CH617350A5

CH617350A5 - Process for the preparation of HB-Ag vaccines with high-level antibody formation

Info

Publication number: CH617350A5
Application number: CH1636974A
Authority: CH
Inventors: Satoshi Funakoshi; Tsunekazu Fukushima; Toshihiko Tanaka
Original assignee: Green Cross Corp
Priority date: 1974-01-28
Filing date: 1974-12-10
Publication date: 1980-05-30
Also published as: FR2258864A1; GB1462298A; DE2440926C3; DE2440926B2; CA1023662A; FR2258864B1; JPS5523254B2; JPS50105817A; DE2440926A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HB-Ag-(Hepatitis B-Antigen)-Vaccinen. The invention relates to a method for producing HB-Ag (hepatitis B antigen) vaccines.

Es wird angenommen, dass HB-Ag ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Hepatitis hervorruft. Plasma-HB-Ag gehört elektrophoretisch zu den a- oder ^-Globulinen und ist bei einer Plasmafraktionierung nach üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt. HB-Ag is believed to be a virus or a virus-like entity that causes hepatitis in humans. Plasma HB-Ag belongs electrophoretically to the a- or ^ -globulins and is distributed in most fractions in a plasma fractionation according to conventional methods.

Um dem HB-Ag seine Infektivität zu nehmen, wird eine Hitzebehandlung durchgeführt. Im allgemeinen wird ein Plasma-Albuminpräparat 10 Stunden bei 60° C einer Hitzebehandlung unterworfen, um nach Verabreichung an den Menschen das Auftreten von Hepatitis zu verhindern. Bei der Verabreichung derartiger Präparate lässt sich jedoch die Bildung von HB-Ab (Antikörper zu HB-Ag) im Blut nicht beobachten. Da Gewebekulturen von HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von konzentrierten Vaccinen zur Verfügung. A heat treatment is carried out to reduce the HB-Ag's infectivity. In general, a plasma albumin preparation is subjected to a heat treatment at 60 ° C for 10 hours to prevent the occurrence of hepatitis after administration to humans. When such preparations are administered, however, the formation of HB-Ab (antibody to HB-Ag) in the blood cannot be observed. Since tissue cultures of HB-Ag have so far not been successfully carried out, there was no process available for the production of concentrated vaccines.

In der US-PS 3 735 004 wird die Herstellung eines inaktivierten Vaccins durch 1- bis 3minütiges Sieden (1- bis 3minü-tige Behandlung bei 98° C) eines von einem Hepatitispatienten entnommenen, verdünnten Serums beschrieben. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieses Vaccins wird das Auftreten von Hepatitis verhindert, und auch bei bereits hervorgerufener Hepatitis wird der Krankheitsverlauf gemildert. Im allgemei-s nen wird jedoch die antigene Wirkung durch Erhitzen vermindert. Für eine bessere Prophylaxe und Therapie von Hepatitis besteht daher ein Bedarf nach inaktivierten Vaccinen mit einer stärkeren antigenen Wirkung und einer geringeren Infektivität, die in grossen Dosen verabfolgt werden können. US Pat. No. 3,735,004 describes the production of an inactivated vaccine by boiling for 1 to 3 minutes (treatment for 1 to 3 minutes at 98 ° C.) of a diluted serum taken from a hepatitis patient. Intramuscular administration of this vaccine prevents the occurrence of hepatitis, and the course of the disease is also alleviated in the case of hepatitis that has already been caused. In general, however, the antigenic effect is reduced by heating. For better prophylaxis and treatment of hepatitis, there is therefore a need for inactivated vaccines with a stronger antigenic effect and less infectivity, which can be administered in large doses.

io Aufgabe der Erfindung ist es somit, HB-Ag-Vaccine mit starker Antikörperbildung zur Verfügung zu stellen, deren Infektivität durch Hitzebehandlung auf ein Minimum gesenkt ist. The object of the invention is therefore to provide HB-Ag vaccines with strong antibody formation, the infectivity of which is reduced to a minimum by heat treatment.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass beim Erhitzen einer wässerigen Lösung von HB-Ag in 15 Gegenwart von Harnstoff oder Guanidin bzw. Guanidinhy-drochlorid infolge irreversibler Entfaltung des Eiweisses durch Spaltung von Disulfidbrücken die antigene Wirkung von HB-Ag gesteigert wird, wodurch sich bei Verabfolgung der Lösung an Menschen eine starke Antikörperbildung ergibt. 20 Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von entfalteten HB-Ag-Vaccinen mit starker Antikörperbildung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässerige Lösung von HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart einer Verbindung, wie Harnstoff oder Guanidinhy-25 drochlorid, eine ausreichende Zeit auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt, wodurch die Disulfidbrücken des Eiweisses gespalten werden und dadurch die Infektivität des HB-Ag verlorengeht und dessen antigene Wirkung erhöht wird, die entfaltend wirkende Verbindung entfernt und die Lösung in eine 30 physiologisch verträgliche Form bringt. The invention is based on the surprising finding that when an aqueous solution of HB-Ag is heated in the presence of urea or guanidine or guanidine hydrochloride as a result of irreversible unfolding of the protein by cleaving disulfide bridges, the antigenic action of HB-Ag is increased, as a result of which strong administration of antibodies results when the solution is administered to humans. The invention thus relates to a process for the production of unfolded HB-Ag vaccines with strong antibody formation, which is characterized in that an aqueous solution of HB-Ag-containing plasma protein in the presence of a compound such as urea or guanidine-25-hydrochloride, heated to a temperature of 60 to 120 ° C for a sufficient time, whereby the disulfide bridges of the protein are split and thereby the infectivity of HB-Ag is lost and its antigenic effect is increased, the compound with a developing effect is removed and the solution is in a physiologically acceptable form brings.

Eine wässerige Pufferlösung mit 1 Prozent (Gewicht/Volumen) menschlichem Plasmaprotein und einem HB-Ag-Titer von 8x, gemässen durch gekreuzte Immunelektrophorese (im folgenden als IES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro Nakamu-35 ra: Electrophoretic Expérimental Method, [1963], S. 287, erschienen bei Bunko-do) wird durch Lösen der a- und/3-Globu-linfraktionen von menschlichem Plasma in 0,06 Mol/1 Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 hergestellt. Teile dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2 Mol/1 bzw. 6 Mol/1 40 mit Harnstoff und bis zu einer Konzentration von 2 Mol/1 mit Guanidin versetzt. Diese Lösungen werden jeweils auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titers von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle I angegeben. An aqueous buffer solution with 1 percent (weight / volume) human plasma protein and an HB-Ag titer of 8x, according to crossed immunoelectrophoresis (hereinafter referred to as the IES method; cf. Shojiro Nakamu-35 ra: Electrophoretic Experimental Method, [1963 ], P. 287, published by Bunko-do) is prepared by dissolving the a- and / 3-globulin fractions of human plasma in 0.06 mol / 1 phosphate buffer with a pH of 7.6. Parts of this solution are mixed with urea up to a concentration of 2 mol / 1 or 6 mol / 1 40 and with guanidine up to a concentration of 2 mol / 1. These solutions are each heated to temperatures from 60 to 120 ° C. The dependence of the HB-Ag titer on the heating time is shown in Table I.

Aus der Tabelle geht hervor, dass sich durch Zusatz von 45 Harnstoff oder Guanidin ein Anstieg des HB-Ag-Titers der Lösung ergibt. Dies ist überraschend, da der HB-Ag-Titer in der Regel beim Erhitzen abnimmt, wie auch bei der Lösung zu ersehen ist, die nicht mit Harnstoff oder Guanidin versetzt ist. Beispielsweise ergibt sich bei der 6 Mol/1 Harnstofflösung ein so Anstieg des HB-Ag-Titers nach 10 Stunden bei 60° C, 30 Minuten bei 80° C, 10 Minuten bei 100° C bzw. 3 Minuten bei 120° C. Es besteht eine Tendenz, dass der auf diese Weise erhöhte HB-Ag-Titer lange Zeit erhalten bleibt und anschliessend abfällt. Da die Infektivität mit Zunahme der Erhitzungs-55 dauer abnimmt und da die zur Erhöhung des HB-Ag-Titers notwendige minimale Erhitzungszeit länger ist als die Zeit, die bisher zur Beseitigung der Infektivität angewendet wurde, ist es nach den erfindungsgemässen Verfahren möglich, ein Vaccin zu erhalten, das im Vergleich zu den Vaccinen her-60 kömmlicher Verfahren eine stärkere antigene Wirkung und eine geringere Infektivität aufweist. The table shows that the addition of 45 urea or guanidine results in an increase in the HB-Ag titer of the solution. This is surprising since the HB-Ag titer generally decreases when heated, as can also be seen in the solution which is not mixed with urea or guanidine. For example, in the 6 mol / 1 urea solution there is an increase in the HB-Ag titer after 10 hours at 60 ° C., 30 minutes at 80 ° C., 10 minutes at 100 ° C. or 3 minutes at 120 ° C. It there is a tendency that the HB-Ag titer, which is increased in this way, is retained for a long time and then drops. Since the infectivity decreases with increasing heating time and since the minimum heating time required to increase the HB-Ag titer is longer than the time previously used to remove the infectivity, it is possible according to the methods of the invention to use a vaccine to obtain, which has a stronger antigenic effect and a lower infectivity compared to the vaccines of conventional methods.

Der Mechanismus für den Anstieg des HB-Ag-Titers, der sich beim erfindungsgemässen Verfahren erreichen lässt, wird dem Umstand zugeschrieben, dass das entfaltend wirkende 65 Mittel, wie Harnstoff oder Guanidin, mit dem HB-Ag reagiert und dessen Disulfid-Bindungen spaltet. Dadurch liegt das Protein ungefaltet vor, wodurch mehr antigenwirkende Zentren freigesetzt werden. The mechanism for the increase in HB-Ag titer, which can be achieved in the method according to the invention, is attributed to the fact that the unfolding agent, such as urea or guanidine, reacts with the HB-Ag and cleaves its disulfide bonds. As a result, the protein is unfolded, which releases more antigen-acting centers.

3 3rd

Tabelle I Table I

617 350 617 350

Lösung Tempe- HB-Ag * HB-Ag-Titer ratur Titer vor Zeit Solution Tempe-HB-Ag * HB-Ag titer rature titer ahead of time

(°C) dem (Minuten) (Stunden) (° C) dem (minutes) (hours)

Erhitzen 1 3 10 " 30 1 3 6 10 24 Heat 1 3 10 "30 1 3 6 10 24

Phosphat phosphate

60 60

8x 8x

4x 4x

4x puffer 4x buffer

80 80

8x 8x

4x 4x

2x 2x

100 100

8x 8x

4x 4x

2x 2x

2x lx 2x lx

0 0

120 120

8x 8x

4x 4x

2x lx 2x lx

0 0

Lösung solution

60 60

8x 8x

16x mit 2 Mol/1 16x with 2 mol / 1

80 80

8x 8x

16x 16x

Harnstoff urea

100 100

8x 8x

16x 16x

— -

Lösung solution

60 60

8x 8x

16x 16x

8x mit 6 Mol/1 8x with 6 mol / 1

80 80

8x 8x

16x 16x

32x 32x

16x 16x

8x 8x

Harnstoff urea

100 100

8x 8x

16x 16x

— -

120 120

8x 8x

16x 16x

8x 8x

0 0

Lösung solution

60 60

8x 8x

16x 16x

8x mit 2 Mol/1 8x with 2 mol / 1

80 80

8x 8x

16x 16x

8x 8x

'8x '8x

Guanidin Guanidine

100 100

8x 8x

16x 16x

8x 8x

16x 16x

8x 8x

0 0

Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. * Als Mass des HB-Ag-Titers wird der Wert für die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren noch nachweisen lässt. The solutions to be examined were successively diluted to twice the volume. * The measure for the HB-Ag titer is the value for the maximum dilution of the solution at which HB-Ag can still be detected using the IES method.

«—» bedeutet, dass keine Messung durchgeführt wurde. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten und Erhitzungstemperaturen ab, bei denen sich der HB-Ag-Titer erhöht. «-» means that no measurement was carried out. The dashed line gives the limit for the heating times and heating temperatures at which the HB-Ag titer increases.

Als Denaturierungsmittel bzw. entfaltend wirkende Mittel werden erfindungsgemäss Verbindungen verwendet, die auf native Proteine, die aus Polypeptidketten bestehen, unter Einwirkung auf ionische oder andere schwache Bindungen entfaltend wirken. Besonders bevorzugt sind Harnstoff und Guani-dinhydrochlorid. Es ist bekannt, dass die Wirkung dieser entfaltend wirkenden Mittel eintritt, wenn sie in relativ hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Im erfindungsgemässen Verfahren werden Konzentrationen von 2 bis 8 Mol/1 vorzugsweise 6 bis 8 Mol/1 eingesetzt. Bei relativ niedrigen Konzentrationen sind längere Zeiten bis zum Erreichen des erhöhten HB-Ag-Titers erforderlich, der dann aber länger anhält. According to the invention, compounds are used as denaturing agents or agents which unfold, which act on native proteins which consist of polypeptide chains, acting on ionic or other weak bonds. Urea and guanidine hydrochloride are particularly preferred. It is known that these unfolding agents are effective when used in relatively high concentrations. Concentrations of 2 to 8 mol / 1, preferably 6 to 8 mol / 1, are used in the process according to the invention. At relatively low concentrations, longer times are required until the increased HB-Ag titer is reached, which then lasts longer.

Unter menschlichen Plasmaproteinen, die im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können, sind nicht nur solche zu verstehen, die HB-Ag enthalten, das tatsächlich Hepatitis beim Menschen hervorrufen kann, sondern auch alle anderen Proteine, in denen sich HB-Ag nach dem IES-Verfah-ren oder radioimmunologisch (im folgenden als RIA-Verfah-ren bezeichnet; vgl. Shigeshi Toyoshima et al., «Pediatrie Clinic», Bd. 24 [1971], S. 3044), nachweisen lässt. Es können also Plasma, Serum und verschiedene Proteinfraktionen, die sich durch übliche Fraktionierungsmethoden aus Plasmaprotein erhalten lassen, verwendet werden. Human plasma proteins which can be used in the method according to the invention are not only to be understood as those which contain HB-Ag, which can actually cause hepatitis in humans, but also all other proteins in which HB-Ag follows the IES method -ren or radioimmunological (hereinafter referred to as the RIA method; cf. Shigeshi Toyoshima et al., "Pediatrie Clinic", Vol. 24 [1971], p. 3044). Plasma, serum and various protein fractions which can be obtained from plasma protein by conventional fractionation methods can thus be used.

HB-Ag weist eine veränderliche Gestalt und Grösse auf, wie sich elektronenmikroskopisch feststellen liess. Die Infektivität von HB-Ag hängt spezifisch von der einzelnen Plasmaproteinfraktion ab, die HB-Ag enthält. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen Gehalts an HB-Ag, bestimmt nach dem RIA-Verfahren, eine wesentlich höhere Hepatitis-Infektivität auf als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Fibrinogenfraktion stark infektiöse Teilchen enthält. Die nach dem RIA-Verfahren bestimmte HB-Ag-Menge in einer Albuminfraktion entspricht zumindest der in der Fibrinogenfraktion enthaltenen Menge, während ihre Infektivität so gering ist, dass sie kaum ausreicht, Hepatitis zu verursachen, wenn das Präparat 10 Stunden bei 60° C einer Hitzebehandlung unterzogen wird. Anderseits enthalten a- und /3-Globulinfrak-tionen mehr HB-Ag als die Albuminfraktion. Demgemäss ist die HB-Ag-Menge, die sich in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin- und Haptoglobinpräparaten nachweisen 30 lässt, höher als im Albuminpräparat. Werden diese Transferrin- und Haptoglobinpräparate jedoch der gleichen Hitzebehandlung wie das Albuminpräparat unterzogen, so verursachen sie beim Menschen keine Hepatitis. Es ist daher anzunehmen, dass das in diesen a- und ß-Globulinfraktionen enthaltene 35 HB-Ag eine niedrige Infektivität aufweist. HB-Ag has a variable shape and size, as can be determined by electron microscopy. The infectivity of HB-Ag depends specifically on the single plasma protein fraction that contains HB-Ag. For example, despite its low HB-Ag content, determined by the RIA method, a fibrinogen fraction has a significantly higher hepatitis infectivity than other plasma protein fractions. This is probably due to the fact that the fibrinogen fraction contains highly infectious particles. The amount of HB-Ag in an albumin fraction determined by the RIA method corresponds at least to the amount contained in the fibrinogen fraction, while its infectivity is so low that it is barely sufficient to cause hepatitis if the preparation is at 60 ° C for 10 hours Is subjected to heat treatment. On the other hand, a- and / 3-globulin fractions contain more HB-Ag than the albumin fraction. Accordingly, the amount of HB-Ag which can be detected in transferrin and haptoglobin preparations fractionated from these fractions is higher than in the albumin preparation. However, if these transferrin and haptoglobin preparations are subjected to the same heat treatment as the albumin preparation, they do not cause hepatitis in humans. It can therefore be assumed that the 35 HB-Ag contained in these a- and ß-globulin fractions has a low infectivity.

Im Verfahren der Erfindung werden als Ausgangsmaterialien vorzugsweise Plasma und Serum eingesetzt, die grosse Mengen an HB-Ag enthalten, insbesondere a- und /3-Globulinfraktionen, die grosse HB-Ag-Mengen enthalten und eine 40 niedrige Infektivität aufweisen. Diese Fraktionen werden zweckmässigerweise als Neben- und Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen erhalten, Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Plasmaproteinfraktionen werden nach üblichen Verfahren zur 45 Fraktionierung von Plasmaproteinen erhalten, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Fraktionierung mit Äthanol in der Kälte nach Cohn; vgl. E. J. Cohn, L. E. Strong, W. L. Hughes, D. J. Mulford, J. N. Ashworth, M. Me-lin und H. L. Taylor, Journal of the American Chemical Socie-50 ty, Bd. 68 (1946), S. 459. Beispielsweise werden die a- und ß -Globulinfraktionen als Fraktionen IV und IV-1 nach der Cohnschen Fraktionierung oder durch Fällung mit Ammoniumsulfat zwischen 35 Prozent und 50 Prozent Sättigung erhalten. Falls eine wässerige Lösung der Proteinfraktion trüb 55 ist, kann sie zur Erleichterung der nachfolgenden Behandlung geklärt werden. Die Klärung wird beispielsweise durch Zentri-fugation oder durch Erhitzen der Lösung auf etwa 60° C bei neutralem pH-Wert und anschliessendem Abfiltrieren der gebildeten Niederschläge durchgeführt. Plasma and serum which contain large amounts of HB-Ag, in particular α- and / 3-globulin fractions which contain large amounts of HB-Ag and have a low infectivity, are preferably used as starting materials in the process of the invention. These fractions are expediently obtained as minor and sub-fractions when obtaining other valuable plasma protein fractions. The plasma protein fractions used in the process according to the invention are obtained by customary methods for fractionating plasma proteins, for example by precipitation with ammonium sulfate or by fractionation with ethanol in the cold according to Cohn; see. EJ Cohn, LE Strong, WL Hughes, DJ Mulford, JN Ashworth, M. Me-lin and HL Taylor, Journal of the American Chemical Socie-50 ty, Vol. 68 (1946), p. 459. For example, the a- and β-globulin fractions as fractions IV and IV-1 after the Cohn fractionation or by precipitation with ammonium sulfate between 35 percent and 50 percent saturation. If an aqueous solution of the protein fraction is cloudy 55, it can be clarified to facilitate subsequent treatment. The clarification is carried out, for example, by centrifugation or by heating the solution to about 60 ° C. at neutral pH and then filtering off the precipitates formed.

60 Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das HB-Ag enthaltende Ausgangsmaterial in einem wässerigen Medium in Gegenwart des genannten entfaltend wirkenden Mittels erhitzt. Beispiele für wässerige Medien sind Wasser und physiologisch verträgliche wässerige Salzlösungen, 65 insbesondere physiologische Kochsalzlösung. Der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung liegt zweckmässigerweise im Neutralbereich und wird auf einem Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, gehalten. Um die Lösung auf dem gewünschten pH- 60 When carrying out the process according to the invention, the HB-Ag-containing starting material is heated in an aqueous medium in the presence of the said detergent. Examples of aqueous media are water and physiologically compatible aqueous salt solutions, in particular physiological saline. The pH of the solution to be heated is expediently in the neutral range and is kept at a value of 5 to 9, preferably 6.5 to 7.5. To bring the solution to the desired pH

617 350 617 350

4 4th

Wert zu halten, ist die Verwendung eines Puffers empfehlenswert. Es können anorganische Puffer, wie Phosphate und Carbonate, oder organische Puffer, wie Acetate, Trisaminome-thanhydrochlorid und Glycinhydrochlorid, verwendet werden. To keep value, the use of a buffer is recommended. Inorganic buffers such as phosphates and carbonates or organic buffers such as acetates, trisaminomethane hydrochloride and glycine hydrochloride can be used.

Wie bereits erwähnt, werden die Lösungen auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt. Die Zeitdauer, während der die Lösung erhitzt wird, hängt von der Temperatur ab. Auf jeden Fall wird sie so gewählt, dass sie ausreicht, um die Infektivität zu beseitigen und die durch den HB-Ag-Titer wiedergegebene antigene Wirkung zu erhöhen. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann die Erhitzungsdauer gegenüber den herkömmlichen Verfahren verlängert werden. Demgemäss kann bei Verwendung des entfaltend wirkenden Mittels in niedrigen Konzentrationen die übliche Erhitzungsdauer von 10 Stunden bei 60° C, die bisher beispielsweise bei der Hitzebehandlung von Albuminfraktionen und a- und ^-Globulinfraktionen angewendet wurde, auf mehr als 24 Stunden bei 100° C verlängert werden. Eine herkömmliche Erhitzungsdauer von 3 Minuten kann auf Zeiträume von 30 Minuten bis mehr als 6 Stunden ausgedehnt werden. Bei der Verwendung des entfaltend wirkenden Mittels in hohen Konzentrationen können herkömmliche Erhitzungszeiten von 3 Minuten bei 100° C auf 10 Minuten bis mehr als 6 Stunden verlängert werden. Auch bei anderen Temperaturen lassen sich die herkömmlichen Erhitzungszeiten verlängern, so dass die Infektivität gesenkt und die antigene Wirkung gesteigert wird. Wenn innerhalb des Bereichs der so verlängerten Erhitzungszeiten (bei verschiedenen Temperaturen) eine relativ kurze Erhitzungszeit gewählt wird, bei der die Infektivität beseitigt und die antigene Wirkung gesteigert wird, ist es möglich, ein Vaccin zu erhalten, dessen Infektivität nicht höher liegt als die von herkömmlichen Vaccinen und dessen antigene Wirkung, wiedergegeben durch den HB-Ag-Titer, höher als vor dem Erhitzen ist. Anderseits kann bei der Wahl relativ langer Erhitzungszeiten innerhalb des vorerwähnten Zeitraums inaktiviertes HB-Ag erhalten werden, dessen antigene Wirkung gesteigert und dessen Infektivität wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist. As already mentioned, the solutions are heated to temperatures of 60 to 120 ° C. The length of time that the solution is heated depends on the temperature. In any case, it is chosen so that it is sufficient to eliminate the infectivity and to increase the antigenic effect reproduced by the HB-Ag titer. According to the method according to the invention, the heating time can be extended compared to the conventional methods. Accordingly, when using the unfolding agent in low concentrations, the usual heating time of 10 hours at 60 ° C, which was previously used, for example, in the heat treatment of albumin fractions and α- and ^-globulin fractions, can be extended to more than 24 hours at 100 ° C will. A conventional 3 minute heating period can be extended to periods from 30 minutes to more than 6 hours. When using the unfolding agent in high concentrations, conventional heating times can be extended from 3 minutes at 100 ° C to 10 minutes to more than 6 hours. The conventional heating times can also be extended at other temperatures, so that the infectivity is reduced and the antigenic effect is increased. If, within the range of heating times thus prolonged (at different temperatures), a relatively short heating time is chosen in which the infectivity is eliminated and the antigenic effect is increased, it is possible to obtain a vaccine whose infectivity is no higher than that of conventional ones Vaccines and their antigenic effect, as represented by the HB-Ag titer, are higher than before the heating. On the other hand, if relatively long heating times are selected within the aforementioned period, inactivated HB-Ag can be obtained, its antigenic effect is increased and its infectivity is significantly reduced or completely eliminated.

Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebenenfalls durch Filtrieren geklärt und anschliessend gegen eine isotonische Lösung, beispielsweise eine isotonische Kochsalzlösung, dialysiert, um Stabilisatoren, Puffersalze und gebildete niedermolekulare Substanzen zu entfernen, wodurch ein erfin-dungsgemässes Vaccin erhalten wird. After the heat treatment, the solution is clarified, if necessary, by filtration and then dialyzed against an isotonic solution, for example an isotonic saline solution, in order to remove stabilizers, buffer salts and low-molecular substances formed, whereby a vaccine according to the invention is obtained.

Durch Dialyse unter vermindertem Druck gemäss einem üblichen Verfahren kann die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten Verbindungen eingeengt werden. Das so erhaltene Vaccin wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt. Nach Passieren eines Sterilfilters erhält man ein Vaccin, das zur Verabfolgung an Menschen geeignet ist. By dialysis under reduced pressure according to a conventional method, the solution can be concentrated at the same time as the removal of the aforementioned compounds. The vaccine thus obtained is adjusted to an appropriate concentration. After passing through a sterile filter, a vaccine is obtained which is suitable for administration to humans.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten HB-Ag-Vaccine weisen im Vergleich zu herkömmlichen Vac-cinpräparaten die gleiche oder eine höhere HB-Ag-Antigen-kapazität auf und sind in ihrer Anwendung beim Menschen sicherer. The HB-Ag vaccines produced by the process according to the invention have the same or a higher HB-Ag antigen capacity than conventional Vac-cin preparations and are safer to use in humans.

Der Vorteil der erfindungsgemäss hergestellten HB-Ag-Vaccine liegt nicht nur in ihrer starken antigenen Wirkung, sondern auch in ihrer starken Antikörperbildung nach Verabfolgung an den Menschen. Werden beispielsweise durch 1- bis 3minutiges Erhitzen des gleichen Ausgangsmaterials auf 98° C ein Vaccin nach dem erfindungsgemässen Verfahren und eine nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, wobei beide Vaccine in bezug auf ihren HB-Ag-Titer identisch eingestellt sind, und werden diese Vaccine intramuskulär verabfolgt, so ist die Antikörpermenge, die sich im Serum des Patienten mit dem erfindungsgemäss hergestellten Vaccin einige Male grösser als die entsprechende Menge bei einem Patienten, der mit dem herkömmlichen Vaccin behandelt worden ist. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich also Vaccine erhalten, die in ihrer Antikörperbildung aktiviert sind. Dies bedeutet im Zusammenhang mit der Steigerung des HB-Ag-Titers durch Erhitzen, dass es gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung des gleichen Aus-gangsmaterials möglich ist, ein Vaccin herzustellen, das eine wesentlich höhere Antikörperbildung als ein herkömmlich hergestelltes Vaccin aufweist. The advantage of the HB-Ag vaccines produced according to the invention lies not only in their strong antigenic action, but also in their strong antibody formation after administration to humans. For example, if the same starting material is heated to 98 ° C. for 1 to 3 minutes, a vaccine is produced by the process according to the invention and one by a conventional process, both vaccines having the same HB-Ag titer, and these vaccines become intramuscular administered, the amount of antibody which is in the patient's serum with the vaccine produced according to the invention is several times greater than the corresponding amount in a patient who has been treated with the conventional vaccine. Vaccines which are activated in their antibody formation can thus be obtained by the process according to the invention. In connection with the increase in the HB-Ag titer by heating, this means that it is possible according to the method according to the invention using the same starting material to produce a vaccine which has a significantly higher antibody formation than a conventionally produced vaccine.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen ist der HB-Ag-Titer durch die maximale Verdünnung der zu untersuchenden Lösung, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Ver-fahren noch nachweisen lässt, angegeben. Das HB-Ab enthaltende Serum wird jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. Der HB-Ab-Titer wird als maximale Verdünnung des Serums angegeben, bei der sich HB-Ab nach dem IES-Verfahren unter Verwendung eines Standardserums, dessen HB-Ag-Titer lx ist, noch nachweisen lässt. The examples illustrate the invention. In the examples, the HB-Ag titer is given by the maximum dilution of the solution to be examined, at which HB-Ag can still be detected using the IES method. The serum containing HB-Ab is diluted to twice the volume. The HB-Ab titer is given as the maximum dilution of the serum at which HB-Ab can still be detected by the IES method using a standard serum whose HB-Ag titer is lx.

Beispiel 1 example 1

100 ml gesammeltes Plasma mit einem HB-Ag-Titer von 8x werden nach dem Cohnschen Verfahren mit Äthanol fraktioniert. Die Fraktion IV-1 wird mit Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7,6 gebracht und anschliessend 10 Minuten auf 100° C erhitzt. Nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhält man eine klare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 16x. 180 ml dieser Lösung werden mit Harnstoff bis zu einer Harnstoff-Konzentration von 6 Mol/1 versetzt und anschliessend 1 Stunde auf 85° C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer der Lösung auf 32x erhöht. Anschliessend wird die Lösung unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert, wobei die Phosphate und der Harnstoff entfernt werden. Sodann wird die Lösung durch ein Sterilfilter gegeben. Man erhält 80 ml einer injizierbaren Lösung. 100 ml of collected plasma with an HB-Ag titer of 8x are fractionated with ethanol using the Cohn method. Fraction IV-1 is brought to pH 7.6 with phosphate buffer and then heated to 100 ° C. for 10 minutes. After removing the precipitate formed, a clear solution with an HB Ag titer of 16x is obtained. 180 ml of this solution are mixed with urea up to a urea concentration of 6 mol / 1 and then heated at 85 ° C. for 1 hour, the HB-Ag titer of the solution increasing to 32 ×. The solution is then dialyzed under reduced pressure against an isotonic saline solution, the phosphates and the urea being removed. The solution is then passed through a sterile filter. 80 ml of an injectable solution are obtained.

Beispiel 2 Example 2

10 Liter gesammeltes Plasma mit einem HB-Ag-Titer von 4x werden einer üblichen Ammoniumsulfatfällung unterworfen. Die zwischen einer 30- und 50prozentigen Ammoniumsulfatsättigung erhaltenen a- und/3-Globulinfraktionen werden gegen Wasser dialysiert. Nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhält man eine klare wässerige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 64x. 500 ml dieser Lösung werden bis zu einer Harnstoff-Konzentration von 2 Mol/1 mit Harnstoff versetzt und anschliessend 1 Stunde auf 105° C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer auf 128 x erhöht. Anschliessend wird die Lösung zur Entfernung des Harnstoffs gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert. Nach dem Abfiltrieren der gebildeten Niederschläge wird durch Ultrafiltration eine Konzentration bis zu einem HB-Ag-Titer von 2048 X erreicht. Sodann wird durch ein Sterilfilter gegeben. Man erhält 21 ml eines injizierbaren Vaccins in isotonischer Kochsalzlösung. 10 liters of collected plasma with a HB-Ag titer of 4x are subjected to a normal ammonium sulfate precipitation. The a- and / 3-globulin fractions obtained between 30 and 50 percent ammonium sulfate saturation are dialyzed against water. After removing the precipitate formed, a clear aqueous solution with an HB-Ag titer of 64x is obtained. 500 ml of this solution are mixed with urea up to a urea concentration of 2 mol / l and then heated at 105 ° C. for 1 hour, the HB-Ag titer increasing to 128 ×. The solution is then dialyzed against an isotonic saline solution to remove the urea. After the precipitates formed have been filtered off, a concentration up to an HB Ag titer of 2048 X is reached by ultrafiltration. Then passed through a sterile filter. 21 ml of an injectable vaccine in isotonic saline are obtained.

Beispiel 3 Example 3

1000 ml gesammeltes Plasma mit einem HB-Ag-Titer von 4x werden gemäss dem Cohn'schen Verfahren fraktioniert. Die Fraktion IV-1 wird gegen Wasser dialysiert und anschliessend 1 Stunde zur Ausfällung unerwünschter Proteine auf 60° C erhitzt. Nach dem Entfernen der Niederschläge durch Zentrifugation wird zu dem erhaltenen Überstand von 100 ml Volumen eine konzentrierte Ammoniumsulfatlösung gegeben, bis eine 50prozentige Ammoniumsulfatsättigung erreicht ist. Anschliessend wird 30 Minuten gerührt, wodurch die Fällung vervollständigt wird. Die Niederschläge werden abzen-trifugiert und anschliessend in einer geringen Menge Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen einen Natriumchlorid enthaltenden isotonischen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 dialysiert. Man erhält 20 ml einer Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 125 x. Diese Lösung wird bis zu einer Guanidinhy-drochlorid-Konzentration von 2 Mol/1 mit Guanidinhydrochlo- 1000 ml of collected plasma with a HB-Ag titer of 4x are fractionated according to the Cohn method. Fraction IV-1 is dialyzed against water and then heated to 60 ° C. for 1 hour to precipitate undesired proteins. After removing the precipitates by centrifugation, a concentrated ammonium sulfate solution is added to the resulting supernatant of 100 ml volume until a 50 percent ammonium sulfate saturation is reached. The mixture is then stirred for 30 minutes, which completes the precipitation. The precipitates are centrifuged off and then dissolved in a small amount of water. The solution obtained is dialyzed against an isotonic phosphate buffer containing pH 7.2 and sodium chloride. 20 ml of a solution with an HB Ag titer of 125 × are obtained. This solution is mixed with guanidine hydrochloride up to a guanidine hydrochloride concentration of 2 mol / l.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

617 350 617 350

rid versetzt und anschliessend 20 Minuten auf 100° C erhitzt, wodurch sich der HB-Ag-Titer auf 250x erhöht. Die in der Lösung gebildeten geringen Mengen eines Niederschlags werden abzentrifugiert. Nach Passieren eines Sterilfilters erhält man 20 ml einer injizierbaren Lösung. rid added and then heated to 100 ° C for 20 minutes, which increases the HB-Ag titer to 250x. The small amounts of a precipitate formed in the solution are centrifuged off. After passing through a sterile filter, 20 ml of an injectable solution is obtained.

Beispiel 4 Example 4

Die in Beispiel 2 hergestellte klare wässerige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 64x wird 30 Minuten auf 100° C erhitzt. Die erhaltene antigene Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 16x wird gemäss Beispiel 1 eingeengt. Man erhält eine Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 2048 x. Diese Lösung (im folgenden als «nichtaktiviertes Vaccin» bezeichnet) und die gemäss Beispiel 2 erhaltene Vaccinelösung mit einem HB-Ag-Titer von 2048x (im folgenden als «aktivierte Vaccin» bezeichnet) werden in Verbindung mit dem Freundschen kompletten Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen durch Injektion verwendet. 3 Wochen lang werden jedem Kaninchen pro Woche 0,5 ml Vaccin sub- und intrakutan verabfolgt. Sodann wird die Behandlung für einen Monat unterbrochen. Anschliessend werden nochmals 3 Injektionen in der vorbeschriebenen Weise vorgenommen. 1 Woche nach der letzten Injektion wird Blut aus dem Herzen der Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums entnommen. Das Antiserum wird in einem The clear aqueous solution prepared in Example 2 with an HB Ag titer of 64 × is heated to 100 ° C. for 30 minutes. The antigenic solution obtained with an HB-Ag titer of 16x is concentrated according to Example 1. A solution with an HB Ag titer of 2048 × is obtained. This solution (hereinafter referred to as "non-activated vaccine") and the vaccine solution obtained according to Example 2 with an HB-Ag titer of 2048x (hereinafter referred to as "activated vaccine") are used in conjunction with Freund's complete adjuvant for immunizing rabbits used by injection. Each rabbit is given 0.5 ml of vaccine subcutaneously and intracutaneously per week for 3 weeks. The treatment is then interrupted for a month. Then another 3 injections are carried out in the manner described above. One week after the last injection, blood is drawn from the heart of the rabbits to collect an antiserum. The antiserum is in one

Serum, das kein HB-Ag enthält, absorbiert, um ein spezifisches Antiserum gegen HB-Ag herzustellen. Serum that does not contain HB-Ag is absorbed to produce a specific antiserum against HB-Ag.

Von den Antiseren, die aus 8 mit dem nichtaktivierten Vaccin immunisierten Kaninchen stammen, weist eines ein 5 HB-Ab-Titer von 8x, drei einen Titer von 4x, drei einen Titer von 2x und eines keinen messbaren Titer auf. Der Durchschnittswert beträgt 3,3x. Von den zehn mit dem aktivierten Vaccin immunisierten Kaninchen zeigen fünf Antiseren einen HB-Ab-Titer von 16x, drei einen Titer von 8x, eines einen io Titer von 2 x und eines einen Titer von 1 x. Der Durchschnittswert beträgt 10,7 x. Dies zeigt, dass bei Immunisierung von Kaninchen mit aktiviertem bzw. nichtaktiviertem Vaccin, die in bezug auf ihren HB-Ag-Titer gleichwertig sind, die Masszahl der in mit dem aktivierten Vaccin immunisierten Kais ninchen gebildeten Antikörper-Titer etwa dreimal so gross ist wie die Masszahl der Antikörper-Titer, die in Kaninchen, die mit dem nichtaktivierten Vaccin immunisiert sind, gebildet werden. Wird ausserdem der zweifache Anstieg im HB-Ag-Ti-ter des aktivierten Vaccins berücksichtigt, der auf Zusatz von 20 Harnstoff oder einem entsprechenden auf Proteine entfaltend wirkenden Mittel zurückzuführen ist, so ist die Antikörperbildung des aktivierten Vaccins etwa sechsmal grösser als die des nichtaktivierten Vaccins. Of the antisera derived from 8 rabbits immunized with the unactivated vaccine, one has a 5 HB Ab titer of 8x, three a titer of 4x, three a titer of 2x and one no measurable titer. The average value is 3.3x. Of the ten rabbits immunized with the activated vaccine, five antisera show an HB Ab titer of 16x, three a titer of 8x, one an OK titer of 2 x and one a titer of 1 x. The average value is 10.7 x. This shows that when rabbits are immunized with activated or unactivated vaccine, which are equivalent in terms of their HB-Ag titer, the number of antibody titers formed in rabbits immunized with the activated vaccine is approximately three times as large as that Measure of the antibody titers that are formed in rabbits immunized with the unactivated vaccine. If the two-fold increase in HB-Ag titer of the activated vaccine is also taken into account, which can be attributed to the addition of 20 urea or a corresponding protein-developing agent, the antibody formation of the activated vaccine is approximately six times greater than that of the unactivated vaccine .

s s

Claims

617 350617 350

1. Verfahren zur Herstellung von entfalteten HB-Ag-Vac-cinen mit starker Antikörperbildung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung von HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart einer Verbindung, die die Disul-fidbrücken des Eiweisses zu spalten vermag, eine ausreichende Zeit auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt, wodurch die Disulfidbrücken des Eiweisses gespalten werden und dadurch die Infektivität des HB-Ag verlorengeht und dessen antigene Wirkung erhöht wird, die entfaltend wirkende Verbindung entfernt und die Lösung in eine physiologisch verträgliche Form bringt. 1. A process for the preparation of unfolded HB-Ag vaccines with strong antibody formation, characterized in that an aqueous solution of HB-Ag-containing plasma protein in the presence of a compound which is able to cleave the disulfide bridges of the protein is sufficient Time heated to temperatures from 60 to 120 ° C, whereby the disulfide bridges of the protein are split and thereby the infectivity of HB-Ag is lost and its antigenic effect is increased, the unfolding compound is removed and the solution is brought into a physiologically acceptable form.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als HB-Ag enthaltendes Plasmaprotein a- undß-Globulinfraktionen verwendet. 2. The method according to claim 1, characterized in that a-andß-globulin fractions are used as the plasma protein containing HB-Ag.

2 2nd

PATENTANSPRÜCHE PATENT CLAIMS

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Erhitzen so lange durchführt, bis der Antigentiter ansteigt. 3. The method according to claim 1, characterized in that one carries out the heating until the antigen titre rises.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung des HB-Ag enthaltenden Plasmaproteins mit einem pH-Wert von 5 bis 6 verwendet. 4. The method according to claim 1, characterized in that one uses an aqueous solution of the HB-Ag-containing plasma protein with a pH of 5 to 6.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung mit einem pH-Wert von etwa 7 verwendet. 5. The method according to claim 4, characterized in that one uses a solution with a pH of about 7.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Puffer eingestellt wird. 6. The method according to claim 4, characterized in that one uses an aqueous solution, the pH of which is adjusted with a buffer.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Phosphatpuffer eingestellt worden ist. 7. The method according to claim 6, characterized in that one uses a solution whose pH has been adjusted with a phosphate buffer.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die entfaltend wirkende Verbindung in einer Konzentration von 2 bis 5 Mol/1 verwendet. 8. The method according to claim 1, characterized in that one uses the unfolding compound in a concentration of 2 to 5 mol / 1.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung des HB-Ag enthaltenden Plasmaproteins verwendet, die vorher geklärt worden ist. 9. The method according to claim 1, characterized in that one uses an aqueous solution of the HB-Ag-containing plasma protein, which has been previously clarified.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die entfaltend wirkende Verbindung durch Dialyse der wässerigen Lösung gegen eine physiologisch verträgliche Lösung entfernt. 10. The method according to claim 1, characterized in that one removes the unfolding compound by dialysis of the aqueous solution against a physiologically compatible solution.

11. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung durch Sterilfiltration in eine physiologisch verträgliche Form bringt. 11. The method according to claim 1, characterized in that the solution is brought into a physiologically acceptable form by sterile filtration.