La présente invention a trait à des perfectionnements du procédé faisant l'objet du brevet principal N" 564602, en vue de pouvoir exploiter ce procédé d'une façon plus efficace à l'échelle industrielle.
Ledit procédé consiste essentiellement à régler l'activité catalytique d'une enzyme en utilisant une électrode enzymatique, sur laquelle l'enzyme est fixée de manière à pouvoir régler le potentiel électrique de son support, et en effectuant une électrocatalyse enzymatique par un réglage du potentiel appliqué à cette électrode se trouvant en contact avec le système réactionnel, de manière à régler la vitesse de réaction à une valeur désirée. Cela permet de réaliser des avantages techniques importants en maitrisant l'action catalytique de l'enzyme au cours de la réaction désirée.
La possibilité de commander ainsi l'activité d'une enzyme, en réglant le potentiel électrique de son support de la manière décrite ci-dessous, est donc d'un très grand intérêt pratique pour tout procédé industriel dans lequel la catalyse enzymatique pourrait être utilisée.
En effet, la grande sélectivité de chaque enzyme constitue à priori un atout majeur. En revanche, I'activité catalytique d'une enzyme, qui constitue évidemment un facteur déterminant quant à la vitesse de réaction, présente un caractère essentiellement imprévisible étant donné qu'elle peut varier considérablement au cours du temps et dépend de nombreux facteurs qui, à leur tour, sont susceptibles de varier plus ou moins indépendamment les uns des autres. Ainsi, ladite possibilité de réglage de l'activité enzymatique, par l'intermédiaire du potentiel électrique du support de l'enzyme, offre la possibilité de compenser simultanément l'influence de différents facteurs dont le réglage continu est assez difficile dans les meilleurs des cas et impossible à réaliser en pratique dans de nombreux cas.
Or, il est évident que l'application de la catalyse enzymatique à l'échelle industrielle doit répondre à des exigences techniques qui sont bien différentes de celles des réactions enzymatiques réalisées à faible échelle, par exemple à l'échelle du laboratoire.
Ainsi, la proportion d'enzyme effectivement utilisée pour la catalyse, le rendement global et la reproductibilité du procédé, la complexité et le coût de l'appareillage utilisé, la possibilité d'un fonctionnement plus ou moins continu et la nécessité d'utiliser un personnel très spécialisé, peuvent tous constituer des facteurs déterminants pour l'exploitation efficace et économique d'un procédé industriel.
Le but de la présente invention est de réaliser plus pleinement les avantages qui sont inhérents au réglage de l'activité enzymatique, grâce à l'électrocatalyse enzymatique telle que décrite, de manière à pouvoir tenir compte dans une grande mesure des considérations techniques et économiques susmentionnées.
Or, on a découvert par des essais que lorsqu'un maximum d'activité enzymatique est atteint en appliquant un potentiel constant à une électrode enzymatique fixe, I'activité avait tendance à baisser ensuite assez rapidement de manière à annuler l'effet du potentiel. En d'autres termes, le maintien d'une activité maximale ne semble pas possible lorsqu'on soumet le support de l'enzyme à un potentiel fixe, d'où l'intérêt principal d'un réglage du potentiel de manière à pouvoir maintenir une activité moyenne élevée, comme il est prévu selon la la présente invention.
De plus, un autre phénomène a été découvert expérimentalement, à savoir, qu'une variation alternative du potentiel du support de l'enzyme autour d'une valeur moyenne réglable permet.
tait de maintenir une activité enzymatique moyenne bien plus élevée que lorsqu'on soumet l'enzyme à l'action d'un potentiel constant.
C'est pourquoi on se propose de soumettre l'enzyme à l'action d'un potentiel qui varie alternativement, de façon plus ou moins périodique, autour d'une valeur moyenne réglable.
L'emploi d'une électrode enzymatique formée de deux parties distinctes (une catalytiquement active, une conductrice, inerte) permet de choisir des types de dispositions très différents pour cette électrode afin qu'elle puisse remplir ces deux fonctions (support et réglage) dans les meilleures conditions pour chaque application envisagée.
Un avantage important obtenu dans tous les cas réside dans le fait que, contrairement à une électrode solide, unitaire portant l'enzyme uniquement sur sa surface externe, une masse de particules enzymatiques permet de réaliser un taux de fixation (enzyme/support) et une surface active beaucoup plus importants.
De plus, comme on le verra plus loin, il devient possible d'utiliser différents types de réacteurs permettant de réaliser l'électrocatalyse enzymatique de façon très efficace.
Ainsi, par exemple, dans le cas d'un lit fixe, tassé de particules enzymatiques au contact de l'électrode de travail, la surface active spécifique sera évidemment plusieurs fois supérieure à celle d'une électrode unitaire. Toutefois, étant donné que le milieu liquide doit parcourir l'ensemble de ce lit, il convient de le former à partir de particules relativement grandes, afin d'éviter tout écoulement préférentiel ( channelling ) à travers une partie du lit seulement.
De plus, la vitesse du liquide doit être limitée afin d'éviter une perte de charge excessive.
En revanche, on peut avantageusement utiliser une électrode dispersée où les particules enzymatiques subissent un contact intermittent avec l'électrode de travail, ce contact étant alors obtenu par un mouvement relatif qui peut être réalisé de différentes manières telles que: par un lit agité mécaniquement, un lit fluidisé ou un lit en circulation.
Le lit agité permet un mélange intime et prolongé liquide/solide, favorisant ainsi l'apport du substrat et la répartition du produit de réaction dans l'ensemble du liquide.
En revanche, le lit fluidisé, comme le lit fixe, permet d'évacuer continuellement le produit de réaction en dehors du lit, ce qui peut constituer un avantage très important à l'égard de réactions dont le produit constitue un inhibiteur compétitif capable d'entraver le déroulement de la réaction.
Quant au lit en circulation, il permet d'augmenter pratiquement à volonté la quantité de masse enzymatique ainsi que le nombre de contacts avec l'électrode de commande, grâce notamment à un recyclage répété.
Le dessin annexé représente schématiquement et à titre d'exemple, plusieurs formes d'exécution d'un appareil pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de la présente invention:
La fig. 1 est une coupe verticale schématique d'une première forme de l'appareil à lit fixe.
La fig. 2 est une coupe verticale schématique d'un appareil à lit agité.
La fig. 3 est une coupe verticale schématique d'un appareil à lit fluidisé.
L'appareil de la fig. I comprend une cellule I de réaction contenant une électrode enzymatique EE, une électrode ER de référence et une contre-électrode inerte E2 (en platine). Une source non représentée délivre le système réactionnel liquide SR à une entrée 2 de la cellule I dans laquelle il forme un bain et s'écoule ensuite à travers l'électrode EE, d'où le liquide P contenant le produit de la réaction est évacué par une sortie 3 à l'aide d'une pompe aspirante 4 à débit réglable.
L'électrode EE comprend une masse enzymatique ME disposée en contact avec une électrode Etl de travail, dans un tube 5 de verre. Cette électrode Etl est formée d'un matériau inerte (graphite) et la masse ME constitue un lit fixe. poreux composé de particules enzymatiques tassées pe formées chacune d'un support conducteur (graphite) sur lequel l'enzyme est fixée par une liaison covalente. Ce lit fixe ME est disposé dans le tube 5 de verre entre deux plaques poreuses transversales 6 et 7 en verre fritté.
L'électrode ER peut être, par exemple, une électrode de référence au calomel saturé (ECS). En outre, un tube G sert à faire barboter un gaz protecteur inerte (N2) à travers le bain de liquide SR situé dans la cellule 1.
Les trois électrodes Etl, ER et E2 sont reliées à une source 8 d'alimentation électrique. Cette source comprend un potentiostat associé à un générateur d'impulsions (hâcheur ou chopper ) de maniére à appliquer à l'électrode Etl de travail un potentiel réglable E1 sous la forme d'une suite d'impulsions périodiques.
Cette source d'alimentation 8 est agencée de manière à pouvoir ajuster, d'une part, la valeur moyenne initiale E1 des impulsions de tension appliquées à l'électrode Etl, par rapport à l'électrode de référence ER(ECS). Cette valeur initiale El/ECS peut être déterminée sans difficulté au moyen de quelques essais préalables dans lesquels on effectue la réaction enzymatique désirée à peu près dans les conditions réactionnelles moyennes prévues pour le fonctionnement normal de l'appareil.
D'autre part, cette source 8 est agencée de manière à pouvoir régler la valeur moyenne du potentiel El en fonction de l'écart E entre une valeur de consigne affichée Ps et une valeur instantanée mesurée Pm d'une variable de sortie qui dépend de la vitesse de réaction et correspond au produit de réaction P obtenu à la sortie 3.
Ainsi on a indiqué très schématiquement un instrument de mesure PR disposé dans la sortie 3 et destiné à délivrer ladite valeur mesurée Pm afin de pouvoir régler le potentiel El en fonction de Pm, par l'intermédiaire de la source d'alimentation électrique 8, comme il est indiqué en traits discontinus.
En effet, I'appareil décrit, muni d'un tel instrument de mesure Pm, permettra de régler le potentiel El et, par conséquent,
I'activité de l'enzyme fixée sur l'électrode enzymatique, de manière à pouvoir maintenir ladite variable de sortie à sa valeur désirée, en éliminant tout écart qui apparaît entre Pm et Ps au cours de la réaction. En d'autres termes, on peut obtenir assez facilement une régulation en boucle fermée permettant de maintenir Pm égal à
Ps. Il devient ainsi possible de réaliser, par des moyens relativement simples, un système de régulation automatique en boucle fermée, comprenant la source 8, la cellule 1 et l'instrument PR de mesure.
L'appareil décrit ci-dessus et représenté sur la fig. 1 peut être utilisé pour effectuer l'électrocatalyse enzymatique de la manière suivante:
(a) On choisit d'abord l'enzyme selon le substrat à transformer par l'intermédiaire de l'électrode enzymatique EE. On prépare alors la masse enzymatique de cette électrode en fixant cette enzyme sur des granules de graphite, d'une taille moyenne de l'ordre de 1500 la par exemple. Cette fixation peut être obtenue de toute manière appropriée et notamment au moyen d'une liaison covalente entre l'enzyme et des groupes réactifs formés par un prétraitement du support de graphite. On peut utiliser diverses techniques de fixation telles que celles décrites dans le brevet cité plus haut.
Toutefois, le procédé de fixation ne fait pas partie des perfectionnements selon la présente invention et ne sera donc pas décrit plus en détail.
(b) Après le montage des électrodes dans l'appareil selon la disposition de la fig. 1, la pompe 4 est actionnée pour faire circuler le liquide réactionnel avec un débit déterminé; la composition moyenne de ce liquide est déterminée au préalable, ainsi que son débit optimal à travers l'appareil, lequel peut cependant fonctionner à différents débits constants.
(c) Après avoir affiché la fréquence et l'amplitude des impulsions de potentiel, ainsi que le potentiel moyen initial El et la valeur de consigne Ps, sur la source 8, reliée aux électrodes Etl,
E2 et ER, la réaction désirée se déroulera par électrocatalyse enzymatique au sein de l'électrode EE: I'activité de l'enzyme est alors réglée au cours de la réaction en effectuant un réglage de la valeur moyenne du potentiel El appliqué par la source 8 à l'électrode EE, par l'intermédiaire de l'électrode Etl de travail.
(d) Afin de maintenir une vitesse de réaction désirée, on procède alors au réglage de la manière suivante: on on utilise l'instrument PR associé à la sortie 3 (fig. 1) pour
mesurer, de façon continue ou intermittente au cours de la
réaction, la valeur instantanée Pm de la grandeur de sortie
déjà mentionnée, qui correspond au produit de la réaction: - on compare continuellement Pm à Ps afin de déterminer tout
écart E qui apparaît entre eux et on règle El en fonction de cet
écart E, en augmentant E1 lorsque Pm est inférieur à Ps et vice
versa, de manière que cet écart soit annulé continuellement
lorsqu'il apparaît au cours de la réaction et que cette dernière
se déroule ainsi à une vitesse moyenne correspondant à la
valeur de consigne affichée Ps.
Cet appareil permet ainsi de maintenir une activité enzymatique moyenne sensiblement constante en réglant le potentiel El appliqué par la source 8 à l'électrode enzymatique EE.
Or, cet appareil peut être facilement adapté au fonctionnement automatique avec un système de régulation en boucle fermée comprenant la source 8, la cellule I munie de l'électrode EE, et l'instrument de mesure PR associé à des moyens conventionnels (comparateurs, etc.) capables de produire un signal d'écart E=Ps-Pm et de régler E1 automatiquement en fonction de cet écart.
Il devient ainsi possible, grâce à cet appareil selon la fig. I, de compenser simultanément l'influence de divers facteurs variables.
tels que pH et température du milieu réactionnel et la diminution d'activité qui peut avoir différentes causes telles que l'inhibition,
I'empoisonnement ou le vieillissement de l'enzyme.
Or, I'appareillage utilisé à cette fin est relativement simple, comme il ressort de ce qui précède. La source 8 et l'instrument de mesure PR peuvent être constitués par des éléments conventionnels qui n'ont pas été décrits plus en détail étant donné qu'ils ne font pas partie des perfectionnements selon la présente invention.
Il est toutefois évident que le réglage du potentiel El permettra de compenser des variations des paramètres de réaction (pH, temps) seulement dans certaines limites. Ainsi. par exemple, El ne pourra évidemment pas être augmenté à volonté. car le passage d'un courant excessif à travers le système réactionnel liquide peut conduire à un chauffage excessif pouvant avoir un effet néfaste sur l'activité de l'enzyme, et il convient donc de limiter ce courant en conséquence.
De plus, le potentiel réglable El appliqué à l'électrode EE doit évidemment être maintenu dans une gamme permettant d'assurer un niveau d'activité satisfaisant.
Or, des gammes de réglage du potentiel E1 peuvent être établies expérimentalement sans difficulté pour l'appareil fonctionnant à différents débits du liquide réactionnel. On peut ainsi choisir, dans chaque cas, le débit le plus approprié pour assurer le réglage du potentiel El dans des limites permettant de maintenir l'activité enzymatique à une valeur moyenne satisfaisante.
Dans la forme d'exécution selon la fig. 2, I'appareil comprend également une enceinte I de réaction munie d'une entrée 2, d'une sortie 3 et d'une électrode enzymatique EE associée à une électrode de référence ER (type ECS) et une contre-électrode E2.
Toutefois, la disposition des électrodes est bien différente.
Ainsi, I'électrode enzymatique comprend ici une masse ME de particules enzymatiques remises en suspension dans le système liquide réactionnel pour former un lit agité mécaniquement à l'aide d'un agitateur 9.
Ce lit agité est enfermé entre la contre-électrode E2, constituée ici par la paroi (en carbone vitreux) de l'enceinte I, et l'électrode Etl de travail est constituée ici par un bloc de graphite massif. Ce bloc est fixé à un couvercle isolant 10. relié à une borne Il et isolé de la paroi (électrode E2) de l'enceinte I par un joint isolant 12.
L'électrode massive Etl présente ainsi sa surface inférieure au contact avec ledit lit agité et est traversée par l'entrée 2, la sortie 3 et l'électrode ER de référence, qui est entourée par une gaine isolante de verre (non représentée). Ce bloc massif Etl comprend en outre une cavité 13 qui communique avec l'enceinte I et constitue un volume-tampon qui permet de maintenir la surface inférieure de l'électrode Etl en contact permanent avec ledit lit agité.
L'agitateur est représenté schématiquement par son organe d'agitation 9 lequel est actionné depuis l'extérieur au moyen d'un champ magnétique, de manière à imprimer à l'ensemble dudit lit agité un mouvement vertical, circulatoire comme il est indiqué par des flèches, ce mouvement produisant ainsi des collisions répétées entre les particules Pe en suspension dans le lit agité et, d'une part, la surface inférieure de l'électrode Etl et, d'autre part, la contre-électrode E2 constituée par la paroi de l'enceinte 1.
Les trois électrodes Etl, ER et E2 sont reliées à une source 14 d'alimentation électrique qui comprend un potentiostat agencé de manière à appliquer à l'électrode Etl de travail de l'électrode enzymatique un potentiel réglable E1 par rapport à l'électrode de référence ER; la valeur initiale E1 de ce potentiel est établie empiriquement au préalable et affichée sur la source 14.
Les particules enzymatiques Pe du lit agité circulant verticalement sont ainsi portées alternativement à des potentiels différents, qui correspondent à E1 et E2, lors de leurs collisions successives avec les électrodes Etl et E2, respectivement.
Comme on le voit sur la fig. 2, I'entrée 2 et la sortie 3 sont reliées à une pompe doseuse 15 à double circulation. Cette pompe comprend une première entrée reliée à un réservoir 16 d'alimentation en système liquide réactionnel, par l'intermédiaire d'un tuyau 17 muni d'une vanne 22 à trois voies, et une première sortie correspondante reliée à l'entrée 2 à l'enceinte I de réaction.
Cependant, la sortie 3 de cette enceinte comprend une cloison poreuse 18 qui empêche le passage de particules et permet le passage de liquide à partir de l'enceinte 1, à travers la sortie 3, à une seconde entrée de la pompe 15 dont une seconde sortie correspondante conduit à un réservoir d'évacuation 21 par l'intenmé- diaire d'un tuyau 20 muni d'une vanne 23 à trois voies. Un tuyau 24 de dérivation ( by-pass ) est en outre relié à ces deux vannes 22 et 23 de manière à permettre un recyclage comme il sera décrit plus loin. La commande simultanée de ces deux vannes 22, 23 est indiquée schématiquement par une ligne pointillée.
Lorsque la pompe 15 est en marche lors du fonctionnement normal de l'appareil, cette pompe délivre un volume de liquide donné du réservoir 16 à l'enceinte 1 et transfère en même temps un volume égal de cette enceinte 1 au réservoir 21.
Un instrument PR de mesure est enfin associé au tuyau 20 afin de mesurer la valeur instantanée Pm d'une variable de sortie qui dépend de la vitesse de réaction et correspond au produit de réaction P obtenu à la sortie de l'appareil.
Cet appareil selon la fig. 2 peut être utilisé pour effectuer l'électrocatalyse enzymatique de la manière suivante:
(a) On choisit d'abord l'enzyme et l'on prépare la masse ME de particules enzymatiques pe formées de l'enzyme fixée sur graphite comme il est mentionné plus haut par rapport à la fig. 1.
Toutefois, on peut utiliser dans ce cas du graphite pulvérulent plus fin ayant une taille moyenne comprise entre 200 et 400 ,u, par exemple, ce qui permet d'augmenter davantage le taux de fixation (rapport massique enzyme/support) ainsi que la surface active spécifique de l'électrode enzymatique.
(b) Après avoir introduit une masse enzymatique prédéterminée ME dans l'enceinte 1 et assemblé l'appareil selon la disposition représentée sur la fig. 2, on remplit l'enceinte 1 de liquide réactionnel à partir du réservoir 16, on actionne l'agitateur 9 de manière à former ledit lit agité de particules pe et l'on affiche sur la source 14 la valeur initiale E1 déterminée empiriquement au préalable. Les particules pe du lit agité en circulation sont ainsi soumises alternativement à deux potentiels qui correspondent à
El et E2.
(c) Lors d'une phase de démarrage de l'appareil, les vannes 22 et 23 sont ajustées de manière à effectuer le recyclage du liquide réactionnel dans l'enceinte 1 par l'intermédiaire de la pompe 15 et du tuyau 24. Ce recyclage lors de la phase de démarrage permet d'atteindre rapidement la valeur de consigne Ps de la variable de sortie, comme on peut le constater par des mesures à l'aide de l'instrument PR dans le liquide recyclé dans le tuyau 24.
(d) Une fois que Pm atteint Ps, on arrête le recyclage en commutant les vannes 22 et 23 et l'on ajuste le débit de la pompe 15 à une valeur prédéterminée empiriquement qui correspond au fonctionnement normal de l'appareil; le liquide réactionnel contenant du substrat frais est alors transféré continuellement du réservoir 16 à l'enceinte 1 pour y subir la réaction et un volume égal de liquide contenant le produit P de réaction (substrat transformé) est évacué de l'enceinte 1 vers le réservoir 21.
(e) Au cours de ce fonctionnement normal, on mesure continuellement Pm, on le compare à Ps afin de déterminer tout écart E = Ps - Pm et l'on augmente ou diminue le potentiel réglable El en conséquence, de manière à annuler cet écart. En d'autres termes, on règle continuellement E1 par l'intermédiaire de la source 14, en fonction de Pm, comme il est indiqué par une ligne pointillée reliant PR à 14 de manière que Pm soit maintenu à peu près égal à Ps. On peut ainsi maintenir la vitesse de réaction à une valeur plus ou moins constante pendant une longue durée, grâce à ce réglage du potentiel E1 de manière à maintenir une activité enzymatique à peu près constante correspondant à Ps.
L'effet d'électrocatalyse enzymatique obtenu à l'aide du lit agité dans cet appareil selon la fig. 2, peut être expliqué comme suit:
(a) Le potentiel réglable E1 sert à commander la vitesse de réaction en agissant sur l'activité enzymatique. Sa valeur initiale El est donc choisie de manière qu'elle corresponde à une activité relativement élevée permettant d'obtenir une vitesse de réaction satisfaisante.
(b) Le réglage de ce potentiel El pendant le fonctionnement de l'appareil sert alors à maintenir une activité relativement élevée, correspondant à la vitesse de réaction désirée, car il permet de compenser rapidement des variations d'activité qui apparaissent au cours de la réaction et peuvent provenir soit d'un changement des propriétés de l'enzyme, soit d'un changement des conditions réactionnelles, soit des deux à la fois.
(c) Ainsi, chaque fois qu'une particule enzymatique pe entre en collision avec l'électrode Etl de travail, I'enzyme fixée sur cette particule est soumise à l'action du potentiel réglable E1 et présente alors une activité relativement élevée correspondant à E1.
(d) Or, étant donné que le niveau de E1 est choisi de manière qu'il corresponde à une activité relativement élevée, I'activité de l'enzyme est plus faible en l'absence de l'action de E1 sur l'enzyme. Ainsi, pendant les intervalles relativement longs qui séparent les collisions successives de chaque particule avec l'électrode Etl de travail, I'enzyme fixée sur chaque particule circulant au sein du lit agité se trouve à peu près à son potentiel à circuit ouvert (OCV), qui correspond à un état d'équilibre de potentiel avec le liquide réactionnel. L'activité de l'enzyme sera relativement faible, lors de cet équilibre, par rapport à l'activité qui résulte du potentiel E1 qui agit de façon intermittente lors desdites collisions successives.
De même, I'activité enzymatique sera également plus faible lors des collisions de chaque particule pe avec la contre-électrode E2 car le potentiel E2 de celle-ci correspondra à une activité plus faible que ladite activité relativement élevée qui résulte du potentiel E1.
(e) Une circulation uniforme, continue du lit agité, au moyen de l'agitateur 9, permet cependant d'obtenir une mise en contact à peu près uniforme des particules pe avec l'électrode Etl et, par conséquent, un effet catalytique moyen pratiquement constant dû à l'action du potentiel réglable E1 sur l'enzyme fixée sur l'ensemble des particules pe du lit agité.
(f) Or, pendant la circulation au sein du lit agité, le système réactionnel liquide est mélangé intimement avec l'ensemble des particules enzymatiques subissant la circulation et ayant une activité relativement faible, de sorte que le produit de la réaction, qui est formé à la surface de chaque particule, peut être transféré très rapidement à l'ensemble du liquide réactionnel au sein du lit agité. De même, ce mélange intime permet d'assurer un apport continu du substrat à transformer, à partir de l'ensemble du liquide réactionnel vers la surface de chaque particule pe du lit agité.
(g) Cette circulation du lit agité permet ainsi de maintenir une activité enzymatique moyenne relativement élevée grâce à l'action intermittente du potentiel El, d'une part, et auxdits effets obtenus lors du mélange intime au sein du lit agité, d'autre part.
En effet, grâce à la réduction intermittente de l'activité, accompagnée dudit mélange intime, il est possible d'obvier dans une grande mesure au développement de phénomènes d'inhibition compétitive qui sont susceptibles d'entraver le déroulement continu d'une réaction à une vitesse élevée. Or, comme on le sait, une inhibition compétitive de l'enzyme peut résulter d'une accumulation trop rapide du produit de réaction, ce qui diminue la vitesse de réaction, tout comme le fait une variation excessive du pH du liquide réactionnel se trouvant en contact avec l'enzyme.
(h) Ainsi, grâce à l'action combinée du réglage de E1 avec l'agitation du lit et la circulation obtenue par la pompe 15, il est possible de maintenir une vitesse de réaction moyenne relativement élevée et à peu prés constante lors du fonctionnement de l'appareil selon la fig. 2 pendant des périodes relativement longues.
L'appareil selon la forme représentée sur la fig. 3 est muni d'une électrode enzymatique comprenant une masse enzymatique agencée sous la forme d'un lit fluidisé de particules enzymatiques pe suspendues dans un courant ascendant de liquide réactionnel SR qui traverse une colonne 1 de réaction entre une entrée inférieure 25 et une sortie supérieure.
Une chemise coaxiale 26 entoure la colonne 1 pour délimiter un canal annulaire 27 qui communique avec la sortie supérieure de cette colonne.
Un réservoir d'alimentation 16 pour le système réactionnel liquide SR, contenant le substrat à transformer, est relié à l'entrée 25 par l'intermédiaire d'un tuyau d'alimentation 17 muni d'une vanne 22 à trois voies et d'une pompe 33 à débit réglable.
A l'extrémité inférieure de la colonne 1, une plaque d'entrée 34 poreuse de distribution est disposée transversalement pour permettre le passage d'un courant liquide uniforme et empêcher le passage des particules Pe du lit fluidisé.
La paroi délimitant la colonne 1 est formée d'un conducteur électrique (par exemple de titane) et constitue en même temps une électrode Etl de travail reliée par l'intermédiaire de l'entrée 25 à une borne (El) d'une source 28 d'alimentation électrique.
La surface interne de cette paroi de la colonne 1, qui constitue l'électrode Etl, est munie d'une série de chicanes radiales 29 sous forme de barrettes radiales par exemple.
La colonne 1 est munie en outre d'une contre-électrode E2 formée d'une barre métallique axiale 30 (de titane) qui porte une série d'organes conducteurs transversaux 31, sous forme de grilles de titane, par exemple, et qui est suspendue à un couvercle conducteur 32 par l'intermédiaire duquel la barre 30 est reliée à une deuxième borne (E2) de la source 28. Comme il ressort de la fig. 3, les séries de chicanes 29 et d'organes 31 sont disposées en quinconce, et cela de manière que le liquide ascendant présente une vitesse verticale moyenne à peu près uniforme, d'une part, permettant de maintenir le lit fluidisé de particules pe suspendues dans la colonne. D'autre part, cette disposition sert à dévier le liquide ascendant alternativement vers la paroi formant l'électrode Etl et vers la contre-électrode E2 (30, 31).
Les particules pe du lit fluidisé peuvent être préparées à partir d'un support de graphite pulvérulent ou granuleux sur lequel on fixe l'enzyme de toute manière appropriée telle que mentionnée plus haut.
La porosité (rapport volumétrique liquide/solide) du lit fluidisé peut être d'environ 0,65.
En utilisant des techniques de fluidisation bien connues, on peut choisir la taille moyenne des particules pe entre 400 et 1500 Il et choisir la vitesse ascensionnelle du liquide, en fonction de cette taille, de manière à former le lit fluidisé, à le maintenir dans la
colonne 1 et à éviter l'entraînement de particules Pe en dehors de
cette colonne.
Le liquide sortant du lit fluidisé, à l'extrémité ouverte supé
rieure de la colonne 1 de réaction, se déverse dans le canal 27 où il
circule vers le bas et passe dans la sortie 3.
La sortie 3 contient un instrument PR de mesure et est reliée à
un réservoir 21 pour le produit P de la réaction, par l'intermé
diaire d'un conduit 20 muni d'une vanne 23 à trois voies. Cette
vanne 23 permet en outre de relier la sortie 3 à l'entrée 25 par 31'intermédiaire d'un tuyau 24 de dérivation ( by-pass ) condui
sant à la vanne 22, afin de permettre ainsi le recyclage dans la
colonne 1.
La source 28 d'alimentation électrique est agencée de manière
à appliquer entre les deux électrodes Etl et E2 une différence de potentiel réglable AE1-2=El -E2, dont la valeur initiale dEi est
prédéterminée empiriquement, affichée sur la source 28 et corres
pond à un potentiel initial Ei de l'électrode de travail Etl par
rapport à une électrode de référence non représentée sur la fig. 3.
Comme dans les cas précédents, la source 28 permet l'affichage d'une valeur de consigne Ps d'une grandeur de sortie P et le
réglage de AEI-2 en fonction de l'écart entre Ps et une valeur Pm
mesurée par l'instrument PR.
L'appareil décrit selon la fig. 3 peut servir à la mise en oeuvre
de l'invention de la manière suivante:
(a) Après avoir introduit une masse appropriée de particules
enzymatiques pe dans la colonne 1, on assemble l'appareil selon la
fig. 3, on affiche les valeur AE; et Ps sur la source 28 et on met en
marche la pompe 33 avec un débit approprié, prédéterminé
empiriquement, de manière que le système réactionnel liquide SP
provenant du réservoir 16 circule vers le haut dans la colonne 1
avec une vitesse ascensionnelle prédéterminée permettant d'y
former et maintenir un lit fluidisé.
(b) On obtient ainsi la catalyse enzymatique de la réaction
désirée au moyen des particules Pe de ce lit fluidisé dans la
colonne 1 et le liquide contenant le produit P de cette réaction
passe dans le canal 27 vers la sortie 3 d'où il est acheminé par la
vanne 23 au conduit 20 qui l'amène au réservoir 21.
(c) Or, les particules Pe du lit fluidisé entrent alternativement
en collision avec les électrodes Etl et Et2 et leur activité enzymatique dépend essentiellement du potentiel El appliqué à l'élec
trode Etl par la source 28.
(d) Pendant que la réaction se déroule dans la colonne 1, on
mesure Pm au moyen de l'instrument PR, on détermine tout
écart E qui apparaît entre Pm et Ps et on règle AEI 2 en fonction
de cet écart, par l'intermédiaire de la source 28, de manière à
maintenir Pm à peu près égal à Ps.
(e) On maintient ainsi une vitesse de réaction moyenne
désirée, qui correspond à la valeur de consigne affichée Ps, grâce
au réglage de AEl--2 en combinaison avec l'action du lit fluidisé.
En effet, comme dans le cas du lit agité selon la fig. 2, le lit flui
disé selon la fig. 3 permet de soumettre l'enzyme fixée sur chaque
particule pe à de brèves périodes d'activité relativement élevée lors
de ces collisions successives avec l'électrode Etl de travail, avec
des périodes intermédiaires d'activité relativement réduite lorsque
la particule n'est pas soumise à l'action du potentiel E1 de cette
électrode. En outre, les particules enzymatiques Pe du lit fluidisé
ainsi formé subissent également un mélange très intime avec le
système réactionnel liquide Sr, ce qui permet d'assurer un résultat
analogue permettant d'obvier au développement de phénomènes
d'inhibition compétitive.
L'emploi d'un tel lit fluidisé permet d'utiliser, d'une façon à la
fois simple et efficace, une masse relativement importante de
particules associées à l'électrode enzymatique, en dimensionnant
la colonne 1 en conséquence. De plus, le lit fluidisé permet d'obte
nir un écoulement uniforme du milieu liquide réactionnel SR et sa
progression régulière à travers le lit fluidisé, ce qui permet d'éviter
un mélange notable ( back-mixing ) du liquide ayant subi diffé
rents stades de réaction. Cela permet, en particulier, d'éviter plus facilement le développement de phénomènes d'inhibition compétitive qui sont dus à la présence du produit P de réaction dans le liquide en contact immédiat avec l'enzyme et qui peuvent affecter considérablement la catalyse enzymatique de certaines réactions.
Or, la commutation des vannes 22 et 23 permet le recyclage du liquide à travers la colonne 1, par exemple lors d'une phase initiale de démarrage destinée à atteindre rapidement une valeur Pm = Ps, comme on l'a décrit par rapport à la fig. 2, avant de procéder au fonctionnement continu où le liquide sortant de la colonne 1 est évacué directement dans le réservoir 21. Ce recyclage peut par ailleurs être envisagé pour le fonctionnement normal de l'appareil selon la fig. 3, en alternance avec des phases intermédiaires pour l'évacuation de liquide dans le réservoir 21 et l'alimentation de la colonne 1 à partir du réservoir 16 en liquide SR contenant du substrat frais à transformer. En variante, la source 28 peut comprendre un potentiostat et être associée à une électrode de référence.
On appliquera alors à l'électrode Etl un potentiel E1 de valeur réglable par rapport à cette électrode de référence, comme dans le cas de l'appareil selon la fig. 2.
Il est évident que l'on peut utiliser diverses variantes des appareils décrits ci-dessus. Ainsi, par exemple l'électrode de travail fixe, inerte associée à la masse enzymatique peut présenter une configuration quelconque capable d'assurer un triple contact électrique et un mouvement relatif satisfaisant entre le système réactionnel liquide, la masse enzymatique divisée et l'électrode de travail fixe. De même, la contre-électrode peut avoir toute forme désirée et toute disposition relative appropriée par rapport à l'électrode enzymatique.
De plus, on peut effectuer ledit mouvement relatif de diverses manières. Ainsi, par exemple, on peut envisager, comme variante du lit fluidisé maintenu sur place, de faire circuler une suspension de particules enzymatiques dans le système réactionnel, de manière que chaque particule en suspension circule à travers l'enceinte de réaction et soit soumise à un contact intermittent avec l'électrode de travail par des collisions répétées avec cette électrode, soit en un seul passage, soit en plusieurs passages successifs (par recyclage) de chaque particule à travers l'enceinte de réaction.
Les exemples suivants illustrent l'application du procédé selon l'invention.
E.rez11ple 1:
On soumet du lactosérum dégraissé et déprotéiné à une hydrolyse catalysée par la lactase et destinée à transformer le lactose en glucose et galactose, dans un appareil selon la fig. 1.
L'électrode enzymatique comprend alors une masse de particules enzymatiques Pe formées de particules de graphite (taille moyenne 1500 1 < ) portant l'enzyme lactase et constituant un lit fixe poreux disposé en contact avec l'électrode Etl de travail. Ce lit est parcouru par le lactosérum à hydrolyser, fourni à la cellule I de réaction dans des conditions (débit, composition, température, pH) à peu prés constantes qui sont prédéterminées empiriquement. En l'occurrence, la teneur initiale du lactosérum en lactose était de 45 g/I, la température 25 C et le pH 6,5.
Dans ce cas, on soumet l'électrode enzymatique à une polarisation positive périodique, en appliquant à l'électrode Etl un potentiel E1 qui alterne initialement entre + 900 m VIECS et +300 m VIECS (E = +600 m VIECS).
On règle alors la valeur moyenne du potentiel E1 appliqué sous forme d'impulsions périodiques (fréquence I Hz). en fonction de la teneur en glucose Pm mesurée dans le liquide traversant la sortie 3, de manière à maintenir une teneur en glucose constante correspondant à la valeur de consigne désirée Ps en l'occurrence 13,5 g de glucose par litre.
Cette variation périodique de El et le réglage de sa valeur moyenne permettent de maintenir une activité enzymatique moyenne relativement élevée qui correspond à une vitesse de réaction à peu près constante et fournit ainsi un produit qui présente une composition uniforme, c'est-à-dire une teneur uniforme en glucose et galactose.
En l'occurrence, le gain d'activité dû à l'application du potentiel réglable E1 était de 50%.
Exemple 2:
On effectue l'hydrolyse du lactosérum comme dans l'exemple 1 mais dans un appareil selon la fig. 2, comprenant une électrode enzymatique à lit agité.
L'électrode est également polarisée positivement dans ce cas et la valeur initiale El (prédéterminée expérimentalement) du potentiel E1 appliquée à l'électrode Etl est alors de l'ordre de + 1100 mV/ECS. On règle ensuite la valeur E1 en fonction de Pm de manière à maintenir une activité enzymatique moyenne relativement élevée qui fournit un produit traité uniforme, comme dans l'exemple 1.
En l'occurrence, le gain d'activité dû à l'application de El était de 100%. En outre, une hydrolyse à 100% a été réalisée.
Il est entendu que la catalyse enzymatique effectuée conformément à la présente invention s'applique pratiquement à toutes les réactions catalysées par une enzyme et peut être réalisée dans tout type d'appareil comprenant une électrode enzymatique appropriée permettant le réglage du potentiel du support de l'enzyme fixée.
De même, les gammes de réglage de E1 peuvent être bien différentes de celles citées ci-dessus. La fréquence des impulsions de tension peut avoir toute valeur appropriée et elles peuvent avoir différentes formes (carrée, triangulaire, etc.).
Comme il ressort de ce qui précède, la présente invention permet d'effectuer une catalyse enzymatique hétérogène réglable de manière à pouvoir répondre à toutes les exigences d'un procédé industriel.
En effet, I'invention permet de combiner plusieurs avantages techniques importants tels que:
(i) obtention d'une surface active maximale par unité de volume de l'électrode, la surface disponible pour la fixation de l'enzyme sur l'ensemble des particules et donc pour son utilisation pour effectuer la catalyse réglable étant extrêmement élevée;
(ii) utilisation très efficace de la grande surface active globale de l'enzyme fixée sur des particules, grâce au contact intime obtenu par le mouvement relatif entre le milieu réactionnel liquide et les particules enzymatiques:
(iii) réglage facile de l'activité enzymatique grâce à une polarisation électrique réglable de chaque particule enzymatique:
(iv) possibilité de maintenir une activité enzymatique moyenne satisfaisante grâce à une variation alternative du potentiel électrique de l'enzyme, lors de laquelle:
: (a) I'enzyme présente d'une part une activité élevée obtenue par
une polarisation intermittente et réglable, afin de pouvoir
compenser des variations d'activité, quelle qu'en soit la cause
(vieillissement, conditions réactionnelles variables, etc.): (b) I'enzyme présente une activité réduite pendant des périodes
intermédiaires, permettant d'obvier largement à l'évolution de
phénomènes d'inhibition compétitive.
The present invention relates to improvements to the process which is the subject of the main patent No. 564602, with a view to being able to use this process more efficiently on an industrial scale.
Said method essentially consists in regulating the catalytic activity of an enzyme by using an enzyme electrode, on which the enzyme is fixed so as to be able to regulate the electric potential of its support, and by carrying out an enzymatic electrocatalysis by a regulation of the potential applied to this electrode being in contact with the reaction system, so as to adjust the reaction rate to a desired value. This makes it possible to achieve significant technical advantages by controlling the catalytic action of the enzyme during the desired reaction.
The possibility of controlling the activity of an enzyme in this way, by adjusting the electrical potential of its support in the manner described below, is therefore of very great practical interest for any industrial process in which enzymatic catalysis could be used. .
Indeed, the great selectivity of each enzyme constitutes a priori a major advantage. On the other hand, the catalytic activity of an enzyme, which obviously constitutes a determining factor as to the speed of the reaction, is essentially unpredictable since it can vary considerably over time and depends on many factors which, to in turn, are likely to vary more or less independently of each other. Thus, said possibility of regulating the enzymatic activity, by means of the electric potential of the support of the enzyme, offers the possibility of simultaneously compensating for the influence of various factors, the continuous control of which is quite difficult in the best cases. and impossible to achieve in practice in many cases.
Now, it is obvious that the application of enzymatic catalysis on an industrial scale must meet technical requirements which are very different from those of enzymatic reactions carried out on a small scale, for example at the laboratory scale.
Thus, the proportion of enzyme actually used for catalysis, the overall yield and reproducibility of the process, the complexity and cost of the equipment used, the possibility of more or less continuous operation and the need to use a highly skilled personnel, can all be critical factors in the efficient and economical operation of an industrial process.
The aim of the present invention is to realize more fully the advantages which are inherent in the control of the enzyme activity, by means of the enzymatic electrocatalysis as described, so that the above-mentioned technical and economic considerations can be taken into account to a great extent. .
However, it has been discovered by tests that when a maximum of enzymatic activity is reached by applying a constant potential to a fixed enzymatic electrode, the activity then tended to drop quite rapidly so as to cancel the effect of the potential. In other words, the maintenance of a maximum activity does not seem possible when the support of the enzyme is subjected to a fixed potential, hence the main interest of an adjustment of the potential so as to be able to maintain a high average activity, as expected according to the present invention.
In addition, another phenomenon has been discovered experimentally, namely, that an alternating variation of the potential of the support of the enzyme around an adjustable mean value allows.
was to maintain a much higher average enzymatic activity than when subjecting the enzyme to the action of a constant potential.
This is why it is proposed to subject the enzyme to the action of a potential which varies alternately, more or less periodically, around an adjustable mean value.
The use of an enzymatic electrode formed of two distinct parts (one catalytically active, one conductive, inert) makes it possible to choose very different types of arrangements for this electrode so that it can fulfill these two functions (support and adjustment) in the best conditions for each envisaged application.
An important advantage obtained in all cases lies in the fact that, unlike a solid, unitary electrode carrying the enzyme only on its external surface, a mass of enzymatic particles makes it possible to achieve a binding rate (enzyme / support) and a much larger active surface.
In addition, as will be seen below, it becomes possible to use different types of reactors making it possible to carry out enzymatic electrocatalysis very efficiently.
Thus, for example, in the case of a fixed bed packed with enzymatic particles in contact with the working electrode, the specific active surface area will obviously be several times greater than that of a unit electrode. However, since the liquid medium must travel through the whole of this bed, it should be formed from relatively large particles in order to avoid any preferential flow (channeling) through only part of the bed.
In addition, the speed of the liquid must be limited in order to avoid excessive pressure drop.
On the other hand, one can advantageously use a dispersed electrode where the enzymatic particles undergo intermittent contact with the working electrode, this contact then being obtained by a relative movement which can be carried out in different ways such as: by a mechanically stirred bed, a fluidized bed or a circulating bed.
The agitated bed allows an intimate and prolonged liquid / solid mixing, thus promoting the supply of the substrate and the distribution of the reaction product throughout the liquid.
On the other hand, the fluidized bed, like the fixed bed, makes it possible to continuously discharge the reaction product out of the bed, which can constitute a very important advantage with regard to reactions in which the product constitutes a competitive inhibitor capable of hinder the course of the reaction.
As for the bed in circulation, it makes it possible to increase practically at will the quantity of enzymatic mass as well as the number of contacts with the control electrode, thanks in particular to repeated recycling.
The appended drawing shows schematically and by way of example, several embodiments of an apparatus for implementing the method forming the subject of the present invention:
Fig. 1 is a schematic vertical section of a first form of the fixed bed apparatus.
Fig. 2 is a schematic vertical section of a stirred bed apparatus.
Fig. 3 is a schematic vertical section of a fluidized bed apparatus.
The apparatus of FIG. I comprises a reaction cell I containing an enzymatic electrode EE, a reference electrode ER and an inert counter-electrode E2 (in platinum). A source not shown delivers the liquid reaction system SR to an inlet 2 of cell I in which it forms a bath and then flows through the electrode EE, from which the liquid P containing the product of the reaction is discharged. via an outlet 3 using a suction pump 4 with adjustable flow.
The EE electrode comprises an ME enzymatic mass disposed in contact with a working Et1 electrode, in a glass tube. This Et1 electrode is formed from an inert material (graphite) and the mass ME constitutes a fixed bed. porous composed of enzymatic particles pe packed each formed of a conductive support (graphite) on which the enzyme is fixed by a covalent bond. This fixed bed ME is placed in the glass tube 5 between two transverse porous plates 6 and 7 of sintered glass.
The ER electrode can be, for example, a saturated calomel reference electrode (SCE). In addition, a tube G is used to bubble an inert protective gas (N2) through the SR liquid bath located in cell 1.
The three electrodes Et1, ER and E2 are connected to a power supply source 8. This source comprises a potentiostat associated with a pulse generator (chopper or chopper) so as to apply to the working electrode Et1 an adjustable potential E1 in the form of a series of periodic pulses.
This power source 8 is arranged so as to be able to adjust, on the one hand, the initial average value E1 of the voltage pulses applied to the electrode Et1, with respect to the reference electrode ER (ECS). This initial E1 / ECS value can be determined without difficulty by means of a few preliminary tests in which the desired enzymatic reaction is carried out approximately under the average reaction conditions expected for the normal operation of the apparatus.
On the other hand, this source 8 is arranged so as to be able to adjust the average value of the potential El as a function of the difference E between a displayed setpoint value Ps and an instantaneous measured value Pm of an output variable which depends on the reaction rate and corresponds to the reaction product P obtained at exit 3.
Thus there has been very schematically indicated a measuring instrument PR arranged in the output 3 and intended to deliver said measured value Pm in order to be able to adjust the potential El as a function of Pm, by means of the electric power supply source 8, as it is indicated in broken lines.
In fact, the apparatus described, provided with such a measuring instrument Pm, will make it possible to adjust the potential El and, consequently,
The activity of the enzyme attached to the enzyme electrode, so as to be able to maintain said output variable at its desired value, eliminating any difference which appears between Pm and Ps during the reaction. In other words, it is quite easy to obtain closed-loop regulation making it possible to maintain Pm equal to
Ps. It thus becomes possible to produce, by relatively simple means, an automatic closed-loop regulation system, comprising the source 8, the cell 1 and the measuring instrument PR.
The apparatus described above and shown in FIG. 1 can be used to perform enzymatic electrocatalysis as follows:
(a) The enzyme is first chosen according to the substrate to be transformed via the enzymatic electrode EE. The enzymatic mass of this electrode is then prepared by fixing this enzyme on graphite granules, of an average size of the order of 1500 la for example. This attachment can be obtained in any suitable manner and in particular by means of a covalent bond between the enzyme and reactive groups formed by a pretreatment of the graphite support. Various fixing techniques can be used such as those described in the patent cited above.
However, the fixing method does not form part of the improvements according to the present invention and will therefore not be described in more detail.
(b) After mounting the electrodes in the device according to the arrangement in fig. 1, the pump 4 is actuated to circulate the reaction liquid with a determined flow rate; the average composition of this liquid is determined beforehand, as well as its optimum flow rate through the device, which can however operate at various constant flow rates.
(c) After displaying the frequency and amplitude of the potential pulses, as well as the initial average potential El and the reference value Ps, on the source 8, connected to the Etl electrodes,
E2 and ER, the desired reaction will take place by enzymatic electrocatalysis within the EE electrode: the activity of the enzyme is then regulated during the reaction by adjusting the average value of the potential E1 applied by the source 8 to the EE electrode, through the Etl working electrode.
(d) In order to maintain a desired reaction rate, the adjustment is then carried out as follows: the PR instrument associated with output 3 (fig. 1) is used for
measure, continuously or intermittently during the
reaction, the instantaneous value Pm of the output quantity
already mentioned, which corresponds to the product of the reaction: - we continuously compare Pm to Ps in order to determine any
deviation E which appears between them and we adjust El according to this
deviation E, by increasing E1 when Pm is less than Ps and vice
versa, so that this difference is continuously canceled
when it appears during the reaction and the reaction
thus takes place at an average speed corresponding to the
displayed setpoint value Ps.
This apparatus thus makes it possible to maintain a mean enzymatic activity which is substantially constant by adjusting the potential E1 applied by the source 8 to the enzyme electrode EE.
Now, this device can be easily adapted to automatic operation with a closed loop regulation system comprising the source 8, the cell I provided with the electrode EE, and the measuring instrument PR associated with conventional means (comparators, etc. .) capable of producing a deviation signal E = Ps-Pm and of automatically adjusting E1 according to this deviation.
It thus becomes possible, thanks to this device according to FIG. I, to simultaneously compensate for the influence of various variable factors.
such as pH and temperature of the reaction medium and the decrease in activity which can have various causes such as inhibition,
Poisoning or aging of the enzyme.
However, the apparatus used for this purpose is relatively simple, as emerges from the above. The source 8 and the measuring instrument PR may consist of conventional elements which have not been described in more detail since they do not form part of the improvements according to the present invention.
It is however obvious that the adjustment of the potential E1 will make it possible to compensate for variations in the reaction parameters (pH, time) only within certain limits. So. for example, El obviously cannot be increased at will. because passing an excessive current through the liquid reaction system can lead to excessive heating which may have an adverse effect on the activity of the enzyme, and therefore this current should be limited accordingly.
In addition, the adjustable potential E1 applied to the electrode EE must obviously be kept within a range making it possible to ensure a satisfactory level of activity.
However, the potential E1 adjustment ranges can be established experimentally without difficulty for the apparatus operating at different flow rates of the reaction liquid. It is thus possible, in each case, to choose the most appropriate flow rate to ensure the adjustment of the E1 potential within limits making it possible to maintain the enzymatic activity at a satisfactory mean value.
In the embodiment according to FIG. 2, the apparatus also comprises a reaction chamber I provided with an input 2, an output 3 and an enzymatic electrode EE associated with a reference electrode ER (ECS type) and a counter-electrode E2.
However, the arrangement of the electrodes is quite different.
Thus, the enzymatic electrode here comprises a mass ME of enzymatic particles resuspended in the liquid reaction system to form a bed mechanically stirred using a stirrer 9.
This stirred bed is enclosed between the counter-electrode E2, here constituted by the wall (made of glassy carbon) of the enclosure I, and the working electrode Et1 is here constituted by a block of solid graphite. This block is fixed to an insulating cover 10. connected to a terminal II and isolated from the wall (electrode E2) of the enclosure I by an insulating gasket 12.
The solid electrode Et1 thus has its lower surface in contact with said stirred bed and is crossed by the inlet 2, the outlet 3 and the reference electrode ER, which is surrounded by an insulating glass sheath (not shown). This massive Etl block further comprises a cavity 13 which communicates with the enclosure I and constitutes a buffer volume which makes it possible to maintain the lower surface of the Etl electrode in permanent contact with said stirred bed.
The agitator is represented schematically by its agitation member 9 which is actuated from the outside by means of a magnetic field, so as to impart to the whole of said agitated bed a vertical, circulatory movement as indicated by arrows, this movement thus producing repeated collisions between the Pe particles in suspension in the stirred bed and, on the one hand, the lower surface of the Etl electrode and, on the other hand, the counter-electrode E2 formed by the wall speaker 1.
The three electrodes Et1, ER and E2 are connected to a power supply source 14 which comprises a potentiostat arranged so as to apply to the working electrode of the enzymatic electrode an adjustable potential E1 with respect to the electrode of ER reference; the initial value E1 of this potential is established empirically beforehand and displayed on the source 14.
The enzymatic particles Pe of the agitated bed circulating vertically are thus taken alternately to different potentials, which correspond to E1 and E2, during their successive collisions with the electrodes Et1 and E2, respectively.
As seen in fig. 2, inlet 2 and outlet 3 are connected to a dual circulation metering pump 15. This pump comprises a first inlet connected to a reservoir 16 for supplying the reaction liquid system, via a pipe 17 provided with a three-way valve 22, and a corresponding first outlet connected to the inlet 2 to the reaction chamber I.
However, the outlet 3 of this enclosure comprises a porous partition 18 which prevents the passage of particles and allows the passage of liquid from the enclosure 1, through the outlet 3, to a second inlet of the pump 15, a second of which is the corresponding outlet leads to an evacuation tank 21 via a pipe 20 provided with a three-way valve 23. A branch pipe 24 (bypass) is also connected to these two valves 22 and 23 so as to allow recycling as will be described below. The simultaneous control of these two valves 22, 23 is indicated schematically by a dotted line.
When the pump 15 is running during normal operation of the device, this pump delivers a given volume of liquid from the reservoir 16 to the enclosure 1 and at the same time transfers an equal volume from this enclosure 1 to the reservoir 21.
A measuring instrument PR is finally associated with the pipe 20 in order to measure the instantaneous value Pm of an output variable which depends on the reaction rate and corresponds to the reaction product P obtained at the output of the apparatus.
This device according to fig. 2 can be used to perform enzymatic electrocatalysis as follows:
(a) The enzyme is first chosen and the ME mass of enzymatic particles pe formed from the enzyme fixed on graphite is prepared as mentioned above with respect to FIG. 1.
However, it is possible in this case to use finer powdery graphite having an average size of between 200 and 400, u, for example, which makes it possible to further increase the rate of fixation (enzyme / support mass ratio) as well as the surface area. specific active of the enzyme electrode.
(b) After having introduced a predetermined enzymatic mass ME into the enclosure 1 and assembling the apparatus according to the arrangement shown in FIG. 2, the chamber 1 is filled with reaction liquid from the tank 16, the stirrer 9 is actuated so as to form said stirred bed of particles pe and the initial value E1 determined empirically beforehand is displayed on the source 14. . The particles pe of the circulating agitated bed are thus subjected alternately to two potentials which correspond to
El and E2.
(c) During a start-up phase of the apparatus, the valves 22 and 23 are adjusted so as to carry out the recycling of the reaction liquid in the chamber 1 via the pump 15 and the pipe 24. This recycling during the start-up phase makes it possible to quickly reach the setpoint value Ps of the output variable, as can be seen by measurements using the instrument PR in the liquid recycled in pipe 24.
(d) Once Pm reaches Ps, the recycling is stopped by switching the valves 22 and 23 and the flow rate of the pump 15 is adjusted to an empirically predetermined value which corresponds to the normal operation of the apparatus; the reaction liquid containing fresh substrate is then transferred continuously from the tank 16 to the chamber 1 to undergo the reaction there and an equal volume of liquid containing the reaction product P (transformed substrate) is discharged from the chamber 1 to the tank 21.
(e) During this normal operation, Pm is continuously measured, compared with Ps in order to determine any deviation E = Ps - Pm and the adjustable potential El is increased or decreased accordingly, so as to cancel this deviation . In other words, E1 is continuously adjusted via source 14, as a function of Pm, as indicated by a dotted line connecting PR to 14 so that Pm is kept roughly equal to Ps. can thus maintain the reaction rate at a more or less constant value for a long time, thanks to this adjustment of the potential E1 so as to maintain an approximately constant enzymatic activity corresponding to Ps.
The enzymatic electrocatalysis effect obtained using the stirred bed in this apparatus according to FIG. 2, can be explained as follows:
(a) The adjustable potential E1 serves to control the reaction rate by acting on the enzymatic activity. Its initial value E1 is therefore chosen so that it corresponds to a relatively high activity making it possible to obtain a satisfactory reaction rate.
(b) The adjustment of this potential E1 during operation of the apparatus then serves to maintain a relatively high activity, corresponding to the desired reaction rate, since it makes it possible to rapidly compensate for variations in activity which appear during the operation. reaction and can result either from a change in the properties of the enzyme, or from a change in the reaction conditions, or both.
(c) Thus, each time an enzymatic particle pe collides with the working electrode Et1, the enzyme fixed on this particle is subjected to the action of the adjustable potential E1 and then exhibits a relatively high activity corresponding to E1.
(d) Now, given that the level of E1 is chosen so that it corresponds to a relatively high activity, the activity of the enzyme is lower in the absence of the action of E1 on the enzyme. . Thus, during the relatively long intervals between the successive collisions of each particle with the working Et1 electrode, the enzyme attached to each particle circulating within the stirred bed is at approximately its open circuit potential (OCV). , which corresponds to a state of equilibrium of potential with the reaction liquid. The activity of the enzyme will be relatively low, during this equilibrium, compared to the activity which results from the potential E1 which acts intermittently during said successive collisions.
Likewise, the enzymatic activity will also be lower during the collisions of each particle pe with the counter-electrode E2 because the potential E2 of the latter will correspond to a lower activity than said relatively high activity which results from the potential E1.
(e) Uniform, continuous circulation of the agitated bed by means of the agitator 9, however, makes it possible to obtain approximately uniform contacting of the particles pe with the Etl electrode and, consequently, an average catalytic effect. practically constant due to the action of the adjustable potential E1 on the enzyme fixed on all the particles pe of the stirred bed.
(f) However, during the circulation within the stirred bed, the liquid reaction system is intimately mixed with all the enzymatic particles undergoing the circulation and having a relatively low activity, so that the product of the reaction, which is formed at the surface of each particle, can be transferred very quickly to all of the reaction liquid within the stirred bed. Likewise, this intimate mixing makes it possible to ensure a continuous supply of the substrate to be transformed, from all of the reaction liquid to the surface of each particle pe of the stirred bed.
(g) This circulation of the agitated bed thus makes it possible to maintain a relatively high average enzymatic activity thanks to the intermittent action of the E1 potential, on the one hand, and to said effects obtained during the intimate mixing within the agitated bed, on the other hand. go.
Indeed, thanks to the intermittent reduction of the activity, accompanied by said intimate mixing, it is possible to obviate to a great extent the development of competitive inhibition phenomena which are liable to hinder the continuous course of a reaction to high speed. However, as is known, a competitive inhibition of the enzyme can result from an excessively rapid accumulation of the reaction product, which decreases the reaction rate, just as does an excessive variation in the pH of the reaction liquid located in contact with the enzyme.
(h) Thus, thanks to the combined action of the adjustment of E1 with the agitation of the bed and the circulation obtained by the pump 15, it is possible to maintain a relatively high and approximately constant average reaction rate during operation. of the appliance according to fig. 2 for relatively long periods.
The apparatus according to the form shown in FIG. 3 is provided with an enzymatic electrode comprising an enzymatic mass arranged in the form of a fluidized bed of enzymatic particles pe suspended in an ascending stream of reaction liquid SR which passes through a reaction column 1 between a lower inlet 25 and an upper outlet .
A coaxial jacket 26 surrounds column 1 to delimit an annular channel 27 which communicates with the upper outlet of this column.
A supply tank 16 for the liquid reaction system SR, containing the substrate to be transformed, is connected to the inlet 25 by means of a supply pipe 17 provided with a three-way valve 22 and a pump 33 with adjustable flow rate.
At the lower end of column 1, a porous distribution inlet plate 34 is arranged transversely to allow the passage of a uniform liquid stream and to prevent the passage of the particles Pe from the fluidized bed.
The wall delimiting the column 1 is formed of an electrical conductor (for example of titanium) and at the same time constitutes a working electrode Etl connected via the input 25 to a terminal (El) of a source 28 power supply.
The internal surface of this wall of column 1, which constitutes the Et1 electrode, is provided with a series of radial baffles 29 in the form of radial bars for example.
Column 1 is further provided with a counter-electrode E2 formed of an axial metal bar 30 (of titanium) which carries a series of transverse conductive members 31, in the form of titanium grids, for example, and which is suspended from a conductive cover 32 through which the bar 30 is connected to a second terminal (E2) of the source 28. As can be seen from FIG. 3, the series of baffles 29 and members 31 are arranged in a staggered fashion, and this so that the ascending liquid has an approximately uniform average vertical speed, on the one hand, making it possible to maintain the fluidized bed of suspended particles pe in the column. On the other hand, this arrangement serves to deflect the ascending liquid alternately towards the wall forming the electrode Et1 and towards the counter-electrode E2 (30, 31).
The particles pe of the fluidized bed can be prepared from a pulverulent or granular graphite support on which the enzyme is fixed in any suitable manner as mentioned above.
The porosity (liquid / solid volumetric ratio) of the fluidized bed can be about 0.65.
Using well-known fluidization techniques, it is possible to choose the average size of the particles pe between 400 and 1500 Il and to choose the speed of rise of the liquid, as a function of this size, so as to form the fluidized bed, to maintain it in the
column 1 and to avoid the entrainment of Pe particles outside
this column.
The liquid coming out of the fluidized bed, at the upper open end
of reaction column 1, flows into channel 27 where it
flows down and passes through exit 3.
Output 3 contains a PR measuring instrument and is connected to
a reservoir 21 for the product P of the reaction, through
diary of a conduit 20 provided with a three-way valve 23. This
valve 23 also makes it possible to connect the outlet 3 to the inlet 25 by means of a branch pipe 24 (by-pass)
sant to the valve 22, in order to thus allow recycling in the
column 1.
The power supply source 28 is arranged so
to apply between the two electrodes Et1 and E2 an adjustable potential difference AE1-2 = El -E2, the initial value of which dEi is
predetermined empirically, displayed on the source 28 and correspond
pond at an initial potential Ei of the working electrode Etl by
compared to a reference electrode not shown in FIG. 3.
As in the previous cases, source 28 allows the display of a setpoint value Ps of an output quantity P and the
adjustment of AEI-2 according to the difference between Ps and a value Pm
measured by the PR instrument.
The apparatus described according to FIG. 3 can be used for the implementation
of the invention as follows:
(a) After introducing an appropriate mass of particles
enzymatic e.g. in column 1, the device is assembled according to
fig. 3, the AE values are displayed; and Ps on source 28 and we put in
runs pump 33 with an appropriate, predetermined flow rate
empirically, so that the liquid reaction system SP
from tank 16 flows upwards in column 1
with a predetermined rate of climb allowing
forming and maintaining a fluidized bed.
(b) The enzymatic catalysis of the reaction is thus obtained
desired by means of the Pe particles of this fluidized bed in the
column 1 and the liquid containing the product P of this reaction
passes through channel 27 to exit 3 from where it is routed by the
valve 23 to pipe 20 which brings it to tank 21.
(c) However, the Pe particles of the fluidized bed enter alternately
in collision with the Et1 and Et2 electrodes and their enzymatic activity depends essentially on the potential El applied to the elec
Etl trode by source 28.
(d) While the reaction is proceeding in column 1, we
measure Pm by means of the instrument PR, one determines all
difference E which appears between Pm and Ps and we adjust AEI 2 as a function
of this difference, via the source 28, so as to
keep Pm roughly equal to Ps.
(e) This maintains an average reaction rate
desired, which corresponds to the displayed setpoint value Ps, thanks to
to the adjustment of AEl - 2 in combination with the action of the fluidized bed.
Indeed, as in the case of the agitated bed according to FIG. 2, the flui bed
said according to fig. 3 allows the enzyme attached to each
particle pe at short periods of relatively high activity during
of these successive collisions with the Etl working electrode, with
intermediate periods of relatively reduced activity when
the particle is not subjected to the action of the potential E1 of this
electrode. In addition, the enzymatic particles Pe of the fluidized bed
thus formed also undergo a very intimate mixture with the
liquid reaction system Sr, which ensures a result
analogue to obviate the development of phenomena
competitive inhibition.
The use of such a fluidized bed makes it possible to use, in a manner
both simple and effective, a relatively large mass of
particles associated with the enzyme electrode, by dimensioning
column 1 accordingly. In addition, the fluidized bed makes it possible to obtain
to achieve a uniform flow of the reaction liquid SR medium and its
smooth progression through the fluidized bed, which avoids
a significant mixing (back-mixing) of the liquid having undergone different
rents reaction stages. This makes it possible, in particular, to more easily avoid the development of competitive inhibition phenomena which are due to the presence of the reaction product P in the liquid in immediate contact with the enzyme and which can considerably affect the enzymatic catalysis of certain products. reactions.
However, the switching of the valves 22 and 23 allows the recycling of the liquid through the column 1, for example during an initial start-up phase intended to rapidly reach a value Pm = Ps, as has been described with respect to the fig. 2, before proceeding to continuous operation where the liquid leaving the column 1 is discharged directly into the reservoir 21. This recycling can also be envisaged for the normal operation of the apparatus according to FIG. 3, alternating with intermediate phases for the evacuation of liquid in the reservoir 21 and the supply of the column 1 from the reservoir 16 with liquid SR containing fresh substrate to be transformed. As a variant, the source 28 can comprise a potentiostat and be associated with a reference electrode.
A potential E1 of adjustable value with respect to this reference electrode will then be applied to the electrode Et1, as in the case of the device according to FIG. 2.
It is obvious that various variations of the apparatus described above can be used. Thus, for example the fixed, inert working electrode associated with the enzymatic mass can have any configuration capable of ensuring a triple electrical contact and a satisfactory relative movement between the liquid reaction system, the divided enzymatic mass and the electrode of fixed work. Likewise, the counter-electrode can have any desired shape and any suitable relative arrangement with respect to the enzymatic electrode.
In addition, said relative movement can be effected in various ways. Thus, for example, it is possible to envisage, as a variant of the fluidized bed maintained in place, to circulate a suspension of enzymatic particles in the reaction system, so that each particle in suspension circulates through the reaction chamber and is subjected to intermittent contact with the working electrode by repeated collisions with this electrode, either in a single pass or in several successive passes (by recycling) of each particle through the reaction chamber.
The following examples illustrate the application of the method according to the invention.
E.rez11ple 1:
Degreased and deproteinized whey is subjected to hydrolysis catalyzed by lactase and intended to transform lactose into glucose and galactose, in an apparatus according to FIG. 1.
The enzymatic electrode then comprises a mass of enzymatic particles Pe formed from graphite particles (average size 1500 l <) carrying the lactase enzyme and constituting a porous fixed bed placed in contact with the Etl working electrode. This bed is traversed by the whey to be hydrolyzed, supplied to the reaction cell I under more or less constant conditions (flow rate, composition, temperature, pH) which are predetermined empirically. In this case, the initial lactose content of the whey was 45 g / l, the temperature 25 C and the pH 6.5.
In this case, the enzymatic electrode is subjected to a periodic positive polarization, by applying to the Et1 electrode a potential E1 which initially alternates between + 900 m VIECS and +300 m VIECS (E = +600 m VIECS).
The average value of the applied potential E1 is then adjusted in the form of periodic pulses (frequency I Hz). as a function of the glucose content Pm measured in the liquid passing through the outlet 3, so as to maintain a constant glucose content corresponding to the desired setpoint value Ps, in this case 13.5 g of glucose per liter.
This periodic variation of E1 and the adjustment of its average value makes it possible to maintain a relatively high average enzymatic activity which corresponds to an approximately constant reaction rate and thus provides a product which has a uniform composition, i.e. a uniform content of glucose and galactose.
In this case, the gain in activity due to the application of the adjustable potential E1 was 50%.
Example 2:
The hydrolysis of the whey is carried out as in Example 1 but in an apparatus according to FIG. 2, comprising an enzymatic stirred bed electrode.
The electrode is also positively polarized in this case and the initial value E1 (experimentally predetermined) of the potential E1 applied to the electrode Et1 is then of the order of + 1100 mV / ECS. The E1 value is then adjusted as a function of Pm so as to maintain a relatively high average enzyme activity which provides a uniform processed product, as in Example 1.
In this case, the gain in activity due to the application of E1 was 100%. Further, 100% hydrolysis was performed.
It is understood that the enzymatic catalysis carried out in accordance with the present invention is applicable to practically all reactions catalyzed by an enzyme and can be carried out in any type of apparatus comprising a suitable enzyme electrode allowing adjustment of the potential of the support of the enzyme. enzyme attached.
Likewise, the adjustment ranges of E1 may be very different from those mentioned above. The frequency of the voltage pulses can have any suitable value and they can have different shapes (square, triangular, etc.).
As emerges from the foregoing, the present invention makes it possible to carry out an adjustable heterogeneous enzymatic catalysis so as to be able to meet all the requirements of an industrial process.
Indeed, the invention makes it possible to combine several important technical advantages such as:
(i) obtaining a maximum active surface area per unit volume of the electrode, the surface available for the binding of the enzyme on all of the particles and therefore for its use for carrying out the adjustable catalysis being extremely high;
(ii) very efficient use of the large overall active surface area of the enzyme fixed on particles, thanks to the intimate contact obtained by the relative movement between the liquid reaction medium and the enzymatic particles:
(iii) easy adjustment of the enzymatic activity thanks to an adjustable electrical polarization of each enzymatic particle:
(iv) possibility of maintaining a satisfactory average enzymatic activity thanks to an alternating variation of the electrical potential of the enzyme, during which:
: (a) the enzyme exhibits on the one hand a high activity obtained by
intermittent and adjustable polarization, in order to be able to
compensate for variations in activity, whatever the cause
(aging, varying reaction conditions, etc.): (b) the enzyme exhibits reduced activity for periods
intermediaries, allowing to largely obviate the evolution of
competitive inhibition phenomena.