Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide
Es ist bekannt, dass das Tetracosapeptid der Formel
L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L- prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-
L-prolin sowie die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, die Wirkung des natürlichen Adrenocoitcotropins (ACTH) hat.
Das natürliche Hormon, wie auch das oben genannte synthetische Tetracosapeptid enthalten ausschliesslich optisch aktive Aminosäuren der L-Form. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Tetracosapeptide der oben genannten Aminosäurezusammensetzung, in welchen die erste Aminosäure (Serin), D- oder D,L-Konfiguration hat, eine bessere adrenocorticotrope Wirkung als das nur LÁminosäuren aufweisende Tetracosapeptid besitzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des Tetracosapeptids der Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-Larginyl-L- prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl
L-prolin, in der die erste Aminosäure D- oder D,L-Konfiguration hat, sowie der entsprechenden Verbindung, welche statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, ferner von Säureadditionssalzen und deren Verwendung zur Herstellung von Komplexen der genannten Peptide mit komplexbildenden Metallen, wie Kupfer, Kobalt, und insbesondere Zink, oder schwerlöslichen Salzen oder Hydroxyden dieser Metalle, vor allem Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat, Zinkhydroxyd und Zinkcarbonat.
Die bei einem pH von 7-8 in wässriger Lösung ausfallenden, schwerlöslichen Komplexe enthalten das Peptid chemisch gebunden an die schwerlösliche Metallverbindung, z. B. an Zinkphosphat, vgl. Schweizer Patent Nr. 467 073.
Die neuen Verbindungen haben eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit und sollen in der Human- und Veterinärmedizin an Stelle des natürlichen Hormons verwendet werden.
Die neuen Tetracosapeptide werden erfindungsgemäss erhalten, wenn man die Aminosäuren D-Serin (oder D,L-Serin), L-Tyrosin, L-Serin, L-Methionin, L-Glutaminsäure (oder L-Glutamin), L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryptophan, Glycin, L-Lysin, L Prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, LArginin, L-Arginin, L-Prolin, L-Valin, L-Lysin, L-Valin, L Tyrosin, L-Prolin in der angegebenen Reihenfolge unter intermediärem Schutz der Amino- bzw. Carboxylgruppen miteinander vereinigt. Die Aminosäuren werden in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Beispielsweise kann man eines der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw.
Peptidmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids, verknüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z. B.
ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid (z. B. aus N-Athyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sul- fonat, s. Woodward et al., J. Am. Chem. Soc. 89, 1011 [1961]), oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester oder Carboxymethylthiolester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe), z. B.
einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden.
An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbe sondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl-, Tritylrestes oder der Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl gruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonyl- restes.
Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann vorteilhaft durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die tSberfüh- rung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Vorteilhaft kondensiert man das Dekapeptid der Formel
L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (oder glutaminyl-)-L-histidyl-L-phenylalanyl
L-arginyl-L-tryptophyl-glycin, in dem die a-Aminogruppe des Seryls und gegebenenfalls die y-Carboxylgruppe des Glutamyls geschützt sind, in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem Ester des Tetradecapeptids der Formel
L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L valyl-L-tyrosyl-L-prolin, in dem die e-Aminogruppen des Lysyls geschützt sind.
Als Schutzgruppen für die a-Aminogruppe des Seryls und die Aminogruppen des Lysyls verwendet man vor- zugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (B OC); die df^-Carboxylgruppe des Glutamyls und die Endcarboxylgruppe des Prolins werden vorteilhaft durch die tert. - Butylestergruppe geschützt.
Das genannte Tetradecapeptid kann beispielsweise nach den in der deutschen Patentschrift Nr. 1196 666 oder Nr. 1 214242 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Dekapeptid kann analog dem im Schweizer Patent Nr. 408 948 oder in den deutschen Patenten Nr. 1 212981 oder Nr. 1 210 877 beschriebenen Dekapeptid hergestellt werden. Man kann auch die Iminogruppe des Histidins durch den Benzyl- oder Tritylrest schützen, wie im Schweizer Patent Nr. 409 992 oder im französischen Patent Nr. 85 518 gezeigt, und das so geschützte Dekapeptidderivat mit dem Tetradekapeptidester kondensieren.
Ferner kann man auch vorteilhaft das Tetrapeptid tert.-Butyloxycarbonyl D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionrn mit dem Eikosapeptidester L-Glutamyl-(oder Glutaminyl-)L-histidyl-L phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycyl-L- lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-Llysyl-L arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L valyl-L-tyrosyl-L-prolinester, in dem die E-Aminogruppen der Lysinreste durch die tert . -Butyloxycarbonylgruppe und die Carboxylgruppen des Prolin- und gegebenenfalls Glutaminsäurerestes durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind, kondensieren, beispielsweise nach der Azidmethode, wie im deutschen Patent Nr. 1196666 (Case 4823) beschrieben.
Der Eikosapeptidester mit Glutaminsäure als erster Aminosäure wird z. B. erhalten, wenn man Carbobenzoxy (i,-tert.-butyl) zL-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit dem Tritosylat des Tetradekapeptidderivates E-tert. -Butyl-oxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valyl-glycyl-tert. -butyloxycarbonyl-Llysyl-tert . butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl
L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester kondensiert und die Carbobenzoxygruppe hydrogenolytisch in Gegenwart von Eisessig und Palladiumkohle abspaltet.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze gewinnen, wie z. B.
solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Nijialonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleins äure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoes äure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfons äure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure,
Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Tetrakosapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Die neuen Tetracosapeptide können in analoger Weise wie die nur L-Konfiguration aufweisenden Tetracosapeptide in Kompiexverbindungen übergeführt werden. So kann man insbesondere Zinkphosphat-, Zinkhydroxyd- und Zinkcarbonatkomplexe oder nach dem in der schweizerischen Patentschrift Nr. 490 337 beschriebenen Verfahren Zinkpyrophosphatkomplexe herstellen. Man erhält diese Komplexe, indem man eine saure wässrige Lösung, welche das Peptid und ein wasserlösliches Zinksalz enthält, mit einem Alkalimetallhydroxyd, -phosphat oder -pyrophosphat umsetzt und das pH auf 7-8 einstellt.
Die Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Folgende Systeme wurden für die Dünnschichtchromatographie (an Silicagel) verwendet: System 43: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100 :40:55).
System 52: n-Butanol-Essigsäure-Wasser (100:10:30).
System 100: Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60:20:6:11).
System 101: n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30 :20 : 6: 24).
Beispiele 1. tert.-Butyloxycarbonyl-D-serin-hydrat
10,5 g (0,1 Mol) D-Serin werden in 50 ml 2n Natronlauge gelöst und mit einer Lösung von 15,7 g (0,11 Mol) tert.-Butyloxycarbonylazid in 50 ml Methanol versetzt. Anschliessend werden 11,1 g (0,11 Mol) Triäthylamin in 100 ml Methanol unter Rühren bei 400 innert 4 Stunden zugetropft. Nach weiterem Rühren während 2 Stunden bei 400 und über Nacht bei Zimmertemperatur wird die Reaktionslösung durch Zugabe von 2n Salzsäure auf pH 6-7 gestellt und darauf im Vakuum bei 300 von Methanol befreit. Die wässrige Lösung wird mit Essigester überschichtet und bei 0 unter Rühren mit konz. Salzsäure auf pH 1-2 gestellt. Die Essigesterphase wird rasch abgetrennt, mehrmals mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Das erhaltene Öl (19,8 g) kristallisiert als Monohydrat beim Verreiben mit wenig Wasser bei 00: 15,95 g (71 %), F. 50-520. Nach Umkristallisieren aus wenig Wasser: F. = unverändert; [a] 2D= -f-9,10 + 10 (c = 1,1 in Wasser). Die Substanz ist gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich: Rf43 = 0,31; Rf1o0= 0,65.
2. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L methionin-methylester.
8,26 g (20 mMol) L-Tyrosyl-L-seryl-L-methioninmethylester werden unter Erwärmen auf 700 in einem Gemisch von 150 ml Acetonitril und 10 ml Dimethylformamid gelöst und nach Kühlen auf Zimmertemperatur mit 4,46 g (20 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-serin versetzt. Die Lösung wird auf -5 gekühlt, unter Rühren mit einer Lösung von 4,53 g (22 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Acetonitril versetzt und eine Stunde bei -5 und über Nacht bei 0 gerührt. Nach Zugabe von 0,15 ml Eisessig wird das Reaktionsgemisch weitere 30 Min. bei 0 gerührt, der ausgeschiedene Dicyclohexyl harnstoff abfiltriert und das Filtrat bei 0,1 mm Hg eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen, die Lösung bei 0 mit ln Salzsäure, 1n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand verfestigt sich beim Verreiben mit Äther; nach Umkristallisieren aus Methanol-Äther: 9,1 g (76, F. 152-1550; [a]D= -7,00 + 10 (c = 0,9 in Methanol). Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm folgende Rf-Werte: Rf = 0,29 in Chloroform + Methanol (9:1); Rf4s = 0,78; Rfioo = 0,85.
3. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methionin-hydrazid.
Eine Lösung von 12 g (20 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl - D -seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methyl- ester in 50 ml Methanol wird mit 5 ml (0,1 Mol) Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 3 Stunden wird das ausgeschiedene kristalline Hydrazid abfiltriert und mit Wasser und Äthanol gewaschen: 9,82 g (82%), F. 148-152 ; umkristallisiert aus Methanol: F. 150-1530; [a]2D=-6,3 + 10 (c = 1 in Methanol). Die Substanz ist gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich: Rfo3 = 0,65; Rf,e = 0,57; Rftoo = 0,51.
4. tert .-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methionyl-(y-tert.-butyl)-Uglutamyl-L-histidyl-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin.
1,43 g (2,4 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L- tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid werden bei - 100 in 15 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und bei dieser Temperatur mit 1,58 ml eiskalter 6n Salzsäure versetzt. Hierauf tropft man bei -XO 0,5 ml eiskalte 5n Natriumnitritlösung dazu und lässt 25 Min. bei -5 bis 80 reagieren. Gleichzeitig werden 1,65 g y-tert.-Butyl-L- glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl - L - tryptophylglycin (1,9 mMol), in 5 ml warmem Dimethylformamid gelöst, auf -100 gekühlt und mit 1,85 ml Triäthylamin versetzt.
Bei -150 trägt man die eiskalte Lösung des BOC-Tetrapeptidazides ein, rührt noch 1 Stunde bei -100 und lässt über Nacht bei 0 weiterreagieren. Aus der Reaktionslösung scheidet sich wenig anorganisches Salz aus. Dieses wird durch Filtration abgetrennt und die resultierende Lösung am Hochvakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Das rohe amorphe BOC-Dekapeptid wird mit 100 ml 2n Ammoniumhydroxydlösung ausgefällt, abgenutscht und mit Wasser neutral gewaschen.
Nach dem Trocknen erhält man 1,88 g rohes DekaPep- tidderivat. Die Kristallisation aus 50 ml 90 %igem Methanol gibt 1,2 g reines BOC-Dekapeptid. F. 2080 (Zers.). Die Dünnschichtchromatogramme auf Silikagel in den Systemen 52 und 101 zeigen nur je einen Fleck mit Pauly-Ehrlich- und Reindel-Hoppe-Reagens. Rf5e 0,2 und Rflol = 0,6. [a]D = -160 1 10 (c = 0,9 in 50 %igem Pyridin).
5. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methionyl-(r-tert. -butyl) -L-glutamyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-tert. butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L- valyl-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester.
Unter Stickstoff werden 0,725 g tert.-Butyloxycarbonyl-l)-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methionyl-(y-tert.-butyl) -L-glutamyl-L histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl glycin (0,5 mMol) und 1,11 g (0,5 mMol) e-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L- lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert. butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L prolin-tert .-butylester-trihydrochlorid in 5 ml 90 Sigem Pyridin während 1 Stunde bei 500 gerührt, dann gibt man 175 mg (0,85 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid dazu und nach 5 Stunden nochmals die gleiche Menge Carbodiimid.
Man lässt 24 Stunden bei der erwähnten Temperatur reagieren, filtriert vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab (161 mg) und fällt das rohe Reaktionsprodukt mit viel Essigester aus (1,77 g). Das Hydrochlorid wird an einem Ionenaustauscher Amberlite IR-4B (Acetatform) (m 16 mm, h = 27 cm) in das Triacetat übergeführt. Zur Reinigung wird die gesamte Menge des geschützten Tetracosapeptidesters in 50 % tert.-Butanol an einer Carboxymethylcellulosesäule (e 16 mm, h = 17 cm) mittels 50 zeigen tert.-Butanols, enthaltend steigende Konzentrationen von 2n Essigsäure, chromatographiert.
Neben Randfraktionen lässt sich der reine geschützte Tetracosapeptidester mittels 50%gen tert.-Butanols und 2n Essigsäure (96 : 4) eluieren. Ausbeute: 740 mg.
Im Dünnschichtchromatogramm zeigt diese Fraktion im System 101 nur 1 Fleck mit Pauly-, Reindel Hoppe- oder Ninhydrin-Reagens, Rf = 0,6. [a]D = 490 + 20 (c = 0,62 in Methanol).
U. V.-Spektrum in 0,1n Natronlauge in Methanol: man 283 ma, e = 8600 und ;tmax 289 mu, zur = 8950.
Verhältnis Tyr 1,9.
Try 6. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L- valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-hexaacetat.
500 mg geschützter Tetracosapeptid-tert.-butylester werden mit 5,5 ml 9ûSiger Trifluoressigsäure während 30 Min. bei Zimmertemperatur gespalten. Das Trifluoracetat wird mit viel peroxydfreiem Äther ausgefällt, abfiltriert mit viel Äther und zum Schluss mit Petroläther gewaschen. Der amorphe Rückstand wird in Wasser gelöst und das Trifluoracetat ins Acetat an einer Ionenaustauschersäule von Amberlite IR-45 übergeführt. Ausbeute: 450 mg dünnschichtchromatographisch reines Tetracosapeptid. Rftot = 0,5 (an Aluminiumoxyd).
k.]D = -850 + 1,5 (c = 0,62 in 1 %iger Essigsäure).
UV.-Spektrum in 0,ln Natronlauge: imaX 283 m e = 8300 und 288 m,m, e = 8600.
Das Peptid lässt sich nicht mit Leucinaminopeptidase spalten.
Im Saffran- und Sayertest zeigt es eine hohe adrenocorticotrope Wirkung.
PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur Herstellung der neuen Tetracosapeptide der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L- glutamyl- (oder L glutaminyl)-L-histidyl-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L- lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L- arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L- valyl-L-tyrosyl-L-prolin sowie der entsprechenden Verbindungen, welche statt des D-Serylrestes den Rest des D,L-Serins aufweisen, und ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminosäuren D-Serin (oder D,L-Serin), L-Tyrosin, L Serin, L-Methionin, L-Glutaminsäure (oder L-Glutamin), L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryptophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, L-Arginin, L-Arginin, L-Prolin, Valin, L Lysin,
L-Valin, Tyrosin, L-Prolin in der angegebenen Reihenfolge unter intermediärem Schutz von Amino- und/oder Carboxylgruppen miteinander vereinigt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Seryl-Utyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutainyl-
L-hlstidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L- tryptophyl-glycin, dessen a-Amino- und r-Carboxylgruppen geschützt sind, mit
L-Lysyl-Uprolyl-L-valyi-glycyl-L-lysyl-L-Wsyl-L- arginyl-L- arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L- valyl-L-tyrosyl-Uprolin, dessen e-Aminogruppen und terminale Carboxylgruppe geschützt sind, kondensiert.
2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man tert.-Butyloxycarbonyl-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L methionyl-y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit
Nd-tert.-Butyloxyearbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L- v alyl-glycyl-tert . -butyloxycarbonyl-L-lysyl- tert.-butyloxycarb onyl-L-lysyl-L- arginyl-L- arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert butylester kondensiert.
3. Verfahren nach Patentanspruch I oder dem Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen basischen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze überführt.
PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach Patentanspruch I hergestellten Tetracosapeptiden der Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L glutamyl-(oder L-glutaminyl)-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L- arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder der entsprechenden Verbindungen, die statt des D Serylrestes den Rest des D,L-Serins aufweisen, zur Herstellung von Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine saure wässrige Lösung, welche das Peptid und ein wasserlösliches Zinksalz enthält, mit einem Alkalimetallhydroxyd, -phosphat oder -pyrophosphat umsetzt und das pH auf 7-8 einstellt.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
Process for the production of new polypeptides
It is known that the tetracosapeptide of the formula
L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl -L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-
L-proline and the corresponding compound, which has the remainder of glutamine instead of the glutamyl residue, has the effect of natural adrenocoitcotropin (ACTH).
The natural hormone, as well as the synthetic tetracosapeptide mentioned above, contain only optically active amino acids of the L-form. It has now surprisingly been found that tetracosapeptides of the above-mentioned amino acid composition, in which the first amino acid (serine) has a D or D, L configuration, have a better adrenocorticotropic effect than the tetracosapeptide, which only has lamino acids.
The present invention therefore relates to a process for the preparation of the tetracosapeptide of the formula
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl- L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-larginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl
L-proline, in which the first amino acid has the D or D, L configuration, and the corresponding compound which has the remainder of glutamine instead of the glutamyl residue, and also acid addition salts and their use for the production of complexes of the peptides mentioned with complex-forming metals such as copper, cobalt, and in particular zinc, or sparingly soluble salts or hydroxides of these metals, especially zinc phosphate, zinc pyrophosphate, zinc hydroxide and zinc carbonate.
The sparingly soluble complexes which precipitate in aqueous solution at a pH of 7-8 contain the peptide chemically bound to the sparingly soluble metal compound, e.g. B. zinc phosphate, cf. Swiss Patent No. 467 073.
The new compounds have a high adrenocorticotropic activity and are to be used in human and veterinary medicine instead of the natural hormone.
The new tetracosapeptides are obtained according to the invention if the amino acids D-serine (or D, L-serine), L-tyrosine, L-serine, L-methionine, L-glutamic acid (or L-glutamine), L-histidine, L -Phenylalanine, L-Arginine, L-Tryptophan, Glycine, L-Lysine, L-Proline, L-Valine, Glycine, L-Lysine, L-Lysine, LArginine, L-Arginine, L-Proline, L-Valine, L- Lysine, L-valine, L tyrosine, L-proline combined with one another in the specified order with intermediate protection of the amino or carboxyl groups. The amino acids are linked individually in the order mentioned or after forming smaller peptide units beforehand. For example, one of the amino acid or peptide molecules can be in the form of an ester with another amino acid or peptide.
A peptide molecule containing a protected amino group in the presence of a condensation agent such as a carbodiimide or a phosphorous acid ester halide, or an amino acid or a peptide with an activated carboxyl group (and protected amino group) can be used with the amino acid or peptide ester with a free amino group, z. B.
an acid halide, azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide (e.g. from N-ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonate, see Woodward et al., J. Am. Chem. Soc. 89, 1011 [1961]), or an activated ester such as cyanomethyl ester or carboxymethyl thiol ester. Conversely, an amino acid or a peptide with a free carboxyl group (and a protected amino group) with an amino acid or a peptide with an activated amino group (and a protected carboxyl group), e.g. B.
a phosphite amide to react.
Free functional groups not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals which can be easily split off by hydrolysis or reduction, the carboxyl group preferably by esterification, e.g. B. with methanol, tert-butanol, benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, the amino group, for example by introducing the tosyl, trityl or carbobenzoxy group or colored protective groups such as the p-phenylazo-benzyloxycarbonyl group and the p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl group, or in particular of the tert-butyloxycarbonyl radical.
The nitro group is suitable for protecting the amino group in the guanido grouping of arginine; However, the said amino group of arginine does not necessarily have to be protected during the reaction. The imino group of the histidine can advantageously be protected by the benzyl or trityl radical.
The conversion of a protected amino or imino group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process takes place according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
The decapeptide of the formula is advantageously condensed
L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (or glutaminyl-) - L-histidyl-L-phenylalanyl
L-arginyl-L-tryptophyl-glycine, in which the α-amino group of seryl and optionally the γ-carboxyl group of glutamyl are protected, in the presence of a carbodiimide with an ester of the tetradecapeptide of the formula
L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L valyl-L-tyrosyl-L- proline, in which the e-amino groups of the lysyl are protected.
The tert-butyloxycarbonyl group (B OC) is preferably used as protective groups for the a-amino group of seryl and the amino groups of lysyl; the df ^ -carboxyl group of glutamyl and the terminal carboxyl group of proline are advantageous by the tert. - Butyl ester group protected.
Said tetradecapeptide can be produced, for example, by the processes described in German patent specification No. 1196 666 or No. 1 214242. The decapeptide can be prepared analogously to the decapeptide described in Swiss Patent No. 408 948 or in German Patent No. 1,212,981 or No. 1,210,877. The imino group of the histidine can also be protected by the benzyl or trityl residue, as shown in Swiss Patent No. 409 992 or in French Patent No. 85 518, and the decapeptide derivative thus protected can be condensed with the tetradecapeptide ester.
Furthermore, the tetrapeptide tert-butyloxycarbonyl D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methione with the eicosapeptide ester L-glutamyl- (or glutaminyl-) L-histidyl-L-phenylalanyl-larginyl-L-tryptophyl can also advantageously be used -glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-Llysyl-L arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L valyl-L-tyrosyl-L -proline ester, in which the E-amino groups of the lysine residues through the tert. -Butyloxycarbonylgruppe and the carboxyl groups of the proline and optionally glutamic acid residues are protected by the tert-butyl ester group, condense, for example by the azide method, as described in German Patent No. 1196666 (Case 4823).
The eikosapeptide ester with glutamic acid as the first amino acid is z. B. obtained if you carbobenzoxy (i, -tert.-butyl) zL-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophyl-glycine with the tritosylate of the tetradecapeptide derivative E-tert. -Butyl-oxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert. -butyloxycarbonyl-Llysyl-tert. butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl
L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline tert.-butyl ester condensed and the carbobenzoxy group was split off hydrogenolytically in the presence of glacial acetic acid and palladium carbon.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts. The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids, such as. B.
those with inorganic acids, such as hydrohalic acids, for example hydrochloric acid or hydrobromic acid, perchloric acid, nitric acid or thiocyanic acid, sulfuric or phosphoric acids, or organic acids, such as formic acid, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, nijialonic acid, succinic acid Acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, hydroxymaleic acid, dihydroxymaleic acid, benzoic acid, phenylacetic acid, 4-aminobenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, anthranilic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-amino-salicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-amino-salicylic acid, acetic acid, 4-aminosulfoic acid , Ethanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid,
Naphthalenesulfonic acid or sulfanilic acid.
The tetrakosapeptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral administration.
The new tetracosapeptides can be converted into complex compounds in a manner analogous to the tetracosapeptides having only the L configuration. In particular, zinc phosphate, zinc hydroxide and zinc carbonate complexes or zinc pyrophosphate complexes can be produced by the process described in Swiss Patent No. 490 337. These complexes are obtained by reacting an acidic aqueous solution containing the peptide and a water-soluble zinc salt with an alkali metal hydroxide, phosphate or pyrophosphate and adjusting the pH to 7-8.
The invention is described in the following example. The temperatures are given in degrees Celsius.
The following systems were used for thin layer chromatography (on silica gel): System 43: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (100: 40: 55).
System 52: n-butanol-acetic acid-water (100: 10: 30).
System 100: ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water (60: 20: 6: 11).
System 101: n-butanol-pyridine-acetic acid-water (30: 20: 6: 24).
Examples 1. tert-Butyloxycarbonyl-D-serine hydrate
10.5 g (0.1 mol) of D-serine are dissolved in 50 ml of 2N sodium hydroxide solution, and a solution of 15.7 g (0.11 mol) of tert-butyloxycarbonylazide in 50 ml of methanol is added. Then 11.1 g (0.11 mol) of triethylamine in 100 ml of methanol are added dropwise over a period of 4 hours with stirring at 400. After stirring for a further 2 hours at 400 and overnight at room temperature, the reaction solution is adjusted to pH 6-7 by adding 2N hydrochloric acid and then freed from methanol in vacuo at 300. The aqueous solution is covered with a layer of ethyl acetate and concentrated at 0 while stirring. Hydrochloric acid adjusted to pH 1-2. The ethyl acetate phase is separated off quickly, washed several times with saturated sodium chloride solution, dried and evaporated in vacuo.
The oil obtained (19.8 g) crystallizes as a monohydrate on trituration with a little water at 00: 15.95 g (71%), mp 50-520. After recrystallization from a little water: F. = unchanged; [a] 2D = -f-9.10 + 10 (c = 1.1 in water). According to the thin layer chromatogram, the substance is uniform: Rf43 = 0.31; Rf1o0 = 0.65.
2. tert-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L methionine methyl ester.
8.26 g (20 mmol) of L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine methyl ester are dissolved in a mixture of 150 ml of acetonitrile and 10 ml of dimethylformamide while warming to 700 and, after cooling to room temperature, with 4.46 g (20 mmol) tert-Butyloxycarbonyl-D-serine added. The solution is cooled to -5, a solution of 4.53 g (22 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of acetonitrile is added while stirring, and the mixture is stirred at -5 for one hour and at 0 overnight. After adding 0.15 ml of glacial acetic acid, the reaction mixture is stirred for a further 30 minutes at 0, the dicyclohexyl urea which has separated out is filtered off and the filtrate is evaporated at 0.1 mm Hg.
The residue is taken up in ethyl acetate, the solution is washed at 0 with 1N hydrochloric acid, 1N sodium bicarbonate and water, dried and evaporated in vacuo. The residue solidifies when rubbed with ether; after recrystallization from methanol-ether: 9.1 g (76, m.p. 152-1550; [a] D = -7.00 + 10 (c = 0.9 in methanol). The substance shows the following Rf values in the thin-layer chromatogram : Rf = 0.29 in chloroform + methanol (9: 1); Rf4s = 0.78; Rfioo = 0.85.
3. tert-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine hydrazide.
A solution of 12 g (20 mmol) of tert-butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine methyl ester in 50 ml of methanol is mixed with 5 ml (0.1 mol) of hydrazine hydrate and left at room temperature. After 3 hours, the precipitated crystalline hydrazide is filtered off and washed with water and ethanol: 9.82 g (82%), mp 148-152; recrystallized from methanol: mp 150-1530; [a] 2D = -6.3 + 10 (c = 1 in methanol). According to the thin layer chromatogram, the substance is uniform: Rfo3 = 0.65; Rf, e = 0.57; Rftoo = 0.51.
4. tert-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl- (y-tert-butyl) -Uglutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycine.
1.43 g (2.4 mmol) of tert-butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine hydrazide are slurried at -100 in 15 ml of dimethylformamide and at this temperature with 1.58 ml ice-cold 6N hydrochloric acid added. 0.5 ml of ice-cold 5N sodium nitrite solution is then added dropwise at -XO and allowed to react at -5 to 80 for 25 minutes. At the same time, 1.65 g of y-tert-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycine (1.9 mmol), dissolved in 5 ml of warm dimethylformamide, are cooled to -100 and mixed with 1.85 ml of triethylamine.
The ice-cold solution of the BOC-tetrapeptide azide is added at -150, the mixture is stirred for a further 1 hour at -100 and the reaction is allowed to continue at 0 overnight. Little inorganic salt separates from the reaction solution. This is separated off by filtration and the resulting solution is concentrated to a small volume in a high vacuum. The crude amorphous BOC decapeptide is precipitated with 100 ml of 2N ammonium hydroxide solution, suction filtered and washed neutral with water.
After drying, 1.88 g of crude DekaPeptide derivative are obtained. Crystallization from 50 ml of 90% methanol gives 1.2 g of pure BOC decapeptide. F. 2080 (dec.). The thin-layer chromatograms on silica gel in systems 52 and 101 show only one spot each with Pauly-Ehrlich and Reindel-Hoppe reagent. Rf5e 0.2 and Rflol = 0.6. [a] D = -160 1 10 (c = 0.9 in 50% pyridine).
5. tert-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl- (r-tert-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl -glycyl-tert. butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl -Tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline tert-butyl ester.
0.725 g of tert-butyloxycarbonyl-1) -seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl- (y-tert-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl are added under nitrogen -L-tryptophyl glycine (0.5 mmol) and 1.11 g (0.5 mmol) of e-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L prolyl-L-valyl-glycyl-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert. butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L proline tert-butyl ester trihydrochloride in 5 ml of 90% pyridine stirred for 1 hour at 500, then 175 mg (0.85 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide are added and the same amount of carbodiimide again after 5 hours.
It is left to react for 24 hours at the temperature mentioned, the dicyclohexylurea which has separated out is filtered off (161 mg) and the crude reaction product is precipitated with a large amount of ethyl acetate (1.77 g). The hydrochloride is converted into the triacetate on an Amberlite IR-4B ion exchanger (acetate form) (m 16 mm, h = 27 cm). For purification, the entire amount of the protected tetracosapeptide ester is chromatographed in 50% tert-butanol on a carboxymethyl cellulose column (e 16 mm, h = 17 cm) using 50 points of tert-butanol containing increasing concentrations of 2N acetic acid.
In addition to marginal fractions, the pure protected tetracosapeptide ester can be eluted using 50% tert-butanol and 2N acetic acid (96: 4). Yield: 740 mg.
In the thin-layer chromatogram, this fraction in system 101 shows only 1 spot with Pauly, Reindel Hoppe or ninhydrin reagent, Rf = 0.6. [a] D = 490 + 20 (c = 0.62 in methanol).
U.V. spectrum in 0.1N sodium hydroxide solution in methanol: one 283 ma, e = 8600 and; tmax 289 mu, for = 8950.
Ratio Tyr 1.9.
Try 6. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl -glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline hexaacetate.
500 mg of protected tetracosapeptide tert-butyl ester are cleaved with 5.5 ml of 9% trifluoroacetic acid for 30 minutes at room temperature. The trifluoroacetate is precipitated with a lot of peroxide-free ether, filtered off with a lot of ether and finally washed with petroleum ether. The amorphous residue is dissolved in water and the trifluoroacetate is converted into the acetate on an Amberlite IR-45 ion exchange column. Yield: 450 mg tetracosapeptide pure by thin layer chromatography. Rftot = 0.5 (on aluminum oxide).
k.] D = -850 + 1.5 (c = 0.62 in 1% acetic acid).
UV spectrum in 0.1 ln sodium hydroxide solution: imaX 283 m e = 8300 and 288 m, m, e = 8600.
The peptide cannot be cleaved with leucine aminopeptidase.
In the Saffran and Sayertest it shows a high adrenocorticotropic effect.
PATENT CLAIM I
Process for the preparation of the new tetracosapeptides of the formula D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl- (or L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycyl-L- lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-proline and the corresponding compounds which have the remainder of D, L-serine instead of the D-seryl radical, and their salts, characterized in that the amino acids D-serine (or D, L-serine), L -Tyrosine, L-Serine, L-Methionine, L-Glutamic Acid (or L-Glutamine), L-Histidine, L-Phenylalanine, L-Arginine, L-Tryptophan, Glycine, L-Lysine, L-Proline, L-Valine, Glycine, L-Lysine, L-Lysine, L-Arginine, L-Arginine, L-Proline, Valine, L-Lysine,
L-valine, tyrosine, L-proline combined with one another in the order given with intermediate protection of amino and / or carboxyl groups.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that D-seryl-utyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutainyl-
L-hlstidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine, the α-amino and r-carboxyl groups of which are protected with
L-Lysyl-Uprolyl-L-valyi-glycyl-L-lysyl-L-Wsyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-Uproline, whose e-amino groups and terminal carboxyl group are protected, condensed.
2. The method according to claim I, characterized in that tert-butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L methionyl-y-tert-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L phenylalanyl L-arginyl-L-tryptophyl-glycine with
Nd-tert-butyloxyearbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-v alyl-glycyl-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert-butyloxycarb onyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert-butyloxycarbonyl
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline tert-butyl ester condensed.
3. The method according to claim I or dependent claim 1 or 2, characterized in that the basic compounds obtained are converted into their acid addition salts.
PATENT CLAIM II
Use of tetracosapeptides of the formula prepared according to claim I
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L glutamyl- (or L-glutaminyl) -L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L lysyl-L-prolyl- L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline or the corresponding compounds, the instead of the D seryl radical have the radical D, L-serine, for the preparation of complexes, characterized in that an acidic aqueous solution containing the peptide and a water-soluble zinc salt is reacted with an alkali metal hydroxide, phosphate or pyrophosphate and that Adjusts pH to 7-8.
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