Zusatzpatent zum Hauptpatent Nr. 329194 Verfahren zur Herstellung von 14a-Oxy-progesteron Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Ver fahren zur Herstellung der neuen Verbindung 14a- Oxy-progesteron der Formel
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das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Progesteron einer biochemischen Oxydation mittels Enzymen unterwirft, welche von Pilzarten der Gattung Helico- stylum aus der Familie Thamnidiaceae,
insbesondere des Pilzes Helicostylum piriforme oder der Gat tung Mucor aus der Familie der Mucoraceen, insbe sondere der Pilze Mucor griseocyanus oder Mucor parasiticus, die alle der Ordnung Mucorales ange hören, erzeugt werden.
Die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung kann in das bekannte 21-Acetoxy-14-pregnen-3,20-dion [Meyer et a1. Helv. Chim. Acta, 30, 1508 (1947)] übergeführt werden, indem man das 14a-Oxy-proge- steron (4-Pregnen-14a-ol-3,20-dion) in Gegenwart eines Palladium-Kohle-Katalysators hydriert und das so erhaltene Pregnan-14a-ol-3,20-dion mit Natrium- Borhydrid selektiv zum Pregnan-3,14a-diol-20-on reduziert.
Die Bromierung des Pregnan-3,14a-diol- 20-ons mit Brom in Chloroform bildet 21-Brom- pregnan-3,14a-diol-20-on, das mit Kallumacetat in Aceton in das 21-Acetoxy-pregnan-3,14a-diol-20-on übergeführt werden kann. Letzteres lässt sich durch Wasserabspaltung mit wasserfreier Oxalsäure leicht in das 21-Acetoxy-14-pregnen-3-oi-20-on überführen, das durch Oxydation mit Chromsäure in Essigsäure das bekannte 21-Acetoxy-14-pregnen-3,20-dion lie fert.
Das erfindungsgemäss erhältliche Produkt besitzt lyophobe und einen erhöhten Anteil an lyophilen Gruppen, wodurch es wertvolle Eigenschaften zur Modifizierung der Grenzflächenspannung erhält, so dass man es als Emulgator, zum Brechen von Emul sionen, Suspendiermittel und Stabilisiermittel für Emulsionen verwenden kann. Man kann mit ihm auch Absorptionsgrundlagen mit verbesserter Wasser absorption und erweichenden Eigenschaften, die in der Pharmacie und Kosmetik für sich allein oder als Träger für bekannte Arzneimittel verwendbar sind, herstellen.
Ein geeignetes Produkt erhält man durch Zusammenschmelzen einer Mischung von 85% wei ssem Petrolatum, 10% Stearylalkohol und 5% 14a- Oxy-progesteron und Kühlen der Mischung unter Rühren bis zum Festwerden. Diese Absorptionsbasis lässt sich leicht bei Zimmertemperatur mit wässrigem Material verreiben, oder bei höheren Temperaturen emulgieren, wobei glatte, stabile, Wasser-in-Öl-Emul- sionen entstehen. Die Verbindung besitzt an sich pharmakologische Wirksamkeit und eignet sich zur Herstellung herzaktiver Hormone.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher erläutern.
<I>Beispiel 1</I> Man stellt ein Kulturmedium her aus 20 g Eda- min (enzymatisches Abbauprodukt von Lactalbumin), 3 g Maismaische (corn steep liquor) und 50 g Dex trose, die mit Leitungswasser auf 1 Liter verdünnt werden, wonach man das pH auf 3,4-4,5 einstellt und sterilisiert.
Fünf Liter dieser Flüssigkeit werden mit Mucor griseocyanus [ATCC 1207a(+)] beimpft und 24 Stunden bei 25 C bebrütet, wobei man so belüftet und rührt, dass die Sauerstoffaufnahme 6,3-7 Millimol pro Stunde und Liter Na 2s03 Lösung nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller [Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944)] beträgt.
Zu diesem Medium, das eine 24 Stunden alte Kultur des Mucor griseocyanus enthält, gibt man 5 g Progesteron in 250 cm3 Aceton, so dass das Steroid in der Kultur dispergiert wird. Nach weiteren 24 Stunden Be- brütung unter den gleichen Temperatur- und Belüf tungsbedingungen wird die Kulturflüssigkeit und das Mycel extrahiert.
Man filtriert vom Mycel ab, wäscht dieses zweimal mit je seinem Volumen Aceton und extrahiert es zweimal mit je seinem Volumen Me- thylenchlorid. Die Aceton- und Methylenchlorid- extrakte werden zum Filtrat gegeben. Diese Mischung wird nacheinander zweimal mit der Hälfte ihres Vo lumens Methylenchlorid dann noch zweimal mit dem Viertel ihres Volumens Methylenchlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylenchloridextrakte werden zwei mal mit einem Zehntel ihres Volumens einer 2%igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung und dann zwei mal mit je einem Zehntel ihres Volumens Wasser ge waschen. Nach dem Trocknen mit 3-5 g wasser freiem Natriumsulfat pro Liter Lösung und Abfiltrie- ren, wird das Lösungsmittel abdestilliert, und es ver bleibt ein kristalliner Rückstand von 4,815 g.
Die ser wird mit Skellysolve B (Petroläther) verrieben, wobei 3,322 g unlösliches Produkt zurückbleiben, das mit Äther verrieben wird. Eine Probe von 1,718 g des in Äther unlöslichen Produktes löst man in 100 cm3 Benzol und chromatographiert über 85 g Aluminiumoxyd (mit HCl gewaschen und bei 120 C getrocknet).
Die Säule wird dann mit je 170 cm?, der in Tabelle I angegebenen Lösungsmittel eluiert.
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<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Eluatfeststoffe
<tb> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 1,1
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 0,4
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> 3,2
<tb> 4 <SEP> do. <SEP> 1,3
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10 % <SEP> Äther <SEP> 6 <SEP> do. <SEP> 96,0
<tb> 7 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> 259,6
<tb> 8 <SEP> do. <SEP> 215,8
<tb> 9 <SEP> Äther <SEP> 143,5
<tb> 10 <SEP> do. <SEP> 84,3
<tb> 11 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Chloroform <SEP> 104,4
<tb> 12 <SEP> do. <SEP> 66,9
<tb> 13 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Chloroform <SEP> 18,5
<tb> 14 <SEP> do.
<SEP> 8,1
<tb> 15 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Chloroform <SEP> 2,4
<tb> 16 <SEP> do. <SEP> 11,6
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<I>Tabelle <SEP> 1</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Eluatfeststoffe
<tb> <U>in <SEP> mg</U>
<tb> 17 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50 ö <SEP> Chloroform <SEP> 13,2
<tb> 18 <SEP> do. <SEP> 9,4
<tb> 19 <SEP> Chloroform <SEP> 39,0
<tb> 20 <SEP> do. <SEP> 474,4
<tb> 21 <SEP> do. <SEP> 81,6
<tb> 22 <SEP> do. <SEP> 40,5
<tb> 23 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 24,1
<tb> 24 <SEP> Aceton <SEP> 22,7
<tb> 25 <SEP> Methanol <SEP> 65,2 Die Fraktionen 19 und 20 werden vereinigt und aus Aceton umkristallisiert, wobei man 382,5 mg 14a- Oxy-progesteron vom Schmelzpunkt 180-187 C erhält.
Die Struktur wird durch das Infrarotspek- trum und die optische Drehung (a) D = + 200 (c = 0,4857 in Chloroform) bestätigt.
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Analyse: <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C21H3003 <SEP> : <SEP> C <SEP> 76,40; <SEP> H <SEP> 9,15
<tb> gefunden: <SEP> C <SEP> 76,50;
<SEP> H <SEP> 9,31 <I>Beispiel 2</I> Man stellt ein Kulturmedium her aus 20 g Eda- mine (enzymatisches Abbauprodukt von Lactal- bumin), 3 g Maismaische (com steep liquor) und 50 g technischer Dextrose, verdünnt mit Leitungswasser auf einen Liter, stellt auf pH 4,3-4,5 und sterilisiert.
Zwölf Liter dieses Mediums werden mit Helicostylum piriforme (ATCC 8992) beimpft und 24 Stunden bei 28 C und einer solchen Belüftung unter Rühren kulti viert, dass die Sauerstoffaufnahme 6,3-7 Millimol pro Stunde und Liter Na2S03 Lösung nach der Me thode von Cooper, Fernstrom und Miller [Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944)] beträgt.
Zu diesem eine 24stündige Kultur von Helicostylum piriforme enthal tenden Medium gibt man 6 g Progesteron, in 275 cm3 Aceton gelöst, um eine Suspension des Steroids in der Kultur herzustellen. Nach weiteren 27 Stunden Kulti vierung unter den gleichen Temperatur- und Belüf tungsbedingungen werden Mycel und Flüssigkeit, wie im Beispiel 1, extrahiert, wobei man einen kristallinen Rückstand von 8,313 g erhält, der in 600 cm3 Ben zol plus 10% Äther gelöst und dann über 300 g Alu miniumoxyd (mit HCl gewaschen und bei 120 C getrocknet) chromatographiert wird.
Die eluierenden Lösungsmittel werden der Säule in 600-cm3-Portio- nen, wie in Tabelle II gezeigt, zugegeben.
Die Fraktionen 12-14 ergeben zusammen ein Trockenstoffgewicht von 1,269 g. Man kristallisiert aus 15 cm3 Äthylacetat aus und erhält 0,680 g Kri stalle vom Schmelzpunkt 140-148 C. Nach wieder holtem Umkristallisieren aus Methanol erhält man 164 mg 14a-Oxy-progesteron vom Schmelzpunkt 191 bis 199 C und der optischen Drehung (a)20 + 215 (c = 0,693 in Chloroform).
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Analyse: <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C21H3003: <SEP> C <SEP> 76,40; <SEP> 11<B>9,15</B>
<tb> gefunden: <SEP> C <SEP> 76,39; <SEP> H <SEP> 9,36
EMI0003.0001
<I>Tabelle <SEP> 1I</I>
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Eluatfeststoffe
<tb> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Äther <SEP> 95,6
<tb> 2 <SEP> do. <SEP> 121,9
<tb> 3 <SEP> Äther <SEP> 3,8
<tb> 4 <SEP> do. <SEP> 3,4
<tb> 5 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Chloroform <SEP> 4,8
<tb> 6 <SEP> do. <SEP> 9,0
<tb> 7 <SEP> do. <SEP> 9,0
<tb> 8 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Chloroform <SEP> 16,5
<tb> 9 <SEP> do. <SEP> 18,0
<tb> 10 <SEP> do. <SEP> 10,0
<tb> 11 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Chloroform <SEP> 19,0
<tb> 12 <SEP> do. <SEP> 115,0
<tb> 13 <SEP> do.
<SEP> 175,6
<tb> 14 <SEP> Chloroform <SEP> 978,5
<tb> 15 <SEP> do. <SEP> 1432;0
<tb> 16 <SEP> do. <SEP> 461,0
<tb> 17 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 679,0
<tb> 18 <SEP> do. <SEP> 260,0
<tb> 19 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 245,0
<tb> 20 <SEP> do. <SEP> 118,0
<tb> 21 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 246,0
<tb> 22 <SEP> do. <SEP> <B>135,0</B>
<tb> 23 <SEP> Aceton <SEP> <B>1</B>87,5
<tb> 24 <SEP> do. <SEP> 65,5
<tb> 25 <SEP> Methanol <SEP> 299,0
<tb> 26 <SEP> do.
<SEP> 21,5
<tb> - <SEP> unlöslicher <SEP> Rückstand <SEP> 930,7 <I>Beispiel 3</I> Man stellt ein Nährmedium her aus 20 g Eda- mine (enzymatisches Abbauprodukt von Lactalbu- min), 3 g Maismaische (corn steel liquor) und 50 g technischer Dextrose, verdünnt mit Leitungswasser auf einen Liter und stellt das pH auf 4,3-4,5.
Zwölf Liter dieser sterilisierten Lösung werden mit Mucor parasiticus (ATCC 6476) beimpft und 20 Stunden bei 28 C bebrütet, wobei man so rührt und be lüftet, dass pro Stunde und Liter NazS03 lösung nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller [Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944)] 6,3-7 Millimol Sauerstoff aufgenommen werden.
Zu diesem Medium, das eine 20stündige Kultur von Mucor parasiticus ent hält, gibt man 3 g Progesteron in 150 cm3 Aceton gelöst, wodurch eine Suspension des Steroids in der Kultur entsteht. Man setzt die Bebrütung weitere 48 Stunden unter den gleichen Temperatur- und Be lüftungsbedingungen fort und extrahiert dann wie im Beispiel 1 beschrieben.
Man erhält 4,667 g eines öligen Rückstandes, der beim Verreiben mit 30 cm3 Äther teilweise kristallisiert, worauf man das Pro dukt in 150 cm- Benzol löst und über 220 g Alu miniumoxyd (mit HC1 gewaschen und bei 120 C ge trocknet) chromatographiert. Die Eluierung erfolgt mit 200 cm3 Portionen Lösungsmittel wie in der Ta belle III angegeben.
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<I>Tabelle <SEP> 111</I>
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Eluierte <SEP> Feststoffe
<tb> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 73,0
<tb> 2 <SEP> do. <SEP> 26,5
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 28,0
<tb> 4 <SEP> do. <SEP> <B>21,5</B>
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 20% <SEP> Äther <SEP> 35,0
<tb> 6 <SEP> do. <SEP> 27,5
<tb> 7 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> 17,0
<tb> 8 <SEP> do. <SEP> 6,5
<tb> 9 <SEP> Äther <SEP> 4,5
<tb> 10 <SEP> do. <SEP> 5,0
<tb> 11 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Chloroform <SEP> 7,5
<tb> 12 <SEP> do. <SEP> 9,5
<tb> 13 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Chloroform <SEP> 1839,0
<tb> 14 <SEP> do. <SEP> 605,5
<tb> 15 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 20% <SEP> Chloroform <SEP> 356,0
<tb> 16 <SEP> do.
<SEP> 336,5
<tb> 17 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Chloroform <SEP> 331,0
<tb> 18 <SEP> do. <SEP> 269,5
<tb> 19 <SEP> do. <SEP> 94,0
<tb> 20 <SEP> Chloroform <SEP> 68,0
<tb> 21 <SEP> Chloroform <SEP> 22,0
<tb> 22 <SEP> do. <SEP> 15,0
<tb> 23 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 18,0
<tb> 24 <SEP> do. <SEP> 8,0
<tb> 25 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 12,5
<tb> 26 <SEP> do. <SEP> 9,0
<tb> 27 <SEP> Chloroform <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 26,5
<tb> 28 <SEP> do.
<SEP> 29,5
<tb> 29 <SEP> Aceton <SEP> 62,0
<tb> 30 <SEP> Methanol <SEP> 77,0 Die Fraktion 13 wird in 20 cm3 Aceton gelöst und das Ungelöste abfiltriert. Die klare Lösung wird konzentriert und tropfenweise mit Äther verdünnt, wobei man 585,5 mg Kristalle vom Schmelzpunkt 182-194 C erhält. Eine Probe von 85 mg dieses Produktes wird bei 165 C und 0,05 mm Druck subli miert.
Das Sublimat wird aus 3 cm3 Aceton und Hexan umkristallisiert, und man erhält -14a-Oxy- progesteron vom Schmelzpunkt 195-200,5 C und einer optischen Drehung (a)D = + 188 (c = 1,036 in Chloroform).
EMI0003.0045
Analyse: <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C21Hso0s: <SEP> C <SEP> 76,40; <SEP> H <SEP> 9,15
<tb> gefunden: <SEP> C <SEP> 77,02; <SEP> H <SEP> 9,55