius sterilisiert. Dann werden die Kolben mit einer Öse voll Streptomyces jumonjinensis Nr. 3008 inokuliert und auf einer Schrägkultur zum Wachsen gebracht, worauf man die Kultur während 72 Stunden bei 28 C schüttelt. Auf diese Weise erhält man eine Samen- bzw.
Impfkultur. 15 Liter des obigen Mediums werden in einen Fermentierbehälter von 30 Liter Volumen eingebracht, worauf man nach dem Sterilisieren in üblicher Weise 200 ml der oben erwähnten Impfkultur hinzugibt. Das Züchten erfolgt während ungefähr 90 Stunden bei 28- C, einer Belüftung von 15 Liter/ Minute, einem Rühren mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute und einem inneren Druck von 1,0 bis 1,1 kg/cm2, wodurch man eine maximale Erzeugung der Substanz Nr. 3008B erreicht. Ein Versuch mit Hilfe der Zylinderplattenmethode unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa SANK 73 860 als Testorganismus zeigt, dass die Erzeugung der Substanz Nr. 3008B ungefähr 40,ug/ml beträgt.
Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe mit Hilfe von Celite filtriert, wobei man 12 Liter des Filtrats erhält.
6 Liter dieses Kulturfiltrates werden auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und hierauf auf einer Säule von 120 g Aktivkohle adsorbiert.
Nach erfolgter Adsorption wird die Säule mit Wasser eluiert, um insgesamt 160 mg der Substanz Nr. 3008B in 7,2 Liter des Eluates zu gewinnen. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 300 ml eingeengt. Das Konzentrat wird dann durch Zugabe von ver dünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von
7,5 und anschliessend unmittelbar durch Zugabe von Tri fluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, worauf man 10mal mit jeweils 300 ml Äthylacetat (insgesamt 3 Liter) extrahiert.
Die Athylacetatschicht wird über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 30 ml eingeengt und dann über Sephadex
LH-20 der Säulenchromatographie unterworfen und zwar auf einer Säule von 600 ml Sephadex LH-20, welches mit mittels Wasser gesättigtem Äthylacetat aufgequollen worden war, wobei mit dem gleichen Lösungsmittelsystem entwickelt wird. Die Trifluoressigsäure und der grössere Anteil an Ver unreinigungen werden in 23 Liter der ursprünglichen Eluate eluiert und die Substanz Nr. 3008B in 3,75 Liter der nach folgenden Eluate eluiert. Die aktive Fraktion wird getrocknet und eingeengt, wobei man 60 mg der Substanz Nr. 3008B (500 ugu/mg) als ölige Substanz erhält.
Diese ölige Substanz wird erneut über Sephadex LH-20 unter den gleichen Bedin gungen, wie dies weiter oben beschrieben worden ist, zur weiteren Reinigung der Säulenchromatographie unterwor fen. Jede Fraktion wird durch Kieselgeldünnschichtchroma tographie (Chromatogrammfolie Nr. 6060) unter Verwen dung einer Mischung von Aceton, Äthylacetat und Wasser im
Mischungsverhältnis 65:25:15 als Entwicklerlösungsmittel ge testet. Hierauf werden jene Fraktionen gesammelt, welche eine einzige Stelle bei Rf 0,5 mit Jodfärbung aufweisen. Die gesammelten Fraktionen werden getrocknet und eingeengt, wobei man 24 mg der Substanz Nr. 3008B (1000 z4gu/mg) erhält.
Beispiel 2
4 Liter des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und 4mal mit jeweils 2 Liter Äthylacetat (insgesamt 8 Liter) extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird erneut 2mal mit jeweils 0,8 Liter destilliertem Wasser (insgesamt 1,6 Liter) extrahiert, wodurch die Substanz Nr. 3008B in die wässrige Schicht übergeht. Die wässrige Schicht wird dann auf einen pH-Wert von 6,8 ein gestellt und über DEAE-Sephadex A-25 der Säulenchroma tographie unterworfen.
Dies will besagen, dass die wässrige
Schicht auf eine Säule von 170 ml von DEAE-Sephadex gegossen wird, welche mit einer 0,01-molaren Ammonium formiatpufferlösung zuvor auf einen pH-Wert von 6,8 ein gestellt worden ist, wobei die Substanz Nr. 3008B mit der gleichen Pufferlösung eluiert wird. 200 ml der so erhaltenen wirksamen Fraktionen, welche 54 ,ugu der Substanz Num mer 3008B enthalten, werden mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 600 ml verdünnt, worauf man erneut über
DEAE-Sephadex unter den oben erwähnten Bedingungen der
Säulenchromatographie unterwirft, um auf diese Weise 200 ml der wirksamen Fraktion, welche 50 ugu der Substanz
Nr. 3008B enthält, zu erhalten.
Das Eluat wird dann auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und auf einer Säule von 3 g Aktivkohle absorbiert.
Nach ausreichendem Waschen mit Wasser wird die Säule mit einer 20vol.-o/oigen wässrigen Acetonlösung eluiert. 300 ml der wirksamen Eluate werden gesammelt, das Ganze durch Zugabe einer wässrigen 0,1n-Ammoniaklösung auf einen pH Wert von 6,0 eingestellt und hierauf gefriergetrocknet, wobei man 75 mg des Ammoniumsalzes der Substanz Nr. 3008B in Form eines blassgelben Pulvers (500 gu/mg) erhält.
Beispiel 3
Eine Athylacetatlösung, welche 3,2 g der Substanz Nummer 3008B erhält (erhalten durch Extraktion und Reinigung in ähnlicher Weise bis zur ersten Säulenchromatographie über Sephadex LH-20 gemäss Beispiel 1) wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Dann versetzt man solange mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan, bis die Blasenbildung aufgehört hat, um auf diese Weise den Methylester der Substanz Nr. 3008B zu erhalten. Hierauf wird während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck eingeengt.
Die entstandene ölige Substanz wird in Benzol gelöst, über 60 g Kieselgel absorbiert, gründlich mit Benzol gewaschen und mit einer Mischung von Benzol und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 9:1) entwickelt, um den Methylester der Substanz Nr. 3008B zu eluieren. Die Fraktionen des Methylesters der Substanz Nr. 3008B, welche eine einzelne Stelle bei Rf von 0,25 bei der Kieselgeldünnschichtchromatographie (Kieselgel F 254 der Firma Merck & Co., Inc., USA) unter Verwendung einer Mischung von Benzol und Athylacetat (Mischungsverhältnis 3:
:1) als Entwicklerlösungsmittel und Jod als Nach- weismittel enthalten, werden gesammelt und hierauf so eingeengt, dass man 2,3 g des Methylesters der Substanz Nummer 3008B erhält. 216 g des so erhaltenen Methylesters der Substanz Nr. 3008B werden in 50 ml destilliertem Wasser, welches 10 Vol.- /o Methanol enthält, gelöst, worauf man dieser Lösung eine äquimolare Menge einer 0,05n-Natrium- hydroxydlösung hinzugibt und das Gemisch während 15 Minuten bei Zimmertemperatur rührt. Dann wird das Gemisch unmittelbar durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt.
Das Gemisch wird 10mal mit jeweils 50 ml Portionen von Äthylacetat (insgesamt 500 ml) extrahiert, getrocknet, eingeengt und über einer Säule von 100 ml Sephadex LH-20, welche mit mit Wasser gesättigtem Äthylacetat zum Quellen gebracht worden ist, adsorbiert, worauf man mit mit Wasser gesättigtem Athylacetat entwickelt. 200 ml der so erhaltenen aktiven Fraktion werden getrocknet und eingeengt, wobei man 81 mg der Substanz (1000 gu/mg) als ölige Substanz erhält.
Beispiel 4
100 mg des Methylesters der Substanz Nr. 3008B, erhalten gemäss Angaben im obigen Beispiel 3, werden in einer molaren Phosphatpufferlösung, enthaltend 10 ovo Methanol, bei einem pH-Wert von 6,8 gelöst, worauf man nach Einengen auf 5 ovo Serum von Mäusen hinzugibt. Die Reaktion wird während 30 Minuten bei 370 C durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, 10mal mit jeweils 500 ml Äthylacetat (insgesamt 500 ml) extrahiert und hierauf über Sephadex LH-20 in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man 60 mg der Substanz Nr. 3008B (1000 Clgu/mg) erhält.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of antibiotic substance No. 3008B, characterized in that a microorganism producing substance No. 3008B, which belongs to the genus Streptomyces, is cultivated and substance No. 3008B is obtained from the culture broth.
2. The method according to claim 1, characterized in that the microorganism used is Streptomyces jumonjinensis
3. The method according to claim 1, characterized in that one carries out the cultivation by shaking culture or by submerged culture in a liquid medium.
4. The method according to claim 1, characterized in that one carries out the cultivation in a practically neutral pH range and a temperature of 25 to 300 C for 80 to 120 hours.
The present invention relates to a method for producing an antibiotic substance, namely substance no. 3008B, which consists in growing a microorganism producing substance no. 3008B, which belongs to the genus Streptomyces, and substance no 3008B wins.
A method for producing an antibiotic substance, namely cephemimycin, with a broad antibacterial spectrum has already been developed, which consists in cultivating a microorganism producing the antibiotic substance cephemimycin, which belongs to the genus Streptomyces, and obtaining the cephemimycin from the culture broth (cf. Swiss Patent No. 578 620).
Based on further experiments with antibiotic substances which are produced using a strain of cephemimycin-producing microorganisms, namely Streptomyces jumonjinensis strain No. 3008 (under No. 1545 in the Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry , Japan, and also deposited under No. NRRL 5741 on June 8, 1973 in the Northern Regional Research Laboratory, Northern Central Region, Agricultural Research Service, US Department of Agriculture), it was found that another antibiotic substance, namely the substance No. 3008B, obtained in a culture broth of the microorganism, which substance No. 3008B can be successfully isolated and purified.
The antibiotic substance obtainable according to the invention exerts an inhibitory effect on gram-positive and gram-negative bacteria and in particular on clinically isolated strains of such gram-positive and gram-negative bacteria which, compared with the commercially available antibiotic substances, such as, for. As penicillins, cephalosporins, chloramphenicol, tetracycline, kanamycin, macrolide antibiotics, etc., are resistant, and it is known that the antibiotic substances currently pose problems because they develop resistant strains.
Among the microorganisms producing substance no. 3008B which can be used according to the invention, the properties of the actinomycetes, Streptomyces jumonjinensis strain no. 3008, which are obtained from a soil sample which has been collected from Jumonjitoge, Chichibut, Saitama Prefecture, Japan, are described in patent mentioned above. However, it is now well known that various properties of Actinomycetes are not unique and can be easily changed both naturally and artificially. The strains which can be used in the present process include all strains which belong to the genus Streptomyces and are capable of producing substance No. 3008B. Streptomyces jumonjinensis in particular is used with advantage.
The cultivation according to the present invention takes place according to the method generally known for actinomycetes.
Shake cultures and submerged cultures in a liquid medium are preferred.
Any well-known actinomycete nutrients can be used as components of the medium.
For example, as assimilable carbon sources come glucose, glycerin, maltose, dextrin, soluble starch, soybean oil, cottonseed oil, bacon oil, etc. and as an assimilable nitrogen source, defatted soybean meal, defatted peanut meal, defatted cottonseed meal, bran, fish meal, maize source liquid, peptone, yeast, casein , Yeast extract, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate etc., in question. Sodium chloride, phosphates, calcium carbonate, etc. can be used as inorganic salts. A small amount of a metal salt can also be added if necessary. When carrying out the cultivation in a liquid medium with aeration and stirring, anti-foam bodies, e.g. B. use silicone oil, vegetable oils, surfactants, etc.
The pH of the medium can be within the neutral range, while the cultivation is usually carried out at temperatures of 25 to 300 C and in particular at about 280 C.
The maximum production of substance No. 3008B can be achieved by carrying out the cultivation for 80 to 120 hours under the cultivation conditions mentioned above.
Substance no. 3008B is easily soluble in water and is mainly in the filtrate of the culture broth. After cultivation has been completed, the mycelium and the remaining solid mass can be separated by filtration using diatomaceous earth or the like, which is used as a filter aid, or by centrifugation, substance No. 3008B, which in one case is in the filtrate and in the other case in of the supernatant liquid can be isolated and purified by taking advantage of its physicochemical properties.
For example, substance No. 3008B can be obtained in a culture filtrate from the culture broth by using an adsorbent. Activated carbon can be used as the adsorbent, for example, substance No. 3008B being adsorbed on the activated carbon and mixed with a suitable solvent system, e.g. B. a mixture of methanol and water, a mixture of n butanol and water, aqueous acetone and the like, can be eluted. Substance No. 3008B is an acidic substance and can therefore also be adsorbed and eluted from it by an anion exchange resin, an anion exchange cellulose or an anion exchange extract.
Anion exchange resins include, for example, strong basic anion exchange resins, e.g. B. Dowex 21K from Dow Chemical Co, USA, and weak basic anion exchange resins, e.g. B. Duolite A-2 from Diamond Alkali Co., USA.
Examples of anion exchange cellulose are diethylaminoethyl cellulose (DEAE cellulose from Brown Co., USA) and anion exchange dextran gels, for example diethylaminoethyl Sephadex A-25 (DEAE Sephades A-25 from Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden), etc.
Chromatography can also be used to purify substance no. 3008B using silica gel, Avicel (microcrystalline form of cellulose from Asahi Kasei Kogyo K.K., Japan), Sephadex LH-20 from the company
Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden).
Substance No. 3008B can be mixed with an ester, e.g. B.
Ethyl acetate, or an alcohol, e.g. B. n-propanol, extracted, taking advantage of their property to be acidic. Another advantage of the possibility of extraction is that this substance can be extracted from its acidic solution with a solvent.
Substance No. 3008B extracted with a solvent in an acidic state can be easily converted into an aqueous layer by re-extracting with distilled water or the like.
Substance No. 3008B can be isolated by thin layer chromatography in a manner known per se or by repeated use of the same or by a combination of such measures in the form of the purified compound. The substance No. 3008B thus obtained is colorless and is an oily and acidic substance which can be freeze-dried in a suitable salt form, e.g. B. in the form of the sodium salt, can be obtained as a pale yellow powder.
To clean substance no. 3008B, one can also proceed by converting the substance into the corresponding methyl ester. For the esterification one can use a conventional esterification agent, e.g. B. diazomethane or the like, use.
The methyl ester of substance No. 3008B is a more stable substance than substance No. 3008B itself and, moreover, has a higher solubility in a lower polar solvent, so that it can be easily cleaned with silica gel or the like. Substance No. 3008B can therefore be easily purified by using methyl esterification during the cleaning methods of substance No. 3008B. The methyl ester of substance number 3008B thus purified can thereupon, for example in a manner known per se.
as by hydrolysis with a dilute alkali solution or by an esterase, e.g. B. mouse serum esterase, saponifying the contaminants formed during the saponification by extraction with a solvent, by column chromatography with Cephadex LH-20 or the like, to thereby obtain pure substance No. 3008B.
The physicochemical properties of substance number 3008B can be found below. Elemental analysis, molecular weight and specific rotation of substance No. 3008B were determined in the methyl ester form because the substance itself is inconsistent. The infrared and magnetic nuclear magnetic resonance spectra of the methyl ester of substance no. 3008B, as can be seen below, indicate that substance no. 3008B contains a monocarboxyl group, which is esterified to the methyl ester. In the accompanying drawing, Fig. 1 shows the infrared spectrum of the substance No. 3008B, and Fig. 2 similarly shows the nuclear magnetic resonance spectrum thereof.
Fig. 3 shows the infrared spectrum of the methyl ester of substance No. 3008B and Fig. 4 similarly shows the nuclear magnetic resonance spectrum of this ester.
(1) Elemental analysis:
Determined as a methyl ester because substance no. 3008B itself is not stable.
Analysis for the corresponding methyl ester:
C = 50.31 010, H = 5.4 O / o, N = 6.39 0 / o.
(2) molecular weight:
Determined as a methyl ester for the reasons mentioned above.
The molecular weight of the methyl ester, measured with a highly qualified mass spectrometer, is 213.
The molecular formula of the methyl ester can therefore be represented by the following empirical formula CeH1105N.
(3) Melting point:
Was not determined because the substance is oily at room temperature. A constant melting point is not given because the sodium salt of the substance is also unstable.
(4) Specific rotation: determined as the corresponding methyl ester [a] D0 = +49.4 (c = 1 / o, methanol).
(5) Ultraviolet absorption spectrum:
No specific absorption could be observed beyond 220 mu; only the final absorption was observed.
(6) Infrared absorption spectrum:
Measured with KBr pellet, is shown in Fig. 1.
(7) Magnetic core spectrum:
The nuclear magnetic resonance spectrum, measured with heavy water as solvent and with sodium 2,2dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate as internal reference substance, can be found in FIG. 2, while the values (ppm) are shown below:
5.20 (1H, doublet, J = 3 cps), 4.75-4.80 (1H),
4.40 (2H),
4.10 (1H, AB quartet, J = 16.6 / 3 cps),
3.90 (1H, AB doublet, J = 16.5).
(8) Solubility in solvents:
Soluble in water, alcohol, dioxane, tetrahydrofuran etc., sparingly soluble in ethyl acetate and insoluble in chloroform, benzene, carbon tetrachloride, ether, hexane etc.
(9) Color reaction (color on the developed plate of a thin layer of silica chromatography according to the information below):
Positive for iodine, potassium permanganate and 2,4-dinitrophenylhydrazine reactions and negative for ninhydrin, sulfuric acid (with heating) and silver nitrate reactions.
(10) Neutrality, basicity or acidity:
Acidic substance.
(11) Color of the substance:
The free form of Substance No. 3008B is a colorless, oily substance, while its sodium salt is a pale yellow powder.
(12) Thin layer chromatography:
By thin layer chromatography (flowing up method) using silica gel chromatogram film 6060 from Eastman Kodak Co., USA, and a developer solvent consisting of a mixture of acetone, ethyl acetate and water in a mixing ratio of 65:25:15, Rf value = 0.5. The determination is usually made by bioautography with Pseudomonas aeruginosa SANK 73 860 or staining with iodine.
(13) Persistence:
Substance No. 3008B is essentially unstable, but relatively stable in the form of an aqueous solution. A residual activity of 60 to 80% is found in an Mcllvaine buffer solution even when heated at 600 ° C. for 1 hour. The efficiency is carried out using a cylindrical plate method using the above-mentioned Pseudomonas aeruginosa SANK 73 860 as a test organism.
For comparison purposes, the infrared and magnetic9 nuclear magnetic resonance spectra of the methyl ester of substance no; 3008B reproduced below.
(1) Infrared absorption spectrum:
Infrared spectrum measured with KBr compacts according to FIG. 3.
(2) Nuclear magnetic resonance spectrum:
The nuclear magnetic resonance spectrum was measured with deuterochloroform as solvent and tetramethylsilane as internal reference compound. The values can be found in Fig; 4, while the <S values (ppm) are found below: 5.70 (1H, quartet, J = 3/1 cps),
5.05 (1H),
4.93 (1H),
4.28 (1H),
4.18 (1H), 3.78 (311, -CO2CH3),
3.51 (1H, AB quartet, J = 16.5 / 3 cps),
3.06 (1H, AB quartet, J = 16.5 / 1 cps).
(3) 13C nuclear magnetic resonance spectrum:
Values of the 13C NMR spectrum measured with Deutero chloroform can be found below: - 174.96S 60.45d
167.91S 56.84t
152.05S 53.03q
100.53d 46.28t
The biological properties of substance No. 3008B can be found below: (1) Antimicrobial spectrum:
Minimal inhibitory concentrations of substance No. 3008B with respect to various microorganisms can be found in Table 1 below.
Table 1 Test organism Medium * MIC (g / ml) Straphylococcus aureus 209P JC-1 G 6.25 S. aureus 1557 (PC, TC, resistant) G 12.5 S. aureus 42 (multi-resistant) G 12.5 Bacillus subtilis PCI 219 G 12.5 SarcinaluteaPCI 1001 G 50 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 G> 100 Escherichia coli NIHJ JC-2 G 25 E. coli BG 25 E. coli 640 (PC, TC, CM, resistant) G 25 Proteus vulgaris OX 19 G 25 P. rettgeri 1603 G 100 Pseudomonas aeruginosa SANK 73860 G 3.12
Table 1 (continued) Medium test organism:
MIC g / ml) Pseudomonas aeruginosa SC 8753 G> 100 (multi-resistant) Klebsiella pneumoniae PCI 602 G 6.25 Klebsiella pneumoniae 846 G 25 (PC, cephaloridine, resistant) Candida alubicans YU 1200 S) 100 Trichophyton mentagrophytes S> 100
SANK 11868 Penicillium chrysogenum Q 176 P> 100 Aspergillus oryzae IAM 2630 P) 100 Piricularia oryzae IAM 5087 P) 100 * Medium G: nutrient agar with 1 0/0 glycerin
S: Sabouraud dextrose agar
P: Potato dextrose agar
Breeding:
The minimum inhibitory concentration was determined after cultivation for 24 hours at 370 C with bacteria and for 48 hours at 280 C with yeast and fungi. As a result of the minimum inhibitory concentration against bacteria in heart infusion agar with 400 / horse serum above, no effect could be determined after the addition of the horse serum.
(2) Toxicity:
There were no abnormal symptoms after 14 days after 200 mg or
600 mg / kg substance No. 3008B can be determined by intravenous injection in mice.
The process according to the invention is illustrated by the following examples. Depending on the properties of substance no. 3008B, the process according to the invention can be designed. Furthermore, the invention is not restricted to the examples below, but also encompasses all methods of purifying, extracting and purifying substance No. 3008B by known means.
example 1
A medium which has a pH of 7.2 prior to sterilization and 1.5% w / v glycerin, 1.5% w / v soluble starch, 2.0 / 0 (w / v) fish meal, 0.2 0 / o (w / v) calcium carbonate and 0.01 o / o (w / v) anti-foaming agent (Nissan Disfoam CB-442, from Nippon Oils & Fats Co., Ltd., Japan), is poured in the form of 100 ml portions into 500 ml Sakaguchi flasks and the flask contents are sterilized at 1200 Celsius for 45 minutes. The flasks are then inoculated with an eyelet full of Streptomyces jumonjinensis No. 3008 and grown on a slant culture, after which the culture is shaken at 28 ° C. for 72 hours. In this way you get a seed or
Vaccination culture. 15 liters of the above medium are placed in a fermentation container with a volume of 30 liters, after which, after sterilization, 200 ml of the above-mentioned seed culture are added in the usual way. The cultivation is carried out for about 90 hours at 28 ° C., aeration of 15 liters / minute, stirring at a speed of 200 revolutions per minute and an internal pressure of 1.0 to 1.1 kg / cm 2, whereby a maximum Generation of substance no. 3008B achieved. An experiment using the cylindrical plate method using Pseudomonas aeruginosa SANK 73 860 as a test organism shows that the production of substance No. 3008B is approximately 40 .ug / ml.
After the cultivation has ended, the culture broth is filtered using Celite, giving 12 liters of the filtrate.
6 liters of this culture filtrate are adjusted to a pH of 4.0 and then adsorbed on a column of 120 g of activated carbon.
After adsorption has taken place, the column is eluted with water in order to obtain a total of 160 mg of substance No. 3008B in 7.2 liters of the eluate. The active fractions are collected, adjusted to pH 6.0 and concentrated to a volume of 300 ml under reduced pressure. The concentrate is then adjusted to pH by adding dilute sodium hydroxide solution
7.5 and then immediately adjusted to a pH of 3.0 by adding tri-fluoroacetic acid, whereupon it is extracted 10 times with 300 ml of ethyl acetate (3 liters in total).
The ethyl acetate layer becomes anhydrous
Dried sodium sulfate, concentrated under reduced pressure to a volume of 30 ml and then over Sephadex
LH-20 subjected to column chromatography on a column of 600 ml Sephadex LH-20 which had been swollen with water saturated ethyl acetate, developing with the same solvent system. The trifluoroacetic acid and the greater proportion of impurities are eluted in 23 liters of the original eluates and the substance no. 3008B in 3.75 liters of the following eluates. The active fraction is dried and concentrated to give 60 mg of substance No. 3008B (500 ugu / mg) as an oily substance.
This oily substance is again subjected to Sephadex LH-20 under the same conditions as described above for further purification of the column chromatography. Each fraction is chromatographed by silica gel thin layer chromatography (chromatographic film No. 6060) using a mixture of acetone, ethyl acetate and water in the
Mixing ratio 65:25:15 tested as developer solvent. Then those fractions are collected which have a single site at Rf 0.5 with iodine staining. The collected fractions are dried and concentrated to give 24 mg of substance no. 3008B (1000 z4gu / mg).
Example 2
4 liters of the culture filtrate obtained according to Example 1 are adjusted to a pH of 3.0 and extracted 4 times with 2 liters of ethyl acetate (8 liters in total). The ethyl acetate layer is extracted again twice with 0.8 liters of distilled water (1.6 liters in total), whereby the substance no. 3008B passes into the aqueous layer. The aqueous layer is then adjusted to a pH of 6.8 and subjected to column chromatography over DEAE-Sephadex A-25.
This is to say that the watery
Layer is poured onto a column of 170 ml of DEAE-Sephadex, which has previously been adjusted to a pH of 6.8 with a 0.01 molar ammonium formate buffer solution, substance No. 3008B eluting with the same buffer solution becomes. 200 ml of the effective fractions thus obtained, which contain 54, ugu of the substance number mer 3008B, are diluted with distilled water to a volume of 600 ml, whereupon the mixture is again diluted
DEAE-Sephadex under the conditions of
Column chromatography subjects to 200 ml of the active fraction, which is 50 ugu of the substance
No. 3008B contains.
The eluate is then adjusted to a pH of 4.0 and absorbed on a column of 3 g of activated carbon.
After sufficient washing with water, the column is eluted with a 20 vol.% Aqueous acetone solution. 300 ml of the active eluates are collected, the whole is adjusted to a pH of 6.0 by adding an aqueous 0.1N ammonia solution and then freeze-dried, whereby 75 mg of the ammonium salt of substance no.3008B in the form of a pale yellow powder (500 gu / mg).
Example 3
An ethyl acetate solution which contains 3.2 g of substance number 3008B (obtained by extraction and purification in a similar manner until the first column chromatography on Sephadex LH-20 according to Example 1) is dried over anhydrous sodium sulfate and under reduced pressure to a volume of 50 ml constricted. An ethereal solution of diazomethane is then added until the bubbles have stopped, in order to obtain the methyl ester of substance no. 3008B. The mixture is then stirred at room temperature for 30 minutes and then concentrated under reduced pressure.
The resulting oily substance is dissolved in benzene, absorbed over 60 g of silica gel, washed thoroughly with benzene and developed with a mixture of benzene and ethyl acetate (mixing ratio 9: 1) to elute the methyl ester of substance No. 3008B. The fractions of the methyl ester of substance no. 3008B, which have a single site at Rf of 0.25 in silica gel thin layer chromatography (silica gel F 254 from Merck & Co., Inc., USA) using a mixture of benzene and ethyl acetate (mixing ratio 3 :
: 1) as developer solvent and iodine as detection agent are collected and then concentrated so that 2.3 g of the methyl ester of substance number 3008B are obtained. 216 g of the methyl ester of substance no. 3008B thus obtained are dissolved in 50 ml of distilled water which contains 10% by volume / o methanol, whereupon an equimolar amount of a 0.05N sodium hydroxide solution is added to this solution and the mixture during Stir for 15 minutes at room temperature. The mixture is then immediately adjusted to a pH of 3.0 by adding trifluoroacetic acid.
The mixture is extracted 10 times with 50 ml portions of ethyl acetate (500 ml total), dried, concentrated and adsorbed over a column of 100 ml Sephadex LH-20 which has been swelled with water saturated ethyl acetate, followed by developed ethyl acetate saturated with water. 200 ml of the active fraction thus obtained are dried and concentrated to give 81 mg of the substance (1000 gu / mg) as an oily substance.
Example 4
100 mg of the methyl ester of substance no. 3008B, obtained as described in Example 3 above, are dissolved in a molar phosphate buffer solution containing 10 ovo of methanol at a pH of 6.8, after which, after concentration to 5 ovo, serum from mice adds. The reaction is carried out at 370 C for 30 minutes. After the reaction has ended, the reaction mixture is adjusted to a pH of 3.0 by adding trifluoroacetic acid, extracted 10 times with 500 ml of ethyl acetate (total of 500 ml) and then via Sephadex LH-20 in the same manner as in Example 3 of column chromatography subjected to 60 mg of substance No. 3008B (1000 Clgu / mg).