Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids
Es wurde gefunden, dass man zu einem bisher unbekannten Polypeptid der Formel I (siehe Formelblatt) gelangen kann, indem man das Nonapeptid Derivat der Formel V (siehe Formelblatt) durch Oxydation in wässriger Lösung in das Endprodukt I überführt.
Zum bisher unbekannten Nonapeptid-Derivat der Formel V kann man gelangen, indem man das neue Hexapeptid der Formel II (siehe Formelblatt), in welchem R eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Sulfhydrylgruppe gebräuchliche Gruppe und R' eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Aminogruppe gebräuchliche Gruppe bedeuten, mit einem reaktionsfähigen Derivat der freien Säure III (siehe Formelblatt), in welchem R" eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Aminogruppe gebräuchliche Gruppe und R"' eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Sulfhydrylgruppe gebräuchliche Gruppe bedeuten, zum Nonapeptid-Derivat IV (siehe Formelblatt) kondensiert und dieses durch Reduktion mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak in das Nonapeptid-Derivat V umwandelt.
Zur vorübergehenden Blockierung der Aminogruppen können dabei die zu diesem Zweck gebräuchlichen Gruppierungen wie die Carbobenzoxygruppe, die Carbo-p-chloro-benzyloxy-, die p-Toluol sulfonyl- oder die Triphenylmethylgruppe verwendet werden. Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe führt man vorzugsweise eine Phenyl-, eine Benzyl-, eine p Bromo-benzyl-, eine p-Chloro-benzyl-, eine p-Nitrobenzyl- oder eine p-Xylylgruppe ein. Mit besonderem Vorteil verwendet man jedoch den Benzylrest.
Es wurde gefunden, dass die Verbindung I eine starke vasokonstriktorische Wirkung besitzt, wie die natürliche Vasopressine, von denen sich die neue Verbindung dadurch unterscheidet, dass sie anstelle von Lysin (Vasopressin vom Schwein) resp. Arginin (Vasopressin vom Rind) Ornithin, anstelle von Phenylalanin Isoleucin und anstelle von Tyrosin Phenylalanin enthält. Von Oxytocin unterscheidet sich die neue Verbindung durch die Anwesenheit Phenylalanins anstelle von Tyrosin und diejenige Ornithins anstelle von Leucin (siehe Formelblatt).
Bei der vorliegenden Verbindung I fehlt jedoch im Gegensatz zu den natürlichen Vasopressinen die antidiuretische Wirkungskomponente fast vollständig, oxytocischen Wirkungskomponenten weitgehend, so dass die vorliegende Verbindung I als eine Substanz mit gezieltem vasokonstriktorischem Effekt in die Therapie eingeführt werden kann. Die spezifische vasokonstriktorische Wirkung wird durch direkte Beeinflussung der Gefässmuskulatur erzielt, weshalb die vorliegende Verbindung 1 - im Gegensatz zu Adron- alin und Noradrenalin - keine vegetativ-nervösen Nebenerscheinungen hervorruft.
Das Hauptanwendungsgebiet der neuen Verbindung list die Prophylaxe und Therapie parenchymatöser Blutungen, wobei die Infiltration des Gewebes mit der Verbindung I eine ausgesprochen ischämisierende Wirkung zur Folge hat. Insbesondere bei chirurgischen Eingriffen in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Gynäkologie und Geburtshilfe, Urologie und Zahnheilkunde findet die vorliegende Verbindung I Anwendung. Sie wird dabei entweder dem Lokalanästheticum zugesetzt oder bei Operationen in Allgemeinnarkose mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und zur Infiltration verwendet.
Das Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel V wird beispielsweise folgendermassen ausgeführt:
Man kondensiert a-N-Carbobenzoxy-N-8-p-toluol- sulfonyl-L-ornithin mit Glycinäthylester zu a-N Carbobenzoxy-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin- äthylester. Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird der erhaltene N-8-p-Toluolsulfonyl-Lornithyl-glycin-äthylester mit N-Carbobenzoxy-Lprolin kondensiert zu N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-8- p -toluolsulfonyl-L-ornithyl -glycin- äthylester, der in das entsprechende Amid umgewandelt wird.
Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin- amid mit N-Carbobenzoxy-L- glutamulyl- Laspara- ginyl-S-benzyl-L-cystein-azid zu N-Carbobenzoxy-L glutaminyl-l- asparaginyl-S -benzyl-L- cysteinyl-l- prolyl-N-6-p -toluolsulfonyl-L- ornithyl-glycinamid kondensiert.
Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Glutaminyl-L-aspara ginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsul- fonyl - L - ornithyl - glycinamid mit Carbobenzoxy-Sbenzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-azid zu N-Carbobenzoxy-S- benzyl-l-cysteinyl- L-phenyl- alanyl-l-isoleucyl- 6,-lutaminyl-L- asparaginyl-S- benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L- omithyl-glycinamid kondensiert. Dieses Nonapeptid Derivat wird mit einem Alkalimetall, vorzugsweise mit Natrium oder Kalium in flüssigem Ammoniak behandelt, so dass das lineare Nonapeptid V entsteht. Dieses wird erfindungsgemäss durch Oxydation, vorzugsweise mit Luft, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd in wässeriger Lösung in das biologisch aktive, zyklische Polypeptid I, d. h.
Phe2-Orn8-Oxytocin, übergeführt. Das verfahrensgemäss hergestellte, bisher unbekannte Polypeptid I kann als freie Base oder als Salz einer organischen oder anorganischen Säure, entweder als Arzneimittel allein oder in entsprechenden Arzneiformen für parenterale, enterale oder intranasale Verabreichungen verwendet werden.
Zwecks Herstellung geeigneter Arzneiformen werden diese mit anorganischen oder organischen pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verwendet. Als Hilfsstoffe werden verwendet, z. B. für Tabletten und Dragees: Milchzucker, Stärke, Talk, Stearinsäure usw.; für Sirupe: Rohrzucker-, Invertzucker-, Glukose-Lösungen u. a.; für Injektionspräparate: Wasser, Alkohole, Glycerol, pflanzliche Öle und dergleichen; für Suppositorien: natürliche oder gehärtete Öle und Wachse u. a. Zudem können die Zubereitungen geeignete I Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmit- tel, Lösungsvermittler, Süss- und Farbstoffe, Aromantien usw. enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturangaben in Celsiusgraden gemacht.
Beispiel 1 : a) N-a-Carbobenzoxy-N-a-p-toluolsulfonyl-L- ornithyl-glycin-äthylester
Man löst 104 g N-a-Carbobenzoxy-N-d-p-toluol- sulfonyl-L-ornithin und 27 g Glycin-äthylester in 450 ccm Acetonitril, kühlt bei 0 , gibt 51 g Dicyclohexyl-carbodiimid zu und schüttelt 4 Stunden bei Zimmertemperatur. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Das gesamte Filtrat wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand kristallisiert nach Zugabe von Petroläther. Nach Umkristallisation aus n-Propanol erhält man 93 g N-a-Carbobenzoxy-N--p4eluolsul- fonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester; Smp. 136".
La]2 = -7" (960/oiger Äthanol). b) N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-o-p-toluolsul- fonyl-L-ornithyl-glycin-amid
90 g N-a-Carbobenzoxy-N-d-p-toluolsulfonyl-L- ornithyl-glycin-äthylester werden in 800 ccm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure gelöst. Man lässt eine Stunde stehen bei 20 , verdampft im Vakuum unterhalb 40 und wäscht den Rückstand sorgfältig mit Diäthyläther nach.
Man löst den Rückstand in 500 ccm Acetonitril, gibt 25 ccm Triäthylamin und 43 g N-Carbobenzoxy-L-prolin zu, kühlt bei 0 , fügt noch 35,5 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und schüttelt über Nacht bei 20 . Nach dem Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes wird das Filtrat im Vakuum bei 300 eingedampft, der Rückstand in Essigester gelöst und diese Lösung mit verdünnter Schwefelsäure und wässerigem Ammoniak gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird der Essigester im Vakuum abgedampft und der Rückstand in 1 Liter absolutem Äthanol gelöst. Die Lösung wird bei 0 gekühlt, mit Ammoniak gesättigt und über Nacht bei 20 stehengelassen.
Nach dem Eindampfen im Vakuum bei 30 wird der Rückstand in 100 ml Dimethylformamid gelöst und durch Zugabe von 1500 ml Essigester kristallisiert. Man erhält 66 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-a-p-toluolsulfonyl- L-ornithyl-glycidamid ; Smp. 122" (Zers).
[a] D22 = -46" (950/oiger Eisessig). c) N- Carbobenzoxy-L-glutaminyl-Lasparaginyl-
S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsul- fonyl-L-ornithyl-glycinamid
Man löst 100 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-d-p- toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 500 ccm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure, lässt während 1 Stunde bei 200 stehen und verdampft im Vakuum unterhalb 40". Der Rückstand wird mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und hierauf zu einer Lösung von 100 g N-Carbobenzoxy-L-glut aminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-azid [Boissonnas & coll., Helv. chim. Acta, 38, 1491 (1955)] und 26 ccm Triäthylamin in 1000 ccm Dimethylformamid zugegeben.
Man lässt über Nacht bei 20 stehen, gibt 3000 ccm Essigester hinzu, filtriert den Niederschlag ab und wäscht mit Essigester. Man erhält 105 g N-Carbobenzoxy-L-glut aminyl-L-aspara ginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-o-p-toluolsul- fonyl-Lornithyl-glycinamid; Smp. 188 (Zers.).
[a] = 330 (Dimethylformamid). d) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L- phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L- asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid
Man löst 50 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L asparaginyl-S- benzyl-l-cysteinyl -L-prolyl-N-8 -p- toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 250 ccm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure und lässt während 1 Stunde bei 20 stehen.
Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unterhalb 40 wird der Rückstand mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und mit einer Lösung von 31,1 g N-Carbobenzoxy-S- benzyl-l- cysteinyl-l- phenylalanyl-L-isoleucyl-azid und 7,5 ccm Triäthylamin in 250 ccm Dimethylformamid versetzt. Man lässt 2 Tage bei 200 stehen, versetzt hierauf mit 1000 ccm Essigester und wäscht den Niederschlag mit Essigester. Nach dem Trocknen im Vakuum bei 300 wird das Produkt mit warmem Methanol gewaschen.
Man erhält 45 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L cysteinyl - L- phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L- asparaginyl-S -benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-8-p- toluolsulfonyl-L-omithyl-glycinamid. Smp. 242". a]21 = (Dimethylformamid).
e) L-Cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-
L-ornithyl-glycinamid
Man versetzt eine Lösung von 5 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl L-glutaminyl-l- asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L- prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 1200 ccm trockenem flüssigem Ammoniak unter Rühren bei der Siedetemperatur der Lösung mit so viel Natrium- oder Kaliummetall, bis eine beständige blaue Färbung eingetreten ist. Nach Zugabe von 3 g Ammoniumchlorid wird die Lösung zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand enthält das L-Cysteinyl-L phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl- L-cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycinamid. f) Polypeptidverbindung I
Der Rückstand, enthaltend L-Cysteinyl-L-phenyl alany-l-isoleucyl- L-glutaminyl-L- asparaginyl-l- cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycinamid, wird in fünf Liter 0,01-n Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6,5-8,0 durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff während 1 Stunde bei 0-40 oxydiert. Man bringt die Lösung, die die Substanz enthält, auf einen pH von 4,0-5,0 und dampft nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid oder von 0,64 g Methansulfonsäure zur Trockne ein, wobei ein trockenes Pulver erhalten wird, das gut haltbar ist.
Es kann aufbewahrt werden und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuell nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.
Beispiel 2:
Man verfährt wie in Beispiel 1. Man oxydiert aber am Ende bei 0-10 durch Zusatz von 7,5 ccm einer l-n Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4,0-9,0 (anstatt der Oxydation durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff).
Beispiel 3:
Man verfährt wie in Beispiel 1. Man oxydiert aber am Ende bei 0-350 durch Zusatz von 6,7 ccm l-n Lösung von Kalium-Ferricyanid in Wasser bei einem pH von 5,5-7,5.
EMI4.1
Process for the production of a previously unknown polypeptide
It has been found that a previously unknown polypeptide of the formula I (see formula sheet) can be obtained by converting the nonapeptide derivative of formula V (see formula sheet) into the end product I by oxidation in aqueous solution.
The previously unknown nonapeptide derivative of the formula V can be obtained by using the new hexapeptide of the formula II (see formula sheet), in which R is a group used in peptide synthesis to protect the sulfhydryl group and R 'is a group in peptide synthesis to protect the amino group common group, with a reactive derivative of the free acid III (see formula sheet), in which R "is a group customary in peptide synthesis to protect the amino group and R" 'is a group customary in peptide synthesis to protect the sulfhydryl group, to the nonapeptide Derivative IV (see formula sheet) is condensed and this is converted into the nonapeptide derivative V by reduction with an alkali metal in liquid ammonia.
For the temporary blocking of the amino groups, the groups customary for this purpose, such as the carbobenzoxy group, the carbo-p-chlorobenzyloxy, the p-toluenesulfonyl or the triphenylmethyl group, can be used. To protect the sulfhydryl group, a phenyl, a benzyl, a p-bromobenzyl, a p-chloro-benzyl, a p-nitrobenzyl or a p-xylyl group is preferably introduced. However, it is particularly advantageous to use the benzyl radical.
It has been found that the compound I has a strong vasoconstrictor effect, like the natural vasopressins, from which the new compound differs in that it instead of lysine (vasopressin from pigs) resp. Arginine (bovine vasopressin) contains ornithine, instead of phenylalanine isoleucine and instead of tyrosine phenylalanine. The new compound differs from oxytocin in the presence of phenylalanine instead of tyrosine and that of ornithine instead of leucine (see formula sheet).
In the present compound I, however, in contrast to the natural vasopressins, the antidiuretic active component is almost completely absent, and oxytocic active components largely, so that the present compound I can be introduced into therapy as a substance with a targeted vasoconstrictor effect. The specific vasoconstrictor effect is achieved by directly influencing the vascular muscles, which is why the present compound 1 - in contrast to adronalin and noradrenaline - does not cause any vegetative-nervous side effects.
The main field of application of the new compound is the prophylaxis and therapy of parenchymal bleeding, the infiltration of the tissue with the compound I having a pronounced ischemic effect. The present compound I is used in particular in surgical interventions in ear, nose and throat medicine, gynecology and obstetrics, urology and dentistry. It is either added to the local anesthetic or, during operations under general anesthesia, diluted with physiological saline and used for infiltration.
The process for the preparation of compounds of the formula V is carried out, for example, as follows:
A-N-carbobenzoxy-N-8-p-toluenesulfonyl-L-ornithine is condensed with glycine ethyl ester to give a-N carbobenzoxy-N-d-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine ethyl ester. After splitting off the carbobenzoxy group, the N-8-p-toluenesulfonyl-lornithyl-glycine-ethyl ester is condensed with N-carbobenzoxy-Lproline to give N-carbobenzoxy-L-prolyl-N-8-p -toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine- ethyl ester, which is converted into the corresponding amide.
After the carbobenzoxy group has been split off, the L-prolyl-Ndp-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide with N-carbobenzoxy-L-glutamulyl-lasparaginyl-S-benzyl-L-cysteine-azide becomes N-carbobenzoxy-L glutaminyl-1-asparaginyl-S -benzyl-L-cysteinyl-1-prolyl-N-6-p -toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide condensed.
After the carbobenzoxy group has been split off, the L-glutaminyl-L-aspara ginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-Ndp-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycinamide with carbobenzoxy-sbenzyl-L-cysteinyl-L- phenylalanyl-L-isoleucyl-azide to N-carbobenzoxy-S-benzyl-l-cysteinyl-L-phenyl-alanyl-l-isoleucyl-6, -lutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl -Ndp-toluenesulfonyl-L-omithyl-glycine amide condensed. This nonapeptide derivative is treated with an alkali metal, preferably with sodium or potassium in liquid ammonia, so that the linear nonapeptide V is formed. According to the invention, this is converted into the biologically active, cyclic polypeptide I, i.e. by oxidation, preferably with air, oxygen or hydrogen peroxide in aqueous solution. H.
Phe2-Orn8-oxytocin, transferred. The previously unknown polypeptide I produced according to the process can be used as a free base or as a salt of an organic or inorganic acid, either as a medicament alone or in appropriate medicament forms for parenteral, enteral or intranasal administration.
In order to produce suitable dosage forms, these are used with inorganic or organic pharmacologically indifferent auxiliaries. As auxiliaries are used, for. B. for tablets and dragees: lactose, starch, talc, stearic acid, etc .; for syrups: cane sugar, invert sugar, glucose solutions etc. a .; for injection preparations: water, alcohols, glycerol, vegetable oils and the like; for suppositories: natural or hydrogenated oils and waxes, etc. a. In addition, the preparations can contain suitable preservatives, stabilizers, wetting agents, solubilizers, sweeteners, colorants, flavorings, etc.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1: a) N-a-Carbobenzoxy-N-a-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine-ethyl ester
104 g of N-α-carbobenzoxy-N-d-p-toluenesulfonyl-L-ornithine and 27 g of glycine ethyl ester are dissolved in 450 cc of acetonitrile, cooled at 0, 51 g of dicyclohexyl carbodiimide are added and shaken for 4 hours at room temperature. The precipitated dicyclohexylurea is filtered off and washed with acetonitrile. The entire filtrate is evaporated in vacuo. The residue crystallizes after the addition of petroleum ether. After recrystallization from n-propanol, 93 g of N-α-carbobenzoxy-N-p4eluolsulfonyl-L-ornithyl-glycine-ethyl ester are obtained; M.p. 136 ".
La] 2 = -7 "(960 /% ethanol). B) N-carbobenzoxy-L-prolyl-N-o-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide
90 g of N-α-carbobenzoxy-N-d-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine ethyl ester are dissolved in 800 cc of anhydrous acetic acid saturated with hydrogen bromide. The mixture is left to stand at 20 for one hour, evaporated in a vacuum below 40 and the residue is carefully washed with diethyl ether.
The residue is dissolved in 500 cc of acetonitrile, 25 cc of triethylamine and 43 g of N-carbobenzoxy-L-proline are added, the mixture is cooled at 0, 35.5 g of dicyclohexylcarbodiimide are added and shaken overnight at 20. After filtering off the dicyclohexylurea, the filtrate is evaporated in vacuo at 300, the residue is dissolved in ethyl acetate and this solution is washed with dilute sulfuric acid and aqueous ammonia. After drying over sodium sulfate, the ethyl acetate is evaporated off in vacuo and the residue is dissolved in 1 liter of absolute ethanol. The solution is cooled to 0, saturated with ammonia and left to stand at 20 overnight.
After evaporation in vacuo at 30, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide and crystallized by adding 1500 ml of ethyl acetate. 66 g of N-carbobenzoxy-L-prolyl-N-a-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycidamide are obtained; 122 "(dec).
[a] D22 = -46 "(950% glacial acetic acid). c) N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-lasparaginyl-
S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide
100 g of N-carbobenzoxy-L-prolyl-Ndp-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide are dissolved in 500 cc of anhydrous acetic acid saturated with hydrogen bromide, left to stand for 1 hour at 200 and evaporated in a vacuum below 40 ". The residue is with Diethyl ether was carefully washed and then added to a solution of 100 g of N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl azide [Boissonnas & coll., Helv. Chim. Acta, 38, 1491 (1955 )] and 26 cc of triethylamine in 1000 cc of dimethylformamide were added.
It is left to stand overnight at 20, 3000 cc of ethyl acetate are added, the precipitate is filtered off and washed with ethyl acetate. 105 g of N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-o-p-toluenesulfonyl-lornithyl-glycine amide are obtained; M.p. 188 (dec.).
[a] = 330 (dimethylformamide). d) N-carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl N-d-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide
Dissolve 50 g of N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L asparaginyl-S-benzyl-1-cysteinyl-L-prolyl-N-8-p-toluenesulfonyl-L-ornithyl-glycine amide in 250 cc of anhydrous acetic acid saturated with hydrogen bromide and let stand at 20 for 1 hour.
After evaporation of the solvent in vacuo below 40, the residue is carefully washed with diethyl ether and with a solution of 31.1 g of N-carbobenzoxy-S-benzyl-1-cysteinyl-1-phenylalanyl-L-isoleucyl azide and 7.5 ccm of triethylamine in 250 ccm of dimethylformamide. It is left to stand for 2 days at 200, 1000 cc of ethyl acetate are then added, and the precipitate is washed with ethyl acetate. After drying in vacuo at 300, the product is washed with warm methanol.
45 g of N-carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S -benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-8-p-toluenesulfonyl are obtained -L-omithyl-glycine amide. M.p. 242 ". A] 21 = (dimethylformamide).
e) L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-
L-ornithyl-glycinamide
A solution of 5 g of N-carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-Ndp-toluenesulfonyl- L-ornithyl-glycine amide in 1200 ccm of dry liquid ammonia with stirring at the boiling point of the solution with enough sodium or potassium metal until a constant blue color has occurred. After adding 3 g of ammonium chloride, the solution is evaporated to dryness.
The residue contains L-cysteinyl-L phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycine amide. f) Polypeptide Compound I.
The residue containing L-cysteinyl-L-phenylalany-1-isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-1-cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycinamide is dissolved in five liters of 0.01 N acetic acid and oxidized at a pH of 6.5-8.0 by passing in air or oxygen for 1 hour at 0-40. The solution containing the substance is brought to a pH of 4.0-5.0 and, after the addition of 50 g of sodium chloride or 0.64 g of methanesulfonic acid, is evaporated to dryness, a dry powder being obtained which can be kept well is.
It can be stored and cleared when in use. However, the solution can also be used directly, possibly after diluting with water or a salt solution.
Example 2:
The procedure is as in Example 1. At the end, however, the oxidation is carried out at 0-10 by adding 7.5 cc of a solution of hydrogen peroxide in water at a pH of 4.0-9.0 (instead of oxidation by introducing air or Oxygen).
Example 3:
The procedure is as in Example 1. At the end, however, the oxidation is carried out at 0-350 by adding 6.7 ccm of 1N solution of potassium ferricyanide in water at a pH of 5.5-7.5.
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