CA2630530C - Composition comprising a colloidal synthetic bioresorbable vector and a viral vector - Google Patents

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Abstract

The invention relates to pharmaceutical compositions containing a colloidal synthetic bioresorbable vector which comprises at least one type of proteinic substance, to a viral vector corresponding to at least one type of proteinic substance of the synthetic vector and to a method for the prophylactic, therapeutic and diagnosis use thereof.

Description

WO 2007/05758 WO 2007/05758

2 PCT/FR2006/051039 COMPOSITION COMPRENANT UN VECTEUR SYNTHETIQUE COLLOIDAL BIORESORBABLE ET UN
VECTEUR VIRAL
La présente invention concerne le domaine de la vaccination prophylactique et thérapeutique. En particulier, la présente invention a pour objet une composition vaccinale comprenant un vecteur viral permettant d'exprimer des substances protéiques et un vecteur synthétique présentant des substances protéiques.
Historiquement, les antigènes utilisés dans les vaccins sont, soit des microorganismes vivants dont le pouvoir pathogène a été atténué, soit des microorganismes tués. Cependant ces vaccins provoquent souvent des effets secondaires non désirables lors de l'administration et dans de rares cas des complications très graves. Ainsi, depuis de nombreuses années, pour assurer la sécurité vaccinale, on privilégie l'utilisation des fractions purifiées des microorganismes dans les vaccins. Un tel immunogène, administré seul, peut ne pas induire de réponse immune suffisante. Selon l'art antérieur, de nombreuses stratégies vaccinales ont été
développées pour augmenter ou orienter la réponse immunitaire induite par les immunogènes purifiés présents dans un vaccin.
La stratégie la plus directe consiste à associer la substance protéique d'intérêt (immunogène) à un adjuvant. Bien que de nombreux types d'adjuvants soient en développement, les hydroxydes d'aluminium (alum) étaient jusqu'à récemment le seul adjuvant autorisé pour une administration à l'homme. Or l'alum est un adjuvant faible pour l'induction des réponses humorales, il n'est pas approprié pour tous les antigènes et ne permet pas d'obtenir des réponses cellulaires. Parmi les adjuvants en développement, les systèmes les plus efficaces pour induire une immunité forte sont les vecteurs synthétiques à
base de microparticules et en particulier les microparticules de poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) et de poly(acide lactique) (PLA). De par leur taille, ces particules permettent de cibler des cellules présentatrices d'antigène comme les macrophages ou les cellules dendritiques et améliorent la prise en charge de l'immunogène par le système immunitaire. La substance protéique peut être soit encapsulée dans les microparticules, soit adsorbée à la surface. Les deux approches permettent d'induire à la fois des réponses immunes cellulaires et humorales, même si à l'origine elles étaient surtout utilisées pour obtenir une réponse anticorps. Cependant, l'encapsulation présente deux inconvénients majeurs. Le premier c'est qu'il faut une dégradation partielle ou totale de la microparticule pour que la substance protéique devienne disponible pour le système immunitaire, ainsi la mise en place de l'immunité est retardée. Le second c'est que la substance protéique peut être dénaturée ou dégradée lors de l'encapsulation et ainsi perdre ses propriétés immunogéniques. Pour ces raisons ce procédé ne peut pas être utilisé avec tout type de substance protéique, alors que le procédé par adsorption ne présente pas ces inconvénients. Dans les deux cas, l'obstacle majeur à l'utilisation est leur manque d'efficacité pour générer des réponses cellulaires spécifiques. Si par rapport à l'alum les réponses cellulaires induites sont bien meilleures, elles sont bien en deçà de ce que l'on peut obtenir avec un vecteur viral.
Les vecteurs viraux recombinants permettent de faire exprimer in vivo (chez l'animal ou chez l'homme) la substance protéique d'intérêt. Il s'agit d'une stratégie efficace qui permet une forte mobilisation du système immunitaire. Mais l'induction d'une réponse immune durable dans le temps nécessite l'utilisation de vecteurs vivants atténués qui peuvent se répliquer dans l'organisme vacciné. Or, pour des raisons réglementaires liées à la sécurité
d'utilisation des vaccins, les nouvelles générations de vaccins utilisent des vecteurs viraux non réplicatifs chez l'homme, entraînant une diminution des réponses immunes spécifiques dans le temps. Ainsi, dans le cas de vaccins prophylactiques, il est encore parfois nécessaire de restirnuler l'immunité spécifique pour garder une réponse mémoire efficace.
Dans le domaine de l'immunothérapie, la restirnulation de l'immunité spécifique reste utile pour maintenir l'intensité des réponses immunes qui permettent de contrôler l'organisme pathogène. Ainsi, l'administration répétée de vecteurs viraux semble nécessaire mais s'accompagne d'un problème majeur qui est celui de l'immunité anti- vecteur. En effet, le vecteur viral est lui-même un immunogène et dès lors qu'il est administré à plusieurs reprises, il y a apparition puis augmentation de l'immunité spécifique du vecteur. Cette réponse immune visant à éliminer le vecteur viral empêche aussi l'expression du gène qu'il véhicule entraînant ainsi une diminution de l'efficacité des réponses immunes contre la substance protéique d'intérêt.
De plus, l'immunité anti- vecteur empêche l'utilisation du vecteur concerné pour vacciner contre une autre maladie. Schagen et al. décrivent certaines approches permettant de pallier cette 2 PCT / FR2006 / 051039 COMPOSITION COMPRISING A BIORESORBABLE COLLOIDAL SYNTHETIC VECTOR AND A
VIRAL VECTOR
The present invention relates to the field of prophylactic vaccination and therapeutic. In particular, the present invention relates to a vaccine composition comprising a viral vector for expressing protein substances and a vector synthetic material containing protein substances.
Historically, the antigens used in vaccines are either microorganisms living organisms whose pathogenicity has been attenuated, ie microorganisms you are. However these vaccines often cause undesirable side effects when administration and in rare cases very serious complications. Thus, since many years, for ensure immunization safety, the use of purified microorganisms in vaccines. Such an immunogen, administered alone, may not not induce sufficient immune response. According to the prior art, many strategies vaccines have been developed to increase or guide the immune response induced by immunogenic purified present in a vaccine.
The most direct strategy is to combine the protein substance interest (immunogenic) to an adjuvant. Although many types of adjuvants are development, aluminum hydroxides (alum) were until recently the alone adjuvant authorized for administration to humans. Alum is an adjuvant Weak To induction of humoral responses, it is not appropriate for all antigens and not allow to obtain cellular responses. Among the adjuvants in development, most effective systems for inducing strong immunity are the vectors synthetic to microparticles and in particular the microparticles of poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) and poly (lactic acid) (PLA). Because of their size, these particles allow to target antigen-presenting cells such as macrophages or cell dendritics and improve the management of the immunogen by the system immune. The protein substance may be either encapsulated in the microparticles or adsorbed to the area. Both approaches allow to induce both responses cellular immune and humorous, even if originally they were mostly used to obtain answer antibody. However, encapsulation has two major disadvantages. The first is that partial or complete degradation of the microparticle is required for the substance protein becomes available to the immune system, so the implementation place of immunity is delayed. The second is that the protein substance can be denatured or degraded during encapsulation and thus lose its properties immunogenic. For these reasons this process can not be used with any type of substance protein, while the Adsorption process does not have these disadvantages. In both cases, the obstacle major to use is their lack of efficiency to generate responses cell specific. If compared to alum the induced cellular responses are much better, they are well below what can be achieved with a viral vector.
The recombinant viral vectors make it possible to express in vivo (in the animal or in humans) the protein substance of interest. This is a strategy effective that allows a strong mobilization of the immune system. But the induction of an answer immune sustainable use requires the use of live attenuated vectors that can replicate in the vaccinated organism. However, for regulatory reasons related to security the use of vaccines, new generations of vaccines use viral vectors replicative in humans, resulting in decreased immune responses specific in the time. Thus, in the case of prophylactic vaccines, it is still sometimes necessary to to restore specific immunity to keep an efficient memory response.
In the field Immunotherapy, restirnulation of specific immunity remains useful to maintain the intensity of immune responses that control the body pathogenic. So, repeated administration of viral vectors seems necessary but accompanied by a major problem which is that of anti-vector immunity. Indeed, the Viral vector is itself even an immunogen and since it is administered several times, there is has an appearance then increase of the specific immunity of the vector. This immune response aimed to eliminate the viral vector also prevents the expression of the gene that it drives vehicle so a decrease the effectiveness of immune responses against the protein substance of interest.
Moreover, anti-vector immunity prevents the use of the vector concerned for vaccinate against other illness. Schagen et al. describe some approaches to to overcome this

3 immunité anti- vecteur telles que des modifications au niveau du vecteur ou encore des adaptations au niveau des patients vaccinés (2004, Critical reviews in Oncology/Hematology 50 :51-70). Toutefois la mise en uvre de ces approches est difficile et ne peut pas être réalisée pour toutes les maladies ou tous les patients. La stratégie utilisant des vecteurs viraux n'est donc pas optimisée.
Une autre voie d'amélioration de la réponse immune induite par vaccination est la stratégie de prime-boost. Elle consiste à augmenter les réponses immunes pécifiques en administrant séquentiellement deux vaccins différents véhiculant une même substance protéique au lieu d'administrer le même vaccin plusieurs fois. Par exemple, il est possible d'utiliser un vecteur viral différent à chaque injection (Negri DR, et al., 2004, Journal of General Virology, 85 :1191-1201). Cependant cette stratégie n'a que peu de chances de succès car le nombre de vecteurs viraux dont l'emploi est autorisé chez l'homme est très restreint. De plus, l'administration répétée de ces vecteurs viraux se heurte encore une fois au problème de l'immunité anti- vecteur. Afin de contourner ce problème, Otten et al. décrivent l'utilisation d'un prime ADN suivi d'un boost de microparticules de PLGA en surface desquelles des antigènes protéiques Dra adsorbés (2003, Journal of Virology, 77 :6087-6092). Sharpe et al. ont proposé un prime ADN en encapsulant l'ADN dans des microparticules à base de PLGA et un boost par un vecteur viral MVA (2003, Virology, 313 :13-21). O'hagan et al. décrivent l'utilisation d'un prime par de l'ADN
adsorbé sur des microparticules de PLGA, suivi d'un boost par un vecteur vaccine (2001, Journal of Virology, 75 :9037-9043). La demande de brevet WO 98/56919A décrit un prime ADN, suivi d'un boost par un poxvirus. L'inconvénient de l'utilisation d'un prime ADN est sa faible efficacité notamment chez les primates et aussi lorsqu'il s'agit de gène peu immunogène comme par exemple le gène tat du VIH-1. La demande de brevet WO 98/56919A
décrit également l'utilisation d'un prime par des VLP ( virus-like particles ), suivi d'un boost par un poxvirus. Les VLP sont des particules virales défectives qui n'incorporent pas le génome viral et qui ne peuvent pas se répliquer. Elles sont souvent formées par autoassemblage des protéines structurales d'un virus ou d'un rétrotranspo son (élément endogène semblable à un rétrovirus) telles que le précurseur Pr55 Gag du HIV-1 ou les protéines Li et L2 du HPV-16 3 anti-vector immunity such as changes in the vector or still some adaptations at the level of vaccinated patients (2004, Critical reviews in Oncology / Hematology 50: 51-70). However, the implementation of these approaches is difficult and can not be performed for all diseases or all patients. The strategy using viral vectors is not optimized.
Another way of improving the immune response induced by vaccination is the premium-boost strategy. It consists in increasing the immune responses pecific sequentially administering two different vaccines carrying one substance protein instead of administering the same vaccine multiple times. For example, he is possible to use a different viral vector at each injection (Negri DR, et al., 2004, Journal of General Virology, 85: 1191-1201). However this strategy has only few chances of because the number of viral vectors authorized for use in the man is very restricted. In addition, the repeated administration of these viral vectors is once again at problem of anti-vector immunity. In order to get around this problem, Otten and al. describe the use of a DNA bonus followed by a boost of PLGA microparticles area of which adsorbed Dra protein antigens (2003, Journal of Virology, 77: 6087-6,092). Sharpe et al. proposed a DNA bonus by encapsulating DNA in microparticles based on PLGA and a boost with a MVA viral vector (2003, Virology 313: 13-21). O'hagan et al. describe the use of a premium by DNA
adsorbed on PLGA microparticles, followed by a boost with a vaccinia vector (2001, Journal of Virology, 75: 9037-9043). Patent Application WO 98 / 56919A describes a premium DNA, followed by a boost by a poxvirus. The disadvantage of using a bonus DNA is its weak efficacy especially in primates and also when it comes to little gene immunogenic as for example the tat gene of HIV-1. The patent application WO 98 / 56919A
described also the use of a premium by VLPs (virus-like particles), followed by a boost by a poxvirus. VLPs are defective viral particles that do not incorporate not the genome viral and can not replicate. They are often formed by self-assembly of structural proteins of a virus or retrotranspo (endogenous similar to a retroviruses) such as the Pr55 Gag precursor of HIV-1 or the Li and L2 of the HPV-16

4 (papillomavirus humain). En fonction des protéines virales exprimées, la structure du VLP peut se rapprocher plus ou moins de celle du virion natif, de sorte que les VLP sont comparables à un virus. L'inconvénient de ces VLP est qu'elles sont issues de la biotechnologie et que leur fabrication selon les normes réglementaires est très difficile.
Les Demanderesses ont maintenant mis en évidence, contre tout attente, que l'association particulière d'un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant des substances protéiques et d'un vecteur viral comprenant les séquences nucléotidiques codant pour les substances protéiques correspondantes, permet d'augmenter l'efficacité de la vaccination liée à l'utilisation d'une substance protéique, tout en diminuant l'immunité anti-vecteur.
Ainsi un premier objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant ou consistant en :
¨ un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant au moins une substance protéique, ¨ un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique ¨ éventuellement en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Un autre objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant ¨ un vecteur synthétique colloïdal constitué de microparticules ou microsphères biorésorbables non toxiques comprenant un antigène protéique ou plusieurs antigènes protéiques, et , CA 02630530 2015-01-27 4a - un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour le ou les antigènes protéique(s) compris dans le vecteur synthétique.
Un autre objet de l'invention consiste en un kit pharmaceutique comprenant - un vecteur synthétique colloïdal constitué de microparticules ou microsphères biorésorbables non toxiques comprenant un antigène protéique ou plusieurs antigènes protéiques, et - un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour le ou les antigènes protéique(s) compris dans le vecteur synthétique.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation du kit tel que défini par l'invention pour la préparation d'un médicament.
Un autre objet de l'invention consiste en un kit pharmaceutique comprenant la composition telle que définie par l'invention et au moins un excipient.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation de la composition telle que définie par l'invention pour la préparation d'un médicament.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation du kit tel que défini par l'invention pour la préparation d'un vaccin prophylactique ou thérapeutique.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation du kit tel que défini par l'invention pour un traitement prophylactique ou thérapeutique chez un patient.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation de la composition telle que définie par l'invention, pour la préparation d'un vaccin prophylactique thérapeutique.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation de la composition telle que définie par l'invention pour un traitement prophylactique ou thérapeutique chez un patient.

4b La présente invention propose donc une nouvelle composition comprenant un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable présentant au moins une substance protéique.
On entend par composé biorésorbable un composé qui n'est pas toxique, c'est-à-dire dont l'administration dans l'organisme ne provoque pas de modification physiologique ou métabolique létale, invalidante ou gênante dans la vie quotidienne, et qui peut être éliminé par les voies naturelles de l'organisme après administration. ________________________________________________________ Les termes colloïdes et colloïdal(aux) définissent toute dispersion d'une substance (phase dispersée) au sein d'une phase continue aqueuse dont au moins une des trois dimension est inférieure ou égale à 101um et préférentiellement inférieure ou égale à lium.
Une phase continue aqueuse est une phase dont la composition est majoritairement de l'eau, comme par exemple un tampon ou un mélange eau/solvant organique miscible à l'eau.
Bien entendu, une phase continue aqueuse appropriée aux fins de l'invention est une phase non toxique.
La phase dispersée peut être un liquide insoluble dans la phase continue comme par exemple une huile ou un mélange d'huiles, ou bien des matières grasses organiques, ou encore être un solide de nature polymère ou minérale. La phase dispersée est toujours biorésorbable.
Des exemples de phase dispersée comprennent l'huile d'olive, l'huile de tournesol, l'huile d'arachide, l'huile de colza, ou leurs mélanges ; des triglycérides ;
les polymères synthétiques tels que les polymères d'hydroxyacide comme par exemple l'acide lactique, l'acide glycolique, l'aide hydroxybutyroique, ou les composés issus de la caprolactone ; des polypeptides comme les composés issus de la polymérisation du caprolactame ;
les polymères naturels tels que, à titre d'exemple, les polysaccharides comme l'acide hyaluronique, le chitosane, le dextrane.
Des exemples de tels colloïdes biorésorbables sont donnés dans Benita S. et Levy M.Y., 1993, Journal of Pharmaceutical Sciences, 82(11) :1069-1079 (émulsions liquide/liquide), Trotta M., et al., 2003, International Journal of Pharmeaceutics, 257: 153-160 (émulsions lipide solide/liquide) et Jiang W., et al., 2005, Biodegradable poly(lactic-co-glycolic) acid microparticles for injectable delivery of vaccine antigens Advanced Drug Delivery Reviews, 57 : 391-410.
La forme du vecteur synthétique colloïdal est donnée par la phase dispersée qui peut être sphérique ou non, homogène ou constituée d'un empilement de lamelles.
De préférence, le vecteur synthétique de l'invention est de nature sphérique.
De préférence encore le vecteur est composé de micro sphères. Les termes micro sphère et microparticule sont employés indifféremment dans la suite de la description.
Par microparticule ou microsphère on entend des particules de taille au plus micronique pour leur permettre d'entrer dans les cellules présentatrices d'antigènes. Par taille au plus micronique, on entend une dimension inférieure ou égale à 999 m. De préférence, les microparticules ont un diamètre de particule inférieure ou égale à 3 m. De façon davantage préférée, les particules de l'invention sont de taille submicronique, avec, de préférence, un diamètre compris entre 150 et 900 nm, de préférence encore entre 250 et 700 nm. La taille des particules est facilement déterminée par des techniques connues de l'homme du métier telles que, par exemple, en utilisant la microscopie à balayage électronique, la diffusion quasi-élastique de la lumière, la microscopie électronique à transmission.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les vecteurs synthétiques colloïdaux sont des vecteurs à base de polymère.
A titre d'exemple cb vecteurs synthétique à base de polymère, on peut citer des vecteurs comprenant des microparticules à base de polymères tels que les poly(acides oc-hydroxylés), les poly(acides hydroxybutyriques), les polycaprolactones, les polyorthoesters et les polyanhydrides. De préférence, le vecteur synthétique comprend au moins un polymère biorésorbable choisi parmi un poly(acide oc-hydroxylé) tel que le poly(acide D-lactique), le poly(acide L lactique) (appelés PLA), le poly(acide glycolique) (appelé PLG), ou bien un mélange de poly(acides oc¨hydroxylés) tels qu'un mélange de poly(acides D- et L-lactiques), un mélange de poly(acide L-lactique) et de poly(acide glycolique), un mélange de poly(acide D-lactique) et de poly(acide glycolique), ou un mélange de poly(acides D- et L-lactiques) et de poly(acide glycolique). Lorsque le polymère est un mélange de poly(acides oc-hydroxylés), la proportion de chaque constituant peut être facilement déterminée par l'homme du métier.
Ainsi, par exemple, on peut utiliser un mélange racémique de poly(acides D- et L-lactiques) ou un mélange PLA/PLG à divers pourcentages connus de l'homme du métier. De préférence, le vecteur synthétique colloïdal selon l'invention est préparé à
partir d'au moins un polymère choisi parmi les poly(acides oc-hydroxylés). De préférence encore, les particules de l'invention sont dénuées d'agent stabilisant et d'agent tensioactif de sorte qu'elles ne sont pas toxiques. Par microparticule toxique, on entend une microparticule comportant au moins un composé susceptible de provoquer des troubles biologiques, tels que des perturbations du métabolisme, dans l'organisme ayant reçu la microparticule. De telles particules non toxiques peuvent être préparées selon le protocole décrit dans la demande de brevet W02005/027871.
Selon un autre mode de réalisation, le vecteur synthétique colloïdal est préparé à
partir d'au moins un polymère naturel tel que ceux cités précédemment.
La composition de l'invention est utile pour stimuler tant une réponse à
médiation cellulaire qu'une réponse humorale. Elle est utile tant en prophylactique et thérapeutique qu'en diagnostic.
Ainsi, les substances protéiques appropriées aux fins de l'invention portées par le vecteur synthétique peuvent être toutes substances protéiques contre lesquelles on cherche à
déclencher une réponse immunitaire.
Par réponse immunitaire, on entend une réponse à médiation cellulaire, une réponse humorale ou les deux.
Par réponse à médiation cellulaire, on entend une réponse médiée par les lymphocytes T et/ou d'autres leucocytes. Cette réponse se traduit par l'induction d'une activité lytique par les lymphocytes T cytotoxiques et/ou par la production de cytokines par les lymphocytes T
CD8+ ou par les cellules T auxiliaires (helper).
Par réponse humorale, on entend une réponse médiée par les molécules anticorps sécrétés par les lymphocytes B.
Par substance protéique, on entend toute substance protéique ayant un rôle d'antigène après addition aux vecteurs appropriés aux fins de l'invention tels que peptides, protéines, fragments de protéine, polyprotéines, glycoprotéines et glycoprotéines, étant entendu que les fragments de protéine ont conservé la structure d'intérêt.
Les antigènes sont des molécules susceptibles d'être reconnues par un anticorps dont ils ont induit la synthèse par une réponse immunitaire et contenant au moins un épitope.
Des exemples de fragments de protéine comprennent par exemple les peptides, les polypeptides et les épitopes.
Les épitopes sont des peptides comprenant entre 3 et 15 et généralement entre 4 (human papillomavirus). Depending on the viral proteins expressed, the structure VLP may be more or less similar to that of the native virion, so that the VLPs are comparable to a virus. The disadvantage of these VLPs is that they are from biotechnology and their manufacture according to the standards regulatory is very difficult.
The Claimants have now highlighted, against all odds, that the particular association of a synthetic colloidal vector bioresorbable comprising protein substances and a viral vector comprising the nucleotide sequences encoding protein substances corresponding, increases the effectiveness of vaccination linked to the use of a substance protein, while decreasing anti-vector immunity.
Thus a first object of the invention consists of a composition pharmaceutical composition comprising or consisting of:
A bioabsorbable colloidal synthetic vector comprising at least one protein substance, A viral vector comprising at least one nucleotide sequence encoding for a protein substance corresponding to at least one substance protein of the synthetic vector ¨ possibly in combination with a pharmaceutically acceptable excipient acceptable.
Another subject of the invention consists of a pharmaceutical composition comprising ¨ a synthetic colloidal vector consisting of microparticles or non-toxic bioresorbable microspheres comprising an antigen protein or several protein antigens, and , CA 02630530 2015-01-27 4a a viral vector comprising at least one nucleotide sequence encoding for the protein antigen (s) included in the synthetic vector.
Another subject of the invention consists of a pharmaceutical kit comprising a synthetic colloidal vector consisting of microparticles or non-toxic bioresorbable microspheres comprising an antigen protein or several protein antigens, and a viral vector comprising at least one sequence nucleotide encoding the protein antigen (s) included in the vector synthetic.
Another object of the invention is the use of the kit as defined by the invention for the preparation of a medicament.
Another subject of the invention consists of a pharmaceutical kit comprising the composition as defined by the invention and at least one excipient.
Another object of the invention is the use of the composition such as defined by the invention for the preparation of a medicament.
Another object of the invention is the use of the kit as defined by the invention for the preparation of a prophylactic or therapeutic vaccine.
Another object of the invention is the use of the kit as defined by the invention for prophylactic or therapeutic treatment in a patient.
Another object of the invention is the use of the composition such defined by the invention, for the preparation of a prophylactic vaccine therapeutic.
Another object of the invention is the use of the composition such defined by the invention for a prophylactic or therapeutic treatment in a patient.

4b The present invention therefore proposes a new composition comprising a bioresorbable colloidal synthetic vector having at least one substance protein.
By bioabsorbable compound is meant a compound that is not toxic, that is to say, the administration of which in the organism does not provoke change physiological or metabolic lethal, debilitating or annoying in life daily, and that can be eliminated by the natural ways of the body after administration. ________________________________________________________ The terms colloid and colloidal (aux) define any dispersion of a substance (dispersed phase) within a continuous aqueous phase of which at least one of three dimension is less than or equal to 101um and preferentially lower or equal to lium.
A continuous aqueous phase is a phase whose composition is mostly from water, such as a buffer or a mixture of water and organic solvent miscible with water.
Of course, an aqueous continuous phase suitable for the purposes of the invention is a phase nontoxic.
The dispersed phase can be an insoluble liquid in the continuous phase as by example an oil or a mixture of oils, or fat organic, or be a solid of polymeric or mineral nature. The dispersed phase is always bioresorbable.
Examples of dispersed phase include olive oil, sunflower, peanut oil, rapeseed oil, or mixtures thereof; triglycerides;
polymers synthetic materials such as hydroxy acid polymers such as, for example, lactic, glycolic acid, hydroxybutyric acid, or compounds derived from caprolactone; of the polypeptides such as compounds derived from the polymerization of caprolactam;
the natural polymers such as, for example, polysaccharides as acid hyaluronic acid, chitosan, dextran.
Examples of such bioabsorbable colloids are given in Benita S. and Levy MY, 1993, Journal of Pharmaceutical Sciences, 82 (11): 1069-1079 (Emulsions liquid / liquid), Trotta M., et al., 2003, International Journal of Pharmeaceutics, 257: 153-160 (solid / liquid lipid emulsions) and Jiang W., et al., 2005, Biodegradable poly (lactic-co glycolic) acid microparticles for injection vaccine antigens Advanced Drug Delivery Reviews, 57: 391-410.
The form of the synthetic colloidal vector is given by the dispersed phase that can to be spherical or not, homogeneous or constituted by a stack of lamellae.
Preferably, the synthetic vector of the invention is spherical in nature.
Of more preferably the vector is composed of micro spheres. The terms micro sphere and microparticle are used indifferently in the following description.
By microparticle or microsphere means particles up to micronic for their allow entry into the antigen presenting cells. By size at more micronically, we mean a dimension less than or equal to 999 m. Preferably, microparticles have a particle diameter less than or equal to 3 m. More favorite, particles of the invention are of submicron size, preferably with a diameter between 150 and 900 nm, more preferably between 250 and 700 nm. The size of particles is easily determined by techniques known to man of the job such that, for example, using scanning electron microscopy, the virtual diffusion elastic light, transmission electron microscopy.
According to one embodiment of the invention, the synthetic vectors colloidal are polymer-based vectors.
As an example of synthetic vectors based on polymer, mention may be made of of the vectors comprising microparticles based on polymers such as polyacids hydroxylated), poly (hydroxybutyric acids), polycaprolactones, polyorthoesters and polyanhydrides. Preferably, the synthetic vector comprises at least one polymer bioresorbable selected from a poly (oc-hydroxylated acid) such as poly (D-acid) lactic acid), the poly (Lactic acid) (called PLA), poly (glycolic acid) (called PLG), or a mixture of poly (oxyhydroxy acids) such as a mixture of poly (D- and L-lactic acid) a mixture of poly (L-lactic acid) and poly (glycolic acid), a mixture of poly (acid D-lactic) and poly (glycolic acid), or a mixture of poly (D- and L-lactic acid) and poly (glycolic acid). When the polymer is a mixture of poly (acids oc-hydroxy) the proportion of each constituent can easily be determined by the skilled person.
Thus, for example, a racemic mixture of poly (D- and L-lactic acid) or a PLA / PLG mixture at various percentages known to those skilled in the art. Of preferably, the synthetic colloidal vector according to the invention is prepared for from at least one polymer chosen from poly (α-hydroxy acids). Preferably again, the particles of the invention are devoid of stabilizing agent and surfactant so that they are not toxic. By toxic microparticle is meant a microparticle comprising at least one compound likely to cause biological disorders, such as disturbances metabolism, in the body that has received the microparticle. Such non-toxic particles can be prepared according to the protocol described in the patent application W02005 / 027871.
According to another embodiment, the colloidal synthetic vector is prepared for from at least one natural polymer such as those mentioned above.
The composition of the invention is useful for stimulating both a response to mediation cellular than a humoral response. It is useful both in prophylactic and therapeutic that diagnostic.
Thus, the protein substances suitable for the purposes of the invention speak synthetic vector can be any protein substances against which one seeks to trigger an immune response.
By immune response is meant a cell-mediated response, a reply humorous or both.
Cell-mediated response refers to a response mediated by the lymphocytes T and / or other leucocytes. This response results in the induction of a lytic activity by cytotoxic T lymphocytes and / or the production of cytokines by T lymphocytes CD8 + or helper T cells.
By humoral response, we mean a response mediated by the antibody molecules secreted by B lymphocytes.
Protein substance means any protein substance having a role antigen after addition to the appropriate vectors for the purposes of the invention that peptides, proteins, protein fragments, polyproteins, glycoproteins and glycoproteins, being understood that the protein fragments have retained the structure of interest.
Antigens are molecules that can be recognized by a antibodies of which they induced synthesis by an immune response and containing at least an epitope.
Examples of protein fragments include, for example, peptides, the polypeptides and epitopes.
Epitopes are peptides comprising between 3 and 15 and generally between

5 et 15 acides aminés, consistant en le fragment peptidique minimal contre lequel est déclanché
une réponse immunitaire.

Le vecteur synthétique présente les substances protéiques en de multiples copies. Par au moins une substance protéique, on entend au moins plusieurs substances protéiques de même type. Par type de substance protéique, on entend un ensemble de substances protéiques déclanchant la même réponse immunitaire par production des mêmes anticorps (i.e. ayant la même immunité).
Le vecteur synthétique peut donc comprendre :
- soit des substances protéiques de même type et donc constituant des antigènes associé à la même maladie. Ainsi, par exemple, le vecteur synthétique peut comprendre comme substance protéique la protéine p24 sous forme de protéine mtive et/ou de protéine mutée et/ou de fragment de protéine, étant entendu que la protéine mutée et le fragment ont conservé leur immunité ;
- soit des substances protéiques de types différents et constituant des antigènes associé à la même maladie. Ainsi, par exemple, le vecteur synthétique peut comprendre plusieurs protéines du virus de l'immunodéficience humaine (VIE) telles que la protéine Gag, la protéine Gag mutée n'ayant pas la même immunité, la protéine Tat, la protéine Rev, la protéine Nef, la protéine Env ;
- soit des substances protéiques de types différents et constituant des antigènes associé à des maladies différentes. Ainsi, par exemple, le vecteur synthétique peut comprendre au moins un type de protéine du VIH, telles que les protéines p24, Tat, Rev, et au moins un type de protéine du virus de l'hépatite C (VHC) telles que les protéines NS2, NS3, NS4.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le vecteur synthétique comprend des substances protéiques de types différents et constituant des antigènes associés à la même maladie.
Les substances protéiques peuvent être de plusieurs origines telles que d'origine virale, bactérienne ou de pathologie d'origine non infectieuse (comme le cancer ou une maladie métabolique).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la substance protéique est un antigène d'origine virale.

Lorsque la substance protéique est d'origine virale, les virus utilisés sont tous virus pour lesquels on connaît des substances capables d'une réponse immunitaire.
A titre d'exemple, on peut citer, sans aucune limitation, les herpes virus, les virus des hépatites tels que le virus de l'hépatite B (VHB) ou le virus de l'hépatite C
(VHC), les papillomas virus (HPV),les virus de l'immunodéficience humaine (VIE), tels que VlH-1 et VIH-2, différentes souches des virus de grippe humaine et de grippe aviaire.
Les séquences nucléiques des virus appropriées aux fins de l'invention, ainsi que les protéines codées par lesdites séquences sont largement connues de l'homme du métier et sont disponibles par exemple dans des bases de données telles que GenBank.
Ainsi, par exemple, le virus VIH a des gènes qui codent pour des protéines structurelles du virus. Le gène gag code pour la protéine qui forme le core du virion, incluant l'antigène p24. Le gène pol code pour les enzymes responsables de la transcription inverse (transcriptase inverse), du clivage (protéase) et de l'intégration (intégrase). Le gène env code pour les glycoprotéines d'enveloppe. Il contient six autres gènes (tat, rev, nef, vif, vpr et vpu (VIH-1) ou vpx (VIH-2)) qui codent pour des protéines impliquées dans la régulation de l'expression des gènes du virus (protéines de régulation). Le génome du VIH
comprend également les LTR 5' et 3' (Long Terminal Repeat) qui comprennent des éléments de régulation impliqués dans l'expression des gènes du virus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la substance protéique utilisée dans le procédé de l'invention est une protéine du virus VIH. A titre d'exemple d'antigène du virus VIH, on peut citer les protéines de régulation ou la protéine gag ou la glycoprotéine Env, les protéines de régulation préférées étant la protéine Tat, Rev ou Nef S'agissant du VHC, l'extrémité 5' de son génome correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside, les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2, et une petite protéine appelée p7. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans ès différents génotypes. Les protéines d'enveloppe El et E2 sont codées par des régions plus variables d'un isolat à un autre. La protéine p7 est une protéine extrêmement hydrophobe qui constituerait un canal ionique. L'extrémité 3' du génome du VHC contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4, NS5) et pour une région 3' non codante possédant un domaine bien conservé (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, juin 1997, 25(6) : 1527-1538).
La protéine non structurale NS3 du VHC est une protéine de 630 acides aminés qui comprend deux domaines structuraux distincts : un domaine N- terminal, de 81 acides aminés, doté d'une activité protéasique à sérine active intervenant dans la maturation de la protéine virale (domaine appelé NS3 protéase), et un domaine C- terminal, de 549 acides aminés, comprenant une activité hélicase associée à une activité NTPasique qui joue un rôle dans la réplication du génome viral (domaine appelé NS3 hélicase). Cette protéine NS3 est relativement bien conservée parmi les différents génotypes du virus, de sorte que cette protéine constitue un antigène candidat vaccin de choix.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la substance protéique est un antigène associé aux tumeurs.
En effet, certaines tumeurs expriment des antigènes qui sont potentiellement reconnus par les lymphocytes T CD8+ même s'ils ne sont pas à l'origine d'une réponse immune intense. Il s'agit d'antigènes associés aux tumeurs (AAT) ou marqueurs tumoraux (Houghton AN, 1994, J Exp Med 180 :1). En améliorant la présentation des AAT au système immunitaire, il est possible de les rendre plus immunogéniques, ainsi les AAT
peuvent servir de base au développement de vaccins anti- cancéreux sous forme de protéine recombinante ou de peptide de synthèse.
Afin de tester les nouvelles stratégies d'immunothérapie qui visent à
augmenter la reconnaissance des AAT, Wang et al. ont développé un modèle expérimental chez la souris (1995, Journal of Immunology, 154 :4685-4692). La lignée tumorale CT26.WT, fond génétique BALB/c, a été transduite par le gène lacZ d'Escherichia cou codant pour l'enzyme beta-galactosidase afin de créer la lignée CT26.CL25. Les deux lignées sont létales chez la souris et leur cinétique de croissance sont similaires. Administrée chez la souris, la lignée CT26.CL25 est à l'origine de formation de tumeurs qui peuvent être ralenties voire inhibées en présence d'une réponse immune contre la beta-galactosidase qui constitue un AAT modèle.

Les substances protéiques appropriées aux fins de l'invention peuvent être obtenues par les techniques du génie génétique qui comprend les étapes de:
- culture d'un microorganisme ou de cellules eucaryotes transformé(es) à
l'aide d'une séquence nucléotidique codant pour la substance protéique d'intérêt et - récupération de ladite substance protéique produite par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes.
Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Pour plus de détail la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA
Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai ; Armais of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991.
Les substances protéiques d'intérêt, lorsqu'elles sont de petites tailles, peuvent également être préparées par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme du métier.
La substance protéique est associée aux vecteurs colloïdaux selon les techniques connues de l'homme de l'art, telles que l'inclusion ou la liaison à la surface. A titre d'exemple d'inclusion de la substance protéique dans le vecteur synthétique colloïdal, on peut citer l'encapsulation (Tamber H, et al., 2005, Adv Drug Deliv Rev, 57(3) : 357-76.).
A titre de liaison de la substance colloïdale au vecteur synthétique colloïdal, on peut citer l'adsorption, comme décrit dans la demande de brevet W02005/027871, ou le greffage covalent impliquant la formation d'une liaison chimique entre un groupement réactif du vecteur colloïdal et un autre de la substance protéique de façon décrite par exemple dans Protein immobilization-Fundamentals and Applications R.F. Taylor Ed, Marcel Dekker inc, New York, 1991.
Selon un mode de réalisation particulier, les substances protéiques sont ajoutées aux vecteurs synthétiques par liaison et de préférence encore par adsorption, comme par exemple en mélangeant les microparticules avec les substances protéiques et en incubant sous agitation, par exemple à température ambiante ou à 37 C.
La composition selon l'invention comprend également un vecteur viral.

Le vecteur viral comprend au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique.
Par substance protéique du vecteur viral correspondant à une substance protéique du vecteur synthétique, on entend que la substance protéique du vecteur viral constitue un antigène associé à la même maladie que la substance protéique du vecteur synthétique, qu'elle soit du même type ou de type différent, comme indiqué précédemment. Quand les substances protéiques sont de type différent, il faut qu'elles aient au moins un épitope en commun, comme par exemple les protéines Gag et p24.
Ainsi, le génome du vecteur viral est modifié de façon à insérer une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour une ou plusieurs substances protéiques constituant des antigènes de la même maladie ou des maladies différentes. Parmi ces substances protéiques, au moins une correspond à une substance protéique du vecteur synthétique, ces substances protéiques constituant des antigènes associés à la même maladie.
Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur viral comprend une séquence nucléotidique codant pour une protéine du VIEL
Outre la ou les séquences nucléotidiques codant pour au moins une substance protéique constituant un antigène associé à la même maladie que la substance protéique du vecteur synthétique, le vecteur viral comprend également les moyens nécessaires à
l'expression de ladite substance protéique.
On entend par moyen nécessaire à l'expression d'une substance protéique, tout moyen qui permet d'obtenir la substance protéique, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection.
Les moyens nécessaires à l'expression d'une substance protéique sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acide nucléique codant pour ladite substance.
Par liés de façon opérationnelle , on entend une juxtaposition desdits éléments nécessaires à
l'expression et du gène codant pour la substance protéique, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, ils peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène d'intérêt tant que leur relation fonctionnelle est préservée.
Les moyens récessaires à l'expression de la substance protéique peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire inclus dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec la protéine d'intérêt à
exprimer.
Des exemples de promoteurs hétérologues comprennent (i) les promoteurs viraux tels que le promoteur SV40 (Virus simien 40), le promoteur du gène de la thirnidine-kinase du virus simplex de l'Herpès (TK-HSV-1), le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur intermédiaire précoce du cytomégolovirus humain (CMV) et le promoteur majeur tardif adénoviral (MLP), ainsi que (ii) tout promoteur cellulaire qui contrôle la transcription des gènes codant pour des protéines chez des eucaryotes supérieurs, tel que le promoteur du gène de phosphoglycérate-kinase (PGK) constitutif (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), le promoteur des gènes spécifiques du foie alphal-antitrypsine et FD( et le promoteur SM22 spécifique des cellules du muscle lisse (Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425).
Lesdites séquences contenues dans le vecteur viral peuvent être liées directement entre elles sous le contrôle d'un seul promoteur et/ou d'un seul élément régulateur de l'expression, ou bien elles peuvent être séparées en étant sous la dépendance chacune de promoteurs et/ou régulateurs de l'expression indépendants, identiques ou différents.
A titre de vecteur viral qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer par exemple les vecteurs viraux type adénovirus, poxvirus, baculovirus, herpesvirus, togavirus, rétrovirus.
Les adénovirus ont été détectés dans de nombreuses espèces animales. Ils ne s'intègrent pas et sont peu pathogènes. Ils sont capables d'infecter une variété de types cellulaires, les cellules en division et les cellules en repos. Ils possèdent un tropisme naturel pour les épithéliums bronchiques. De plus, ils ont été utilisés en tant que vaccins entériques vivants pendant de nombreuses années avec un excellent profile de sécurité.
Enfin, on peut les faire pousser facilement et les purifiées en grande quantité. Ces caractéristiques ont fait que les adénovirus sont particulièrement appropriés pour une utilisation en tant que vecteurs d'expression et notamment en tant vecteurs de thérapie génique à des fins thérapeutiques et vaccinales.
Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur de l'invention est un adénovirus.
Des exemples d'adénovirus à utiliser dans la présente invention peuvent être dérivés de toute source d'origine humaine ou animale, en particulier d'origine canine (par exemple CAV-1 ou CAV-2 ; référence Genbank CAV1GENOM et CAV77082, respectivement), d'origina avienne (référence Genbank AAVEDSDNA), d'origine bovine (telle que BAV3, Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol., 72: 1394-1402), d'origine ovine, féline, porcine, d'origine simienne, ou bien d'un de leurs hybrides. Tout sérotype peut être utilisé. Toutefois, les adénovirus d'origine humaine sont préférés et en particulier l'adénovirus 5 (Ad5).
De façon générale, les virus cités sont disponibles dans les collections ATCC
et ont fait l'objet de nombreuses publications décrivant leur séquence, leur organisation et leur biologie, ce qui permet à l'homme du métier de les appliquer facilement. Par exemple, la séquence de l'adénovirus type 5 est décrite dans la base de donnée Genbank (M73260 et M29978) et est incorporée ici par référence.
Le génome des adénovirus est constitué d'une molécule d'ADN linéaire double brin d'environ 36 kb portant plus d'environ 30 gènes nécessaires pour terminer le cycle viral. Il y a 4 gènes précoces répartis dans le génome de l'adénovirus (El à E4). Les régions El, E2 et E4 sont essentielles pour la réplication virale. La région E3 est considérée comme une région non essentielle sur la base de l'observation que les virus mutants apparaissant naturellement ou les virus hybrides ayant perdu cette région E3 continuent à se répliquer comme les virus de type sauvage dans les cellules cultivées (Kelly et Lewis, 1973, J. Virol., 12 :643-652). Les gènes tardifs (L1 à L5) codent en majorité pour les protéines structurales constituant la capside virale. Ils chevauchent au moins en partie les premiers motifs de transcription et sont transcrits à partir d'un promoteur unique (MLP pour Major Late Promoter ).
De plus, le génome adénoviral porte aux deux extrémités des régions à action en cis essentielles pour la réplication d'ADN, respectivement les motifs de répétition inversés 5' et 3' (ITRs pour Inverted Terminal Repeats ) et une séquence d'empaquetage.

Les adénovirus actuellement utilisés dans les protocoles de thérapie génique sont dénués de la majorité de la région El, ce qui rend les virus déficients au niveau de leur réplication pour éviter leur dissémination dans l'environnement et dans l'organisme hôte. En outre, h plupart des adénovirus sont également dénués de la région E3 afin d'accroître leur capacité de clonage. La faisabilité du transfert de gène en utilisant ces vecteurs a été
démontrée dans une variété de tissus in vivo (voir par exemple Yei et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5: 731-744; Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1401-1405 ;
U56,099,831 ; et U56,013,638).
Un autre vecteur d'expression particulièrement approprié aux fins de l'invention est un poxvirus, lequel constitue un autre mode de réalisation de l'invention.
Les poxvirus constituent un groupe de virus complexe enveloppés, se distinguant principalement par leur morphologie inhabituelle, leur grand génome d'ADN et leur site cytoplasmique de réplication. Le génome de plusieurs éléments des poxviridae, comprenant la souche virale de la vaccine de Copenhagen (VV) (Goebel et al., 1990, Virol.
179: 247-266 et 517-563) et la souche du virus de la vaccine modifié d'Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol., 244: 635-396), a été cartographié et séquencé. La souche VV
possède un génome d'ADN double brin d'environ 192 kb codant pour environ 200 protéines dont approximativement 100 sont impliquées dans l'assemblage du virus. La souche MVA est une souche du virus de la vaccine hautement atténuée, générée par plus de 500 passages en série de la souche d'Ankara du virus de la vaccine (CVA) sur des fibroblastes d'embryons de poulet (Mayr et al., 1975, Infection, 3 : 6-16). Le virus MVA a été déposé
devant la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1721. La détermination de la séquence complète du génome du MVA et la comparaison avec celui du VV permet l'identification précise des altérations qui sont apparues dans le génome viral et la définition de sept délétions (I à VII) et de nombreuses mutations conduisant à
des cadres de lecture ouverts fragmentés (Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396).
D'autres exemples de poxvirus appropriés aux fins de l'invention comprennent le pox du canari, le pox de volaille, le pox de vache, l'entomopox, le pox de singe, le pox de porc et le pox de pingouin.

Le poxvirus se trouve sous deux formes morphologiquement distinctes, appelées virus mature intracellulaire (IMV) et virus extracellulaire enveloppé (EEV).
De préférence, le poxvirus utilisé aux fins de l'invention est un Modified Vaccinia Virus Ankara.
Les méthodes de suppression et d'insertion de séquences d'ADN dans des vecteurs d'expression sont largement connues de l'homme du métier et consistent notamment en des étapes de digestion enzymatique et ligature. De préférence la séquence nucléotidique insérée dans le vecteur viral code pour une protéine du virus du VIII.
Les compositions à base de vecteurs selon l'invention sont particulièrement efficaces pour l'inhibition, la prévention et le traitement d'une maladie dont la substance protéique de la composition constitue un antigène, telle qu'une infection par un virus. Elles sont donc particulièrement utiles pour la préparation d'un médicament, et en particulier d'un vaccin, qu'il soit thérapeutique ou prophylactique.
Ainsi, l'invention concerne également une méthode de traitement prophylactique ou thérapeutique, en particulier vaccination, comprenant l'administration, à un patient, d'une dose efficace de la composition selon l'invention.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, vaginale, intraoculaire, intra-auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration.
Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques ( patch ), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra- auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, telles que rectale ou vaginale, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.
Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés.

Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 10 mg de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique.
Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient.
La quantité et la nature de l'excipient peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier. Elles sont choisies selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités.
La composition selon l'invention peut être contenus dans un kit pharmaceutique.
L'administration de la composition selon l'invention peut être simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
Par administration simultanée, on entend une administration au même moment et au même endroit de la composition.
Par administration échelonnée, on entend l'administration du vecteur viral ou du vecteur synthétique à des temps différés. Le délai entre chaque administration peut s'étendre de quelques minutes à plusieurs années, de préférence de plusieurs semaines à
plusieurs mois et de façon préférée elle peut être de 3 ou 4 semaines.
Par administration séparée, on entend l'administration du vecteur viral et du vecteur synthétique à des endroits corporels différents. Le vecteur viral et le vecteur synthétique peuvent être dans le même excipient ou de préférence dans des excipients différents appropriés.
De préférence, la composition selon l'invention est administrée de façon échelonnée.
De préférence encore, le vecteur synthétique est administré avant le vecteur viral.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, la composition de l'invention comprend :
i) un constituant prime consistant en le vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant au moins une substance protéique et ii) un constituant boost consistant en le vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique.
Outre une application thérapeutique et prophylactique, l'invention a également une application diagnostique. Ainsi, l'invention concerne également l'utilisation de la composition de l'invention pour le diagnostic in vitro de l'état pathologique dont la ou les substances protéiques du vecteur synthétique et du vecteur synthétique constituent les antigènes, et en particulier d'une infection virale ou un cancer.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à 20 annexées, sur lesquelles :
La figure 1 représente les réponses CTL lors de l'expérience d'immunisation N
1 avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant un vecteur synthétique à base de microparticules de poly(acide D,L-lactique) associées à la protéine p24 (appelé ci-après PLA/p24) et d'un vecteur viral MVA comprenant la séquence gag (appelé ci-après virus MVA gag).
La figure 2 représente les réponses ELISPOT IFN-y spécifiques du peptide Gag AMQ lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 3 représente les réponses ELISPOT IFN-y spécifiques de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 4 représente les réponses ELISPOT IL-4 spécifiques de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 5 représente la sécrétion de la cytokine GM-CSF spécifique de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 6 représente la sécrétion de la cytokine IL-5 spécifique de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 7 représente la sécrétion de la cytokine IL-2 spécifique de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 8 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 9 représente les réponses CTL lors de l'expérience d'immunisation N
2 avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 10 représente les réponses ELISPOT IFN-y spécifiques du peptide Gag AMQ
après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 11 représente la sécrétion spécifique de la protéine p24 des cytokines IL-2, IL-4, IL-10 après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 12 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24 (12A) ou de l'adénovirus (12B) après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 13 compare les réponses ELISPOT IFN- y spécifiques du peptide Gag AMQ après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag.
La figure 14 compare les réponses ELISPOT IL-4 spécifiques de la protéine p24 après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag.
La figure 15 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24 après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag.
La figure 16 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques du virus MVA après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag.
La figure 17 représente les réponses ELISPOT IFN- y spécifiques du peptide beta-gal TPH
après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA-beta- gal et le vecteur viral MVA beta-gal.
La figure 18 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques de la beta- gal après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA-beta- gal et le vecteur viral MVA beta- gal.
La figure 19 représente les réponses ELISPOT IFN-y spécifiques du peptide p24 AMQ
après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique CPL-p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 20 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques du peptide p24 AMQ après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique CPL-p24 et le vecteur viral MVA gag.
Exemple 1 : Immunisation de souris avec une composition vaccinale selon l'invention La composition vaccinale utilisée comprend un vecteur synthétique à base de microparticules de poly(acide D,L- lactique) associées à la protéine p24 (appelé ci- après PLA/p24) et d'un vecteur viral MVA comprenant la séquence gag de SEQ ID N 1 (appelé ci-après virus MVA gag) 1. Modèle animal Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2K') femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés Dans cette série d'expériences on a utilisé les immunogènes suivants seuls ou en combinaison :
- les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant et d'adsorption de la demande de brevet W02005/027871.
- le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIH- 1, codant pour la protéine p24.
Le virus recombinant a été construit à Transgene à partir de la souche sauvage (MVATGN33) telle que décrite dans Antoine G., et al., 1998, The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain : comparison with other orthopoxviruses , Virology, 244: 365-396. Ce virus recombinant a ensuite été produit et purifié
comme suit : le MVA est répliqué sur les cellules embryonnaires de poulet. Après 48 à 72 h d'infection, les cellules sont récoltées, puis lysées par congélation/décongélation et par sonication. Le lysat est purifié/concentré par 2 coussins de saccharose suivi éventuellement de 2 gradients de saccharose.
Pour des précisions, on pourra se rapporter au livre Current Protocols in Molecular Biology , Vol 2, chapitre 16.16 éditeurs Ausubel FM, Brent R, Kigston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, John Wiley & Sons, inc, New York. 3 volumes.
- le virus MVA sauvage MVATGN33. Il s'agit d'un témoin négatif qui sert à
mesurer si le vecteur viral induit une réponse immune non spécifique lors des immunisations.
- l'ADN gag. Le gène gag (de SEQ ID N 1) a été cloné dans le plasmide d'expression eucaryote phCMV (contient le promoteur intermédiaire/précoce du cytomégalovirus humain et des signaux d'épissage et de polyadénylation issus du gène beta- globine du lapin (J K Yee, et al, 1994, Proc Natl Acad Sci U S A., 91(20): 9564-9568). Les préparations d'ADN sans endotoxines et en grande quantité ont été réalisées avec le kit de Gigaprep endotoxine-free de Macherey-Nagel. L'ADN sert de contrôle positif, car il est connu que chez la souris l'administration par voie intramusculaire d'ADN nu permet d'induire une bonne réponse cytotoxique (CTL).
3. Immunisations Expérience 1 35 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à
0 et 3 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée sauf pour l'ADN qui a été administré par voie intramusculaire.
Tableau 1 Dose Dose Nombre de souris lère injection 2'1" injection semaine 0 semaine 3 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 lug 5 PLA/p24 40 lug MVA gag 107 pfu 5 PLA/p24 40 lug PLA/p24 40 lug 5 MVA sauvage 107 pfu MVA sauvage 107 pfu 5 ADN gag 10 lug (IM) PLA/p24 40 lug 5 PLA/p24 40 lug ADN gag 10 lug (IM) 5 Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA
utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée, comme indiqué dans Current Protocols in Molecular Biology, supra.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
Expérience 2 Dans cette expérience, on a augmenté le nombre d'injections.
30 souris ont reçu 2 ou 3 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à 0, 3 et 6 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 2 ci-dessous. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée.

Tableau 2 Dose Dose Dose Nombre lère injection 2'1" ection 3'1" injection de souris Semaine 0 Semaine 3 Semaine 6 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 ug 5 MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 ug PLA/p24 40 ug 5 PLA/p24 40 ug MVA gag 107 pfu 5 MVA sauvage 107 pfu MVA sauvage 107 pfu MVA sauvage 107 pfu 5 Les animaux ont été sacrifiés 3 semaines après la dernière injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
Expérience 3 30 souris ont reçu 2 ou 3 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à
0, 3 et 6 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 3 ci-dessous. Toutes les injections ont été
réalisées par voie sous-cutanée.
Tableau 3 Dose Dose Dose Nombre lère injection 2'1" injection 3'1" injection de souris Semaine 0 Semaine 3 Semaine 6 MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 ug 5 MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 ug PLA/p24 40 ug 5 PLA/p24 40 ug MVA gag 107 pfu 5 PLA/p24 40 ug MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 ug 5 PLA/p24 40 ug PLA/p24 40 ug 5 PLA/p24 40 ug PLA/p24 40 ug PLA/p24 40 ug 5 Les animaux ont été sacrifiés 3 semaines après la dernière injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.

4. Analyses immunologiques On a recherché la réponse humorale et la réponse cellulaire comme suit :
- Réponse humorale : on a effectué un prélèvement de sang sur les souris avant leur sacrifice.
La présence des anticorps anti-p24 a été déterminée par ELISA. La protéine p24 (produite avec Escherichia cou i et purifiée par chromatographie d'affinité métal-chélate selon Cheynet V. et al., 1993, Protein Expr Purif, 4(5) : 367-72) a été utilisée en capture et les anticorps spécifiques présents dans le sérum ont été révélés par un anticorps polyclonal anti- souris à
titre d'anticorps de détection qui est un anticorps de chèvre anti-IgG de souris AffiniPure conjugué à la peroxydase de raifort (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat no 115-035-062).
Le titre est l'inverse de la dilution pour laquelle on obtient une absorbance de 0,1 unité DO
avec le protocole ELISA utilisé.
- Réponse cellulaire: après sacrifice des souris, les rates ont été prélevées de façon stérile pour préparer une suspension cellulaire. Les analyses suivantes ont été
pratiquées sur les suspensions cellulaires obtenues, chaque souris ayant été analysée de manière individuelle ou en pool lorsque la quantité de cellules obtenues n'était pas suffisante pour analyse individuelle.
(i) Test CTL: La suspension cellulaire a été mise en culture en présence d'un peptide de la protéine p24 de 9-mer (AMQMLKETI ¨ SEQ ID N 2) qui correspond à un épitope CTL H-2Kd-restreint immunodominant, et d'IL-2. Cinq jours plus tard, la population effectrice a été restimulée par des cellules naïves irradiées, chargées avec le peptide. La population cytotoxique effectrice a été récoltée au bout du 7ème jour et l'activité CTL a été
mesurée en utilisant comme cibles les cellules P815 (ATCC TM- 64) marquées au 51Cr.
(ii) ELISPOT : L'ELISPOT permet de déterminer le nombre de cellules sécrétant une cytokine donnée en réponse à un stimulus spécifique. Nous nous sommes intéressés aux cytokines IFN-y de type Thl et IL-4 de type Th2. Les suspensions cellulaires obtenues à
partir des rates ont été restimulées in vitro par le peptide AMQMLKETI pendant 20h pour analyser les réponses de type CD8. Les suspensions cellulaires obtenues à
partir des rates ont été restirnulées in vitro par la protéine p24 (sans endotoxines) pendant 42h pour analyser les réponses de type CD4.
Les plaques d'ELISPOT 96 puits avec des membranes de PVDF (Multiscreen IP, Millipore) ont été coatées par un anticorps anti-IFN- ? ou anti-IL-4. Pendant la restirnulation, les suspensions de splénocytes ont été incubées dans ces plaques de manière à
capturer les cytokines sécrétées par chaque cellule. Les spots correspondant à chaque cellule sécrétant la cytokine d'intérêt ont été révélés par un anticorps de détection biotinylé
spécifique de la cytokine d'intérêt.
(iii) Sécrétion des cytokines : Les splénocytes ont été stimulées pendant 3 jours dans du milieu de culture complet (milieu de culture alpha minimal essential medium MEM) contenant 10% sérum de veau foetal, 10 mM HEPES, 5 x le M B-mercaptoéthanol, 4 mM
L-glutamine, 80 15/m1 pénicilline, 80 mg/mi streptomycine, acides amines non-essentiels lx (cat no. 11140-035), sodium pyruvate lx (cat no. 11360-039) (constituants de Invitrogen, Cergy Pontoise, France)) en présence ou non de l'antigène d'intérêt p24, puis les cytokines sécrétées dans le surnageant de culture ont été dosées par le kit mouse FlowCytomix Thl/Th2 lOplex de Bender Medsystems (Cat no. BMS720141-i).
5. Résultats 5.1. La réponse CTL
Le tableau 4 ci-après récapitule les résultats obtenus lors des 3 expériences successives:

Tableau 4 Code composition vaccinale Souris Fréquence des souris avec analysées en réponse CIL
pool nb de souris positif/nb de souris (Exp 1, n=5) analysées en individuel A MVA gag + MVA gag Pool négatif 0/5 A' MVA gag + MVA gag + MVA gag 1/5 B MVA gag + PLA/p24 Pool négatif 1/10 B' MVA gag + PLA/p24 + PLA/p24 3/10 C PLA/p24 + MVA gag Pool positif 2/10 C' PLA/p24 + MVA gag + PLA/p24 1/5 F ADN gag + PLA/p24 Pool positif Non effectué
G PLA/p24 + ADN gag Pool positif Non effectué
D PLA/p24 + PLA/p24 Pool négatif 0/5 D' PLA/p24 + PLA/p24 + PLA/p24 0/5 E MVA + MVA sauvage Pool négatif Non effectué
E' MVA + MVA + MVA sauvage 0/5 La Figure 1 représente les réponses CTL obtenues lors de l'expérience d'immunisation n 1. Chaque groupe est constitué de 5 souris, les rates ont été
poolées avant la réalisation du dosage CTL. La stimulation non spécifique (sans peptide) dans tous les groupes étant de 0, elle n'est pas représentée. De même, les réponses CTL
obtenues avec les compositions A, D et E étant de 0, elles ne sont pas représentées. L'abscisse correspond au ratio cellules effectrices (CTL) sur cellules cibles (à lyser). L'axe des ordonnées correspond au pourcentage de lyse moyenne.
Les réponses CTL induites sont de faible intensité avec tous les immunogènes utilisés (MVA, PLA ou combinaisons), à l'exception du groupe G de l'expérience 1 qui a reçu de l'ADN en dernier (Figure 1). L'induction de CTL dans les groupes ADN est normal : l'ADN
est optimisé dans ce but, c'est un témoin positif chez la souris mais qui ne marche pas aussi bien chez les primates.
Même si les réponses restent faibles, les groupes contenant à la fois du MVA
et du PLA donnent de meilleures réponses CTL que les groupes ayant reçu du MVA seul ou du PLA seul.
Lorsque 2 injections ont été réalisées, dans les groupes ayant reçu 2 fois du MVA ou 2 fois des PLA, il n'y a pas de CTL détecté lors du sacrifice retenu (A et D), alors que dans les groupes ayant reçu à la fois PLA et MVA (B et C) il y a une faible fréquence de CTL.
L'ordre d'injection joue aussi un rôle : PLA + MVA (C) donne de meilleurs résultats que MVA + PLA (B).
Lorsque 3 injections ont été réalisées, la fréquence d'induction des réponses reste encore faible. Les réponses CTL ne sont pas améliorées par rapport à deux injections. La stratégie vaccinale utilisant le MVA nécessite 3 injections pour donner les mêmes résultats que les combinaisons de PLA et de MVA.
5.2. La réponse ELISPOT IFN-y contre le peptide Gag AMQ
La figure 2 représente les réponses ELISPOT IFN-y spécifiques du peptide Gag AMQ. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été
inclus dans l'analyse. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide Gag AMQ sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été
déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes).
L'interféron gamma ou de type 11 est aussi appelé interféron immunitaire car il est sécrété par les lymphocytes T de type CD4+, par les lymphocytes T de type CD8+
et les cellules NK. Il protège les cellules contre les infections virales. Il stimule l'activité phagocytaire des macrophages, leur permettant de tuer les cellules tumorales. Il stimule la maturation des lymphocytes T et B et augmente la production d'anticorps. Il augmente l'expression des molécules HLA de classe I et II par les macrophages. Il s'agit d'une cytokine de type Thl.

Il est possible de classer les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- y obtenues. Les meilleures réponses sont induites par les compositions PLA + MVA (C) et MVA + MVA (A). Dans ces cas, la troisième injection n'apporte soit aucune amélioration (composition MVA + MVA) (A'), soit peut faire diminuer la réponse observée (composition PLA + MVA) (C'). Les compositions MVA + PLA
(B et B') et ADN + PLA (F) permettent de générer des réponses d'intensité
intermédiaires, alors que la stratégie utilisant uniquement des PLA (D et D') n'induit que des réponses faibles.
Ainsi, nous avons pu montrer que la composition vaccinale PLA + MVA (C) était au moins aussi bonne, sinon meilleure que la combinaison MVA + MVA (A) pour induire une sécrétion d'IFN- y spécifique du peptide AMQ.
5.3. La réponse ELISPOT IFN-y contre la protéine p24 La Figure 3 représente les réponses ELISPOT IFN- y spécifiques de la protéine p24.
Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse.
Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN- y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 42h par la protéine p24 sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été
déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes).
Encore une fois, il est possible de classer les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- y obtenues. Les meilleures réponses sont induites par les compositions PLA + MVA (C et C') et ADN + PLA (F). La troisième injection fait encore diminuer la réponse observée dans le cas de la composition PLA + MVA
(C'). Les compositions MVA + PLA (B et B') et MVA+ MVA (A et A') permettent de générer des réponses d'intensité intermédiaires, alors que la stratégie utilisant uniquement des PLA (D et D') n'induit que des réponses faibles.
Ainsi, nous avons pu montrer que la composition vaccinale PLA + MVA était le meilleur choix pour induire une sécrétion d'IFN- y spécifique de la protéine p24.
5.4. La réponse ELISPOT IL-4 contre la protéine p24 La figure 4 représente les réponses ELISPOT IL-4 spécifiques de la protéine p24.
Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse.
Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IL-4 de manière spécifique en réponse à une stimulation de 42h par la protéine p24 sur un million de centiles stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à
partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes).
Encore une fois, il est possible de dasser les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IL-4 obtenues. La meilleure réponse est induite par la composition PLA + MVA (C et C'). La troisième injection semble encore une fois non nécessaire car elle n'améliore que de très peu la réponse induite par la composition PLA + MVA (C'). Les compositions MVA + PLA (B et B') et ADN + PLA (F) et PLA +

PLA (D et D') permettent de générer des réponses d'intensité intermédiaires, alors que la stratégie utilisant uniquement des MVA n'induit que des réponses faibles (A et A').
Ainsi, nous avons pu montrer que la composition vaccinale PLA + MVA était le meilleur choix pour induire une sécrétion d'IL-4 spécifique de la protéine p24.
5.5. Sécrétion des cytokines L'étude de la sécrétion des cytokines permet de tracer un tableau de l'état d'activation immunitaire de l'animal ayant reçu la composition vaccinale. On peut répartir les cytokines en quatre groupes en fonction de leurs propriétés :
1) Les médiateurs de l'immunité naturelle (IFN-y, IL-1, IL-6, IL-8 ...) 2) Les activateurs de l'activation, croissance et différenciation lymphocytaire (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TGF-B) 3) Les activateurs non spécifiques de l'inflammation (IFN-y, IL-5, IL-8) 4) Les activateurs et différenciateurs de leucocytes immatures (IL-3, GM-CSF) Grâce à l'utilisation d'un kit multiplex, nous avons pu doser la sécrétion de 10 cytokines différentes dans les surnageants de culture des splénocytes obtenues des animaux sacrifiés.
Ces cytokines sont : IFN-y, TNF- oc, GM-CSF, IL-4, IL-17, IL- la, IL-2, IL-5 , IL-6, IL-10.
Aucune des compositions vaccinales testées n'induit une sécrétion significative des cytokines IL-1cc et IL-17.
Pour tous les autres cytokines testés nous avons pu mettre en évidence des différences parmi les groupes.
La figure 5 représente la sécrétion de la cytokine GM-CSF spécifique de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été
inclus dans l'analyse, lorsque la quantité de cellules disponibles le permettait. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses.
Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration de GM-CSF (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
La cytokine GM-CSF (granulocyte- macrohage colony stirnulating factor) est un puissant immunostirnulateur qui permet d'activer les fonctions immunitaires telles que l'adhésion, la phagocytose, etc. des macrophages, des neutrophiles et des éosinophiles.
Comme nous le pouvons voir sur la figure 5, nous avons montré une importante sécrétion de GM-CSF dans les groupes contenant du PLA en association ou non avec le MVA
(sauf lorsque le nombre d'injection est augmenté à 3 pour les PLA) alors que les groupes immunisés exclusivement avec du MVA n'en sécrètent pas ou peu.
La figure 6 représente la sécrétion de la cytokine IL-5 spécifique de la protéine p24.
Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse, lorsque la quantité de cellules disponibles le permettait. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses.
Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration d'IL-5 (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
Pour tous les cytokines de type Th2 testées comme IL-4, IL-5, IL-6 et IL-10, les profils de sécrétion sont très similaires à celui présenté en figure 6 qui correspond à la sécrétion de l'IL-5. Aucune sécrétion n'est observée dans les groupes ayant reçu du MVA
sauvage (c'est normal, c'est un témoin négatif). De faibles concentrations sont obtenues pour les groupes MVA gag, 2 ou 3 injections, et les groupes associant l'ADN et le PLA. Des concentrations moyennes sont obtenues pour les groupes de souris immunisées par les compositions PLA et MVA. Les concentrations les plus fortes sont obtenues dans les groupes ayant reçu uniquement du PLA. La sécrétion de cytokines est donc orientée plus ou moins vers les cytokines de type Th2 en fonction de la composition vaccinale :
- on observe une réponse majoritairement de type Th2 pour les groupes immunisés uniquement avec les PLA (la sécrétion d'IFN-gamma de d'IL-2, cytokines de type Thl est faible (figure 7), - on observe une réponse non polarisée, à la fois Thl et Th2 pour les groupes immunisés avec les combinaisons PLA et MVA.
- pour les groupes MVA, la sécrétion des cytokines de type Th2 est faible.
Notons aussi que les 4 cytokines Th2 dosées ne sont pas sécrétées à la même concentration. C'est l'IL-4 et l'IL-10 qui sont sécrétées à des taux élevés.
Le tableau suivant récapitule les concentrations moyennes des différentes cytokines observées dans les groupes ayant reçu les compositions PLA et MVA.
Tableau 5 Cytokine IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 Conc moyenne 2600 1460 260 2660 (Pg/m1) L'interleukine 4, IL-4, est sécrétée par les lymphocytes T de type CD4+. Elle augmente la croissance et la différenciation des lymphocytes B préalablement activés, favorise la production d'IgE qui joue un rôle important dans les réactions d'hypersensibilité immédiate.
Elle active aussi les macrophages.
L'interleukine 5, IL-5, stimule la croissance, la différenciation et l'activité des éosinophiles qui jouent un rôle important dans la lutte contre les infections parasitaires.
L'augmentation du nombre des éosinophiles n'est pas seulement un signe d'atteinte parasitaire mais aussi un moyen de défense. L'IL-5 induit la prolifération des lymphocytes B et leur sécrétion d'immunoglobulines. Elle active les lymphocytes T cytotoxiques. Son utilisation dans le traitement de certaines maladies parasitaires peut être envisagée.
L'interleukine 6, IL-6, stimule la croissance et la différenciation des lymphocytes B et augmente la génération des plaquettes. Elle provoque, par activation des hépatocytes, la sécrétion des protéines de l'inflammation comme le fibrinogène et la protéine C réactive. Elle a un rôle pro-inflammatoire. Elle a un effet cytotoxique vis-à-vis de certaines tumeurs.
La figure 7 représente la sécrétion de la cytokine IL-2 spécifique de la protéine p24.
Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse, lorsque la quantité de cellules disponibles le permettait. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses.
Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration d'IL-2 (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
L'IL-2 est un facteur de croissance pour les lymphocytes T. Elle active leur transformation en lymphocytes T cytotoxiques de type CD8+ qui sécrètent l'interféron oc, lequel stimule les macrophages à libérer le TNFoc et le TGFoc (transforming growth factor oc).
L'IL-2 stimule la croissance et l'activité cytolytique des cellules NK
(natural "(iller). Elle stimule la maturation des lymphocytes B et la synthèse d'anticorps. C'est une cytokine de type Thl.
Il est possible de classer les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction de la sécrétion d'IL-2, spécifique de la protéine p24. La meilleure réponse est induite par la combinaison MVA + PLA (B), puis PLA + MVA (C), PLA seul (D) et MVA seul (A).
5.6. La réponse humorale spécifique de la protéine p24 La figure 8 représente une cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été
inclus dans l'analyse. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-p24 mesuré par ELISA de capture p24 ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté
sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6, S9 =
semaine 9.
En ce qui concerne les réponses humorales anti-p24, pour la première fois dans cette série d'expérience, augmenter le nombre d'injections permet d'améliorer de façon significative la réponse immune mesurée. En effet, quel que soit le groupe étudié, passer de 2 à 3 injections d'immunogène augmente environ d'un log la réponse anti-p24 (sauf pour le groupe PLA seul où l'augmentation est moindre mais tout de même significative).
Pour les groupes ayant reçu 3 injections, toutes les combinaisons contenant du MVA
et du PLA ou le PLA seul induisent un titre élevé (10E6), supérieur d'un log au titre induit par du MVA seul.
De façon similaire, pour les groupes ayant reçu 2 injections, toutes les compositions contenant du MVA et du PLA ou le PLA seul induisent un titre élevé, supérieur d'un log au titre induit par du MVA seul.
Changer une injection de PLA en MVA dans un schéma de vaccination ne nuit pas aux titres en anticorps obtenus mais permet d'élargir les réponses cellulaires par rapport à
celles qui sont générées uniquement par un vecteur PLA.
Conclusion :
En fonction du type de réponse analysée, la meilleure composition n'est pas toujours la même, certaines compositions obtenant spécifiquement de très bonnes réponses.
Cependant, pour obtenir une réponse immune large et intense, la meilleure composition est la composition PLA + MVA.
Exemple 2: Immunisation de souris avec la composition vaccinale microparticules PLA/p24 et l'Adénovirus Gag 1. Modèle animal Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2K') femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants :
- les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant de la demande de brevet W02005/02787.
- L'Adénovirus type 5 Gag qui est recombinant pour le gène gag du virus VIII- 1, codant pour la protéine p24. (Généthon) - L'Adénovirus type 5 eGFP qui est recombinant pour le gène codant pour la enhanced Green Fluorescent Protein (Généthon). Il s'agit d'un témoin négatif qui sert à mesurer si le vecteur viral induit une réponse immune non spécifique lors des immunisations.
- l'ADN gag. Le gène gag (SEQ ID N 1) a été cloné dans le plasmide d'expression eucaryote phCMV (plasmide non commercial). Les préparations d'ADN sans endotoxines et en grande quantité ont été
réalisées avec le kit de Gigaprep endotoxine-free de Macherey-Nagel.
L'ADN sert de contrôle positif, car il est connu que chez la souris l'administration par voie intramusculaire d'ADN nu permet d'induire une bonne réponse cytotoxique (CTL).
3. Immunisations 30 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à
0 et 3 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 6 ci-après. Toutes les injections ont été réalisées par voie intramusculaire pour l'adénovirus et l'ADN et par voie sous-cutanée pour les PLA.

Tableau 6 Dose Dose Nombre de souris Composition 1 ' injection 2 1" injection semaine 0 semaine 3 Ad5 gag 108 ip Ad5 gag 108 ip 5 H
Ad5 gag 108 ip PLA/p24 40 ug 5 I
PLA/p24 40 ug Ad5 gag 108 ip 5 J
Ad5 gag 107 ip Ad5 gag 107 ip 5 H' Ad5 gag 107 ip PLA/p24 40 ug 5 I' PLA/p24 40 ug Ad5 gag 107 ip 5 .1' Les animaux ont été sacrifiés 3 semaines après la dernière injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1. De plus, nous avons mesuré les réponses humorales dirigées contre 1'adénovirus5 en utilisant une technique ELISA. Le protocole est identique à celui utilisé pour l'ELISA anti-p24, sauf qu'un lysat d' adénovirus est utilisé en capture.
5. Résultats 5.2. Réponses CTL
La figure 9 représente les réponses CTL obtenues lors de l'expérience d'immunisation n 2. Chaque groupe est constitué de 5 souris, analysée individuellement. La stimulation non spécifique (sans peptide) dans tous les groupes étant de 0, elle n'est pas représentée. L'abscisse correspond au ratio cellules effectrices (CTL) sur cellules cibles (à
lyser). L'axe des ordonnées correspond au pourcentage de lyse moyenne ; il s'agit de la moyenne arithmétique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Dans tous les groupes 5 souris sur 5 ont développé une réponse CTL, sauf une souris du groupe Ad5gag 107 + PLA.
On observe la même chose pour les 2 doses de virus testées : les combinaisons Ad +

Ad (H et H') et PLA + Ad (J et J') induisent de meilleures réponses CTL que la combinaison Ad + PLA (I et I' ).
5.3. La réponse ELISPOT IFN-y contre le peptide Gag AMQ
La Figure 10 représente les réponses ELISPOT IFN- y spécifiques du peptide Gag AMQ. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN- y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide Gag AMQ
sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris (numérotée de 1 à 5 pour chaque souris, ainsi H1 correspond à la souris 1 ayant reçu la composition H Ad5 gag 108 ip et Ad5 gag 108 ip, etc. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à une moyenne de triplicats.
On peut noter d'après la figure 10 que:
- à 108 : la réponse PLA + Ad > Ad + Ad> Ad + PLA
- à 107 : la réponse Ad + Ad> ou = PLA + Ad > Ad + PLA. La différence entre les compositions Ad + Ad et PLA + Ad est peu flagrante. Globalement la réponse ELISPOT
IFN- gamma est en concordance avec le test CTL : Les compositions PLA + Ad et Ad + Ad sont plus efficaces que Ad + PLA.
5.4. Sécrétion de cytokines Comme dans l'exemple 1, nous avons testé la sécrétion de 10 cytokines dans le surnageant. Parmi celles-ci, l'IL-5, l'IL-6, l'IL-17 et l'IFN- y n'étaient pas sécrétées ou sécrétées à des concentrations infinitésimales. Quant au GM-CSF, TNF- oc et IL-lût, leur sécrétion n'était pas spécifique de la protéine p24 par la technique de dosage utilisée. Il est très probable que c'est l'immunisation par l'adénovirus qui provoque la sécrétion de ces cytokines. Si une sécrétion spécifique de la protéine p24 existe, elle est noyée dans celle provoquée par l'adénovirus.
Pour 3 autres cytokines, à savoir IL-2 (Th1), ainsi que l'1L-4 et l'IL-10 (Th2), nous avons pu mesurer la sécrétion spécifique de la protéine p24. Les résultats sont présentés dans la figure 11.
La figure 11 représente la sécrétion des cytokines IL-2, IL-4 et IL-10 spécifique de la protéine p24. Chaque composition vaccinale a été administrée à 5 souris.
Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration de chaque cytokine (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
Les résultats sur la figure 11 montrent que:
- la composition Ad5 gag + Ad5 gag (H et H' )ne donne aucune sécrétion d'IL-2, IL-4 ou IL-10.
- seule la composition PLA + Ad5 gag (J et J') donne une sécrétion de IL-2 et IL-4.
- les compositions PLA + Ad5 gag (J et J') et Ad5 gag + PLA (I et I') permettent une sécrétion de IL-10.
La composition Ad + Ad (H et H') induit une réponse cytokine plutôt polarisée Thl (mesurée par ELISPOT IFN- gamma) La composition PLA + Ad 5 (J et J') induit une réponse cytokine non polarisée, puisque à la fois des cytokines Thl comme IFN- gamma (par ELISPOT) et l'IL-2, et des cytokines Th2 comme l'IL-4 et L'IL-10 sont détectées.
5.5. Réponses humorales La figure 12 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales. La figure 12(A) représente la réponse anticorps dirigée contre la protéine p24 et la figure 12(B) représente la réponse anticorps dirigée contre l'adénovirus. Chaque composition vaccinale a été administrée à 5 souris. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG
mesuré par ELISA ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été
déterminé
individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
S3 = semaine 3, S6 = semaine 6.
La réponse anti- adénovirus (ou réponse anti- vecteur) est d'environ 1 log de moins dans les groupes ayant reçu les compositions Ad+PLA (I et I') et PLA+Ad (J et J') que pour Ad+Ad (H et H').
Les compositions selon l'invention permettent donc de diminuer l'immunité anti-adénovirus.

Exemple 3: Comparaison des compositions vaccinales PLA/p24 + MVAgag et Alum/p24 + MVAgag chez la souris 1. Modèle animal Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants :
- les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant et d'adsorption de la demande de brevet WO 2005/02787.
- alum/p24 : l'Am (Imject Alum, Pierce, No de catalogue 77161) est mélangé
volume pour volume (1:1) avec la protéine p24 diluée dans du PBS. On administre une dose de 40 ltg de p24 par injection et par animal.
- le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIE- 1, codant pour la protéine p24.
Le virus recombinant a été construit à Transgene, comme indiqué dans l'exemple 1.
- l'ADN gag. Le gène gag de séquence SEQ ID N 1 a été cloné dans le plasmide d'expression eucaryote phCMV. Les préparations d'ADN sans endotoxines et en grande quantité ont été réalisées avec le kit de Gigaprep endotoxine-free de Macherey-Nagel.
L'ADN sert de contrôle positif, car il est connu que chez la souris l'administration par voie intramusculaire d'ADN nu permet d'induire une bonne réponse cytotoxique (CTL).
3. Immunisations 30 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à
0 et 3 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 7 ci-après. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée sauf pour l'ADN qui a été administré par voie intramusculaire.

Tableau 7 Dose Dose Nombre de Composition 1 ère injection 2'1" injection souris semaine 0 semaine 3 MVA gag 107 pfu PLA/p24 40 lug 5 B
PLA/p24 40 ltg MVA gag 107 pfu 5 C
MVA gag 107 pfu Alum/p24 40 lug 5 K
Alum/p24 40 lug MVA gag 107 pfu 5 L
PLA/p24 40 lug ADN gag 5 lug (IM) 5 G
Alum/p24 40 lug ADN gag 5 lug (1M) 5 M
Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA
utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1. De plus, nous avons mesuré les réponses humorales dirigées contre le MVA en utilisant une technique ELISA. Le protocole est identique à celui utilisé pour l'ELISA anti-p24, sauf qu'un lysat de MVA est utilisé en capture.
5. Résultats 5.1. La réponse ELISPOT IFN-y contre le peptide Gag AMQ
La figure 13 représentent les réponses ELISPOT IFN- y spécifiques du peptide Gag AMQ. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN- y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide Gag AMQ
sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à
partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Les réponses ELISPOT IFN- y obtenues lors de cette expérience sont plus faibles que d'habitude. Cette baisse est observée à la fois pour les groupes testés et les groupes contrôles, et est liée au déroulement de l'expérience. De ce fait, comme nous cherchons à
comparer les différentes combinaisons entre elle, cette expérience reste interprétable et montre clairement que la composition PLA/p24 + MVA gag (C) induit une meilleure sécrétion d'IFN-y mesurée par ELISPOT que les autres groupes testées, à savoir MVA gag + PLA/p24 (B), MVA gag + Alum/p24 (K), Alum/p24 + MVA gag (L).
5.2. La réponse ELISPOT IL-4 contre la protéine p24 La figure 14 représente les réponses ELISPOT IL-4 spécifiques de la protéine p24.
L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 42h par la protéine p24 sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Pour l'induction d'une réponse ELISPOT de type IL-4, le meilleur immunogène est constitué par l'association MVAgag et PLA/p24 (B et C). Quelque soit l'ordre d'administration de cette composition, les réponses IL-4 obtenues sont supérieures à celles induites par les compositions MVA gag + Alum/p24 (quel que soit l'ordre) (K et L), PLA/p24 + ADNgag (G) et Alum/p24 + ADNgag (M). Si l'on s'intéresse maintenant à
l'ordre d'administration des produits, c'est toujours la composition PLA/p24 +
MVAgag (C) qui donne de meilleurs résultats que la combinaison inverse, MVAgag + PLA/p24 (B).
5.3. La réponse humorale spécifique de la protéine p24 La figure 15 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-p24 mesuré par ELISA de capture p24; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été
déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S2= semaine 2, S4= semaine 4, S6= semaine 6.
Pour l'induction dune réponse anticorps spécifique de la protéine p24, le meilleur immunogène est constitué encore une fois par l'association MVAgag et PLA/p24 (B et C).
Quelque soit l'ordre d'administration de cette composition, les titres d'IgG
anti-P4 obtenus sont de 0,6 à 1,2 log plus élevées à semaine 6 que celles induites par les combinaisons MVA
gag + Alum/p24 (quel que soit l'ordre) (K et L), PLA/p24 + ADNgag (G) et Alum/p24 +
ADNgag (M). Si l'on s'intéresse maintenant à l'ordre d'administration des produits, c'est toujours la combinaison PLA/p24 + MVAgag (C) qui donne de meilleurs résultats que la combinaison inverse, MVAgag + PLA/p24 (B), mais seulement de 0,4 log.
5.4. La réponse humorale spécifique du virus MVA
La figure 16 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques du virus MVA. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-MVA mesuré
par ELISA
de capture MVA. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris.
Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S4= semaine 4, S6= semaine 6.
Dans les groupes PLA/p24 + MVAgag (C) et Alum/p24 + MVAgag (L), le MVA a été administré à semaine 3. Comme nous pouvons le voir sur la figure 16, la réponse anti-MVA n'a pas eu le temps de se mettre en place au moment de l'analyse, à
semaine 6. Par contre dans les groupes ayant reçu l'injection de MVA en premier, il est possible de mesurer la réponse anti- vecteur. De façon étonnante, dès 4 semaines, la réponse anti-MVA est bien plus faible dans le groupe MVAgag + PLA/p24 (B) que dans le groupe MVAgag +
Alum/p24 (K). De plus avec la combinaison MVAgag + PLA/p24, le titre anti-MVA
n'augmente pas dans le temps, ce qui n'est pas le cas avec la combinaison MVAgag +
Alum/p24.
En association avec le MVA, les PLA permettent de limiter la réponse anticorps anti-MVA alors que ce n'est pas le cas de l'association MVA + Alum. Il s'agit d'une propriété
très intéressante et très utile pour des applications d'immunisation et de vaccination.
Conclusion :
Les compositions selon l'invention PLA/p24 et MVAgag permettent d'induire de meilleures réponses cellulaires et humorales que les compositions Alum/p24 et MVAgag. De plus, elles permettent de limiter la réponse anti-vecteur.

Exemple 4: Administration des compositions vaccinales PLA/p24 et MVAgag par voie intranasale 1. Modèle animal Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants :
- les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant et d'adsorption de la demande de brevet W02005/027871.
- le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIE- 1, codant pour la protéine p24.
Le virus recombinant a été construit à Transgene, comme indiqué précédemment.
3. Immunisations souris ont reçu 3 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à 0, et 20 jours. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 8 ci-après. Toutes les injections ont été réalisées par voie intranasale.
Tableau 8 Dose Dose Dose Nombre de 1 ère injection 2'1" injection 3'1" injection souris jour 0 jour 10 jour 20 PLA/p24 20 lug PLA/p24 20 lug MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu PLA/p24 20 lug 5 Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA
utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 32 jours après la première injection. Le sang, les sécrétions vaginales, les fèces, la rate et l'appareil génital (vagin) ont été
prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1.
5. Résultats Récapitulation des données expérimentales Tableau 9 Combinaisons vaccinales PLA/p24, MVAgag, PLA/p24, MVAgag, MVAgag PLA/p24 Nombre de souris ayant développé une réponse CIL 2/5 2/5 % moyen de lyse des souris CTL+ 50% 45%
L'ELISPOT mesure le nombre de cellules sécrétant la cytokine par 10E6 cellules analysées ELISPOT IFN-y, AMQ, sang 155 79 ELISPOT IFN-y, p24, sang 146 94 ELISPOT IL-4, AMQ, sang 50 10 ELISPOT IL-4, p24, sang 126 32 ELISPOT IFN-y, AMQ, vaginal 1550 754 ELISPOT IL-4, AMQ, vaginal 0 0 ELISPOT IL-4, p24, vaginal 0 0 Titre en IgG anti-p24 du sérum (déterminé par 68 000 200 000 ELISA) Titre en IgA anti-p24 des sécrétions vaginales 18 8 (déterminé par ELISA) Titre en IgG anti-p24 des sécrétions vaginales 124 616 (déterminé par ELISA) IgA anti-p24 dans les fèces (Absorbance à 450 J20 0,20 J20 0,18 nm, déterminée par ELISA) J32 0,02 J32 0,03 IgG anti-p24 dans les fèces (Absorbance à 450 J20 0,17 J20 0,17 nm, déterminée par ELISA) J32 0,69 J32 0,60 L'administration des combinaisons PLA/p24 et MVAgag par voie intranasale permet d'induire à la fois une réponse immune systémique mesurée dans les prélèvements de sang et de rate, et une réponse immune périphérique au niveau des muqueuses, en particulier au niveau du tractus uro-génital. A chaque fois, les deux bras du système immunitaire sont activés : on a pu mettre en évidence au niveau de ces deux sites des réponses immunes cellulaires et humorales dirigées contre la protéine p24. La capacité à
induire une large réponse périphérique au niveau du tractus uro-génital constitue un atout considérable pour les combinaisons PLA/p24 et MVAgag dans les applications vaccinales à but prophylactique ou thérapeutique.
Exemple 5: Immunisation de souris avec la combinaison vaccinale microparticules PLA/beta-gal et virus MVA beta-gal 1. Modèle animal Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants :
- les microparticules PLA/beta- gal préparées selon le protocole déplacement de solvant décrit dans la demande de brevet W02005/027871.
- le virus MVA beta-gal (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène lacZ de E. cou, codant pour l'enzyme beta-galactosidase (beta-gal). Le virus recombinant a été construit à Transgene, et produit et purifié comme décrit précédemment.
3. Immunisations 35 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à
0 et 3 semaines. Les combinaisons vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 10 suivant. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée.

Tableau 10 Code Dose Dose Nombre de souris 1 ' injection 2 1" injection semaine 0 semaine 3 PLA/beta- gal 40 PLA/beta-gal 40 5 = MVA beta- gal 10 pfu MVA beta- gal 10' pfu 5 O PLA/beta- gal 40 g MVA beta- gal 107 pfu 5 MVA beta- gal 107 pfu PLA/beta-gal 40 g 5 PLA/beta- gal 40 ug + 5 MVA beta- gal 107 pfu PLA/beta- gal 40 ug + 5 MVA beta- gal 107 pfu PLA/beta- gal 40 !Lig + PLA/beta-gal 40 ug + 5 MVA beta- gal 107 pfu MVA beta- gal 107 pfu Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA
utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques On a recherché la réponse humorale et la réponse cellulaire comme suit :
- Réponse cellulaire: après sacrifice des souris, les rates ont été
prélevées de façon stérile pour préparer une suspension cellulaire. L'ET ISPOT permet de déterminer le nombre de cellules sécrétant une cytokine donnée en réponse à un stimulus spécifique.
Nous nous sommes intéressés à la cytokine IFN-y de type Thl. Les suspensions cellulaires obtenues à
partir des rates ont été restimulées in vitro par le peptide TPH (TPHPARIGL¨
SEQ ID
N 3) pendant 20h pour analyser les réponses de type CD8. Les plaques d'ELISPOT

puits avec des membranes de PVDF (Multiscreen IP, Millipore) ont été coatées par un anticorps anti-IFN-y. Pendant la restirnulation, les suspensions de splénocytes ont été
incubées dans ces plaques de manière à capturer les cytokines sécrétées par chaque cellule.
Les spots correspondant à chaque cellule sécrétant la cytokine d'intérêt ont été révélés par un anticorps de détection biotinylé spécifique de la cytokine d'intérêt.
- Réponse humorale : on a effectué un prélèvement de sang sur les souris avant leur sacrifice. La présence des anticorps anti-beta- gal a été déterminée par ELISA. La protéine beta- gal a été utilisée en capture et les anticorps spécifiques présents dans le sérum ont été

révélés par un anticorps polyclonal anti- souris à titre d'anticorps de détection qui est un anticorps de chèvre anti-IgG de souris AffiniPure conjugué à la peroxydase de raifort (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat no 115-035-062). Le titre est l'inverse de la dilution pour laquelle on obtient une absorbance de 0,1 unité DO avec le protocole ELISA
utilisé.
5. Résultats 5.1. La réponse ELISPOT IFN-y contre le peptide beta-gal TPH
Les résultats sont présentés sur la figure 17 qui donne les réponses ELISPOT
IFN-y spécifiques du peptide beta-gal TPH. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide beta-gal TPH sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été
déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Ces résultats mettent en évidence qu'il est possible de classer les combinaisons vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN-y obtenues. Les meilleures réponses sont induites par les combinaisons PLA + MVA, en injection séparée (0) ou en deux injections simultanées (S). Des réponses intermédiaires sont obtenues avec une seule injection de PLA + MVA en même temps (groupes Q et R). Les réponses les plus faibles sont observées avec les groupes ne contenant qu'un seul immunogène PLA

uniquement (M) ou MVA uniquement (N).
Ainsi, dans le modèle beta-galactosidase aussi, nous avons pu montrer que la combinaison vaccinale PLA + MVA était meilleure que la combinaison MVA + MVA
pour induire une sécrétion d'IFN-y spécifique du peptide TPH. De plus l'ordre d'injection semble aussi avoir une importance car parmi toutes les combinaisons PLA + MVA
testées, c'est le groupe 0, PLA puis MVA qui a permis d'obtenir le meilleur résultat. Il est à
noter que c'est aussi la même combinaison qui s'était révélée la plus efficace dans è modèle p24 (exemple 1).
5.2. La réponse humorale spécifique de la protéine beta-gal Les résultats sont présentés sur la figure 18 qui compare la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine beta-gal. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-beta- gal mesuré par ELISA de capture beta-gal ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6.
Ces résultats montrent que les meilleures réponses humorales sont obtenues pour le groupe PLA + PLA (M). Les titres induits chez les souris ayant reçues du PLA
et du MVA à
chaque injection (S) sont comparables. Dans les groupes 0, P, Q et R, les titres sont plus bas d'environ un log. Parmi, toutes les combinaisons testées, le plus mauvais inducteur d'anticorps anti-beta-gal, c'est MVA + MVA. Dans le modèle beta-galactosidase, comme dans le modèle p24, toutes les combinaisons contenant du MVA et du PLA induisent un titre élevé, supérieur d'un log au titre induit par du MVA seul.
Comme dans l'exemple 1 (p24) changer une injection de PLA en MVA dans un schéma de vaccination ne nuit pas beaucoup aux titres en anticorps obtenus mais permet d'élargir les réponses cellulaires par rapport à celles qui sont générées uniquement par un vecteur PLA.
Même si l'immunisation PLA + MVA (S) ne permet pas d'induire la meilleure réponse immune selon chaque type de réponse analysée, dans l'ensemble c'est le groupe pour lequel on observe les réponses les plus larges et les plus intenses.
Exemple 6: Immunisation de souris avec la combinaison vaccinale microparticules CPL/p24 et virus MVA gag 1. Modèle animal Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants :
- les microparticules CPL utilisées dans ce travail sont formées par coprécipitation de deux polysaccharides ; le chitosane (Mahtani chitosan PVT Batch 124) et le sulfate de dextrane (Sigma : 31404). Les deux polymères sont au préalable mis en solution dans de l'eau à pH 4 contenant 50 mM de NaCl. Les solutions sont laissées sous agitation magnétique pendant 12 heures avant de préparer les particules. Ensuite, 20 ml de la solution de chitosane à 0,1%
(masse molaire de 105000 g/mol et d'un degré d' acétylation 9) sont mélangés à
9,35 ml de la solution de sulfate de dextrane à 0,1%. La solution en défaut est versée rapidement sur la solution en excès placée sous agitation magnétique à 1000 rpm. Le mélange est laissé 30 secondes sur l'agitateur à 500 rpm, puis il est centrifugé pendant 30 minutes à 7 800 g. Le surnageant est éliminé par retournement, le culot est repris dans de l'eau puis à nouveau centrifugé pendant 30 minutes à 8 000 g. Les culots ainsi obtenus sont repris dans de l'eau et conservés à température ambiante sous agitation constante. Les particules obtenues sont caractérisées par une mesure de taille (granulomètre Coulter), et de charge (Zetasizer Malvern).
- Pour l'adsorption de la protéine p24 sur les CPL, la p24 à 1 Wl en tampon phosphate 10 mM pH 5,7 est mélangée volume pour volume avec des particules CPL à 1% de taux de solide soit 0,5% final. Les échantillons sont mis sous agitation sur une roue à température ambiante pendant 20 heures. Après incubation, les tubes sont récupérés et centrifugés 10 minutes à 1800 g à 20 C. Les surnageants sont récupérés et centrifugés 15 minutes à 3000 g à 20 C pour éliminer les particules pouvant rester en suspension, puis la concentration en protéine est déterminée en utilisant un dosage BCA (kit BCA Protein Assay, Pierce : 23225).
Les culots sont repris dans 400 lul de tampon phosphate 10 mM. Les particules obtenues sont caractérisées par une mesure de taille et de charge.
- Le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIH- 1, codant pour la protéine p24.
Le virus recombinant a été construit à Transgene, et produit et purifié comme décrit précédemment.
3. Immunisations 35 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci-dessus à
0 et 3 semaines. Les combinaisons vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 11 suivant. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée.

Tableau 11 Code Dose Dose Nombre de souris 1 ère injection 2'1" injection semaine 0 semaine 3 = CPL/p24 10 g CPL/p24 10 g 5 = MVA gag 10' pfu MVA gag 10' pfu / CPL/p24 10 g MVA gag 107 pfu W MVA gag 107 pfu CPL/p24 10 g 5 X CPL/p24 10 jig + MVA 5 gag 107 pfu Y CPL/p24 10 jig + MVA 5 gag 107 pfu CPL/p24 10 jig + MVA CPL/p24 10 jig + MVA 5 gag 107 pfu gag 107 pfu Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA
utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1.
5. Résultats 5.1. La réponse ELISPOT IFN-y contre le peptide gag AMQ
Les résultats sont présentés sur la figure 19 qui donne les réponses ELISPOT
IFN- y spécifiques du peptide p24 AMQ. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN- y de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide p24 AMQ sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été
déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Ces résultats montrent qu'il est possible de classer les combinaisons vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- y obtenues. La meilleure réponse est induite par la combinaison MVA + MVA (U). La deuxième catégorie contient les combinaisons CPL + MVA, en injection séparée (V) ou en deux injections simultanées (Z).
Une seule injection simultanée de CPL et de MVA (X et Y) n'est pas assez efficace pour induire une réponse ELISPOT IFN- y élevée. Finalement, la combinaison CPL +
CPL (T) est la moins efficace.
Comme pour l'association PLA + MVA, l'association CPL + MVA est efficace pour induire une sécrétion d'IFN-y spécifique du peptide AMQ. L'injection simultanée des deux immunogènes ne permet pas cependant d'améliorer les performances par rapport à

administration séparée de 3 semaines (Z vs V).
5.2. La réponse humorale spécifique de la protéine p24 Les résultats sont présentés sur la figure 20 qui compare la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-p24 mesuré par ELISA de capture p24 ; l'échelle de cet axe est logarithmique.
Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté
sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6.
Les résultats montrent que, pour les groupes ayant reçu 2 injections, toutes les combinaisons contenant du CPL et du MVA (V, W,Z) ou le CPL seul (T) induisent un titre élevé (10E6), supérieur de 2-3 log au titre induit par du MVA seul. Cependant la combinaison CPL + MVA (V) est plus efficace que l'ordre d'injection inverse (W). Dans les groupes n'ayant reçu qu' une seule injection de CPL et MVA (X et Y), les titres en anticorps sont plus faibles, mais quand même supérieurs à ce que l'on obtient avec du MVA seul.
Comme pour l'association PLA + MVA, changer une injection de CPL en MVA
dans un schéma de vaccination ne nuit pas aux titres en anticorps obtenus mais permet d'augmenter considérablement les réponses cellulaires par rapport à celles qui sont générées uniquement par un vecteur CPL.
Conclusions :
L'ensemble de ces exemples nous a permis de montrer que la combinaison d'un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable, tel que PLA, CPL, et d'un vecteur viral, tel que MVA et adénovirus, permet d'induire des réponses immunes efficaces et larges.
De préférence, pour la meilleure efficacité, la combinaison devrait être administrée dans l'ordre vecteur synthétique, puis vecteur viral. 5 and 15 amino acids, consisting of the minimal peptide fragment against which is off an immune response.

The synthetic vector presents the protein substances in multiple copies. By at least one protein substance means at least one or more substances Proteins from same type. By type of protein substance, we mean a set of substances Proteins triggering the same immune response by producing the same antibody (ie having the same immunity).
The synthetic vector can therefore comprise:
- either protein substances of the same type and thus constituting antigens associated with the same disease. So, for example, the synthetic vector can understand as substance Protein the p24 protein as a mtive protein and / or a mutated protein and / or protein fragment, it being understood that the mutated protein and the fragment have kept their immunity;
- either protein substances of different types and constituting antigens associated with the same disease. So, for example, the synthetic vector can include many human immunodeficiency virus (LIF) proteins such as protein Gag, the Mutated Gag protein that does not have the same immunity, Tat protein, protein Rev, the Nef protein, the Env protein;
- either protein substances of different types and constituting antigens associated with different diseases. So, for example, the synthetic vector can understand at least one type of HIV protein, such as p24, Tat, Rev, and at least a type of hepatitis C virus (HCV) protein such as NS2, NS3 proteins, NS4.
According to one embodiment of the invention, the synthetic vector comprises of the protein substances of different types and constituting antigens associated with the same sickness.
Protein substances can be of many origins such as original viral, bacterial or pathological non-infectious (as the cancer or metabolic disease).
According to a particular embodiment of the invention, the substance protein is a antigen of viral origin.

When the protein substance is of viral origin, the viruses used are all viruses for which substances capable of an immune response are known.
By way of example, mention may be made, without any limitation, of herpes viruses, virus hepatitis such as hepatitis B virus (HBV) or hepatitis C virus (HCV), the papillomas virus (HPV), Human Immunodeficiency Virus (LIF), such as VlH-1 and HIV-2, different strains of human and bird flu viruses.
The nucleic acid sequences of the viruses suitable for the purpose of the invention, as well as that proteins encoded by said sequences are widely known to the human profession and are available for example in databases such as GenBank.
So, for example, the HIV virus has genes that encode proteins structural effects of the virus. The gag gene codes for the protein that forms the core of the virion, including the p24 antigen. The pol gene codes for the enzymes responsible for reverse transcription (reverse transcriptase), cleavage (protease) and integration (Integrase). The env gene code for envelope glycoproteins. It contains six other genes (tat, rev, nave, vivid, vpr and vpu (HIV-1) or vpx (HIV-2)) that encode proteins involved in regulation of the expression of the genes of the virus (regulatory proteins). The HIV genome comprises also the LTR 5 'and 3' (Long Terminal Repeat) which include elements of regulation involved in the expression of the genes of the virus.
According to one embodiment of the invention, the protein substance used in the method of the invention is a protein of the HIV virus. For exemple virus antigen HIV, we can mention the regulatory proteins or the gag protein or the Env glycoprotein Preferred regulatory proteins being Tat, Rev or Nef protein With regard to HCV, the 5 'end of its genome corresponds to a non translated adjacent to the genes that encode structural proteins, the protein core of the nucleocapsid, the two envelope glycoproteins, E1 and E2, and a small called protein p7. The 5 'untranslated region and the core gene are relatively well preserved in ès different genotypes. The envelope proteins E1 and E2 are encoded by more regions variables from one isolate to another. P7 protein is an extremely protein hydrophobic which would be an ion channel. The 3 'end of the HCV genome contains the genes that coding for nonstructural proteins (NS2, NS3, NS4, NS5) and for a region 3 'no coding having a well conserved domain (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, June 1997, 25 (6): 1527-1538).
HCV NS3 Nonstructural Protein is a protein of 630 amino acids who comprises two distinct structural domains: an N-terminal domain, of 81 amino acids, with protease activity with active serine involved in maturation of protein viral (domain called NS3 protease), and a C-terminal domain, of 549 acids amines, comprising a helicase activity associated with NTPase activity which plays a role in the replication of the viral genome (domain called NS3 helicase). This NS3 protein is relatively well conserved among the different genotypes of the virus, so that this Protein is an antigen candidate vaccine of choice.
According to another embodiment of the invention, the protein substance is a antigen associated with tumors.
Indeed, some tumors express antigens that are potentially recognized by CD8 + T cells even if they are not the cause of an answer immune intense. These are tumor-associated antigens (TAAs) or markers tumors (Houghton AN, 1994, J Exp Med 180: 1). Improving the presentation of AATs to the system immune, it is possible to make them more immunogenic, so the AAT
can serve the development of cancer vaccines in the form of protein recombinant or synthetic peptide.
In order to test new immunotherapy strategies that aim to increase the recognition of AAT, Wang et al. have developed an experimental model at the mouse (1995, Journal of Immunology, 154: 4685-4692). The CT26.WT tumor line, background BALB / c gene, was transduced by the Escherichia lacZ gene encoding neck for the beta-galactosidase enzyme to create the CT26.CL25 line. Both lineages are lethal in mice and their growth kinetics are similar. administered in the mouse, the CT26.CL25 is responsible for the formation of tumors that can be slowed down inhibited in the presence of an immune response against beta-galactosidase constitutes a AAT model.

Protein substances suitable for the purposes of the invention may be obtained by genetic engineering techniques that includes the steps of:
- culture of a microorganism or eukaryotic cells transformed (s) to using a nucleotide sequence coding for the protein substance of interest and recovery of said protein substance produced by said microorganism or the said eukaryotic cells.
These techniques are well known to those skilled in the art. For more details concerning, we can refer to the book below: Recombinant DNA
Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Armais of the New York Academy of science Volume 646, 1991.
Protein substances of interest, when they are small, can also be prepared by well-known classical peptide syntheses of the man of career.
The protein substance is associated with the colloidal vectors according to techniques known to those skilled in the art, such as inclusion or binding to the area. For exemple of inclusion of the protein substance in the synthetic colloidal vector, we can cite encapsulation (Tamber H, et al., 2005, Adv Drug Deliv Rev, 57 (3): 357-76.).
As binding of the colloidal substance to the colloidal synthetic vector, it is possible to mention adsorption, as described in patent application WO2005 / 027871, or covalent grafting involving the formation of a chemical bond between a reactive group of colloidal vector and another of the protein substance as described for example in Protein immobilization-Fundamentals and Applications RF Taylor Ed, Marcel Dekker inc, New York, 1991.
According to a particular embodiment, the protein substances are added to synthetic vectors by binding and more preferably by adsorption, For example by mixing the microparticles with the protein substances and incubating under stirring, for example at room temperature or at 37 C.
The composition according to the invention also comprises a viral vector.

The viral vector comprises at least one nucleotide sequence encoding a protein substance corresponding to at least one protein substance of the vector synthetic.
Protein substance of the viral vector corresponding to a substance protein from synthetic vector means that the protein substance of the viral vector constitutes a antigen associated with the same disease as the protein substance of the vector synthetic, that she either of the same type or of a different type, as indicated above. When the substances Proteins are of different types, they must have at least one epitope in common, as for example the Gag and p24 proteins.
Thus, the genome of the viral vector is modified to insert one or many nucleotide sequences encoding one or more protein substances constituting antigens of the same disease or different diseases. Of these substances protein, at least one corresponds to a protein substance of the synthetic vector, these substances proteins constituting antigens associated with the same disease.
According to a preferred embodiment, the viral vector comprises a sequence nucleotide encoding a VIEL protein In addition to the nucleotide sequence (s) coding for at least one substance protein constituting an antigen associated with the same disease as the substance protein from synthetic vector, the viral vector also includes the means necessary to the expression of said protein substance.
By means necessary for the expression of a protein substance is meant any means which makes it possible to obtain the protein substance, such as in particular a promoter, a transcription terminator, an origin of replication and preferably a marker selection.
The means necessary for the expression of a protein substance are related to way operational to the nucleic acid sequence encoding said substance.
By related operationally means a juxtaposition of the said elements necessary to the expression and the gene coding for the protein substance, which are in such a relationship that it allows them to function in an expected way. For example, they can exist bases between the promoter and the gene of interest as long as their relationship functional is preserved.
The means necessary for the expression of the protein substance can be of the homologous means, that is to say included in the genome of the vector used, or well being heterologous. In the latter case, said means are cloned with the protein of interest to Express.
Examples of heterologous promoters include (i) viral promoters such that the SV40 promoter (Simian Virus 40), the promoter of the thir-kinase of Herpes simplex virus (TK-HSV-1), the Rous sarcoma virus LTR
(RSV), the early intermediate promoter of human cytomegolovirus (CMV) and the major promoter late adenovirus (MLP), as well as (ii) any cellular promoter that controls the transcription genes encoding proteins in higher eukaryotes, such as the promoter constitutive phosphoglycerate kinase (PGK) gene (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), the promoter of the liver-specific genes alphal-antitrypsin and FD (and the SM22 promoter specificity of smooth muscle cells (Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425).
Said sequences contained in the viral vector can be linked directly between them under the control of a single promoter and / or a single element regulator of expression, or they can be separated while being dependent each of independent and identical promoters and / or expression different.
As a viral vector which are suitable for the purposes of the invention, it is possible quote by viral vectors such as adenovirus, poxvirus, baculovirus, herpesvirus, togavirus, retrovirus.
Adenoviruses have been detected in many animal species. They do not do not integrate and are not very pathogenic. They are able to infect a variety of types cells, dividing cells and resting cells. They own a natural tropism for bronchial epithelia. In addition, they were used as enteric vaccines live for many years with an excellent safety profile.
Finally, we can grow easily and purified in large quantities. These characteristics have made that adenoviruses are particularly suitable for use as that vectors of expression and especially as gene therapy vectors for purposes therapeutic and vaccine.
According to a preferred embodiment, the vector of the invention is a adenoviruses.
Examples of adenoviruses for use in the present invention may be derivatives from any source of human or animal origin, in particular of canine origin (for example CAV-1 or CAV-2; reference Genbank CAV1GENOM and CAV77082, respectively), avian origina (reference Genbank AAVEDSDNA), of bovine origin (as AVB3, Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol., 72: 1394-1402), of ovine origin, feline, porcine, of simian origin, or one of their hybrids. Any serotype can be used. However, the adenoviruses of human origin are preferred and in particular the adenovirus 5 (Ad5).
In general, the viruses mentioned are available in the ATCC collections and have has been the subject of numerous publications describing their sequence, their organization and their biology, which allows the skilled person to apply them easily. By example, the adenovirus sequence type 5 is described in the Genbank database (M73260 and M29978) and is incorporated herein by reference.
The adenovirus genome consists of a double linear DNA molecule strand about 36 kb carrying more than about 30 genes needed to complete the viral cycle. There is has 4 early genes distributed in the genome of the adenovirus (E1 to E4). The El, E2 and E4 are essential for viral replication. Region E3 is considered as a region not essential based on the observation that mutant viruses appearing naturally or hybrid viruses that have lost this E3 region continue to replicate like viruses from wild type in cultured cells (Kelly and Lewis, 1973, J. Virol., 12 : 643-652). The late genes (L1 to L5) predominantly encode structural proteins constituting the viral capsid. They overlap at least in part with the first reasons for transcript and are transcribed from a single promoter (MLP for Major Late Promoter).
In addition, adenoviral genome carries at both ends cis-acting regions essential for the DNA replication, respectively the inverted repeat patterns 5 'and 3' (ITRs for Inverted Terminal Repeats) and a packaging sequence.

Adenoviruses currently used in gene therapy protocols are devoid of the majority of the El region, making deficient viruses level of their replication to prevent their spread in the environment and in the host organism. In Moreover, most adenoviruses are also devoid of the E3 region so to increase their cloning ability. The feasibility of gene transfer using these vectors has been demonstrated in a variety of tissues in vivo (see for example Yei et al., 1994, Hum. Uncomfortable Ther., 5: 731-744; Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1401-1405 ;
U56,099,831; and U56,013,638).
Another expression vector particularly suitable for the purpose of the invention is a poxvirus, which constitutes another embodiment of the invention.
Poxviruses are a group of enveloped complex viruses, distinguishing mainly by their unusual morphology, their large DNA genome and their site cytoplasmic replication. The genome of several elements of poxviridae, comprising the Copenhagen vaccinia viral strain (VV) (Goebel et al., 1990, Virol.
179: 247-266 and 517-563) and the strain of modified vaccinia virus of Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol., 244: 635-396), was mapped and sequenced. The VV strain has a double-stranded DNA genome of about 192 kb encoding about 200 proteins whose approximately 100 are involved in the assembly of the virus. Strain MVA is a highly attenuated vaccinia virus strain, generated by more than 500 serial passages of the Ankara strain of vaccinia virus (CVA) on fibroblasts of embryos chicken (Mayr et al., 1975, Infection, 3: 6-16). The MVA virus has been deposited in front, there National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number 1721. The determination of the complete MVA genome sequence and comparison with that of VV allows the precise identification of the alterations that appeared in the viral genome and the definition of seven deletions (I to VII) and many mutations leading to executives from fragmented open reading (Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396).
Other examples of poxviruses suitable for the purposes of the invention include the pox canary, poultry pox, cow pox, entomopox, monkey pox, the pox of pork and the penguin pox.

The poxvirus is found in two morphologically distinct forms, called virus intracellular mature (IMV) and enveloped extracellular virus (EEV).
Preferably, the poxvirus used for the purposes of the invention is a modified vaccinia Ankara virus.
The methods of deleting and inserting DNA sequences into vectors expression are widely known to those skilled in the art and consist of especially in enzymatic digestion and ligation steps. Preferably the sequence inserted nucleotide in the viral vector encodes an VIII virus protein.
The vector-based compositions according to the invention are particularly effective for the inhibition, prevention and treatment of a disease whose protein substance of the The composition constitutes an antigen, such as an infection with a virus. They thereby are particularly useful for the preparation of a medicament, and in particular of a vaccine, which he either therapeutic or prophylactic.
Thus, the invention also relates to a prophylactic treatment method or therapeutic, in particular vaccination, including administration, at a patient, a dose effective of the composition according to the invention.
The pharmaceutical compositions of the invention are suitable for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, vaginal, intraocular, intra auricular, said active ingredient being administrable in unit form of Directors.
The unit forms of administration can be for example tablets, of the capsules, granules, powders, solutions or oral suspensions injectables, transdermal patches (patch), forms of sublingual administration, buccal, Intratracheal, intraocular, intranasal, intra-auricular, by inhalation, forms topical administration, such as rectal or vaginal, transdermal, subcutaneous cutaneous, intramuscular or intravenous, or implants. For the administration topically, one can consider creams, gels, ointments, lotions or eye drops.
These galenic forms are prepared according to the usual methods of the fields considered.

Said unit forms are dosed to allow administration daily 0.001 to 10 mg of active ingredient per kg of body weight, depending on the form dosage.
There may be special cases where higher or higher dosages weak are appropriate; such dosages are not outside the scope of the invention. According to convenient usual, the appropriate dosage for each patient is determined by the doctor according to the mode administration, weight and response of the patient.
The quantity and nature of the excipient can be easily determined by the skilled person. They are chosen according to the pharmaceutical form and the fashion desired administration.
The composition according to the invention may be contained in a kit pharmaceutical.
The administration of the composition according to the invention may be simultaneous, separate or staggered over time.
Simultaneous administration means administration at the same time and at same place of the composition.
By staggered administration is meant the administration of the viral vector or of synthetic vector at delayed times. The time between each administration can expand from a few minutes to several years, preferably from several weeks to several months and preferably it may be 3 or 4 weeks.
By separate administration is meant the administration of the viral vector and the vector synthetic at different bodily places. The viral vector and the synthetic vector may be in the same excipient or preferably in excipients different appropriate.
Preferably, the composition according to the invention is administered in a staggered.
More preferably, the synthetic vector is administered before the vector viral.
Thus, according to one embodiment of the invention, the composition of the invention includes:
i) a premium component consisting of the synthetic colloidal vector bioresorbable comprising at least one protein substance and ii) a boost component consisting of the viral vector comprising at least least one nucleotide sequence coding for a protein substance corresponding to less a protein substance of the synthetic vector.
In addition to a therapeutic and prophylactic application, the invention also a diagnostic application. Thus, the invention also relates to the use composition of the invention for the in vitro diagnosis of the pathological condition of which the substances proteins of the synthetic vector and the synthetic vector constitute the antigens, and particular of a viral infection or cancer.
The present invention will be better understood with the aid of the following examples given only for illustrative and non-limiting purposes, and with the aid of the figures 1 to 20 annexed, on which:
Figure 1 shows the CTL responses during the N immunization experiment 1 with different vaccine compositions including compositions according to the invention including a synthetic vector based on microparticles of poly (D, L-lactic acid) associated with the p24 protein (hereinafter referred to as PLA / p24) and an MVA viral vector comprising the sequence gag (hereinafter called MVA virus gag).
FIG. 2 represents the ELISPOT IFN-γ responses specific for the Gag peptide.
AMQ during 3 immunization experiments with different vaccine compositions of which the compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
Figure 3 shows ELISPOT IFN-γ responses specific for protein p24 during 3 immunization experiments with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the vector Viral MVA gag.
Figure 4 shows the ELISPOT IL-4 responses specific for the protein p24 during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the vector Viral MVA gag.
FIG. 5 represents the secretion of the cytokine GM-CSF specific to the p24 protein during 3 immunization experiments with different vaccine compositions of which the compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
FIG. 6 represents the secretion of the IL-5 specific cytokine of the p24 protein during 3 immunization experiments with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the vector Viral MVA gag.
FIG. 7 represents the secretion of the IL-2 specific cytokine of the p24 protein during 3 immunization experiments with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the vector Viral MVA gag.
Figure 8 shows the kinetics of appearance of humoral responses specific to the p24 protein during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
Figure 9 shows the CTL responses during the N immunization experiment 2 with different vaccine compositions including compositions according to the invention including the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector Adenovirus Gag.
FIG. 10 represents the ELISPOT IFN-γ responses specific for the Gag peptide.
QMA
after immunization with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the PLA / p24 synthetic vector and the viral vector Adenovirus Gag.
FIG. 11 represents the specific secretion of the p24 protein of cytokines IL-2, IL-4, IL-10 after immunization with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the vector viral Adenovirus Gag.
Figure 12 shows the kinetics of appearance of humoral responses specific to the p24 protein (12A) or adenovirus (12B) after immunization with different vaccine compositions, the compositions according to the invention comprising the vector synthetic PLA / p24 and the viral Adenovirus Gag vector.
Figure 13 compares ELISPOT IFN-γ responses specific for Gag peptide.
AMQ after immunization with different vaccine compositions whose compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
Figure 14 compares ELISPOT IL-4 responses specific for p24 protein after immunization with different vaccine compositions whose compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
Figure 15 compares the kinetics of appearance of humoral responses specific to the p24 protein after immunization with different vaccine compositions of which the compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
Figure 16 compares the kinetics of appearance of humoral responses specific to the virus MVA after immunization with different vaccine compositions whose compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
Figure 17 shows the peptide-specific ELISPOT IFN-γ responses.
beta-gal TPH
after immunization of mice with different vaccine compositions whose compositions of the invention comprising the PLA-betagal synthetic vector and the vector viral MVA beta-gal.
Figure 18 compares the kinetics of appearance of humoral responses specific to the beta- gal after immunization of mice with different compositions vaccines whose compositions of the invention comprising the PLA-betagal synthetic vector and the vector viral MVA beta- gal.
FIG. 19 represents the ELISPOT IFN-γ responses specific for p24 peptide QMA
after immunization of mice with different vaccine compositions whose compositions of the invention comprising the synthetic vector CPL-p24 and the viral vector MVA gag.
Figure 20 compares the kinetics of appearance of humoral responses specific to p24 AMQ peptide after immunization of mice with different compositions vaccine of which the compositions of the invention comprising the synthetic vector CPL-p24 and the vector Viral MVA gag.
Example 1 Immunization of mice with a vaccine composition according to the invention The vaccine composition used comprises a synthetic vector based on microparticles of poly (D, L-lactic acid) associated with the p24 protein (hereinafter referred to as PLA / p24) and a viral vector MVA comprising the gag sequence of SEQ ID No. 1 (hereinafter referred to virus MVA gag) 1. Animal model Immunization experiments were performed in BALB / c mice (H
2K ') females 6 to 8 weeks old at the time of first immunization.
2. Immunogens administered In this series of experiments the following immunogens were used alone or in combination :
microparticles PLA / p24 prepared according to the displacement protocol of solvent and adsorption of the patent application WO2005 / 027871.
- MVA gag virus (Modified Vaccinia Virus Ankara, vaccinia virus attenuated, strain Ankara) which is recombinant for the gag gene of the HIV-1 virus, encoding the p24 protein.
The recombinant virus was constructed at Transgene from the wild strain (MVATGN33) as described in Antoine G., et al., 1998, The complete genomic Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses, Virology, 244: 365-396. This recombinant virus was then produced and purified as follows:
MVA is replicated on embryonic chicken cells. After 48 to 72 hours of infection, cells are harvested, then lysed by freezing / thawing and by sonication. The lysate is purified / concentrated by 2 cushions of sucrose followed possibly by 2 gradients of sucrose.
For details, we can refer to the book Current Protocols in Molecular Biology, Vol 2, Chapter 16.16 Ausubel FM, Brent R, Kigston RE, editors Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, John Wiley & Sons, Inc., New York. 3 volumes.
wild MVATGN33 MVA virus. This is a negative witness that serves to measure whether the Viral vector induces a nonspecific immune response during immunizations.
- gag DNA. The gag gene (of SEQ ID No. 1) was cloned into the plasmid expression eukaryotic phCMV (contains the intermediate / early promoter of human cytomegalovirus and splicing and polyadenylation signals from the beta-globin gene of rabbit (JK Yee, et al., 1994, Proc Natl Acad Sci US A, 91 (20): 9564-9568). The preparations of DNA without endotoxins and in large quantities were performed with the Gigaprep kit endotoxin-free Macherey-Nagel. DNA serves as a positive control because it is known that in the mouse the intramuscular administration of naked DNA makes it possible to induce a good reply cytotoxic (CTL).
3. Immunizations Experience 1 35 mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above.
0 and 3 weeks. The vaccine compositions received by each group of mice are indicated in Table 1 below. All injections were performed by subcutaneous except for DNA that has been administered intramuscularly.
Table 1 Dose Rate Number of mice 1st injection 2'1 "injection week 0 week 3 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 lug 5 PLA / p24 40 lug MVA gag 107 pfu 5 PLA / p24 40 lug PLA / p24 40 lug 5 MVA wild 107 pfu MVA wild 107 pfu 5 DNA gag 10 lug (IM) PLA / p24 40 lug 5 PLA / p24 40 lug DNA gag 10 lug (IM) 5 Pfu = plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used. The Viral titre is expressed in pfu according to the viral stock assay technique used, as reported in Current Protocols in Molecular Biology, supra.
The animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and the blood and the spleen were collected for immunological analyzes.
Experience 2 In this experiment, the number of injections was increased.
30 mice received 2 or 3 doses of the immunogens described in point 2 below.
above at 0, 3 and 6 weeks. The vaccine compositions received by each group of mice are indicated in Table 2 below. All injections were performed by subcutaneous.

Table 2 Dose Dose Dose Number 1st injection 2'1 "ection 3'1" injection of mouse Week 0 Week 3 Week 6 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 ug 5 MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 ug PLA / p24 40 ug 5 PLA / p24 40 ug MVA gag 107 pfu 5 MVA wild 107 pfu MVA wild 107 pfu MVA wild 107 pfu 5 The animals were sacrificed 3 weeks after the last injection and the blood and spleen were collected for immunological analyzes.
Experience 3 30 mice received 2 or 3 doses of the immunogens described in point 2 below.
over to 0, 3 and 6 weeks. The vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 3 below. All injections were carried out under skin.
Table 3 Dose Dose Dose Number 1st injection 2'1 "injection 3'1" injection of mouse Week 0 Week 3 Week 6 MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 ug 5 MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 ug PLA / p24 40 ug 5 PLA / p24 40 ug MVA gag 107 pfu 5 PLA / p24 40 μg MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 μg 5 PLA / p24 40 μg PLA / p24 40 μg 5 PLA / p24 40 μg PLA / p24 40 μg PLA / p24 40 μg 5 The animals were sacrificed 3 weeks after the last injection and the blood and spleen were collected for immunological analyzes.

4. Immunological analyzes The humoral response and cellular response were searched as follows:
- Humoral response: we performed a blood sample on the mice before their sacrifice.
The presence of anti-p24 antibodies was determined by ELISA. P24 protein (produced with Escherichia coli and purified by metal-affinity chromatography.
chelate according to Cheynet V. et al., 1993, Protein Expr Purif, 4 (5): 367-72) was used in capture and antibodies specificities present in the serum were revealed by a polyclonal antibody anti-mouse to As a detection antibody that is a goat anti-IgG antibody AffiniPure mouse with horseradish peroxidase (H + L, Jackson Immunoresearch, Cat No. 115-035-062).
The title is the inverse of the dilution for which an absorbance is obtained 0.1 unit OD
with the ELISA protocol used.
- Cellular response: after sacrifice of the mice, the rats were removed sterile to prepare a cell suspension. The following analyzes were practiced on obtained cell suspensions, each mouse having been analyzed in a manner individual or in pool when the amount of cells obtained was not sufficient to individual analysis.
(i) CTL Test: The cell suspension was cultured in the presence of a peptide of the 9-mer p24 protein (AMQMLKETI ¨ SEQ ID N 2) which corresponds to a epitope CTL H-2Kd-restricted immunodominant, and IL-2. Five days later, the population effector was restimulated by irradiated naive cells loaded with the peptide. The effector cytotoxic population was harvested after the 7th day and CTL activity has been measured using as targets the P815 (ATCC TM-64) cells labeled with 51 Cr.
(ii) ELISPOT: The ELISPOT makes it possible to determine the number of cells secreting a given cytokine in response to a specific stimulus. We are interested in IFN-γ cytokines of Th1 type and Th2-type IL-4. Cell suspensions obtained at from the spleens were restimulated in vitro by the AMQMLKETI peptide during 20h for analyze the CD8 responses. Cell suspensions obtained at from the rats have in vitro with p24 protein (without endotoxins) for 42 hours to analyze the CD4 type responses.
96-well ELISPOT plates with PVDF (Multiscreen IP) membranes, Millipore) were coated with anti-IFN-? or anti-IL-4. During the restirnulation, splenocyte suspensions were incubated in these plates so as to capture the cytokines secreted by each cell. The spots corresponding to each cell secreting the cytokine of interest were revealed by a biotinylated detection antibody specific to the cytokine of interest.
(iii) Secretion of Cytokines: Splenocytes were stimulated during 3 days in of the complete culture medium (minimal medium culture medium essential medium SAME) containing 10% fetal calf serum, 10 mM HEPES, 5 x M B-mercaptoethanol, 4 mM
L-glutamine, 80 15 / ml penicillin, 80 mg / ml streptomycin, non-amino acids essential lx (Cat No. 11140-035), sodium pyruvate 1x (Cat No. 11360-039) (components of Invitrogen, Cergy Pontoise, France)) in the presence or absence of the antigen of interest p24, then cytokines secreted in the culture supernatant were assayed by the mouse kit FlowCytomix Thl / Th2 lOplex from Bender Medsystems (Cat No. BMS720141-i).
5. Results 5.1. The CTL response Table 4 below summarizes the results obtained during the 3 experiments successive:

Table 4 Vaccine composition code Mouse Frequency of mice with analyzed in response CIL
pool number of positive mice / nb of mouse (Exp 1, n = 5) analyzed individually A MVA gag + MVA gag Negative Pool 0/5 A 'MVA gag + MVA gag + MVA gag 1/5 B MVA gag + PLA / p24 Negative Pool 1/10 B 'MVA gag + PLA / p24 + PLA / p24 3/10 C PLA / p24 + MVA gag Pool positive 2/10 C 'PLA / p24 + MVA gag + PLA / p24 1/5 F DNA gag + PLA / p24 Positive pool Not performed G PLA / p24 + gag positive Pool DNA Not Performed D PLA / p24 + PLA / p24 Negative Pool 0/5 PLA / p24 + PLA / p24 + PLA / p24 0/5 E MVA + Wild MVA Negative Pool Not Performed E 'MVA + MVA + wild MVA 0/5 Figure 1 shows the CTL responses obtained during the experiment Immunization No. 1. Each group consists of 5 mice, the female rats were pooled before performing the CTL assay. Nonspecific stimulation (without peptide) in all the groups being 0, it is not represented. Similarly, CTL responses obtained with the compositions A, D and E being 0, they are not shown. The x corresponds to ratio effector cells (CTL) on target cells (to be lysed). The axis of ordered matches at the average lysis percentage.
Induced CTL responses are low intensity with all immunogens used (MVA, PLA or combinations), with the exception of group G of experiment 1 which has received from DNA last (Figure 1). Induction of CTL in the DNA groups is normal: DNA
is optimized for this purpose, it is a positive control in the mouse but which does not not walk too well in primates.
Even if the answers remain weak, the groups containing both MVA
and PLA give better CTL responses than groups that received MVA alone or PLA alone.
When 2 injections were performed, in the groups that received 2 MVA or 2 times PLA, there is no CTL detected at the sacrifice chosen (A and D), Whereas in groups receiving both PLA and MVA (B and C) there is a low CTL frequency.
The injection order also plays a role: PLA + MVA (C) gives better results that MVA + PLA (B).
When 3 injections have been performed, the frequency of induction of the responses rest still weak. CTL responses are not improved over two injections. The Vaccine strategy using MVA requires 3 injections to give the same results than the combinations of PLA and MVA.
5.2. The ELISPOT IFN-γ response against the Gag AMQ peptide FIG. 2 represents the ELISPOT IFN-γ responses specific for the Gag peptide.
QMA. All the animals immunized during the 3 successive experiments were included in analysis. For each vaccine composition, the number of animals that received this composition is indicated in parentheses. The y-axis represents the number secretion of IFN-γ secreting cells specifically in response to a stimulation of 18h with Gag AMQ peptide on one million stimulated cells. This answer has been determined individually for each mouse. The number presented on this graphic is the average calculated from all mice in a group (n = 5, 10 or 15 according to groups).
Interferon gamma or type 11 is also called immune interferon because he is secreted by CD4 + T cells by CD8 + T cells and the NK cells. It protects cells against viral infections. It stimulates phagocytic activity macrophages, allowing them to kill tumor cells. It stimulates the maturation of T and B cells and increases the production of antibodies. It increases the expression of HLA class I and II molecules by macrophages. This is a cytokine Thl type.

It is possible to classify the vaccine compositions into several categories in function of the ELISPOT IFN-y responses obtained. The best answers are induced by PLA + MVA (C) and MVA + MVA (A) compositions. In these cases, the third injection does not bring any improvement (MVA + MVA composition) (A '), or can decrease the observed response (PLA + MVA composition) (C '). MVA + PLA compositions (B and B ') and DNA + PLA (F) generate intensity responses intermediaries, then that the strategy using only PLA (D and D ') only induces weak responses.
Thus, we were able to show that the PLA + MVA (C) vaccine composition was at less as good, if not better than the combination MVA + MVA (A) for induce a IFN-γ secretion specific for the AMQ peptide.
5.3. The IFN-y ELISPOT response against p24 protein Figure 3 shows the ELISPOT IFN-γ responses specific for the protein p24.
All animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis.
For each vaccine composition, the number of animals that received this composition is indicated in parentheses. The y-axis represents the average number of cell secreting IFN-γ specifically in response to stimulation of 42h by the p24 protein on a million stimulated cells. This answer was determined individually for each mouse. The number shown on this chart corresponds to the average calculated from all mice in a group (n = 5, 10 or 15 according to groups).
Again, it is possible to classify the vaccine compositions into many categories according to the ELISPOT IFN-y responses obtained. Best answers are induced by the PLA + MVA (C and C ') and DNA + PLA (F) compositions. The third injection further reduces the response observed in the case of PLA + MVA composition (VS'). The compositions MVA + PLA (B and B ') and MVA + MVA (A and A') make it possible to generate intermediate intensity responses, while the strategy using only PLA (D and D ') induces only weak responses.
Thus, we were able to show that the PLA + MVA vaccine composition was the better choice to induce IFN-γ secretion specific for the p24 protein.
5.4. The IL-4 ELISPOT response against the p24 protein Figure 4 shows the ELISPOT IL-4 responses specific for the protein p24.
All animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis.
For each vaccine composition, the number of animals that received this composition is indicated in parentheses. The y-axis represents the average number of cell secreting IL-4 specifically in response to 42h stimulation by the protein p24 on a million stimulated percentiles. This answer has been determined individually for each mouse. The number shown on this graph is the average calculated at from all the mice in a group (n = 5, 10 or 15 depending on the groups).
Once again, it is possible to dilute the vaccine compositions by many categories according to the ELISPOT IL-4 responses obtained. The best answer is induced by the composition PLA + MVA (C and C '). The third injection seems one more unnecessary because it only improves the response induced by the composition PLA + MVA (C '). MVA + PLA (B and B ') and DNA + PLA (F) and PLA + compositions PLA (D and D ') make it possible to generate intermediate intensity responses, while strategy using only MVA induces only weak responses (A and AT').
Thus, we were able to show that the PLA + MVA vaccine composition was the best choice for inducing secretion of IL-4 specific for protein p24.
5.5. Secretion of cytokines The study of the secretion of cytokines makes it possible to draw a table of the state of immune activation of the animal having received the vaccine composition. We can divide cytokines in four groups according to their properties:
1) Mediators of natural immunity (IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-8 ...) 2) activators of activation, growth and differentiation lymphocyte (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TGF-B) 3) Non-specific activators of inflammation (IFN-γ, IL-5, IL-8) 4) Activators and differentiators of immature leukocytes (IL-3, GM-CSF) Thanks to the use of a multiplex kit, we were able to measure the secretion of 10 cytokines different in the culture supernatants of splenocytes obtained from sacrificed animals.
These cytokines are: IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-4, IL-17, IL-1α, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10.
None of the vaccine compositions tested induces secretion significant cytokines IL-1cc and IL-17.
For all other cytokines tested we were able to highlight differences among the groups.
FIG. 5 represents the secretion of the cytokine GM-CSF specific to the protein p24. All the animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis, when the quantity of available cells allowed it. For each composition vaccine, the number of animals given this composition is indicated between parentheses.
Cells obtained from mice of the same group were pooled before the implementation culture for the secretion test. The y-axis represents the concentration of GM-CSF (in μg / ml) secreted into the culture medium in response to stimulation 3 days per the p24 protein.
The cytokine GM-CSF (granulocyte-macrohage colony stirnowing factor) is a powerful immunostainer that activates immune functions as adhesion, phagocytosis, etc. macrophages, neutrophils and eosinophils.
As we can see in Figure 5, we showed a significant secretion of GM-CSF in groups containing PLA in association or not with MVA
(except when the number of injection is increased to 3 for PLA) while the groups immunized exclusively with MVA do not secrete or little.
FIG. 6 represents the secretion of the IL-5 specific cytokine of the p24 protein.
All animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis, when the quantity of cells available allowed it. For each vaccine composition, the number of animals given this composition is indicated in parentheses.
Cells obtained from mice of the same group were pooled prior to implementation.
culture for the secretion test. The y-axis represents the concentration of IL-5 (in pg / ml) secreted into the culture medium in response to stimulation of 3 days by the p24 protein.
For all Th2-type cytokines tested such as IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10, the secretion profiles are very similar to that presented in Figure 6 which corresponds to the secretion of IL-5. No secretion is observed in the groups having received from MVA
wild (it's normal, it's a negative witness). Low concentrations are obtained for MVA gag groups, 2 or 3 injections, and the groups associating DNA and PLA. of the average concentrations are obtained for groups of immunized mice by the PLA and MVA compositions. The highest concentrations are obtained in the groups that received PLA only. The secretion of cytokines is therefore oriented more or less towards Th2 type cytokines as a function of the vaccine composition:
- a predominantly Th2 response is observed for the groups immunized only with PLA (IFN-gamma secretion of IL-2, cytokines of type Th is weak (Figure 7), an unpolarized response is observed, both Th1 and Th2 for the immunized groups with the PLA and MVA combinations.
for the MVA groups, the secretion of Th2 type cytokines is weak.
Note also that the 4 Th2 cytokines dosed are not secreted at the same concentration. It is IL-4 and IL-10 that are secreted at high levels.
The next board summarize the average concentrations of the different cytokines observed in groups having received PLA and MVA compositions.
Table 5 Cytokine IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 Average conc 2600 1460 260 2660 (Pg / m1) Interleukin 4, IL-4, is secreted by CD4 + T cells. She increases the growth and differentiation of B lymphocytes previously activated, favors IgE production plays an important role in the reactions immediate hypersensitivity.
It also activates macrophages.
Interleukin 5, IL-5, stimulates growth, differentiation and the activity of eosinophils that play an important role in the fight against infections parasitic.
The increase in the number of eosinophils is not just a sign parasitic but also a defense. IL-5 induces proliferation of lymphocytes B and their secretion of immunoglobulins. It activates cytotoxic T lymphocytes. His use in treatment of certain parasitic diseases may be considered.
Interleukin 6, IL-6, stimulates the growth and differentiation of B lymphocytes and increases the generation of platelets. It causes, by activation of hepatocytes, the secretion of inflammation proteins such as fibrinogen and protein C reactive. She has a pro-inflammatory role. It has a cytotoxic effect vis-à-vis certain tumors.
FIG. 7 represents the secretion of the IL-2 specific cytokine of the p24 protein.
All animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis, when the quantity of cells available allowed it. For each vaccine composition, the number of animals given this composition is indicated in parentheses.
Cells obtained from mice of the same group were pooled prior to implementation.
culture for the secretion test. The y-axis represents the concentration of IL-2 (in pg / ml) secreted into the culture medium in response to stimulation of 3 days by the p24 protein.
IL-2 is a growth factor for T cells. It activates their transformation into CD8 + cytotoxic T lymphocytes that secrete oc interferon, which stimulates macrophages to release TNFoc and TGFoc (transforming growth factor oc).
IL-2 stimulates growth and cytolytic activity of NK cells (natural "(iller).
stimulates B cell maturation and antibody synthesis. It's a cytokine Thl type.
It is possible to classify the vaccine compositions into several categories in function of the secretion of IL-2, specific for the p24 protein. The best answer is induced by the combination MVA + PLA (B), then PLA + MVA (C), PLA alone (D) and MVA alone (AT).
5.6. The specific humoral response of the p24 protein FIG. 8 represents a kinetics of appearance of the humoral responses specific of the p24 protein. All animals immunized during the 3 experiments successive included in the analysis. For each vaccine composition, the number of animals Have received this composition is indicated in parentheses. The y-axis represents the title in Anti-p24 IgG measured by p24 capture ELISA; the scale of this axis is logarithmic. The antibody titre was determined individually for each mouse. The number presented on this graph corresponds to the geometric mean calculated from all the mice group (n = 5, 10 or 15 depending on the group). S3 = week 3, S6 = week 6, S9 =
week 9.
Regarding humoral anti-p24 responses, for the first time in this series of experience, increasing the number of injections helps to improve way significant measured immune response. Indeed, whatever the group studied, go from 2 to 3 immunogen injections increases about one log the anti-p24 response (except for the PLA group alone where the increase is smaller but still significant).
For groups that received 3 injections, all combinations containing MVA
and PLA or PLA alone induce a high titre (10E6), greater than one log in the title induced by MVA alone.
Similarly, for groups that received 2 injections, all compositions containing MVA and PLA or PLA alone induce a high, higher titre from a log to title induced by MVA alone.
Changing an injection of PLA into MVA in a vaccination schedule does not hurt to the antibody titers obtained but allows to broaden the cellular responses compared to those that are generated solely by a PLA vector.
Conclusion:
Depending on the type of response analyzed, the best composition is not always the same, some compositions getting specifically very good answers.
However, to obtain a broad and intense immune response, the best composition is PLA + MVA composition.
Example 2 Immunization of mice with the vaccine composition microparticles PLA / p24 and Adenovirus Gag 1. Animal model Immunization experiments were performed in BALB / c mice (H
2K ') females 6 to 8 weeks old at the time of first immunization.
2. Immunogens administered In this series of experiments were used alone or in combination the following immunogens:
microparticles PLA / p24 prepared according to the displacement protocol of solvent of the patent application WO2005 / 02787.
Adenovirus type Gag which is recombinant for the gag gene of the virus VIII-1, coding for the p24 protein. (Genethon) Adenovirus type 5 eGFP which is recombinant for the gene encoding the enhanced Green Fluorescent Protein (Genethon). This is a witness negative, which is used to measure whether the viral vector induces an immune response specific during immunizations.
- gag DNA. The gag gene (SEQ ID No. 1) was cloned into the plasmid eukaryotic expression phCMV (non-commercial plasmid). The DNA preparations without endotoxins and in large quantities were performed with the Gigaprep endotoxin-free kit from Macherey-Nagel.
DNA serves as a positive control because it is known only in mice the intramuscular administration of naked DNA makes it possible to induce good cytotoxic response (CTL).
3. Immunizations 30 mice received 2 doses of the immunogens described in point 2 above at 0 and 3 weeks. The vaccine compositions received by each group of mice are indicated in Table 6 below. All injections were performed by intramuscular adenovirus and DNA and subcutaneously for PLA.

Table 6 Dose Dose Number of mice Composition 1 injection 2 1 injection week 0 week 3 Ad5 gag 108 ip Ad5 gag 108 ip 5 H
Ad5 gag 108 ip PLA / p24 40 μg 5 I
PLA / p24 40 μg Ad5 gag 108 ip 5 J
Ad5 gag 107 ip Ad5 gag 107 ip 5 H ' Ad5 gag 107 ip PLA / p24 40 μg 5 I ' PLA / p24 40 μg Ad5 gag 107 ip 5 .1 ' The animals were sacrificed 3 weeks after the last injection and the blood and spleen were collected for immunological analyzes.
4. Immunological analyzes Realized following the same protocols as in example 1. In addition, we have measured the humoral responses directed against adenovirus5 using a technical ELISA. The protocol is identical to that used for the anti-p24 ELISA except that a lysate adenovirus is used in capture.
5. Results 5.2. CTL answers Figure 9 shows the CTL responses obtained during the experiment Immunization No. 2. Each group consists of 5 mice, analyzed individually. The nonspecific stimulation (without peptide) in all groups being 0, she is not represented. The abscissa corresponds to the ratio effector cells (CTL) on target cells (to lyse). The y-axis corresponds to the average lysis percentage; he this is the arithmetic mean calculated from all mice in a group (n = 5).
In all groups 5 out of 5 mice developed a CTL response, except one mouse from the Ad5gag 107 + PLA group.
The same thing is observed for the 2 doses of virus tested: the combinations Ad +

Ad (H and H ') and PLA + Ad (J and J') induce better CTL responses than the combination Ad + PLA (I and I ').
5.3. The ELISPOT IFN-γ response against the Gag AMQ peptide Figure 10 shows the ELISPOT IFN-γ responses specific for Gag peptide.

QMA. The y-axis represents the average number of cells secreting IFN-y of specific way in response to an 18h stimulation with the Gag AMQ peptide on a million cells stimulated. This answer was determined individually for each mouse (numbered from 1 to 5 for each mouse, thus H1 corresponds to the mouse 1 having received composition H Ad5 gag 108 ip and Ad5 gag 108 ip, etc. The number presented on this graph is an average of triplicates.
It can be seen from Figure 10 that:
- to 108: the response PLA + Ad> Ad + Ad> Ad + PLA
at 107: the response Ad + Ad> or = PLA + Ad> Ad + PLA. The difference between the Ad + Ad and PLA + Ad compositions are not very obvious. Overall answer ELISPOT
IFN-gamma is in agreement with the CTL test: PLA + Ad compositions and Ad + Ad are more effective than Ad + PLA.
5.4. Secretion of cytokines As in Example 1, we tested the secretion of 10 cytokines in the supernatant. Of these, IL-5, IL-6, IL-17 and IFN- were not secreted or secreted at infinitesimal concentrations. GM-CSF, TNF-oc and IL-lut, their secretion was not specific for the p24 protein by the assay technique used. It is very likely that it is the immunization with adenovirus that causes the secretion of these cytokines. If a specific secretion of the p24 protein exists, it is drowned in that caused by the adenovirus.
For 3 other cytokines, namely IL-2 (Th1), as well as 1L-4 and IL-10 (Th2), we were able to measure the specific secretion of the p24 protein. The results are presented in Figure 11.
Figure 11 shows the secretion of cytokines IL-2, IL-4 and IL-10 specific of the p24 protein. Each vaccine composition was administered to 5 mice.
Cells obtained from mice of the same group were pooled prior to implementation.
culture for the secretion test. The y-axis represents the concentration of each cytokine (in pg / ml) secreted into the culture medium in response to a stimulation of 3 days by the p24 protein.
The results in Figure 11 show that:
the composition Ad5 gag + Ad5 gag (H and H ') gives no secretion of IL-2, IL-4 or IL-10.
only the composition PLA + Ad5 gag (J and J ') gives a secretion of IL-2 and IL-4.
the compositions PLA + Ad5 gag (J and J ') and Ad5 gag + PLA (I and I') allow a secretion of IL-10.
Ad + Ad composition (H and H ') induces a rather polarized cytokine response Th (measured by ELISPOT IFN-gamma) The composition PLA + Ad 5 (J and J ') induces a non-polarized cytokine response, since both Th1 cytokines like IFN-gamma (by ELISPOT) and IL-2, and Th2 cytokines such as IL-4 and IL-10 are detected.
5.5. Humoral answers Figure 12 shows the kinetics of appearance of humoral responses. The figure 12 (A) represents the antibody response directed against the p24 protein and the Figure 12 (B) represents the antibody response directed against the adenovirus. Each vaccine composition administered to 5 mice. The y-axis represents the IgG titer measured by ELISA; the scale of this axis is logarithmic. The antibody titre was determined individually for each mouse. The number shown on this chart corresponds to the geometric mean calculated from all mice in a group (n = 5).
S3 = week 3, S6 = week 6.
The anti-adenovirus response (or anti-vector response) is about 1 log of less in the groups having received Ad + PLA (I and I ') and PLA + Ad (J and I ') that for Ad + Ad (H and H ').
The compositions according to the invention thus make it possible to reduce the immunity against adenoviruses.

Example 3 Comparison of PLA / p24 + MVAgag Vaccine Compositions Alum / p24 + MVAgag in the mouse 1. Animal model Immunization experiments were performed in BALB / c (H-2d) mice females 6 to 8 weeks old at the time of first immunization.
2. Immunogens administered In this series of experiments were used alone or in combination the following immunogens:
microparticles PLA / p24 prepared according to the displacement protocol of solvent and adsorption of the patent application WO 2005/02787.
- alum / p24: Am (Imject Alum, Pierce, Catalog No. 77161) is mixed volume for volume (1: 1) with the p24 protein diluted in PBS. We administer a dose of 40 ltg of p24 per injection and per animal.
- MVA gag virus (Modified Vaccinia Virus Ankara, vaccinia virus attenuated, strain Ankara) which is recombinant for the gag gene of the VIE-1 virus, coding for the p24 protein.
The recombinant virus was constructed at Transgene, as shown in the example 1.
- gag DNA. The gag gene of sequence SEQ ID No. 1 has been cloned into the plasmid eukaryotic expression phCMV. DNA preparations without endotoxins and in big amount were made with the Gigaprep endotoxin-free kit from Macherey-Nagel.
DNA serves as a positive control because it is known only in mice administration by lane Intramuscular DNA can be used to induce a good cytotoxic response (CTL).
3. Immunizations 30 mice received 2 doses of the immunogens described in point 2 above at 0 and 3 weeks. The vaccine compositions received by each group of mice are indicated in Table 7 below. All injections were performed by subcutaneous except for DNA that has been administered intramuscularly.

Table 7 Dose Rate Number of Composition 1st injection 2'1 "injection mouse week 0 week 3 MVA gag 107 pfu PLA / p24 40 lug 5 B
PLA / p24 40 ltg MVA gag 107 pfu 5 C
MVA gag 107 pfu Alum / p24 40 lug 5 K
Alum / p24 40 lug MVA gag 107 pfu 5 L
PLA / p24 40 lug DNA gag 5 lug (IM) 5G
Alum / p24 40 lug DNA gag 5 lug (1M) 5M
Pfu = plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used. The Viral titre is expressed in pfu according to the viral stock assay technique used.
The animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and the blood and the spleen were collected for immunological analyzes.
4. Immunological analyzes Realized following the same protocols as in example 1. In addition, we have measured the humoral responses directed against the MVA using a ELISA technique. The protocol is identical to that used for the anti-p24 ELISA, except that MVA lysate is used in capture.
5. Results 5.1. The ELISPOT IFN-γ response against the Gag AMQ peptide Figure 13 shows the peptide specific ELISPOT IFN-γ responses.
Gag QMA. The y-axis represents the average number of cells secreting IFN-y of specific way in response to an 18h stimulation with the Gag AMQ peptide on a million cells stimulated. This answer was determined individually for each mouse. The number shown on this graph is the average calculated at from all the mice in a group (n = 5).
The ELISPOT IFN-y responses obtained during this experiment are more low than usual. This decrease is observed both for the groups tested and the groups controls, and is linked to the progress of the experiment. Because of this, as we seek to compare the different combinations between her, this experience remains interpretable and clearly shows that the composition PLA / p24 + MVA gag (C) induces a best secretion of IFN-γ measured by ELISPOT than the other groups tested, namely MVA gag + PLA / p24 (B), MVA gag + Alum / p24 (K), Alum / p24 + MVA gag (L).
5.2. The IL-4 ELISPOT response against the p24 protein Figure 14 shows ELISPOT IL-4 responses specific for protein p24.
The y-axis represents the average number of cells secreting IFN-y of specific way in response to 42h stimulation by the p24 protein on a million stimulated cells. This response was determined individually for each mouse. The number shown on this graph is the average calculated from all the mouse of a group (n = 5).
For the induction of an IL-4 ELISPOT response, the best immunogen is formed by the association MVAgag and PLA / p24 (B and C). Whatever the order administration of this composition, the IL-4 responses obtained are greater than those induced by MVA gag + Alum / p24 compositions (whatever the order) (K and L) PLA / p24 + DNAgag (G) and Alum / p24 + DNAgag (M). If we are interested now at the order of administration of the products, it is always the composition PLA / p24 +
MVAgag (C) which gives better results than the inverse combination, MVAgag + PLA / p24 (B).
5.3. The specific humoral response of the p24 protein Figure 15 shows the kinetics of appearance of humoral responses specific of the p24 protein. The y-axis represents the anti-p24 IgG titer measured by Capture ELISA p24; the scale of this axis is logarithmic. The title antibody has been determined individually for each mouse. The number presented on this graphic is the geometric mean calculated from all mice of a group (N = 5). S2 = week 2, S4 = week 4, S6 = week 6.
For the induction of a specific antibody response of the p24 protein, the better immunogen is again constituted by the combination MVAgag and PLA / p24 (B and C).
Whatever the order of administration of this composition, IgG titers anti-P4 obtained are 0.6 to 1.2 log higher at week 6 than those induced by MVA combinations gag + Alum / p24 (whatever the order) (K and L), PLA / p24 + DNAgag (G) and Alum / p24 +
DNAgag (M). If we are now interested in the order of administration of products is always the combination PLA / p24 + MVAgag (C) which gives better results that the inverse combination, MVAgag + PLA / p24 (B), but only 0.4 log.
5.4. The specific humoral response of the MVA virus Figure 16 shows the kinetics of appearance of humoral responses specific MVA virus. The y-axis represents the measured anti-MVA IgG titer by ELISA
MVA capture. The antibody titre was determined individually for each mouse.
The number shown on this graph is the geometric mean calculated from of all the mice in a group (n = 5). S4 = week 4, S6 = week 6.
In the PLA / p24 + MVAgag (C) and Alum / p24 + MVAgag (L) groups, MVA was been administered at week 3. As we can see in Figure 16, the anti-response MVA did not have time to set up at the time of the analysis, week 6. By cons in groups who received MVA injection first it is possible to measure the anti-vector response. Surprisingly, as early as 4 weeks, the anti-MVA is good lower in the MVAgag + PLA / p24 (B) group than in the MVAgag + group Alum / p24 (K). Moreover with the combination MVAgag + PLA / p24, the title anti-MVA
does not increase in time, which is not the case with the combination MVAgag +
Alum / p24.
In combination with MVA, PLA can limit the antibody response anti-MVA while this is not the case of the association MVA + Alum. It's about a property very interesting and very useful for immunization and vaccination.
Conclusion:
The compositions according to the invention PLA / p24 and MVAgag make it possible to induce better cellular and humoral responses than the Alum / p24 compositions and MVAgag. Of Moreover, they make it possible to limit the anti-vector response.

EXAMPLE 4 Administration of PLA / p24 and MVAgag Vaccine Compositions by intranasal route 1. Animal model Immunization experiments were performed in BALB / c (H-2d) mice females 6 to 8 weeks old at the time of first immunization.
2. Immunogens administered In this series of experiments were used alone or in combination the following immunogens:
microparticles PLA / p24 prepared according to the displacement protocol of solvent and adsorption of the patent application WO2005 / 027871.
- MVA gag virus (Modified Vaccinia Virus Ankara, vaccinia virus attenuated, strain Ankara) which is recombinant for the gag gene of the VIE-1 virus, coding for the p24 protein.
The recombinant virus was constructed at Transgene, as previously indicated.
3. Immunizations mice received 3 doses of the immunogens described in point 2 above at 0, and 20 days. The vaccine compositions received by each group of mice are indicated in Table 8 below. All injections were performed by intranasal.
Table 8 Dose Dose Dose Number of 1st injection 2'1 "injection 3'1" injection mouse day 0 day 10 day 20 PLA / p24 20 lug PLA / p24 20 lug MVA gag 107 pfu 5 MVA gag 107 pfu MVA gag 107 pfu PLA / p24 20 lug 5 Pfu = plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used. The viral title is expressed in pfu according to the assay technique of the viral stock used.
The animals were sacrificed 32 days after the first injection. The blood, the vaginal secretions, feces, spleen and genitalia (vagina) have been taken for immunological analyzes.
4. Immunological analyzes Performed according to the same protocols as in Example 1.
5. Results Summary of experimental data Table 9 Vaccine combinations PLA / p24, MVAgag, PLA / p24, MVAgag, MVAgag PLA / p24 Number of mice that developed a CIL response 2/5 2/5 % of lysis of CTL + mice 50% 45%
The ELISPOT measures the number of cells secreting the cytokine by 10E6 cells analyzed ELISPOT IFN-y, AMQ, blood 155 79 ELISPOT IFN-y, p24, blood 146 94 ELISPOT IL-4, AMQ, blood 50 10 ELISPOT IL-4, p24, blood 126 32 ELISPOT IFN-y, AMQ, vaginal 1550 754 ELISPOT IL-4, AMQ, vaginal 0 0 ELISPOT IL-4, p24, vaginal 0 0 Title to IgG anti-p24 serum (determined by 68 000 200 000 ELISA) Title in anti-p24 IgA vaginal secretions 18 8 (determined by ELISA) Title in IgG anti-p24 vaginal secretions 124 616 (determined by ELISA) IgA anti-p24 in feces (Absorbance at 450 J20 0.20 J20 0.18 nm, determined by ELISA) J32 0.02 J32 0.03 IgG anti-p24 in feces (Absorbance at 450 J20 0.17 J20 0.17 nm, determined by ELISA) J32 0.69 J32 0.60 Administration of PLA / p24 and MVAgag combinations intranasally allows to induce both a systemic immune response measured in the blood samples and of spleen, and a peripheral mucosal immune response, in particular to level of the urogenital tract. Each time, the two arms of the system immune are activated: it was possible to highlight at these two sites immune cellular and humoral directed against the p24 protein. The ability to induce a broad Peripheral response at the urogenital tract is an asset considerable for PLA / p24 and MVAgag combinations in targeted vaccine applications prophylactic or therapeutic.
Example 5 Immunization of mice with the vaccine combination microparticles PLA / beta-gal and MVA beta-gal virus 1. Animal model Immunization experiments were performed in BALB / c (H-2d) mice females 6 to 8 weeks old at the time of first immunization.
2. Immunogens administered In this series of experiments were used alone or in combination the following immunogens:
the PLA / betagal microparticles prepared according to the protocol solvent displacement described in the patent application WO2005 / 027871.
- the MVA beta-gal virus (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus of the attenuated vaccine, strain Ankara) which is recombinant for the E. coli lacZ gene, coding for the enzyme beta-galactosidase (beta-gal). The recombinant virus was built at Transgene, and product and purified as previously described.
3. Immunizations 35 mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above.
0 and 3 weeks. The vaccine combinations received by each group of mice are indicated in the following table 10. All injections were performed by subcutaneous.

Table 10 Code Dose Dose Number of mice 1 injection 2 1 injection week 0 week 3 PLA / beta- gal 40 PLA / beta-gal 40 5 = MVA beta- gal 10 pfu MVA beta- gal 10 ' pfu 5 O PLA / betal 40 g MVA beta- gal 107 pfu 5 MVA beta- gal 107 pfu PLA / beta-gal 40 g 5 PLA / beta- gal 40 ug + 5 MVA beta- gal 107 pfu PLA / beta- gal 40 ug + 5 MVA beta- gal 107 pfu PLA / beta- gal 40! Lig + PLA / beta-gal 40 ug + 5 MVA beta- gal 107 pfu MVA beta- gal 107 pfu Pfu = plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used. The Viral titre is expressed in pfu according to the viral stock assay technique used.
The animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and the blood and the spleen were collected for immunological analyzes.
4. Immunological analyzes The humoral response and cellular response were searched as follows:
- Cell response: after sacrifice of the mice, the rats were taken so sterile to prepare a cell suspension. The ISPOT allows you to determine the number of cells secreting a given cytokine in response to a specific stimulus.
We are interested in the Th1-type cytokine IFN-γ. Cell suspensions obtained at from the spleens were restimulated in vitro by the peptide TPH (TPHPARIGL¨
SEQ ID
N 3) for 20h to analyze the CD8 responses. ELISPOT plates wells with PVDF membranes (Multiscreen IP, Millipore) were coated by a anti-IFN-γ antibody. During the cancellation, suspensions of splenocytes have been incubated in these plates in order to capture cytokines secreted by each cell.
The spots corresponding to each cell secreting the cytokine of interest been revealed by a biotinylated detection antibody specific for the cytokine of interest.
- Humoral response: a blood sample was taken from the mice before their sacrifice. The presence of anti-beta- gal antibodies was determined by ELISA. Protein beta- gal has been used in capture and the specific antibodies present in the serum have been revealed by a polyclonal anti-mouse antibody as an antibody to detection which is a goat anti-mouse IgG antibody AffiniPure conjugated with peroxidase horseradish (H + L, Jackson Immunoresearch, Cat No. 115-035-062). The title is the opposite of the dilution for which gives an absorbance of 0.1 OD unit with the ELISA protocol used.
5. Results 5.1. The ELISPOT IFN-γ response against beta-gal TPH peptide The results are shown in Figure 17 which gives the ELISPOT responses IFN-specific for beta-gal peptide TPH. The y-axis represents the number means cells secreting IFN-γ specifically in response to a stimulation of 18h by the peptide beta-gal TPH on one million stimulated cells. This answer was determined individually for each mouse. The number shown on this chart corresponds to the average calculated from all mice in a group (n = 5).
These results highlight that it is possible to classify combinations vaccines into several categories based on ELISPOT IFN-y responses obtained. The better responses are induced by PLA + MVA combinations, in injection separate (0) or in two simultaneous injections (S). Intermediate answers are obtained with single injection of PLA + MVA at the same time (groups Q and R). The answers more are observed with groups containing only one PLA immunogen only (M) or MVA only (N).
So, in the beta-galactosidase model too, we were able to show that the vaccine combination PLA + MVA was better than the MVA + MVA combination for induce secretion of IFN-γ specific for the peptide TPH. Moreover the order Injection seems also be important because of all PLA + MVA combinations tested, this is the group 0, PLA then MVA which allowed to obtain the best result. He is at note that this is also the same combination that had proved the most effective in è model p24 (example 1).
5.2. The specific humoral response of the beta-gal protein The results are shown in Figure 18 which compares the kinetics of appearance of humoral responses specific to the beta-gal protein. The y-axis represents the anti-betagal IgG titre measured by beta-gal capture ELISA; the scale of this axis is logarithmic. The antibody titre was determined individually for each mouse. The number shown on this graph is the average calculated from all the mouse of a group (n = 5). S3 = week 3, S6 = week 6.
These results show that the best humoral responses are obtained for the PLA + PLA group (M). Titers induced in mice that received PLA
and MVA to each injection (S) are comparable. In groups 0, P, Q and R, the titles are lower about a log. Among all the combinations tested, the worst antibody inducer anti-beta-gal is MVA + MVA. In the beta-galactosidase model, as in the model p24, all combinations containing MVA and PLA induce a high title, greater than one log to the title induced by MVA alone.
As in Example 1 (p24) change an injection of PLA into MVA in a Vaccination schedule does not significantly affect antibody titres but allows to expand the cellular responses to those that are generated only by a PLA vector.
Even though PLA + MVA (S) immunization does not induce the best reply immune according to each type of response analyzed, overall it is the group for which we observe the broadest and most intense responses.
Example 6 Immunization of mice with the vaccine combination microparticles CPL / p24 and MVA virus gag 1. Animal model Immunization experiments were performed in BALB / c (H-2d) mice females 6 to 8 weeks old at the time of first immunization.
2. Immunogens administered In this series of experiments were used alone or in combination the following immunogens:
the CPL microparticles used in this work are formed by coprecipitation of two polysaccharides; chitosan (Mahtani chitosan PVT Batch 124) and sulphate dextran (Sigma: 31404). The two polymers are first dissolved in water at pH 4 containing 50 mM NaCl. The solutions are left under magnetic stirring during 12 hours before preparing the particles. Then 20 ml of the solution of 0.1% chitosan (Molar mass of 105000 g / mol and a degree of acetylation 9) are mixed with 9.35 ml of the 0.1% dextran sulfate solution. The default solution is paid quickly on the excess solution placed under magnetic stirring at 1000 rpm. The mixture is left 30 seconds on the stirrer at 500 rpm and then it is centrifuged for 30 minutes at 7,800 g. The supernatant is removed by flipping, the pellet is taken up in water then again centrifuged for 30 minutes at 8000 g. The resulting pellets are taken again in water and kept at room temperature with constant stirring. The particles obtained are characterized by size measurement (Coulter granulometer), and load (Zetasizer Malvern).
For the adsorption of the p24 protein on the CPLs, the p24 at 1 Wl in phosphate buffer 10 mM pH 5.7 is mixed volume for volume with CPL particles at 1% rate of solid or 0.5% final. Samples are stirred on a wheel at temperature ambient for 20 hours. After incubation, the tubes are recovered and centrifuged 10 minutes at 1800 g at 20 C. Supernatants are recovered and centrifuged minutes to 3000 g at 20 C to remove the particles that can remain in suspension, then the concentration in protein is determined using a BCA assay (BCA Protein Assay kit, Pierce: 23225).
The pellets are taken up in 400 μl of 10 mM phosphate buffer. The particles obtained are characterized by a measure of size and load.
- MVA gag virus (Modified Vaccinia Virus Ankara, vaccinia virus attenuated, strain Ankara) which is recombinant for the gag gene of the HIV-1 virus, encoding the p24 protein.
The recombinant virus was constructed at Transgene, and produced and purified as described previously.
3. Immunizations 35 mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above.
0 and 3 weeks. The vaccine combinations received by each group of mice are indicated in the following table 11. All injections were performed by subcutaneous.

Table 11 Code Dose Dose Number of mice 1st injection 2'1 "injection week 0 week 3 = CPL / p24 10 g CPL / p24 10 g = MVA gag 10 'pfu MVA gag 10' pfu / CPL / p24 10 g MVA gag 107 pfu W MVA gag 107 pfu CPL / p24 10 g 5 X CPL / p24 10 jig + MVA 5 gag 107 pfu Y CPL / p24 10 jig + MVA 5 gag 107 pfu CPL / p24 10 jig + MVA CPL / p24 10 jig + MVA 5 gag 107 pfu gag 107 pfu Pfu = plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used. The Viral titre is expressed in pfu according to the viral stock assay technique used.
The animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and the blood and the spleen were collected for immunological analyzes.
4. Immunological analyzes Performed according to the same protocols as in Example 1.
5. Results 5.1. The ELISPOT IFN-γ response against AMQ gag peptide The results are shown in Figure 19 which gives the ELISPOT responses IFN- y p24 AMQ peptide specific. The y-axis represents the average number of cells secreting IFN-γ specifically in response to a stimulation of 18h by the p24 AMQ peptide on one million stimulated cells. This answer was determined individually for each mouse. The number shown on this chart corresponds to the average calculated from all mice in a group (n = 5).
These results show that it is possible to classify combinations vaccines several categories depending on the ELISPOT IFN-y responses obtained. The best response is induced by the combination MVA + MVA (U). The second category contains the CPL + MVA combinations, in separate injection (V) or in two injections simultaneous (Z).
A single simultaneous injection of CPL and MVA (X and Y) is not enough effective for induce an IFN-γ ELISPOT response. Finally, the combination CPL +
CPL (T) is the least effective.
As for the association PLA + MVA, the association CPL + MVA is effective for induce an IFN-γ secretion specific for the AMQ peptide. injection simultaneous immunogens does not, however, improve performance compared to separate administration of 3 weeks (Z vs V).
5.2. The specific humoral response of the p24 protein The results are shown in Figure 20 which compares the kinetics of appearance of specific humoral responses of the p24 protein. The y-axis represents the title anti-p24 IgG measured by p24 capture ELISA; the scale of this axis is logarithmic.
The antibody titer was determined individually for each mouse. The number presented on this graph is the average calculated from all mouse of a group (N = 5). S3 = week 3, S6 = week 6.
The results show that, for groups that received 2 injections, all the combinations containing CPL and MVA (V, W, Z) or CPL alone (T) induce a title high (10E6), 2-3 log higher than the titre induced by MVA alone. However the combination CPL + MVA (V) is more efficient than the reverse injection order (W). In the groups having received only one injection of CPL and MVA (X and Y), the titles in antibodies are more weak, but still higher than what we get with MVA alone.
As for PLA + MVA, change a CPL injection into MVA
in a vaccination schedule does not affect antibody titers obtained but allows to significantly increase cellular responses to those that are generated only by a CPL vector.
Conclusions:
All of these examples allowed us to show that the combination of a bioresorbable colloidal synthetic vector, such as PLA, CPL, and a vector viral, as MVA and adenovirus, can induce effective and broad immune responses.
Of preferably, for the best efficiency, the combination should be administered in the order synthetic vector, then viral vector.

Claims (25)

REVENDICATIONS 51 1. Kit pharmaceutique comprenant :
¨ un vecteur synthétique colloïdal constitué de microparticules ou microsphères biorésorbables non toxiques comprenant un antigène protéique ou plusieurs antigènes protéiques, et ¨ un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour le ou les antigènes protéique(s) compris dans le vecteur synthétique. 1. A pharmaceutical kit comprising:
¨ a synthetic colloidal vector consisting of microparticles or non-toxic bioresorbable microspheres comprising an antigen protein or several protein antigens, and A viral vector comprising at least one nucleotide sequence encoding for the protein antigen (s) included in the synthetic vector. 2. Le kit pharmaceutique selon la revendication 1, pour une administration simultanée, séparée ou échelonnée du vecteur synthétique et du vecteur viral. 2. The pharmaceutical kit according to claim 1 for administration simultaneous, separate or staggered synthetic vector and viral vector. 3. Le kit pharmaceutique selon la revendication 1, pour une administration échelonnée du vecteur synthétique et du vecteur viral. 3. The pharmaceutical kit according to claim 1 for administration scaled synthetic vector and viral vector. 4. Le kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le kit est configuré pour une administration échelonnée du vecteur synthétique avant le vecteur viral. 4. The pharmaceutical kit according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the kit is configured for step administration synthetic vector before the viral vector. 5. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les microparticules ou microsphères sont préparées à partir d'au moins un polymère choisi parmi les poly(acides a-hydroxylés). 5. The kit according to any one of claims 1 to 4, characterized in that than the microparticles or microspheres are prepared from at least one polymer chosen from poly (α-hydroxy acids). 6. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les microparticules ou microsphères sont préparées à partir d'au moins un polymère naturel. 6. The kit according to any one of claims 1 to 5, characterized in that than the microparticles or microspheres are prepared from at least one natural polymer. 7. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les microparticules ou microsphères comprennent des antigènes protéiques de types différents, tout en étant associés à la même maladie. 7. The kit according to any one of claims 1 to 6, characterized in that that microparticles or microspheres include protein antigens from different types, while being associated with the same disease. 8. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend, en tant que vecteur viral, un adénovirus ou un poxvirus. 8. The kit according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it comprises, as a viral vector, an adenovirus or a poxvirus. 9. Le kit selon la revendication 8, caractérisé en ce que le poxvirus est le Modified Vaccinia Virus Ankara. 9. The kit according to claim 8, characterized in that the poxvirus is the Modified Vaccinia Virus Ankara. 10. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les antigènes protéiques sont d'origine virale ou bactérienne. 10. The kit according to any one of claims 1 to 9, characterized in that than Protein antigens are of viral or bacterial origin. 11. Le kit selon la revendication 10, caractérisé en ce que les antigènes protéiques d'origine virale sont des protéines du virus VIH. 11. The kit according to claim 10, characterized in that the antigens protein of viral origin are proteins of the HIV virus. 12. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'antigène protéique est un antigène associé à des tumeurs. 12. The kit according to any one of claims 1 to 9, characterized in that than the protein antigen is an antigen associated with tumors. 13. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le vecteur synthétique colloïdal a une taille submicronique. 13. The kit according to any one of claims 1 to 12, characterized in that than the colloidal synthetic vector has a submicron size. 14. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le vecteur synthétique colloïdal a un diamètre entre 150 et 900µm. 14. The kit according to any one of claims 1 to 12, characterized in that than the colloidal synthetic vector has a diameter between 150 and 900 μm. 15. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le vecteur synthétique colloïdal a un diamètre entre 250 et 700µm. 15. The kit according to any one of claims 1 to 12, characterized in that than the colloidal synthetic vector has a diameter of between 250 and 700 μm. 16. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le vecteur synthétique colloïdal est dénué d'agent stabilisateur et d'agent tensioactif. 16. The kit according to any one of claims 1 to 12, characterized in that than the colloidal synthetic vector is devoid of stabilizing agent and agent surfactant. 17. Le kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 comprenant au moins un excipient. 17. The pharmaceutical kit according to any one of claims 1 to 16 comprising at least one excipient. 18. Le kit pharmaceutique selon la revendication 17, caractérisé en ce que le au moins un excipient est identique ou différent pour le vecteur viral et le vecteur synthétique. 18. The pharmaceutical kit according to claim 17, characterized in that the at minus one excipient is the same or different for the viral vector and the vector synthetic. 19. Utilisation du kit tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la préparation d'un médicament. 19. Use of the kit as defined in any one of the claims 1 to 18 for the preparation of a medicine. 20. Utilisation du kit tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la préparation d'un vaccin prophylactique ou thérapeutique. 20. Use of the kit as defined in any one of the claims 1 to 18 for the preparation of a prophylactic or therapeutic vaccine. 21. Utilisation du kit tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour un traitement prophylactique ou thérapeutique chez un patient. 21. Use of the kit as defined in any one of the claims 1 to 18 for prophylactic or therapeutic treatment in a patient. 22. L'utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que le vecteur synthétique colloïdal et le vecteur viral sont un vaccin. 22. The use according to claim 21, characterized in that the vector colloidal synthetic and viral vector are a vaccine. 23. L'utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que les vecteurs sont adaptés pour une administration échelonnée dans le temps du vecteur viral et du vecteur synthétique. 23. The use according to claim 21, characterized in that the vectors are adapted for a time-scale administration of the viral vector and synthetic vector. 24. L'utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que les vecteurs sont adaptés pour une administration échelonnée sur une période de 3 ou 4 semaines. 24. The use according to claim 23, characterized in that the vectors are adapted for phased administration over a period of 3 or 4 weeks. 25. L'utilisation selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce que les vecteurs sont adaptés pour une administration du vecteur synthétique avant l'administration du vecteur viral. 25. The use according to claim 23 or 24, characterized in that the vectors are suitable for administration of the synthetic vector before the administration of the viral vector.
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