CH618215A5

CH618215A5 - Process for the preparation of aminocyclitol antibiotics

Info

Publication number: CH618215A5
Application number: CH1126778A
Authority: CH
Inventors: Sol Jacob Daum; Robert La Grone Clarke
Original assignee: Sterling Drug Inc
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1978-11-01
Publication date: 1980-07-15
Also published as: AU503105B2; PT64816B; NO146811C; CH618214A5; NO147308B; IL49053A; DK143111C; SE7601810L; NZ180036A; DE2606517A1; NO820574L; NO760472L; EG12994A; FR2301265B1; NO803185L; DK143111B; CH617964A5; AR221027A1; IN147046B; IN149240B

Description

Cette invention concerne un procédé de préparation d'antibiotiques du type aminocyclitol répondant à la formule I

R-

r

CH-NH-R

NH-R,

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4

dans laquelle R,, R3 et R8 représentent chacun un atome d'hydrogène; ou bien l'un de Rj, R3 et R8 représente un groupement co-amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur de formule

H2NCH2(CH2)nCHOHCO

dans laquelle n est égal à 0 ou à 1, les autres groupements Rl5 R3 et Rg étant des atomes d'hydrogène; R2 et R5 représentent un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy; sauf que lorsque R2 est un atome d'hydrogène, R5 n'est pas un groupement hydroxy eis par rapport aux groupements amino en position 1 et 3 et R6 et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle.

On prépare des composés de formule I où Rb R3 et Rg sont des atomes d'hydrogène, par la méthode décrite dans le brevet des E.U.A. N° 3 669 838 de Shier et al. Cette méthode consiste à cultiver un milieu nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un dérivé d'aminocycli-tol ajouté de formule:

liaison simple. Selon le mode opératoire décrit par Shier et al., la nature du mutant est telle qu'il est incapable de synthétiser la sous-unité aminocyclitol à partir d'un milieu nutritif pour ainsi produire l'antibiotique, mais qu'il peut incorporer cette dernière s dans un antibiotique quand on ajoute de l'aminocyclitol au milieu nutritif.

On a trouvé qu'un autre mutant que M. purpurea ATCC 31 119, c'est-à-dire M. purpurea ATCC 31 164, est également capable d'incorporer dans les antibiotiques de formule I ci-H dessus, un aminocyclitol de formule:

Ha

NH-R.

II

HH-Rn dans laquelle R1; R2, R3 et R5 ont les significations données ci-dessus, et où R! et R3 peuvent en plus représenter une liaison simple réunissant les deux atomes d'azote des groupements amine, en présence d'un micro-organisme mutant approprié, ledit micro-organisme mutant étant incapable de synthétiser ledit aminicyclitol lui-même mais pouvant incorporer ledit aminocyclitol dans le composé de formule I, particulièrement un mutant de Micromonospora purpurea désigné par Micromonospora purpurea ATCC 31 119 et à séparer le produit du milieu de culture. On produit les composés de formule I dans laquelle R] et R3 sont tous deux un atome d'hydrogène quand on utilise l'aminocyclitol de formule II où Ri et R3 représentent une

25 dans laquelle R2' et R5' sont chacun un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy et R/ est un groupement amine ou hydroxy.

Le procédé, qui permet de préparer les composés de formule I où R6 et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène m ou un groupement méthyle; R2 et R5 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy; Rj, R3 et R8 représentent un atome d'hydrogène, est mis en œuvre en présence M. purpurea ATCC 31 164enutilisantlemode opératoire ci-dessus, et consiste à cultiver un milieu nutritif contenant 35 des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un aminocyclitol de formule IIa en présence de M. purpurea ATCC 31 164.

Les composés de formule I, où l'un des groupement Rj, R3 et R8 représente un groupement co-amino-a-hydroxy-alcanoyle 40 inférieur, peuvent être préparés par le procédé décrit par Konishi et al. dans le brevet des E.U.A. N 3 780 018, qui consiste à faire réagir le composé de formule I où chacun des groupements Rj, R3 et R8 est un atome d'hydrogène, avec un ester de N-hydroxysuccinimide de formule:

0

^11

M CH20-C-NHCH2(CH2)nCH0HC0-0-N

IV

où n a la signification donnée précédemment, puis on soumet le mélange résultant des composés de formule I où l'un des groupements Rl R3 et Rg est le groupement co-(N-benzyloxycarbo-nyl)amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur:

/ \

Ì

_.CH20-C-NHCH2 (CH2)nCHOHCO-

5

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.10

les deux autres étant des atomes d'hydrogène, à l'hydrogènolyse du groupement benzyloxycarbonyle par l'hydrogène sur un catalyseur.

Les esters de N-hydroxysuccinimide de formule IV forment une catégorie de composés qui est connue de manière générale).

Comme indiqué précédemment, quand on utilise comme substance de départ dans la réaction d'acylation un composé de formule I où chacun des groupements Rb R3 et R8 est un atome d'hydrogène, on obtient un mélange des trois mono-amides isomères possibles dans lesquels l'un des atomes d'hydrogène des groupements amine, R[, R3 ou R8, est remplacé par le groupement co-(N-benzyloxycarbonyl)amino-a-hydroxy-alca-noyle inférieur. Quand on désire une caractérisation et une étude séparées de ces produits, ils doivent évidemment être séparés l'un de l'autre.

On peut effectuer la réaction d'acylation en faisant réagir des quantités équivalents, en moles, du composé de formule I et de l'ester de N-hydroxysuccinimide, de préférence à une température de —10° C à +10° C, et dans une solution aqueuse d'un solvant organique inerte, par exemple le tétrahydrofuranne, le dioxanne, l'éther diméthylique de l'éthylèneglycol, le diméthyl-acétamide, le diméthylformamide, l'éther diméthylique du pro-pylèneglycol, etc.

On peut effectuer l'hydrogènolyse du groupement benzyloxycarbonyle sur un catalyseur de palladium sur charbon dans un solvant organique miscible à l'eau inerte, par exemple le méthanol, l'éthanol, le dioxanne, le tétrahydrofuranne, l'éther diméthylique de l'éthylèneglycol, l'éther diméthylique du pro-pylèneglycol, etc.

On a essayé les composés de formule I dans un essai classique antibactérien avec dilution en série, et on a trouvé qu'ils possèdent une activité antibactérienne, en particulier vis-à-vis des organismes résistant à la gentamicine. Les composés sont ainsi utiles comme agents antibactériens.

Les composés de formule I sont essentiellement destinés à une administration orale, locale ou parentérale et peuvent être préparés, pour leur utilisation, à l'aide d'un support pharmaceutique par mise en suspension, soit sous forme d'une base libre soit sous forme des sels d'addition d'acide non toxiques, phar-maceutiquement acceptables, dans un support inerte comme le polyéthylèneglycol, soit par mise sous forme de comprimés ou encapsulage pour l'administration orale, seuls ou avec des adjuvants appropriés, ou bien ils peuvent être introduits dans des crèmes ou des gelées classiques pour une application locale.

Les structures moléculaires des nouveaux composés ont été attribuées sur la base de l'étude de leurs caractéristiques chro-matographiques déterminées par Chromatographie sur couche mince (CCM), leur spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) et leur spectre de masse ; par dégradation en composés connus ; et par la correspondance entre les valeurs calculées et trouvées pour leurs analyses élémentaires.

Les exemples spécifiques suivants sont représentatifs de la façon de préparer les composés et de la façon de mettre en œuvre le procédé de l'invention, sans que l'invention soit limitée à ces exemples.

Processus de mutation

Dans les modes opératoires suivants, on utilise divers milieux constitués comme suit: 60

Milieu 1:

35

45

5(1

N—Z Amine g/l

Glucose

10

Amidon soluble

20

Extrait de levure

5

N-Z-Amine-Type A (Difco)

5

CaC03

1

Gélose

15

Milieu 2: Milieu de germination (dans l'eau distillée)

Extrait de bœuf 0,3 %

Tryptone 0,5%

Dextrose 0,1 %

Amidon soluble 2,4%

Extrait de levure 0,5 %

CaC03 0,4%

Milieu 3: Soja-glucose g/l

Farine de soja 30

Dextrose (Cerelose) 40

CaC03 1

Milieu 4: TGE (extrait trypticase-glucose) g/l

Extrait trypticase-glucose 5,0

Trypticase-peptone 3,0

Glucose 1,0

Gélose 15,0

Milieu 5: Milieu de production

Extrait de bœuf 0,3 %

Extrait de levure 0,5 %

Farine de soja 0,5 %

Maltose 0,1%

Amidon 2,4%

Casamino-acide 0,1%

CaC02 0,4% CoCl2 • 6H20 1 mg/litre

Milieu 6: Gélose d'essai de streptomycine g/l

Extrait de bœuf 1,5

Extrait de levure 3,0

Peptone 6,0

Gélose 15,0

On obtient l'organisme Micromonospora purpurea du Department of Agriculture des Etats-Unis sous le N° NRRL 2953 et on le maintient sur des cultures de gélose inclinées N-Z amine (Milieu 1). On effectue des fermentations en immersion dans des ballons contenant le milieu de germination 2 pendant 4 jours à 37° C sur un agitateur rotatif. A partir des semences de cette première étape, on transfère un inoculum à 10% dans le milieu de germination (milieu 2) et l'on continue la fermentation comme ci-dessus à 28° C pendant 7 jours.

Pour établir l'aptitude de l'organisme à biosynthétiser la gentamicine en l'absence de désoxystreptamine ajoutée, on effectue une fermentation de troisième étape en utilisant un inoculum à 5% dans un fermenteur de 10 litres dans un milieu de soja et de glucose (milieu 3) à 28° C, en agitant à 200 tours par minute et en insufflant 2 litres d'air filtré par minute. Après 6 jours, on acidifie le contenu du réservoir à pH 2,2 avec de l'acide sulfurique 6N, on filtre et on neutralise une portion de 500 ml avec de l'hydroxyde d'ammonium et on la fait passer sur une résine échangeuse d'ions IRC 50 (forme Na+). Puis on rince la colonne avec de l'eau et on l'élue avec de l'acide sulfurique 2N. En suivant le mode opératoire décrit dans le brevet des E.U.A. N° 3 091 772, on isole un échantillon de 300 mg de gentamicine brute, que l'on trouve être biologiquement active et qui contient trois composants similaires à la gentamicine Cl9 C2 et Cla par examen en CCM.

Dans le but d'obtenir un mutant de l'organisme, on cultive les cultures de bouillon dans le milieu 2 (37° C pendant 3 jours) et l'on récolte les cellules résultantes par centrifugation, on les lave et on les remet en suspension dans la solution saline tamponnée. On traite cette suspension par l'agent mutagène, la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine. On cultive sur plaque de milieu 4 des échantillons de la culture mutagénisée à 37° C

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jusqu'à ce que l'on volt des colonies (généralement environ une semaine). Les colonies sont transplantées sur deux séries de plaques (milieu 4) dont une série est recouverte d'une suspension de spores de B. subtilis. Après incubation à 37° C pendant 18 à 20 heures, les «transplantations» qui ne présentent aucune s zone d'inhibition sur la plaque à B. subtilis sont transférées de la plaque originale (pas de B. subtilis) à des cultures sur gélose inclinées de milieu 1 et on les fait incuber jusqu'à ce que l'on voit une croissance totale.

Ces mutants non producteurs potentiels sont ensuite mis en m présence de désoxystreptamine dans un essai de stimulation de la biosynthèse antibiotique, comme suit. Des cultures mères des mutants potentiels sont déposées sous forme de stries à la surface de plaques de milieu 4 et on les fait incuber à 37° C jusqu'à ce qu'on voit la croissance (environ 3 à 4 jours). Puis on i s plonge des disques de papier filtre dans une solution de désoxystreptamine (500 ng/ml) et on les place au-dessus des stries de culture. Après incubation pendant 24 heures, on inocule la surface de la plaque avec B. subtilis en utilisant la technique de couverture par une couche, et on continue l'incubation pendant 211 18 à 20 heures supplémentaires. Les isolats présentant des zones d'inhibition autour du disque sont désignés comme étant des mutants de désoxystreptamine. Un de ces mutants, appelé mutant VIB et déposé à American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, sous le nom de 25 Micromonospora purpurea ATCC 31 119, est utilisé dans la production des antibiotiques du type gentamicine comme décrit ci-dessous.

Ce dernier organisme est ensuite lui-même soumis au même mode opératoire de mutation que celui décrit ci-dessus, et l'on .10 cultive sur plaque des échantillons de la culture mutagénisée, sur le milieu 4, à 37° C jusqu'à ce que l'on voit des colonies (environ une semaine). On transplante les colonies sur deux séries de plaques contenant de la gélose d'essai de streptomycine (milieu 6). 35

Une des séries sert de plaque originale pour la récupération ultérieure alors que la seconde série contient 25 |xg/ml de sulfate de streptamine et une suspension de spores de B. subtilis,

formant une couche supérieure, comme organisme d'épreuve. On fait incuber ces plaques à 37° C pendant 24 heures et on les 40 examine pour rechercher des zones d'inhibition. Celles présentant les plus larges zones sont transférées de la plaque originale sur des cultures sur gélose inclinées de N-Z amine (milieu 1) et on les fait incuber pendant une semaine à 37° C.

Les mutants incorporant les taux inférieurs de sulfate de 45 streptamine sont ensuite testés avec la streptamine et le scyllo-inosose à 500 jxg/ml comme base. On transfère les cultures mères dans des flacons contenant le milieu 2 plus les intermédiaires précédents et on les fait incuber à 37° C sur un agitateur rotatif pendant 7 jours. On détermine périodiquement l'activité 50 antibiotique dans les flacons par la méthode d'essai de diffusion avec disques en utilisant B. subtilis comme organisme d'essai. Les isolats présentant des zones d'inhibition autour du disque sont désignés comme des mutants de streptamine ou de scyllo-inosose. Un te1 mutant, appelé mutant VIB-3P et déposé des le 55 11 juillet 1975 ì la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20851, sous le nom de Micro-monospora purpurea ATCC 31 164, est utilisé pour la produc-tion des aminocyclitols antibiotiques du type streptamine, désoxystreptamine et diséxoxystreptamine comme décrit ci-des- Ml sous.

Biosyntheses ivec M. purpurea ATCC 31164

<i5

Exemple 1

On maintient des cultures de l'organisme mutant sur des cultures inclinées de gélose N—Z amine (milieu 1) à partir desquelles on effectue des transferts dans les ballons contenant 500 ml de milieu de germination 2. On fait incuber les ballons à 28° C pendant 4 jours sur un agitateur rotatif (course de 5 cm) à 225 tours par minute.

On transfère de manière aseptique un inoculum à 10% (volume/volume) provenant de l'étape de germination, dans des fermenteurs de 14 litres contenant 9 litres de milieu de germination 2 stérile. On les agite à 450 tours par minute à 28—29° C et on y insuffle de l'air filtré à 5 litres par minute. Au moment de l'inoculation, on ajoute 200 mg par litre de sulfate de streptamine sous forme d'une suspension dans de l'eau distillée stérile. On continue la fermentation pendant 8 jours.

On transfère de manière aseptique un inoculum de 10 litres de 24 heures préparé comme précédemment, dans des fermenteurs de 130 litres contenant 70 litres de milieu de germination 2 stérile, et on ajoute 0,31 g par litre de sulfate de streptamine en suspension dans de l'eau distillée stérile. On effectue une fermentation aérobie à 29° C pendant 7 jours.

On arrête les fermentations par addition d'acide sulfurique 10N jusqu'à pH 2,0 et par filtration en utilisant un adjuvant de filtration pour recueillir les mycéliums. On ajuste le pH du bouillon filtré à 7,0 et l'on ajoute 1,56 g d'acide oxalique par gramme de carbonate de calcium présent dans le milieu, pour éliminer le calcium. Puis on laisse reposer pendant une nuit, et l'on décante le bouillon clarifié et on le fait passer sur une résine Bio-Rex 70 (échangeur de cations faible) sous forme Na+, en utilisant environ 14 g de résine par litre de bouillon. Puis on lave la colonne avec de l'eau distillée et on l'élue avec de l'acide sulfurique 2N. On réunit toutes les fractions présentant une activité antibiotique, on les neutralise et on les concentre sous vide en dessous de 50° C, jusqu'au moment où la cristallisation du sel devient évidente (à un volume d'environ 1/3). Puis on ajuste le pH à 10,5, et l'on ajoute quatre volumes d'acétone pour faire précipiter les matières minérales que l'on élimine par filtration. On ajuste le pH du filtrat à 5,0 avec de l'acide sulfurique 6N, on le concentre sous vide à environ 1/20 du volume initial et on le refroidit. On recueille par filtration une récolte cristalline blanche fondant au-dessus de 300° C qui se révèle, par ses propriétés en Chromatographie sur couche mince et son spectre infrarouge, être identique au sulfate de streptamine. De deux fermentations de 10 litres traitées comme précédemment, on obtient un total de 0,7 de sulfate de streptamine, et de deux fermentations de 80 litres, on recueille à cette étape un total de 21 g de sulfate de streptamine.

On concentre encore le filtrat et on ajoute 10 volumes de méthanol ce qui fournit le premier solide antibiotique brut. De deux fermentations de 10 litres on obtient 7 g, et de deux fermentations de 80 litres, on obtient 24 g.

Pour identifier les composants antibiotiques pendant les modes opératoires de purification, on détermine les valeurs de la mobilité chromatographique obtenues par Chromatographie sur papier et Chromatographie sur couche mince pour les genta-micines Cu Q et Cla et pour chacun des homologues correspondants d'aminocyclitol préparés comme indiqué précédemment, où la mobilité chromatographique (désignée ci-après par MC) est exprimée comme étant:

jyjç _ distance du composant par rapport à l'origine distance de la gentamicine Q par rapport à l'origine.

Les systèmes chromatographiques utilisés sont les suivants:

Système 1 — Papier Whatman n° 1 saturé, avec du sulfatebi-sulfate 0,95M et développé de manière descendante dans de l'éthanol aqueux à 80% plus 1,5% de NaCl, et bioautographe ultérieur en utilisant B. subtilis comme organisme d'essai.

Système 2 - Plaque de gel de silice F 254 développée dans la phase inférieure du mélange chloroforme (1): méthanol (1): hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (1). Les composants

7

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sont localisés avec une pulvérisation de ninhydrine et chauffage.

Les valeurs MC des composants antibiotiques principaux de la présente invention par rapport à un complexe de gentamicine de référence, valeurs qui sont toutes données par rapport à la gentamicine C,, sont données dans le tableau I, où les composés désignés par composant 1, composant 2 et composant 3 sont respectivement:

0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabino-pyranosyl-( 1 -^6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)] -D-streptamine;

0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabino-pyranosyI-(l—»ó^O-pjó-diamino-ó-C-méthyl^.S^ó-tétra-désoxy-a-D-érythro-glucopyranosyHl-^j-D-streptamine ; et

0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthyIamino-P-L-arabino-pyranosyl-(l—^-O-^.ó-diamino^SAó-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl^l—>4)]-D-streptamine.

Tableau I ■

MC Système I

MC Système 2

Gentamicine C!

1

Gentamicine C2

0,89

0,83

Gentamicine Cia

0,50

0,67

Composant 1 (Principal)

0,96

0,92

Composant 2 (Faible)

0,76

0,75

Composant 3 (Faible)

0,50

0,61

Le solide brut (7 g) des fermenteurs de 10 litres, qui pré- 1() sente une activité antibactérienne, est mis en suspension dans 200 ml de méthanol et 10 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré (28%), et on agite le mélange pendant 30 minutes et on le filtre. On répète ceci deux fois supplémentaires, et on réunit les filtrats et on les concentre sous vide, ce qui donne une huile 35 jaune pâle pesant 0,9 g. Les «sels épuisés» sont essentiellement dépourvus d'activité antibiotique.

On mélange la base huileuse avec 4 g de gel de silice (Davison, qualité 923,74-149 microns) et on l'introduit dans une colonne de gel de silice mesurant 1,8 X 28 cm. On prépare le4l, colonne sous forme d'une suspension en utilisant la phase inférieure du mélange alcool isopropylique (l):chloroforme (2):hydroxyde d'ammonium aqueux à 17% (1). On développe la colonne avec ce solvant et l'on recueille des fractions de 50 ml. 45

Les fractions 8 et 9 contiennent un seul composant positif à la ninhydrine qui fournit 20 mg sous forme d'une huile jaune pâle par élimination du solvant. Le spectre de masse de cette substance, appelé composant 1, présente un ion moléculaire et des fragments principaux chacun supérieur de 16 unités de 50 masse (c'est-à-dire d'un atom d'oxygène) à ceux obtenus pour la gentamicine C,, comme suit :

Référence: gentamicine Q: M+ 477,420,360, 350, 347, 322,319,304

Composant 1 : M+ 493,436, 376,366, 363,338, 335,320. „ On transforme cette substance en son sulfate en la dissolvant dans l'éthanol et en ajoutant quelques gouttes d'éthanol contenant de l'acide sulfurique. On recueille le solide blanc résultant et on le sèche, ce qui donne 22 mg du composant 1, la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino^-L-arabinopyranosyl- ()ll (l-^6)-0~[2-amino-6-méthyl-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétra-désoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- (1^4)]- D-streptamine,

sous forme de la di-base heptasulfatée et décahydratée, p.f. >300° C.

65

Analyse, calculée pour (C2iH43N508)2 • 7H2 S04 • 10H20: C 27,22; H 6,53; N7.55; S 12,09 Trouvée: C27,15; H6,67; N7,79; S 12,76.

Les fractions 10-13 fournissent un composant positif à la ninhydrine, plus polaire, appelée la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l—> 6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1^-4)]-D-streptamine, le composant 2 qui présente une activité antibiotique.

Les fractions 15-26 présentent un troisième composant plus polaire présentant une activité antibiotique. Le spectre de masse de ce composant présente des pics caractéristiques des sucres correspondant à la gentamicine Cla, à 129 (purpurosamine) et 160 (garosamine) et est appelé le composant 3, la O-3-désoxy-4- C-méthyl-3-mithylamino-ß- L-arabinopyranosyl- (/-> 6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-*4)]-D-streptamine.

Ou bien, on isole comme suit le nouveau composant 1 : on dissout un mélange de la base antibiotique brute obtenue comme précédemment (0,9 g) dans 7 ml d'eau et on ajuste le pH à 4,5 avec de l'acide sulfurique IN. On fait passer le solvant sur une colonne de résine échangeuse d'anions forte (IRA 401) sous forme OH" (dimensions du lit = 0,7 X10 cm). On élue la colonne avec de l'eau et on évapore l'éluat sous vide à 35° C. On triture le résidu résultant avec 50 ml de la phase inférieure d'un solvant composé d'hydroxyde d'ammonium aqueux à 17%, d'alcool isopropylique et de chloroforme (1:1:2). On décante le solvant et on le concentre sous vide, ce qui laisse un résidu huileux pesant 140 mg. Le spectre de masse de cette substance correspond à celui des fractions 8 et 9 ci-dessus c'est-à-dire M+ 493,436,376, 366,363,338, 335,320.

Le spectre de résonance magnétique nucléaire du composant 1 est également compatible avec la structure proposée correspondant à la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1—>4)]-D-streptamine et est résumé dans le tableau II.

Tableau II ô

5,87, 5,60 5,22

3,09,3,15

2,9-4,8

1,9-2,6

Intégration Attribution

2 OCHO épimères

12 H échangeable 6 NCH3 X 2

13 -CHO X 6, -CHN X 5, -CH20 4 -CH2CH2-

Ou bien, on dissout un échantillon de 4 g du sel antibiotique brut dans 50 ml d'eau et on le fait passer sur une résine échangeuse d'anions AG1X8 (lit de résine 1X 27 cm). On élue l'antibiotique avec de l'eau et l'on réunit toutes les fractions actives et on les évapore sous vide. On effectue l'élimination du sel sur le résidu par extraction avec de l'hydroxyde de sodium méthanolique. On mélange la base libérée avec 7 g de gel de silice et on l'introduit sur une colonne de 50 g de gel de silice. On développe cette colonne avec le mélange chloroforme: méthanol: hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (3:4:2) et l'on recueille des fractions de 25 ml. Les premières fractions fournissent le nouveau composant 1 le moins polaire, mais mélangé avec plusieurs impuretés moins polaires comme le montre la Chromatographie sur couche mince. On réunit ces fractions et on introduit le produit concentré sur une colonne de 50 g de gel de silice comme précédemment. On développe cette colonne avec le mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (5:3:1) et l'on recueille des fractions de 25 ml. Les fractions 6-12 contiennent le composant désiré débarrassé des impuretés évidentes. On transforme l'huile résultant de l'élimination du solvant en sulfate dans l'acide sulfurique éthanolique comme décrit précédemment, ce qui donne 0,124 g du composant 1 sous forme de la di-base heptasulfatée et décahydratée, p.f. >300° C, décrit ci-dessus.

618 215

En cultivant un aminocyclitol approprié avec le mutant Micromonospora purpurea ATCC 31 164, dans le milieu de germinatioir 2 et en séparant les produits décrits ci-dessus dans l'exemple 1, on prépare de la même manière les composés suivants de formule I:

Exemple 2

La 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopy-ranosyl-(l-*6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-{l-^>4)]épi-streptamine (MC par rapport à la gentamicine Q: Système 1 = 0,59, Système 2=0,63); la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthyl-amino-ß-L-arabinopyranosyl- (l-^>6)- 0-[2,6-diamino-6- C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—*4)]épistreptamine\ et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthyl-amino-ß-L-arabinopyranosyl- (/—» 6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- (l-^>4)épistreptamine sont obtenues en utilisant l'épistreptamine au lieu de la streptamine dans le mode opératoire de fermentation.

Exemple 3

En suivant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1 et en utilisant 0,10 g par litre de 2-désoxy-strept-amine dans une fermentation de 10 litres dans le milieu de production 5, en présence de M. purpurea ATCC 31 164, et en séparant le produit comme précédemment, on obtient 0,51 g de substance brute qui, par Chromatographie sur gel de silice, fournit comme composant principal une substance dont l'identité des mobilités chromatographiques montre qu'elle est identique à la gentamicine C[, c'est-à-dire la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-fi-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6- C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- (1^4)]-D-2-désoxystreptamine

Exemple 4

En suivant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1 et en utilisant 0,10 g par litre de 2,5-didésoxy-streptamine dans deux fermentations de 80 litres et six fermentations de 10 litres dans le milieu de production 5 dans lequel on a remplacé la farine de soja par 0,5 % de tryptone et l'amidon par 2% de Cerelose, en présence de M. purpurea ATCC 31 164, et en séparant le produit comme précédemment, on obtient deux résidus, 0,68 g et 0,13 g, que l'on réunit et que l'on Chromatographie sur des plaques de gel de silice ce qui donne trois bandes dont les spectres de masse montrent qu'elles correspondent respectivement au composant Q: 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthy lamino)-ß-L-arabinopyranosyl- (l^>6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- (/—> 4)]-D-2,5-didésoxystreptamine; le composant C2: 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-fi-L-arabinopyranosyl- (1—» 6)-0-]2,6-diamino-6- C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl (l-*4)]-D-2,5-didés-oxystreptamine; et le composant Cla: 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(mJthylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-]2,6-di-amino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1^*4)]-D-2,5-didésoxystreptamine. Les spectres de masse pour les trois composants Cx, C2 et Cla indiqués ci-dessus comportent les pics suivants: Composant Ct: M+ 461,404,344, 334, 331, 306,303,288,160 et 157. Composant C2: M+ 447,404,334, 330,317,306,288,160 et 143. Composant Cla: M+ 433, M+ +1 434,404,334,316,306,303,288,275,160 et 129.

Les valeurs Rf, par CCM sur plaques de gel de silice en utilisant la phase inférieure du mélange chloroforme (l):métha-nol (l):hydroxyde d'ammonium concentré (1) comme solvant de développement, sont 0,43,0,37, et 0,29 pour les composants C!, C2 et Cla respectivement.

Exemple 5

En suivant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1 et en utilisant 0,50 g par litre de 2-amino-l ,3,4,5,6-cyclohexanepentol (l,3,5cis) dans trois fermentations de 10 5 litres dans le milieu de production 5 contenant en plus 0,1 % de phytone, en présence de M. purpurea ATCC 31 164, et en séparant le produit comme précédemment, on obtient 214 mg de substance qui se révèle, par sa mobilité chromatographique et par son spectre de masse, être identique au «composant 1 » 10 décrit dans l'exemple 1 ci-dessus, c'est-à-dire la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-fi-L-arabinopyranosyl- (7—» 6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-D-streptamine. Le spectre de masse présente les pics suivants: M+ 493,457,436,383,376, 15 366,363, 346,344,338,335,321,318, 261,160 et 157.

Synthèse des dérivés à substituant Amino-hydroxy-alcanoyle inférieur

Exemple 6

20 On refroidit à 5° C dans un bain de glace, une solution de 270 mg (0,54 mmole) de 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthyl-amino-ß-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthyl-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-ranosyl-(l—>4)]-D-streptamine, décrite ci-dessus dans l'exem-25 pie 1 (composant 1), dissous dans 5 ml de tétrahydrofuranne auquex à 50%, et on la traite par 208 mg (0,59 mmole) de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-( — )-y-(N-benzy-Ioxycarbonyl)amino- a-hydroxybutyrique (brevet des E.U.A. N° 3 780 018 de Konishi et al.), et on agite le mélange à 5° C m pendant 20 heures. Puis on concentre le mélange à 10 ml sous vide. On ajoute 25 ml de n-butanol et 10 ml d'eau, et l'on sépare les couches. On lave de nouveau la couche aqueuse avec 10 ml de n-butanol. On évapore les couches organiques réunies, ce qui laisse un résidu de 513 mg de produit brut que l'on laisse 35 de côté.

On évapore le couche aqueuse à siccité, ce qui donne 304 mg d'un résidu que l'on dissout dans 25 ml de tétrahydrofuranne aqueux à 50% et que l'on traite par 208 mg supplémentaires de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(—)-y-4(1 (N-benzyloxycarbonyl)-amino-a- hydroxybutyrique comme précédemment. Le traitement du mélange réactionnel fournit 435 mg supplémentaires du produit brut que l'on réunit aux 513 mg préalablement obtenus et on les Chromatographie sur 7 plaques de gel de silice 40 X 20 cm d'une épaisseur de 1 mm. On 45 développe le système avec le phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré à 28% (3:1:1). Sept passages dans ce système de solvant sont nécessaires, et après avoir élué la bande du produit qui est visible à l'ultra-violet, on obtient 229,5 mg d'un produit brut des 50 trois produits monoacylés.

On dépose le mélange des produits acylés sur trois plaques de gel de silice de 40 X 20 cm et 1 mm d'épaisseur et on développe les plaques 5 fois avec la phase inférieure du mélange 55 chloroforme:isopropanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1), deux fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:isopropanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (3:1:1) et 9 fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré 60 (28%) (4:1:1). On obtient 3 bandes distincts visibles sous un rayonnement ultra-violet que l'on découpe séparément et que l'on élue du gel de silice avec la phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (1:1:1), ce qui fournit trois composants: A, 90,9 mg; B, 65 59,1 mg; et C, 48,5 mg, qui sont les dérivés amide de l'acide S-(—)-Y-(N-benzyloxycarbonyl)- amino-a-hydroxybutyrique en positions 2', 1 et 3 respectivement de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-

9

618215

amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—»4)]-D-streptamine. Les valeurs Rf pour les composants A, B et C, quand on développe 5 fois sur gel de silice avec la phase inférieure du système chloroforme: méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1),

sont:

A-0,48 B-0,62 C-0,70

On agite le composant B (1-amide, 56,1 mg) dissous dans 25 ml d'éthanol aqueux à 50% et 20 mg, de palladium-sur-charbon à 10%, dans un agitateur de Parr à 3,75 atmosphères pendant 5,5 heures, après quoi on élimine le catalyseur par filtration sur un adjuvant de filtration. L'évaporation du solvant fournit 34,3 mg d'un verre blanc que l'on dissout dans 2,5 ml d'eau et que l'on traite par 11,4 mg d'acide sulfurique dans 0,1 ml d'eau. L'addition de 10 ml d'éthanol fait précipiter la 1-lS-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-mêthylamino-fi-L-arabinopyranosyl- (7—> 6) 0[2-amino-6-méthylamino-6- C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glu-copyranosyl- (1-^4)]-D-streptamine sous forme du pentasulfate (32 mg), p.f. 230-235° C avec décomposition, CCM, Rf = 0,18 (gel de silice, chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%):eau, 1:4:2:1; Rf de référence de la gentamicine C] = 0,73).

Analyse, calculée pour C25H50O10N6 • 5H2S04:

C 27,67; H 5,57; N7,75 Trouvée C 27,50; H 5,58; N7,42.

On traite de la même manière les composants A et C. A fournit 47 mg de 2'-[S-(—)-y-amino-a-hydroxy-butyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-[2-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-éry- }5 thro-glucopyranosyl- (1^>4)]-D-streptamine sous forme de la di-base tétrasulfatée et heptahydratée, p.f. 237-241° C avec décomposition; CCM, Rt = 0,33 [gel de silice, chloroforme:mé-thanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%):eau, 1:4:2:1 ; Rf de référence de la gentamicine Q=0,73]. 4«

Analyse, calculée pour (C25H50N6O10)2 • 4H2S04 ■ 7H20:

C 35,16; H 7,20; N9,84 Trouvée C 35,38; H 7,08; N9,49

Le composant C fournit 26 mg de 3-[S-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l^>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(7-h> 4)]-D-streptamine sous forme de la di-base pentasulfatée et trihydratée, p.f. 220-230° C avec décomposition ; CCM, Rf = 0,30 [gel de silice, chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%):eau, 1:4:2:1 ; Rf de référence de la gentamicine Q=0,73]. 5

Analyse, calculée pour (C25H50N6O10)2 • 5H2S04 • 3H20:

C 34,64; H 6,74; N9,67 Trouvée C 34,35 ; H 6,38 ; N 8,60.

6

En procédant d'une manière similaire à celle décrite dans l'exemple 6 en utilisant respectivement les antibiotiques décrits dans l'exemples 2 et l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(—)-v-(N-benzyloxycarbonyl)amino-a-hydroxybutyrique ou l'ester pentafluorophénylique de la N-(benzyloxycarbonyl)-(S)-isosérine [acide (S)-ß-amino-a-hydroxypropionique, décrit par Haskell et al., Carbohydrate Research, 28,273-280 (1973)], on prépare de la même manière les composés suivants de formule I:

5

Exemple 7

1 -f(S)-fi-amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylaminô-fi-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-]2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-10 ranosyl- (l^>4)]épistreptamine et 2' -[(S)-ß-amino-a-hydroxy-propionyl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabi-nopyranosyl- (1—* 6) - O-]2,6-diamino-6- C-méthyl-2,3,4,6-tétra-désoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- ( 1^>4) ]-épistreptamine

15 Exemple 8

l-[S-(—)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl- (1—» 6)-0-] 2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1-^4)-2,5-didésoxystreptamine et 2' -[S-(—)-y-amino-a-2o hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl- (/-> 6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a- D-érythro-glucopyranosyl- (1-^4)] -2,5-didésoxystreptamine

Exemple 9

25 1 -[(S)-fi-amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl- (l^>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l^> 4)] -2-désoxystreptamine et 2' -[(S)-ß-amino-a-hydroxypropionyl] -0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-3o mithylamino-ß-L-arabinopyranosyl- (l^>6)-0-2-amino-6-mé-thylamino-6- C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gluco-py ranosyl- (1^> 4)]-2-désoxystreptamine.

Resultats des essais antibacteriens

On teste la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1—>4)]-D-streptamine décrite ci-dessus dans l'exemple 1 et appelée composant 1 en la comparant à la gentamicine vis-à-vis d'un certain nombre de micro-organismes selon le mode opératoire suivant.

On prépare des solutions mères de chaque composé contenant 200 g/ml de base, dans de l'eau distillée et on les stérilise par filtration. On cultive pendant 24 heures à 37° C des cultures des microorganismes d'essai dans des tubes de 10 ml de phos-phate-tryptose ou bouillon de Mueller-Hinton. On ajuste chaque culture avec du bouillon jusqu'à une densité optique de 0,1 sur un spectronic 20 (environ 108 cellules/ml). On dilue les cultures ajustées à raison de 1:500 dans le bouillon pour les utiliser comme inoculum (concentration finale en cellules d'environ 2 X105 cellules/ml). On teste l'activité antibactérienne des composés d'essai par une méthode de dilution en tube en une seule série. On prépare des dilutions originales en double dilution en série dans du bouillon à partir des solutions mères de médicaments, et l'on place 0,2 ml de chaque concentration de médicaments dans 17 tubes de 13 X100 ml. On inocule tous les tubes avec 0,2 ml de la culture diluée appropriée (concentration finale de cellules par tube = 105 cellules/ml). On détermine les concentrations inhibitrices minimales (plus faibles concentrations en médicaments ne présentant pas de croissance visible) après une incubation de 16 heures à 37° C.

Les résultats sont donnés dans le tableau III ci-dessous. On considère les composés inactifs à des concentrations inhibitrices supérieures à 100 fig/ml.

618 215

Tableau IIP

Organisme

10

Concentration inhibitrice minimale fUg/ml)

Composant I

Gentamicine

Staphylococcus aureus Smith

0,78

0,195

Escherichia coli Vogel

3,13

Escherichia coli W677/HJR66

50

inactive

Escherichia coli JR 35

3,13

6,25

Escherichia coli JR 76.2

6,25

100

Escherichia coli JR89

50

Escherichia coli Kl 2 ML 1629

3,13

1,56

Enterobacter cloacae A-20960

1,56

25

Klebsiella pneumoniae 39645

1,56

0,78

Klebsiella pneumoniae A-20636

3,13

50

Proteus mirabilis MGH-1

6,25

1,56

Providencia 164

100

inactive

Providencia stuartii A-20894

100

Pseudomonas aeruginosa MGH-2

3,13

0,39

Pseudomonas aeruginosa A-20717

12,5

< 12,5

Pseudomonas aeruginosa A-20741

Inactif

Inactive

Pseudomonas aeruginosa A-20897

12,5

Inactive

"Cultivé dans le bouillon tryptose-phosphate.

On fait un essai de comparaison de ce même composant 1 décrit ci-dessus dans l'exemple 1, la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino- ß-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-D-streptamine, avec le complexe de gentamicine (Cb Q et Cla) et la gentamicine Q, et l'on fait un essai de comparaison entre les 1-, 3- et 2'-[S-(—)-Y-amino-<x-hydroxybutyryl]amides du composant 1, décrits ci-dessus dans l'exemple 6, et appelés respectivement composé 1 (1-HABA),

:5 composant 2 (3-HABA) et composant 1 (2'-HABA), et les 1-, 3-, et 2'-[S-(—)-Y-amino-Ct-hydroxybutyryl]amides correspondants de la gentamicine C! (tous décrits par Konishi et al. dans le brevet des E.U.A. N° 3 780 018 délivré le 18 décembre 1973) et appelés respectivement C! (1-HABA) C, (3-HABA) » et C, (2'-HABA). Les résultats sont donnés dans le tableau IV ci-dessous où les organismes d'essai 1,2,3,4,4 et 5 désignent respectivement B. subtilis ATCC 6633, S. aureus Smith, E. coli JR 76.2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumoniae A-20636 et Ps. aeruginosa A-20897.

Tableau IVe

Organismes d'essai

Composé 1

2

3

4

5

6

Gentamicine

C„ C2, Cla ^0,024

0,39

50

12,5

25

>100

Gentamine Q 0,049

0,78

50

12,5

25

>100

Composant I 0,098

1,56

6,25

0,78

3,13

25

C, (1-HABA) 0,39

3,13

12,5

3,13

6,25 >100

Composant I

(1-HABA) 0,78

6,25

12,5

6,25

12,5

>100

Cj (3-HABA) 3,13

25

>100

100

> 100

>100

Composant I

(3-HABA) 6,25

50

100

50

>100

C] (2'-HABA) 6,25

50

100

25

50

>100

Composant I

(2'-HABA) 1,56

25

50

25

50

>100

"Cultivé dans le bouillon Mueller-Hinton.

C

Claims

618 215

REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un composé de formule I

dans laquelle Rl5 R3 et R8 représentent chacun un atome amino)-ß-L-arabinopyranosyl(l—»6)-0-[2-amino-6-(méthyl-

d'hydrogène, et R2 et R5 représentent chacun un atome d'hy- amino)- 6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythrogIucopy-drogène ou un groupement hydroxy, R6 et R7 représentent 45 ranosyl- (1—»4)]-D-2-désoxystreptamine, caractérisé par le fait chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle et ses que l'aminocyclitol ajouté est la 2-désoxystreptamine.

sels d'addition d'acide, caractérisé en ce qu'on cultive un milieu 3. Procédé selon la revendication 1 permettant de préparer nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3(méthylamino)-P-L-arabinopyra-

nosyl- (l-»6)-0-[2-amino-6(méthylamino)-6-C-méthyl-5» 2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—»4)]-D-streptamine ou la Ó-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-P-L-arabinopyranosyl- (l-»6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-cx-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-D-streptamine, caractérisé en ce que l'aminocyclitol ajouté est la 55 streptamine.
4. Procédé selon la revendication 1 permettant de préparer la 0-3-désoxy-4-C-méthyI-3- (méthylamino)-P-L-arabinopyra-nosyl-(l—»6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-(,0 2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyI-(l—>4)]-D-2,5-didésoxystreptamine ; la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-dans laquelle R2' et R5' sont chacun un atome d'hydrogène ou (m0thylamino)-ß~L-arabinopyranosyl- (1^6)-0-[2,6-diamino-un groupement hydroxy et R, ' est un groupement amine ou 6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-

hydroxy en présence de Micromonospora purpurea ATCC (1—>4)]-D-2,5-didésoxystreptamine ou la 0-3-désoxy-4-C-

31 164, et si on le désire on transforme la base libre obtenue en ()s méthyl-3- (méthylamino)-p-L-arabinopyranosyl- (l-»6)-0-un de ses sels d'addition d'acide. [2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-
2. Procédé selon la revendication 1 permettant de préparer (1—»4)]-D-2,5-didésoxystreptamine, caractérisé en ce que la gentamicine C1( la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3- (méthyl- l'aminocyclitol ajouté est la 2,5-didésoxystreptamine.

des sels essentiels et un amînocyclitol de formule

HO NH.

618 215
5. Procédé selon la revendication 1 permettant de préparer la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-P-L-arabino-pyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)-D-streptamine caractérisé en ce que l'aminocyclitol ajouté est le 2-amino-1,3,4,5,6-cyclohexanepentol ( 1,3,5-cis).
6. Procédé pour la préparation d'un composé de formule I dans laquelle l'un des symboles Rb R3 et R« représente un radical co-amino-a-hydroxyalcanoyle inférieur, caractérisé en ce qu'on exécute le procédé selon la revendication 1 et qu'on fait ; réagir le composé obtenu avec un ester de N-hydroxysuccin-imide de formule

/V

-CHo0-C-NHCH_(CH_) CHOHCO-O-N 2 2 2 n \

IV

dans laquelle n est égal à zéro ou 1, et qu'on soumet le groupement benzyloxycarbonyle du produit résultant à l'hydro-gènolyse par l'hydrogène sur un catalyseur.