Färbeflüssigkeit für tierisches Gewebe.
Die Präparierung von Gewebestücken für die mikroskopische Untersuchung erfordert eine Reihe von Behandlungen, bevor die Schnitte auf dem Objektträger montiert werden. Insbesondere müssen die Gewebe stiieke nacheinander in verschiedene Bänder eingetaucht werden, und zwar zum Fixieren des Gewebes, zum Auswaschen des Fixiermittels, zum Entwässern des Gewebes, bei spielsweise durch Eintauehen in Alkohol oder andere Entwässerungsmittel ; dann muss das Gewebe mit einem Klärungsmittel behandelt und mit einem Einbettungsmittel imprägniert werden. Nach dieser vorbereitenden Behandlung wird das Gewebe in Scheiben der ge wünschten Stärke geschnitten und aus den Schnitten das Einbettungsmittel, z. B.
Paraffin, mit einem Losungsmittel entfernt, worauf die Schnitte auf dem Objektträger gefärbt werden.
Für basophiles Material von tierischen und menschlichen Gewebeschnitten ist Hämatein (oxydiertes Hämatoxylin) der gebräuch- liche Farbstoff. Es wurde gefunden, dass be sonders gute Resultate erzielt werden, wenn die Färbeflüssigkeit ausser einem Farbstoff ein Beizmittel enthält und die genannten beiden Komponenten in dem Mengenverhältnis zugegen sind, welches dem ihrer Äquiva- lentgewichte entspricht. Im Gegensatz dazu enthalten die bereits bekannten Lösungen das Beizmittel in einer Menge, die das 12-bis 25fache des Farbstoffes beträgt.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Färbeflüssigkeit für tierisches Gewebe, ins. besondere für die mikroskopische Unter suchung von Gewebesehnitten, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Farbstoff und mindestens ein Beizmittel enthält. und zwar in dem Mengenverhältnis, das den Äquivalentgewiehten der beiden Komponen- ten entspricht.
Insbesondere im Fall der Verwendung von Hämatein als Farbstoff enthält die Färbeflüssigkeit zweckmässig ausserdem ein Anti oxydationsmittel, um die Oxydation des Hämateins zu verhindern. Vorzugsweise dient das verwendete Antioxydationsmittel zugleich als Träger bzw. Lösungsmittel für das Hämatein. Es ist ferner vorteilhaft, der Färbe ffüssigkeit einen Puffer mit einem pH = 3 beizufügen, wodurch die Annahme der Färbung druch das Gewebe gefördert wird. Es wurde experimentell festgestellt, dass gerade der pH-Wert von 3 der Färbeflüssigkeit eine be- sonders hohe Stabilität verleiht, wodurch sie längere Zeit vervendungsfähig bleibt.
Zur Herstellnng einer Hämatein als Farbstoff enthaltenden Färbeflüssigkeit werden vorzugsweise folgende Komponenten verwendet : Hämatoxylin, C16JH14O6 (mol-Gew. 356, 16) 0, 015 Mol 5,3527 g Kaliumaluminiumsulfat, AlK (SO,) 2. 12 H2O (Mol-Gew. 474, 37) 0, 0075 Mol 3, 5577 g Kaliumpermanganat, KMnO4 (Mol-Gew. 158, 03) ) 0, 010 Mol 1, 5803 g Monokaliumphthalat, KHCsH4O4 (Mol-Gew. 204, 2) 0, 05 Mol 10, 210g Diäthylenglykol, C4H103 250, 0 cm3 Salzsäure, In-HCl-Lösung 69, 7376 cm3 Destilliertes Wasser ad 1000, 00 em3
In diesem Beispiel wird Kaliumaluminium- sulfat als Beizmittel verwendet, doch können auch andere übliche Beizmittel, z. B. Chrom trioxyd, verwendet werden.
Das Kaliumpermangantat dient als Oxyda tionsmittel zur Überführugn des Hähnatoxylins in Hämatein, doch können auch andere Oxydationsmittel, z. B. Natriumkaliumpermanganat, für diesen Zweek verwendet werden.
Diäthylenglykol wirkt zugleieh als Anti oxydationsmittel und als Lösungsmittel für den Farbstoff.
WIonokaliumphthalat und Salzsäure wirken zusammen als Puffer, es können aber auch andere Puffersubstanzen verwendet werden.
Als Verdünnungsmittel ist frisch destilliertes Wasser zu bevorzugen. Wurde es einige Tage vor der Verwendung hergestellt, soll es zum Austreiben von möglicherweise absorbiertem Kohlendioxyd gekocht werden.
Die erwähnte Färbeflüssigkeit ist durch folgende Eigensehaften charakterisiert : chemisehe Beständigkeit, selektives und spezifisches Färbevermögen, Zuverlässigkeit in der Pärbewirkung ohne Differenzierung, das heisst ohne Überfärbung und, Unterfärbung.
Möglichkeit der Standardisierung der genannten Eigenschaften. Demzufolge sind die Eigenschaften in versehiedenen Bädern, welche zu versehiedenen Zeiten hergestellt werden, wiederholbar, und diese Eigenschaften bleiben alle während der gesamten nützlichen
Lebensdauer der Losungen unverändert be stehen.
Mit dieser Färbeflüssigkeit lassen sich verschiedene Zellbestandteile des Gewebes selektiv färben, z. B. die parietalen und zymo- genen Zellen der Magenschlienahaut.
Ferner kann die Färbeflüssigkeit ohne
Zuhilfenahme von versehiedenen Fixierugs bedingungen als quantitativer Inclikator von basophilen und aeidophilen Verhältnissen dienen.
Von wesentlieher Bedeutung ist, class der
Farbstoff, das Hämatein, und das Beizmittel, das Kaliumaluminiumsulfat, im Verhältnis ihrer Äquivalentgewichte zugegen sind. Da druch wird einerseits das selektive und spe zifische Färbevermögen und anderseits eine weitgehende Stabilität des Beizmittels in der
Lösung bewirkt und damit die nachteilige
Bildung von Niederschlagen vermieden. In folge der Stabilität des Beizmittels wird eine gleiehmässige Beizwirkung erzielt, und zwar während der ganzen Lebensdauer der Farb lösung, dies ist bei Lösungen, bei denen fortgesetzt Ausfällungen des Beizmittels erfol gen, keineswegs der Fall.
Das als Oxydationsmittel verwendete Ka liumpermanganat wird im Verhältnis von
2MolEMnOzu3MolHämatoxylinCigHuOs zugesetzt, so dass entsprechend der Reaktion : 3 C16H14O6 + 2KMnO4 = 3 C16H12O6 + 2 MnOO + 2 KOH + 2 H20 die Gasamtmenge des verfügbaren Hämatoxy- lins in Hämatein übergeführt wird. Demzufolge hat die Lösung eine maximale Farte- kraft in bezug auf die Menge des verwendeten Hämatoxylins. Die Färbeflüssigkeit liefert gleichmässige Färbungen, weil sie im Gegen- satz zu naeh bisher üblichen Vorschriften bereiteten Lösungen kein nieht oxydiertes Hämatoxylin enthält, etwa zufolge zu lang- samer Oxydation.
Da Hämatein der wirksame Farbstoff ist. so ist die vollständige ITmwand- lung des Hämatoxylins zu Hämatein eine we sentliche Bedingung für die Standardisierung der Färbeflüssigkeit. Die vollständige Umwandlung des Hämatoxylins in Hämatein hat ferner den Vorteil, eine Oberflächenoxyda- tion und Sehaumbildung zu verhindern. Kaliumpermanganat bietet als Oxydationsmittel den Vorteil, dass es im Gegensatz zu manehen andern Oxydationsmitteln keine Beizeigen- schaften besitzt. Die Verwendung eines Oxydationsmittels, welches eine zusätzliche Beizwirkung ausübt, würde den heiklen Ausgleich dieser Funkeion stören.
Es zeigte sich, dass die Eigenschaften der Färbeflüssigkeit durch den Zusatz eines nieht flüchtigen Losungsmittels beträchtlich verbessert werden können ; ferner wird das Eindringen der Färbelösung in die Gewebeteile er leichtert, wenn die Färbeflüssigkeit hygroskopisch wirkt. Dadurch wird eine Konzentration der Färbelösung an der Oberfläche verhindert und die Bildung von Oberflächenschaum aus andern Ursachen als der stattfindenden Oxydation verunmoglieht. Diäthylenglykol ist ein Losungsmittel, welches den genannten Anforderungen voll entspricht. Zudem bietet Diäthylenglykol den weiteren Vorteil, als Antioxydationsmittel zu wirken.
I) er Zusatz eines Puffers erfüllt zwei wiehtige Funktionen, nämlich die Erhaltung des für die Stabilitä der Losung und für ein optinales Färbevermögen geeigneten PH-Wertes. Dies soll nicht besagen, dass der richtige pH-Wert allein ausreichend ist. Die richtige Ionenkonzentration bei einem gegebenen pH Wert ist ebenfalls wichtig. Hat der Puffer eine zu hohe Konzentration, so können die chemischen Bestandteile des Gewebes nicht in geeigneter Weise mit der Färbelosung rea- gieren.
Dies ist wichtig, weil eine Hämatoxy- linlösung auf Gewebe nicht sofort die ge wünschte Färbung liefert, sondern, zunächst in einen unlösliehen Lack des gewünschten Farbtons übergeführt werden muss, was wiederum von der Art des Beizmittels abhängig ist, da Hämatoxylin ein polygenetischer Bei zenfarbstoff ist. Daher ist der richtigepn- Wert und die richtige Ionenkonzentration des Puffers für die gleichmässige Bildung eines konstanten Farbwertes wiehtig. Zweickmässig wird hierfür ein Alkali von konstantem Wert verwendet. Leitungswasser ist zu vermeiden, da es den Nachteil einer veränderliehen Alka linität aufweist.
Als Träger wird am besten destilliertes Wasser verwendet, weil es ein ge meinsames Losungsmittel für alle Bestandteile darstellt und zudem ein Medium ist, in dem die Ionenbeweglichkeit befriedigend ist.
Zur Herstellung einer Färbeflüssigkeit der genannten Art werden zunäehst Hämat oxylin und Kaliumaluminiumsulfat getrennt in kleinen Mengen destilliertem Wasser destilliertem löst, die beiden Lösungen vermiseht und das Ganze auf 300 cm3 mit destilliertem Wasser ergänzt. Diese Lösung wird 20 Minuten ge- kocht und dann der Abkühlung überlassen.
Der Einfachheit halber soll sie mit A bezeiehnet werden.
Das Kaliumpermanganat wird in destilliertem Wasser aufgelöst, zu 150 cm3 ergänzt und allmählieh unter ständigem Umrühren der Lösung A beigefügt. Hierbei erfolgt, wie oben erwähnt, die Oxydation des Hämatoxylins. Die erhaltene Farblösung wird mit B bezeichnet.
Diäthylenglykol wird unter ständigem Umrühren der Lösung B allmählich zugesetzt.
Die erhaltene Losung wird mit C bezeichnet.
Zu dieser Lösung C werden die Puffersub- stanzen, Monokaliumphthalat und Salzsäure, nacheinander gegeben, wobei das Phthalat zu nächst unter ständigem Umrühren in destilliertem Wasser aufgelöst wird. Nach dem Abkühlen des Ganzen auf Zimmertemperatur wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1000, 00 cm3 ergänzt. Es ist zweck- mässig, die fertige Färbelösung eine Stude umzurühren.
Nach dem Färben des basophilen Materials der Gewebeschnitte kann eine andere Färbelösung, gewöhnlich eine Eosinlösung, zum Färben des aeidophilen Materials oder des Cytoplasmas verwendet werden. Bisher wurden in der histol9igischen Technik Lösungen mit einem Mindestgehalt von 0, 5 bis 1, 0 O/o Eosin verwendet, und es wurden oft höhere Konzentrationen verwendet, weil gewöhnlieh angenommen wird, dal3 eine grössere Menge Farbstoff für einen starken Farbeffekt-not- wendig ist. Dies ist keineswegs zutreffend, weil eine gute Färbung nur unter geeigneten Bedingungen erreicht werden kann.
Für eine Färbelosung gemäss der Erfin ding, welche als Farbstoff Eosin enthält, wird vorzugsweise eine Kombination von Beizmitteln verschiedener Art mit der Fähigkeit, Doppelfarblacke zu liefern, verwendet. Geeigente Beizmittel sind Calciumacetat und Chromtrioxyd, doch können auch andere Beizmittel verwendet werden. Der gebildete Doppelfarblack hat den Vorug, am. Gewebe besser zu haften als ein einfacher Farblack. Cal ciumacetat wirkt als Beizmittel in der ersten Phase, das heisst bei der Kondensation des Eosinmoleküls mit dem Beizmittelmolekül.
Das Chromtrioxyd hat ebenfalls eine Beizwir kung. doch wird es hauptsächlich wegen der Oxydationswirkung verwendet. Es ist vorteilhaft, der Eosinlösung ein Quellmittel beizugeben, z. B. Harnstoff, um das Eindringen des Färbemittels in das Gewebe zu erleich- tern. Ferner ist auch der Zusatz eines Netz- mittels, z. B. Natriumdioktylsulfouschnt, vorteilhaft. Als Puffer werden vorzugsweise Monokaliumphosphat nnd Dinatriumphosphat verwendet, wobei der pH-Wert der Eosinlösung 6 beträgt.
Eine bevorzugte Zusammensetzung einer solchen Eosin-Farbeflüssigkeit ist die fol zende : Eosin (Natrium-Tetrabromfluoresecin), C20H6O5Br4-Na2, Farbreinheit 91% G, 0015 Mol 1, 0989 g Caleiumacetat, Ca (CH3COO)2. H2O 0,00075 Mol 0, 1321 Chromtrioxyd, Crois 0, 00075 Mol 0, 0750 g Monokaliumphosphat, KH2PO4 0,01 Mol 1, 3620 g Dinatriumphosphat, Na2HPO45. 7 H2O 0, 6166 g Harnstoff, NH2. CO. NH2 3,000 g Natriumdioktylsulfosuccinat, 5%ige wässerige Lösung 1, 0 CM3 Destilliertes Wasser ad 1000, 00 em3
Die Losung wird z.
B. wie folgt herge- stellt : Die genannten Bestandteile werden getrennt in kleinen Mengen dest. Wassers ge- lost. Die Eosinlosung wird vorsichtig 25 Minu- ten gekocht, wobei destilliertes Wasser zum Ausgleich des Verdampfungsverlustes, jedoch nicht über ein Volumen von 150 cm3 zugesetzt wird. Dann wird die Caleiumaeetatlösung zu- gegeben und die Mischung weitere 2 Stunden gekocht, wobei gegebenenfalls destilliertes Wasser zur Erhaltung des Volumens von 150 em3 zugefügt wird. Naehdem die Losung auf 60 C abgekühlt ist, wird das Chromtrioxyd allmählieh unter Umrühren zugesetzt.
Nachdem die Losung etwa eine Stunde gestanden ist, wird Zlonokaliumphosphat unter I7mrühren zugefügt und dann Dinatrium- phosphat. Zu der auf 40 C abgekühlten Losung wird nacheinander Harnstoff und das Netzumittel in genannter Reihenfolge unter ständigem Rühren zugefügt. Zu der auf Zim- mertemperatur abgekühlten Lösung wird schliesslich bis zum Volumen von 1000 cm3 destilliertes Wasser zugesetzt.
Zum Entfernen des Paraffins aus dem Gewebe und zum Färben der Sehnitte wird vorzugsweise der unter dem geschützten Namen Autotechnicon im Handel erhältliche automatische Tauchapparat verwendet, der z. B. im USA-Patent Nr. 2341198 von Edwin C.
Weiskopf beschrieben ist.
Bei der Behandlung der Gewebestüeke zur Entfernung des Paraffins und zum Färben der Sehnitte wurden bisher niedrige Alkohole, z. B. Äthanol, dazu verwendet, das als Losungsmittel für das Paraffin verwendete Xylol zu entfernen und vom Gewebe den übersehüssigen Eosinfarbstoff auszuwaschen.
Alkohole haben jedoch nachteilige Eigen schaften. Sie wirken entfärbend, da sie an scheinend durch chemische Aktivität einen Teil der acidophilen und in manchen Fällen aueh der basophilen Färbung vom Gewebe entfernen. Ihre Hygroskopizität führt zur Attfnahme von Wasser aus der Atmosphäre und damit zu einer Verdünnung. Äthylalkohol verdunstet bei Zimmertemperatur rasch ; demzufolge haben die auf den Objektträgern montierten Schnitte die Neigung, mehr oder weniger auszutrocknen bei der Cberführung von einem in das andere Bad. Es wurde gefunden, dass die erwähnten Nachteile behoben werden können durch Verwendung von Di- äthylenglykol-monoäthylätheracetat für den genannten Zweek.
Dieses Losungsmittel hat den Siedepunkt 217, 5 C, so dass es nicht be reitss bei Zimmertemperatur verdunstet. Ferner ist es in jedem Verhältnis mit Wasser, Alkoholen un, d aromatischen Kohelenwasserstoffen misehbar und zudem nicht hygrosko- pisch.
Die Verwendung der besehriebenen Färbeflüssigkeiten wird nachstehend durch ein Beispiel illustriert.
Zur automatischen Durchführung der Eintauchoperationen wird der erwähnte Autotechnieon -Apparat verwendet. Lösungsmittel F bedeutet im folgenden Diäthylenglykol- monoäthylätheracetat.
Die 12 Becher des Autotechnieon -Appa- rates sind an den angegebenen Stellen angeordnet und enthalten die genannten Flüssigkeiten. Die Zeitdauer des Eintauchens ist in minutez angegeben.
Stellung
Behandlungs- Behandlungs der flüssigkeit ziet
Bechers
1 Xylol, rein 2 Min.
2 Lösungmittel F, rein 2 (fur mit Queeksilber eblorid fixiertes Gewebe wird der Lösung 0, 25 /o
Jod zugesetzt)
3 Lösungsmittel F, rein 2
4 Destilliertes Wasser 2 5 Farbefliissigkeit 5 (Hämateinlösung)
6 Destilliertes Wasser 4 7 0, 01 n-Lösung von
Lithiumearbonat 2
8 Destilliertes Waaser 4 ') Färbeflüssigkeit 5 (Eosinlosung)
10 Losungsmittel F, rein 5
11 Lösungsmittel F, rein 5
12 Losungsmittel F, rein 5
Die vom Apparat abgenommenen Schnitte werden schliesslich 5 Minute in einen Becher mit Xylol gelegt.
Die Barder werden zweckmässig wie folgt ausgeweellselt : a) Xylol b) Losungsmittel F in Becher 2 und 3 c) Destilliertes Wasser in Becher 4, 6, 8 d) Lithiumearbonatlösung in Becher 7 c) Lösungsmittel F in Becher 10, 11, 12 f) Färbelösungen in Becher 5 und 9
Die praktische Verwendungsdauer der Bäder wird dureh den Umfang der einschlä gigen Laboratoriumsarbeiten bestimmt.
Coloring liquid for animal tissue.
Preparing pieces of tissue for microscopic examination requires a series of treatments before the sections are mounted on the slide. In particular, the tissue stiieke must be dipped one after the other in different tapes, namely to fix the tissue, to wash out the fixative, to dehydrate the tissue, for example by immersion in alcohol or other dehydrating agents; then the tissue must be treated with a clarifying agent and impregnated with an embedding agent. After this preparatory treatment, the tissue is cut into slices of the desired thickness and the embedding material, for. B.
Paraffin, removed with a solvent, whereupon the sections on the slide are stained.
For basophilic material from animal and human tissue sections, hematein (oxidized hematoxylin) is the common dye. It has been found that particularly good results are achieved when the coloring liquid contains a mordant in addition to a dye and the two components mentioned are present in the proportion which corresponds to that of their equivalent weights. In contrast to this, the solutions already known contain the mordant in an amount which is 12 to 25 times that of the dye.
The invention thus provides a dye liquid for animal tissue, ins. especially for the microscopic examination of tissue tendons, which is characterized in that it contains a dye and at least one mordant. in the proportion that corresponds to the weighted equivalents of the two components.
In particular when hematein is used as the dye, the dye liquid also expediently contains an anti-oxidant in order to prevent the hematein from being oxidized. The antioxidant used preferably also serves as a carrier or solvent for the hematein. It is also advantageous to add a buffer with a pH = 3 to the staining liquid, which promotes the acceptance of the staining by the tissue. It has been found experimentally that it is precisely the pH value of 3 that gives the dyeing liquid a particularly high stability, which means that it remains usable for a longer period of time.
The following components are preferably used to prepare a coloring liquid containing hematein as a dye: Hematoxylin, C16JH14O6 (mol-wt. 356, 16) 0.015 mol 5.3527 g potassium aluminum sulfate, AlK (SO,) 2. 12 H2O (mol-wt. 474, 37) 0.075 mole 3.5577 g potassium permanganate, KMnO4 (mole weight 158.03)) 0.010 mole 1.5803 g monopotassium phthalate, KHCsH4O4 (mole weight 204.2) 0.05 mole 10 , 210g diethylene glycol, C4H103 250.0 cm3 hydrochloric acid, In-HCl solution 69.7376 cm3 distilled water ad 1000.00 em3
In this example, potassium aluminum sulfate is used as the pickling agent, but other conventional pickling agents, e.g. B. chromium trioxide can be used.
The potassium permangantate is used as Oxyda tion agent for Überführugn the Hähnatoxylins in hematein, but other oxidants such. B. sodium potassium permanganate, can be used for this purpose.
Diethylene glycol also acts as an anti-oxidant and as a solvent for the dye.
Wionopotassium phthalate and hydrochloric acid work together as a buffer, but other buffer substances can also be used.
Freshly distilled water is the preferred diluent. If it was made a few days before use, it should be boiled to drive off any carbon dioxide it may have absorbed.
The mentioned coloring liquid is characterized by the following properties: chemical resistance, selective and specific coloring capacity, reliability in the coloring effect without differentiation, i.e. without over-coloring and under-coloring.
Possibility of standardizing the properties mentioned. As a result, the properties are repeatable in different baths made at different times, and these properties all remain useful throughout
Lifetime of the solutions exist unchanged.
With this staining liquid, different cell components of the tissue can be stained selectively, e.g. B. the parietal and zymogenic cells of the gastric serum membrane.
Furthermore, the dye liquid can be used without
With the aid of various fixation conditions, serve as a quantitative inclusive of basophilic and aeidophilic conditions.
What is essential is the class of
The dye, the hematein, and the mordant, the potassium aluminum sulfate, are present in the proportion of their equivalent weights. As a result, on the one hand, the selective and specific coloring capacity and, on the other hand, an extensive stability of the mordant in the
Solution causes and thus the disadvantageous
Avoid formation of deposits. As a result of the stability of the pickling agent, a uniform pickling effect is achieved throughout the life of the color solution; this is by no means the case with solutions in which the pickling agent continues to precipitate.
The Ka liumpermanganat used as an oxidant is in the ratio of
2MolEMnO to 3MolHematoxylinCigHuOs added so that according to the reaction: 3 C16H14O6 + 2KMnO4 = 3 C16H12O6 + 2 MnOO + 2 KOH + 2 H20 the total amount of available hematoxylin is converted into hematein. As a result, the solution has a maximum breaking force with respect to the amount of hematoxylin used. The staining liquid provides uniform colorations because, in contrast to the previously customary solutions, it does not contain any non-oxidized hematoxylin, for example as a result of oxidation that is too slow.
Because hematein is the effective dye. the complete IT conversion of the hematoxylin to hematein is an essential condition for the standardization of the staining liquid. The complete conversion of the hematoxylin into hematein also has the advantage of preventing surface oxidation and hemorrhage. As an oxidizing agent, potassium permanganate offers the advantage that, unlike many other oxidizing agents, it has no pickling properties. The use of an oxidizing agent, which has an additional pickling effect, would disrupt the delicate balance of this Funkeion.
It was found that the properties of the dye liquid can be considerably improved by adding a non-volatile solvent; Furthermore, the penetration of the staining solution into the tissue is made easier if the staining liquid has a hygroscopic effect. This prevents the staining solution from concentrating on the surface and prevents the formation of surface foam for reasons other than the oxidation taking place. Diethylene glycol is a solvent which fully meets the requirements mentioned. In addition, diethylene glycol has the further advantage of acting as an antioxidant.
I) the addition of a buffer fulfills two important functions, namely the maintenance of the pH value suitable for the stability of the solution and for an optimal coloring capacity. This is not to say that proper pH alone is sufficient. The correct concentration of ions at a given pH is also important. If the concentration of the buffer is too high, the chemical components of the tissue cannot react appropriately with the staining solution.
This is important because a hematoxylin solution does not immediately provide the desired color on tissue, but first has to be converted into an insoluble lacquer of the desired color, which in turn depends on the type of mordant, since hematoxylin is a polygenetic pigment . The correct pn value and the correct ion concentration of the buffer are therefore important for the uniform formation of a constant color value. An alkali of constant value is used for this purpose. Tap water is to be avoided as it has the disadvantage of changing alkalinity.
Distilled water is best used as a carrier because it is a common solvent for all components and is also a medium in which the ion mobility is satisfactory.
To produce a coloring liquid of the type mentioned, hematoxylin and potassium aluminum sulfate are first dissolved separately in small amounts of distilled water, the two solutions are mixed and the whole thing is supplemented to 300 cm3 with distilled water. This solution is boiled for 20 minutes and then left to cool.
For the sake of simplicity, it should be denoted by A.
The potassium permanganate is dissolved in distilled water, made up to 150 cm3 and gradually added to solution A with constant stirring. Here, as mentioned above, the hematoxylin is oxidized. The color solution obtained is denoted by B.
Diethylene glycol is gradually added to solution B with constant stirring.
The solution obtained is denoted by C.
The buffer substances, monopotassium phthalate and hydrochloric acid, are added one after the other to this solution C, the phthalate first being dissolved in distilled water with constant stirring. After cooling the whole thing to room temperature, the volume is made up to 1000.00 cm3 with distilled water. It is advisable to stir the finished staining solution for one hour.
After the basophilic material of the tissue sections has been stained, another staining solution, usually an eosin solution, can be used to stain the aeidophilic material or the cytoplasm. So far, solutions with a minimum content of 0.5 to 1.0% eosin have been used in historical technology, and higher concentrations have often been used because it is usually assumed that a larger amount of dye is necessary for a strong color effect is. This is by no means true because good coloration can only be achieved under suitable conditions.
For a dye solution according to the invention which contains eosin as the dye, a combination of mordants of various types with the ability to provide double-colored lakes is preferably used. Suitable pickling agents are calcium acetate and chromium trioxide, but other pickling agents can also be used. The double colored varnish formed has the advantage of adhering to the fabric better than a simple colored varnish. Calcium acetate acts as a dressing agent in the first phase, i.e. when the eosin molecule condenses with the dressing agent molecule.
The chromium trioxide also has a pickling effect. but it is mainly used for its oxidative effect. It is advantageous to add a swelling agent to the eosin solution, e.g. B. urea, to facilitate the penetration of the dye into the fabric. Furthermore, the addition of a wetting agent, e.g. B. Natriumdioktylsulfouschnt, advantageous. Monopotassium phosphate and disodium phosphate are preferably used as buffers, the pH of the eosin solution being 6.
A preferred composition of such an eosin color liquid is the following: eosin (sodium tetrabromofluoresecin), C20H6O5Br4-Na2, color purity 91% G, 0015 mol 1, 0989 g caleium acetate, Ca (CH3COO) 2. H2O 0.00075 mol 0.1321 chromium trioxide, Crois 0.00075 mol 0.0750 g monopotassium phosphate, KH2PO4 0.01 mol 1.3620 g disodium phosphate, Na2HPO45. 7 H2O 0.6166 g urea, NH2. CO. NH2 3.000 g sodium dioctyl sulfosuccinate, 5% aqueous solution 1.0 CM3 distilled water ad 1000.00 em3
The solution is z.
B. produced as follows: The components mentioned are distilled separately in small amounts. Dissolved water. The eosin solution is carefully boiled for 25 minutes, distilled water being added to compensate for the evaporation loss, but not over a volume of 150 cm3. The Caleiuma acetate solution is then added and the mixture is boiled for a further 2 hours, with distilled water being added if necessary to maintain the volume of 150 cubic meters. After the solution has cooled to 60 ° C., the chromium trioxide is gradually added with stirring.
After the solution has stood for about an hour, zlonopotassium phosphate is added with stirring, and then disodium phosphate. To the solution cooled to 40 ° C., urea and the wetting agent are added one after the other in the order mentioned, with constant stirring. Finally, to the solution cooled to room temperature, distilled water is added up to a volume of 1000 cm3.
To remove the paraffin from the fabric and to dye the tendons, the automatic immersion apparatus available commercially under the protected name Autotechnicon is preferably used. B. U.S. Patent No. 2341198 by Edwin C.
Weiskopf is described.
In the treatment of the pieces of tissue to remove the paraffin and to dye the tendons, low alcohols such. B. ethanol, is used to remove the xylene used as the solvent for the paraffin and to wash out the excess eosin dye from the tissue.
However, alcohols have disadvantageous properties. They have a decolorizing effect, since they appear to remove some of the acidophilic and in some cases also the basophilic staining from the tissue through chemical activity. Their hygroscopicity leads to the absorption of water from the atmosphere and thus to a dilution. Ethyl alcohol evaporates rapidly at room temperature; consequently, the sections mounted on the slides have a tendency to dry out to a greater or lesser extent when they are transferred from one bath to the other. It has been found that the disadvantages mentioned can be eliminated by using diethylene glycol monoethyl ether acetate for the purposes mentioned.
This solvent has a boiling point of 217.5 ° C., so that it does not evaporate at room temperature. Furthermore, it can be measured in any ratio with water, alcohols and aromatic hydrocarbons and is also not hygroscopic.
The use of the dye liquids described is illustrated below by means of an example.
The aforementioned Autotechnieon apparatus is used to automatically carry out the immersion operations. Solvent F in the following denotes diethylene glycol monoethyl ether acetate.
The 12 cups of the Autotechnieon apparatus are arranged in the specified places and contain the liquids mentioned. The duration of immersion is given in minutes.
position
Treatment- Treatment of the liquid
Mug
1 xylene, pure 2 min.
2 Solvent F, pure 2 (for tissue fixed with queek silver eblorid, the solution is 0.25 / o
Iodine added)
3 Solvent F, pure 2
4 Distilled water 2 5 Color liquid 5 (hematin solution)
6 Distilled water 4 7 0.01 n solution of
Lithium carbonate 2
8 Distilled waaser 4 ') Coloring liquid 5 (eosin solution)
10 solvent F, pure 5
11 Solvent F, pure 5
12 Solvent F, pure 5
The sections removed from the apparatus are finally placed in a beaker with xylene for 5 minutes.
The barders are expediently corrugated as follows: a) Xylene b) Solvent F in beakers 2 and 3 c) Distilled water in beakers 4, 6, 8 d) Lithium carbonate solution in beakers 7 c) Solvent F in beakers 10, 11, 12 f) Staining solutions in beakers 5 and 9
The practical duration of use of the baths is determined by the scope of the relevant laboratory work.