Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen ss -substituierten Propionsäuren der allgemeinen For mehl 1
EMI1.1
in der R eine Kette von 3 oder 4 CH2-Gruppen bedeutet, deren erste auch durch -0- oder -NH- ersetzt sein kann und X und/oder Y für H, OH, Acetoxy, niederes Alkyl, beispielsweise Methyl oder Äthyl, sowie durch Hydroxy- oder Oxogruppen substituiertes und/oder durch Sauerstoff unterbrochenes niederes Alkyl, beispielsweise -COCH3, -CHOH-CH3, -CO-CH2OH, -COCH2OCOCH3, wobei X und Y miteinander verbunden sein können, oder X und Y zusammen Sauerstoff bedeuten. Es sind bereits einige Vertreter dieser Verbindungsklasse bekannt.
So wurde 7a-Me thyl-perhydroindandion-(1,5)-[(3 -propionsäure-(4)] sowohl auf synthetischem Wege als auch durch mikrobiellen Abbau hergestellt. Durch das DWP 54 654 ist bekannt, 7a-Methyl 1-acetyl-perhydroindanon-(5)-6B-propionsäure-(4)] aus C21-Steroiden mit Kulturen der Art Nocardia opaca oder deren Enzymen herzustellen. Ähnliche Verbindungen mit einer Säuregruppierung in 1-Stellung sind ebenfalls auf mikrobiellem Wege hergestellt worden. So wurde 7a-Methyl1 -valeriansäure-perhydroindanon-(5) Iss -propionsäure (4)] durch Kultivierung von Corynebacterium (Arthrobactor) simplex in einem Medium, das Cholsäure enthält, hergestellt (BP 1 078 166). Diese bekannten Verfahren haben allgemein den Mangel schlechter Reproduzierbarkeit.
Die angegebenen Ausbeuten können oftmals nicht realisiert werden und zeigen bei geringen Änderungen der Wachstumsbedingungen der Mikroorganismen mitunter starke Schwankungen. Verhältnismässig lange Fermentationszeiten haben zur Folge, dass die gebildeten Verbindungen teilweise weiter abgebaut werden und damit die Ausbeute herabgesetzt wird. Ausserdem können während dieser Zeit Störungen durch eventuelle Fremdinfektionen erfolgen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Mängel zu beseitigen und ein allgemein anwendbares und reproduzierbares mikrobielles Verfahren zur Herstellung ,B-sub- stituierter Propionsäuren der allgemeinen Formel I zu finden.
Erfindungsgemäss werden Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt, indem man im A- und/oder B-Ring ein- oder mehrfach ungesättigte 3-Ketosteroide der allgemeinen Formeln IIa und/oder IIb:
EMI1.2
in denen R, X und Y die obengenannte Bedeutung haben und Z für = 0 oder -H und -OH steht, in einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (beispielsweise Dimethylformamid) löst und mit aeroben Kulturen von unter Wachstumsbedingungen gezüchteten Stämmen der Gattung Nocardia spec. oder deren Enzymen behandelt.
Die Fermentation wird nach 10-100, vorzugsweise 20 bis 50 Stunden, abgebrochen und die gebildete Verbindung in bekannter Weise, wie das von der Isolierung ähnlicher Verbindungen bekannt ist, abgetrennt und isoliert. Im allmeinen empfiehlt sich ausserdem der Zusatz eines Metallkomplexes, vorzugsweise Eisenacetylacetonat, zur Fermenta tionslösung. Beispielsweise wird ein Bakterienstamm der Gattung Nocardia opaca IMET 7030 (deponiert im Institut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Deutschen Akademie der Wissenschaften, 69 Jena, Beuthenbergstrasse 11 auf einem Nähragar der Zusammensetzung: Dextrose 10,0 g, bakt. Pepton 10,0 g, Caseinhydrolysat 10,0 g, Hefeextrakt 20,0 g, NaCI 6,0 g. ad 1000,0 cm3 Leitungswasser, pH 7,0 [H. Prauser und W. Köhler, Z. allgem.
Mikrobiologie, 5/4, 308 (1965)] angezüchtet, Difco-Nutrient Broth damit beimpft und gleichzeitig das Steroid, beispielsweise Progesteron, in einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid sowie ein Metallkomplex, vorzugsweise Eisenacetylacetonat, in einem organischen Lösungsmittel.
beispielsweise Äthanol, zugesetzt und das gebildete Produkt nach der Fermentation in bekannter Weise abgetrennt und isoliert.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsart des Verfahrens besteht darin, dass der Fermentationslösung ein Ionenaustauscher. vorzugsweise ein basischer Ionenaustauscher, beispielsweise Amberlite. zugesetzt wird. Die Zugabe des Ionenaustauschers in einer seiner Kapazität entsprechenden Menge erfolgt gleichzeitig mit der Zugabe des Steroids zur beimpften Nährlösung. Die entstehende Verbindung wird dadurch sofort an den Austauscher gebunden und so dem weiteren Abbau entzogen. Nach Beendigung der Reaktion wird die gebildete Verbindung mit einem Lösungsmittelgemisch, beispielsweise Methanol/Ameisensäure, eluiert und nach dem Einengen zur Trockne durch Lösen in Natriumbicarbonatlösung. Ansäuern und Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform oder Essigester, gereinigt. Der Ionenaustauscher kann anschliessend regeneriert und wieder eingesetzt werden.
Das Verfahren ermöglicht in einfacher Weise die Herstellung bisher unbekannter Verbindungen. Es verläuft ohne besonderen Aufwand in einer Stufe mit guten und reproduzierbaren Ausbeuten. Ein weiterer Vorzug des Verfahrens ist darin zu sehen, dass hohe Steroidkonzentrationen in der Bakterienkultur eingesetzt werden können. Ausserdem besitzt es den Vorteil, dass optisch aktive Verbindungen entstehen. Durch Zusätze von Metallkomplexen oder Ionen austauschern werden die Fermentationszeiten verkürzt und der weitere Abbau der gebildeten Verbindung sowie eventuell auftretende Fremdinfektionen eingeschränkt.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind Stoffwechselprodukte von anabol, androgen oder gestagen wirksamen Steroiden. Stoffwechselprodukte dieser Verbindungen üben im menschlichen oder tierischen Organismus regulative Funktionen aus und haben daher pharmakologische Bedeutung. Ausserdem sind die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen für den Aufbau weiterer biologisch wirksamer Substanzen, z. B. von Retrosteroiden, von Interesse.
Die Erfindung soll nachstehend an Beispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1 1-Methyl-cyclohexan-( 1)-ol-(4)-on-2,3-dipropionsäurelacton aus Testololacton
Einhundert 500-cm3-Rundkolben mit je 100 cm3 Difco Nutrient-Broth werden mit je einem 3 Tage alten Schrägröhrchen von Nocardia restrictus IMET 7136 (unter der Nr. 217 bei der World Survey of Collections of Microorganisms WFCC registriert), welche bei 28 auf 2%igem Glycerinagar angezüchtet worden waren, beimpft. Die weitere Kultivierung erfolgt bei 25" auf einem Rundschwingtisch. Nach 24 Stunden wird insgesamt 1 g Testololacton in 50 cm3 Dimethylformamid auf diese 100 Kolben gleichmässig verteilt und weitere 42 Stunden bei 25 geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird das Kulturmedium mit 5n HCI auf pH 3 angesäuert und mit Chloroform extrahiert.
Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird der braune, ölige Rückstand zweimal an einer Kieselgelsäule (15 x 250 mm) chromatographiert.
Es wurden 30 Fraktionen zu je 10 cm3 abgenommen: Fraktion 1- 5 Chloroform plus 5% Äthylacetat-Ameisensäuregemisch (100:25) Fraktion 6-10 Chloroform plus 10% Äthylacetat-Ameisensäuregemisch (100:25) Fraktion 11-15 Chloroform plus 15% Äthylacetat-Ameisensäuregemisch (100:25) Fraktion 16-20 Chloroform plus 20% Äthylacetat-Ameisensäuregemisch (100:25) Fraktion 21-25 Chloroform plus 30% Äthylacetat-Ameisensäuregemisch (100:25) Fraktion 26-30 Chloroform plus 40% Äthylacetat-Ameisensäuregemisch (100:25)
Die Fraktionen 14-22 wurden zur Trockne gebracht und der kristalline Rückstand (460 mg = 55% d. Th.) je einmal aus Chloroform und Äthylacetat umkristallisiert.
Schmp. 129 bis 131", [a]D22 -1,8 in Aceton (c = 1%)
Beispiel 2
7a, la-Dimethyl-perhydroindanol-(l)-on-(5)-[ propionsäure-(4)] aus 17a-Methyltestosteron
Einhundert 500-cm3-Rundkolben mit je 50 cm3 Difco Nutrient-Broth wurden mit je einem 4 Tage alten Schrägröhrchen von Nocardia restrictus IMET 7136 (unter der Nr. 217 bei der World Survey of Collections of Microorganisms WFCC registriert), welche bei 28 auf 2%igem Glycerinagar angezüchtet worden war, beimpft. Die weitere Kultivierung erfolgte bei 25 auf einem Rundschwingtisch.
Zu dieser Kultur wurden nach 24 Stunden insgesamt 2,4 g 17u- Methyl-testosteron (F. 163-168) in 16 cm3 Dimethylformamid zugegeben und weitere 24 Stunden bei 25 geschüttelt.
Zur Aufarbeitung wurde das Kulturmedium mit 5n HCl auf pH 3 angesäuert und dreimal mit 500 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, auf etwa 100 cm3 eingeengt und dreimal mit gesättigter NaHCO3 Lösung ausgeschüttelt. Die vereinigte NaHCO3-Lösung wurde mit 5n HCI angesäuert und dreimal mit 50 cm3 Äthylacetat extrahiert. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde ein halbkristalliner Rückstand (1,49 g) erhalten, der zur weiteren Reinigung an einer Kieselgelsäule (20 x 280 mm) chromatographiert wurde.
Es wurden 20 Fraktionen zu je 20 cm3 abgenommen.
Eluiert wurde mit einem Gemisch von Chloroform-Äthylacetat-Ameisensäure (375:100:25). Die Fraktionen 9-15 ergaben nach Einengung 1,0 g kristalline Ketonsäure ( = 49,5 % d. Th.). Je eine Umkristallisation aus Äthylmethylketon sowie aus Äthylacetat ergaben 835 mg 7a, 1a-Dimethyl- perhydroindanol-(1)-on-(5)-6B-propionsäure-(4)] vom Schmp. 162-166", [a]n20 34,90 in Aceton (c = 1%).
Beispiel 3
7a-Methyl- 1 -acetyl-perhydroindanon-(5)- ;B-propionsäure- (4)] aus Progesteron
50 cm3 Difco-Nutrient-Broth in einem 500-cm3-Rundkolben werden mit der Kultur eines 5 Tage alten Schrägröhrchens von Nocardia opaca, welches bei 28 C auf Nähragar (Dextrose 10,0 g, bakt. Pepton 10,0 g, Caseinhydrolysat 10,0 cm3, Hefeextrakt 2,0 g, NaCl 6,0 g, ad 1000,0 ml Leitungswasser; pH 7,0) angezüchtet worden war, beimpft.
Gleichzeitig erfolgt die Zugabe von 150 mg Progesteron in 1 cm3 Dimethylformamid und 5 mg Eisenacetylacetonat in 0,2 cm3 Alkohol. Die weitere Fermentation erfolgt bei 280 C auf einem Rundschwingtisch. Nach etwa 48 Stunden wird das Kulturmedium mit 5n HCI auf pH 3 angesäuert und dreimal mit 50 cm3 Chloroform extrahiert. Die Auszüge werden vereinigt, über Na2SO4 getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand wird mit 20 cm3 Benzol/Äther (1:1) in einen Schütteltrichter überführt und dreimal mit 10 cm3 5 %iger NaHCO3-Lösung ausgeschüttelt. Die vereinigte NaHCO3-Lösung wird mit 5n HCI angesäuert und dreimal mit 20 cm3 Chloroform extrahiert. Der vereinigte und über NaSO4 getrocknete Chloroformextrakt ergibt nach Abdestillieren des Lösungsmittels einen kristallinen Rückstand, aus dem nach Lösen in Äther und Behandlung mit wenig Aktivkohle, nach Einengen beim Stehen in der Kälte die 7a Methyl- 1-acetylperhydroindanon-(5)-[ss-propionsäure (4)] vom Schmp. 90 bis 93" C und (a)D23 +79 (Chlf.) auskristallisiert. Ausbeute 77% d. Th.
Beispiel 4
7 a-Methyl- 1-acetyl-perhydroindanon-(5)-[ss-propionsäure- (4)] aus Progesteron
50 cm3 Difco-Nutrient-Broth in einem 500-cm3-Rundkolben werden mit der Kultur eines 5 bis 6 Tage alten Schrägröhrchens von Nocardia opaca, welches bei 28 C auf Nähragar (Dextrose 10,0 g bakt. Pepton 10,0 g, Caseinhydrolysat 10,0 g, Hefeextrakt 2,0 g, NaCl 6,0 g, ad 1000,0 ml Leitungswasser; pH 7,0) angezüchtet worden war, beimpft.
Gleichzeitig erfolgt die Zugabe von 150 mg Progesteron in 1 cm3 Dimethylformamid sowie 10 cm3 Amberlite IRA 410, der vorher mit 1n Na2CO3-Lösung in die Karbonat-Form gebracht worden war. Die anschliessende Fermentation erfolgt bei 28 C auf einem Rundschwingtisch. Nach 48 Stunden wird vom Austauscher abfiltriert und nacheinander mit Wasser und Methanol gewaschen. Nach Überführung in eine Säule (15 > < x 100 100 mm) wird der Austauscher mit 200 cm3 Methanol-Ameisensäure-Gemisch (95 :5) eluiert. Das Eluat wird i. V. bei etwa 400 C zur Trockne gebracht, in wenig 5%iger NaHCO3-Lösung gelöst, mit 5n HCI angesäuert und mit Chloroform extrahiert.
Nach Abdestillieren des Lösungsmittels liegt die 7a-Methyl- 1-acetyl-perhydroindanon-(5)- [ss-propionsäure-(4)] in kristalliner Form vor. Ausbeute: 80% d. Th.