CA2489214A1 - Anti-aurora-a monoclonal antibody, method for obtaining same, and uses thereof for diagnosing and treating cancers - Google Patents

Abstract

Monoclonal antibody (MAb) that recognizes specifically the human or murine aurora-A kinase (I) binds to membranes that contain (I), can detect and optionally purify (I) by immunoprecipitation, stains biological tissues where (I) is secreted and does not inhibit the enzymatic activity of (I), is new. Independent claims are also included for the following: (1) in vitro diagnosis and prognosis of solid tumors (of breast, stomach or colon-rectum) in humans or animals, using MAb to detect, and optionally quantify, (I) in biological samples; (2) kit for performing method (1), comprising MAb and optionally a marker of cell proliferation, preferably a marker of PCNA, especially an antibody; (3) screening for inhibitors of (I); and (4) preparing MAb.

Description

ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-AURORA-A, SON PROCEDE
D'OBTENTION, ET SES UTILISATIONS DANS LE DIAGNOSTIC ET LE
TRAITEMENT DES CANCERS
La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre la kinase aurore-A des mammifères, son procédé d'obtention, ainsi que ses utilisations dans le cadre du diagnostic ou du pronostic de cancers, et dans des compositions pharmaceutiques dans le cadre du traitement des cancers.
La protéine kinase aurore-A est un oncogène, sa surexpression dans des cellules Rat-1 suffit à provoquer l'apparition d'un phénotype transformé et l'implantation de ces cellules transformées dans des sôuris immunodéficientes induit l'apparition de tumeurs.
(Bischoff et al., 199 ; Zhou et al., 1990. Le gène codant pour cette kinase est localisé
sur le chromosome 20 en 20q13, amplicon fréquemment détecté dans de nombreuses tumeurs (sein, colon, cancer gastriques).
La surexpression de la protéine kinase aurore-A a été observée dans de nombreuses tumeurs. De manière très intéressante la présence de cette kinase en quantité anormale n'est pas corrélée à une prolifération détectée par coloration avec un marqueur spécifique de la prolifération tel que PCNA. Aurore-A est donc un marqueur spécifique de l' aspect tumoral des cellules (Tanaka et al., 1999 ; Takahashi et al., 2000).
Aurore-A fait partie d'une famille multigénique de protéines kinases appelées aurore, elle comporte trois membres : aurore-A (décrite précédemment) aurore-B
(Prigent et al., 1999) et aurore-C (Bernard et al., 1990. Bien que seule aurore-A ait un réel pouvoir oncogène les deux autres kinases ont ég~.lement été retrouvées surexprimées dans les mêmes tumeurs (Giet et Prigent, 1999).
L'amplification du gène codant pour aurore-A est associée à la présence d'une activité anormalement élevée de la protéine kinase dans ces tumeurs. De plus la surexpression ectopique de cette kinase dans des cellules en culiure suffit à
provoquer l'apparition d'un phénotype transformé, ces cellules transplantées dans des souris immunodéficientes induisent l'apparition de tumeurs.
La surexpression de la kinase aurore-A est très étroitement liée à l'état cancéreux d'une cellule. Cette surexpression de la kinase aurore-A induit une polyploïdie des cellules et provoque une amplification des centrosomes, deux événements préfigurant un mauvais pronostic du cancer du sein par exemple. ANTI-AURORA-A MONOCLONAL ANTIBODIES, METHOD THEREOF
, AND ITS USES IN DIAGNOSIS AND
CANCER TREATMENT
The subject of the present invention is a monoclonal antibody directed against the kinase aurora-A mammals, its process of obtaining, as well as its uses in the in the diagnosis or prognosis of cancers, and in compositions pharmaceuticals for the treatment of cancer.
The protein kinase aurora-A is an oncogene, its overexpression in cell Rat-1 is sufficient to cause the appearance of a transformed phenotype and the implantation of these cells transformed in immunodeficient sisters induces the appearance of tumors.
(Bischoff et al., 199; Zhou et al., 1990. The gene coding for this kinase is situated on chromosome 20 in 20q13, amplicon frequently detected in many tumors (breast, colon, gastric cancer).
Overexpression of aurora-A protein kinase has been observed in many tumors. Very interestingly the presence of this kinase in abnormal amount is not correlated with proliferation detected by coloring with a proliferation specific marker such as PCNA. Aurore-A is therefore a marker pen specific to the tumor aspect of cells (Tanaka et al., 1999; Takahashi et al., 2000).
Aurore-A is part of a multigene family of protein kinases called aurora, it has three members: aurora-A (described above) aurora-B
(Prigent et al., 1999) and aurore-C (Bernard et al., 1990. Although only dawn-A have a real oncogenic power the other two kinases were also found.
overexpressed in the same tumors (Giet and Prigent, 1999).
Amplification of the gene encoding aurora-A is associated with the presence of a abnormally high protein kinase activity in these tumors. Moreover the ectopic overexpression of this kinase in hair cells is sufficient to provoke the appearance of a transformed phenotype, these cells transplanted into mouse immunodeficient induce the appearance of tumors.
The overexpression of aurora-A kinase is very closely linked to the state cancerous of a cell. This overexpression of the aurora-A kinase induces a polyploidy of cells and causes amplification of centrosomes, two events prefiguring a poor prognosis for breast cancer, for example.

2 Il est donc important de pouvoir mesurer précisément l'expression de cette kinase dans les pathologies cancéreuses, tant au niveau ARNm que protéine.
Or la mesure de l'expression de la protéine kinase aurora-A dépend entièrement de l'utilisation d'un bon anticorps monoclonal.
Toutefois, aucun anticorps monoclonal suffisamment spécifique dirigé contre la protéine kinase humaine aurora-A n'a pu être obtenu jusqu'à présent, et n'est disponible dans le commerce.
La présente invention a pour but de fournir un anticorps monoclonal anti-aurora-A
fiable, se liant à cette protéine avec une spécificité et une sensibilité
suffisante pour envisager son utilisation à des fins de recherche expérimentale, ainsi que dans le domaine du diagnostic, du pronostic et du traitement des cancers.
L'invention concerne un anticorps monoclonal anti-aurora-A reconnaissant spécifiquement la kinase aurora-A humaine et marine, et ayant les propriétés suivantes * il peut se fixer sur les membranes contenant la protéine aurora-A humaine ou manne, * il permet de détecter, et, le cas échéant, de purifier, la protéine aurora-A
humaine et marine par immunoprécipitation, * il permet la coloration des tissus biologiques où est sécrétée la protéine aurora-A
et, * il n'inhibe pas l'activité enzymatique de la protéine aurora-A humaine et marine, ledit anticorps monoclonal étant tel qu'obtenu par - cinq injections espacées de quinze jours à des souris de protéine kinase aurora-A recombinante produite pax des bactéries E. coli transformées avec un vecteur d'expression bactérien dans le génome duquel a été inséré a'ADNc humain codant pour aurora-A, sacrifice desdites souris, et fusion entre des cellules de la rate de ces souris et des cellules de hamster immortalisées en culture pour obtenir des hybridomes, - criblage des hybridomes produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine recombinante utilisée pour l'immunisation des souris lors de l'étape précédente, et récupération des hybridomes positifs après ce premier crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A à partir d'un extrait de cellules humaines HeLa en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce deuxième crible, 2 It is therefore important to be able to precisely measure the expression of this kinase in cancer pathologies, both in terms of mRNA and protein.
However, the measurement of the expression of aurora-A protein kinase entirely depends the use of a good monoclonal antibody.
However, no sufficiently specific monoclonal antibody directed against human protein kinase aurora-A has so far been unavailable, and is not available in trade.
The object of the present invention is to provide an anti-monoclonal antibody aurora-A
reliable, binding to this protein with specificity and sensitivity sufficient for consider its use for experimental research, as well as in the area of cancer diagnosis, prognosis and treatment.
Disclosed is a monoclonal anti-aurora-A antibody which recognizes specifically human and marine aurora-A kinase, and having the properties following * it can attach to membranes containing the human aurora-A protein or manna, * it makes it possible to detect, and, if necessary, to purify, the aurora-A protein human and marine by immunoprecipitation, * it allows the coloring of biological tissues where the protein is secreted aurora-A
and, * it does not inhibit the enzymatic activity of the human aurora-A protein and Marine, said monoclonal antibody being as obtained by - five injections fifteen days apart in protein kinase mice aurora-A recombinant produced by E. coli bacteria transformed with a vector of bacterial expression in the genome of which has been inserted a human cDNA encoding for aurora-A, sacrifice of said mice, and fusion between cells of the miss of these mice and hamster cells immortalized in culture to obtain hybridomas, - screening of hybridomas producing an antibody capable of immunoprecipitating the recombinant protein used for immunization of mice during step previous, and recovery of positive hybridomas after this first screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous aurora-A protein from a extract of human HeLa cells in culture, and recovery of hybridomas positive after this second screen,

3 - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en imrnunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules humaines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce troisième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A de souris à
partir d'un extrait de cellules marines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce quaïrième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules marines en culture, - récupération et purification par clonage d'un hybridome positif après (étape de criblage précédente, et produisant un anticorps monoclonal possédant l'ensemble des propriétés définies ci-dessus.
A ce titre, (invention a plus particulièrement pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, encore désignë anticorps 35C1, ledit anticorps étant secrété par fhybridome déposé le 12 juin 2003 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de (Institut Pasteur sous le numéro I-3050.
L'invention a également pour objet (utilisation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus parüculièrement de (anticorps 35C1 susmentionné, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic ih vitro, ou de pronostic de cancers chez l'homme ou l'animal.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement de l'anticorps susmentionné, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic irz vitro, ou de pronostic, de tumeurs solides, tels que les cancers du sein, les cancers gasiriques et les cancers colorectaux.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement de l'anticorps susmentionné, en association avec un marqueur de prolifération cellulaire, tel qu'un marqueur de la protéine PCNA (Tanaka et al., 1999 ; Takahashi et al., 2000).
L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro, ou de pronostic, de cancers tels que définis ci-dessus, chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu' elle comprend 3 - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of human cells in culture, and recovery of the positive hybridomas after this third screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous protein aurora-A from mice to go of an extract of cultured marine cells, and recovery of hybridomas positive after this fourth screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of cultured marine cells, - recovery and purification by cloning of a positive hybridoma after (step from the previous screening, and producing a monoclonal antibody having all properties defined above.
As such, (the invention more particularly relates to an antibody monoclonal as defined above, also designated antibody 35C1, said antibody being secreted by fhybridome deposited on June 12, 2003 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of (Institut Pasteur under number I-3050.
The subject of the invention is also (use of a monoclonal antibody such than defined above, and more particularly of (35C1 antibody mentioned above, for the bet use of an in vitro diagnostic method, or cancer prognosis in man or animal.
A more particular subject of the invention is the use of an antibody monoclonal as defined above, and more particularly of the antibody above, for the implementation of an irz vitro diagnostic method, or of prognosis, solid tumors, such as breast cancer, cancer gasiriques and colorectal cancers.
The invention also relates to the above use of an antibody monoclonal as defined above, and more particularly of the antibody above, in combination with a cell proliferation marker, such as one PCNA protein marker (Tanaka et al., 1999; Takahashi et al., 2000).
The subject of the invention is also any method of in vitro diagnosis, or of prognosis, of cancers as defined above, in humans or animals, characterized in that it includes

4 - la mise en présence d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus 'particulièrement de (anticorps 35C1 susmentionné, avec un échantillon biologique prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé sur un support solide, - la détection, et le cas échéant la quantification, de la protéine aurora-A
susceptible d'étre présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués, notamment d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps monoclonal lié à
ladite protéine aurora-A, soit la protéine aurora-A liée audit anticorps monoclonal dans les complexes formés lors de l'étape précédente entre l'anticorps monoclonal et la protéine i aurora-A susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du support solide.
Avantageusement, dans le cadre de la méthode susmentionnée, la détermination d'une quantité de protéine aurora-A inférieure ou supérieure à un seuil physiologique déterminé en fonction de l'échantillon biologique, témoigne respectivement d'un bon ou d'un mauvais pronostic du cancer diagnostiqué.
L'invention a également pour objet, un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend - un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement (anticorps 35C1 susmentionné, - le cas échéant, un marqueur de prolifération cellulaire, tel qu'un marqueur de la protéine PCNA, notamment un anticorps anti-PCNA.
L'invention concerne également (utilisation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement de l'anticorps 35C1 susmentionné, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de cancers, tels que les cancers du sein, les cancers colorectaux et les cancers gastriques.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute composition pharmaceutique, contenant un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement (anticorps 35C1 susmentionné, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention a également pour objet fuülisation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement de l'anticorps 35C1 susmentionné, pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage d'inhibiteurs de la kinase aurora-A dans laquelle la baisse de l'activité de cette kinase est mesurée à (aide dudit anticorps.

L'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de criblage d'inhibiteurs de la kinase aurora A caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes - le traitement de cellules, telles que des lignées dérivées de différents cancers (sein, colon etc...), par l'inhibiteur testé, - immunoprécipitation de la protéine kinase aurora-A à l'aide d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement de l'anticorps susmentionné, et mesure de l'activité kinase, notamment selon la méthode décrite dans le paragraphe 3. g) ci-après.
L'invention concerne également le procédé de préparation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement de l'anticorps susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- cinq injections espacées de quinze jours à des souris de protéine kinase aurora-A recombinante produite par des bactéries E. colt transformées avec un vecteur d'expression bactérien dans le génome duquel a été inséré l'ADNc humain codant pour aurora-A, sacrifice desdites souris, et fusion entre des cellules de la rate de ces souris et des cellules de hamster immortalisées en culture pour obtenir des hybridomes, - criblage des hybridomes produisant un anticorps capable d'irnrnunoprécipiter la protéine recombinante utilisée pour l'immunisation des souris lors de l'étape précédente, et récupération des hybridomes positifs après ce premier crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A à partir d'un extrait de cellules humaines HeLa en culture, et récupération, des hybridomes positifs après ce deuxième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules humaines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce troisième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A de souris à
partir d'un extrait de cellules marines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce quatrième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules marines en culture, - récupération et purification par clonage d'un hybridome positif après (étape de criblage précédente, et produisant un anticorps monoclonal possédant l'ensemble des propriétés définies ci-dessus.
L'invention sera davantage illustrée à (aide de la description détaillée de l'anticorps monoclonal 35C1 défini ci-dessus et de son procédé d'obtention.
Le cDNA humain codant pour aurora-A (SEQ m NO : 1) a été inséré dans un vecteur d' expression bactérien (pET29 Novagene).
La protéine kinase a été produite dans des bactéries BL21 (DE3)pLysS et purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne Ni-NTA-agarose (Qiagen).
La protéine purifiée au laboratoire a ensuite été injectée à des souris (BALB/c).
Après cinq injections espacées de 15 jours la souris a été sacrifiée et une fusion a été effectuée entre des cellules de la rate de la souris et des cellules de hamster immortalisées en culture pour obtenir des hybridomes.
Les hybridomes obtenus au nombre de 960 ont alors été testés pour leur capacité à
produire un anticorps reconnaissant en western blot la protéine utilisée pour l'immunisation.
Les hybridomes positifs après ce premier crible ont alors été testés en western blot pour leur capacité à reconnaître la protéine endogène aurora-A à partir d'un extrait de cellules humaines HeLa en culture.
Les hybridomes positifs après ce deuxième crible ont été testés pour leur capacité
à reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotiques de cellules humaines en culture.
Les hybridomes positifs aprés ce troisième crible ont alors été testés en western blot pour leur capacité à reconnaître la protéine endogène aurora-A de souris à partir d'un exixait de cellules marines en culture.
Les hybridomes positifs après ce quatrième crible ont été testés pour leur capacité
à reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotiques de cellules marines en culture.
Un hybridome répondant à tous ces critères a été retenu et cloné pour obtenir un clone pur. Ce clone a été baptisé 35C1.

Il sécrète un anticorps monoclonal anti-aurore-A qui reconnaît la kinase aurore-A
humaine et marine.
Cet anticorps monoclonal anti-aurore-A reconnaissant spécifiquement la kinase aurore-A humaine et marine a les propriétés suivantes ~ il peut-être utilisé en Western-blot (immunodétection indirecte de la protéine sur membrane de niirocellulose ou nylon) ~ il permet de localiser la protéine dans des cellules en culture par immunodétection indirecte ~ il.n'inhibe pas l' activité enzymatique de la kinase in vitro ~ il permet de purifier la kinase aurore-A d'extrait acellulaire par immunoprécipitation ~ puisqu'il n'inhibe pas l'activité kinase de aurore-A il peut être utilisé
pour doser l'activité kinase dans des extraits protéiques préparés à partir de tissus présentant des pathologies.
1) Purification de la protéine aurore-A recombinante Le cDNA codant pour la kinase aurore-A humaine a été cloné dans le vecteur d'expression bactérien pET29 (fournisseur Novagen) qui permet de produire une protéine recombinante contenant 6 résidus histidine supplémentaires. La souche de bactérie E. coli BL21(DE3) pLysS (fournisseur Promega) qui est déficiente en protéase et qui s'autolyse par production de lysozyme après décongélation (toutes ces propriétés facilitent la purification de protéines) a été utilisée. La surexpression de la protéine aurore-A-(His)6 dans les bactéries en phase de croissance (D06oo = 0,6) est induite à
22°C par addition de 1 mM IPTG (Isopropyl-(3-D-thiogalacto~ide) pendant 4 heures.
Les bactéries sont ensuite lysées à 4°C en utilisant en plus de leur propriété autolytique, du lysozyme et des ultrasons. La protéine aurore-A-(His)6 est ensuite purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne de nickel (Ni-NTA-agarose (fournisseur Qiagen). La protéine est éluée par 250 mM imidazole suivant les instructions Qiagen.
La protéine purifiée est ensuite passée sur centricon YM-10 (fournisseur Millipore) pour lâ placer dans une solution de PBS (NaCI 136 mM, KCl 26 mM, Na2HP04 2 mM, KH~P04 2 mM, pH 7,2). Des fractions de 15 ~g de protéine ont été préparées, lyophilisées et conservées à 4°C.

2) Immunisation de la souris Une souris BALB/c a été immunisée par voie infra-péritonéale avec 15 ~.g de protéine aurora-A recombinante diluée dans 50% d'adjuvant de Freund complet (fournisseur Sigma). La souris a ensuite été injectée deux fois 15 ~,g de protéine aurora-A recombinant diluée dans 50% d'adjuvant de Freund incomplet avec trois semaines d'intervalle. Lorsque des anticorps anti-aurora-A ont été détectés dans le sang de la souris, elle a été sacrifiée et la rate prélevée. Des cellules en suspension ont été obtenues à partir de cette rate par homogénéisation avec un Dounce.
Ces cellules de rate ont été fusionnées avec des cellules SP2/O-Agl4 provenant d'un myélome marin et obtenues auprès de l'ECACC (Shulinan et al., 1978). Une fusion a été effectuée entre 100.106 cellules de rate.et 20.106 cellules SP2/O-Agl4 dans 50% de polyéthylène glycol 1500 (fournisseur Roche) pendant 90 mn à
37°C. Les cellules ont ensuite été distribuées dans des boites 10 x 96 puits contenant un milieu de sélection HAT (fournisseur Sigma Chemicals).
3) Crible des hybridomes a) ELISA
100 ~,l de PBS contenant 4 ~,g/ml de protéine recombinante aurora-A ont été
déposés dans chaque puits de plaques Elisa (plaques 96 puits) et incubé 36 heures a 4°C. Après deux lavages avec du PBS les puits sont remplis de PBS
contenant 3% de BSA (Albumine Sérique Bovine , fournisseur Sigma) et les plaques sont incubées une nuit à 4°C. Le lendemain 100 ~,l de chaque surnageant de fusion est transféré dans ces plaques 96 puits contenant aurora-A recombinante. Les pl~.ques sont incubées à
température ambiante pendant 2 heures. Après deux lavages avec du PBSBSA, les plaques sont incubées avec un anticorps anti-souris couplé à la phosphatase (Sigma Biochemical). Les puits sont ensuite lavés deux fois avec du PBS et une fois avec une solution AP (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCI and 5 mM MgCl2). La présence d'un anticorps monoclonal est détectée après remplissage des puits avec 50 ~,l de solution AP
contenant le substrat synthétique de phosphatase (Vitro-4-phenyl phosphate disodique hexahydrate sait) à 5 mg/ml (fournisseur Merck) et par l'apparition d'une coloration jaune dans le puits.

b) Western blot contre la protéine recombinante Dix plaques 96 puits (8x12) ont été analysées par tests ELISA sans donner de résultats très reproductifs. Ces plaques ont alors été testées par Western blot effectués de la manière suivante. La protéine recombinante aurora-A a été soumise à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et transférée sur membrane de nitrocellulose selon la technique décrite précédemment (Roghi et al., 1998).
Les membranes ont été découpées pour isoler la région correspondant à
l'emplacement ou migrait la protéine aurora-A. Les bouts de membranes ont été bloquées par incubation dans une solution de TBST (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.05% Tween 20) contenant 5% de lait pendant 2 heures à 4°C. Chaque bout de membrane a ensuite été
incubé avec les surnageants de cellule dilués au 1:100 dans une solution de TEST
contenant 2.5% de lait pendant 1 h à 4°C.~Les immuno-complexes ont été
identifiés en utilisant soit un second anticorps anti-souris couplé à la peroxidase ou à la phosphatase (fournisseur Sigma Chemicals) à la dilution préconisée par le fabriquant. La révélation de la réaction a été effectuée par la technique de chemiluminescence pour la péroxidase (fournisseur Amersham Pharmacia Biotech) selon les indications du fournisseur ou par colorimétrie pour la phosphatase en utilisant les deux substrats NBT/BCIP
(fournisseur Sigma Chemicals) selon les indications du fournisseur.
Les puits de chaque plaque ont été regroupés par pools de 8 correspondant à
chaque colonne de chaque plaque. La présence de monoclonaux a été analysée dans chaque pool par Western blot contre la protéine recombinante aurora-A. Sur les pools testés seuls 19 ont donné une réponse positive.
Chacun des 8 puits correspondant à chaque pool positif a été testé séparément par la même technique de Western blot dans le but d'identifier qu~l(s) puits contenait(ent) des anticorps. La figure 1 montre un exemple de résultats obtenus avec le pool numéro 2, dans ce cas particulier seuls les puits A et B contenaient des anticorps, le puits ayant été retenu.
Sur les 120 pools testés seuls 19 ont été retenus parce qu'ils donnaient une très forte réponse positive. Dans ces 19 pools seuls 23 puits contenaient des anticorps dirigés contre la protéine aurora-A recombinante.

c) Western blot contre la protéine aurora-A humaine endogéne La même technique de Western blot a cette fois été utilisée pour identifier les surnageants capable de reconnaître la protéine aurora-A parmi toutes les protéines d'un extrait acellulaire total préparé à partir de cellules humaines en culture.
Les cellules choisies sont des cellules HeLa. Les extraits ont été préparés à
partir de boite de culture contenant environ 106 cellules, les cellules ont été
lysées dans leur boite par 1 ml de solution dite Laemmli correspondant à la solution de dépôt sur gel polyacrylamide-SDS (Laemmli 1970), la solution a été incubée 10 min à
90°C, soniquée et centrifugée, 10 p.l du surnageant est déposé sur le gel.
Parmi les 23 surnageant ayant été sélectionnés précedemment seul 12 contenait un anticorps capable de reconnâitre une protéine de 46 kD (taille attendue pour aurora-A) par Western blots effectués sur des extrait de cellules Hela.
d) Immunofluorescence sur cellules humaines Une étape supplémentaire a été introduite dans le crible pour sélectionner les anticorps qui étaient capable de décorer le centrosome dans des cellules humaines en culture. Le choix des cellules s'est porté la lignée cellulaire MCF7 dérivant d'un cancer du sein car la protéine aurora-A a été rapportée surexprimée dans ces cellules.
La technique utilisée est l'immunofluorescence indirecte. Les cellules sont cultivées sur des lamelles rondes en verre dans les boites 12 puits (fournisseur Corning Inc) pendant 4S heures. Les lamelles sont ensuite lavées par une solution de PBS et les cellules fixées par du méthanol froid (-20°C). Les cellules sont ensuite incubées 30 rnn à
température ambiante dans du PBS contenant de la BSA 3%. Après trois lavages par du PBS les lamelles sont incubées avec les surnageant d'hybridom~ dilués au 1:50 dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules sont a nouveau lavées trois fois par du PBS et incubées à température ambiante pendant 1 heure avec un second anticorps anti-souris couplé à la fluorescéine « FITC » (fournisseur Sigma Chemicals).
Les lamelles sont lavées trois fois par du PBS et les cellules montées entre lame et lamelle dans du Mowiol contenant de l'antifading. Les observations ont été
effectuées avec un microscope fluorescent Leica DMRXA et les images prises avec une caméra noir et banc (COHU) ont été traitées par le logiciel Leica Qfish.
Sur les 12 surnageants retenus précédemment seuls 4 contenaient des anticorps capables de décorer les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique des cellules MCF7.
Cette localisation correspond exactement à celle attendue pour la kinase aurora-A.

e) Western blot contre la protéine aurora-A mutine endogène Dans le but d'augmenter la sélectivité du crible nous avons testé les 4 surnageants contre la protéine orthologue de aurora-A chez la souris. LTn premier crible a été
effectué par Western blot contre des extraits acellulaires de cellules de souris en culture, cellules m-ICcl2. Les extraits acellulaires ont été préparés comme pour les cellules humaines et le Western blots effectués de la même manière que précédemment.
Deux des surnageant étaient capable de reconnaître une protéine de 46 kD (taille également attendue pour la kinase aurora-A mutine) fj Immunofluorescence sur cellules mutines Nous avons contrôlé si les deux surnageants précédemment identifiés en Western blot étaient capable de décorer les centrosomes de cellules de souris en culture. Nous avons choisi les cellules LLC1 car elles présentent un index mitotique très élevé. Seul un des deux anticorps a été capable de localiser une protéine dans les centrosomes et aux pôles du fuseau mitotique, localisations attendues pour la protéine kinase aurora-A
de souris.
g) Dosage de l'activité kinase aurora-A
Les mesures de l'activité kinase aurora-A ont été effectuées dans 20 wl dé
Tris-HCl 50 rnM pH 7,5, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, MgCl210 mM, et ATP 10 ~,M dont 1 pCi de [y-32P] ATP 3000 Ci/mmole (fournisseur Amersham Pharmacie Biotech) contenant 4 ~,g de protéine basique de la myéline (MBP) pour la figure 5 (fournisseur Sigma Chemicals) ou 10 ~.l d'un extrait de bactéries ayant produit la protéine pour la figure 6. Les réactions sont incubées â 37°C pendant 10 min. 10 ~1 de la réaction sont analysés soit en comptage (figure 5) soit après migration sur gel de polyacrylamide-SDS, séché et examiné en autoradiographie (figure 6).
h) Clonage du monoclonal sélectionné
Le surnageant que nous avons sélectionné contenait un mélange hétérogène de cellules obtenus après la fusion. Nous avons repiqué ces cellules en effectuant une dilution limite et obtenu 20 clones. Le surnageant de ces 20 clones a été
testé en Western blot contre la protéine recombinante aurora-A, S ont donné une réponse positive. Ces 8 surnageants ont été testés sur des extraits de cellules humaines HeLa, de cellules marines m-ICcl2. Seuls deux surnageants ont été retenus.
Ces deux surnageants ont à nouveau été re-clonés par dilution limite et re-testés comme précédemment. Ce dernier clonage avait pour but de sélectionner un clone qui maintenait un niveau de production d'anticorps reproductible après repiquage.
Seul un des deux clone s'est avéré stable, il a été baptisé 35C1 et retenu pour stockage et production de monoclonal.
i) Propriétés du monoclonal 35C1 (voir les figures) L'anticorps reconnaît spécifiquement que la protéine kinase aurore-A humaine et marine en Western blot dans des extraits acellulaire totaux (figure 1).
Il localise la protéine kinase aurore-A dans des cellules humaines et dans des cellules marines en culture (figure 3).
Il immunoprécipite la protéine aurore-A d' extraits de cellules humaine MCF7 (figure 4).
Il n'inhibe pas l'activité kinase de aurore-A (figure 5).
Il permet donc d'immuno-précipiter la protéine aurore-A et de mesurer son activité kinase alors qu'elle est toujours associée à l'anticorps (figure 6) Ces propriétés du monoclonal 35C1 en font un outil de choix pour l'étude de la protéine kinase aurore-A.
Il peut être utilisé dans des méthodes de diagnostic et de pronostic de tumeurs solides. Le niveau d'expression de l'ARNm codant pour la protéine aurore-A est étroitement corrélée avec l'instabilité génétique des cellules de cancer du sein et avec un grade élevé de la tumeur (Miyoshi et al. 2001). Ceci a été très clairement établi pour le cancer du sein. Par contre en raison de l'absence d'anticorps monoclonal suffisamment spécifique, cette corrélation entre la quantité d'ARNm aurore-A et le grade du cancer n'a pas encore pu être vérifiée au niveau protéique. Le monoclonal 35C1 anti-aurore-A
permettra ce type de mesures. Il permet d'une part de mesurer la quantité de protéine aurore-A (Western blot et immunohistochimie) et d'autre part de mesurer l'activité
aurore-A (immunoprécipitation) dans des tumeurs, et ainsi de déterminer le seuil de la quantité d'aurore-A au-dessous et au-dessus duquel le pronostic d'un cancer déterminé
sera bon ou mauvais respectivement.

Par ailleurs, l'anticorps 35C1 permet de tester l'efficacité d'inhibiteurs de l'activité kinase aurora-A in vivo. La protéine kinase aurora-A est immunoprécipitée de cellules HeLa par exemple préalablement Traitées par l'inhibiteur et son activité mesurée in vivo. Ceci permet entre autre d'évaluer la stabilité des inhibiteurs in vivo.
Références bibliographiques Bernard M, Sanseau P, Henry C, Couturier A, Prigent C. Cloning of STKl3, a third human protein kinase related to Drosophila aurora and budding yeast Ipll that maps on chromosome 19q13.3-ter. Genomics. 1998 Nov 1;53(3):406-9.
Bischoff JR, Anderson L, Zhu Y, Mossie K, Ng L, Souza B, Schryver B, Flanagan P, Clairvoyant F, Ginther C, Chan CS, Novotny M, Slamon DJ, Plowman GD.
A homologue of Drosophila aurora kinase is oncogenic and amplified in human colorectal cancers. EMBO J 1998 Jun 1;17(11):3052-65.
Giet R, Prigent C. Aurora/Ipllp-related kinases, a new oncogenic family of mitotic serine-threonine kinases. J Cell Sci 1999 Nov;112 ( Pt 21):3591-601.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(259):680-5.
Miyoshi Y, Iwao K, Egawa C, Noguchi S. Association of centrosomal kinase STK15/BTAK mRNA expression with chromosomal instability in human breast cancers. Int J Cancer 2001 May 1;92(3):370-3.
Prigent C, Gill R, Trower M, Sanseau P. In silico cloning of a new protein kinase, Aik2, related to Drosophila Aurora using the new tool: EST Blast. In Silico Biol 1999;1(2):123-8.
Roghi C, Giet R, Uzbekov R., Morin N, Chartrain I, Le Guellec R, Couturier A, Doree M, Philippe M, Prigent C. The Xenopus protein kinase pEg2 associates with the centrosome in a cell cycle-dependent marner, binds to the spindle microtubules and is involved in bipolar mitotic spindle assembly. J Cell Sci. 1998 Mar; l l l ( Pt 4 - bringing together a monoclonal antibody as defined above, and more particularly of the above-mentioned 35C1 antibody, with a sample organic taken from an individual, said antibody being optionally attached to a solid support, - detection, and if necessary quantification, of the aurora-A protein likely to be present in the biological sample using reagents marked, in particular of labeled antibodies, recognizing either the monoclonal antibody linked to said aurora-A protein, i.e. the aurora-A protein linked to said monoclonal antibody in the complexes formed in the previous step between the monoclonal antibody and the protein i aurora-A likely to be present in the biological sample, and this, optionally, after appropriate rinsing of the solid support.
Advantageously, within the framework of the aforementioned method, the determination an amount of aurora-A protein below or above a threshold physiological determined according to the biological sample, testifies respectively of a good or a poor prognosis for diagnosed cancer.
The subject of the invention is also a kit for implementing a method diagnostic defined above, characterized in that it comprises - a monoclonal antibody as defined above, and more particularly (35C1 antibody mentioned above, - where appropriate, a cell proliferation marker, such as a marker of the PCNA protein, including an anti-PCNA antibody.
The invention also relates to (use of a monoclonal antibody such as defined above, and more particularly of the aforementioned 35C1 antibody, for the preparation of drugs for the treatment of cancers, such as cancers breast, colorectal cancers and gastric cancers.
As such, the invention more particularly relates to any composition pharmaceutical, containing a monoclonal antibody as defined above, and more particularly (35C1 antibody mentioned above, in combination with a vehicle pharmaceutically acceptable.
The subject of the invention is also the fuülisation of a monoclonal antibody such than defined above, and more particularly of the aforementioned 35C1 antibody, for the bet implementation of a screening method for aurora-A kinase inhibitors in which the decrease in activity of this kinase is measured using (using said antibody.

The invention more particularly relates to any screening method aurora A kinase inhibitors characterized in that it includes steps following - the treatment of cells, such as lines derived from different cancers (breast, colon, etc.), by the inhibitor tested, - Aurora-A protein kinase immunoprecipitation using an antibody monoclonal as defined above, and more particularly of the antibody above, and measurement of kinase activity, in particular according to the method described in paragraph 3. g) below.
The invention also relates to the method for preparing an antibody monoclonal as defined above, and more particularly of the antibody above, characterized in that it comprises the following stages:
- five injections fifteen days apart in protein kinase mice recombinant aurora-A produced by E. colt bacteria transformed with a vector of bacterial expression in the genome of which the human cDNA coding has been inserted for aurora-A, sacrifice of said mice, and fusion between cells of the miss of these mice and hamster cells immortalized in culture to obtain hybridomas, - screening of hybridomas producing an antibody capable of immunoprecipitating the recombinant protein used for immunization of mice during step previous, and recovery of positive hybridomas after this first screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous aurora-A protein from a extract of human HeLa cells in culture and recovery of hybridomas positive after this second screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of human cells in culture, and recovery of the positive hybridomas after this third screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous protein aurora-A from mice to go of an extract of cultured marine cells, and recovery of hybridomas positive after this fourth screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of cultured marine cells, - recovery and purification by cloning of a positive hybridoma after (step from the previous screening, and producing a monoclonal antibody having all properties defined above.
The invention will be further illustrated by means of the detailed description of the monoclonal antibody 35C1 defined above and its process for obtaining.
The human cDNA encoding aurora-A (SEQ m NO: 1) was inserted into a bacterial expression vector (pET29 Novagene).
Protein kinase was produced in BL21 (DE3) pLysS bacteria and purified by affinity chromatography on a Ni-NTA-agarose column (Qiagen).
The protein purified in the laboratory was then injected into mice (BALB / c).
After five injections 15 days apart, the mouse was sacrificed and one fusion a was done between mouse spleen cells and hamster immortalized in culture to obtain hybridomas.
The 960 hybridomas obtained were then tested for their ability to produce an antibody recognizing in western blot the protein used to immunization.
The positive hybridomas after this first screen were then tested in western blot for their ability to recognize the endogenous aurora-A protein from a extract of HeLa human cells in culture.
The positive hybridomas after this second screen were tested for their capacity to recognize in indirect immunofluorescence the centrosomes and poles of the spindle mitotic cells in culture.
The positive hybridomas after this third screen were then tested in western blot for their ability to recognize endogenous mouse aurora-A protein from of an exixite of cultured marine cells.
The positive hybridomas after this fourth screen were tested for their capacity to recognize in indirect immunofluorescence the centrosomes and poles of the spindle mitotic cells in culture.
A hybridoma meeting all these criteria was selected and cloned to obtain a pure clone. This clone was baptized 35C1.

It secretes an anti-aurora-A monoclonal antibody which recognizes kinase Aurora-A
human and marine.
This anti-aurora-A monoclonal antibody specifically recognizing kinase Aurora-A human and marine has the following properties ~ it can be used in Western blot (indirect immunodetection of the protein on niirocellulose or nylon membrane) ~ it makes it possible to locate the protein in cells in culture by indirect immunodetection ~ it does not inhibit the enzymatic activity of kinase in vitro ~ it purifies the aurora-A kinase of acellular extract by immunoprecipitation ~ since it does not inhibit the kinase activity of aurora-A it can be used for assay kinase activity in protein extracts prepared from presenting fabrics pathologies.
1) Purification of the recombinant aurora-A protein The cDNA encoding human aurora-A kinase was cloned into the vector of bacterial expression pET29 (supplier Novagen) which makes it possible to produce a recombinant protein containing 6 additional histidine residues. Strain of E. coli BL21 (DE3) pLysS bacteria (supplier Promega) which is deficient in protease and which autolysis by production of lysozyme after thawing (all these properties facilitate protein purification) has been used. The overexpression of protein aurora-A- (His) 6 in bacteria in the growth phase (DO6oo = 0.6) is induced to 22 ° C by addition of 1 mM IPTG (Isopropyl- (3-D-thiogalacto ~ ide) for 4 hours.
The bacteria are then lysed at 4 ° C using in addition to their autolytic property, lysozyme and ultrasound. The aurora-A- (His) 6 protein is then purified through Nickel column affinity chromatography (Ni-NTA-agarose (supplier Qiagen). The protein is eluted with 250 mM imidazole according to the instructions Qiagen.
The purified protein is then passed over YM-10 centricon (supplier Millipore) for place it in a PBS solution (NaCI 136 mM, KCl 26 mM, Na2HP04 2 mM, KH ~ P04 2 mM, pH 7.2). Fractions of 15 ~ g of protein were prepared, lyophilized and stored at 4 ° C.

2) Mouse immunization A BALB / ca mouse was immunized intraperitoneally with 15 ~ .g of recombinant aurora-A protein diluted in 50% complete Freund's adjuvant (Sigma supplier). The mouse was then injected twice 15 ~, g of aurora protein A recombinant diluted in 50% incomplete Freund's adjuvant with three weeks intervals. When anti-aurora-A antibodies have been detected in the blood of the mouse, it was sacrificed and the spleen removed. Cells in suspension were obtained from this spleen by homogenization with a Dounce.
These spleen cells were fused with SP2 / O-Agl4 cells from marine myeloma and obtained from ECACC (Shulinan et al., 1978). A
fusion was carried out between 100.106 spleen cells and 20.106 SP2 / O cells Agl4 in 50% polyethylene glycol 1500 (supplier Roche) for 90 min at 37 ° C. The cells were then distributed in 10 x 96-well dishes containing a middle of HAT selection (supplier Sigma Chemicals).
3) Screen of hybridomas a) ELISA
100 ~, l of PBS containing 4 ~, g / ml of aurora-A recombinant protein were deposited in each well of Elisa plates (96-well plates) and incubated 36 hours a 4 ° C. After two washes with PBS the wells are filled with PBS
containing 3% of BSA (Bovine Serum Albumin, supplier Sigma) and the plates are incubated a overnight at 4 ° C. The next day 100 ~, l of each fusion supernatant is transferred into these 96-well plates containing recombinant aurora-A. Pl ~ .ques are incubated at room temperature for 2 hours. After two washes with PBSBSA, the plates are incubated with an anti-mouse antibody coupled to phosphatase (Sigma Biochemical). The wells are then washed twice with PBS and once with a AP solution (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl and 5 mM MgCl2). The presence of a monoclonal antibody is detected after filling the wells with 50 ~, l of AP solution containing the synthetic phosphatase substrate (Vitro-4-phenyl phosphate disodium hexahydrate knows) at 5 mg / ml (supplier Merck) and by the appearance of a coloring yellow in the well.

b) Western blot against the recombinant protein Ten 96-well plates (8x12) were analyzed by ELISA tests without giving any very reproductive results. These plates were then tested by Western blot performed as follows. The recombinant aurora-A protein was subjected to polyacrylamide-SDS gel electrophoresis and transferred onto membrane nitrocellulose according to the technique described above (Roghi et al., 1998).
The membranes have been cut to isolate the region corresponding to the location or migrated the aurora-A protein. The ends of the membranes were blocked by incubation in a TBST solution (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) containing 5% milk for 2 hours at 4 ° C. Each end of the membrane has then been incubated with cell supernatants diluted 1: 100 in a solution of TEST
containing 2.5% milk for 1 hour at 4 ° C. ~ The immuno-complexes were identified in using either a second anti-mouse antibody coupled to peroxidase or to phosphatase (supplier Sigma Chemicals) at the dilution recommended by the manufacturer. The revelation of the reaction was carried out by the chemiluminescence technique for the peroxidase (supplier Amersham Pharmacia Biotech) according to the supplier's instructions or by colorimetry for phosphatase using the two NBT / BCIP substrates (provider Sigma Chemicals) as indicated by the supplier.
The wells of each plate were grouped into pools of 8 corresponding to each column of each plate. The presence of monoclonals was analyzed in each pool by Western blot against the recombinant protein aurora-A. On the only 19 tested pools gave a positive response.
Each of the 8 wells corresponding to each positive pool was tested separately through the same Western blot technique in order to identify that the well (s) contained (ent) antibodies. Figure 1 shows an example of results obtained with the pool number 2, in this particular case only wells A and B contained antibodies, the well having been retained.
Of the 120 pools tested, only 19 were selected because they gave a very strong positive response. In these 19 pools only 23 wells contained antibody raised against the recombinant aurora-A protein.

c) Western blot against the endogenous human aurora-A protein The same Western blot technique was used this time to identify the supernatants capable of recognizing the aurora-A protein among all proteins of a total acellular extract prepared from cultured human cells.
The cells chosen are HeLa cells. The extracts were prepared at go of culture dish containing approximately 106 cells, the cells were lysed in their box with 1 ml of so-called Laemmli solution corresponding to the deposition solution on gel polyacrylamide-SDS (Laemmli 1970), the solution was incubated for 10 min at 90 ° C, sonicated and centrifuged, 10 μl of the supernatant is deposited on the gel.
Among the 23 supernatants having been selected previously only 12 contained a antibody capable of recognizing a 46 kD protein (size expected for aurora-A) by Western blots carried out on extracts of Hela cells.
d) Immunofluorescence on human cells An additional step has been introduced in the screen to select the antibodies that were able to decorate the centrosome in cells human in culture. The choice of cells went to the MCF7 cell line derived of a cancer because the aurora-A protein has been reported overexpressed in these cells.
The technique used is indirect immunofluorescence. The cells are grown on round glass coverslips in 12-well dishes (Corning supplier Inc) for 4S hours. The coverslips are then washed with a solution of PBS and cells fixed with cold methanol (-20 ° C). The cells are then incubated 30 rnn at room temperature in PBS containing 3% BSA. After three washes by PBS coverslips are incubated with hybridoma supernatants ~ diluted 1:50 in some PBS for 1 hour at room temperature. The cells are again washed three times with PBS and incubated at room temperature for 1 hour with a second anti-mouse antibody coupled to fluorescein "FITC" (supplier Sigma Chemicals).
The coverslips are washed three times with PBS and the cells mounted between blade and coverslip in Mowiol containing antifading. The observations were conducted with a Leica DMRXA fluorescent microscope and images taken with a camera black and bench (COHU) were processed by Leica Qfish software.
Of the 12 supernatants previously selected only 4 contained antibodies capable of decorating the centrosomes and poles of the mitotic spindle of MCF7 cells.
This location corresponds exactly to that expected for the kinase aurora-A.

e) Western blot against the endogenous mutine aurora-A protein In order to increase the selectivity of the screen we tested the 4 supernatants against the orthologous protein of aurora-A in mice. LTn first screen a summer performed by Western blot against acellular extracts of cells from cultured mice, m-ICcl2 cells. The acellular extracts were prepared as for the cell Human and Western blots performed in the same manner as above.
Of them supernatants were able to recognize a 46 kD protein (size also expected for mutine aurora-A kinase) fj Immunofluorescence on mutine cells We have checked whether the two supernatants previously identified in Western blot were able to decorate the centrosomes of mouse cells by culture. We we chose LLC1 cells because they have a very mitotic index Student. Alone one of the two antibodies was able to locate a protein in centrosomes and at the poles of the mitotic spindle, expected locations for the protein kinase aurora-A
of mice.
g) Assay of aurora-A kinase activity Aurora-A kinase activity measurements were made in 20 wl of tris HCl 50 rnM pH 7.5, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, MgCl210 mM, and ATP 10 ~, M including 1 pCi of [y-32P] ATP 3000 Ci / mmole (supplier Amersham Pharmacie Biotech) containing 4 ~, g of myelin basic protein (MBP) for Figure 5 (provider Sigma Chemicals) or 10 ~ .l of an extract of bacteria which produced the protein for Figure 6. The reactions are incubated at 37 ° C for 10 min. 10 ~ 1 reaction are analyzed either by counting (Figure 5) or after migration on gel of polyacrylamide-SDS, dried and examined by autoradiography (Figure 6).
h) Cloning of the selected monoclonal The supernatant we selected contained a heterogeneous mixture of cells obtained after fusion. We transplanted these cells in performing a dilution limit and obtained 20 clones. The supernatant of these 20 clones was tested in Western blot against the recombinant protein aurora-A, S gave a response positive. These 8 supernatants were tested on cell extracts HeLa human marine cells m-ICcl2. Only two supernatants have been retained.
These two supernatants were again re-cloned by limiting dilution and re-tested like before. The purpose of this last cloning was to select a clone who maintained a level of reproducible antibody production after subculturing.
Only one of the two clones proved stable, it was baptized 35C1 and retained for storage and production of monoclonal.
i) Properties of the 35C1 monoclonal (see figures) The antibody specifically recognizes that the human aurora-A protein kinase and marine in Western blot in total cell-free extracts (Figure 1).
It locates the aurora-A protein kinase in human cells and in marine cells in culture (Figure 3).
It immunoprecipitates aurora-A protein from human cell extracts MCF7 (figure 4).
It does not inhibit the aurora-A kinase activity (Figure 5).
It therefore makes it possible to immuno-precipitate the aurora-A protein and to measure its kinase activity while still associated with the antibody (Figure 6) These properties of the 35C1 monoclonal make it a tool of choice for studying the protein kinase aurora-A.
It can be used in methods of diagnosis and prognosis of tumors solid. The level of expression of the mRNA coding for the aurora-A protein is closely correlated with the genetic instability of cancer cells breast and with a high tumor grade (Miyoshi et al. 2001). This was very clearly established for the breast cancer. However due to the absence of monoclonal antibodies enough specific, this correlation between the amount of aurora-A mRNA and the grade of Cancer could not yet be verified at the protein level. The 35C1 monoclonal anti Aurora-A
will allow this type of measurement. It allows on the one hand to measure the quantity of protein aurora-A (Western blot and immunohistochemistry) and secondly to measure the activity aurora-A (immunoprecipitation) in tumors, and thus to determine the threshold of the amount of aurora-A below and above which cancer prognosis determined will be good or bad respectively.

Furthermore, the antibody 35C1 makes it possible to test the effectiveness of inhibitors of aurora-A kinase activity in vivo. The protein kinase aurora-A is immunoprecipitated from HeLa cells, for example, previously treated with the inhibitor and its measured activity in vivo. This allows, among other things, to assess the stability of the inhibitors in vivo.
Bibliographic references Bernard M, Sanseau P, Henry C, Couturier A, Prigent C. Cloning of STKl3, a third human protein kinase related to Drosophila aurora and budding yeast Ipll That maps on chromosome 19q13.3-ter. Genomics. 1998 Nov 1; 53 (3): 406-9.
Bischoff JR, Anderson L, Zhu Y, Mossie K, Ng L, Souza B, Schryver B, Flanagan P, Clairvoyant F, Ginther C, Chan CS, Novotny M, Slamon DJ, Plowman GD.
A homologue of Drosophila aurora kinase is oncogenic and amplified in human colorectal cancers. EMBO J 1998 Jun 1; 17 (11): 3052-65.
Giet R, Prigent C. Aurora / Ipllp-related kinases, a new oncogenic family of mitotic serine-threonine kinases. J Cell Sci 1999 Nov; 112 (Pt 21): 3591-601.
Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15; 227 (259): 680-5.
Miyoshi Y, Iwao K, Egawa C, Noguchi S. Association of centrosomal kinase STK15 / BTAK mRNA expression with chromosomal instability in human breast cancers. Int J Cancer 2001 May 1; 92 (3): 370-3.
Prigent C, Gill R, Trower M, Sanseau P. In silico cloning of a new protein kinase, Aik2, related to Drosophila Aurora using the new tool: EST Blast. In Silico Biol 1999; 1 (2): 123-8.
Roghi C, Giet R, Uzbekov R., Morin N, Chartrain I, Le Guellec R, Couturier A, Doree M, Philippe M, Prigent C. The Xenopus protein kinase pEg2 associates with the centrosome in a cell cycle-dependent marner, binds to the spindle microtubules and is involved in bipolar mitotic spindle assembly. J Cell Sci. 1998 Mar; lll (Pt

5):557-72.
Shulinan M, Wilde CD, Kohler G. A better cell lire for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature 1978 Nov 16;276(5685):269-70.
Takahashi T, Futamura M, Yoshimi N, Sano J, Katada M, Takagi Y, Kimiira M, Yoshioka T, Okano Y, Saji S. (2000) Centrosomal kinases, HsAIRKl and HsAlRK3, are overexpressed in primary colorectal cancers. Jpn J Cahce~ Res 91 (10):1007-Takahashi T, Futamura M, Yoshimi N, Sano J, Katada M, Takagi Y, Kimura M, Yoshioka T, Okano Y, Saji S. Centrosomal kinases, HsAIRKI and HsAlItK3, are overexpressed in primary colorectal cancers. Jpn J Cancer Res 2000 Oct;91(10):1007-14.
Tanaka T, Kimura M, Matsunaga K, Fukada D, Mori H, Okano Y. Centrosomal kinase AIKl is overexpressed in invasive ductal carcinome of the breast.
Cancer Res 1999 May 1;59(9):2041-4.
Zhou H, Kuang J, Zhong L, Kuo WL, Gray JW, Sahin A, Brinkley BR, Sen S.
Tumour amplified kinase STK15BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation. Nat Genet. 1998 Oct;20(2):104-6.
Légende des figures Légende de la fiQUre 1 : Crible des hybridomes par western blot. La protéine recombinante aurore-A purifiée a été déposée sur gel de polyacrylamide-SDS et transférée sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a été colorée au' rouge ponceau et la bande correspondant à aurore-A découopée. Chaque panneau correspond à
un morceau de membrane avec aurore-A. Après fusion les cellules ont été
distribuées dans des boites 96 puits. Pour cribler la présence de monoclonaux anti-aurore-A des aliquots des surnageants des puits de chaque colonne sont regroupés en pools, ceci pour chaque boite. Chaque pool est ensuite testé en western blot colonne de droite de 1 à 12.
Lorsqu'un pool est considéré comme positif, ici le pool numéro 1, les surnageants de chaque puits constituant ce pool (de A à H) sont re-testé individuellement.
Dans ce cas précis les puits A et B contenaient des anticorps, mais seul le puits B a été
retenu.
Légende figure 2 : Western blot. Les extraits acellulaires totaux sont séparés sur gel de polyacrylamide SDS et le gel est transféré sur membrane de nitrocellulose. Le puits 1 ne contient pas d'extrait et le puit 2 contient 10 ~1 d'exirait (correspondant à 106 cellules par ml). L'anticorps est utilisé à une dilution de 1/100. Seule la protéine aurora-A de 46 kD est détectée.
Légende figure 3 : hnmunodétection indirecte de aurore-A dans des cellules humaines et marines. Les cellules humaines sont des MCF7 et les cellules marines des LLC1. Sont détectés en immunofluorescence l'ADN par coloration DAPI (bleu), la y-tubuline (rouge) et aurora-A (vert) Légende figure 4: Immunoprécipitation de aurora-A. La protéine est immunoprécipitée par l'anticorps 35C1 couplé à la protéine A Sepharose. Les immunoprécipités sont séparés sur un gel de polyacrylamide-SDS, le gel est transféré et les immunocomplexes révélés avec le monoclonal 35C1. Puits 1 : l'anticorps seul ; puits 2 : immunoprécipitation effectuée avec la protéine A Sepharose seule ; puits a 3 : immunoprécipitation effectuée avec l'anticorps monoclonal 35C1 ; puits 4 immunoprécipitation effectuée avec un anticorps préparé au laboratoire.
Légende figure 5 : Activité de la kinase recombinante aurora-A humaine purifiée mesurée en présence de l'anticorps monoclonal 35C1. L'anticorps 1C1 dirigé
contre la protéine aurora-A de xénope et qui ne croise pas avec la protéine humaine est utilisé
comme contrôle. L'activité kinase est mesurée en utilisant la MBP (Myelin Basic Protein) comme substrat.
Légende figure 6 : Activité de la protéine aurora-A endogéne immunoprécipitée par l'anticorps 35C1 fixé sur des bille de protéine A Dynabeads. L'activité de la kinase est mesurée sur un substrat ne comportant qu'une seule sérine phosphorylable.
Il s'agit d'une construction GST en fusion avec la queue de l'histone H3 (avec la sérine 10). Un substrat contrôle est également utilisé où la sérine 10 est remplacée par une alanine. Les puits l, 4 et 7 contiennent aurora-A recombinante purifiée est utilisée. Les puits 2, 5 et 8 contiennent aurora-A recombinante immunoprécipitée et fi~,ée à l'anticorps et à la protéine A Sepharose. Les puits3 et 6 ne contiennent pas de kinase. Les puits 3, 4 et 5 contiennent le substrat phosphorylable GST-H3(S) et les puits 6, 7 et 8 le substrat non phosphorylable GST-H3(S/A) pour les kinases.

LISTE DE SEQUENCES
<110> CNRS
<120> ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-AURORA-A, SON PROCEDE
D'OBTENTION, ET SES UTILISATIONS DANS LE DIAGNOSTIC ET
LE TRAITEMENT DES CANCERS
<130> IFB 01 BN CNR AURA
<140>
<141>
<160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2253 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222> (257)..(1495) <400> 1 ggaagacttg ggtccttggg tcgcaggtgg gagccgacgg gtgggtagac cgtgggggat 60 atctcagtgg cggacgagga cggcggggac aaggggcggc tggtcggagt ggcggagcgt 120 caagtcccct gtcggttcct ccgtccctga gtgtccttgg cgctgccttg tgcccgccca 180 gcgcctttgc atccgctcct gggcaccgag gcgccctgta ggatactgct tgttacttat 240 tacagctaga ggcatc atg gac cga tct aaa gaa aac tgc att tca gga cct 292 Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys Ile Ser G1y Pro gtt aag gct aca gct cca gtt gga ggt cca aaa cgt gtt ctc gtg act 340 Val Lys Ala Thr Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Va1 Leu Val Thr cag caa'att cct tgt cag aat cca tta cct gta aat agt ggc cag'gct 388 Gln Gln Ile Pro Cys Gln Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala cag cgg gtc ttg tgt cct tca aat tct tcc cag cgc gtt cct ttg caa 436 Gln Arg Val Leu Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln gca caa aag ctt gtc tcc agt cac aag ccg gtt cag aat cag aag cag 484 Ala Gln Lys Leu Va1 Ser Ser His Lys Pro Val Gln Asn Gln Lys Gln aag caa ttg cag gca acc agt gta cct cat cct gtc tcc agg cca ctg 532 Lys Gln Leu Gln Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu aat aac acc caa aag agc aag cag ccc ctg cca tcg gca cct gaa aat 580 Asn Asn Thr Gln Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn aat cct gag gag gaa ctg gca tca aaa cag aaa aat gaa gaa tca aaa 628 Asn Pro Glu Glu Glu Leu A1a Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys aag agg cag tgg gct ttg gaa gac ttt gaa att ggt cgc cct ctg ggt 676 Lys Arg Gln Trp Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly aaa gga aag ttt ggt aat gtt tat ttg gca aga gaa aag caa agc aag 724 Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys ttt att ctg gct ctt aaa gtg tta ttt aaa gct cag ctg gag aaa gcc 772 Phe Ile Leu Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala gga gtg gag cat cag ctc aga aga gaa gta gaa ata cag tcc cac ctt 820 Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile G1n Ser His Leu l75 180 185 cgg cat cct aat att ctt aga ctg tat ggt tat ttc cat gat gct acc 868 Arg His Pro Asn Ile Leu Axg Leu'Tyr Gly Tyr Phe His. Asp Ala Thr 1g0 195 200 aga gtc tac cta att ctg gaa tat gca cca ctt gga aca gtt tat aga 916 Arg Val Tyr Leu Ile Leu G1u Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg gaa ctt cag aaa ctt tca aag ttt gat gag cag aga act gct act tat 964 Glu Leu Gln Lys Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr ata aca gaa ttg gca aat gcc ctg tct tac tgt cat tcg aag aga gtt 1012 Ile Thr Glu Leu Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val att cat aga gac att aag cca gag aac tta ctt ctt gga tca gct gga 1060 Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly gag ctt aaa att gca gat ttt ggg tgg tca gta cat gct cca tct tcc 1108 Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His A1a Pro Ser Ser agg agg acc act ctc tgt ggc acc ctg gac tac ctg ccc cct gaa atg 1156 Arg Arg Thr Thr Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met att gaa ggt cgg atg cat gat gag aag gtg gat ctc tgg agc ctt gga 1204 Ile Glu Gly Arg Met His Asp G1u Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly gtt ctt tgc tat gaa ttt tta gtt ggg aag cct cct ttt gag gca aac 1252 Val Leu Cys Tyr Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn acataccaagag acctacaaa agaatatca cgggttgaa ttcacattc 1300 ThrTyrGlnGlu ThrTyrLys ArgIleSer ArgValGlu PheThrPhe cctgactttgta acagaggga gccagggac ctcatttca agactgttg 1348 ProAspPheVal ThrGluGly AlaArgAsp LeuIleSer ArgLeuLeu aagcataatccc agccagagg ccaatgctc agagaagta cttgaacac 1396 LysHisAsnPro SerGlnArg ProMetLeu ArgGluVal LeuGluHis ccctggatcaca gcaaattca tcaaaacca tcaaattgc caaaacaaa 1444 ProTrpI1eThr AlaAsnSer SerLysPro SerAsnCys GlnAsnLys gaatcagctagc aaacagtct taggaatcg tgcaggggg agaaatcct 1492 GluSerAlaSer LysGlnSer tga gccagggctg ccatataacc tgacaggaac atgctactga agtttatttt 1545 accattgact gctgccctca atctagaacg ctacacaaga aatatttgtt ttactcagca 1605 ggtgtgcctt aacctcccta ttcagaaagc tccacatcaa taaacatgac actctgaagt 1665 gaaagtagcc acgagaattg tgctacttat actggttcat aatctggagg caaggttcga 1725 ctgcagccgc cccgtcagcc tgtgctaggc atggtgtctt cacaggaggc aaatccagag 1785 cctggctgtg gggaaagtga ccactctgcc ctgaccccga tcagttaagg agctgtgcaa 1845 taaccttcct agtacctgag tgagtgtgta acttattggg ttggcgaagc ctggtaaagc 1905 tgttggaatg agtatgtgat tctttttaag tatgaaaata aagatatatg tacagacttg 1965 tattttttct ctggtggcat tcctttagga atgctgtgtg tctgtccggc accccggtag 2025 gcctgattgg gtttctagtc ctccttaacc acttatctcc catatgagag tgtgaaaaat 2085 aggaacacgt gctctacctc catttaggga tttgcttggg atacagaaga ggccatgtgt 2145 a ctcagagctg ttaagggctt atttttttaa aacattggag tcatagcatg tgtt~taaact 2205 ttaaatatgc aaataaataa gtatctatgt ctaaaaaaaa aaaaaaaa 2253 <210> 2 <211> 403 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys Ile Ser Gly Pro Val Lys Ala Thr Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Thr Gln Gln Ile Pro Cys Gln.Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala Gln Arg Val Leu Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln Ala Gln Lys Leu Val Ser Ser His Lys Pro Val Gln Asn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu Glu Leu Ala Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys Lys Arg Gln Trp Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe 130 135 , 140 Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys Phe Ile Leu Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile Gln Ser His Leu Arg His Pro Asn Tle Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Phe His Asp Ala Thr Arg Val Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg Glu Leu Gln Lys 210 215 22Ö
Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr Ile Thr Glu Leu Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Ser Arg Arg Thr Thr Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg Met His Asp Glu Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Leu Cys Tyr Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn Thr Tyr Gln G1u Thr Tyr Lys Arg Ile Ser Arg Val Glu Phe Thr Phe Pro Asp Phe Val Thr Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ile Ser Arg Leu Leu Lys His Asn Pro Ser G1n Arg Pro Met Leu Arg Glu Val Leu Glu His Pro Trp Ile Thr Ala Asn Ser Ser Lys Pro Ser Asn Cys Gln Asn Lys Glu Ser Ala Ser Lys Gln Ser 5): 557-72.
Shulinan M, Wilde CD, Kohler G. A better cell read for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature 1978 Nov 16; 276 (5685): 269-70.
Takahashi T, Futamura M, Yoshimi N, Sano J, Katada M, Takagi Y, Kimiira M, Yoshioka T, Okano Y, Saji S. (2000) Centrosomal kinases, HsAIRKl and HsAlRK3, are overexpressed in primary colorectal cancers. Jpn J Cahce ~ Res 91 (10): 1007-Takahashi T, Futamura M, Yoshimi N, Sano J, Katada M, Takagi Y, Kimura M, Yoshioka T, Okano Y, Saji S. Centrosomal kinases, HsAIRKI and HsAlItK3, are overexpressed in primary colorectal cancers. Jpn J Cancer Res 2000 October; 91 (10): 1007-14.
Tanaka T, Kimura M, Matsunaga K, Fukada D, Mori H, Okano Y. Centrosomal kinase AIKl is overexpressed in invasive ductal carcinoma of the breast.
Cancer Res 1999 May 1; 59 (9): 2041-4.
Zhou H, Kuang J, Zhong L, Kuo WL, Gray JW, Sahin A, Brinkley BR, Sen S.
Tumor amplified kinase STK15BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation. Nat Genet. 1998 Oct; 20 (2): 104-6.
Legend of figures Legend of fiQUre 1: Screening of hybridomas by western blot. Protein purified recombinant aurora-A was deposited on polyacrylamide-SDS gel and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was stained with ' red culvert and the strip corresponding to aurora-A decouopée. Each panel correspond to a piece of membrane with aurora-A. After fusion the cells were distributed in 96-well dishes. To screen for the presence of anti-aurora monoclonals Has aliquots of the supernatants from the wells of each column are grouped into pools, this for each box. Each pool is then tested in western blot on the right column from 1 to 12.
When a pool is considered positive, here pool number 1, the supernatants from each well constituting this pool (from A to H) are re-tested individually.
In that case specific wells A and B contained antibodies, but only well B was retained.
Figure 2 legend: Western blot. Total cell-free extracts are separated sure SDS polyacrylamide gel and the gel is transferred to the membrane nitrocellulose. The well 1 contains no extract and well 2 contains 10 ~ 1 of exirate (corresponding to 106 cells per ml). The antibody is used at a dilution of 1/100. Only the aurora protein A of 46 kD is detected.
Caption Figure 3: indirect immunodetection of aurora-A in cells human and marine. Human cells are MCF7 and cells marines LLC1. DNA is detected by immunofluorescence by DAPI staining (blue), the y-tubulin (red) and aurora-A (green) Figure 4 legend: Immunoprecipitation of aurora-A. Protein is immunoprecipitated by antibody 35C1 coupled to protein A Sepharose. The immunoprecipitates are separated on a polyacrylamide-SDS gel, the gel is transferred and the immunocomplexes revealed with the monoclonal 35C1. Well 1: the antibody alone ; well 2: immunoprecipitation carried out with protein A Sepharose alone ; well at 3: immunoprecipitation carried out with the monoclonal antibody 35C1; well 4 immunoprecipitation performed with an antibody prepared in the laboratory.
Figure 5 legend: Activity of the human aurora-A recombinant kinase purified measured in the presence of the monoclonal antibody 35C1. 1C1 antibody directed against the xenopus aurora-A protein which does not cross with human protein is in use as a control. Kinase activity is measured using MBP (Myelin Basic Protein) as a substrate.
Caption figure 6: Activity of the endogenous immunoprecipitated aurora-A protein by the antibody 35C1 fixed on beads of protein A Dynabeads. The activity of kinase is measured on a substrate comprising only one phosphorylatable serine.
It's about of a GST construct in fusion with the tail of the histone H3 (with the serine 10). A
control substrate is also used where serine 10 is replaced by a alanine. The wells 1, 4 and 7 contain purified recombinant aurora-A is used. The wells 2, 5 and 8 contain recombinant aurora-A immunoprecipitate and fi ~, ée to the antibody and to the protein A Sepharose. Wells 3 and 6 do not contain kinase. The wells 3, 4 and 5 contain the phosphorylatable substrate GST-H3 (S) and wells 6, 7 and 8 the substrate no phosphorylatable GST-H3 (S / A) for kinases.

LIST OF SEQUENCES
<110> CNRS
<120> ANTI-AURORA-A MONOCLONAL ANTIBODIES, ITS PROCESS
, AND ITS USES IN DIAGNOSIS AND
TREATMENT OF CANCERS
<130> IFB 01 BN CNR AURA
<140>
<141>
<160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2253 <212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222> (257) .. (1495) <400> 1 ggaagacttg ggtccttggg tcgcaggtgg gagccgacgg gtgggtagac cgtgggggat 60 atctcagtgg cggacgagga cggcggggac aaggggcggc tggtcggagt ggcggagcgt 120 caagtcccct gtcggttcct ccgtccctga gtgtccttgg cgctgccttg tgcccgccca 180 gcgcctttgc atccgctcct gggcaccgag gcgccctgta ggatactgct tgttacttat 240 tacagctaga ggcatc atg gac cga tct aaa gaa aac tgc att tca gga cct 292 Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys Ile Ser G1y Pro gtt aag gct aca gct cca gtt gga ggt cca aaa cgt gtt ctc gtg act 340 Val Lys Ala Thr Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Va1 Leu Val Thr cag caa'att cct tgt cag aat cca tta cct gta aat agt ggc cag'gct 388 Gln Gln Ile Pro Cys Gln Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala cag cgg gtc ttg tgt cct tca aat tct tcc cag cgc gtt cct ttg caa 436 Gln Arg Val Leu Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln gca caa aag ctt gtc tcc agt cac aag ccg gtt cag aat cag aag cag 484 Ala Gln Lys Leu Va1 Ser Ser His Lys Pro Val Gln Asn Gln Lys Gln aag caa ttg cag gca acc agt gta cct cat cct gtc tcc agg cca ctg 532 Lys Gln Leu Gln Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu aat aac acc caa aag agc aag cag ccc ctg cca tcg gca cct gaa aat 580 Asn Asn Thr Gln Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn aat cct gag gag gaa ctg gca tca aaa cag aaa aat gaa gaa tca aaa 628 Asn Pro Glu Glu Glu Leu A1a Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys aag agg cag tgg gct ttg gaa gac ttt gaa att ggt cgc cct ctg ggt 676 Lys Arg Gln Trp Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly aaa gga aag ttt ggt aat gtt tat ttg gca aga gaa aag caa agc aag 724 Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys ttt att ctg gct ctt aaa gtg tta ttt aaa gct cag ctg gag aaa gcc 772 Phe Ile Leu Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala gga gtg gag cat cag ctc aga aga gaa gta gaa ata cag tcc cac ctt 820 Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile G1n Ser His Leu l75 180 185 cgg cat cct aat att ctt aga ctg tat ggt tat ttc cat gat gct acc 868 Arg His Pro Asn Ile Leu Axg Leu'Tyr Gly Tyr Phe His. Asp Ala Thr 1g0 195 200 aga gtc tac cta att ctg gaa tat gca cca ctt gga aca gtt tat aga 916 Arg Val Tyr Leu Ile Leu G1u Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg gaa ctt cag aaa ctt tca aag ttt gat gag cag aga act gct act tat 964 Glu Leu Gln Lys Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr ata aca gaa ttg gca aat gcc ctg tct tac tgt cat tcg aag aga gtt 1012 Ile Thr Glu Leu Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val att cat aga gac att aag cca gag aac tta ctt ctt gga tca gct gga 1060 Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly gag ctt aaa att gca gat ttt ggg tgg tca gta cat gct cca tct tcc 1108 Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His A1a Pro Ser Ser 270,275,280 agg agg acc act ctc tgt ggc acc ctg gac tac ctg ccc cct gaa atg 1156 Arg Arg Thr Thr Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met att gaa ggt cgg atg cat gat gag aag gtg gat ctc tgg agc ctt gga 1204 Ile Glu Gly Arg Met His Asp G1u Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly gtt ctt tgc tat gaa ttt tta gtt ggg aag cct cct ttt gag gca aac 1252 Val Leu Cys Tyr Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn acataccaagag acctacaaa agaatatca cgggttgaa ttcacattc 1300 ThrTyrGlnGlu ThrTyrLys ArgIleSer ArgValGlu PheThrPhe cctgactttgta acagaggga gccagggac ctcatttca agactgttg 1348 ProAspPheVal ThrGluGly AlaArgAsp LeuIleSer ArgLeuLeu aagcataatccc agccagagg ccaatgctc agagaagta cttgaacac 1396 LysHisAsnPro SerGlnArg ProMetLeu ArgGluVal LeuGluHis ccctggatcaca gcaaattca tcaaaacca tcaaattgc caaaacaaa 1444 ProTrpI1eThr AlaAsnSer SerLysPro SerAsnCys GlnAsnLys gaatcagctagc aaacagtct taggaatcg tgcaggggg agaaatcct 1492 GluSerAlaSer LysGlnSer tga gccagggctg ccatataacc tgacaggaac atgctactga agtttatttt 1545 accattgact gctgccctca atctagaacg ctacacaaga aatatttgtt ttactcagca 1605 ggtgtgcctt aacctcccta ttcagaaagc tccacatcaa taaacatgac actctgaagt 1665 gaaagtagcc acgagaattg tgctacttat actggttcat aatctggagg caaggttcga 1725 ctgcagccgc cccgtcagcc tgtgctaggc atggtgtctt cacaggaggc aaatccagag 1785 cctggctgtg gggaaagtga ccactctgcc ctgaccccga tcagttaagg agctgtgcaa 1845 taaccttcct agtacctgag tgagtgtgta acttattggg ttggcgaagc ctggtaaagc 1905 tgttggaatg agtatgtgat tctttttaag tatgaaaata aagatatatg tacagacttg 1965 tattttttct ctggtggcat tcctttagga atgctgtgtg tctgtccggc accccggtag 2025 gcctgattgg gtttctagtc ctccttaacc acttatctcc catatgagag tgtgaaaaat 2085 aggaacacgt gctctacctc catttaggga tttgcttggg atacagaaga ggccatgtgt 2145 at ctcagagctg ttaagggctt atttttttaa aacattggag tcatagcatg tgtt ~ taaact 2205 ttaaatatgc aaataaataa gtatctatgt ctaaaaaaaa aaaaaaaa 2253 <210> 2 <211> 403 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys Ile Ser Gly Pro Val Lys Ala Thr Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Thr Gln Gln Ile Pro Cys Gln.Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala Gln Arg Val Leu Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln Ala Gln Lys Leu Val Ser Ser His Lys Pro Val Gln Asn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu Glu Leu Ala Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys Lys Arg Gln Trp Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe 130 135, 140 Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys Phe Ile Leu Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile Gln Ser His Leu Arg His Pro Asn Tle Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Phe His Asp Ala Thr Arg Val Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg Glu Leu Gln Lys 210 215 22Ö
Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr Ile Thr Glu Leu Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Ser Arg Arg Thr Thr Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg Met His Asp Glu Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Leu Cys Tyr Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn Thr Tyr Gln G1u Thr Tyr Lys Arg Ile Ser Arg Val Glu Phe Thr Phe Pro Asp Phe Val Thr Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ile Ser Arg Leu Leu Lys His Asn Pro Ser G1n Arg Pro Met Leu Arg Glu Val Leu Glu His Pro Trp Ile Thr Ala Asn Ser Ser Lys Pro Ser Asn Cys Gln Asn Lys Glu Ser Ala Ser Lys Gln Ser

Claims (13)

1. Anticorps monoclonal anti-aurora-A reconnaissant spécifiquement la kinase aurora-A humaine et murine, et ayant les propriétés suivantes:
* il peut se fixer sur les membranes contenant la protéine aurora-A humaine ou murine, * il permet de détecter, et, le cas échéant, de purifier, la protéine aurora-A
humaine et murine par immunoprécipitation, * il permet la coloration des tissus biologiques où est sécrétée la protéine aurora-A, et * il n'inhibe pas l'activité enzymatique de la protéine aurora-A humaine et murine, ledit anticorps monoclonal étant tel qu'obtenu par - cinq injections espacées de quinze jours à des souris de protéine kinase aurora-A recombinante produite par des bactéries E. coli transformées avec un vecteur d'expression bactérien dans le génome duquel a été inséré l'ADNc humain codant pour aurora-A, sacrifice desdites souris, et fusion entre des cellules de la rate de ces souris et des cellules de hamster immortalisées en culture pour obtenir des hybridomes, - criblage des hybridomes produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine recombinante utilisée pour l'immunisation des souris lors de l'étape précédente, et récupération des hybridomes positifs après ce premier crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A à partir d'un extrait de cellules humaines HeLa en culture, et récupération,des hybridomes positifs après ce deuxième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules humaines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce troisième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A de souris à
partir d'un extrait de cellules murines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce quatrième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules murines en culture, - récupération et purification par clonage d'un hybridome positif après l'étape de criblage précédente, et produisant un anticorps monoclonal possédant l'ensemble des propriétés définies ci-dessus. 1. Anti-aurora-A monoclonal antibody specifically recognizing kinase aurora-A human and murine, and having the following properties:
* it can attach to membranes containing the human aurora-A protein or murine * it makes it possible to detect, and, if necessary, to purify, the aurora-A protein human and murine by immunoprecipitation, * it allows the coloring of biological tissues where the protein is secreted Aurora-A, and * it does not inhibit the enzymatic activity of the human aurora-A protein and murine said monoclonal antibody being as obtained by - five injections fifteen days apart in protein kinase mice recombinant aurora-A produced by E. coli bacteria transformed with a vector of bacterial expression in the genome of which the human cDNA coding has been inserted for aurora-A, sacrifice of said mice, and fusion between cells of the miss of these mice and hamster cells immortalized in culture to obtain hybridomas, - screening of hybridomas producing an antibody capable of immunoprecipitating the recombinant protein used for immunization of mice during step previous, and recovery of positive hybridomas after this first screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous aurora-A protein from a extract of human HeLa cells in culture and recovery of hybridomas positive after this second screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of human cells in culture, and recovery of the positive hybridomas after this third screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous protein aurora-A from mice to go an extract of murine cells in culture, and recovery of hybridomas positive after this fourth screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of murine cells in culture, - recovery and purification by cloning of a positive hybridoma after step from the previous screening, and producing a monoclonal antibody having all properties defined above. 2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, encore désigné anticorps 35C1, tel que secrété par l'hybridome déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur sous le numéro I-3050. 2. Monoclonal antibody according to claim 1, also designated antibody 35C1, as secreted by the hybridoma deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Institut Pasteur under the number I-3050. 3. Utilisation d'un anticorps monoclonal tel que défini dans la revendication 1 ou 2, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro, ou de pronostic de cancers chez l'homme ou l'animal. 3. Use of a monoclonal antibody as defined in claim 1 or 2, for the implementation of an in vitro diagnostic method, or prognosis of human and animal cancers. 4. Utilisation d'un anticorps monoclonal selon la revendication 3, pour la mise en aeuvre d'une méthode de diagnostic ih vitro, ou de pronostic, de fumeurs solides, tels que les cancers du sein, les cancers gastriques et les cancers colorectaux. 4. Use of a monoclonal antibody according to claim 3, for the setting work of an in vitro diagnostic method, or prognosis, of smokers solid, such than breast cancer, gastric cancer and colorectal cancer. 5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, en association avec un marqueur de prolifération cellulaire, tel qu'un marqueur de la protéine PCNA. 5. Use according to claim 3 or 4, in combination with a marker of cell proliferation, such as a marker for the PCNA protein. 6. Méthode de diagnostic in vitro, ou de pronostic, de cancers tels que définis dans la revendication 4, chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en présence d'un anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, avec un échantillon biologique prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé sur un support solide, - la détection, et le cas échéant la quantification, de la protéine aurora-A
susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués, notamment d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps monoclonal lié à
ladite protéine aurora-A, soit la protéine aurora-A liée audit anticorps monoclonal dans les complexes formés lors de l'étape précédente entre l'anticorps monoclonal et la protéine aurora-A susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du support solide. 6. Method for in vitro diagnosis, or prognosis, of cancers such as defined in claim 4, in humans or animals, characterized in that it comprises:
- bringing together a monoclonal antibody according to claim 1 or 2, with a biological sample taken from an individual, said antibody being the case if necessary fixed on a solid support, - detection, and if necessary quantification, of the aurora-A protein likely to be present in the biological sample using reagents marked, in particular of labeled antibodies, recognizing either the monoclonal antibody linked to said aurora-A protein, i.e. the aurora-A protein linked to said monoclonal antibody in the complexes formed in the previous step between the monoclonal antibody and the protein aurora-A likely to be present in the biological sample, and this, optionally, after appropriate rinsing of the solid support. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que la détermination d'une quantité de protéine aurore-A inférieure ou supérieure aux valeurs physiologiques normales dans l'échantillon biologique, témoigne respectivement d'un bon ou d'un mauvais pronostic du cancer diagnostiqué. 7. Method according to claim 6, characterized in that the determination a amount of aurora-A protein lower or higher than the values physiological normal in the biological sample, respectively indicates a good or a poor prognosis for diagnosed cancer. 8. Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend:
- un anticorps monoclonal anti-aurore A selon la revendication 1 ou 2, - le cas échéant, un marqueur de prolifération cellulaire, tel qu'un marqueur de la protéine PCNA, notamment un anticorps anti-PCNA. 8. Kit for the implementation of a diagnostic method according to the claim 6 or 7, characterized in that it comprises:
- an anti-aurora A monoclonal antibody according to claim 1 or 2, - where appropriate, a cell proliferation marker, such as a marker of the PCNA protein, including an anti-PCNA antibody. 9. Utilisation d'un anticorps défini dans la revendication 1 ou 2, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de cancers, tels que les cancers du sein, les cancers colorectaux et les cancers gastriques. 9. Use of an antibody defined in claim 1 or 2, for the preparation of drugs for the treatment of cancers, such as cancers breast, colorectal cancers and gastric cancers. 10. Composition pharmaceutique contenant un anticorps selon la revendication 1 ou 2, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable. 10. Pharmaceutical composition containing an antibody according to claim 1 or 2, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 11. Utilisation d'un anticorps monoclonal anti-aurore A selon la revendication ou 2, pour la mise en couvre d'une méthode de criblage d'inhibiteurs de la kinase aurore A dans laquelle la baisse de l'activité de cette kinase est mesurée à l'aide dudit anticorps. 11. Use of an anti-aurora A monoclonal antibody according to claim or 2, for the implementation of a method for screening for inhibitors of aurora kinase A in which the decrease in the activity of this kinase is measured using of said antibody. 12. Méthode de criblage d'inhibiteurs de la kinase aurora A caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes:
- le traitement de cellules, telles que des lignées dérivées de différents cancers, par l'inhibiteur testé, - immunoprécipitation de la protéine kinase aurore-A à l'aide d'un anticorps selon la revendication 1 ou 2, et mesure de l'activité kinase. 12. Method for screening for aurora A kinase inhibitors, characterized in that it includes the following stages:
- the treatment of cells, such as lines derived from different cancers, by the inhibitor tested, - Aurore-A protein kinase immunoprecipitation using an antibody according to claim 1 or 2, and measuring kinase activity. 13. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti-aurore A selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- cinq injections espacées de quinze jours à des souris dé protéine kinase aurore-A recombinante produite par des bactéries E. coli transformées avec un vecteur expression bactérien dans le génome duquel a été inséré l'ADNc humain codant pour aurora-A, sacrifice desdites souris, et fusion entre des cellules de la rate de ces souris et des cellules de hamster immortalisées en culture pour obtenir des hybridomes, - criblage des hybridomes produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine recombinante utilisée pour l'immunisation des souris lors de l'étape précédente, et récupération des hybridomes positifs après ce premier crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A à partir d'un extrait de cellules humaines HeLa en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce deuxième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules humaines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce troisième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable d'immunoprécipiter la protéine endogène aurora-A de souris à
partir d'un extrait de cellules marines en culture, et récupération des hybridomes positifs après ce quatrième crible, - criblage des hybridomes récupérés à l'étape précédente, produisant un anticorps capable de reconnaître en immunofluorescence indirecte les centrosomes et les pôles du fuseau mitotique de cellules marines en culture, - récupération et purification par clonage d'un hybridome positif après l'étape de criblage précédente, et produisant un anticorps monoclonal possédant l'ensemble des propriétés définies dans la revendication 1. 13. Process for the preparation of an anti-aurora A monoclonal antibody according to the claim 1 or 2, characterized in that it comprises the following steps:
- five injections fifteen days apart in protein kinase mice Aurora-A recombinant produced by E. coli bacteria transformed with a vector bacterial expression in the genome of which the human cDNA coding has been inserted for aurora-A, sacrifice of said mice, and fusion between cells of the miss of these mice and hamster cells immortalized in culture to obtain hybridomas, - screening of hybridomas producing an antibody capable of immunoprecipitating the recombinant protein used for immunization of mice during step previous, and recovery of positive hybridomas after this first screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous aurora-A protein from a extract of human HeLa cells in culture, and recovery of hybridomas positive after this second screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of human cells in culture, and recovery of the positive hybridomas after this third screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of immunoprecipitating the endogenous protein aurora-A from mice to go of an extract of cultured marine cells, and recovery of hybridomas positive after this fourth screen, - screening of the hybridomas recovered in the previous step, producing a antibody capable of recognizing in indirect immunofluorescence the centrosomes and the poles of the mitotic spindle of cultured marine cells, - recovery and purification by cloning of a positive hybridoma after step from the previous screening, and producing a monoclonal antibody having all properties defined in claim 1.