La présente invention a pour objet un procédé de production de lycopène par biosynthèse.
Le lycopéne est un pigment rouge naturel que l'on trouve notamment dans plusieurs espèces de fruits, dont la tomate, lorsqu'ils arrivent à maturité. Son utilisation est largement répandue dans l'industrie alimentaire.
On connaît divers procédés de production de lycopéne par voie de fermentation. Parmi les micro-organismes producteurs utilisés, on peut citer Blakeslea trispora ou Streptomyces ch resto- myceticus var. rubescens, par exemple. Un micro-organisme du genre Flavobacter est, lui, connu pour ses facultés de synthèse de la zéaxanthine et se prête à la production industrielle par biosynthèse de ce pigment caroténoïde jaune. On sait qu'il en va de même de certains mutants obtenus par action de la l-méthyl-3nitro- I-nitrosoguanidine (NTG) sur un tel micro-organisme au sein d'un milieu nutritif solidifié dont la source principale de carbone assimilable est le glucose.
Le procédé de production de lycopène selon l'invention est caractérisé par le fait que l'on fait agir de la l-méthyl-3-nitro-lnitrosoguanidine sur un micro-organisme du genre Flavobacter au sein d'un milieu nutritif solidifié dont la source principale de carbone assimilable est le saccharose, que l'on obtient un mutant producteur de lycopéne et que l'on cultive le mutant dans un milieu nutritif aqueux.
On a constaté, en effet, qu'il est possible d'obtenir ainsi des colonies rouges au lieu de colonies jaunes lors d'un traitement au
NTG en milieu nutritif solide d'un micro-organisme du genre
Flavobacter producteur de zéaxanthine et que l'on peut ensuite cultiver en milieu nutritif aqueux usuel le mutant ainsi obtenu, qui est producteur de lycopène.
Dans ce qui précède, comme dans ce qui va suivre, on utilise l'expression micro-organisme du genre Flavobacter pour désigner un micro-organisme choisi parmi les bactéries de ce genre ou un mutant d'un tel micro-organisme. Par l'expression milieu nutritif, on entend désigner un milieu de culture contenant les substances nécessaires à la croissance et à la vie du micro-organisme, à savoir au moins une source de carbone assimilable, au moins une source d'azote assimilable, des vitamines et des oligo-éléments.
Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on peut préparer une culture initiale d'une bactérie du genre Flavobacter productrice de zéaxanthine dans un milieu nutritif aqueux, diluer cette culture dans une solution physiologique stérile et mélanger dans une boîte de Petri la solution diluée de culture avec une solution aqueuse de NTG. On peut effectuer le mélange à raison de 1 volume de solution diluée de culture pour 1 volume de solution aqueuse contenant 1 à 20 mg de NTG par ml. On peut verser alors de l'agar fondu sur la solution obtenue et mélanger soigneusement le tout. Lorsque l'agar est solidifié, on peut maintenir ce milieu solide à une température d'incubation convenable, comprise par exemple entre 20 et 30go, jusqu'à ce que des colonies rouges y apparaissent.
On peut prélever et repiquer plusieurs fois de suite les colonies rouges sur des supports nutritifs solides.
On peut soumettre le micro-organisme mutant ainsi obtenu à un ou plusieurs traitements de mutation ultérieurs analogues en milieu solidifié.
La souche mutante peut être ensuite inoculée à un milieu nutritif aqueux contenant les substances nécessaires à la croissance du micro-organisme. La culture peut être poursuivie sous aération et agitation, pour permettre une oxygénation suffisante, à une température comprise entre 20 et 30 C, de préférence entre 22 et 25 C, et à un pH compris entre 6,5 et 8, de préférence entre 7 et 7,5, durant un temps suffisant pour obtenir une quantité substantielle de lycopène dans le bouillon de culture par centrifugation ou filtration, par exemple. La biomasse peut trouver des utilisations en tant que telle, pour la coloration de produits alimentaires, potages à la tomate ou desserts aux fruits par exemple, ou être soumise à un traitement d'extraction à l'aide d'un solvant organique polaire.
On a vu que la source principale de carbone assimilable dans le milieu nutritif solide doit être le saccharose. Une source principale de carbone assimilable pour le milieu nutritif aqueux peut être choisie parmi les sucres tels que le glucose, le lactose ou le sucrose, par exemple.
Parmi les substances susceptibles d'entrer dans la composition d'une source principale d'azote aminé pour le milieu nutritif solide et pour le milieu nutritif aqueux, on peut citer, par exemple, la liqueur de trempage de maïs, les extraits de levure, les hydrolysats de protéine, en particulier les produits obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de protéines d'origine végétale telles que les protéines de soja ou d'arachide, ou l'hydrolysat de caséine appelé tryptone.
Cette source d'azote aminé peut également contenir une substance préparée par hydrolyse acide ou enzymatique d'une biomasse récupérée à titre de sous-produit de la biosynthèse d'un pigment caroténoîde par culture d'une bactérie du genre Flavobacter, en particulier par hydrolyse d'une biomasse de Flavobacter cultivée pour préparer du lycopène et dont on a extrait le pigment.
Qu'il s'agisse du milieu nutritif aqueux dans lequel on prépare la culture initiale ou du milieu nutritif aqueux dans lequel on cultive la souche mutante, la source principale de carbone assimilable peut représenter de 0,1 à 15% en poids du milieu et la source principale d'azote assimilable peut représenter de 0,1 à 8% en poids du milieu. On peut y ajouter également du sulfate de magnésium dans la proportion de 0,1 à 2% en poids. La balance aux 100% peut être faite par de l'eau du robinet, par exemple.
Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration.
Exemple 1:
On prépare une culture d'une souche du genre Flavobacter (ATCC N" 21588) dans un milieu nutritif aqueux dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
Saccharose 3,0%
Extrait de levure 1,0%
Hydrolysat de caséine (tryptone) 1,0%
Sulfate de magnésium 0,5%
Eau du robinet balance à 100%
Cette culture, qui contient 5 g de cellules du micro-organisme par litre de milieu nutritif, est ensuite diluée dans le rapport 1:10s (en volume) par une série d'opérations successives dans une solution physiologique stérile contenant 0,9% en poids de chlorure de sodium.
On mélange ensuite soigneusement 1 ml de cette solution avec 1 ml d'une solution aqueuse de NTG contenant 5 mg/ml de cette substance, dans une boite de Petri. On ajoute ensuite 10 ml d'agar fondu sur la solution ainsi préparée et l'on mélange complètement l'agar et la solution. Lorsque l'agar est solidifié, la boîte de Petri est incubée à une température de l'ordre de 25 à 28 C, jusqu'à l'apparition de colonies rouges dans le milieu solidifié, c'est-à-dire pendant 2 à 4 j. On sépare ensuite les colonies rouges de la boite de Petri, puis on les étale sur des supports en agar nutritif en l'absence de NTG, en plusieurs opérations successives.
La souche mutante obtenue est inoculée à raison de 5% en volume à un milieu nutritif stérile placé dans des flacons dont le pH est ajusté à 7,3 et dont la composition est la suivante:
Glucose 3,0%
Extrait de levure 1,0%
Hydrolysat de caséine (tryptone) 1,0%
Sulfate de magnésium 0,5%
Eau du robinet balance à 100%
La culture de la souche dans ce milieu est poursuivie durant 48 h à une température de 25 C, le milieu étant constamment aéré par agitation des flacons sur des agitateurs à mouvements rotatifs exécutés à 200 t/mn pour une excentricité de 8 cm. Les flacons sont alors centrifugés et l'on recueille la masse cellulaire qui représente 10 g de matière sèche par litre de bouillon de culture.
La concentration spécifique de lycopéne dans cette biomasse est de 8 mg de pigment par g de matière sèche, ce qui correspond à une production de 80 ug de lycopène par ml de bouillon de culture.
The present invention relates to a process for producing lycopene by biosynthesis.
Lycopene is a natural red pigment that is found in several species of fruits, including tomato, when they reach maturity. Its use is widely used in the food industry.
Various methods of producing lycopene by fermentation are known. Among the producing microorganisms used, mention may be made of Blakeslea trispora or Streptomyces ch restomyceticus var. rubescens, for example. A microorganism of the genus Flavobacter is known for its zeaxanthin synthesis faculties and lends itself to industrial production by biosynthesis of this yellow carotenoid pigment. It is known that the same applies to certain mutants obtained by the action of l-methyl-3nitro-I-nitrosoguanidine (NTG) on such a microorganism in a solidified nutrient medium, the main source of which can be assimilated carbon. is glucose.
The method for producing lycopene according to the invention is characterized by the fact that l-methyl-3-nitro-lnitrosoguanidine is made to act on a microorganism of the genus Flavobacter in a solidified nutrient medium, the substance of which is The main source of assimilable carbon is sucrose, which is obtained from a lycopene-producing mutant and the mutant is cultured in an aqueous nutrient medium.
It has been found, in fact, that it is thus possible to obtain red colonies instead of yellow colonies during a treatment with
NTG in a solid nutrient medium of a microorganism of the genus
Flavobacter zeaxanthin producer and which can then be cultivated in usual aqueous nutrient medium the mutant thus obtained, which is lycopene producer.
In the foregoing, as in what follows, the expression microorganism of the genus Flavobacter is used to denote a microorganism chosen from bacteria of this genus or a mutant of such a microorganism. The expression nutrient medium is understood to denote a culture medium containing the substances necessary for the growth and life of the microorganism, namely at least one source of assimilable carbon, at least one source of assimilable nitrogen, vitamins and trace elements.
To carry out the process according to the invention, an initial culture of a bacterium of the Flavobacter genus which produces zeaxanthin in an aqueous nutrient medium can be prepared, this culture is diluted in a sterile physiological solution and the solution mixed in a Petri dish. diluted culture with an aqueous solution of NTG. Mixing can be carried out at a rate of 1 volume of dilute culture solution per 1 volume of aqueous solution containing 1 to 20 mg of NTG per ml. We can then pour molten agar on the solution obtained and mix everything thoroughly. When the agar has solidified, this solid medium can be maintained at a suitable incubation temperature, for example between 20 and 30go, until red colonies appear there.
Red colonies can be picked and subcultured several times on solid nutrient supports.
The mutant microorganism thus obtained can be subjected to one or more similar subsequent mutation treatments in a solidified medium.
The mutant strain can then be inoculated into an aqueous nutrient medium containing the substances necessary for the growth of the microorganism. The culture can be continued with aeration and stirring, to allow sufficient oxygenation, at a temperature between 20 and 30 C, preferably between 22 and 25 C, and at a pH between 6.5 and 8, preferably between 7 and 7.5, for a time sufficient to obtain a substantial amount of lycopene in the culture broth by centrifugation or filtration, for example. The biomass can find uses as such, for coloring food products, tomato soups or fruit desserts for example, or be subjected to an extraction treatment using a polar organic solvent.
We have seen that the main source of assimilable carbon in the solid nutrient medium must be sucrose. A main source of assimilable carbon for the aqueous nutrient medium can be chosen from sugars such as glucose, lactose or sucrose, for example.
Among the substances liable to enter into the composition of a main source of amino nitrogen for the solid nutrient medium and for the aqueous nutrient medium, there may be mentioned, for example, corn steep liquor, yeast extracts, protein hydrolysates, in particular products obtained by acidic or enzymatic hydrolysis of proteins of plant origin such as soya or peanut proteins, or the casein hydrolyzate called tryptone.
This source of amino nitrogen can also contain a substance prepared by acid or enzymatic hydrolysis of a biomass recovered as a by-product of the biosynthesis of a carotenoid pigment by culture of a bacterium of the genus Flavobacter, in particular by hydrolysis. a Flavobacter biomass cultivated to prepare lycopene and from which the pigment has been extracted.
Whether it is the aqueous nutrient medium in which the initial culture is prepared or the aqueous nutrient medium in which the mutant strain is cultivated, the main source of assimilable carbon can represent from 0.1 to 15% by weight of the medium and the main source of assimilable nitrogen can represent from 0.1 to 8% by weight of the medium. Magnesium sulfate can also be added to it in the proportion of 0.1 to 2% by weight. The 100% balance can be done by tap water, for example.
The following examples are given by way of illustration.
Example 1:
A culture of a strain of the genus Flavobacter (ATCC N "21588) is prepared in an aqueous nutrient medium the pH of which is adjusted to 6.5 and the composition of which is as follows:
Sucrose 3.0%
Yeast extract 1.0%
Casein hydrolyzate (tryptone) 1.0%
Magnesium sulfate 0.5%
100% balance tap water
This culture, which contains 5 g of cells of the microorganism per liter of nutrient medium, is then diluted in the ratio 1: 10s (by volume) by a series of successive operations in a sterile physiological solution containing 0.9% in weight of sodium chloride.
1 ml of this solution is then mixed thoroughly with 1 ml of an aqueous solution of NTG containing 5 mg / ml of this substance, in a Petri dish. Then 10 ml of molten agar is added to the solution thus prepared and the agar and the solution are completely mixed. When the agar is solidified, the Petri dish is incubated at a temperature of the order of 25 to 28 C, until the appearance of red colonies in the solidified medium, that is to say for 2 to 4 d. The red colonies are then separated from the Petri dish, then they are spread on nutrient agar supports in the absence of NTG, in several successive operations.
The mutant strain obtained is inoculated at a rate of 5% by volume into a sterile nutrient medium placed in flasks the pH of which is adjusted to 7.3 and the composition of which is as follows:
Glucose 3.0%
Yeast extract 1.0%
Casein hydrolyzate (tryptone) 1.0%
Magnesium sulfate 0.5%
100% balance tap water
The culture of the strain in this medium is continued for 48 h at a temperature of 25 ° C., the medium being constantly aerated by stirring the flasks on agitators with rotary movements executed at 200 rpm for an eccentricity of 8 cm. The flasks are then centrifuged and the cell mass is collected which represents 10 g of dry matter per liter of culture broth.
The specific concentration of lycopene in this biomass is 8 mg of pigment per g of dry matter, which corresponds to a production of 80 μg of lycopene per ml of culture broth.