25 MÉMOIRE DESCRIPTIF
La rusticité et la persistance active de cellules BFCP, parfois appelée compétence édaphique et/ou saprophytique, voire, en anglais, « fitness in soit », et LE facteur clé
pouvant déterminer la réussite d'un protocole d'inoculation (de bactérisation) de sols, de résidus de culture au soi, de racines, de 30 semences et, dans le cadre de la présente invention, d'engrais organique et organo-minéraux (EO/EOM).
Or, cette rusticité est un phénomène mal compris étant donnée la complexité
des processus biologiques qui la sous-tendent. Sa mise en évidence directe et positive à l'aide de techniques biomolëculaires, qui présupposent souvent le jeu et l'expression de mécanismes relativement simples est donc à toutes fins pratiques hors de questions ici, du moins dans un avenir rapproché. Pourtant, son importance 35 agronomique et bioindustrielle demeure, et l'utilité des techniques pouvant en favoriser l'expression et/ou la sélection (obtention et rétention) est indéniable. Nous avons dans un précédent brevet cherché à
concevoir une telle technique permettant de retenir au sein de cultures mères de bactéries telluriques (CMBT) les souches BFCP les plus rustiques et donc en principe les mieux adatpées à la vie dans les sols arables. Nous décrivons ici une valorisation agronomique et bioindustrielle additionnelle de ces biomasses BFCP particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols. Du coup, nous proposons aussi une méthode analytique simple capable de révéler la dominance et la survie de ce type de bactéries malgré la bactéricidité de l'environnement proximal aux EOM enrichis de sels minéraux fertilisants. Du coup, l'invention permet la fabrication et l'utilisation agronomique d'EOM
bactérisés, dits EOMI (« I » pour inoculant), innovation notable dans le secteur des intrants à la production agronomique des grandes cultures.
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La fertilisation des cultures à l'aide d'engrais azotés, phosphatés et potassiques de synthèses chimiques, ou NPK, constitue un avancé important en agriculture mais est associée aujourd'hui à bon nombre de soucis agro-environnementaux que cherche à adresser les EO/EOM, et plus particulièrement, les EOMI (i.e. EOM + inocula BFC~ bactérisés tel que proposés ici.
Premièrement, l'efficacité
agronomique marginale de NPK décroït a mesure que les augmentations de rendements qui leurs sont attribuables augmente. Cela provoque un engorgement des sols en NPK augmentant ainsi le risque que ces minéraux hautement solubles soient entraînés vers les nappes phréatiques contribuant ainsi massivement à la pollution diffuse d'origine agricole. Deuxièmement, cette très grande solubilité des engrais NPK, et de certains pesticides, constitue en soi un certain risque de pollution agro-environnementale. Ces caractéristiques de la fertilisation NPK des grandes cultures contribuent en partie à augmenter le risque de pollution des sols, mais surtout de l'eau, par les nitrates et les phosphates.
Afin de réduire les impacts agro-environnementaux des fertilisations azotées et phosphatées, il existe en principe une gamme de mesures d'intervention. Sans toutes les énumérer, dans l'ensemble il s'agit de mieux régir l'utilisation des engrais NPK en favorisant notamment leur absorption par les cultures via la modification de leur chimie in situ et ou une meilleure estimation des besoins actuels de la culture de façon à éviter les surdoses.
La bactérisation des EO/EOM est en ce sens souhaitable et utile d'un point de vue agronomique.
En effet, elle permet d'une part de conférer une tripe action organique, minérale et bactérienne aux engrais de démarrage, et d'autre part facilite le conditionnement et le transfert vers les cibles des inocula BFCP, notamment en ce qui concerne les cultures non-Leguminosea, les enfants pauvres du secteur bioindustriel des inocula microbiens destinés à l'agriculture. Cette valorisation microbiologique des EOM
permet donc de réduire sensiblement la quantité de phosphore apporté au démarrage de la culture. En effet, les EOM bactérisés ou non, sont nécessairement moins concentré en P que les engrais de démarrage conventionnels ; à doses hectare équivalents, les EOM réduisent donc l'apport de P au démarrage et procure ainsi à l'utilisateur une certaine marge de manoeuvre le temps venu d'apporter des compléments d'engrais organiques, de biosolides, voire de lisiers en cours de saisons, tout en respectant, et cela est ici primordial, les bilans massiques NPK qui leurs sont dictés par d'éventuels plans agro-environnementaux de fertilisation, PAEF, et/ou toutes autres réglementation agro-environnementale. A
efficacité égale, les EOM bactérisés selon la présente invention permettent de réduire sensiblement les quantités d'intrants phosphatés nécessaire au démarrage des cultures ouvrant donc ainsi la prote à une valorisation respectueuse de l'environnement à la fermer des autres matièrs organiques, fumiers, lisiers, biosolides, matières résiduelles fertilisantes (MRF), etc. dont l'écoulement et la gestion sont souvent problématiques autrement.
La biofertilisation à l'aide d'EOlEOM et J'inocula BFCP - l'état de la technique Selon Parent (2003), les EOM ne sont pas qu'une mélange mécanique de granules de matières organique et minérales. Les matières minérales et organiques doivent être prémélangées et granulées ensemble pour augmenter le contenu nutritif et la densité des granules (selon Parent et al. 2000 par exemple). Le contenu minimal requis est de 7,5% de carbone dans la composition de la granule ; ceux qui ne contiennet pas de substances minérales exogènes sont donc appelés engrais organiques (E0) granulés. En principe, et selon Parent (2003), l'interaction entre les ligands organiques (matières organiques) des EO/EOM et les sites de fixation normalement occupés par de l'orthophosphate (le phosphate) dans le sol permet en d'en améliorer l'efficacité élémentaire. Pour l'essentielle, ces sites de fixations sont des hydroxydes de fer et d'aluminium ainsi que le calcium. En occupant ces sites de fixation, ces ligands augmentent indirectement la disponibilité et donc l'assimilation des orthophosphates par la plante.
La biofertilisation par inoculation de bactéries favorisant la croissance des plantes, ou BFCP, des cultures Leguminosea est déjà bien conçue et a fait l'objet d'un important développement bioidustriel (Bashan 1998). Or, cela est loin d'être le cas pour les cultures non-Leguminosea. L'efficacité
agronomique des BFCP pour cultures non-Leguminosea est en général fortement limitée par la quantité
d'exsudats racinaire produits au cours de la saison (Lynch et Whipps 1990 ;
Alden et al. 2001 ). En présence de grandes quantités de résidus de culture cette limitation peut être contournée dans la mesure où les BFCP sont appliquées directement par pulvérisation sur les résidus de culture, résidus de culture qui sont ainsi valorisés comme substrats carbonés et énergétiques (Claude et Fillion 2004 ; Claude 2001 ).
En absence de telles quantités de résidus de culture, le problème demeure entier, et l'utilité agronomique des BFCP pour cultures non-Leguminosea limitée.
Traditionnellement, et en l'absence d'une abondance de résidus de culture cellulosiques au moment des semis, la bactérisation-BFCP des grandes cultures non-Leguminosea ce fait par pelliculage des semences avec un inoculum conçu à cet effet (Bashan 1998). Une telle bactérisation des semences peut être problématique étant donné la bactériocidité de certains composés chimiques utilisés pour le traitement phytosanitaire des semences. De façon plus générale, les bactéries utilisées pour la bactérisation des semences non-Leguminosea manquent de compétence édaphique et sont relativement mal adaptées à la vie dans les sols (Van Veen et al. 1997).
II est donc aujourd'hui utile d'effectuer cette biofertilisation par bactérisation par des voies alternatives, notamment, via la bactérisation à l'automne des résidus de culture au sol, s'il y a (Claude et Fillion 2004 ; Claude 2001 ; Claude 1997). Dans le cas contraire, et grâce à
la présente invention, il est aussi possible d'envisager la bactérisation d'EO/EOM à l'aide d'inocula bactériens avantageusement produits, formulés et conditionnés à l'état solide, et incorporée aux EO/EOM
soit par voie de pelliculage, soit, si loisible et avantageux, par intégration de ces inocula directement au pré-mélanges au cours de leurs procédés de fabrication.
Les engrais de démarrage - un marché
La fertilisation localisée consiste à appliquer une partie des engrais à
proximité de la semence au moment du semis, soit au démarrage de la culture. Cette pratique est avantageuse dans les sols pauvre IS en phosphate assimilable et/ou très acides, là où le phosphore est peu mobile dans le sol et facilement immobilisée par les composées de fer et d'aluminium (CPVQ 1988). Ces engrais, dits engrais de démarrages, sont avantageux pour la réalisation de la présente invention. Ils sont généralement de deux types (Craaq 2003) ;
1. à base de mono- ou di-ammonium phosphaté (MAP et DAP, respectivement) Hardiness and active persistence of BFCP cells, sometimes called edaphic competence and / or saprophytic, or even, in English, "fitness in itself", and THE key factor can determine success an inoculation (bacterization) protocol for soils, crop residues self, of roots, of Seeds and, in the context of the present invention, of organic fertilizer and Organo-minerals (EO / EOM).
However, this rusticity is a poorly understood phenomenon given the complexity biological processes which underlie it. Its direct and positive highlighting with the help of biomolecular techniques, which often presuppose play and the expression of relatively simple mechanisms so is for all purposes practices out of issues here, at least in the near future. However, his importance 35 agronomic and bioindustrial remains, and the usefulness of to promote the expression and / or the selection (obtaining and retention) is undeniable. We have in a previous patent sought to design such a technique to retain within parent cultures of telluric bacteria (CMBT) the most hardy BFCP strains and therefore in principle the best adatpated to life in the arable soils. Here we describe an agronomic valuation and additional bioindustrial of these biomasses BFCP particularly well suited to life in soils. So, we also offer a simple analytical method capable of revealing the dominance and survival of this type of bacteria despite the bactericidal environment proximal to EOMs enriched with salts fertilizing minerals. Of Therefore, the invention allows the manufacture and agronomic use of EOM
the so-called EOMI ("I" for inoculant), a notable innovation in the production input sector agronomic cultures.
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Fertilization of crops with nitrogen fertilizers, phosphates and potassic syntheses Chemicals, or NPK, is an important advance in agriculture but is associated today with good number of agri-environmental concerns that EO / EOM seeks to address, and more particularly, the EOMI (ie EOM + inocula BFC ~ bactericidal as proposed here.
First, the effectiveness Marginal Agronomic Analysis of NPK decreases as increases in yields that are attributable increases. This causes congestion of NPK soils increasing so the risk that these highly soluble minerals are driven to groundwater thus contributing massively to diffuse pollution of agricultural origin. Second, this very high solubility of NPK fertilizers, and certain pesticides, constitutes in itself a certain risk of agro-pollution Environmental. These characteristics of NPK fertilization of large crops contribute in part to increase the risk of pollution of the soil, but especially of water, by nitrates and phosphates.
To reduce the agro-environmental impacts of nitrogen fertilization and phosphates, he In principle, there is a range of intervention measures. Without all enumerate, overall it The aim is to better regulate the use of NPK fertilizers by promoting their absorption by crops through the modification of their in situ chemistry and / or a better estimate of current needs of culture so as to avoid overdoses.
The bacterization of EO / EOM is in this sense desirable and useful from a point of agronomic view.
Indeed, it allows on the one hand to confer a tripe organic action, mineral and bacterial starter fertilizer, and on the other hand facilitates the conditioning and transfer to inocula targets BFCP, particularly with respect to non-leguminous cultures, children poor people bioindustrial microbial inocula for agriculture. This microbiological valuation of EOM
therefore significantly reduces the amount of phosphorus starting the culture. In indeed, EOMs that are bactericidal or not, are necessarily less concentrated in P than fertilizers conventional startups; in equivalent hectare doses, the EOMs therefore reduce the contribution of P to start-up and thus provides the user with a certain leeway on the time to bring supplements of organic fertilizers, biosolids or even slurries seasons, while respecting, and this is primordial here, the NPK mass balances that are dictated to them by possible agricultural plans Environmental Fertilizer, PAEF, and / or any other regulation agri-environmental. AT
equal efficiency, the bacterial EOMs according to the present invention make it possible to significantly reduce quantities of phosphatic inputs needed to start opener crops so so the prote at a eco-friendly valorization to the closing of other materials organic, manure, slurry, biosolids, fertilizing residual materials (FRM), etc. whose flow and management are often problematic otherwise.
Biofertilization using EOlEOM and Iinocula BFCP - the state of the technical According to Parent (2003), EOMs are not just a mechanical mixture of granules of materials organic and mineral. The mineral and organic materials must be premixed and granulated together to increase the nutrient content and density of the granules (according to Parent et al. 2000 by example). The minimum content required is 7.5% carbon in the composition granule; those which do not contain exogenous mineral substances are therefore called organic fertilizers (E0) granules. In principle, and according to Parent (2003), the interaction between ligands organic matter EO / EOMs and the attachment sites normally occupied by orthophosphate (the phosphate) in the soil makes it possible to improve its elementary efficiency. For the essential, these sites of Fixations are hydroxides of iron and aluminum as well as calcium. In occupying these sites fixation, these ligands indirectly increase the availability and therefore orthophosphate assimilation by the plant.
Biofertilization by inoculation of bacteria favoring the growth of plants, or BFCP, Leguminosea crops is already well-designed and has been the subject of an important bio-industrial development (Bashan 1998). However, this is far from the case for non-Leguminosea. The effectiveness The agronomic data of BFCP for non-leguminous cultures is generally strongly limited by quantity root exudates produced during the season (Lynch and Whipps 1990;
Alden et al. 2001). In presence of large amounts of crop residues this limitation can be bypassed to the extent where the BFCP are applied directly by spraying on residues of culture, crop residues which are thus valued as carbon and energy substrates (Claude and Fillion 2004; Claude 2001).
In the absence of such amounts of crop residues, the problem remains whole, and agronomic utility BFCPs for non-Leguminosea crops limited.
Traditionally, and in the absence of an abundance of crop residues cellulosic time of sowing, Bacterization-BFCP of non-Leguminosea this is done by filming seeds with an inoculum designed for this purpose (Bashan 1998). Such a bacterization of seeds may be problematic given the bacteriocidal nature of certain compounds chemicals used for the phytosanitary treatment of seeds. More generally, bacteria used for the bacterization of non-Leguminosea seeds lack edaphic competence and are relatively poorly adapted to life in soils (Van Veen et al 1997).
It is therefore useful today to carry out this biofertilization by bacterization by pathways alternatives, in particular, via the bacterization in autumn of residues from growing on the ground, if there is (Claude and Fillion 2004; Claude 2001; Claude 1997). If not, and thanks to the present invention, it is also possible to consider the bacterization of EO / EOM using inocula advantageously products, formulated and packaged in solid form, and incorporated into EO / EOM
either by laminating, or, if it is possible and advantageous, by integrating these inocula directly into the pre-mixes during their manufacturing processes.
Starter fertilizers - a market Localized fertilization involves applying part of the fertilizer to proximity of the seed to time of sowing, ie at the start of the crop. This practice is advantageous in poor soils IS in assimilable phosphate and / or very acidic, where the phosphorus is little mobile in the ground and easily immobilized by compounds of iron and aluminum (CPVQ 1988). These fertilizers, so-called fertilizer starts, are advantageous for carrying out the present invention. They are usually two types (Craaq 2003);
1. mono- or di-ammonium phosphated (MAP and DAP, respectively)
2. à base d'urée (Alkanani et MacKenzie 1996) Dans le premier cas il s'agit de réduire le contact engrais / sol de façon à
réduire le degré de fixation physico-chimique sur les sites d'oxy-hydroxydes de fer et d'aluminium, et dans le deuxième cas le degré de volatilisation de l'urée sous forme d'ammoniaque. En générale, les réactions acide-base et les phénomènes d'osmolyses à proximité des granules contenant des minéraux de N et de P peuvent nuire à
la viabilité de BFCP réintroduites en leurs proximités. Étant donnée la forte teneur en matière organique des EOM, teneur en carbone préjudiciable à leur efficacité pondérale par rapport aux engrais NPK, la réactivité immédiate des granules est réduite ainsi que la mortalité de BFCP
éventuellement réintroduites en leurs proximités.
Au Québec et au Canada c'est le marché des engrais de démarrage phosphatés qui, dans un premier temps, semble le plus porteur pour les EOM bactérisés (EOMI). De 10 à
15 millions d'unités (i.e.
kg P205 / ha) sont vendus au Québec et plus de 20 millions en Ontario, soit environ le quart des unités d'engrais phosphatés normalement consommés sur le marché ; le marché canadien dans son ensemble est de l'ordre de 125 millions $Cad. Le marché français s'élève à plus 150 millions d'unités. La valeur de remplacement basée sur le prix de 1 kg de P205 et d'environ 1,00 $CAD. Pour l'essentiel, faute d'une efficacité pondérale comparable à celles des engrais de démarrage minéraux de synthèse, la pénétration de ce marché par les EO/EOM demeure aujourd'hui marginale. C'est précisément cette efficacité
pondérale que permettra d'améliorer la présente invention.
La biofertilisation à l'aide d'EOlEOM bactérisés avec des BFCP - la problématique II serait avantageux de combiner l'épandage des engrais de démarrage P et des inocula BFCP.
En effet, l'accumulation du phosphore en réaction avec le calcium, le fer et/ou l'aluminium du sol est un phénomène marqué dans beaucoup de sols agricoles (Beauchemin et Simard 1999 ;
Zhang et al. 1995 ;
Giroux et al. 2002 ; Pellerin 2003). Cette accumulation entraîne une augmentation de la charge polluante de ces sols, et représente donc un sérieux problème agro-environnemental dans plusieurs cas (Khiari et al. 2000). De plus, les sols riches en phosphore peu ou pas solubles, tant en France qu'au Québec, comme de raison répondent mal à la fertilisation - P (eg. Chabot et al. 1998 ;
Craaq 2003). Ainsi, sur les sols ayant des indices (P/AI)M3 supérieurs à une certaine valeurs critique préétablit pour ce type de sol, la probabilité de réponse aux engrais phosphatés est généralement faible (eg.
inférieure à 20°/a selon le Craaq 2003). L'invention permet d'améliorer cette réponse via l'action des BFCP.
Dans des sols dit relativement riches en P l'efficacité des engrais P est donc limitée bien que rien n'indique que le plein potentiel de rendement de la culture n'ait été atteint.
La valorisation du P et plus particulièrement des engrais P sur ces sols est donc incomplète. En générale, l'efficacité agronomique de la fertilisation P sur ces sols, forts répandus dans bon nombre de régions agricoles tempérées tant au Québec qu'en France (Beauchemin et Simard 1999), peut être partiellement améliorée à l'aide de deux techniques ;
o l'utilisation d'engrais organo-minéraux, ou EOM (Khiari et Parent 2003 ;
Parent 2003) ;
o la bactérisation de rhizosphères à l'aide de BFCP (Antoun et al. 1998 ;
Chabot et al. 1993, 1996).
Ces deux techniques par contre souffrent actuellement de plusieurs problèmes d'ordre technique qui limitent leurs efficacités et donc leur déploiement et leur utilisation par l'agriculteur. L'efficacité
agronomique des inocula BFCP est minée par ; une insuffisance de carbone à
proximité des racines (Lynch et Whipps 1990 ; Alden et al. 2001 ), une certaine bactériocidité de certains produits phytosanitaires et une compétence édaphique insuffisamment recherchée (Van Veen et al. 1997).
L'efficacité agronomique des EOM, et surtout des EO, est limitée par une mauvaise efficacité pondérale étant donné leurs teneurs en matière organique, soit de l'ordre de cinq à six fois leurs teneurs en P205 (Khiari et Parent 2003). L'invention propose de combiner ces deux concepts et d'ainsi surmonter ces limitations, notamment en vue d'utiliser ces nouvelles matières fertilisantes en tant qu'engrais de démarrage.
Cependant, la valorisation des EQ/EOM par bactérisation-BFCP a été ce jour limitée du fait de certains freins technologiques, dont l'incompétence des souches BFCP utilisées à la vie dans les sols, notamment en présence de fortes osmolarités en proximité des engrais de démarrage, la difficulté
d'obtenir à faible coûts des formulations solides de celles-ci, et enfin les coûts relativement élevés associées au pelliculage de MRF ultimes. La présente invention ce propose donc de résoudre ces problèmes et du coup permettre la fabrication et l'utilisation économique d'EOMI (i.e. EOM + inocula BFCP). Cette triple problématique peut donc ëtre résolue via une double mise en contacte des cellules BFCP. En effet, il est possible de résumer schématiquement (essentiel de cette invention en évoquant une double mise en contacte bactéries - biosolides ; la première servant à
dynamiser les cinétiques de croissance des cellules BFCP sélectionnées comme constituantes de l'éventuel inoculum solide, et la deuxième servant a assurer le conditionnement et l'expédition de celles-ci vers les cibles in situ, notamment ici les engrais organo-minéraux (EOM) destinés au démarrage des cultures (Figure 1). Du coup, nous sommes en mesure d'assurer la fabrication d'un EOMI (i.e. EOM +
inocula BFC>~ à triple action, organique, minérale et bactérienne.
Beaucoup de sols agricoles, notamment au moment des semis de printemps, ont à
leurs surfaces peu ou pas de résidus de culture. Les sols pauvres en résidus de cultures au moment des semis sont aussi peu propices à la biofertilisation des cultures non-Leguminosea à l'aide J'inocula BFCP. En effet, et en principe, étant donnée le manque de symbioses effectives entre les BFCP et la culture non-Leguminosea, lesdites cellules BFCP auraient avantage à utiliser les résidus comme substrats carbonés et énergétiques, ce qui dans ce cas est impossible. Bien que dans de telles situations l'apport exprès de résidus de culture exogènes par l'agriculteur est impensable agronomiquement parlant, l'apport d'amendements de sols lui est, par contre, recommandable. Cependant, les doses hectare requises sont généralement de l'ordre de 10 Mg par hectare ou plus (N'Dayegamiye 2000), et la bactérisation BFCP de telles quantités de matières n'est pas économique, soit inefficace étant donné
la très grande quantité de cellules bactériennes qui leur sont associées et qui sont capables de masquer l'action in situ des BFCP
réintroduites. La bactérisation d'une plus petite quantité d'amendements sous forme de biosolides, de biomasses, de matières résiduelle fertilisantes, et plus particulièrement et avantageux, d'EO/EOM doit donc être envisagées. Étant donnée l'utilité d'apporter qu'une petite quantité
de matières organiques exogènes, notamment sous la forme d'EO/EOM, il est nécessaire de placer celles-ci et les BFCP à
réintroduire qu'elles pourraient contenir, à proximité des semences à l'aide d'un semoir combiné, un peu comme on le fait pour les engrais de démarrage. D'où un certain avantage d'utiliser des EO/EOM
destinés au démarrage de cultures agronomiques non-Leguminosea comme support et expédiant pour les dites BFCP. La présente invention se rapporte surtout mais non exclusivement cette dernière solution technique nécessaire à la bactérisation in sifu de cultures non-Leguminosea lorsqu'il y a peu ou pas de résidus de culture au sols au moment des semis ; les cas avec résidus de culture au sol au moment des semis a précédemment fait l'objet de notre brevet FR 2 833 016 (Claude 2001 ;
Claude 2003) et a été
rapporté par Claude et Flllion (2004).
Donc, bien que les inocula BFCP et les EO/EOM existent séparément, il serait avantageux de les combiner en un seul produit afin d'en facilité l'utilisation agronomique.
Cependant, et à ce jour, ce rapprochement salutaire a été impossible, étant donnée l'absence de cellules BFCP rustiques et véritablement adaptées à la vie dans les sols et capables de résister à un certain stress osmotique, d'une part, et d'autre part étant donnée l'indisponibilité d'inocula BFCP rustiques de ce type formulés à l'état solide et produit économiquement par fermentation à l'état solide. Des cellules BFCP véritablement telluriques et donc suffisamment rustiques pour survivre aux stresses physico-chimiques propres à une telle adjonction sont donc ici indispensables. Or, la mise en oeuvre de notre précédent brevet, FR 2 833 016 (Claude 2001 ), permet d'obtenir ce type de cellules, qui sont du coup non seulement rustiques et bien adaptées à la vie dans les sols, mais aussi capables de mieux résister au stress physico-chimiques en présence proximale des granules d'engrais, même d'EO/EOM, bien que dans ce cas le stress soit moindre. De plus, des inocula formulés à l'état solide et produits économiquement sont nécessaire afin de rendre économiquement rentable la bactérisation d'EO/EOM. Or, dans le cadre de la présente invention nous avons effectivement mis au point un procédé de fermentation et formulation à l'état solide, ou FFES, valorisant la compétence édaphique des cellules bactériennes obtenues selon FR 2 833 016.
Pour ce faire, nous avons introduit de fines particules de sol en plus du substrat cellulosique normalement présent. En effet, il est reconnu que dans le sol c'est surtout les particules fines, avantageusement moins de 200 micromètres, qui sont le plus associées aux biomasses bactériennes du sol (Mills 2003 ; Jocteur-Monrozier et al. 1991; Chenu 1993). Mieux, la présence de ces fines particules de sols au cours de la FFES peut non seulement valoriser la compétence édaphique des BFCP isolées selon FR 2 833 016, mais y contribuer. En effet, selon Van Dyke et Prosser (1998 et 2000) il est possible d'induire la rusticité
de cellules bactériennes telluriques déjà isolées en les mettant en contact avec des matières inertes, organiques et inorganiques dépourvues pour l'essentiel de matières nutritives.
D'autres problèmes d'ordre technique ont aussi empêché cette combinaison d'EO/EOM et d'inocula BFCP ;
~ Premièrement, Bactériser directement des engrais NPK n'a put être réalisée parce que les réactions chimiques à proximité des granules nuisent à la viabilité des BFCP ainsi réintroduites en leurs proximités. En effet, fosmolarité (i.e. la somme des pressions osmotiques attribuable à l'ensemble des espèces chimiques en solution) en proximité des granules est un stress déterminant que doivent affronter les cellules BFCP incorporées aux éventuels EOMI. Plusieurs études démontrent le rôle prépondérant de l'enveloppe d'exopolysaccharide (EPS), ou « glycocalyx », de bactéries du sol dans le contrôle de la diffusion d'ions, de l'eau, de substrats carbonés, etc., et donc vraisemblablement bien que non - démontré sans équivoque, dans la résistance à un éventuel choc osmotique provoquée par une trop forte concentration immédiate de sels minéraux fertilisants. Cela dit, il existe néanmoins quelques publications sur l'effet osmo-régulatrice des alginates (Alg) produites par certaines BFCP du genre Pseudomonas, sans pour autant que les concentrations salines soient aussi élevées qu'elles le sont en proximité desdites granules (Hart et al. 2001 ;
Chenu et Roberson 1996 ;
Schnider-Keel et al. 2001 ; Miller et Wood 1996 ; Hartmann et al. 1991 ). Par exemple, selon Schnider-Keel et aL (2001 ), une teneur en sels (NaCI) maximale de 0,6 M est suffisante pour atténuer sévèrement la croissance des Pseudomonas ; dans le cas d'un EOM enrichit de 25% de sels MAP, la molarité du MAP est elle d'environ 3,00, soit cina fois la molarité du NaCI
utilisée par Schnider-Keel et al. (2001). Dans les faits, cette molarité de 0,6 M NaCI est probablement bien plus élevée que celle dans la solution du sol. II en demeure donc que le stress osmotique en proximité de granules EOM
enrichis est considérablement plus fort qu'il ne l'est dans la solution du sol. Selon nos calculs, nous estimons que la molarité des sels conséquents (i.e. ammonium, phosphate, sodium, chlore, etc.) en proximité d'une granule d'EOM enrichit à 25% de MAP est d'environ de 3, soit 30 à 60 fois ce qu'elle est dans la solution du sol (cf. Miner et Wood 1996). La question est donc ;
les cellules BFCP
1o incorporées aux EOMI peuvent elles survivre et rester activité et efficaces malgré ce stress, du moins le temps nécessaire pour qu'il ce dissipe, soit, disons une période de 6 à 10 jours ?
~ Deuxièmement, adjoindre les BFCP directement aux EO/EOM au cours de certains type de procédés de fabrication (Parent et al. 2000 ; Marcoux et al. 1992) est impraticable étant donnée la nature de ces procédés impliquant généralement de hautes températures et des pressions hydrostatiques 15 relativement importantes nécessaires pour la cuisson et la consolidation des granules formés par extrusion, températures et/ou pressions en principe contraires à une quelconque bactérisation. II faut noter ici, que la résistance de bactéries à certains chocs thermiques et reliée à leurs résistance aux pressions hydrostatiques (Aertsen et aL 2004) ; fait notable en ce qui concerne les susdits procédés de fabrïcations.
20 ~ Troisièmement, ce type de bactérisation est aussi limitée par l'utilisation de cellules BFCP mal adaptées a la vie dans les sols (Van Veen et al. 1997) et donc incapables de persister dans le temps et d'utiliser la source de carbone que représente la fraction organique des EOM.
~ Quatrièmement, il faudra aussi pouvoir produire économiquement ces BFCP et cela préférablement par fermentation à l'état solide de façon à obtenir du coup une formulation solide de celles-ci, moins 25 enclin à faire subir aux bactéries qu'elles contiennent un choc au moment de leur combinaison après la mise en contact avec les EO/EOM.
En ce sens, une précédente demande de brevet (W0 02/057862 A2) exige, par exemple, pour l'incorporation de microorganismes à des granules de biosolides que ceux-ci soient incorporés 30 séquentiellement à l'une des multiples couches encapsulant lesdites granules. Cette approche peut être limitative et causer problème pour des granules non - sphériques, ou encoure pour des granules ne comportant de couches multiples encapsulant un certain noyau. 11 existe aussi une technologie française (FR 2 615 203) permettant la fabrication d'un inoculum sous la forme de granules comprenant un noyau consistant en une matrice nourricière enrobant les microorganismes à inoculer.
Or, cette technologie 35 n'est pas assimilable à la fabrication d'EO/EOM et/ou de leurs précurseurs biosolides ; elle ne concerne donc pas directement la présente invention.
Or, la bactéricidité de ces granules, même s'ils sont de type EOM, est peu ou pas documentée dans la littérature scientifique. Neilsen et al. (1994) parlent de l'utilité
d'apporter des bactéries et du MAP
conjointement à un amendement organique pour l'implantation de cultures horticoles, sans pour autant que ne ce pose la question de la bactéricidité du MAP à ce stade. Gaind et Gaur (2002) eux notèrent que s l'apport de Pseudomonas striata à des cendres d'origine minière, à hauteur de 40 tonnes par hectare, ne fut pas bactéricide, et cela malgré la présence d'engrais phosphatés dans le mélange. Les doses hectare de cendre permirent effectivement de diluer l'engrais P lui évitant d'interagir trop directement avec les BFCP. Enfin, Lima et L. (1996) eux rapportèrent l'effet de la fertilisation phosphaté sur les populations bactériennes, mais pour l'ensemble du sol, sans ce préoccuper particulièrement de l'environnement en proximité des granules d'engrais. Donc, à proprement parler, la bactéricidité
de l'environnement proximal des granules d'EO/EOM, voire des granules de MAP/DAP, ne fait part partie des bases de connaissances actuelles, et/ou de l'état de la technique.
Activité inventive 1s La présente invention permet de combiner avantageusement des inocula BFCP et des EO/EOM, créant ainsi une nouvelle matière fertilisante à triple action, minérale, organique et bactériologique, très avantageuse pour le démarrage de cultures non - Leguminosea, notamment sur sols dont le degré de saturation en phosphore est moyennement élevé et/ou ayant peu ou pas de résidus de culture au sol au moment des semis. Du coup elle permet de mieux valoriser des BFCP
particulièrement bien adaptées à
la vie dans les sols et à résister à de fortes pressions osmotiques, ainsi que le carbone organique des EO/EOM. L'invention permet aussi de résoudre certains problèmes d'ordre bioindustriel nuisant au pleine développement de la biofertilisation comme pratique agricole courante.
Ni engrais de synthèse, ni compost, ni simple inocula bactérien, nous proposons ici de contribuer au développement d'un biofertilisant à triple action, minérale, organique et bactérienne, produit par voie d'un bioprocédé intégrant des granules d'EO/EOM et des biomasses bactériennes d'origines telluriques particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols. Ce biofertilisant nouveau sera d'autant plus capable de se substituer en partie aux engrais de synthèse chimique normalement utilisés en grandes cultures agronomiques à titre d'engrais de démarrage. Dans l'immédiat, et à titre d'exemple non restrictive, nous proposons de mettre au point un tel bioprocédé mixte à l'aide de granules d'EO/EOM, et/ou de leurs précurseurs organiques, par co-formulation de ceux-ci avec des bactéries BFCP
capables de solubiliser le phosphore du sol (Chabot et al. 1993 ; Rodriguez et Fraga 1999). Cela devra permettre d'accroître la production des systèmes de cultures ainsi fertilisés et d'apporter du coup une plus grande valeur ajoutée aux EO/EOM les rendant ainsi plus compétitifs à l'égard des engrais NPK ;
cette plus grande valeur 3s ajoutée favorisera l'écoulement de leurs stocks ainsi que ceux des MRF à
partir desquelles ils sont constitués.
Des matières fertilisantes à triple action - minérale, organique et bactérienne - sont particulièrement utiles étant donné l'action synergique entre la composante organique des EO/EOM et les BFCP, d'une part, et d'autre part la possibilité de biofertiliser des cultures non-Leguminosea en absence de résidus de culture au sol ayant pu faire office de substrats carbonés. De plus, cette triple-action rend les sols normalement perçus comme saturés en phosphore plus propices à la fertilisation phosphatée et donc à une augmentation de leurs potentiels de rendements.
Double mise en confact biosolide-BFCP - une double valorisation des BFCP «
compétentes »
10 La rusticité et la compétence édaphique (i.e. adaptation à la vie dans les sols) de bactéries telluriques de type BFCP et isolées de sols arables selon FR 2 833 016 (Claude 2001 ) peuvent maintenant être doublement valorisées. Une première fois au cours de ladite fermentation et formulation à l'état solide, ou FFES, partie intégrante de la présente invention, et cela à travers une première mise en contact de ces bactéries et de fines particules solides de sols capables de dynamiser la production bio -industrielle de ces microorganismes. Une deuxième valorisation de cette rusticité et cette adaptation à la vie dans les sols que possèdent lesdits microorganismes est possible par une deuxième mise en contact des cellules ainsi produites FFES et des EO/EOM, voire tout aussi avantageusement leurs pré-mélanges.
II est important de noter que ces mises en contactes sont soit sans effet, soit nocives pour des bactéries isolées de façon plus conventionnelles de sols arables. La double mise en contacte est donc ici impérative et efficace qu'avec des bactéries telluriques « compétentes »
isolées selon FR 2 833 016. En effet, sans la mise en contact entre les fines particules de sols et ces bactéries, le titre cellulaire de finoculum atteint par fermentation à l'état solide ne serait pas suffisamment élevé pour rendre économiquement rentable la bactérisation de matières résiduelles fertilisantes telle que les EO/EOM. De plus, sans cette première mise en contact, mieux aurait fallut produire les 1810 cellules / g via une fermentation à l'état liquide plus conventionnelle ; la lyophilisation et ou le séchage des biomasses bactériennes ainsi produites entraîneraient cependant une mortalité telle qu'il faudra produire initialement non pas 1e10 mais bien 1e11 cellules viables / g, d'où un surcoût appréciable et prohibitif. Enfin, il est toujours pensable de ne pas formuler à l'état solide les bactéries produites par fermentation à l'état liquide et de les appliquer directement sous formes liquides aux EO/EOM ; cette mise en contact liquide - solide provoquera cependant la réaction chimique des EO/EOM au détriment de la survie des bactéries telluriques ainsi placées à leurs surfaces.
De plus la nécessité d'enrichir les EOM avec une certaine quantité de sels minéraux, notamment le MAP, provoquerait en soi la mort, par osmolyse, des cellules BFCP, insuffisamment rustiques et adaptées à la vie dans la sols. Or, les cellules BFCP isolées selon notre procédé décrit dans FR
2 833 016 sont, de part leurs compétences édaphiques, particulièrement résistante à ce type de stresses osmotiques, ce qui leur permet d'ëtre combinée avantageusement avec des EOM
relativement riches en sels minéraux. Dans le cas contraire, et dès l'application en bandes des EOM
bactérisés avec des BFCP
plus conventionnelles, les réactions chimiques en proximité desdites granules seront trop bactéricides pour permettre une survie et une activité in sifu de ces organismes.
Synergie EOlEOM - BFCP - la rencontre de deux secteurs bioindustriels Les besoins en carbone des BFCP situées en proximité des racines sont en principe que partiellement satisfaits par les exsudats provenant de celles-ci. II est donc raisonnable que l'abondance de carbone contenu dans les EO/EOM puisse lui aussi contribuer à combler d'avantage les besoins nutritifs de ces microorganismes. En ce sens, le carbone et la matière organique apportés à proximité
des racines par les EO/EOM en tant qu'engrais de démarrage est donc lui aussi doublement valorisé ; ils permettent une plus grande disponibilité des phosphates de part leurs fixations sur les sites de fixation autrement occupés par les phosphates (Parent 2003), et ils agissent comme substrats nutritifs pour les BFCP ainsi réintroduites au sol en proximité des racines.
Triple action (bio)fertilisante - la boucle est bouclée Le mode d'action des EO/EOM bactérisés selon la présente invention sera donc tripartite.
Premièrement l'action minérale est bien connue et découle simplement de l'apport d'éléments nutritifs incorporés aux EOM selon, par exemple, un procédé décrit dans le brevet US
6,056,801. Divers EOM
(Labrie 2004 ; Dupuis 2004) et certains engrais organiques (E0) (Provencher 2003) ont déjà fait l'objet d'un certain développement. Deuxièmement, l'action organique provient de l'interaction entre les ligands organiques (matières organiques) des EO/EOM et les sites de fixation normalement occupés par de l'orthophosphate (le phosphate) dans le sol (Parent 2003). Pour l'essentielle, ces sites de fixations sont des hydroxydes de fer et d'aluminium ainsi que le calcium. En occupant ces sites de fixation, ces ligands augmentent indirectement la disponibilité et donc l'assimilation des orthophosphates par la plante. Enfin, troisièmement, l'action bactérioloaiaue, enfin, est le fruit de l'interaction entre les BFCP à proximité des racines. Cette interaction peut être multiforme et mettre en jeu un nombre de mécanismes, dont la diazotrophie, la production de facteurs de croissance, la dissolution de certains composés organiques et inorganiques de façon à les rendre plus assimilables par la plante, etc. (cf.
Arshad et Frankenberger, Jr.
1998 ; Antoun et al. 1998 ; Chabot et al. 1993 ; Rodriguez et Fraga 1999).
Des matières fertilisantes à triple action - minérale, organique et bactérienne - sont particulièrement utiles étant donné l'action synergique entre la composante organique des EO/EOM et les BFCP, d'une part, et d'autre part la possibilité de biofertiliser des cultures non-Leguminosea même en absence de résidus de culture ayant autrement pu faire office de substrats carbonés. De plus, cette triple action rend les sols normalement perçus comme saturés en phosphore plus propices à une certaine fertilisation phosphatée, et donc à une augmentation de leurs potentiels de rendements.
Avantages par rapport à l'état de l'art - des avancées agronomiques et bioindustrielles D'un aoint de vue adronomiaue, et en sus de la synergie découlant de la mise en contact J'inocula BFCP et d'EOlEOM, les avantages de l'invention par rapport à l'état de la techniques sont multiples ;
o Réduction des risques de pollutions agro-environnementales et amélioration des bilans massiques de la fertilisation organo-minérale ;
o Apport simultanée J'inocula BFCP et d'engrais de démarrage et donc une plus grande facilité
dans l'utilisation des inocula BFCP pour cultures non-Leguminosea ;
o Écoulement partiel de matières résiduelles fertilisantes (MRF) et de biosolides au cours de la fabrication de ces intrants à valeur ajoutée pour la production de grandes cultures ;
o Alternative à la bactérisation BFCP des semences pour cultures non-Leguminosea semées en absence de résidus de culture au sol ;
o Souplesse en ce qui concerne l'utilisation à la ferme, et/ou l'incorporation aux EOM des BFCP à
l'usine.
D'un aoint de vue bioindustriel, la FFES, partie intégrante de la présente (invention permet d'atteindre des densités cellulaires de l'ordre de 1 e10 cellules par gramme de mélange organo - minéral, avantageusement des résidus de cultures cellulosiques mélangés à de fine particules de sols arables, dans les trois à quatre semaines qui suivent le début de l'incubation, et cela à partir d'une densité
cellulaire initiale d'environ ie7, voire parfois aussi faible que 1e6, voire 1e5 par gramme de mélange, en conditions non - stériles et à température ambiante s'il le faut. Les avantage bio - industriels de ce procédé sont donc évidents, notamment pour la production J'inocula de bactéries diazotrophes ;
~ Une forte réduction des besoins en capacité de fermentation, puisque l'essentiel de l'augmentation de la densité cellulaire de finoculum se fait en milieu solide ;
~ L'adéquation du support, mélange de résidus de culture et de particules de sols, en ce qui concerne les bactéries telluriques destinées à être réintroduites dans les sols ;
~ La possibilité d'utiliser une formulation solide pour fin de pulvérisation, ce qui a traditionnellement fait défaut aux formulations bactériennes à base de tourbe, ou avantageusement pour le pelliculage d'EO/EOM;
~ Étant donné la rusticité des BFCP candidates, leurs utilisation entant qu'additif bactérien pour EOIEOM enrichit de sels minéraux fertilisant permet d'assurer une certaine dominance numérique au dépends des souches bactériennes contaminantes et moins rustiques. Du coup, le degré de pureté microbiologique des EOMI ainsi produit est de facto assuré et d'autant plus compatible avec les réglementations écotoxicologiques en cours.
Enfin, il est important de noter que dans sans forme ia plus simple, l'invention permet de dynamiser, dans le cadre d'une certaine fermentation à l'état solide, les cinétiques de croissance de cellules bactériennes véritablement telluriques au dépends de celles qui ne le sont pas. L'invention est donc parfaitement réconciliable avec l'état de la technique dans le secteur des fermentations à l'état solide, notamment et à titre d'exemple non limitative, selon la technologie décrite dans le brevet EP
0 406 103 A1 (« Composition pesticides à base de microorganismes, leur procédé
de préparation et leur application en agronomie » ; Inra 1990). Dans de telles situations, la production des BFCP véritablement telluriques isolées selon FR 2 833 016 est dynamisée dans le sens décrit ci-dessus, et cela dans les délais de productions normalement requis par lesdites technologies de fermentation à l'état solide selon l'état de la technique.
L'invention permet donc de produire, à partir d'un « starter » facilement produit par fermentation classique et d'un mélange organo - minéral bon marché à base de résidus de culture et de particules de sol, le tout ne contenant que 1e6 cellules par gramme, un inocula solide riche à hauteur de 5e9 cellules par gramme, voire jusqu'à 1810, donc capable d'apporter plus de 1813 cellules par hectare pour une dose hectare d'environs 1 kg, ce qui du propre aveu de (industrie, serait difficilement atteint autrement.
Champ et conditions d'applicaüons - l'emphase sur !es céréales Afin d'établir des conditions favorables à la réalisation de l'invention le champs d'application de l'invention peut être avantageusement restreint. Le champ d'application de la présente invention peut donc en partie la définir. Quelques restrictions doivent donc s'appliquer ;
o Afin de mieux assurer la réalisation de l'invention, il est avantageux de bactériser des EO/EOM
contenant au minimum et approximativement 20 à 25°!° de carbone, soit environ 45 à 50% de matière organique. Cette teneur minimale approximative évite une trop grande réactivité physico-chimique des granules au contact du sol, réactivité contraire à la survie immédiate des BFCP, tout en procurant à celles-ci un maximum de substrat carboné à es sus de celui exsudé proximité de la rhizosphère.
o Application en bandes à proximité des semences en tant qu'engrais de démarrage ; Les EO/EOM
doivent être appliqués à proximité des semences à l'aide d'un semoir combiné
en tant qu'engrais de démarrage (Craaq 2003). Cette situation est souvent le fait des semis de printemps de grandes cultures, notamment celles du maïs et de certaine céréales de printemps (CPVQ 1988).
Heureusement, ces situations sont aussi généralement caractérisées par l'absence de résidus de cultures au sol, ou en surface des sols, au moment (printemps) du semis et donc du placement en bandes des engrais de démarrage.
a Sols dépourvus de grandes guantité résidus de culture au moment des semis ;
La présence d'une surabondance de résidus de culture, soit plus de trois, voire cinq Mg par hectare au moment des semis, favorisera l'action strictement organo-minéral des EO/EOM bactérisés au détriment de la mise en évidence de l'efficacité relative des BFCP. Plus exactement ; c'est le rapport C/N
relativement faible (environ 30) de la composante organique des EO/EOM, par rapport à celui des résidus de culture (environ 100), qui permettra à cette matière organique, en soi, d'amorcer une certaine minéralisation des ces résidus. Cette action, bien que bénéfique en soi, masquera l'action des BFCP rendant ainsi l'invention inutile en de telles situations.
II est donc parfois avantageux en ce sens d'appliquer conjointement les BFCP et les EO/EOM en situations où les résidus de culture au sol sont peu ou pas présent au moment des semis.
o Dans le cas de BFCP destinées à l'amélioration de la nutrition phosphatée des culture, il est avantageux que les sols soient plutôt saturés en ahosphore fixé mais autrement assimilable sur lesquels les grandes cultures répondent peu ou pas à l'apport d'engrais phosphore conventionnels. Ces sols dont le pouvoir de fixation de P est appréciable (Zhang et al. 1995 ;
Beauchemin et Simard 1999 ; Parent 2003 ; Craaq 2003) limitent donc l'efficacité agronomique des engrais phosphatés couramment utilisés. Les cultures agronomiques sur ces sols répondent généralement mal à l'apport de phosphore. En en serre etlou sous conditions contrôlées cependant, les plantes cultivées sur ces sols répondent bien à la bactérisation de leurs rhizosphères par des BFCP capables, par exemple, de solubiliser des orthosphosphates fixés sur les hydroxydes de fer et d'aluminium (Chabot et al. 1993, 1996 ; Rodriguez et Fraga 1999).
L'utilité de l'invention ne se limité pas qu'à la la bactérisation des EOM
puisque les EO eux aussi peuvent être, en principe, appliqués en bandes à proximité des semences là et où l'application d'EO/EOM
ne serait pas loisible, au moment des semis de cultures céréalière d'hiver en France par exemple. Bien que la pratique ne soit pas courante, elle pourrait le devenir de part les bienfaits de l'invention. Dans les faits donc, et pour facilité la description de la présente invention, le concept d'EO/EOM ici n'exclut pas celui d'EO.
Description détaillée de l'invention La présente invention comprend ;
o un procédé d'obtention de CMBT (cultures mères de bactéries telluriques), avantageusement selon FR 2 833 016 (Claude 2001), cultures sources de bactéries telluriques édaphiquement compétentes et donc bien adaptée à la vie dans les sols (arables) ;
o un procédé de fermentation et formulation à l'état solide (FFES) innovant des BFCP ainsi isolées de ces CMBT, avantageusement selon Claude (2001 ) ;
o un inocula BFCP, conditionné sous la forme d'une poudre suffisamment fins de sorte à permettre, le cas échéant, le pelliculage d'EO/EOM sans l'apport d'eau et/ou de liant ;
o un EO/EOM, voire son procédé de fabrication s'il ne comporte pas d'étapes bactéricides, comme support et expédiant de ces inocula, et aussi capable de fournir aux BCFP
qu'il comporte un substrat carboné et énergétique - les EO/EOM devraient avantageusement contenir un minimum approximatif de 20 à 25% de carbone, soit environ 45 à 50% de matière organique (cf. Allaire et Parent 2004) ;
o une méthode de biofertilisant des cultures non-Legmuminosea par application en bandes à
proximité des semences d'EO/EOM ainsi bactérisés, avantageusement sur sols avec peu ou pas de résidus de culture au sol au moment des semis et moyennement saturés en phosphore selon des indices reconnus.
L'invention mets aussi en oeuvre une méthode analytique innovante permettant de confirmer l'expression des phénotypes rustiques de la part des BFCP candidates concernées. Cette méthode innovante présentée pour la première fois dans le cadre de la présente invention ne nécessite pas l'intervention de techniques biomoléculaires etlou bioinformatiques, techniques de toutes façon et pour l'essentielle inappropriées pour la mise en évidence de phénotypes dont les bases génomiques et métaboliques sont vraisemblablement très complexes (cf. Rüberg et al. 2003) et donc difficilement réductibles et explicables via de simples mécanismes de transcription adnéique en protéomes.
L'invention se réalise en deux temps. Dans un premier temps, il faut effectuer une première mise en contacte biosolides / bactéries BFCP afin de fabriquer l'inocula BFCP
devant servir à la bactérisation des EO/EOM, pré - , ou post-constitution de ceux-ci. Dans un deuxième temps, il faut réaliser une deuxième mise en contacte biosolides / bactéries BFCP maintenant formulées à
l'état solide afin d'assurer définitivement la bactérisation des EO/EOM, soit directement par pelliculage des granules déjà produits et consolidés, soit indirectement, si loisible, par incorporation dudit inoculum au cours de leurs procédés de fabrications. Pour résumer, l'invention comporte donc (Figure 1) ;
~ Une première mise en contact des BFCP et de fines particules de sols servant à dynamiser leur multiplication au cours de ladite fermentation et formulation à l'état solide (FFES), permettant la fabrication d'un inocula BFCP, avantageusement sous la forme d'une poudre plus ou moins fine, dotée d'un titre cellulaire suffisant. Le procédé préféré pour l'obtention des BFCP candidates particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols est décrit dans notre précédent brevet FR 2 833 016.
~ Une deuxième mise en contact de l'inoculum BFCP ainsi produit et des biosolides effectuée soit au moment du pelliculage des EO/EOM avec ladite poudre inoculante produite par FFES, soit par l'incorporation de cet inocula au sein d'un procédé de fabrication d'EO/EOM
granulés ne comportant aucune étape ultimement bactéricide en ce qui concerne les BFCP
candidates rustiques et/ou isolées selon le protocole FR 2 833 016 (Claude 2001 ) et pouvant donc nuire appréciablement et/ou définitivement à la survie desdites BFCP.
i'r'e mise en contact : Fabricafion de la poudre inoculante par FFES
Selon un mode de réalisation de l'invention un consortia de cellules type BFCP, avantageusement de azotobactériennes étant donnée la facilité de leurs mises en culture une fois isolées selon le protocole décrit dans notre précédent brevet français FR 2 833 016. Ces cellules BFCP
peuvent, par exemple, provenir de sols arables québécois tef que des podzols sableux et/ou des un gleysols argileux. Nous pouvons aussi mettre en évidence l'utilité de la FFES à l'aide de souches azotobactériennes précédemment isolées selon FR 2 833 016 (Claude 2001). Ces souches bactériennes, BFCP comme il ce doit selon les revendication de FR 2 833 016, sont du coup particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols, et du coup capables d'interagir favorablement avec les fines particules de sols faisant partie intégrante de la FFES.
II n'est pas impératif d'utiliser un consortium de n souches candidates pour démarrer ainsi la FFES ; tout dépends de la nature du sol du fonctionnement in situ des souches.
La FFES, de part la présence des fines particules de sols, a aussi l'avantage de contribuer elle même à assurer une certaine sélection des souches les plus « édaphiquement compétentes » (i.e. adaptées à
la vie dans les sols arables). En plus d'assurer la production et la formulation de biomasses bactériennes d'origine tellurique, la FFES selon la présente invention permet donc aussi d'en assurer, dans une certaine mesure, la compétence édaphique. A la fin de la FFES il est loisible que les titres cellulaires BFCP des n membres du consortia initial ne soient pas nécessairement identiques. Cela dit, pour fin d'homologation d'un éventuel produit commercial, l'utilisation d'une seule souche BFCP pour démarrer la FFES est probablement le plus avantageux.
La production et la stabilisation de ces cellules bactériennes BFCP candidates sur un support organique, par exemple des résidus de cultures céréalières hachés de dimensions approximatives de l'ordre de 1 à 4 mm leur permettent d'interagir a la fois avec ce support, qui peut aussi servir de source de substrat carboné, et de fines particules de sols arables, avantageusement d'environs 100 micromètres, d'argiles ou de tout autre support inorganique etlou minéral à caractère colloïdal ou argileux capables d'interaction avec des substances humiques ou d'autres polymères phénoliques, naturels ou synthétiques, caractéristiques de sols arables. Les fines particules de sol, selon le mode de réalisation préféré de l'invention, peuvent être considérées comme analogues à une fraction fonctionnelle du complexe argilo - humique du sol (Mills 2003). Pour permettre cette interaction « support inorganique x bactérie x support organique », il est avantageux de procéder comme suit ;
~ Enduire, par pulvérisation, malaxage, aspersion ou immersion, une part de substrat l supports carbonés, avantageusement des résidus de culture céréalière y compris de maïs -grain, avec environs 1e6 cellules de chacune des quelques souches BFCP retenues comme constituant recherches de l'éventuel inoculum, par gramme de substrat - support, avantageusement un résidus de culture cellulosique non - stérile ;
~ Enduire de nouveau, avantageusement par malaxage, les résidus de culture avec les dites fines particules de sols de façon à ce que les substrats - supports soient totalement enduits de ces particules fines. En principe, l'efficacité de cet enduit est reconnaissable à
l'absence de particules fines non - adhérées. II est avantageux d'apporter autant de fines particules de sol que de support organique, bien que les proportions peuvent varier selon le métabolisme des BFCP
retenues.
~ Une fois le titre cellulaire recherché atteint, le mélange peut être amené à
un taux d'humidité
relative d'environ 18%, voire avantageusement d'environ 12 à 15%, soit suffisamment sec pour être pulvérisé par broyage sous la forme d'une poudre inoculante de granulométries variables selon les besoins (cf. ci - dessous ; 2"è"'e mise en contacte).
En ce sens, de part la capacité qu'auront les cellules bactériennes édaphiques à interagir favorablement avec les fines particules de sols, ou leurs analogues, enduisant les résidus de culture hachés, l'invention est particulièrement bien conçue pour la formulation de biomasses azotobactériennes et BFCP telles que décrites dans notre précédent brevet français (FR 2 833 016 ; Claude 2001 ). Selon une mise en oeuvre avantageuse de l'invention, il est loisible de procéder comme suit ;
v Stériliser, par autoclavage par exemple, les résidus de culture finement hachés au préalable;
o Stériliser, par autoclavage par exemple, les fines particules de sol ;
o Traiter avec un antibiotique, l'ampicilline par exemple, un extrait aqueux d'un mélange de sol (frais ou pré - incubé) et de résidus de cultures pailleux (y compris ceux de maïs), avantageusement 50/50 plp, de façon à assurer une nette prédominance microbiologique des biomasses fongiques dans ces extraits (nb. II faut faire ici très attention de laver suffisamment la fraction solide de cet extrait, par centrifugations et re-suspensions successives par exemple, afin d'éliminer l'antibiotique utilisé ;
o Apporter aux résidus de culture, par voie d'un volume égale en poids, 187 cellules (azoto)bactériennes par gramme de résidus (i.e. 187) ; il faut ici utiliser, comme milieu liquide de co-inoculation, le dit extrait à dominance fongique préparé ci - haut ;
o Après malaxage des résidus de culture ainsi inoculés, y incorporer les fines particules de sol et malaxer, en conditions aseptiques, préférablement par agitation au sein d'un récipient plastique préalablement stérilisé ;
o lisser incuber, une fois le récipient fermé avec étanchéité, au moins deux à
trois semaines afin d'assurer le développement du titre cellulaire à une niveau égal ou supérieur à 5e9 cellules bactériennes par gramme de support solide, voire plus si loisible.
Ce mélange des « résidus de culture - fines particules de sol - extrait fongique » et des biomasses bactériennes constitue maintenant (inocula brut et son support solide formulé à l'état solide. II
est tout aussi avantageux, au lieu de stériliser les résidus de culture et fines particules de sols de plus simplement les soumettre à un choc thermique (eg. les chauffer à environ 60 degrés Celsius pendant une heure dans une étuve) afin d'atténuer les éventuels contaminants bactériens et fongiques qu'ils pourraient générer au cours de l'incubation. Cette approche à l'avantage de nuire un minimum à la dynamique d'incubation mais laisse malgré tout se développer une quantité appréciable de contaminants, somme tout cependant en dessous des 186 germes par gramme d'inocula, soit la limite supérieure autorisée par la législation en cours en France.
Afin de faciliter le pelliculage des EO/EOM, le cas échéant, il est avantageux de broyer finement l'inoculum ainsi produit et son support solide. De simples mécanismes, type «
moulin à café » ou « robots culinaires u à actions rotatives sont utiles en ce sens. Étant donné la faible humidité relative de la préparation, ce broyage et le tamisage (eg. 750 micromètres) sont facilement réalisables et ne provoquent pas la mort des bactéries.
II n'y a pas de limite technique à la taille de chaque lot de production, dans la mesure où une fermentation à l'état solide est réalisable, par exemple selon les procédés de Suryanarayan et al. (2001 ), Inra (1990), ou encore selon les règles de l'art décrite de façon générale dans Raimbault (1998). II est aussi possible de réaliser de petits lots, individuellement de 1 à 5 kg, voire l0kg, poids final post-FFES, soit l'équivalent d'une dose hectare. Enfin, l'utilisation ;d'un procédé de fermentation à l'état solide de concert avec ladite FFES telle que décrite ici peut servir avantageusement à
réduire le délais de production, par exemple ici et à titre non - limitatif, bien en deçà des 21 jours nécessaire à la production du titre cellulaire recherché mentionnée ci-dessus.
Z'~'"e mise en contact : Incorporation des BFCP dans des EOlEOM Q
Les inocula, et plus particulièrement les cellules BFCP qu'elle contiennent, produits au cours de la première mise en contacte peuvent maintenant être mis en contact avec les EO/EOM, ou, le cas échéant et si loisible, la fraction organique des pré-mélanges devant servir à Leurs fabrications. Étant donnée une certaine fragilité inhérente à toutes cellules bactériennes d'origines telluriques, il est avantageux que les EO/EOM et/ou des susdits pré-mélanges contiennent une certaine proportion de carbone organique, soit avantageusement un minimum de 20 à 25%. Cela dit, et étant donné la rusticité
et la compétence édaphique de cellules bactériennes isolées selon FR 2 833 016, la contre partie minérale préférentiellement du MAP (sels mono - ammoniacaux de phosphate) peut atteindre l'équivalent de 25%
de la composition finale, voire plus, par exemple 30% étant donnée la présence de liants organiques etlou selon la teneur en matières organiques des biosolides constituants.
La bactérisation par mise en contacte des inocula BFCP et des EO/EOM granulés et/ou leurs précurseurs organo-minéraux, celle-ci peut être effectuée soit à la ferme par mise en contact de l'inocula et les dits EOIEOM, soit industriellement par un voie d'un procédé de traitement de semence conventionnel, et cela dans la mesure où ledit procédé n'est pas en soi bactéricide. Dans les deux cas, il faut incorporer l'équivalent de la dose hectare, soit avantageusement de 1 à 5 kg de l'inocula de titre cellulaire d'au moins 5e9 cellules BFCP candidates par gramme, ce qui équivaut à une dose hectare d'environ de 1813 à 5e13 via 200 kg d'EO/EOM, ou selon les besoins de la culture.
En ce qui concerne la bactérisation des granules EO/EOM post-constitution, et étant donnée la petitesse recherchée de particules d'inoculum et de la rugosité des granules d'EO/EOM, l'adhérence de finoculum est assurée sans avoir à nécessairement ajouter de l'eau ou un quelconque liant, bien que ceux-ci peuvent s'avérer utile en certaines circonstances ; cette adhésion spontanée, le cas échéant, a l'avantage de minimiser les réactions physico-chimiques bactéricides à
proximité des granules. Enfin, les EOIEOM sont avantageusement granulés, soit sous forme de bouchons cylindriques, soit sous forme sphérique, conditionnements moins commun mais plus avantageux (cf. EP 1 174 404 A2) En ce qui concerne l'incorporation des BFCP par mise en contact avec le pré-mélange au cours du procédé de fabrication desdits EO/EOM, il est avantageux que ce procédé ne comporte pas d'étapes bactéricides, notamment par traitements physico-chimiques et/ou thermiques tel que la consolidation par cuisson à température élevées pendant des périodes de temps prolongées.
Selon les divers modes de réalisation décrites au Tableaux 1 et 2, ü est avantageux d'inclure un liant, préférentiellement organique, tel que la mélasse et/ou la vinasse de betterave à hauteur de 5 à 8%
(base massique). En sus de permettre une meilleure consolidation du granule, ce type de liant peut servir de substrat carboné aux cellules BFCP. Selon un mode de réalisation, les granules peuvent ëtre séchés graduellement à une température relativement basse, comme par exemple la température ambiante d'une pièce. D'un point de vue bioindustriel cependant, il est parfois avantageux d'utiliser une température de séchage plus élevée afin de réduire le temps nécessaire pour cette consolidation. Cette approche est aussi compatible avec la présente invention étant donnée la rusticité des souches BFCP
(AZM) isolées selon FR 2 833 016.
Donc, l'incorporation des BFCP peut être effectuée, soit avant, soit après la formation desdites granules. Si le procédé de fabrication comporte une étape potentiellement ou effectivement bactéricide, il est avantageux d'incorporer les BFCP après la formation des granules consolidées. Pour ce faire, il est avantageux de moduler la porosité des granules et la granulométrie de la poudre inoculante de façon à
permettre d'incruster ledit inoculant dans les granules une fois celles-ci produites. Si le procédé de fabrication ne comporte pas une étape potentiellement ou effectivement bactéricide, il est avantageux d'incorporer la poudre inoculante produite par FFES directement aux pré-mélanges.
Mode préféré de réalisation et exemples d'applications A partir de petits échantillons de deux sols (Tableau 6), nous avons isolé, selon Claude (2001 ), des cultures pures de souches candidates « AZM », c'est-à-dire diazotrophes et capables de solubiliser des composés phosphatés récalcitrant minéraux, i.e. a priori et autrement peu solubles dans l'eau. II fallut transférer des aliquotes des cultures mères ainsi obtenues vers des milieux «
JM » (sans azote ; Kumar et Narula 1999). La dominance numérique de ces cellules AZM sera assurée par des cultures liquides JM
de Rang III. Les milieux JM contiennent comme seule source de phosphate des phosphates di- et tricalcique et sous la forme d'hydroxyapatite, ou « HA ». Des colonies seront obtenues par étalement d'aliquotes des cultures de Rang III sur milieux gélosés JM et PK (avec N ;
Kumar et Narula 1999) contenant eux aussi des phosphates di- et tricalcique insolubles. La formation d'halos translucides autour de certaines colonies indiquera l'a dissolution de ces composés phosphatés préalablement insolubles.
Afin d'évaluer le pouvoir solubilisant des isolats AZM nous avons déterminé
les pH des milieux JM
10 après 7 jours de culture pour les cultures de rangs (R) 1, II et III ; plus le pH est faible, plus, en principe, le pouvoir solubilisant des isolats AZM est grand (Kim et al. 1997 ; Kim et al.
2003). Pour des raisons d'ordres pratiques, nous retinrent que douze (12) colonies, six (6) par type de sol, sur la base de leurs index de solubilisation (1S ; Kumar et Narula 1999) ; ces colonies serviront à
la production de biomasses AZM en milieu de culture « No.1 » (Institut Pasteur, Paris) de titres cellulaire AZM d'environ 1e9 par mL.
15 Chacun des 12 isolats (6 par sol) ont été évalués individuellement par rapport à des (12) témoins appariés non - bactérisés (t) ; chaque comparaison est répétée trois fois. La production de matière sèche des parties aériennes, ou MSPA (Hilali et al. 2001 ; Gachon 1988 ; Sardi et Csatho 2002) servira d'indice de l'activité in situ de ces isolats AZM candidats. Les douze (12) isolats seront essayés en sol A et S
reconstitués (170 g / pot) et ensemencé avec du mil (Phleum pratense L.). Des résidus de culture sont 20 utilisés comme expédients pour les AZM (1% plp) ; les résidus de culture ainsi bactérisé contiennent 5E5 cellules AZM par g, soit approximativement l'équivalant de la dose hectare rapportée par Claude et Fillion (2004) pour la bactérisation in situ de résidus de culture en situations agronomiques. Les pots, 72 en tout, ont été fertilisés avec une solution nutritive (100 ml / pot) dépourvue d'azote et de phosphore, le seul phosphore exogène apporté par incorporation solide étant l'équivalent de 60 kg de P par ha sous forme d'hydroxyapatite (HA). L'équivalent de 75 unités d'azote (nitrate d'ammonium) par hectare est apporté 28 jours après semis, soit 10 à 12 jours avant la première coupe (C1). Afin d'évaluer l'effet de l'HA en soi et/ou des résidus de culture nous avons inclus deux témoins ; un sol reconstitué sans HA ni résidus de culture, et un sol reconstitué qu'avec l'HA - les témoins avec HA et résidus de culture étant appariés à
chacun des pots bactérisés à l'aide de l'un des 12 AZM candidates.
Selon la capacité à favoriser la production de la MSPA nous pourrons, en principe, éliminer les quelques souches AZM candidates les moins prometteuses. Les AZM candidates ainsi retenues serviront à amorcer un procédé de fermentation et formulation à l'état solide, ou FFES, et à produire ainsi un inocula pour la bactérisation des biosolides précurseurs d'EO/EOM. Le titre cellulaire l'inocula solide ainsi produit peut atteindre avantageusement 5E9 AZM par g. Chaque AZM candidate retenue sera produite de la sorte, le consortia final étant constitué à par égale de chacune d'entre elles. L'évaluation des 12 isolats AZM (T) ce fit à l'aide de 12 témoins (t) non - bactérisés appariés, chaque unité expérimentale ainsi constituée étant répétée trois fois. Les rapports T/t pour chaque isolat serviront de critères d'évaluation de l'efficacité in situ des AZM candidates. Ces souches ont par fa suite été produites et formulées selon le procédé de fermentation et formulation à l'état solide selon la présente invention.
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Les exemples d'applications 1 et 2 permirent de mettre en évidence l'utilité
de l'invention en terme de titre cellulaire d'une préparation inoculante produite par fermentation à
l'état solide. Nous avons utilisé
un consortia de deux souches azotobactériennes de type AZM jugées les plus prometteuses selon le protocole d'obtention décrit ci-dessus.
Par rapport à une fermentation à l'état solide plus conventionnelle, i.e. sans l'ajout de fines particules de sols capables d'interagir favorablement avec des souches bactériennes d'origine telluriques et particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols, nous pouvons donc augmenter considérablement le titre cellulaire de ces préparations (Figures 2 et 3). Puisque ces préparations sont plutôt sec (i.e. 15%
d'humidité), elles peuvent être considérées comme formulées à (état solide et peuvent servir, entre autres, à la bactérisation à sec d'EO/EOM, voire de leurs pré-mélanges en cours d'extrusion et de consolidation. Si ce n'était de cette forte augmentation du titre cellulaire, les coûts normalement associés à la préparation d'un tel inoculum composé de souches bactérienne telluriques rustiques et généralement oligotrophes rendrait la bactérisation d'EO/EOM prohibitifs.
Exemple 1 : Effet~e fend,~t de fines particules de sols sur ta densité
cellulaire azotobactérienne d'un mélange résidus de culture (blé) et aarticules fines de sol (70 microns) sur l'accumulation de l'azote ammoniacal et des b~,m~sses azotobactériennes dans le temps. : Dans le cadre d'une FFES selon la présente invention, nous avons déterminé la densité cellulaire azotobactérienne des souches AZM avec et sans la présence de fines particules de sol (loam argileux gleysolique). La présence de particules fines de sol (Figure 2) permet effectivement de centupler la densité cellulaire azotobactérienne. Seules les souches azotobactériennes AZM isolées selon FR 2 833 016 (Claude 2001), voire, dans une moindre mesure, avec les souches azotobactériennes témoins isolées selon FR 2 833 016 sont capables d'interagir favorablement de la sorte avec lesdites fines particules de sol et atteindre du coup un titre cellulaire important ; le titre cellulaire obtenus avec une souche azotobactérienne témoin (Azotobacter.
chroococcum no. 76.116, Collection de l'Institut Pasteur, Paris) est lui, nettement inférieur.
Exemple 2 : Évolution des densités cellulaires au sein des microcosmes contentant les résidus de culture bactérisés et enduits de particules fines de sots selon l'invention : Nous avons repris l'essentiel du protocole utilisé pour l'Exemple 1 mais uniquement avec les microcosmes contenant les fines particules de sols afin de mieux démontrer la cinétique d'accumulation des différentes biomasses bactériennes selon leur origines et le type de protocole d'isolement utilisé.
Comme nous pouvons le voir (Figure 3), dès le 78'"e jour d'incubation, seul les FFES contenant les fines particules de sols inoculés avec les biomasses azotobactériennes AZM isolées selon FR 2 833 016 (Claude 2001) contiennent plus de 1e8 cellules azotobactériennes AZM par gramme de préparation. Cela démontre clairement la possibilité de produire et de conditionner simultanément des inocula azotobactériens, et cela si et seulement si, les biomasses bactériennes concernées sont particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols et donc d'autant plus capables d'interagir avec ces fines particules de sols, ce qui n'est pas le cas par exemple des biomasses azotobactériennes A. chroococcum 76.116 de l'Institut Pasteur, voire des autres biomasses témoins produites selon FR 2 833 016. Dans le cas des la souches azotobactériennes candidates isolées selon FR 2 833 016, la densité cellulaire est passée de 1 e6 à 5e9 après 21 jours d'incubation ; la souche témoin sensu FR 2 833 016 (Claude 2001 ) a été, tel que prévu, plus prolifique l0 que fAzotobacter76.116, sans pour autant atteindre les titres cellulaires atteint avec AZM.
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Une troisième exemple d'application nous permit de mettre en évidence l'extraordinaire résistance 15 des souches AZM au stresses osmotiques provoqués par des doses relativement élevées de MAP dans la composition des EOMI. Pour ce faire, nous avons incubé des pré-mélanges de divers types de biosolides et de diverses doses de MAP ; certaines caractéristiques physico-chimiques de ces pré-mélanges sont présentées au Tableau 1.
20 Exemple 3 : Résistance et survie des cellules BFCP de type AZM prol r~ e à
Po~or Inc. et sélectionnées selon le protocole d'isolement décrit dans FR 2 833 016 est ~umis à des stresses osmotiques attribuables à de fortes doses de MAP entrant dans la composition desdits EOMI. : La rusticité des cellules AZM issues de FR 2 833 016 (Claude 2001) peuvent être avantageusement valorisées au cour de la seconde mise en contacte comportant une forte concentration de sels minéraux fertilisant, soit ici de 25 l'ordre de 25% de MAP. La présence de ces sels est utile, voire nécessaire étant donné la faible teneur en sels minéraux fertilisant des EOM par rapport à celle du MAP. Néanmoins, la teneur en sels minéraux fertilisant des éventuels EOMI sera nécessairement et appréciablement moindre que celles des leurs homologues conventionnels dépourvus de matières organiques. Cet appauvrissement, loin de constituer un désavantage, représente un avantage agro-environnemental en ce sens qu'elle permet de réduire la 30 dose-hectare de phosphore apportée au démarrage ; c'est les BFCP, avantageusement de type AZM, qui devront maintenant compenser pour ce bénéfique déficit en phosphore.
Nous avons évalué la capacité qu'ont les cellules AZM isolés selon FR 2 833 016 à résister à des pressions osmotiques (osmolaires) provoquées par des concentration de MAP
allant jusqu'à 3 M MAP, soit le fait d'une concentration d'environ 25% de MAP sur une base massique (Tableaux 1 et 2). Ces 35 concentrations sont maintes fois supérieures à celles présentes dans la solution du sol et donc a priori et en principe bactéricides si ce n'étant de la rusticité inhérente des AZM
isolées selon FR 2 833 016.
Pour mettre en évidence cette plus grande rusticité nous avons utilisé des souches témoins, dites azm, diazotrophes et MPS isolées conventionnellement des sols cibles (Tableau 6).
L'obtention de ce type de souches témoins a été préalablement décrite dans notre brevet FR 2 833 016, et reprise ci-haut dans le cadre de la présente demande de brevet. Nous avons introduit 1 e8 des par g des souches AZM et azm dans deux séries de mélanges biosolides / MAP plus ou moins enrichit en MAP
(Tableaux 1 et 2) et préalablement stérilisés par autoclavage ; le titre cellulaire de ces milieux a été par la suite déterminé sur milieux PK et JM (Kumar et Narula 1999 ; Tableau 3). Nous avons aussi introduit ces deux souches dans les mêmes mélanges mais cette fois-ci non - stérilisés, question d'évaluer leurs capacités respectives à
dominer l'ensemble de la flore microbienne présente (Tableau 4).
II est important de noter qu'il est impossible à ce jour de discerner avec certitude entre ces deux souches, ou encore entre elles et les autres BFCP MPS du sol, à l'aide d'outils biomoléculaires et génomiques puisque ces biomasses bactériennes sont à toutes fins pratiques apparentées, hormis comme de raison la plus grande rusticité des i3FCP les plus rustiques, ici les AZM. En effet, et hormis leurs actions in situ sur la croissance des plantes, les souches édaphiquement compétentes issues de FR
2 833 016 sont difficilement repérables et/ou distinguables des souches apparentées qui le sont moins.
Le stress osmotique provoqué par la MAP s'avère ici utile en ce sens qu'il permet de mettre en évidence cette plus grande compétence. Dans les faits, la pression osmotique assure la dominance des souches tes plus rustiques, et plus particulièrement ici les AZM, réintroduites dans le sol selon la présente invention. Cette dominance peut être illustrée à l'aide d'une méthode analytique mise au point expressément dans le cadre de la présente invention. II s'agit de confronter les souches introduites à de multiple stresses et de faire de la diazotrophie et du caractère MPS de ces souches des « traits rapporteurs » pour la rusticité supposée de celles-ci. Nous avons donc mis au point une méthode analytique permettant de s'assurer de la dominance effective des souches AZM, les plus rustique par définition sensu FR 2 833 016 (Claude 2001 ), au dépends de celles qui le sont moins. Du coup, cette méthode est avantageuse pour !'assurance et le contrôle de la qualité (AQCQ) et cela sans avoir à
dépendre d'une caractérisation génétique et/ou biomoléculaire fine de la compétence édaphique. Nous avons donc développée en ce sens la méthode analytique suivante, dite « indice MPS » ou iMPS, ou encore « dt28-3 » ;
~ Des aliquotes d'une dilution du pré-mélange en cours d'incubation est placé
dans une milieux liquide de type JM (Kumar et Narula 1999) dépourvu d'azote ET de phosphore soluble ; la seule source de phosphore étant l'hydroxyapatie (HA), composé phosphaté
récalcitrant et insoluble si ce n'était de l'action MPS des souches AZM et azm. Le aliquotes sont diluées de la sorte aux 1 e 5'8'", 187'x"' et 18g ièm, et les tubes JM incubés pendant 28 jours à température ambiante (20 - 22 degrés C). La densité optique (DO) des milieux JM est déterminée après 3 et 28 jours d'incubation, la différence entre les deux observations est révélatrice de l'activité
MPS attribuable aux souches AZM ou azm. En principe, si l'aliquote est constitué que des souches diazotrophes et MPS, la différence t28-t3 sera grande ; la présence de souches « contaminantes » non-diazotrphes et/ou MPS réduira la taille de cette différence. Donc, et étant donnée la supposée rusticité des souches AZM issues de FR 2 833 016 en comparaison aux cellules azm témoins, les aliquotes provenant des pré-mélanges à fortes teneurs de MAP devraient contenir une plus forte proportion d'AZM, les autres constituants de la flore bactérienne, y compris les azm inoculées conjointement aux AZM, ayant été éliminés par une pression osmotique bactéricide ; la différence t28-3 sera donc plutôt grande ssi les AZM (MPS ici) ont effectivement résistées au stress osmotique. Si la teneur en MAP des pré-mélanges est réduites, la sélection en faveurs des AZM et au dépends des autres cellules bactériennes moins rustiques, et pour la plus part non diazotrophes et/ou MPS, sera moins forte et le développement de la densité optique de t3 à t28 sera d'autant moins prononcée.
En ce sens, le MAP induit un stress sélectif en faveur des souches BFCP (AZM) rustiques isolées selon FR 2 833 016, tandis que le milieu JM lui favorise (expression du caractère MPS de ces souches diazotrophes. Le caractère MPS, et accessoirement le développement de Ia DO de 3 à 28 jours post inoculation des milieux JM est donc ici un «
trait rapporteur » de la rusticité des AZM.
En d'autre mots, le dissolution du phosphore tel que détecté par la clarification initiale des milieux JM, agit ici comme un trait « rapporteur » pour les cellules capables de diazotrophie, diazotrophie qui est elle, par définition des BFCP-AZM, associée à la rusticité supposée de ces cellules. Si en réponse au stress osmotique les cellules non - rustiques sont éliminées, seules les cellules (AZM) rustiques pourront être soumises à une carence d'azote et de phosphore caractéristiques des milieux JM, et contribuer à
« densifier » (i.e. augmenter la densité apparente) de ces milieux. Pour vérifier que ce sont bien les cellules les plus rustiques (AZM) réintroduites par inoculation qui résistent, et non les autres types de cellules, en principe mois rustiques, voire les cellules témoins (azm) elles aussi réintroduites par inoculation, i1 s'agit simplement d'inclure des témoins non - inoculés et des témoins inoculés avec des cellules témoins tels que définit dans le brevet FR 2 833 016 (Claude 2001 ).
Dans la mesure où les témoins non - inoculés et inoculés (azm) ne provoquent pas d'augmentations sensible de la densité
apparente des milieux JM en fonction de (augmentation du stress osmotique en vigueur dans les pré-mélanges avec MAP, la densification des milieux JM associés aux pré-mélanges inoculés à l'aide des BFCP supposément rustiques ne peut être attribuable qu'à la résistance desdites cellules audit stress osmotique. L'augmentation de la densité optique (la densification) des milieux JM, voire ici de l'iMPS tel que définit ci-dessus, est donc nécessairement une démonstration positive de la rusticité des souches candidates (AZM) introduites par inoculation dans les pré-mélanges biosolides / MAP, précurseurs éventuels des EOMI. Mieux, cette méthode d'analyse permet donc aussi d'évaluer, non seulement de différentes souches candidates pour leurs degrés de rusticités, mais aussi de différents substrats matriciels pour leurs degrés de bactéricidité (voir Tableux 4 et 5, et Figure 4). Tel que démontré dans le cadre de la présente invention, cette méthode d'analyse est particulièrement propice et utile pour le criblage de souches candidates et de biosofides prototypes pouvant servir de précurseurs à la fabrication d'EOMI. Cette méthode est particulièrement utile pour l'évaluation des résistance à divers stresses dont les mécanismes génomiques et métaboliques sont (nécessairement) complexes et donc peu ou pas 5 élucidés (élucidables) et pour lesquels, donc, aucune méthode biomoléculaire, voire bioinformatique, n'a été développée à ce jour.
Cette méthode analytique a aussi l'avantage de mettre en évidence l'effet des divers biosolides sur la sélection à l'avantage des AZM (rustiques) et au dépends de azm (non-rustiques) favorisant ainsi une dominance des AZM dans les mélanges biosolides / MAP et éventuellement aussi en proximité des 10 granules EOMI in situ. Selon notre analyse, l'indice iMPS (ou dt28-3) croît régulièrement en fonction du stress osmotique conséquent à l'augmentation de la teneur en sels provenant directement du MAP
(Tableaux 3 et 4). Cette augmentation de l'iMPS est d'autant plus rapide et poussée que la teneur en matière organique (MO) des biosolides est faible (cf. Tableaux 1 et 2) ; la faible teneur en MO laissant libre cours aux sels MAP d'agir sur la survie de cellules non - rustiques à
l'avantage des AZM qui le sont.
15 Selon cette analyse, rapportée à la Figure 4, il est possible de distinguer clairement entre les biosolides plutôt faibles en MO, i. e. ici les biosolides « GSI » (cf. 8S 5, 6 et 7), et ceux qui sont plutôt riches en MO, i.e. ici les biosolides dit « Shoc » (cf. BS Set 8). Cette mesure indirecte mais appropriée de la bactéricidité
des mélanges biosolides / MAP sert à influencer intelligemment le choix des biosolides à utiliser pour la constitution éventuelle des EOMI prototypes.
20 Dans un premier temps, nous avons évalué une gamme de mélanges biosolides !
MAP ! BFCP
(ici des AZM ou des azm ; Tableau 4) pour leurs degrés de bactéricidité selon l'indice dt28-3 (ou iMPS).
Tel qu'attendu, le titre cellulaire est inversement proportionnel à la concentration MAP, mais surtout, et c'est le plus important ici, tes titres cellulaires AZM résistent beaucoup mieux à ces stresses osmolaires que les titre cellulaires azm (Tableaux 3 et 4). A forte teneur en MAP, les titres cellulaires des cellules 25 AZM dépassent largement ceux des cellules azm, par un facteur de plus de 50, les azm étant vraisemblablement moins résistantes à ce type de stress. De plus, le rapport entre les titres cellulaires pour les cellules AZM et azm et en parfait accord avec la variation de la densité optique des milieux JM
tels que déterminé selon l'indice iMPS (dt28-3) ; cette mesure relative de la dominance in situ des souches de type AZM issues de FR 2 833 016 reflète donc la rusticité inhérente à ces cellules expressément sélectionnées pour leurs compétence édaphique et leur adaptation à la vie dans les sols arables, y compris donc en proximité de granules d'EOMI relativement riches en sels MAP. Mieux, cette analyse nous a permit de distinguer entre deux groupes de biosolides (Tableau 4 et Figure 4).
Malgré l'apport de liants organiques et du support organo - minéral nécessaire à la production et la formulation par FFES des AZM, le titre bactérien, et donc la résistance au stress osmotique attribuable à la présence du MAP, a pu être maintenu vraisemblablement du fait de la rusticité relative des AZM par rapport aux azm moins compétentes et adaptées à la vie dans les sols (et ici les sels) (Tableau 5).
Enfin, nous avons aussi évalué, sommairement, l'effet d'une température de séchage plus élevée que la température ambiante sur la survie de granules post extrusion. La consolidation accélérée de ces granules à l'aide d'une température de séchage de 65 degré Celsius pendant une période de 90 minutes, soit suffisamment pour assurer la consolidation des granules, n'a pas eu d'effet marquée et/ou contreproductive sur la survie des bactéries de type AZM. Selon nos données rapportées au Tableau 5, les cellules AZM, et les azm dans une moindre mesure, résistent à un tel choc thermique. Cette rusticité
des AZM, encore une fois, est parfaitement en accord avec notre visée qu'est la fabrication d'EOMI.
***
l0 Une fois les souches AZM produites économiquement par FFES, et leurs rusticités démontrées, notamment en ce qui concerne leur résistance à des stress osmotiques en proximité des granules EOMI, il fallut en faire l'essai afin de démontrer leurs utilités agronomiques. Pour ce faire nous avons re- -isolé
des souches azotobactériennes de type AZM selon le protocole décrit dans FR 2 833 016 (Claude 2001 ) 15 et devant servir dans la fabrication d'EOMI (cf. Exemples 1, 2 et 3). Du coup nous avons aussi fabriqué
des homologues EOM non - bactérisés de ces EOMI (des EOM) afin de démontrer clairement l'effet AZM
sur l'efficacité pondérale relative des EOMI. Pour fin d'expérimentation, et ici à titre d'exemple non -limitative, nous avons retenu la préparation granulaire BS6 contenant 24,1%
MAP (cf. Essais 6 au Tableau 2) ; la bactéricidité de cette préparation est rapportée au Tableau 5.
Pour produire les EOMI
20 nous avons donc incorporé sur un base massique 9,6% de l'inocula AZM
produit selon notre procédé
FFES, partie intégrante de la présente invention. Pour la constitution des témoins EOM non-bactérisés nous avons incorporé, sur une base massique, 9,6% du substrat et co-formulant stérile sans les BFCP-AZM. Cet apport d'EOMI permet d'expédier au sol en proximité des graines de maïs l'équivalent de 1e13 cellules AZM par hectare. La granulation des pré-mélanges peut-être réalisée par extrusion selon un 25 procédé industriel reconnu. En guise de témoin conventionnel nous avons utilisé des sels de MAP (11-52-0) comme engrais minéral. Un témoin sans phosphore a aussi été utilisé.
Nous avons fait l'essai de ces EOMI et leurs témoins en serre (Tableaux 7 et 8) et aux champs (Tableaux 9 et 10).
Le choix des sols et des sites expérimentaux a fait ici l'objet d'une attention particulière. En sol relativement riche en P, le MAP en tant que témoin ne sera pas efficace, et donc la relative inefficacité
30 des EOM non - bactérisés ne peut être inférée ; une éventuelle efficacité
des EOMI ne pourra être attribuée qu'aux BFCP, ce qui est bien, mais n'est pas inventif en soi etlou l'objet du présent développement expérimental. En sol relativement plus pauvre en P, l'action du MAP sera au contraire détectable, et, bien que celle de l'EOMI un peu moins qu'en sol riche en P, l'efficacité des EOMI par rapport à celles des EOM sera maintenant plus évidente, voire comparable à
celle du MAP. En ce sens, 35 nous ne cherchons pas à simplement mettre en évidence futilité d'expédier des BFCP de type AZM en proximité des racines, cela n'étant pas en soit inventif, mais bine de le faire à l'aide d'EOMI, améliorant du coup l'efficacité relative d'un technologie existante, les EOM. Si c'est effectivement la bactérisation des EOM qui d'intérêt agronomique, mieux vaux donc s'assurer que l'effet MAP soit en elle-même détectable faute de quoi l'inefficacité relative des EOM par rapport au MAP que cherche à
résoudre la bactérisation ne pourra faire l'objet de nos revendications. De plus, et d'un point de vue commercial, il est loisible de démontrer que la bactérisation des EOM est efficace sur sol pauvre en P, voire comparable au MAP
lorsque utilisés comme engrais de démarrage. Donc, si le risque associé à ce type de fertilisation innovante en situation où l'utilisation du MAP est impérative, l'utilisation rassurante d'un démarreur organo-minéral bactérisé tel que proposée en situation où l'utilisation d'un démarreur conventionnel n'est que facultative est d'autant plus légitime. De plus, et enfin, cette utilisation facultative de ce nouveau type de démarreur peut du coup contribuer, par voie de sa composante BFCP, à
augmenter le potentiel de rendement sur sols riche et phosphore.
Exemple 4 : Efficacité des EO/EOM ,I~ctérisés~par rapport à des EO/EOM non -bactérisés.
Dans le cadre de cette essai en serre, nous avons fait (utilisation de deux grands groupes de sols (Tableau 6) ; (1 ) des sols podzoliques des hautes - terres au Québec dont les phosphates sont principalement sous formes alumino-ferriques (Fe, AI), et (2) des sols gleysoliques de la plaine montréalaise (nb. aussi appelée « basses - terres du Saint Laurent ») dont les phosphates sont principalement fixés sous formes calcin-magnésiques (Ca, Mg) (Tabi et al.
1990). Pour chacun de ces grands groupes, nous avons choisi deux niveaux de fertilité en phosphore. Pour chacun de ces quatre (4) types de sols nous avons évalué fEOMI prototype retenu, son homologue non -bactérisé (EOM), et un engrais de démarrage conventionnel (MAP), ainsi qu'une modalité témoin sans engrais de démarrage.
Nous avons répété ces quatre (4) modalités quatre fois et les avons disposées en « carré Patin » au sein de pots de deux litres contenant 1,667 kg de sols reconstitués pour fin d'expérimentation en serre. Les engrais ont été disposés dans un premier temps sur 1,000 kg et recouvert d'une couche de 333 g de sol ;
deux semences de maïs ont été placé au sommet de ces 1,333 kg de sol et recouvertes de 333 g de sol.
De cette façon, les engrais sont placés de façon à simuler l'application d'engrais de démarrage en bandes aux champs au moment du semis du maïs. En tout 64 pots de deux litres ont donc été installés, suivis et récoltés. Nous avons utilisé comme plante-test le maïs récolté à 30 cm ;
l'irrigation des plants ce fit à
l'aide d'une solution nutritive dépourvu de phosphore, mais autrement suffisamment riche pour assurer la pleine croissance de plantules selon les directives du Craaq (2003). Les matières sèches des parties aériennes (MSPA) ont été déterminées et analysées pour leurs teneurs en azote (N), phosphore (P), potassium (K), calcium (Ca) et magnésium (Mg).
Pour déterminer si les augmentations de rendements en MSPA, et éventuellement et si nécessaire des prélèvements en N, P, K, Ca et Mg, attribuables aux EOMI sont significatives, nous avons disposë les quatre séries de 16 pots en « carrés latins ~~ 4x4. A l'aide d'un protocole d'analyse de variance (Anova) conventionnel adaptée à ce type de dispositif expérimental nous avons pu effectuer la comparaison des moyennes des quatre modalités selon une technique dites de Newman-Keuls (NK).
Sur les sols dont le degré de saturation en P, i.e. le rapport P/Al, est moyen (i.e. 5,0) l'efficacité du MAP entant qu'engrais de démarrage est indéniable ; celle de fEOM l'est beaucoup moins (Tableaux 7 et 8), essentiellement du au fait de leur moindre teneur en P, et dans une moindre mesure en N. Cette réduction des teneurs en P, bien que souhaitable d'un point de vue agro-environnemental, est conséquente agronomiquement. Or, et selon les attentes suscitées par la présente invention, la bactérisation de ces même EOM permit cependant d'atteindre des rendements en MSPA comparables à
ceux obtenus avec te MAP (Tableau 7 et 8), et cela tout en réalisant au démarrage de la culture une économie d'environ 26 kg de P205 et de 5 kg d'azote par hectare. Nous avons pu reproduire ces résultats escomptés sur les deux types de sols. Cela dit, si le degré de saturation des sols est plus appréciable {i.e. PIAI = 7,5), l'efficacité du MAP, et accessoirement celle du témoins EOM
non-bactérisé, et essentiellement nulle, tandis que l'efficacité de fEOMI elle reste détectable ; elle est même, relativement au MAP, plus efficace ici que sur sols moins saturés en P. L'action de la composante BFCP-AZM des EOMI est donc indépendante de leurs composantes organo - minérales. En ce sens, elle s'ajoute à
celles-ci et procure, en certaines circonstances, une action tripartite organique, minérale et bactérienne aux EOMI.
Exemple 5 : Effic~çit~,~es EO/EOM bactérisés par rap3~ort à des EO/EOM non -bactérisés. Pour ces essais aux champs, nous avons reprit le mode opératoire utilisé pour l'Exemple 4. Nous avons utilisé
deux grands groupes de sols (Tableau 6) afin de situer deux dispositifs expérimentaux contrastés en terme de texture et de pédologie mais dont les degrés de saturation P (i.e.
P/AI) sont comparables.
Pour déterminer si les augmentations de rendements en MSPA et des prélèvements en N, P, K, Ca et Mg attribuables aux EOMI sont significatives, nous avons disposé les deux séries de 12 parcelles (i.e. quatre (4) modalités x 3 répétitions) en « blocs Fischer », ou en anglais - « randomized complete block design », 4x3. A l'aide d'un protocole d'analyse de variance (Anova) conventionnel adaptée à ce type de dispositif expérimental nous avons pu effectuer la comparaison des moyennes des quatre modalités selon une technique dites de Newman-Keuls (NK).
Tel qu'attendu, et étant donnée un degré moyen de saturation en P (i.e. P/AI
d'environ 4,8), l'efficacité du MAP sur les deux sites est détectable, tandis que celle du MAP
l'est à peine (Tableaux 9 et 10). Plus important, l'efficacité relative des EOMI est elle presque comparable à celle du MAP et, surtout, sensiblement plus grande que celles des EOM non - bactérisés.
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Tableau 3 : Titre cellulaire (moyenne pour les neuf (9) BS essayés) des cellules témoins azm et des cellules rustiques AZM selon la concentration en sel mono - ammoniacal de phosphore (MAP) des pré -mélanges biosolides / MAP / BFCP (AZM, azm). Nous avons inscrit l'indice iMPS, ou « dt28-3 », évalué
selon notre méthode analytique innovante.
Concentrationosmolarit cellules x e9 / g MAP (% p/p) MAP (osM) azm AZM AZMlazm iMPS (dt28-3) 0 0 10 10 1 -0.300 4 0.26 4 9 2 -0.175 7.7 0.58 1 8 8 -0.050 14.3 1.26 0.1 5 50 0.120 25 2.8 0.033 2 61 0.070 Tableau 4 : Estimation de la dominance AZM selon l'indice dt28-3 (ou iMPS) selon les divers types de biosolides (BS) évalués et la concentration en MAP des pré-mélange biosolides l MAP l BFCP (AZM, azm) ; ces données sont rapportées graphiquement à la Figure 4.
Biosolide (BS) 0°I° MAP 4% MAP 8% MAP 15% MAP 25% MAP
______________________________ iMPS (dt28-3) -__________________________ Envirogain (BS 1 ) Lisox (BS 2) Lisox C (BS 3) Poudrette (BS 4) GSI - Centri (BS -0.429 -0.161 -0.127 0.052 -0.015 5) GSI - SLPt (BS -0.141 -0.056 -0.047 0.189 0.315 6) GSI - SLPe (BS -0.388 -0.096 -0.151 0.122 0.139 7) Shoc 25.1 (BS -0.326 -0.105 -0.092 0.063 0.155 8) Shoc 28.1 (BS -0.445 -0.256 -0.225 0.091 0.018 9) Moyenne -0.346 -0.135 -0.128 0.103 0.122 s Tableau 5 : Titres cellulaires AZM-azm et indices de dominance AZM iMPS, ou «
dt28-3 », pour diverses préparations granulaires d'EOMI selon leurs teneurs en MAP et leurs concentrations en N et P par rapport à la celle du MAP ; deux modes de séchage et consolidation des granules ont été essayés.
______ iMPS
(dt28-3) ______ Prparation (21 % MAP %P / azm AZM AZMlazm dt28-t3 C - 56h) MAP
BS 8 (Shoc 25.1 20.8 27 0.1 20 200 0.155 ) BS 9 (Shoc 28. 21.2 27 0.08 50 625 0.018 i ) BS 9 (Shoc 28.1 21.6 26 0.06 40 667 0.018 ) BS 7 (GSI SLP 21.6 34 0.04 44 1100 0.315 corce) BS 6 (GSI SLP 21.6 33 0.04 43 1075 0.139 tourbe) BS 6 (GSI SLP 24.1 35 0.05 45 900 0.139 tourbe) ------iMPS
(dt28-3) ------Prparation (60C % MAP %P / azm AZM AZM/azm dt28-t3 - i h) MAP
BS 8 (Shoc 25.1 20.8 27 0.07 i 9 271 0.210 ) BS 9 (Shoc 28.1 21.2 27 0.05 45 900 0.026 ) BS 9 (Shoc 28.1 21.6 26 0.05 39 780 0.021 ) BS 7 (GSI SLP 21.6 34 0.03 38 1267 0.363 corce) BS 6 (GSI SLP 21.6 33 0.03 40 1333 0.173 tourbe) BS 6 (GSI SLP 24.1 35 0.04 39 975 0.151 tourbe) Tableau 6 : Caractérisation physico-chimique des sëries de sols « Batiscan »
(podzol sableux - sol S) et Le Bras » (gleysol argileux - sol A) d'où proviennent les deux sols utilisés pour les exemples d'application 3 et 4.
Caractristiquesol A sol S
Srie LeBras Batiscan ClassificationGleysol Podzol Texture Limon argileuxLoam sableux Localit St. Lambert,Deschambauft, Qc Glc Sable 17 56 Limon 63 34 d'Argile 20 10 pH eau 5,87 5,95 lo M.O. 2,61 3,26 CEC 11,6 14,1 VEC (%P/AI) 7,5 15 mg/kg P 45,4 76,4 m g/kg K 45,1 154 mg/kg Ca 898 712 mg/kg Mg so,9 37,5 mg/kg AI 972 1588 mg/kg Fe 169 78 P/AI 4,68 4,81 (PIAI) l VEC s2 31 Tableau 7 : Production de matière sèche des parties aériennes (MSPA) sur un sol podzolique par des plants de maïs cultivés en serre et récoltés lorsqu'ils ont atteint 30 cm de hauteur selon la modalité de démarrage.
Sot podzolique Apports au démarrage Rendements MSPA (maïs 30 cm) N Pz05 K20 P/AI = 5,0 PIAt = 7,5 Modalité de démarrage -------- (kg I ha) ----- ---------- (mg I pot) -----Tmoin sans dmarreur 0 0 0 300 c 402 b Avec MAP (11 - 52 9 40 0 425 a 426 b - 0) Avec E~NI (4,5 -17 3,8 14 0,3 325 bc 412 b - 0,5) Avec EaMI (4,5-17 -0,5)3,8 14 0,3 400 a 468 ab Tableau 8 : Production de matière sèche des parties ariennes (MSPA) sur un sol gleysolique par des plants de maïs cultivés en serre et récoltés lorsqu'ils ont atteint 30 cm d~
hauteur selon ia modalité de démarrage.
S Sol gleysolique Apports au démarrage Rendements MSPA (maïs 30 cm) N P205 K20 FIAI = 5,0 PIAI = 7,5 Modatité de démarrage _------_ (kg I ha) -_--__ ___-._____ (g I pot) _-_~~
Tmoin sans dmarreur 0 0 0 328 c 448 b 10 Avec MAP (11 - 52 9 40 0 450 a 455 b - 0) Avec EOM (4,5 -17 - 3,8 14 0,3 348 bc 455 b 0,5) Avec EOMI (4,5 -17 3,8 14 0,3 436 a 492 ab - 0,5) ces~
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' a' ~n o 2. Urea-based (Alkanani and MacKenzie 1996) In the first case, the aim is to reduce the fertilizer / soil contact so that reduce the degree of physicochemical fixation on iron oxy-hydroxide sites and of aluminum, and in the second case the degree of volatilization of urea as ammonia. In general, acid-base reactions and osmolysis phenomena near the granules containing N minerals and of P can harm the viability of BFCP reintroduced into their proximities. Given the strong organic matter content EOM, carbon content detrimental to their weight efficiency by compared to NPK fertilizers, the immediate reactivity of the granules is reduced as well as the mortality of BFCP
possibly reintroduced in their neighborhoods.
In Quebec and Canada it's the market for phosphate starter fertilizers who in a first time, seems the most promising for EOMI (EOMI). From 10 to 15 million units (ie kg P205 / ha) are sold in Quebec and over 20 million in Ontario, about a quarter of the units phosphate fertilizers normally consumed on the market; the Canadian market in general is in the order of $ 125 million Cad. The French market is over 150 million units. The value of replacement based on the price of 1 kg of P205 and about $ 1.00 CAD. For the essential, for lack of a weight efficiency comparable to those of mineral starter synthesis, penetration of this market by EO / EOM remains marginal today. It is precisely this efficiency weight that will improve the present invention.
Biofertilization using EOlEOM with BFCP - the problematic It would be advantageous to combine the application of starter fertilizers P and inocula BFCP.
Indeed, the accumulation of phosphorus in reaction with calcium, iron and / or the soil aluminum is a marked phenomenon in many agricultural soils (Beauchemin and Simard 1999;
Zhang et al. 1995;
Giroux et al. 2002; Pellerin 2003). This accumulation leads to increased pollutant load of these soils, and therefore represents a serious agro-environmental problem in several cases (Khiari and al. 2000). In addition, soils rich in phosphorus with little or no solubility, both in France than in Quebec, as of right respond poorly to fertilization - P (eg Chabot et al 1998;
Craaq 2003). Thus, on the soils with M3 indices (P / AI) above certain critical values pre-established for this type of soil, the Probability of response to phosphate fertilizers is generally low (eg.
less than 20 ° /
Craaq 2003). The invention makes it possible to improve this response via the action of the BFCP.
In soils said to be relatively rich in P the efficiency of fertilizers P is therefore limited although nothing indicates that the full yield potential of the crop has not been achieved.
P valuation and more particularly P fertilizers on these soils is therefore incomplete. In general, the agronomic efficiency of P fertilization on these soils, strong in many areas temperate agricultural crops both Quebec in France (Beauchemin and Simard 1999), may be partially improved using two techniques ;
o the use of organo-mineral fertilizers, or EOM (Khiari and Parent 2003;
Parent 2003);
o The bacterization of rhizospheres using BFCP (Antoun et al., 1998;
Chabot et al. 1993, 1996).
These two techniques, on the other hand, currently suffer from several problems of a technical nature that limit their efficiencies and therefore their deployment and their use by the farmer. The effectiveness agronomic inocula BFCP is undermined by; a carbon deficiency near the roots (Lynch and Whipps 1990, Alden et al., 2001), some bacteriocidal some products phytosanitary requirements and an insufficiently sought-after edaphic competence (Van Veen et al. 1997).
The agronomic efficiency of EOMs, especially EOs, is limited by poor weight efficiency given their organic matter content, ie of the order of five to six times their contents in P205 (Khiari and Parent 2003). The invention proposes to combine these two concepts and to overcome these limitations, particularly with a view to using these new fertilizers as a fertilizer start-up.
However, the valorization of EQ / EOM by bacterization-BFCP has been today limited because of certain technological obstacles, including the incompetence of the BFCP strains used to life in the soil, especially in the presence of strong osmolarities in proximity to start, the difficulty to obtain low-cost solid formulations of these, and finally the relatively high costs associated with the filming of ultimate MRFs. The present invention thus proposes to solve these problems and suddenly allow manufacturing and economical use of EOMI (ie EOM + inocula BFCP). This triple problematic can therefore be solved via a double in contact with cells BFCP. Indeed, it is possible to summarize schematically (essential of this invention by evoking double contact with bacteria - biosolids; the first serving energize the kinetics of growth of selected BFCP cells as constituents of the eventual solid inoculum, and the second serving to package and dispatch them towards the targets in situ, in particular here the organo-mineral fertilizers (EOM) intended for the startup of cultures (Figure 1). Of We are able to ensure the production of an EOMI (ie EOM +
inocula BFC> ~ to triple action, organic, mineral and bacterial.
Many agricultural soils, especially at the time of spring planting, have to their surfaces little or no crop residues. Soils low in crop residues time of sowing are also unsuitable for biofertilization of non-Leguminosea crops using I inoculated BFCP. Indeed, and in principle, given the lack of effective symbiosis between BFCP and non-culture Leguminosea, said BFCP cells would benefit from using the residues as carbon substrates and energy, which in this case is impossible. Although in such situations the express provision of exogenous crop residues by the farmer is unthinkable agronomically speaking, the contribution On the other hand, it is advisable to use soil amendments. However, the doses hectare required are generally of the order of 10 Mg per hectare or more (N'Dayegamiye 2000), and the BFCP bacterization of such quantities of material is not economical, or inefficient given the very large amount of associated bacterial cells that are able to mask the in situ action of the BFCP
reintroduced. The bacterization of a smaller amount of amendments under form of biosolids, biomass, residual fertilising materials, and more particularly advantageous, EO / EOM
so be considered. Given the usefulness of bringing a small amount organic matter exogenous, especially in the form of EO / EOM, it is necessary to place these this and the BFCP to reintroduce that they could contain, close to the seeds using of a combined seed drill, a little as is done for starter fertilizers. Hence a certain advantage to use EO / EOM
intended for starting non-Leguminosea agronomic crops as a support and shipping for said BFCP. The present invention relates mainly but not exclusively this last solution technique required for in-situ bacterization of non-leguminous cultures when there is little or no crop residues on the soil at planting time; cases with residues of ground culture at the time of sowing has previously been the subject of our patent FR 2 833 016 (Claude 2001;
Claude 2003) and has been reported by Claude and Flllion (2004).
So, although the BFCP inocula and the EO / EOM exist separately, it would be advantageous of them combine into one product for ease of agronomic use.
However, and to this day, beneficial comparison was impossible, given the absence of cells Rustic BFCP and truly adapted to life in soils and able to withstand a certain osmotic stress, of a on the other hand, and on the other hand given the unavailability of rustic inocula BFCP
of this type formulated in the state solid and economically produced by fermentation in the solid state. of the BFCP cells truly telluric and therefore sufficiently hardy to survive physical stresses specific chemicals to a such an addition are therefore indispensable here. However, the implementation of our previous patent, FR 2 833 016 (Claude 2001), allows to obtain this type of cells, which are suddenly not only rustic and well adapted to life in the soil, but also able to better withstand physicochemical stress in proximal presence of fertilizer granules, even of EO / EOM, although in this case stress is less. In addition, inocula formulated in the solid state and produced economically are necessary so to make the bacterization of EO / EOM economically profitable. In the context of this invention we actually developed a fermentation process and solid state formulation, or FFES, valuing the edaphic competence of the bacterial cells obtained according to FR 2 833 016.
To do this, we introduced fine soil particles in addition to cellulosic substrate normally present. Indeed, it is recognized that in the soil it is especially the particles fine, advantageously less 200 micrometers, which are most associated with the bacterial biomasses of the ground (Mills 2003;
Monrozier et al. 1991; Chenu 1993). Better, the presence of these fine particles soil during the FFES can not only valorize the edaphic competence of isolated BFCPs according to FR 2 833 016, but contribute to it. Indeed, according to Van Dyke and Prosser (1998 and 2000) it is possible to induce hardiness of already isolated telluric bacterial cells by putting them in contact with inert materials, organic and inorganic, essentially free of nutrients.
Other technical problems also prevented this combination EO / EOM and inocula BFCP;
~ Firstly, directly Bacterinizing NPK fertilizers could not be achieved because the reactions chemicals near the granules adversely affect the viability of the BFCPs as well reintroduced into their proximities. Indeed, fosmolarity (ie the sum of the osmotic pressures attributable to the set chemical species in solution) near the granules is a stress determining that confront the BFCP cells incorporated in the possible EOMIs. Several studies demonstrate the role preponderant of the exopolysaccharide envelope (EPS), or "glycocalyx", of soil bacteria in controlling the diffusion of ions, water, carbon substrates, etc., and so presumably although not - demonstrated unequivocally, in resistance to a possible shock osmotic caused by too much immediate concentration of mineral salts fertilizers. That said, there is nevertheless some publications on the osmo-regulating effect of alginates (Alg) produced by certain BFCPs of the genus Pseudomonas, without the concentrations salines are also higher than they are in proximity to said granules (Hart et al., 2001;
Chenu and Roberson 1996;
Schnider-Keel et al. 2001; Miller and Wood 1996; Hartmann et al. 1991). By example, according to Schnider-Keel et al (2001), a maximum salt content (NaCl) of 0.6 M is sufficient to mitigate severely the growth of Pseudomonas; in the case of an EOM enriches with 25% of MAP salts, the the molarity of the MAP is about 3.00, which is the NaCl molarity used by Schnider-Keel and al. (2001). In fact, this molarity of 0.6 M NaCl is probably good higher than that in the soil solution. It therefore remains that the osmotic stress in EOM granule proximity enriched is considerably stronger than it is in the solution of the ground. According to our calculations, we the molarity of the resulting salts (ie ammonium, phosphate, sodium, chlorine, etc.) in proximity of an EOM granule enriched to 25% MAP is approximately 3, ie 30 to 60 times what she is in the soil solution (see Miner and Wood 1996). The question is therefore;
BFCP cells 1o incorporated into EOMI can they survive and stay active and effective despite this stress, at least the time it takes to dissipate, say, a period of 6 to 10 days ?
~ Second, add BFCPs directly to EO / EOM during some type of processes (Parent et al., 2000, Marcoux et al., 1992) is impracticable given the nature of these processes generally involve high temperatures and pressures hydrostatic 15 relatively important needed for cooking and consolidation granules formed by extrusion, temperature and / or pressure in principle contrary to any bacterization. It takes note here that the resistance of bacteria to certain thermal shocks and related to their resistance to hydrostatic pressures (Aertsen et al. 2004); noticeable fact in relates to the aforesaid methods of fabrications.
Third, this type of bacterization is also limited by the use of bad BFCP cells adapted to life in soils (Van Veen et al 1997) and therefore unable to persist in time and to use the carbon source that represents the organic fraction of EOM.
~ Fourthly, it will also be necessary to be able to produce these BFCP economically and this preferably by fermentation in the solid state so as to obtain a formulation solid of these, less 25 prone to shocking the bacteria that they contain.
of their combination after bringing into contact with the EO / EOM.
In this sense, a previous patent application (WO 02/057862 A2) requires, by example, for incorporation of microorganisms into biosolids granules that these be incorporated Sequentially to one of the multiple layers encapsulating said granules. This approach can be limiting and cause problem for nonspherical granules, or incurs for granules having multiple layers encapsulating a certain nucleus. There is also French technology (FR 2,615,203) allowing the manufacture of an inoculum in the form of granules comprising a core consisting of a feeder matrix coating the microorganisms to be inoculated.
But this technology 35 is not comparable to the manufacture of EO / EOM and / or their precursors biosolids; it does not concern therefore not directly the present invention.
However, the bactericide of these granules, even if they are EOM type, is little or not documented in the scientific literature. Neilsen et al. (1994) speak of the utility to bring bacteria and MAP
together with an organic amendment for planting crops horticultural crops, without that does not pose the question of bactericidal MAP at this stage. Gaind and Gaur (2002) noted that s the addition of Pseudomonas striata to ash from mining of 40 tonnes per hectare, was not bactericidal, despite the presence of phosphate fertilizers in the mixed. The hectare doses of ash actually allowed to dilute the fertilizer P avoiding him to interact too directly with the BFCP. Finally, Lima and L. (1996) reported the effect of fertilization phosphated on populations bacterial, but for the entire soil, without this particular concern of the environment near the granules of fertilizer. So, strictly speaking, the bactericidal of the proximal environment EO / EOM granules, or even MAP / DAP granules, do not form part of knowledge bases and / or the state of the art.
Inventive step 1s The present invention advantageously combines inocula BFCP and EO / EOM, creating a new fertilizer material with triple action, mineral, organic and bacteriological, very advantageous for starting non-Leguminosea crops, particularly on soils whose degree of Phosphorus saturation is moderately high and / or with little or no crop residues on the ground at time of sowing. As a result, it allows better valorization of BFCP
particularly well adapted to living in the soil and withstanding strong osmotic pressures as well as organic carbon EO / EOM. The invention also makes it possible to solve certain problems of order bioindustrial harming the full development of biofertilization as a common agricultural practice.
Neither synthetic fertilizer, nor compost, nor simple bacterial inocula, we propose here to contribute development of a biofertilizer with triple action, mineral, organic and bacterial, produced by a bioprocess incorporating EO / EOM granules and bacterial biomasses of telluric origins particularly well suited to life in the soil. This biofertilizer new will be all the more capable to substitute in part for synthetic chemical fertilizers normally used in field crops agronomic as a starter fertilizer. In the immediate future, and of non restrictive example, we propose to develop such a mixed bioprocess using granules EO / EOM, and / or their organic precursors by co-formulation thereof with BFCP bacteria able to solubilize the soil phosphorus (Chabot et al 1993, Rodriguez and Fraga 1999). This will have to to increase the production of the fertilized cropping systems and to bring greater added value EO / EOM thus making them more competitive with NPK fertilizers;
this greatest value 3s added will promote the flow of their stocks as well as those of the MRFs to from which they are made.
Triple action fertilizer - mineral, organic and bacterial - are particularly useful given the synergistic action between the component organic EO / EOM
BFCP, on the one hand, and on the other, the possibility of biofertilising crops non-Leguminosea absent of soil culture residues that could have served as carbon substrates. Of more, this triple-action makes soils normally perceived as saturated with phosphorus more conducive to phosphate fertilization and therefore to an increase in their potential returns.
Double confiscation biosolids-BFCP - a double valuation of BFCP «
competent "
10 Hardiness and edaphic competence (ie adaptation to life in soil) of bacteria telluric type BFCP and isolated from arable soils according to FR 2 833 016 (Claude 2001) now be doubly valued. A first time during said fermentation and formulation in the solid state, or FFES, an integral part of the present invention, and this through a first implementation contact of these bacteria and fine solid particles of soils capable of boosting organic production -of these microorganisms. A second valuation of this hardiness and this adaptation to the life in the soil that the microorganisms possess is possible by second contact cells thus produced FFES and EO / EOM, or just as advantageously their premixes.
It is important to note that these contacts are either ineffective, be harmful for bacteria isolated in a more conventional way from arable soils. The double put in contact is here imperative and effective with "competent" telluric bacteria isolated according to FR 2 833 016. In effect, without the contact between the fine soil particles and these bacteria, the cellular title of endoculum reached by solid state fermentation would not be sufficient high to make economically profitable bacterization of fertilizing residual materials such as EO / EOM. Of Moreover, without this first contact, it would have been better to produce the 1810 cells / g via a fermentation in the more conventional liquid state; lyophilization and or the drying of biomasses bacterial so produced would, however, result in such mortality that it will be necessary to produce initially not 1e10 but 1e11 viable cells / g, resulting in a significant additional cost and prohibitive. Finally, he is always thinkable of not formulating the bacteria produced in the solid state by fermentation in the liquid state and apply them directly in liquid form to the EO / EOM; this bet in liquid contact - solid will, however, cause the chemical reaction of EO / EOM at the expense of survival bacteria telluric so placed on their surfaces.
In addition the need to enrich the EOM with a certain amount of salts minerals, especially the MAP, in itself, would cause the death, by osmolysis, of the BFCP cells, insufficiently rustic and adapted to life in the soil. However, isolated BFCP cells according to our process described in FR
2,833,016 are, because of their edaphic skills, particularly resistant to this type of stress osmotic, which allows them to be combined advantageously with EOMs relatively rich in mineral salts. In the opposite case, and from the application in bands of EOM
with BFCP
more conventional, the chemical reactions in proximity to said granules will be too bactericidal to allow survival and in situ activity of these organisms.
Synergie EOlEOM - BFCP - the meeting of two bioindustrial sectors The carbon requirements of the BFCPs located near the roots are in principle that partially satisfied by exudates from them. It is therefore reasonable that abundance The carbon content of the EO / EOM can also contribute to more needs nutrients from these microorganisms. In this sense, carbon and matter organic brought near roots by the EO / EOM as a starter fertilizer is so also doubly valued; they allow for greater availability of phosphates fixations on fixation sites otherwise occupied by phosphates (Parent 2003), and they act as nutritious substrates for BFCP thus reintroduced on the ground near the roots.
Triple (bio) fertilizing action - the loop is complete The mode of action of the EO / EOM that has been bacterized according to the present invention will therefore be tripartite.
First the mineral action is well known and stems simply from the supply of nutrients incorporated in the EOMs according to, for example, a method described in the US Pat.
6056801. Various EOM
(Labrie 2004, Dupuis 2004) and some organic fertilizers (E0) (Provencher 2003) have already been of a certain development. Second, the organic action comes from the interaction between the ligands organic matter (organic matter) from EO / EOM and fixation sites normally occupied by orthophosphate (phosphate) in soil (Parent 2003). For the essential, these fixation sites are iron and aluminum hydroxides as well as calcium. By occupying these binding sites, these ligands indirectly increase the availability and thus the assimilation of orthophosphates by the plant. Finally, third, the bacteriological action, finally, is the fruit of the interaction between the BFCP near the roots. This interaction can be multifaceted and involve a number of mechanisms, including diazotrophy, production of growth factors, dissolution of certain organic compounds and inorganic so as to make them more assimilable by the plant, etc. (Cf.
Arshad and Frankenberger, Jr.
1998; Antoun et al. 1998; Chabot et al. 1993; Rodriguez and Fraga 1999).
Triple action fertilizer - mineral, organic and bacterial - are particularly useful given the synergistic action between the component organic EO / EOM
BFCP, on the one hand, and on the other, the possibility of biofertilising crops non-Leguminosea even in absence of culture residues that could have otherwise served as substrates carbon. In addition, this triple action makes the soils normally perceived as saturated in phosphorus more conducive to a certain phosphate fertilization, and therefore to an increase in their potentials yields.
Advantages over the state of the art - agronomic advances and bio-industrial Of an adronomous view, and in addition to the synergy resulting from the in touch I inoculated BFCP and EOlEOM, the advantages of the invention compared to the state techniques are multiple;
o Reduction of risks of agro-environmental pollution and improvement balance sheets mass of organo-mineral fertilization;
o Simultaneous feed Iinocula BFCP and starter fertilizer and therefore a more great facility in the use of inocula BFCP for non-Leguminosea cultures;
o Partial discharge of fertilizing residual materials (FRM) and biosolids during the manufacturing of these value-added inputs for the production of large cultures ;
o Alternative to BFCP bacterization of non-crop seeds Leguminosea sown in absence of crop residues on the ground;
o Flexibility in on-farm use, and / or incorporation EOMs of the BFCP to factory.
From a bioindustrial point of view, the FFES, an integral part of the present (invention allows to reach cell densities of the order of 1 e10 cells per gram organo-mineral mixture, advantageously residues of cellulosic cultures mixed to a fine particles of arable soil, within three to four weeks after the start of incubation, and this from a density cell initial about 7, sometimes as low as 1e6 or 1e5 per gram of mixture, in non - sterile conditions and at room temperature if necessary. The advantages bio-industrial of this The process is therefore obvious, especially for the production Inocula de diazotrophic bacteria;
~ A strong reduction in fermentation capacity requirements, since the essentials of the increase in the cell density of the finoculum is in a solid medium ;
~ The adequacy of the support, mixture of culture residues and particles of soils, concerning telluric bacteria intended to be reintroduced into the floors;
~ The possibility of using a solid formulation for the purpose of spraying, what has traditionally bacterial formulations based on peat, or advantageously for the EO / EOM film coating;
~ Given the hardiness of candidate BFCPs, their use that bacterial additive for EOIEOM enriches with mineral fertilizer fertilizer helps ensure some numerical dominance at the expense of contaminating bacterial strains and less rustic. So, the degree of microbiological purity of the EOMI thus produced is de facto insured and all more compatible with current ecotoxicological regulations.
Finally, it is important to note that in a simpler form, the invention allows to stimulate, in the context of a certain fermentation in the solid state, the kinetics of growth of truly telluric bacterial cells at the expense of those that do not are not. The invention is therefore perfectly reconcilable with the state of the art in the sector fermentations in the state solid, in particular and by way of non-limiting example, according to the technology described in the EP patent 0 406 103 A1 ("Pesticide compositions based on microorganisms, their process of preparation and their application in agronomy "; INRA 1990). In such situations, the production of BFCP genuinely terrestrial sources isolated according to FR 2 833 016 is dynamized in the sense described above.
above, and this in the production lead-times normally required by those technologies of solid state fermentation according to the state of the art.
The invention thus makes it possible to produce, from a "starter" easily produced by fermentation and an inexpensive organo - mineral mixture based on culture and particles of soil, all containing only 1e6 cells per gram, a rich solid inocula up to 5e9 cells per gram, or even until 1810, so able to bring more than 1813 cells per hectare for one dose hectare of about 1 kg, which, according to the industry, would be difficult to reach otherwise.
Field and application conditions - emphasis on cereals In order to establish favorable conditions for the realization of the invention the fields of application of the invention can be advantageously restricted. The scope of the present invention can so in part define it. Some restrictions must therefore apply;
o In order to better ensure the realization of the invention, it is advantageous to to characterize EO / EOM
containing at least approximately 20 to 25 ° C of carbon, about 45 to 50% of organic material. This approximate minimum content avoids too much physical responsiveness chemical granules in contact with the ground, reactivity contrary to survival immediate BFCP, while by providing them with a maximum of carbon substrate above exuded close to the rhizosphere.
o Application in strips near seeds as a fertilizer start-up ; EO / EOM
should be applied close to the seed using a combined seed drill as fertilizer starting point (Craaq 2003). This situation is often the result of spring of field crops, including maize and certain cereals spring (CPVQ 1988).
Fortunately, these situations are also generally characterized by the absence of residues on the soil, or on the surface of the soil, at the time (spring) of sowing and therefore placement in strips of starter fertilizer.
Soils with no significant crop residues at planting time;
The presence of a overabundance of crop residues, more than three or even five Mg per hectare at the time of sowing, will favor the strictly organo-mineral action of the EO / EOM bacterialized detriment of highlighting the relative effectiveness of BFCPs. More exactly ; it's the C / N ratio relatively low (about 30) of the organic component of EO / EOM by compared to that of crop residues (about 100), which will allow this organic matter, in to start a certain mineralization of these residues. This action, although beneficial in self, will mask the action of the BFCP thus rendering the invention useless in such situations.
So it is sometimes advantageous in the sense of jointly applying BFCP and EO / EOM in situations where Crop residues on the soil are little or not present at planting time.
o In the case of BFCP for the improvement of phosphate nutrition culture it is advantage that the soils are rather saturated in fixed ahosphorus but otherwise assimilable on which field crops respond little or not to fertilizer phosphorus conventional. These soils whose P fixing power is appreciable (Zhang et al., 1995;
Beauchemin and Simard 1999; Parent 2003; Craaq 2003) therefore limit agronomic efficiency phosphate fertilizers commonly used. Agronomic crops on these floors meet generally bad at the intake of phosphorus. In greenhouse and / or under conditions controlled however, plants grown on these soils respond well to bacterization of their rhizosphere by BFCP capable, for example, of solubilising orthophosphates fixed on iron and aluminum hydroxides (Chabot et al, 1993, 1996, Rodriguez et al.
Fraga 1999).
The utility of the invention is not limited to the bacterization of EOMs since the EOs too can, in principle, be applied in strips near the seeds there and where the application of EO / EOM
would not be permissible at the time of sowing winter grain crops in France for example. Good that the practice is not common, it could become benefits of the invention. In the facts, and for convenience the description of the present invention, the EO / EOM concept here does not exclude that of EO.
Detailed description of the invention The present invention comprises;
a process for obtaining CMBT (mother cultures of telluric bacteria), advantageously according to FR 2 833 016 (Claude 2001), source cultures of telluric bacteria édaphiquement competent and therefore well adapted to life in soils (arable);
o an innovative fermentation and solid state formulation (FFES) process BFCPs thus isolated of these CMBTs, advantageously according to Claude (2001);
o an inocula BFCP, conditioned in the form of a sufficiently fine powder of so to allow, where appropriate, the film coating of EO / EOM without the addition of water and / or binder;
o an EO / EOM, or even its manufacturing process if it does not include steps bactericidal, as support and dispatch of these inocula, and also able to provide BCFPs that it has a carbonaceous and energetic substrate - the EO / EOM should contain a minimum approximately 20 to 25% of carbon, ie approximately 45 to 50% of material organic (see Allaire and Parent 2004);
o a method of biofertilizing non-Legmuminosea crops by application in strips proximity of the EO / EOM seeds thus bacterized, advantageously on soils with little or no of crop residues on the ground at the time of sowing and moderately saturated in phosphorus according to recognized indices.
The invention also implements an innovative analytical method allowing to confirm the expression of the hardy phenotypes on the part of the candidate BFCP
concerned. This method presented for the first time in the context of this invention does not require the intervention of biomolecular and / or bioinformatic techniques, techniques anyway and for essential for the detection of phenotypes whose genomic bases and are likely to be very complex (see Rüberg et al., 2003) and so hardly reducible and explicable via simple adneic transcription mechanisms in proteomes.
The invention is realized in two stages. At first, you have to perform a first bet in contact with biosolids / BFCP bacteria to manufacture the BFCP inocula to be used for bacterization EO / EOM, pre-, or post-constitution of these. In a second time, you have to do a second contact biosolids / bacteria BFCP now formulated at the solid state to ensure definitively the bacterization of EO / EOM, either directly by lamination granules already produced and consolidated, or indirectly, if permitted, by incorporation of the said inoculum during their processes of fabrications. To summarize, the invention therefore comprises (Figure 1);
~ A first contact between BFCP and fine soil particles serving to boost their multiplication during said fermentation and solid state formulation (FFES), allowing the manufacture of a BFCP inocula, advantageously in the form of a powder more or less fine, with a sufficient cellular title. The preferred method for obtaining the Candidate BFCP
particularly well adapted to life in soils is described in our previous patent FR 2 833,016.
~ A second contact between the BFCP inoculum thus produced and the biosolids carried out either at the time of filming the EO / EOM with said inoculant powder produced by FFES, either by incorporation of this inocula into an EO / EOM manufacturing process granules do not with no ultimately bactericidal steps for BFCP
candidates hardy and / or isolated according to the protocol FR 2 833 016 (Claude 2001) and can therefore harm appreciably and / or permanently for the survival of said BFCP.
I put in contact: Fabricafion of the inoculant powder by FFES
According to one embodiment of the invention a consortia of type cells BFCP, advantageously of azotobacteria given the ease of their culturing a once isolated according to the protocol described in our previous French patent FR 2 833 016. These cells BFCP
can, for example, come from Quebec's soils such as sandy podzols and / or clayey gleysols. We can also highlight the usefulness of the FFES using strains azotobactériennes previously isolated according to FR 2 833 016 (Claude 2001). These strains bacterial, BFCP as it it must according to the claims of FR 2 833 016, are particularly particularly well adapted to life in soils, and thus able to interact favorably with the fines soil particles part integral part of the FFES.
It is not imperative to use a consortium of n candidate strains for start this way FFES; everything depends on the nature of the soil in situ operation of the strains.
The FFES, by the presence of fine soil particles, also has the advantage of contributing to even to ensure some selection of the most "edaphically competent" strains (ie adapted to life in the soil arable). In addition to ensuring the production and formulation of biomass bacterial telluric origin, the FFES according to the present invention thus also makes it possible to ensure, in a to some extent, the edaphic competence. At the end of the FFES it is possible that the titles BFCP cell phones of n members initial consortia are not necessarily identical. That said, for end of approval of a possible commercial product, the use of a single BFCP strain for start the FFES is probably the most advantageous.
The production and stabilization of these candidate BFCP bacterial cells on a support organic matter, for example residues from chopped cereal approximate dimensions of the order of 1 to 4 mm allows them to interact with both this medium, which can also serve as a source of carbonaceous substrate, and fine particles of arable soil, advantageously about 100 micrometers, clays or any other inorganic and / or mineral support colloidal or clayey capable interaction with humic substances or other phenolic polymers, natural or synthetic, characteristics of arable soils. The fine particles of soil, according to the embodiment preferred embodiment of the invention, may be considered analogous to a functional fraction of clay - humic soil complex (Mills 2003). To enable this interaction "inorganic support x bacterium x organic support ", it is advantageous to proceed as follows;
~ Coat, by spraying, mixing, spraying or immersion, a part of substrate l supports carbonates, advantageously cereal crop residues including corn -grain, with around 1e6 cells from each of the few BFCP strains retained as component investigation of the possible inoculum, per gram of substrate - support, advantageously a non - sterile cellulosic culture residues;
~ Coat again, advantageously by mixing, the culture residues with the said fines soil particles so that the substrates are totally coated with these fine particles. In principle, the effectiveness of this coating is recognizable the absence of particles unadhered fines. It is advantageous to provide as many fine particles ground than organic support, although the proportions may vary depending on the metabolism of BFCP
retained.
~ Once the desired cellular title has been reached, the mixture can be brought to a humidity level about 18%, or even advantageously about 12 to 15%, or sufficiently dry for to be pulverized by grinding in the form of an inoculant powder of variable particle sizes as needed (see below, 2 "contact").
In this sense, because of the capacity of edaphic bacterial cells to interact favorably with fine soil particles, or their analogues, coating crop residues chopped, the invention is particularly well designed for the formulation of Azotobacterial biomasses and BFCP as described in our previous French patent (FR 2 833 016 ; Claude 2001). according to an advantageous implementation of the invention, it is possible to proceed as following ;
v Sterilize, for example by autoclaving, the finely cultivated residues chopped beforehand;
o Sterilize, for example by autoclaving, the fine soil particles;
o Treat with an antibiotic, ampicillin for example, an aqueous extract a soil mixture (fresh or pre - incubated) and mulch residues (including those from But), advantageously 50/50 plp, so as to ensure a clear predominance microbiological fungal biomasses in these extracts (nb.
wash the solid fraction of this extract, by centrifugation and re-suspension for example, in order to to eliminate the antibiotic used;
o Bring to crop residues, by equal volume by weight, 187 cell (azoto) bacterial per gram of residues (ie 187); here you have to use, as a liquid medium co-inoculation, the so-called fungal-dominated extract prepared above;
o After mixing the culture residues thus inoculated, incorporate the fines soil particles and mix, under aseptic conditions, preferably by stirring within a plastic container previously sterilized;
o smooth incubate, once the container closed with sealing, at least two to three weeks so to ensure the development of cellular title at an equal or higher level at 5e9 cells bacterial per gram of solid support, or even more if permitted.
This mixture of "crop residues - fine soil particles - extract "fungal" and bacterial biomasses now constitutes (raw inocula and its support solid formulated in the solid state. II
is equally advantageous, instead of sterilizing crop residues and more fine soil particles simply heat them up (eg heat them to about 60 degrees) degrees Celsius during a time in an oven) to reduce potential bacterial contaminants and fungal that they could generate during incubation. This approach has the advantage of minimum to the dynamics incubator, but still leaves an appreciable amount of contaminants, sum all however below 186 germs per gram of inocula, the limit authorized by the legislation in France.
In order to facilitate the filming of EO / EOM, where appropriate, it is advantageous to grind finely the inoculum thus produced and its solid support. Simple mechanisms, type "
coffee grinder "or" robots Culinary u with rotary actions are useful in this sense. Given the weak relative humidity of the preparation, grinding and sieving (eg 750 micrometers) are easily feasible and do not provoke not the death of bacteria.
There is no technical limit to the size of each production lot, in the extent to which a solid state fermentation is feasible, for example according to the methods of Suryanarayan et al. (2001), Inra (1990), or according to the rules of art generally described in Raimbault (1998). II is also possible to make small batches, individually from 1 to 5 kg, even l0kg, final weight post-FFES, the equivalent of a hectare dose. Finally, the use of a method of solid state fermentation of together with the said FFES as described here can serve advantageously to reduce the time to production, for example here and in a non - limiting way, well below the 21 days needed for production of the desired cell title mentioned above.
Z '~''e put in contact: Incorporation of BFCP in EOlEOM Q
The inocula, and more particularly the BFCP cells that it contains, products during the first contact can now be put in contact with the EO / EOM, or where appropriate and if possible, the organic fraction of the premixes to be used for their fabrications. Given a certain fragility inherent in all bacterial cells of origins telluric, it is advantageous that the EO / EOM and / or the aforesaid premixes contain a certain proportion of organic carbon, either advantageously a minimum of 20 to 25%. That said, and given the hardiness and competence of bacterial cells isolated according to FR 2 833 016, the counter mineral part preferentially MAP (mono-ammoniacal salts of phosphate) can to achieve the equivalent of 25%
of the final composition, or even more, for example 30% given the presence organic binders and / or according to the organic content of the constituent biosolids.
The bacterization by contacting the inocula BFCP and EO / EOM granules and / or their organo-mineral precursors, this can be done either on the farm by contacting the inocula and said EOIEOM, either industrially by a way of a process of seed treatment conventional, and this insofar as said method is not in itself bactericide. In both cases, the equivalent of the hectare dose, preferably from 1 to 5 kg of the title inocula at least 5e9 candidate BFCP cells per gram, which equals at one hectare dose from approximately 1813 to 5e13 via 200 kg of EO / EOM, or as required by the culture.
Regarding the bacterization of post-constitution EO / EOM granules, and given the sought-after small size of inoculum particles and roughness of granules of EO / EOM, the adhesion of finoculum is assured without necessarily having to add water or any binder, although these may be useful in certain circumstances; this membership spontaneous, if any, the advantage of minimizing bactericidal physico-chemical reactions near the granules. Finally, EOIEOM are advantageously granulated, either in the form of plugs cylindrical, either in form spherical, less common but more advantageous packaging (see EP 1 174 404 A2) With regard to the incorporation of BFCP by contact with the pre-mix over process of manufacturing said EO / EOM, it is advantageous that this process does not have steps bactericidal agents, in particular by physicochemical and / or thermal treatments such as that consolidation by baking at elevated temperatures for extended periods of time.
According to the various embodiments described in Tables 1 and 2, advantageous to include a binder, preferentially organic, such as molasses and / or vinasse beetroot up to 5 to 8%
(mass basis). In addition to allowing better consolidation of the granule, this type of binder can serve as a carbon substrate for BFCP cells. According to one embodiment, the granules can be gradually dried at a relatively low temperature, for example temperature ambient of a room. From a bioindustrial point of view, however, it is sometimes advantageous to use a higher drying temperature to reduce the time required to this consolidation. This approach is also compatible with the present invention given the hardiness of BFCP strains (AZM) isolated according to FR 2 833 016.
Therefore, BFCP incorporation can be done either before or after formation of said granules. If the manufacturing process involves a potentially or actually bactericidal it is beneficial to incorporate BFCP after granule formation consolidated. To do this, it is advantageous to modulate the porosity of the granules and the granulometry of the inoculant powder so as to allow to embed said inoculant in the granules once they produced. If the process of manufacturing does not involve a potentially or actually step bactericidal, it is advantageous to incorporate the inoculant powder produced by FFES directly into the mixtures.
Preferred embodiment and examples of applications From small samples of two soils (Table 6), we isolated, according to Claude (2001), pure cultures of candidate strains "AZM", that is to say diazotrophic and able to solubilize phosphates recalcitrant minerals, ie a priori and otherwise little soluble in water. It was necessary transfer aliquots of the mother cultures thus obtained to JM "(without nitrogen, Kumar and Narula 1999). The numerical dominance of these AZM cells will be ensured by JM liquid cultures of Rank III. JM media contain the only source of phosphate phosphates di- and tricalcium and in the form of hydroxyapatite, or "HA". Colonies will be obtained by spreading Aliquots of the cultures of Rang III on agar media JM and PK (with N;
Kumar and Narula 1999) also containing insoluble di- and tricalcium phosphates. Training translucent halos around some colonies will indicate the dissolution of these phosphate compounds previously insoluble.
In order to evaluate the solubilizing power of AZM isolates we determined the pH of JM media After 7 days of culture for row crops (R) 1, II and III; more the pH is low, plus, in principle, the The solubilizing ability of AZM isolates is large (Kim et al 1997, Kim et al.
2003). For reasons of practical orders, we retained only twelve (12) colonies, six (6) per type soil, on the basis of their solubilization index (1S, Kumar and Narula 1999); these colonies will serve to biomass production AZM in culture medium "No.1" (Institut Pasteur, Paris) of titles AZM cell of about 1e9 per mL.
15 of 12 isolates (6 per soil) were individually assessed by report to (12) witnesses matched non - bacteri - tized (t); each comparison is repeated three times. The dry matter production aerial parts, or MSPA (Hilali et al 2001, Gachon 1988, Sardi et al.
Csatho 2002) will serve as a clue the in situ activity of these candidate AZM isolates. The twelve (12) isolates will be tested in soil A and S
reconstituted (170 g / pot) and inoculated with millet (Phleum pratense L.). of the crop residues are Used as expedients for AZM (1% plp); crop residues thus bactericidal contain 5E5 AZM cells per g, approximately the equivalent of the hectare dose reported by Claude and Fillion (2004) for in situ bacterization of culture residues in situations Agronomic. The pots, 72 in all, have been fertilized with a nutrient solution (100 ml / pot) without nitrogen and phosphorus, the only exogenous phosphorus brought by solid incorporation being the equivalent of 60 kg of P per ha in form hydroxyapatite (HA). The equivalent of 75 units of nitrogen (ammonium nitrate) per hectare is brought 28 days after sowing, 10 to 12 days before the first cut (C1). To to evaluate the effect of the HA itself and / or culture residues we included two controls; a soil reconstituted without HA or residues of culture, and reconstituted soil with HA - controls with HA and residues of culture being matched to each of the pots labeled with one of the 12 AZM candidates.
Depending on the ability to promote the production of the MSPA we can, in principle, eliminate some AZM candidate strains the least promising. Candidate AZMs thus retained will serve initiating a fermentation and solid state formulation process, or FFES, and thus produce a inocula for the bacterization of EO / EOM precursor biosolids. The title cell the solid inocula as well product can advantageously reach 5E9 AZM per g. Each candidate AZM
holdback will be produced in this way, the final consortia being equal to each of they. The evaluation of the 12 isolates AZM (T) this was done using 12 matched non-bacterialized controls (t), each experimental unit thus constituted being repeated three times. T / T ratios for each isolate will serve as criteria evaluation of the in situ efficacy of candidate AZMs. These strains have fa following been produced and formulated according to the fermentation process and solid state formulation according to the present invention.
***
Examples of applications 1 and 2 made it possible to highlight the usefulness of the invention in term cell titre of an inoculant preparation produced by fermentation at the solid state. We used a consortium of two AZB-type azotobacterial strains considered the most promising according to the obtaining protocol described above.
Compared to a more conventional solid state fermentation, ie without the addition of fines soil particles capable of interacting favorably with strains bacterial telluric origin and particularly well suited to life in soils, so we can increase considerably the cellular titer of these preparations (Figures 2 and 3). Since these preparations are rather dry (ie 15%
of moisture), they can be considered as formulated at (solid state and can serve, others, to the dry characterization of EO / EOM, or even their pre-mixtures in extrusion course and consolidation. If it were not for this sharp increase in cellular title, the costs normally associated to the preparation of such an inoculum composed of telluric bacterial strains rustic and generally oligotrophs would make the bacterization of EO / EOM prohibitive.
Example 1: Effect ~ e splits, ~ t of fine soil particles on your density Azotobacterial cell a mixture of crop residues (wheat) and fine soil particles (70 microns) on the accumulation of nitrogen ammonia and azotobacteria b ~, m ~ sses over time. : In the frame of an FFES according to the present invention, we determined the cell density azotobacterial AZM strains with and without the presence of fine soil particles (Gleysolic clay loam). The presence of fine particles of soil (Figure 2) can effectively increase the cell density azotobactérienne. Only azotobacterial AZM strains isolated according to FR 2 833 016 (Claude 2001), or even in a lesser measurement, with isolated control azotobacterial strains according to FR 2 833 016 are able to interact favorably in this way with said fine soil particles and to hit a title important cell; cell title obtained with a strain control azotobacterium (Azotobacter.
chroococcum no. 76.116, Collection of the Institut Pasteur, Paris) is him, significantly lower.
Example 2 Evolution of Cellular Densities Within Microcosms containing the residues of cultured bacteria and coated with fine particles of fats according to the invention : We have taken over the essentials the protocol used for Example 1 but only with microcosms containing the fines soil particles to better demonstrate the kinetics of accumulation of different biomasses according to their origin and the type of isolation protocol used.
As we can see (Figure 3), from the 78th day of incubation, only the FFES containing the fines soil particles inoculated with AZM azotobacterial biomasses isolated according to FR 2 833 016 (Claude 2001) contain more than 1e8 AZM azotobacterial cells per gram of preparation. This shows clearly the possibility of simultaneously produce and package nitrogen-containing inocula, and this if and only if, The bacterial biomasses involved are particularly well adapted to life in soils and so all the more capable of interacting with these fine soil particles, which is not the case for example A. chroococcum 76.116 azotobacterial biomasses from the Pasteur Institute, even others control biomasses produced according to FR 2 833 016. In the case of the strains azotobactériennes isolated candidates according to FR 2 833 016, the cell density increased from 1 e6 to 5e9 after 21 days incubation; the control strain sensu FR 2 833 016 (Claude 2001) was, as than expected, more prolific 10 that fAzotobacter76.116, without reaching the cellular titles achieved with AZM.
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A third example of application allowed us to highlight the extraordinary resistance AZM strains with osmotic stresses caused by relatively high levels of MAP in the composition of the EOMI. To do this, we incubated premixes of various types of biosolids and various doses of MAP; certain physical characteristics chemicals of these mixtures are presented in Table 1.
EXAMPLE 3 Resistance and Survival of BFCP AZM Prolifed to Po ~ or Inc. and selected according to the isolation protocol described in FR 2 833 016 is ~ umis to osmotic stresses attributable to high doses of MAP in the composition of these EOMI. : The hardiness of AZM cells from FR 2 833 016 (Claude 2001) can be advantageously valued at the heart of the second contact with a high concentration of salts fertilizing minerals, either here from 25% of MAP. The presence of these salts is useful, even necessary given the low grade in mineral salts fertilizing EOM compared to MAP. Nevertheless, the mineral salt content fertilizer potential EOMI will necessarily and significantly less than those of theirs conventional counterparts devoid of organic matter. This impoverishment, far from constituting a disadvantage, represents an agro-environmental benefit in that it reduces the 30 dose-hectare of phosphorus introduced at startup; it's the BFCP, advantageously of the AZM type, which will now have to compensate for this beneficial phosphorus deficit.
We evaluated the capacity of isolated AZM cells according to FR 2 833 016 to resist osmotic (osmolar) pressures caused by MAP concentrations up to 3 M MAP, the fact of a concentration of about 25% of MAP on a mass basis (Tables 1 and 2). These 35 concentrations are many times higher than those present in the soil solution and so a priori and in principle bactericidal if it is not for the inherent hardiness of AZM
isolated according to FR 2 833 016.
To highlight this greater hardiness we used control strains, called azm, diazotrophs and SPMs conventionally isolated from target soils (Table 6).
Obtaining this type of control strains was previously described in our patent FR 2 833 016, and resumed above in the part of the present patent application. We introduced 1 e8 per g AZM and azm strains in two sets of biosolids / MAP mixtures more or less enriches MAP
(Tables 1 and 2) and previously sterilized by autoclaving; the cellular title of these backgrounds was subsequently determined on PK and JM media (Kumar and Narula 1999, Table 3). We have also introduced these two strains into the same mixtures but this time non-sterilized, question to evaluate their respective capacities to dominate the entire microbial flora present (Table 4).
It is important to note that it is impossible to date to discern with certainty between these two strains, or between them and other BFCP MPS soil, using biomolecular tools and genomics since these bacterial biomasses are for all intents and purposes related, except of course the greater hardiness of the most rustic i3FCP, here the AZM. Indeed, and except their actions in situ on the growth of plants, strains edaphically from FR
2,833,016 are hardly recognizable and / or distinguishable from strains relatives who are less so.
The osmotic stress caused by MAP is useful here in that it allows highlighting this greater skill. In fact, the osmotic pressure ensures the dominance of strains your more rustic, and especially here the AZM, reintroduced in the soil according to this invention. This dominance can be illustrated using a method analytical focus expressly within the scope of the present invention. It's about confronting strains introduced to multiple stresses and to make the diazotrophy and the MPS character of these strains of 'traits rapporteurs "for the supposed hardiness of these. So we put at point a method analysis to ensure the effective dominance of AZM strains, the most rustic by definition sensu FR 2 833 016 (Claude 2001), at the expense of those who are less. So, this method is advantageous for quality assurance and control (AQCQ) and that without having to depend on a detailed genetic and / or biomolecular characterization of the edaphic competence. We have therefore developed in this sense the following analytical method, called "index MPS "or iMPS, or still "dt28-3";
~ Aliquots of a dilution of the premix being incubated is placed in an environment JM type liquid (Kumar and Narula 1999) free of nitrogen AND phosphorus soluble; the only source of phosphorus being hydroxyapatite (HA), phosphate compound recalcitrant and insoluble except for the MPS action of AZM and azm strains. The aliquots are diluted the kind at 1 '5'8'",187'x"'and 18g ièm, and the JM tubes incubated for 28 days at temperature ambient temperature (20 - 22 degrees C). The optical density (OD) of the JM media is determined after 3 and 28 days of incubation, the difference between the two observations is revealing the activity MPS attributable to AZM or azm strains. In principle, if the aliquot is constituted only diazotrophic strains and MPS, the difference t28-t3 will be large; the presence of strains Non-diazotrophic "contaminants" and / or MPS will reduce the size of this difference. So, and given the supposed hardiness of the AZM strains from FR 2 833 016 in comparison with the control azm cells, the aliquots from the premixes to strong MAP levels should contain a higher proportion of AZM, the others constituents of bacterial flora, including azm inoculated with AZM, with been eliminated by a bactericidal osmotic pressure; the difference t28-3 will be rather great iff AZM (MPS here) have actually resisted osmotic stress. If the content MAP of pre-mixtures are reduced, selection favors AZM and at the expense of other cells bacterial less rustic, and for the most part not diazotrophic and / or MPS, will be less strong and the development of optical density from t3 to t28 will be all less pronounced.
In this sense, MAP induces selective stress in favor of BFCP (AZM) strains.
rustic isolated according to FR 2 833 016, whereas the medium JM favors it (expression character MPS of these diazotrophic strains. The MPS character, and incidentally the development of the DO from 3 to 28 days post inoculation of the media JM is here a "
rapporteur "
the hardiness of AZM.
In other words, the dissolution of phosphorus as detected by the initial clarification of the media JM acts here as a "reporter" trait for cells capable of diazotrophy, diazotrophy which is it, by definition of BFCP-AZM, associated with the supposed hardiness of these cells. If in response to osmotic stress the non-rustic cells are eliminated, only the Rustic cells (AZM) will be able to to be deficient in nitrogen and phosphorus JM backgrounds, and contribute to "Densify" (ie increase the apparent density) of these environments. For check that these are the most hardy cells (AZM) reintroduced by inoculation that resist, and not the other types of cells, in principle hardy months, even control cells (azm) they also reintroduced by Inoculation is simply to include non-inoculated controls and witnesses inoculated with control cells as defined in patent FR 2 833 016 (Claude 2001).
Since the uninoculated and inoculated (azm) controls do not cause increases sensitive density of JM media as a function of (increased osmotic stress in force in the pre-mixtures with MAP, densification of JM media associated with pre-blends inoculated with the help of BFCP supposedly hardy can only be attributed to resistance said cells audit stress osmotic. The increase in optical density (densification) of media JM, even here iMPS tel defined above, is therefore necessarily a positive demonstration of the hardiness of the strains candidates (AZM) introduced by inoculation into biosolids premixes / MAP, precursors possible EOMIs. Better still, this method of analysis also allows to evaluate, not only different candidate strains for their degree of hardiness, but also different substrates matrices for their bactericidal levels (see Tables 4 and 5, and Figure 4). As demonstrated in In the context of the present invention, this method of analysis is particularly conducive and useful for the screening of candidate strains and prototype biosofids which can serve as precursors to manufacturing of EOMI. This method is particularly useful for the evaluation of resistance to various stresses of which genomic and metabolic mechanisms are (necessarily) complex and so little or no 5 elucidated (elucidable) and for which, therefore, no method biomolecular or even bioinformatic has been developed to date.
This analytical method also has the advantage of highlighting the effect of various biosolids on the selection to the advantage of AZM (hardy) and at the expense of azm (non rustic), thus favoring dominance of AZM in biosolids / MAP mixtures and possibly also close to 10 EOMI granules in situ. According to our analysis, the iMPS index (or dt28-3) regularly depending on osmotic stress resulting in increased salt content from directly from MAP
(Tables 3 and 4) This increase in iMPS is all the more rapid and that the content of organic matter (OM) biosolids is low (see Tables 1 and 2); the low MO content MAP salts can act on the survival of non-hardy cells the advantage of AZMs that are.
According to this analysis, as shown in Figure 4, it is possible to distinguish clearly between biosolids rather low in MO, ie here the "GSI" biosolids (cf 8S 5, 6 and 7), and those who are rather rich in OM, ie here the so-called "Shoc" biosolids (see BS Set 8). This indirect measure but appropriate bactericidal biosolids / MAP mixtures serve to intelligently influence the choice of biosolids to use for the possible constitution of prototype EOMIs.
At first, we evaluated a range of biosolids mixtures!
MAP! BFCP
(here AZM or azm, Table 4) for their degree of bactericide according to the index dt28-3 (or iMPS).
As expected, the cellular title is inversely proportional to the MAP concentration, but above all, and it's the most important here, your AZM cell titles are very resistant better at these osmolar stresses as azm cell titer (Tables 3 and 4). With a high MAP content, cellular cell titles AZM significantly exceed those of azm cells by a factor of more than 50, the azm being presumably less resistant to this type of stress. In addition, the report between cellular titles for AZM and azm cells and in perfect agreement with the variation in optical density of JM media as determined by the iMPS index (dt28-3); this relative measure of the in situ dominance of AZM strains from FR 2 833 016 thus reflect the inherent hardiness to these cells specifically selected for their edaphic competence and their adaptation to life in soils arable, including so close to EOMI granules relatively rich in MAP salts. Better, this analysis allowed us to distinguish between two groups of biosolids (Table 4 and Figure 4).
Despite the addition of organic binders and the necessary organo-mineral support to production and the FFES formulation of the AZMs, the bacterial titre, and therefore the resistance to attributable osmotic stress the presence of MAP, was probably maintained because of the relative hardiness of AZM by compared to less competent azm and adapted to life in soils (and here salts) (Table 5).
Finally, we have also briefly evaluated the effect of a temperature of higher drying that the ambient temperature on post extrusion granule survival. The accelerated consolidation of these granules using a drying temperature of 65 degrees Celsius during a 90 minutes period, enough to ensure the consolidation of the granules, did not have marked effect and / or counterproductive on the survival of AZM-type bacteria. According to our data reported in Table 5, AZM cells, and azm to a lesser extent, resist such a shock thermal. This hardiness AZM, again, is perfectly in line with our goal of the manufacture of EOMI.
***
l0 Once the AZM strains produced economically by FFES, and their proven hardiness, especially with regard to their resistance to osmotic stress in proximity to EOMI granules, it was necessary to test it in order to demonstrate their agronomic utilities. For do this we re-isolate AZM-type azotobacterial strains according to the protocol described in FR 2 833,016 (Claude 2001) And for use in the manufacture of EOMI (see Examples 1, 2 and 3). Of blow we also made non-bacterial EOM homologs of these EOMIs (EOMs) to demonstrate clearly the AZM effect on the relative weight efficiency of EOMIs. For the purpose of experimentation, and here as an example no -limiting, we retained the BS6 granular preparation containing 24.1%
MAP (see Tests 6 at Table 2); the bactericide of this preparation is reported in Table 5.
To produce the EOMI
We have therefore incorporated on a mass basis 9.6% of the AZM inocula.
produced according to our process FFES, an integral part of the present invention. For the constitution of non-bactericized EOM controls we have incorporated, on a mass basis, 9.6% of the substrate and co-formulant sterile without BFCP-AZM. This contribution of EOMI makes it possible to send to the soil in the vicinity of the seeds of corn the equivalent of 1e13 AZM cells per hectare. The granulation of premixes can be carried out by extrusion according to Recognized industrial process. As a conventional witness we have used MAP salts (11-52-0) as a mineral fertilizer. A phosphorus-free control was also used.
We tried to these EOMIs and their witnesses in the greenhouse (Tables 7 and 8) and the fields (Tables 9 and 10).
The choice of soils and experimental sites was the subject of a particular attention. In soil relatively rich in P, MAP as a control will not be effective, and so the relative inefficiency Non-bactericidal EOM can not be inferred; a possible effectiveness EOMIs can not be attributed to the BFCP, which is good, but is not inventive in itself and / or the object of this experimental development. In relatively poor soil in P, the action of the MAP will be on the contrary detectable, and, although that of the EOMI a little less than in soil rich in P, the effectiveness of EOMIs by compared to those of the EOMs will now be more obvious, even comparable to that of MAP. In this sense, 35 we are not trying to simply highlight the futility of shipping BFCP type AZM in proximity to the roots, this is not inventive, but to do with the help of EOMI, improving the relative efficiency of an existing technology, EOMs. If it's actually the bacterization of Which are of agronomic interest, therefore better to ensure that the MAP effect is in itself detectable otherwise the relative ineffectiveness of EOMs compared to the MAP that seeks to solve the bacterization can not be the object of our claims. Moreover, and from a point of view commercial, it is permissible to demonstrate that the bacterization of EOM is effective on soil poor in P, even comparable to MAP
when used as a starter fertilizer. So, if the risk associated with this type of fertilization innovative situation where the use of MAP is imperative, the use of reassuring of a starter organo-mineral bacterium as proposed in a situation where the use of a conventional starter is that facultative is all the more legitimate. Moreover, and finally, this optional use of this new type starter can contribute, by way of its BFCP component, to increase the potential of yield on rich soils and phosphorus.
Example 4: Effectiveness of EO / EOM, I ~ ctered ~ compared to non-EO / EOM
bactérisés.
As part of this greenhouse trial, we did (use of two large groups of soils (Table 6); (1) Podzolic soils of highlands in Quebec whose phosphates are mainly in alumino-ferric forms (Fe, Al), and (2) soils Gleysolic of the plain Montreal (also known as the St. Lawrence Lowlands) whose phosphates are mainly fixed in calcin-magnesic forms (Ca, Mg) (Tabi et al.
1990). For each of these large groups, we chose two levels of phosphorus fertility. For each of these four (4) soil types we have evaluated fEOMI prototype retained, its counterpart not (EOM), and a conventional starter fertilizer (MAP), as well as a control modality without starter fertilizer.
We repeated these four (4) modalities four times and arranged them in "square Patin" within of two-liter pots containing 1,667 kg of reconstituted soils for the purpose of greenhouse experimentation. The fertilizers were initially placed on 1,000 kg and covered with layer of 333 g of soil;
two maize seeds were placed at the top of these 1.333 kg of soil and covered with 333 g of soil.
In this way, the fertilizers are placed so as to simulate the application of starter fertilizer in strips in the fields at the time of sowing corn. In all 64 pots of two liters have been installed, monitored and harvested. We used as a test plant corn harvested at 30 cm;
the irrigation of the plants this made to using a nutrient solution devoid of phosphorus but otherwise rich enough to ensure the full growth of seedlings according to Craaq guidelines (2003). The dry matter of the parties (MSPA) were determined and analyzed for their nitrogen contents (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca) and magnesium (Mg).
To determine if increases in yields of MSPA, and possibly and if samples from N, P, K, Ca and Mg, attributable to EOMI are significant, we have have four sets of 16 pots in "Latin squares ~~ 4x4. Using a protocol of analysis of Conventional variance (Anova) adapted to this type of experimental device we were able to perform the comparison of the averages of the four modalities according to a technique known as Newman-Keuls (NK).
On soils with a degree of saturation in P, ie the ratio P / Al, is medium (ie 5.0) the effectiveness of MAP as starting fertilizer is undeniable; that of fEOM is much less (Tables 7 and 8), mainly due to their lower P content, and in a lesser extent in N. This reduction in P levels, although desirable from an agro-ecological point of view environmental, is consistent agronomically. However, and according to the expectations raised by the present invention, the However, bacterization of these EOMs made it possible to achieve MSPA comparable to those obtained with the MAP (Table 7 and 8), and that while realizing starting the culture a saving around 26 kg of P205 and 5 kg of nitrogen per hectare. We could reproduce these results expected on both types of soils. That said, if the degree of saturation of soils is more appreciable (ie PIAI = 7.5), the effectiveness of the MAP, and incidentally that of the EOM controls non-bacterized, and essentially zero, while the effectiveness of fEOMI remains detectable ; it is even, relatively MAP, more effective here than on soils less saturated in P. The action of the BFCP-AZM component of EOMI is therefore independent of their organo - mineral components. In this meaning, it adds to these and, in certain circumstances, provide for tripartite organic, mineral and bacterial at EOMI.
Example 5: Efficiency, EO / EOM Bacteriatized by Rap3 ~ ort EO / EOM No -bactérisés. For these field trials, we have resumed the procedure used to Example 4. We used two large groups of soils (Table 6) to locate two devices contrasted experimental term of texture and pedology but whose saturation degrees P (ie P / AI) are comparable.
To determine whether increases in MSPA yields and removals in N, P, K, Ca and Mg attributable to EOMI are significant, we have arranged the two sets of 12 plots (ie four (4) modalities x 3 repetitions) in "Fischer blocks", or in English - "randomized complete block design ", 4x3. Using a variance analysis protocol (Anova) conventional adapted to this type of experimental device we were able to perform comparison of averages of the four modalities according to a technique called Newman-Keuls (NK).
As expected, and given an average degree of saturation in P (ie P / AI
about 4.8), the effectiveness of MAP on both sites is detectable, while that of MAP
is barely (Tables 9 and 10). More importantly, the relative effectiveness of EOMIs is almost comparable to MAP and, above all, significantly larger than those of non - bacterial EOMs.
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Table 3: Cellular titre (average for the nine (9) BS tested) azm control cells and AZM hardy cells according to the monoammoniacal salt concentration of phosphorus (MAP) pre -biosolids / MAP / BFCP blends (AZM, azm). We have registered the iMPS index, or "dt28-3", evaluated according to our innovative analytical method.
Concentrationosmolarit cells x e9 / boy Wut MAP (% w / w) MAP (osM) azm AZM AZMlazm iMPS (dt28-3) 0 0 10 10 1 -0.300 4 0.26 4 9 2 -0.175 7.7 0.58 1 8 8 -0.050 14.3 1.26 0.1 5 50 0.120 25 0.0 0.033 2 61 0.070 Table 4: Estimate of AZM dominance by index dt28-3 (or iMPS) according to the various types of biosolids (BS) and MAP concentration of biosolids premix l MAP l BFCP (AZM, azm); these data are reported graphically in Figure 4.
Biosolids (BS) 0 ° I ° MAP 4% MAP 8% MAP 15% MAP 25% MAP
______________________________ iMPS (dt28-3) -__________________________ Envirogain (BS 1) Lisox (BS 2) Lisox C (BS 3) Powder (BS 4) GSI - Centri (BS -0.429 -0.161 -0.127 0.052 -0.015 5) GSI - SLPt (BS -0.141 -0.056 -0.047 0.189 0.315 6) GSI - SLPe (BS -0.388 -0.096 -0.151 0.122 0.139 7) Shoc 25.1 (BS -0.326 -0.105 -0.092 0.063 0.155 8) Shoc 28.1 (BS -0.445 -0.256 -0.225 0.091 0.018 9) Average -0.346 -0.135 -0.128 0.103 0.122 s Table 5: AZM-azm cell titers and AZM iMPS dominance indices, or "
dt28-3 ", for various granular preparations of EOMI according to their MAP levels and their N and P concentrations relative to to that of MAP; two modes of drying and consolidation of granules have been tried.
______ Imps (Dt28-3) ______ Preparation (21% MAP% w / azm AZM AZMlazm dt28-t3 C - 56h) MAP
BS 8 (Shock 25.1 20.8 27 0.1 20 200 0.155 ) BS 9 (Shock 28. 21.2 27 0.08 50 625 0.018 i) BS 9 (Shoc 28.1 21.6 26 0.06 40 667 0.018 ) BS 7 (GSI SLP 21.6 34 0.04 44 1100 0.315 bark) BS 6 (GSI SLP 21.6 33 0.04 43 1075 0.139 peat) BS 6 (GSI SLP 24.1 35 0.05 45 900 0.139 peat) ------Imps (Dt28-3) ------Preparation (60C% MAP% AZM P / AZM AZM / azm dt28-t3 - ih) MAP
BS 8 (Shock 25.1 20.8 27 0.07 i 9 271 0.210 ) BS 9 (Shoc 28.1 21.2 27 0.05 45 900 0.026 ) BS 9 (Shock 28.1 21.6 26 0.05 39,780 0.021 ) BS 7 (GSI SLP 21.6 34 0.03 38 1267 0.363 bark) BS 6 (GSI SLP 21.6 33 0.03 40 1333 0.173 peat) BS 6 (GSI SLP 24.1 35 0.04 39 975 0.151 peat) Table 6: Physico-chemical characterization of "Batiscan" soil series (sandy podzol - soil S) and The Arm "(clay gleysol - soil A) from which the two soils used for examples 3 and 4.
Characteristicsol A soil S
LeBras Batiscan Series ClassificationGleysol Podzol Texture Loamy loamLoam sandy Localit St. Lambert, Deschambauft, Qc Glc Sand 17 56 Limon 63 34 of Clay 20 10 pH water 5.87 5.95 lo 2.61 3.26 CEC 11.6 14.1 VEC (% P / AI) 7.5 15 mg / kg P 45.4 76.4 mg / kg K 45.1 154 mg / kg Ca 898 712 mg / kg Mg N, 9 37.5 mg / kg AI 972 1588 mg / kg Fe 169 78 P / IA 4.68 4.81 (PIAI) l VEC s2 31 Table 7: Dry matter production of aerial parts (MSPA) on a podzolic soil by maize plants grown in the greenhouse and harvested when they reach 30 cm height according to the modality of start-up.
Podzolic Stuffing Inputs at start Yield MSPA (maize 30 cm) N Pz05 K20 P / Al = 5.0 PIAt = 7.5 Starting method -------- (kg I ha) ----- ---------- (mg I pot) -----Warning light without starter 0 0 0 300 c 402 b With MAP (11 - 52 9 40 0 425 to 426 b - 0) With E ~ NI (4,5 -17 3,8 14 0,3 325 bc 412 b - 0.5) With EaMI (4.5-17 -0.5) 3.8 14 0.3 400 to 468 ab Table 8: Dry matter production of airborne particles (MSPA) on soil Gleysolic maize plants grown in the greenhouse and harvested when they reached 30 cm d height according to the modality of start-up.
S Gleysolic soil Start-up contributions MSPA yields (maize 30 cm) N P205 K20 FIAI = 5.0 PIAI = 7.5 Start modality _ ------ _ (kg I ha) -_ - __ ___-._____ (g I pot) _-_ ~~
Warning without starting 0 0 0 328 c 448 b 10 With MAP (11 - 52 9 40 0 450 to 455 b - 0) With EOM (4,5 -17 - 3,8 14 0,3 348 bc 455 b 0.5) With EOMI (4,5 -17 3,8 14 0,3 436 to 492 ab - 0.5) these ~
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