CA2364150A1 - Polypeptides induisant l'apoptose, polynucleotides les codant et leurs applications therapeuthiques - Google Patents
Polypeptides induisant l'apoptose, polynucleotides les codant et leurs applications therapeuthiques Download PDFInfo
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Description
v POLYPEPTIDES INDUISANT L'APOPTOSE, POLYNUCLEOTIDES LES
CODANT ET LEURS APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
a) Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à des polypeptides induisant l'apoptose, aux polynucléotides les codant et à leurs applications thérapeutiques. Plus particulièrement, la présente invention vise des polypeptides induisant la formation de corps apoptotiques capable de stimuler une réponse immunitaire humorale chez les vertébrés, de préférence les mammifères.
b) Brève description de l'art antérieur II est connu que l'apoptose peut être induite par le virus de la rage. II a été
établi que les souches de virus rabique ERA et CVS infectent les lymphocytes, mais que seule l'infection des lymphocytes par la souche rabique vaccinale induit l'apoptose (46). Le déclenchement du processus apoptotique ou son blocage, soit par l'addition de l'inhibiteur de caspases zVAD-FMK, soit par sur-expression de Bcl2 n'a pas d'effet sur la production virale des cellules.
Ceci indique que le processus apoptotique viro-induit par la souche ERA est un événement qui ne modifie pas le cycle viral, certainement parce qu'il intervient trop tardivement et que l'apoptose n'améliore pas le relarguage des particules virales. L'apoptose rabique ne peut pas être induite par la seule incubation des cellules avec du virus non réplicatif. Ce qui permet d'exclure que le virus de la rage induise l'apoptose par interaction avec des récepteurs membranaires.
L'apoptose rabique implique l'activation des caspases 8 et 3, elle est donc caspase dépendante. Dans des expériences de traitement par zVAD-FMK il a été
constaté qu'une sous-population des cellules en apoptose étaient résistantes à
l'action de cet inhibiteur. Ceci laissait penser qu'une voie indépendante des caspases devait aussi être activée. Récemment il vient d'être montré au laboratoire que les souches qui induisent l'apoptose activent la voie AIF
(Thoulouze et al, en préparation). Les deux formes d'apoptose, sont bloquées par Bcl2.
CODANT ET LEURS APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
a) Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à des polypeptides induisant l'apoptose, aux polynucléotides les codant et à leurs applications thérapeutiques. Plus particulièrement, la présente invention vise des polypeptides induisant la formation de corps apoptotiques capable de stimuler une réponse immunitaire humorale chez les vertébrés, de préférence les mammifères.
b) Brève description de l'art antérieur II est connu que l'apoptose peut être induite par le virus de la rage. II a été
établi que les souches de virus rabique ERA et CVS infectent les lymphocytes, mais que seule l'infection des lymphocytes par la souche rabique vaccinale induit l'apoptose (46). Le déclenchement du processus apoptotique ou son blocage, soit par l'addition de l'inhibiteur de caspases zVAD-FMK, soit par sur-expression de Bcl2 n'a pas d'effet sur la production virale des cellules.
Ceci indique que le processus apoptotique viro-induit par la souche ERA est un événement qui ne modifie pas le cycle viral, certainement parce qu'il intervient trop tardivement et que l'apoptose n'améliore pas le relarguage des particules virales. L'apoptose rabique ne peut pas être induite par la seule incubation des cellules avec du virus non réplicatif. Ce qui permet d'exclure que le virus de la rage induise l'apoptose par interaction avec des récepteurs membranaires.
L'apoptose rabique implique l'activation des caspases 8 et 3, elle est donc caspase dépendante. Dans des expériences de traitement par zVAD-FMK il a été
constaté qu'une sous-population des cellules en apoptose étaient résistantes à
l'action de cet inhibiteur. Ceci laissait penser qu'une voie indépendante des caspases devait aussi être activée. Récemment il vient d'être montré au laboratoire que les souches qui induisent l'apoptose activent la voie AIF
(Thoulouze et al, en préparation). Les deux formes d'apoptose, sont bloquées par Bcl2.
2 Une étude réalisée avec des clones de cellules Jurkat sur-exprimant Bcl2 a montré que cette résistance à l'apoptose s'accompagnait d'une modification de la répartition des antigènes viraux N et G. Ainsi dans les cellules qui n'entrent pas en apoptose, les antigènes viraux sont concentrés dans des structures périnucléaires globulaires. Au contraire, dans les cellules qui entrent en apoptose, ils s'accumulent dans le cytoplasme et cette accumulation conduit à
la mort par apoptose. Ces résultats rappellent ceux observés dans le système de cellules lymphoblastoides non transfectées par Bcl2, entre une souche non apoptogène (CVS) et une souche pro-apoptotique (ERA). On voit donc ainsi que le passage d'un phénotype apoptogène se caractérise par l'accumulation des antigènes viraux de manière diffuse dans tout le cytoplasme et que le phénotype non-apoptogène correspond à une accumulation de protéines dans des structures périnucléaires globulaires. Ceci suggérait que la voie d'apoptose rabique soit de type toxique.
Bref au vu de ce qui précède, il est aisé de conclure que lors de l'infection d'une cellule par un virus, la physiologie cellulaire est perturbée et ces modifications peuvent conduire à l'apoptose. La désagrégation de l'intégrité
de la cellule infectée conduit à la génération de corps apoptotiques qui contiennent, en plus de morceaux de noyaux et de cytoplasme, des antigènes viraux. De nombreuses évidences expérimentales attestent maintenant que ces structures sont des immunopotentiateurs extrêmement efficaces lorsqu'ils sont pris en charge par certaines cellules présentatrices d'antigènes CPA (Cellules dendritiques) et qu'il y a présentation des antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I, donc une induction de la réponse immunitaire cellulaire.
Toutefois, jusqu'à ce jour, aucune étude n'a envisagée la possibilité
d'induire de façon spécifique et contrôlée l'apoptose pour qu'elle puisse être utilisé afin d'augmenter le pouvoir immunostimulateur de vaccins, tel un adjuvant, afin de stimuler une réponse humorale. II existe donc un besoin de caractériser une protéine qui induit des corps apoptotiques capable de stimuler la réponse des cellules B du système immunitaire.
la mort par apoptose. Ces résultats rappellent ceux observés dans le système de cellules lymphoblastoides non transfectées par Bcl2, entre une souche non apoptogène (CVS) et une souche pro-apoptotique (ERA). On voit donc ainsi que le passage d'un phénotype apoptogène se caractérise par l'accumulation des antigènes viraux de manière diffuse dans tout le cytoplasme et que le phénotype non-apoptogène correspond à une accumulation de protéines dans des structures périnucléaires globulaires. Ceci suggérait que la voie d'apoptose rabique soit de type toxique.
Bref au vu de ce qui précède, il est aisé de conclure que lors de l'infection d'une cellule par un virus, la physiologie cellulaire est perturbée et ces modifications peuvent conduire à l'apoptose. La désagrégation de l'intégrité
de la cellule infectée conduit à la génération de corps apoptotiques qui contiennent, en plus de morceaux de noyaux et de cytoplasme, des antigènes viraux. De nombreuses évidences expérimentales attestent maintenant que ces structures sont des immunopotentiateurs extrêmement efficaces lorsqu'ils sont pris en charge par certaines cellules présentatrices d'antigènes CPA (Cellules dendritiques) et qu'il y a présentation des antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I, donc une induction de la réponse immunitaire cellulaire.
Toutefois, jusqu'à ce jour, aucune étude n'a envisagée la possibilité
d'induire de façon spécifique et contrôlée l'apoptose pour qu'elle puisse être utilisé afin d'augmenter le pouvoir immunostimulateur de vaccins, tel un adjuvant, afin de stimuler une réponse humorale. II existe donc un besoin de caractériser une protéine qui induit des corps apoptotiques capable de stimuler la réponse des cellules B du système immunitaire.
3 La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à un polypeptide isolé ou purifié et à sa séquence nucléotidique le codant pour induire la formation de corps apoptotiques capable de stimuler chez un mammifère, une réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt, et leurs utilisations à des fins de vaccination thérapeutique et/ou de vaccination préventive de maladies chez l'homme et les animaux.
L'invention porte aussi sur des vecteurs d'expression ou de clonage comprenant un polynucléotide selon l'invention et des cellules transformées de manière transitoire ou stable avec de tels vecteurs.
L'invention concerne également sur des compositions immunogènes ou vaccinales comprenant les polypeptides, les polynucléotides, les corps apoptotiques et/ou les cellules transformées objets de l'invention.
La présente invention porte de plus sur l'utilisation de polypeptides, de polynucléotides, de corps apoptotiques et/ou de cellules transformées tels que définis ci-dessus pour la préparation de vaccins et d'adjuvants destinés à la prévention et/ou au traitement de maladies, telle une encéphalite virale, un cancer, une maladie neuropathologique.
Un des avantages majeurs de la présente invention est que les acides nucléiques, les polypeptides selon l'invention permettent l'induction de corps apoptotiques capable de stimuler la réponse immunitaire humorale chez l'hôte ciblé.
De nombreux autres objectifs et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description non limitative de l'invention qui suit.
La présente invention se rapporte à un polypeptide isolé ou purifié et à sa séquence nucléotidique le codant pour induire la formation de corps apoptotiques capable de stimuler chez un mammifère, une réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt, et leurs utilisations à des fins de vaccination thérapeutique et/ou de vaccination préventive de maladies chez l'homme et les animaux.
L'invention porte aussi sur des vecteurs d'expression ou de clonage comprenant un polynucléotide selon l'invention et des cellules transformées de manière transitoire ou stable avec de tels vecteurs.
L'invention concerne également sur des compositions immunogènes ou vaccinales comprenant les polypeptides, les polynucléotides, les corps apoptotiques et/ou les cellules transformées objets de l'invention.
La présente invention porte de plus sur l'utilisation de polypeptides, de polynucléotides, de corps apoptotiques et/ou de cellules transformées tels que définis ci-dessus pour la préparation de vaccins et d'adjuvants destinés à la prévention et/ou au traitement de maladies, telle une encéphalite virale, un cancer, une maladie neuropathologique.
Un des avantages majeurs de la présente invention est que les acides nucléiques, les polypeptides selon l'invention permettent l'induction de corps apoptotiques capable de stimuler la réponse immunitaire humorale chez l'hôte ciblé.
De nombreux autres objectifs et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description non limitative de l'invention qui suit.
4 BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 est un schéma illustrant le mécanisme du système d'expression de gènes RevTet-ON.
La Figure 2 est un schéma illustrant la formation de particules rétrovirales infectieuses mais incompétentes pour la réplication.
La Figure 3 est un schéma illustrant la mise en évidence de l'expression des différentes protéines dans des lignées Jurkat transgénique.
La Figure 4 représente l'analyse de la taille et de la granulosité des cellules par cytométrie de flux.
Les Figures 5A, 5B et 5C montre une analyse des cellules en apoptose par marquage au Hoechst 33342 (0.5 mg/ml) et dénombrement à l'aide du logiciel Metamorph offline. (A) Cellules en apoptose, une flèche blanche montre des cellules présentant une fragmentation caractéristique de l'ADN nucléaire. (B) Cellules non apoptotiques ne présentant pas de fragmentation du noyau (flèche blanche). (C) Cellules dénombrées à l'aide du logiciel Metamorph offline.
La Figure 6 représente la mesure de l'activation de la caspase I par cytométrie de flux. Le marqueur M1 est utilisé pour mesurer la fluorescence dans les cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées..
La Figure 7 représente la mesure de l'activation de la caspase 8. Le marqueur est analysé par cytométrie de flux. Le marqueur M1 est utilisé pour mesurer la fluorescence dans les cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées.
La Figure 8 est un graphique montrant la production d'anticorps anti-rage (toutes protéines confondues) produits après injection de corps apoptotiques ou de cellules entières chez les souris BALB/ syngéniques des cellules Wehi.
La Figure 1 est un schéma illustrant le mécanisme du système d'expression de gènes RevTet-ON.
La Figure 2 est un schéma illustrant la formation de particules rétrovirales infectieuses mais incompétentes pour la réplication.
La Figure 3 est un schéma illustrant la mise en évidence de l'expression des différentes protéines dans des lignées Jurkat transgénique.
La Figure 4 représente l'analyse de la taille et de la granulosité des cellules par cytométrie de flux.
Les Figures 5A, 5B et 5C montre une analyse des cellules en apoptose par marquage au Hoechst 33342 (0.5 mg/ml) et dénombrement à l'aide du logiciel Metamorph offline. (A) Cellules en apoptose, une flèche blanche montre des cellules présentant une fragmentation caractéristique de l'ADN nucléaire. (B) Cellules non apoptotiques ne présentant pas de fragmentation du noyau (flèche blanche). (C) Cellules dénombrées à l'aide du logiciel Metamorph offline.
La Figure 6 représente la mesure de l'activation de la caspase I par cytométrie de flux. Le marqueur M1 est utilisé pour mesurer la fluorescence dans les cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées..
La Figure 7 représente la mesure de l'activation de la caspase 8. Le marqueur est analysé par cytométrie de flux. Le marqueur M1 est utilisé pour mesurer la fluorescence dans les cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées.
La Figure 8 est un graphique montrant la production d'anticorps anti-rage (toutes protéines confondues) produits après injection de corps apoptotiques ou de cellules entières chez les souris BALB/ syngéniques des cellules Wehi.
5 La Figure 9 est un graphique montrant la production d'anticorps anti-protéine N
produits après injection de corps apoptotiques ou de cellules entières chez les souris BALB/c syngéniques des cellules Wehi.
La Figure 10 montre la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) du gène codant pour la protéine G de la souche rabique ERA.
La Figure 11 montre la séquence peptidique (SEQ ID NO : 2) de la protéine G-ERA déduite à partir de la séquence montrée à la Figure 8.
La Figure 12 montre la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) du gène codant pour la protéine G-ERA et la séquence peptidique déduite correspondante (SEQ
ID NO : 2).
La Figure 13 représente le marquage spécifique des cellules NT2-N par l'anticorps anti-Nf.
La Figure 14 représente la qualité de mesures en apoptose évalué après coloration au Hoechst.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié qui induit la formation de corps apoptotiques capables de stimuler une réponse immunitaire humorale, comme par exemple une réponse humorale de type B.
Par « isolé ou purifié », on entends les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c.-à-d., si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un
produits après injection de corps apoptotiques ou de cellules entières chez les souris BALB/c syngéniques des cellules Wehi.
La Figure 10 montre la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) du gène codant pour la protéine G de la souche rabique ERA.
La Figure 11 montre la séquence peptidique (SEQ ID NO : 2) de la protéine G-ERA déduite à partir de la séquence montrée à la Figure 8.
La Figure 12 montre la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) du gène codant pour la protéine G-ERA et la séquence peptidique déduite correspondante (SEQ
ID NO : 2).
La Figure 13 représente le marquage spécifique des cellules NT2-N par l'anticorps anti-Nf.
La Figure 14 représente la qualité de mesures en apoptose évalué après coloration au Hoechst.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié qui induit la formation de corps apoptotiques capables de stimuler une réponse immunitaire humorale, comme par exemple une réponse humorale de type B.
Par « isolé ou purifié », on entends les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c.-à-d., si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un
6 polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas « isolé ». Toutefois, le même polynucléotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification et/ou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant « isolé ». D'ailleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est « isolé » même si il est encore présent dans ledit organisme.
Par « réponse immunitaire humorale », on entends une réaction in vivo ou in vitro en réponse à un contact avec un immunogène. Une réaction humorale est généralement induite par une production d'anticorps générée contre ledit immunogène.
Par « corps apoptotiques », on entends un complexe acide nucléique/protéine formé par le morcellement cellulaire lors du processus apoptotique de la cellule.
Ainsi, l'invention vise plus particulièrement un polynucléotide qui active la voie des caspases, et tout particulièrement celle de la caspase-8 initiatrice.
Préférentiellement, le polypeptide selon la présente invention est sélectionné
dans le groupe constitué par a) une glycoprotéine G issue d'un virus de la rage, préférablement de la souche ERA, et qui présente une séquence comprenant au moins une proline en position 27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 ; et b) un fragment d'au moins 100 acides aminés de la protéine telle que définie en a).
Le polypeptide de la présente invention peut également comprendre une thréonine en position 89. De manière avantageuse, les inventeurs ont découvert qu'un polypeptide ayant comme séquence peptidique la séquence SEQ ID NO :2 était particulièrement intéressant.
La présente invention vise également un polypeptide chimérique présentant une séquence comprenant au moins un polypeptide tel que défini
Par « réponse immunitaire humorale », on entends une réaction in vivo ou in vitro en réponse à un contact avec un immunogène. Une réaction humorale est généralement induite par une production d'anticorps générée contre ledit immunogène.
Par « corps apoptotiques », on entends un complexe acide nucléique/protéine formé par le morcellement cellulaire lors du processus apoptotique de la cellule.
Ainsi, l'invention vise plus particulièrement un polynucléotide qui active la voie des caspases, et tout particulièrement celle de la caspase-8 initiatrice.
Préférentiellement, le polypeptide selon la présente invention est sélectionné
dans le groupe constitué par a) une glycoprotéine G issue d'un virus de la rage, préférablement de la souche ERA, et qui présente une séquence comprenant au moins une proline en position 27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 ; et b) un fragment d'au moins 100 acides aminés de la protéine telle que définie en a).
Le polypeptide de la présente invention peut également comprendre une thréonine en position 89. De manière avantageuse, les inventeurs ont découvert qu'un polypeptide ayant comme séquence peptidique la séquence SEQ ID NO :2 était particulièrement intéressant.
La présente invention vise également un polypeptide chimérique présentant une séquence comprenant au moins un polypeptide tel que défini
7 précédemment et est associée à une séquence exogène, comme par exemple un épitope B et/ou un épitope T.
Les polypeptides selon la présente invention peuvent être préparés et/ou obtenus par tout procédé approprié et connu par une personne versée dans le domaine. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biomoléculaire en utilisant notamment la RT-PCR et différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après.
La présente invention a donc aussi pour objet des oligonucléotides ayant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID
NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO : 8. Ces oligonucléotides étant préférablement utilisés comme sonde ou comme amorce, telle dans le cadre d'une RT-PCR, pour obtenir un polynucléotide qui code pour le polypeptide de l'invention. A cet effet, la présente invention vise également tout polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini auparavant. Plus précisément, le polynucléotide a préférablement pour séquence nucléotidique celle définie par la séquence SEQ ID NO : 1.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet des vecteurs d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les polypeptides de l'invention, lesquels peuvent être par la suite transférer dans des cellules hôtes, soit par transfection ou transformation. Suite à la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformée, le polypeptide de la présente invention peut être récupéré par des moyens connus par l'homme de l'art.
L'invention concerne donc tout vecteur (de clonage et/ou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé ou transfecté par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Préférablement, les vecteurs sont des vecteurs recombinants contenant une cassette d'expression d'un polynucléotide de la présente invention.
Avantageusement, de tels vecteurs sont sélectionné dans le groupe constitué
par les virus recombinants et les plasmides recombinants possédant une origine de réplication eucaryote. Plus préférablement les vecteurs sont ceux nommés
Les polypeptides selon la présente invention peuvent être préparés et/ou obtenus par tout procédé approprié et connu par une personne versée dans le domaine. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biomoléculaire en utilisant notamment la RT-PCR et différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après.
La présente invention a donc aussi pour objet des oligonucléotides ayant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID
NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO : 8. Ces oligonucléotides étant préférablement utilisés comme sonde ou comme amorce, telle dans le cadre d'une RT-PCR, pour obtenir un polynucléotide qui code pour le polypeptide de l'invention. A cet effet, la présente invention vise également tout polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini auparavant. Plus précisément, le polynucléotide a préférablement pour séquence nucléotidique celle définie par la séquence SEQ ID NO : 1.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet des vecteurs d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les polypeptides de l'invention, lesquels peuvent être par la suite transférer dans des cellules hôtes, soit par transfection ou transformation. Suite à la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformée, le polypeptide de la présente invention peut être récupéré par des moyens connus par l'homme de l'art.
L'invention concerne donc tout vecteur (de clonage et/ou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé ou transfecté par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Préférablement, les vecteurs sont des vecteurs recombinants contenant une cassette d'expression d'un polynucléotide de la présente invention.
Avantageusement, de tels vecteurs sont sélectionné dans le groupe constitué
par les virus recombinants et les plasmides recombinants possédant une origine de réplication eucaryote. Plus préférablement les vecteurs sont ceux nommés
8 pRevTRE.G.ERA et pRevTRE.N.ERA (utilisé comme témoin négatif), pRev-G-CVS, pRev-TRE-N-CVS qui ont été déposé à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 respectivement sous les numéros d'accession I-2760, I-2761, I-2758 et I-2759.
L'invention concerne également des cellules hôtes, préférablement d'origine lymphoblastiques, lesquelles contiennent soit un polynucléotide défini par la SEQ ID NO: 1 ou une fragment de celui-ci, et ce, préférablement intégré
de façon stable, ou soit un polypeptide ou un vecteur tels que définis précédemment.
La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polypeptides et des polynucléotides les codant, de cellules hôtes et de corps apoptotiques selon la présente invention pour la préparation de vaccin ou d'adjuvant de l'immunité.
Par « adjuvant », on entends toute substance ou molécule introduite dans la composition d'un vaccin ou d'une composition immunogène, conduisant à une augmentation de la réponse immunitaire. II est par conséquence entendu, que le polypeptide de la présente invention peut servir en tant qu'adjuvant pour ainsi augmenter la réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt. Parmi les antigènes contre lequel on peut vouloir stimuler une réponse immunitaire, on inclut à titre d'exemple les antigènes viraux, les antigènes tumoraux, les antigènes cellulaires dont la surexpression ou l'altération codent pour une pathologie (par exemple la neuropathologie). II est également clair que d'autres types d'adjuvant bien connu de l'homme de l'art peut être ajouté à la composition vaccinale ou immunogène de la présente invention ci-après décrite.
Ainsi, la présente invention vise donc des composition immunogène ou vaccinale contenant des corps apoptotiques qui stimulent une réponse immunitaire humorale tels que décrits ci-après et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Préférablement, lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir d'une cellule hôte telle que définie précédemment et plus particulièrement par transfection ou micro-injection dudit polypeptide de l'invention dans la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation privilégié, la composition immunogène ou vaccinale contient un élément choisi dans le groupe constitué par
L'invention concerne également des cellules hôtes, préférablement d'origine lymphoblastiques, lesquelles contiennent soit un polynucléotide défini par la SEQ ID NO: 1 ou une fragment de celui-ci, et ce, préférablement intégré
de façon stable, ou soit un polypeptide ou un vecteur tels que définis précédemment.
La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polypeptides et des polynucléotides les codant, de cellules hôtes et de corps apoptotiques selon la présente invention pour la préparation de vaccin ou d'adjuvant de l'immunité.
Par « adjuvant », on entends toute substance ou molécule introduite dans la composition d'un vaccin ou d'une composition immunogène, conduisant à une augmentation de la réponse immunitaire. II est par conséquence entendu, que le polypeptide de la présente invention peut servir en tant qu'adjuvant pour ainsi augmenter la réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt. Parmi les antigènes contre lequel on peut vouloir stimuler une réponse immunitaire, on inclut à titre d'exemple les antigènes viraux, les antigènes tumoraux, les antigènes cellulaires dont la surexpression ou l'altération codent pour une pathologie (par exemple la neuropathologie). II est également clair que d'autres types d'adjuvant bien connu de l'homme de l'art peut être ajouté à la composition vaccinale ou immunogène de la présente invention ci-après décrite.
Ainsi, la présente invention vise donc des composition immunogène ou vaccinale contenant des corps apoptotiques qui stimulent une réponse immunitaire humorale tels que décrits ci-après et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Préférablement, lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir d'une cellule hôte telle que définie précédemment et plus particulièrement par transfection ou micro-injection dudit polypeptide de l'invention dans la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation privilégié, la composition immunogène ou vaccinale contient un élément choisi dans le groupe constitué par
9 - un polypeptide selon la présente invention ;
- un polynucléotide selon la présente invention ;
- un vecteur selon la présente invention ; et - une cellule hôte selon la présente invention .
Ces compositions peuvent être avantageuses pour prévenir ou traiter des encéphalites virales, telle la rage, des cancers, ou des maladies neuropathologiques. Par exemple, on peut envisager une méthode d'induction d'une immunité humorale contre un antigène d'intérêt comprenant l'étape d'administrer une telle composition immunogène ou vaccinale chez l'hôte désiré, en l'occurrence soit un humain ou un animal. Les moyens de préparation et d'administration des compositions de la présente invention ne seront pas décrit davantage car ceux-ci sont déjà connus par l'homme de l'art.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue d'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectués sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puissent utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Exemale 1 : Détermination d'une protéine pro-apoatotique du virus rabiaue II a été montré précédemment au laboratoire (46) que l'apoptose rabique dans les cellules Jurkat nécessite que le virus se réplique et que les caspases soient activées. L'entrée en apoptose est concomitante d'une accumulation et d'une répartition particulière des protéines virales dans le cytoplasme. Ceci suggère que l'engorgement du cytoplasme par les antigènes viraux induit l'apoptose. Certaines souches de rage, comme la souche atténuée ERA
induisent l'apoptose, ce qui n'est pas le cas de la souche hautement pathogène CVS.
Comme, il a été montré que les cellules Jurkat sont infectées par les deux souches virales, nous avons émis l'hypothèse que l'entrée en apoptose était liée 5 à la nature intrinsèque des protéines virales : celles de ERA induisant l'apoptose contrairement aux protéines de la souche CVS. Dans le but d'identifier et de caractériser les protéines pro-apoptotiques, nous avons mis au point un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage sous contrôle de l'opérateur Tet dans des cellules Jurkat. L'objectif du travail consistait à
établir un
- un polynucléotide selon la présente invention ;
- un vecteur selon la présente invention ; et - une cellule hôte selon la présente invention .
Ces compositions peuvent être avantageuses pour prévenir ou traiter des encéphalites virales, telle la rage, des cancers, ou des maladies neuropathologiques. Par exemple, on peut envisager une méthode d'induction d'une immunité humorale contre un antigène d'intérêt comprenant l'étape d'administrer une telle composition immunogène ou vaccinale chez l'hôte désiré, en l'occurrence soit un humain ou un animal. Les moyens de préparation et d'administration des compositions de la présente invention ne seront pas décrit davantage car ceux-ci sont déjà connus par l'homme de l'art.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue d'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectués sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puissent utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Exemale 1 : Détermination d'une protéine pro-apoatotique du virus rabiaue II a été montré précédemment au laboratoire (46) que l'apoptose rabique dans les cellules Jurkat nécessite que le virus se réplique et que les caspases soient activées. L'entrée en apoptose est concomitante d'une accumulation et d'une répartition particulière des protéines virales dans le cytoplasme. Ceci suggère que l'engorgement du cytoplasme par les antigènes viraux induit l'apoptose. Certaines souches de rage, comme la souche atténuée ERA
induisent l'apoptose, ce qui n'est pas le cas de la souche hautement pathogène CVS.
Comme, il a été montré que les cellules Jurkat sont infectées par les deux souches virales, nous avons émis l'hypothèse que l'entrée en apoptose était liée 5 à la nature intrinsèque des protéines virales : celles de ERA induisant l'apoptose contrairement aux protéines de la souche CVS. Dans le but d'identifier et de caractériser les protéines pro-apoptotiques, nous avons mis au point un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage sous contrôle de l'opérateur Tet dans des cellules Jurkat. L'objectif du travail consistait à
établir un
10 système qui permette d'étudier les bases moléculaires de l'apoptose induite par le virus rabique hors d'un contexte d'infection par un virus complet.
Matériel et Méthodes 1.Virus et cellules Les souches de laboratoire du virus rabique ERA (vr332) et CVS (vr959) proviennent de l'American Type Cell Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA) et ont été amplifiées sur des cellules BSR (dérivées de fibroblastes de rein de hamster BHK-21). Ces cellules sont cultivées dans du milieu MEM supplémenté
par 8% de sérum de veau foetal (SVF), tryptose-phosphate, 2mM de L-Glutamine 40mg/ml gentamycine. Les cellules d'encapsidation PT67 (Retro Pack cell line de chez Clontech) sont cultivées sur milieu DMEM supplémenté par 10% de SVF, 4 mM de L-glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 ~.g/ml de streptomycine.
Les cellules NIH3T3 sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté par 10%
de SVF, 100U/ml de pénicilline, 100 ~g/ml de streptomycine, 1mM de sodium-pyruvate. Les cellules Jurkat rtTA (47) sont des cellules cultivées en suspension dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de SVF, 2 Mm de L-Glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 ~g/ml de streptomycine et 2.5 ~,g/ml de puromycine.
Tous ces milieux et solutions proviennent de chez Invitrogen (France).
Matériel et Méthodes 1.Virus et cellules Les souches de laboratoire du virus rabique ERA (vr332) et CVS (vr959) proviennent de l'American Type Cell Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA) et ont été amplifiées sur des cellules BSR (dérivées de fibroblastes de rein de hamster BHK-21). Ces cellules sont cultivées dans du milieu MEM supplémenté
par 8% de sérum de veau foetal (SVF), tryptose-phosphate, 2mM de L-Glutamine 40mg/ml gentamycine. Les cellules d'encapsidation PT67 (Retro Pack cell line de chez Clontech) sont cultivées sur milieu DMEM supplémenté par 10% de SVF, 4 mM de L-glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 ~.g/ml de streptomycine.
Les cellules NIH3T3 sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté par 10%
de SVF, 100U/ml de pénicilline, 100 ~g/ml de streptomycine, 1mM de sodium-pyruvate. Les cellules Jurkat rtTA (47) sont des cellules cultivées en suspension dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de SVF, 2 Mm de L-Glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 ~g/ml de streptomycine et 2.5 ~,g/ml de puromycine.
Tous ces milieux et solutions proviennent de chez Invitrogen (France).
11 2. Mécanisme du ~stème d'expression de Gènes RevTet-ON
Le plasmide régulateur pRevTet-ON code, sous contrôle du promoteur fort CMV, pour le transactivateur inverse Tétracycline rtTA ( une fusion entre le répresseur Tet inverse et le domaine activateur de VP16) (Figure 1 ). Ce dernier se fixe sur son élément de réponse TRE présent sur le vecteur d'expression pRevTRE. L'addition de la Doxycycline (1~g/ml) permet la transcription du gène d'intérêt. Le protocole a été réalisé en suivant les instructions du manuel RevTet (Clontech # K1627-1 ). Les séquences et cartes des plasmides sont disponibles sur http://vwvw.clontech.com.
3. Clonage des gènes viraux et séauencaae Les techniques de biologie moléculaire utilisées pour les RT-PCR, les clonages et le séquençage sont communément décrites dans le manuel de Perbal (48).
4. Obtention des rétrovirus recombinants à partir des lignées PT67 Les différents vecteurs d'expression pRevTRE contenant les gènes d'intérêt, un gène de sélection à un antibiotique ( HygromycineR ), et ~+
(signal nécessaire pour la formation de particules rétrovirales) ou le vecteur régulateur pRevTet-ON ayant le gène de sélection à un antibiotique (Néomycine R ) ont été
transfectés dans les lignées cellulaires d'encapsidation PT67 en utilisant le kit GenePorterTM 2 Transfection Reagent (GTS,Ozyme). La lignée cellulaire d'encapsidation apporte les gènes structuraux nécessaires à la formation d'une particule virale : gag (protéines de structure), pol (transcriptase inverse, intégrase) et env ( glycoprotéine d'enveloppe) intégrés dans le génome de la cellule sans aucune autre séquence virale. Les vecteurs rétroviraux peuvent s'intégrer de manière stable ou être transitoirement exprimés. Les virus libérés par ces cellules sont infectieux mais incompétents pour la réplication empêchant ainsi une production virale dans les lignées cellulaires infectées par la suite. Une sélection avec de l'hygromycine (0,4mg/ml) ou du 6418 (0,4 mg/ml) permet d'isoler des cellules ayant intégré le génome rétroviral et produisant
Le plasmide régulateur pRevTet-ON code, sous contrôle du promoteur fort CMV, pour le transactivateur inverse Tétracycline rtTA ( une fusion entre le répresseur Tet inverse et le domaine activateur de VP16) (Figure 1 ). Ce dernier se fixe sur son élément de réponse TRE présent sur le vecteur d'expression pRevTRE. L'addition de la Doxycycline (1~g/ml) permet la transcription du gène d'intérêt. Le protocole a été réalisé en suivant les instructions du manuel RevTet (Clontech # K1627-1 ). Les séquences et cartes des plasmides sont disponibles sur http://vwvw.clontech.com.
3. Clonage des gènes viraux et séauencaae Les techniques de biologie moléculaire utilisées pour les RT-PCR, les clonages et le séquençage sont communément décrites dans le manuel de Perbal (48).
4. Obtention des rétrovirus recombinants à partir des lignées PT67 Les différents vecteurs d'expression pRevTRE contenant les gènes d'intérêt, un gène de sélection à un antibiotique ( HygromycineR ), et ~+
(signal nécessaire pour la formation de particules rétrovirales) ou le vecteur régulateur pRevTet-ON ayant le gène de sélection à un antibiotique (Néomycine R ) ont été
transfectés dans les lignées cellulaires d'encapsidation PT67 en utilisant le kit GenePorterTM 2 Transfection Reagent (GTS,Ozyme). La lignée cellulaire d'encapsidation apporte les gènes structuraux nécessaires à la formation d'une particule virale : gag (protéines de structure), pol (transcriptase inverse, intégrase) et env ( glycoprotéine d'enveloppe) intégrés dans le génome de la cellule sans aucune autre séquence virale. Les vecteurs rétroviraux peuvent s'intégrer de manière stable ou être transitoirement exprimés. Les virus libérés par ces cellules sont infectieux mais incompétents pour la réplication empêchant ainsi une production virale dans les lignées cellulaires infectées par la suite. Une sélection avec de l'hygromycine (0,4mg/ml) ou du 6418 (0,4 mg/ml) permet d'isoler des cellules ayant intégré le génome rétroviral et produisant
12 respectivement les rétrovirus recombinants MomuLV-NCVS, MomuLV-NERA, MomuLV-GERA, MomuLV-GCVS et MomuLV-TetON.
5. Titrage des stocks rétroviraux Afin de vérifier la viabilité des particules rétrovirales recombinantes MomuLV produites par les lignées d'encapsidation PT67, nous avons réalisé un titrage en plaque sur cellules NIH3T3. 1 ml du surnageant de culture est additionné d'1 ~I de polybrène stérile (agent cationique facilitant la fusion) à une concentration finale de 4 ~g/ml. Des dilutions en séries, du virus sont ensuite réalisées (10-' à 10-6) dans du milieu NIH3T3 + polybrène (4mg/ml). Les cellules cibles NIH3T3 (105 cellules/puits) sont ensuite infectées par les différentes dilutions. 48h après l'infection, les cellules sont soumises à une sélection au 6418 (0,8mg/ml) pour pRevTet-ON ou à l'hygromycine (0,4mg/ml) pour pRevTRE, pendant une semaine. Le titre du virus correspond au nombre de colonies présentes à la plus haute dilution multiplié par le facteur de dilution, il s'exprime en UFC/ml (Unités Formant Colonies/ml).
6. Obtention de liginées de cellules Jurkat transaénigues stables Nous avons dans un premier temps infecté les cellules Jurkat avec le recombinant MomuLV-TetON. Deux jours après l'infection, sont sélectionnées avec du 6418 (0,8mg/ml) les cellules ayant intégré le transactivateur inverse rtTA. Après un mois de repiquage et amplification sur milieu sélectif, nous avons obtenu une population non clonale de cellules résistantes au 6418. Cette lignée Jurkat TetON est en cours de caractérisation. Les cellules Jurkat rtTA
possédant le transactivateur inverse sous forme épisomale ont été infectées avec les différents rétrovirus recombinants MomuLV. Une sélection par la puromycine (2,5 ~,g/ml) et l'hygromycine (0,4mg/ml) a permis d'isoler des lignées stables non clonales possédant à la fois le rtTA sous forme épisomale et ayant intégé le gène d' i nté rêt.
5. Titrage des stocks rétroviraux Afin de vérifier la viabilité des particules rétrovirales recombinantes MomuLV produites par les lignées d'encapsidation PT67, nous avons réalisé un titrage en plaque sur cellules NIH3T3. 1 ml du surnageant de culture est additionné d'1 ~I de polybrène stérile (agent cationique facilitant la fusion) à une concentration finale de 4 ~g/ml. Des dilutions en séries, du virus sont ensuite réalisées (10-' à 10-6) dans du milieu NIH3T3 + polybrène (4mg/ml). Les cellules cibles NIH3T3 (105 cellules/puits) sont ensuite infectées par les différentes dilutions. 48h après l'infection, les cellules sont soumises à une sélection au 6418 (0,8mg/ml) pour pRevTet-ON ou à l'hygromycine (0,4mg/ml) pour pRevTRE, pendant une semaine. Le titre du virus correspond au nombre de colonies présentes à la plus haute dilution multiplié par le facteur de dilution, il s'exprime en UFC/ml (Unités Formant Colonies/ml).
6. Obtention de liginées de cellules Jurkat transaénigues stables Nous avons dans un premier temps infecté les cellules Jurkat avec le recombinant MomuLV-TetON. Deux jours après l'infection, sont sélectionnées avec du 6418 (0,8mg/ml) les cellules ayant intégré le transactivateur inverse rtTA. Après un mois de repiquage et amplification sur milieu sélectif, nous avons obtenu une population non clonale de cellules résistantes au 6418. Cette lignée Jurkat TetON est en cours de caractérisation. Les cellules Jurkat rtTA
possédant le transactivateur inverse sous forme épisomale ont été infectées avec les différents rétrovirus recombinants MomuLV. Une sélection par la puromycine (2,5 ~,g/ml) et l'hygromycine (0,4mg/ml) a permis d'isoler des lignées stables non clonales possédant à la fois le rtTA sous forme épisomale et ayant intégé le gène d' i nté rêt.
13 7. Analyse de la taille et de la Granulométrie des cellules par cytométrie de flux Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin ayant atteint une densité de 5 x105 cellules/ml sont séparées en deux lots homogènes dont un seulement est traité avec de la Dox à 1 ~g/ml. Les cellules sont récupérées après 18h d' induction, puis centrifugées pendant 5min à 800 rpm (4°C). Les cellules sont resuspendues dans du tampon PBS et du Cell Fix (Becton Dickinson, BD, USA). Les cellules sont ensuite analysées à l'aide du cytofluorimètre FACSCalibur et du logiciel Cell Quest Pro (BD, USA).
8. MarauaGe au Hoechst 33342 et dénombrement.
Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin traitées de la même façon que précédemment sont incubées 10 min à 37°C avec du Hoechst 33342 (0,5 mg/ml), agent intercalant de l'ADN permettant de visualiser des cellules présentant une fragmentation caractéristique du noyau. Les cellules sont centrifugées, lavées avec du PBS, fixées 30min avec de la paraformaldéhyde 0,4% (PFA). Après un lavage dans du PBS, les cellules sont reprises dans du glycérol tamponné et montées entre lame et lamelle. Les cellules sont observées au microscope inversé à fluorescence et un dénombrement des cellules présentant une fragmentation caractéristique de l'ADN nucléaire à été effectué
à
l'aide du logiciel Métamorph offlline (Metamorph software imaging system, Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA). Vingt champs ont été
comptés au hasard pour chaque condition et la moyenne a été réalisée.
9. Détection de l'expression des protéines par cytométrie de flux Ce protocole est décrit dans Thoulouze et al (46). Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin, traitées de la même façon que précédemment, sont centrifugées, lavées avec du tampon PBS, fixées 30 min avec de la paraformaldéhyde 0,4%, et perméabilisées avec 0,1 % de saponine (Tampon PB). Les cellules sont resuspendues et incubées 1 h à 4°C avec les anticorps monoclonaux spécifiques : mAb 8.2 biotinylé au (1/100) pour G, et un mélange de trois Mab 1/50 fournit par le Dr N. .Minamoto, Université de Gifu, Japon) pour les protéines N. Les cellules sont lavées dans du PB puis incubées
8. MarauaGe au Hoechst 33342 et dénombrement.
Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin traitées de la même façon que précédemment sont incubées 10 min à 37°C avec du Hoechst 33342 (0,5 mg/ml), agent intercalant de l'ADN permettant de visualiser des cellules présentant une fragmentation caractéristique du noyau. Les cellules sont centrifugées, lavées avec du PBS, fixées 30min avec de la paraformaldéhyde 0,4% (PFA). Après un lavage dans du PBS, les cellules sont reprises dans du glycérol tamponné et montées entre lame et lamelle. Les cellules sont observées au microscope inversé à fluorescence et un dénombrement des cellules présentant une fragmentation caractéristique de l'ADN nucléaire à été effectué
à
l'aide du logiciel Métamorph offlline (Metamorph software imaging system, Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA). Vingt champs ont été
comptés au hasard pour chaque condition et la moyenne a été réalisée.
9. Détection de l'expression des protéines par cytométrie de flux Ce protocole est décrit dans Thoulouze et al (46). Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin, traitées de la même façon que précédemment, sont centrifugées, lavées avec du tampon PBS, fixées 30 min avec de la paraformaldéhyde 0,4%, et perméabilisées avec 0,1 % de saponine (Tampon PB). Les cellules sont resuspendues et incubées 1 h à 4°C avec les anticorps monoclonaux spécifiques : mAb 8.2 biotinylé au (1/100) pour G, et un mélange de trois Mab 1/50 fournit par le Dr N. .Minamoto, Université de Gifu, Japon) pour les protéines N. Les cellules sont lavées dans du PB puis incubées
14 30 min avec les composants appropriés : la streptavidine-PE (1/100) pour la détection de l'anticorps biotinylé et pour les protéines N, l'anti souris-biotinylé
(1/100). Les cellules sont lavées dans du PB et resuspendues au final dans du tampon de marquage pour fluorescence (SB). Les cellules sont incubées 30 min avec streptavidine-PE (1/100) pour la révélation des protéines N, puis lavées dans du tampon SB. Les cellules sont analysées à l'aide du cytofluorimètre.
10. Marauaae des caspases totales et des casaases 1 et 8 Nous avons dans un premier temps, utilisé un inhibiteur des caspases totales, le FITC-VAD-FMK (kit CaspACETM FITC-VAD-FMK in Situ Marker, Promega). Cette molécule est un analogue fluorescent du z-VAD-FMK (N
benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone) où le groupe bloquant N
terminal (N-benzyloxycarbonyl = z) a été remplacé par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour créer un marqueur fluorescent. Ce composé contient une séquence en acides aminés reconnue par les protéases à cystéine, il pénêtre dans la cellule, et se fixe de façon irréversible aux caspases activées.
Ensuite nous avons utilisé le FAM-YVAD-FMK (CaspaTagTM Caspase 1 (YVAD) Activity Kit, Intergen), analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Tyr-Val-Ala-Asp- fluoromethylketone : z-YVAD-FMK qui est un inhibiteur spécifique de la caspase 1, et le FAM-LETD-FMK (CaspaTagTM Caspase 8 (LETD) Activity Kit, Intergen), analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Leu-Glu-Thr-Asp-fluoromethylketone : z-LETD-FMK, qui est un inhibiteur spécifique de la caspase 8. Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin ayant atteint une densité de 5x105 cellules/ml sont séparées en deux lots homogènes dont l'un est traité avec de la Dox à 1mg/ml . Dix huit heures après l'induction, les cellules sont centrifugées, et incubées 1 h à 37°C avec les différents inhibiteurs de caspases.
Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du tampon PBS, puis une fois avec du SB, avant d'être reprises dans du tampon SB et du Cell Fix (BD, USA).
Les cellules sont analysées au cytofluorimêtre.
Rés u Itats 1. Clonage des gènes codant pour les protéines N et G des souches de rage CVS et ERA.
5 Les clones des gènes codant pour les nucléoprotéines et les glycoprotéines des souches ERA et CVS, utilisées dans le travail de thèse précédent (46) pour démontrer la nature pro-apoptogène de la souche ERA, n'existaient pas encore au laboratoire. Mon premier travail a donc été de réaliser le clonage moléculaire de ces gènes. Le clonage a été réalisé dans le plasmide 10 pRevTRE qui devait servir à l'établissement du système inductible TetON.
L'analyse de la séquence de référence du génome rabique dans la banque de donnée de l'EMBL (Numéros d'accession M13215, M21634 par Tordo et col.) indiquait que les sites de restrictions BamHl et Hpal n'étaient présents ni dans le gène codant pour la nucléoprotéine, ni dans celui de la glycoprotéine. Ceci nous
(1/100). Les cellules sont lavées dans du PB et resuspendues au final dans du tampon de marquage pour fluorescence (SB). Les cellules sont incubées 30 min avec streptavidine-PE (1/100) pour la révélation des protéines N, puis lavées dans du tampon SB. Les cellules sont analysées à l'aide du cytofluorimètre.
10. Marauaae des caspases totales et des casaases 1 et 8 Nous avons dans un premier temps, utilisé un inhibiteur des caspases totales, le FITC-VAD-FMK (kit CaspACETM FITC-VAD-FMK in Situ Marker, Promega). Cette molécule est un analogue fluorescent du z-VAD-FMK (N
benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone) où le groupe bloquant N
terminal (N-benzyloxycarbonyl = z) a été remplacé par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour créer un marqueur fluorescent. Ce composé contient une séquence en acides aminés reconnue par les protéases à cystéine, il pénêtre dans la cellule, et se fixe de façon irréversible aux caspases activées.
Ensuite nous avons utilisé le FAM-YVAD-FMK (CaspaTagTM Caspase 1 (YVAD) Activity Kit, Intergen), analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Tyr-Val-Ala-Asp- fluoromethylketone : z-YVAD-FMK qui est un inhibiteur spécifique de la caspase 1, et le FAM-LETD-FMK (CaspaTagTM Caspase 8 (LETD) Activity Kit, Intergen), analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Leu-Glu-Thr-Asp-fluoromethylketone : z-LETD-FMK, qui est un inhibiteur spécifique de la caspase 8. Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin ayant atteint une densité de 5x105 cellules/ml sont séparées en deux lots homogènes dont l'un est traité avec de la Dox à 1mg/ml . Dix huit heures après l'induction, les cellules sont centrifugées, et incubées 1 h à 37°C avec les différents inhibiteurs de caspases.
Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du tampon PBS, puis une fois avec du SB, avant d'être reprises dans du tampon SB et du Cell Fix (BD, USA).
Les cellules sont analysées au cytofluorimêtre.
Rés u Itats 1. Clonage des gènes codant pour les protéines N et G des souches de rage CVS et ERA.
5 Les clones des gènes codant pour les nucléoprotéines et les glycoprotéines des souches ERA et CVS, utilisées dans le travail de thèse précédent (46) pour démontrer la nature pro-apoptogène de la souche ERA, n'existaient pas encore au laboratoire. Mon premier travail a donc été de réaliser le clonage moléculaire de ces gènes. Le clonage a été réalisé dans le plasmide 10 pRevTRE qui devait servir à l'établissement du système inductible TetON.
L'analyse de la séquence de référence du génome rabique dans la banque de donnée de l'EMBL (Numéros d'accession M13215, M21634 par Tordo et col.) indiquait que les sites de restrictions BamHl et Hpal n'étaient présents ni dans le gène codant pour la nucléoprotéine, ni dans celui de la glycoprotéine. Ceci nous
15 a permis de réaliser le clonage en utilisant ces deux sites de restrictions de pRevTRE. Des oligonucléotides contenant soit le site BamHl et le codon d'initiation du gène correspondant, soit le site Hpal et le codon stop de ce même gène ont été synthétisés et qui sont décrits dans le Tableau suivant.
16 Tableau 1 : Oligonucléotides synthétiques pour le clonage ~G-BamH1-start (valable ERAICVS) SEQ ID N
5' GGCCGGATCCATGGTTCCTCAGGCTCTC 3' N-BamH1-start (valable ERAICVS) SEQ ID N0:5 5'GGCCGGATCCATGGATGCCGACAAGATT3' G-Hpa1-CVS-stop SEQ ID N0:61 5'GGCCGTTAACTCACAGTCTGGTCTGACC3' G-Hpa1-ERA-stop SEQ ID NO:
5'GGCCGTTAACTCACAGTCTGGTCTCACC3' N-Hpa1-stop (valable ERAICVS) SEQ ID NO:
5'GGCCGTTAACTTATGAGTCACTCGAATA3' Les ARN intracellulaires totaux ont été isolés 48h après l'infection de cellules BSR avec les deux souches de virus rabique ERA et CVS à une multiplicité d'infection de 3. Des RT-PCR ont été réalisées sur ces extraits après dénaturation des structures secondaires des molécules d'ARN par du méthyle de mercure. Des produits PCR possédant une taille compatible avec l'intégralité
de la séquence codante pour les gènes G et N (respectivement 1575nt et 1353nt) ont été obtenus. Ces produits PCR ont été soumis à une double digestion enzymatique BamHI/Hpal.
Les produits de digestion ne montraient pas par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8% une modification substantielle de leur taille. Cette observation prouvait donc que le choix des sites de clonage avait été pertinent et que ni les gènes N et G des deux souches ERA et CVS ne possédaient ces sites de restriction. Ces produits PCR ont été introduits dans le vecteur pRevTRE
digéré
par BamHl/Hpal et déphosphorylé. Après transformation de bactéries compétentes XL1 Gold et sélection par résistance à l'ampicilline, des clones
5' GGCCGGATCCATGGTTCCTCAGGCTCTC 3' N-BamH1-start (valable ERAICVS) SEQ ID N0:5 5'GGCCGGATCCATGGATGCCGACAAGATT3' G-Hpa1-CVS-stop SEQ ID N0:61 5'GGCCGTTAACTCACAGTCTGGTCTGACC3' G-Hpa1-ERA-stop SEQ ID NO:
5'GGCCGTTAACTCACAGTCTGGTCTCACC3' N-Hpa1-stop (valable ERAICVS) SEQ ID NO:
5'GGCCGTTAACTTATGAGTCACTCGAATA3' Les ARN intracellulaires totaux ont été isolés 48h après l'infection de cellules BSR avec les deux souches de virus rabique ERA et CVS à une multiplicité d'infection de 3. Des RT-PCR ont été réalisées sur ces extraits après dénaturation des structures secondaires des molécules d'ARN par du méthyle de mercure. Des produits PCR possédant une taille compatible avec l'intégralité
de la séquence codante pour les gènes G et N (respectivement 1575nt et 1353nt) ont été obtenus. Ces produits PCR ont été soumis à une double digestion enzymatique BamHI/Hpal.
Les produits de digestion ne montraient pas par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8% une modification substantielle de leur taille. Cette observation prouvait donc que le choix des sites de clonage avait été pertinent et que ni les gènes N et G des deux souches ERA et CVS ne possédaient ces sites de restriction. Ces produits PCR ont été introduits dans le vecteur pRevTRE
digéré
par BamHl/Hpal et déphosphorylé. Après transformation de bactéries compétentes XL1 Gold et sélection par résistance à l'ampicilline, des clones
17 bactériens ont été isolés. La présence de plasmide pRevTRE recombinants a été
vérifiée par l'établissement de profils de restriction et le séquençage des extrémités du plasmide de part et d'autre du site de clonage. Deux clones au moins ont été sélectionnés par construction, et la totalité de la séquence de l'insert a été réalisée.
Les séquences de ces gènes ont été comparées entre elles et à la séquence de référence du génome de la souche de virus rabique PV. Les résultats sont présentés dans les Tableaux 2 et 3 . Ceci a permis d'établir que des séquences correspondant aux gènes N et G des souches ERA et CVS
avaient bien été clonées. Un clone représentatif de chaque gène a été utilisé
dans la suite de ce travail, ils sont dénommés pRevTRE.N.ERA, pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.CVS et pRevTRE.G.CVS. De l'analyse des comparaisons de séquences des protéines N et G de ERA et CVS, on peut conclure que les protéines N et les glycoprotéines divergent légèrement entre elles par 5 et 6 acides aminés respectivement. Comparée à PV, séquence de référence, on constate que la souche ERA serait la plus " éloignée " (9 acides aminés différents pour N et 18 pour G entre ces deux souches) par rapport à
CVS ( 4 acides aminés différents pour N et 16 pour G).
vérifiée par l'établissement de profils de restriction et le séquençage des extrémités du plasmide de part et d'autre du site de clonage. Deux clones au moins ont été sélectionnés par construction, et la totalité de la séquence de l'insert a été réalisée.
Les séquences de ces gènes ont été comparées entre elles et à la séquence de référence du génome de la souche de virus rabique PV. Les résultats sont présentés dans les Tableaux 2 et 3 . Ceci a permis d'établir que des séquences correspondant aux gènes N et G des souches ERA et CVS
avaient bien été clonées. Un clone représentatif de chaque gène a été utilisé
dans la suite de ce travail, ils sont dénommés pRevTRE.N.ERA, pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.CVS et pRevTRE.G.CVS. De l'analyse des comparaisons de séquences des protéines N et G de ERA et CVS, on peut conclure que les protéines N et les glycoprotéines divergent légèrement entre elles par 5 et 6 acides aminés respectivement. Comparée à PV, séquence de référence, on constate que la souche ERA serait la plus " éloignée " (9 acides aminés différents pour N et 18 pour G entre ces deux souches) par rapport à
CVS ( 4 acides aminés différents pour N et 16 pour G).
18 Tableau 2 : Comparaison de séquences des protéines N ERA et CVS
entre elles et avec la souches de référence PV.
Protine N entre PVIERAentre PVICVSentre ERAICVS
% d'homologie (squence nuclotidique)98,67 ~ 99,04 99,48 Nombre d'acides amins diffrents9 4 5 Acides amins diffrents PV ERA CVS
Position 26 Y H ii Tableau 3 : Comparaison de séquences des glycoprotéines ERA et CVS
entre elles et avec la souches de référence PV.
Protine G entre PVIERAentre PVCVSentre ERAICVS
d'hmologie s uence nuclotidi97,73 98,29 99,56 ( ue) Nombre d'acides 18 16 6 amins diffrents Acides amins PV ERA CVS
diffrents Position 8 V I V
entre elles et avec la souches de référence PV.
Protine N entre PVIERAentre PVICVSentre ERAICVS
% d'homologie (squence nuclotidique)98,67 ~ 99,04 99,48 Nombre d'acides amins diffrents9 4 5 Acides amins diffrents PV ERA CVS
Position 26 Y H ii Tableau 3 : Comparaison de séquences des glycoprotéines ERA et CVS
entre elles et avec la souches de référence PV.
Protine G entre PVIERAentre PVCVSentre ERAICVS
d'hmologie s uence nuclotidi97,73 98,29 99,56 ( ue) Nombre d'acides 18 16 6 amins diffrents Acides amins PV ERA CVS
diffrents Position 8 V I V
19 2. Isolement de lignées productrices de particules rétrovirales recombinantes.
Comme les cellules Jurkat sont difficilement transfectables par les méthodes classiques (électroporation, transfection), nous avons choisi de faire pénétrer les transgènes en utilisant la capacité d'infection de particules rétrovirales recombinantes du virus MomuLV. Nous disposions de la lignée PT67 qui contient les gènes structuraux gag, pol et env du MomuLV. Le vecteur pRevTRE possédant les séquences de régulation 3'LTR/5'LTR ainsi que le signal d'encapsidation +, la transfection du plasmide pRevTRE recombinant dans ces cellules aboutit à la production de particules rétrovirales possédant un transgène dans leur génome. Nous avons réalisé la transfection des cellules PT67 avec les plasmides pRevTRE.N.ERA, pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.CVS et pRevTRE.G.CVS. Nous avons aussi inclu une série de transfections avec le plasmide pRevTet-ON qui possède comme transgène le transactivateur tétracycline rtTA sous contrôle du promoteur CMV. La première série de plasmides possède le gène codant pour la résistance à l'hygromycine et le plasmide pRevTet-ON possède celui codant pour la résistance au 6418. Deux jours après la transfection, un milieu sélectif contenant soit de l'hygromycine (0,4mg/ml), soit du 6418 (0,8mg/ml) est ajouté au milieu de culture. Au bout de 4 à 7 jours, les cellules, qui n'ont pas intégré le génome rétroviral défectif meurent et se décollent . Au contraire, celles qui ont subi cette intégration et qui expriment les gènes de résistances aux drogues restent adhérentes et génèrent des amas de cellules Après trois phases d'amplification et repiquage sur une période d'environ 3 semaines, nous disposions de lignées non clonales résistantes soit à
l'hygromycine soit au 6418 pour tous les plasmides originellement transfectés.
La capacité de ces cellules à produire du virus dans le surnageant de culture a été contrôle en réalisant un titrage sur des cellules NIH3T3. Les résultats de ces titrages sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4: Titrage des rétrovirus recombinants MomuLV produits dans le surnageant de culture par les lignées d'encapsidation sur cellules NIH3T3.
Titres des stocks de virus (UFC/ml) MomuLV-NCVS 1.1 OZ
MomuLV-NERA 20.102 MomuLV-GERA 10.102 MomuLV-GCVS 2.102 MomuLV-TetON 4.102 1 ml de chaque stock de virus est additionné de polybrène stérile à une concentration finale de 4ug/ml. Des dilutions en séries sont réalisées (10'~ à 10-6) et chaque dilution est déposée dans un puit contenant 105 10 cellules NIH3T3. 48 h après l'infection, les cellules sont soumises à une sélection par hygromycine (0.4mg/ml) ou au G418(0,8mg/ml). Le titre du virus correspond au nombre de colonies présentes à la plus haute dilution multiplié par le facteur de dilution.
Pour toutes les lignées isolées, une production virale a été obtenue avec 15 succés. Ceci atteste donc de la viabilité biologique de nos constructions et de leur capacité à générer des particules rétrovirales MomuLV recombinantes fonctionnelles. II faut noter cependant que les titres viraux restent faibles (de l'ordre de 102 UFC) ce qui est significativement plus faible que les titres de UFC qui sont décrits dans la littérature. Le fait que nous ayons isolé des lignées
Comme les cellules Jurkat sont difficilement transfectables par les méthodes classiques (électroporation, transfection), nous avons choisi de faire pénétrer les transgènes en utilisant la capacité d'infection de particules rétrovirales recombinantes du virus MomuLV. Nous disposions de la lignée PT67 qui contient les gènes structuraux gag, pol et env du MomuLV. Le vecteur pRevTRE possédant les séquences de régulation 3'LTR/5'LTR ainsi que le signal d'encapsidation +, la transfection du plasmide pRevTRE recombinant dans ces cellules aboutit à la production de particules rétrovirales possédant un transgène dans leur génome. Nous avons réalisé la transfection des cellules PT67 avec les plasmides pRevTRE.N.ERA, pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.CVS et pRevTRE.G.CVS. Nous avons aussi inclu une série de transfections avec le plasmide pRevTet-ON qui possède comme transgène le transactivateur tétracycline rtTA sous contrôle du promoteur CMV. La première série de plasmides possède le gène codant pour la résistance à l'hygromycine et le plasmide pRevTet-ON possède celui codant pour la résistance au 6418. Deux jours après la transfection, un milieu sélectif contenant soit de l'hygromycine (0,4mg/ml), soit du 6418 (0,8mg/ml) est ajouté au milieu de culture. Au bout de 4 à 7 jours, les cellules, qui n'ont pas intégré le génome rétroviral défectif meurent et se décollent . Au contraire, celles qui ont subi cette intégration et qui expriment les gènes de résistances aux drogues restent adhérentes et génèrent des amas de cellules Après trois phases d'amplification et repiquage sur une période d'environ 3 semaines, nous disposions de lignées non clonales résistantes soit à
l'hygromycine soit au 6418 pour tous les plasmides originellement transfectés.
La capacité de ces cellules à produire du virus dans le surnageant de culture a été contrôle en réalisant un titrage sur des cellules NIH3T3. Les résultats de ces titrages sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4: Titrage des rétrovirus recombinants MomuLV produits dans le surnageant de culture par les lignées d'encapsidation sur cellules NIH3T3.
Titres des stocks de virus (UFC/ml) MomuLV-NCVS 1.1 OZ
MomuLV-NERA 20.102 MomuLV-GERA 10.102 MomuLV-GCVS 2.102 MomuLV-TetON 4.102 1 ml de chaque stock de virus est additionné de polybrène stérile à une concentration finale de 4ug/ml. Des dilutions en séries sont réalisées (10'~ à 10-6) et chaque dilution est déposée dans un puit contenant 105 10 cellules NIH3T3. 48 h après l'infection, les cellules sont soumises à une sélection par hygromycine (0.4mg/ml) ou au G418(0,8mg/ml). Le titre du virus correspond au nombre de colonies présentes à la plus haute dilution multiplié par le facteur de dilution.
Pour toutes les lignées isolées, une production virale a été obtenue avec 15 succés. Ceci atteste donc de la viabilité biologique de nos constructions et de leur capacité à générer des particules rétrovirales MomuLV recombinantes fonctionnelles. II faut noter cependant que les titres viraux restent faibles (de l'ordre de 102 UFC) ce qui est significativement plus faible que les titres de UFC qui sont décrits dans la littérature. Le fait que nous ayons isolé des lignées
20 d'encapsidation non clonales, qui sont constituées d'un mélange hétérogène de cellules fortement productrices et de cellules plus faiblement productrices de virions, pourrait expliquer ce résultat. Les titres viraux représenteraient donc un titre moyen. Cette hypothèse a été vérifiée pour au moins une lignée puisque en sous clonant les cellules nous avons été capable d'isoler des sous clones produisant des virus avec un plus haut titre .
21 3. Obtention de lignées de cellules Jurkat transgénipues Notre but était de pouvoir isoler des lignées transgéniques de cellules Jurkat possédant à la fois le transactivateur inverse tétracycline rtTA et les transgènes N et G des souches ERA ou CVS. Les cellules jurkat sont des cellules de la lignée lymphoblastoide humaine qui poussent en suspension avec un temps de doublement d'environ 24h. Ces cellules sont sensibles aux faibles densités cellulaires et aux médiateurs cytotoxiques ou cytolytiques. Dans un premier temps, nous avons infecté des cellules Jurkat avec le MomuLV-TetON
(multiplicité d'infection de 1 ) dans le but d'intégrer le rtTA. Deux jours après l'infection, ces cellules ont été transférées dans un milieu sélectif contenant du 6418 (0,8mg/ml). Après 7 jours de culture dans ces conditions, des cellules vivantes dont la croissance est ralentie par la présence de cellules mortes apparaissent. Aprés un mois de repiquage et amplification en milieu sélectif (deux passages par semaine), et tentative d'éliminer les cellules mortes par centrifugation à basse vitesse (800rpm/mn, pendant 10 min), nous avons obtenu une population non-clonale de cellules résistantes au 6418. Cette lignée Jurkat TetON est en cours de caractérisation.
Dans le but de pouvoir tester plus rapidement le phénotype de nos transgènes viraux, nous avons décidé d'utiliser aussi une lignée Jurkat rtTA
déjà
existante ou le rtTA est présent sous forme épisomale. Dans ces cellules le rtTA
est maintenu par une sélection à la puromycine. Cette lignée nous a été
gracieusement fournie par le Dr John Hiscott (47) par l'intermédiaire du Pr Alain Israel (1P, Paris). Ces cellules ont été infectées par les rétrovirus recombinants MomuLV-N.CVS, MomuLV-N.ERA, MomuLV-G-ERA ou MomuLV-G.CVS.
Deux jours après l'infection, ces cellules ont été mises en culture dans un milieu sélectif contenant 0,4mg/ml d'hygromycine. Une procédure identique à
celle effectuée pour les cellules Jurkat TetON a été ensuite appliquée. Au bout de 1,5 mois nous disposions de lignées stables non-clonales résistantes à la fois à
la puromycine et à l'hygromycine qui possédaient les transgènes viraux intégrés.
Ces lignées ont été nommées JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS.
(multiplicité d'infection de 1 ) dans le but d'intégrer le rtTA. Deux jours après l'infection, ces cellules ont été transférées dans un milieu sélectif contenant du 6418 (0,8mg/ml). Après 7 jours de culture dans ces conditions, des cellules vivantes dont la croissance est ralentie par la présence de cellules mortes apparaissent. Aprés un mois de repiquage et amplification en milieu sélectif (deux passages par semaine), et tentative d'éliminer les cellules mortes par centrifugation à basse vitesse (800rpm/mn, pendant 10 min), nous avons obtenu une population non-clonale de cellules résistantes au 6418. Cette lignée Jurkat TetON est en cours de caractérisation.
Dans le but de pouvoir tester plus rapidement le phénotype de nos transgènes viraux, nous avons décidé d'utiliser aussi une lignée Jurkat rtTA
déjà
existante ou le rtTA est présent sous forme épisomale. Dans ces cellules le rtTA
est maintenu par une sélection à la puromycine. Cette lignée nous a été
gracieusement fournie par le Dr John Hiscott (47) par l'intermédiaire du Pr Alain Israel (1P, Paris). Ces cellules ont été infectées par les rétrovirus recombinants MomuLV-N.CVS, MomuLV-N.ERA, MomuLV-G-ERA ou MomuLV-G.CVS.
Deux jours après l'infection, ces cellules ont été mises en culture dans un milieu sélectif contenant 0,4mg/ml d'hygromycine. Une procédure identique à
celle effectuée pour les cellules Jurkat TetON a été ensuite appliquée. Au bout de 1,5 mois nous disposions de lignées stables non-clonales résistantes à la fois à
la puromycine et à l'hygromycine qui possédaient les transgènes viraux intégrés.
Ces lignées ont été nommées JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS.
22 4. Caractérisation des lignées de cellules Jurkat transgéniaues Les lignées de cellules Jurkat transgéniques ont été caractérisées pour leur capacité à induire l'expression des protéines virales N et G des souches ERA et CVS après traitement avec de la Doxycycline (Dox). En effet, la Dox possède, par rapport à la tétracycline, une affinité 100 fois supérieure pour le transactivateur inverse rtTA. De ce fait, elle induit une plus grande activation de la protéine rtTA et donc une induction plus forte du gène à exprimer.
Les lignées transgéniques, présentent un taux de doublement de 24h qui est similaire à la lignée cellulaire témoin JrtTA, qui ne possède que le rtTA.
Comme les cellules parentales, ces lignées sont sensibles aux faibles concentrations cellulaires et aux facteurs cytolytiques. Les cellules JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS ainsi que les cellules témoin JrtTA ont été mises en culture. Lorqu'elles ont atteint une densité de 5x105 cellules/ml, ces cultures ont été individuellement séparées en deux lots homogènes dont l'un uniquement a été traité avec de la Dox à 1 ~,g/ml. Après une induction de 18h, on observe que les cellules mises en présence de Dox ont un léger retard de croissance par rapport aux cellules non traitées et présentent un taux de cellules mortes légèrement supérieur (10-15%) ce qui traduit une certaine toxicité du traitement à la doxycycline. Les cellules ont été centrifugées, fixées à la paraformaldéhyde et enfin perméabilisées avec 0,1 % de saponine pour vérifier l'expression des protéines par immunochimie. Un marquage à l'aide d'anticorps monoclonaux, spécifiques des antigènes viraux N et G intracellulaires et membranaires (dans le cas de la glycoprotéine) a été effectué. L'analyse a été
faite ensuite par cytométrie de flux. Les résultats sont présentés dans la Fig 3.
Dans le cas des cellules témoin JrTA, l'analyse du marquage ne montre aucune différence en absence ou en présence de Dox ce qui atteste de la spécificité des réactions. Au contraire, pour les lignées Jurkat transgéniques on observe un décalage du pic de fluorescence ce qui correspond à une augmentation du nombre de cellules marquées par les anticorps en présence de Dox. Nous constatons que 46% de cellules Jurkat expriment la protéine N-CVS, et 64% expriment la protéine N-ERA. Pour les protéines G, le taux d'expression
Les lignées transgéniques, présentent un taux de doublement de 24h qui est similaire à la lignée cellulaire témoin JrtTA, qui ne possède que le rtTA.
Comme les cellules parentales, ces lignées sont sensibles aux faibles concentrations cellulaires et aux facteurs cytolytiques. Les cellules JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS ainsi que les cellules témoin JrtTA ont été mises en culture. Lorqu'elles ont atteint une densité de 5x105 cellules/ml, ces cultures ont été individuellement séparées en deux lots homogènes dont l'un uniquement a été traité avec de la Dox à 1 ~,g/ml. Après une induction de 18h, on observe que les cellules mises en présence de Dox ont un léger retard de croissance par rapport aux cellules non traitées et présentent un taux de cellules mortes légèrement supérieur (10-15%) ce qui traduit une certaine toxicité du traitement à la doxycycline. Les cellules ont été centrifugées, fixées à la paraformaldéhyde et enfin perméabilisées avec 0,1 % de saponine pour vérifier l'expression des protéines par immunochimie. Un marquage à l'aide d'anticorps monoclonaux, spécifiques des antigènes viraux N et G intracellulaires et membranaires (dans le cas de la glycoprotéine) a été effectué. L'analyse a été
faite ensuite par cytométrie de flux. Les résultats sont présentés dans la Fig 3.
Dans le cas des cellules témoin JrTA, l'analyse du marquage ne montre aucune différence en absence ou en présence de Dox ce qui atteste de la spécificité des réactions. Au contraire, pour les lignées Jurkat transgéniques on observe un décalage du pic de fluorescence ce qui correspond à une augmentation du nombre de cellules marquées par les anticorps en présence de Dox. Nous constatons que 46% de cellules Jurkat expriment la protéine N-CVS, et 64% expriment la protéine N-ERA. Pour les protéines G, le taux d'expression
23 est de 40% pour G-ERA et de 25% pour G-CVS. Ces résultats indiquent que les quatre protéines sont bien exprimées de façon inductible dans notre système mais que les taux d'expression sont variables (de 25 à 64 %). Ceci pourrait résulter de deux situations 1 ) efficacité variable des sites d'intégration Le système consiste en une intégration du gène d'intérêt dans le génome de la cellule Jurkat. Cette intégration qui se fait au hasard peut localiser le transgène dans une région transcriptionnellement active ou pas. Dans certains cas, le transgène peut être difficilement accessible, et le rtTA peut se fixer plus ou moins bien sur sa cible TRE. Les lignées transgéniques étant pour l'instant non clonales, il est donc très vraisemblable que les produits d'intégrations soient localisés à des locus différents.
2) réactivité variable des anticorps Nous pourrions aussi expliquer cette expression faible par le fait que les anticorps utilisés reconnaissent plus ou moins bien les protéines synthétisées. En effet ces protéines virales sont exprimées en l'absence de leurs autres partenaires protéique viraux et, pour l'instant, nous ne savons pas si toutes les molécules exprimées sont correctement structurées ou non. Dans le cas contraire, une partie plus ou moins importante de la protéine synthétisée pourrait ne pas présenter l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal.
Malgré les légères variations, nos résultats démontrent que les lignées de cellules Jurkat transgéniques produisent de façon inductible les quatre protéines que nous avons décidé d'étudier. Nous avons donc en main un système qui nous permet d'étudier les bases moléculaires de l'apoptose .
5. Mise en évidence d'un phénotype pro-aaoptoaène Nous venons de montrer que nous disposions d'un système de cellules Jurkat ou l'expression des protéines N et G des souches ERA et CVS était inductible. Nous nous sommes donc attachés à démontrer que cette expression
2) réactivité variable des anticorps Nous pourrions aussi expliquer cette expression faible par le fait que les anticorps utilisés reconnaissent plus ou moins bien les protéines synthétisées. En effet ces protéines virales sont exprimées en l'absence de leurs autres partenaires protéique viraux et, pour l'instant, nous ne savons pas si toutes les molécules exprimées sont correctement structurées ou non. Dans le cas contraire, une partie plus ou moins importante de la protéine synthétisée pourrait ne pas présenter l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal.
Malgré les légères variations, nos résultats démontrent que les lignées de cellules Jurkat transgéniques produisent de façon inductible les quatre protéines que nous avons décidé d'étudier. Nous avons donc en main un système qui nous permet d'étudier les bases moléculaires de l'apoptose .
5. Mise en évidence d'un phénotype pro-aaoptoaène Nous venons de montrer que nous disposions d'un système de cellules Jurkat ou l'expression des protéines N et G des souches ERA et CVS était inductible. Nous nous sommes donc attachés à démontrer que cette expression
24 pouvait avoir une implication sur la physiologie cellulaire et plus particulièrement sur la mort cellulaire programmée. Les lignées Jurkat transgéniques ainsi que la lignée JrtTA témoin ont été mises en culture. Lorsque les cultures cellulaires ont atteint une densité de 5x105 cellules/ml, elles ont été séparées en deux lots homogènes dont l'un a été traité avec de la Dox à 1 pg/ml. Le phénotype cellulaire d'induction d'apoptose a été analysé 18h après l'induction soit en mesurant la taille et la granulométrie des cellules en cytométrie de flux, soit en dénombrant les cellules présentant une fragmentation de leurs noyaux (technique de coloration Hoechst).
Lors de l'apoptose, les cellules subissent des changements morphologiques caractéristiques dont certains peuvent être mesurés par cytométrie de flux. Les cellules mortes, formant la population R2, sont caractérisées par une forte granulosité (SSC : Side Light Scatter) et par une réduction de leur taille (FSC : Forward Light Scatter). En revanche, les cellules vivantes, formant la population R1 présentent une granulosité moindre et une plus grande taille. Les résultats sont présentés dans la Fig 4. Dans toutes les cultures nous observons la présence d'une population R2. Après traitement par la Dox, les cellules Jurkat rtTA présentent un niveau de base de 10% de cellules mortes qui pourraient correspondre à des cellules en apoptose . Ce résultat montre que la présence du transactivateur inverse au sein des cellules et l'induction par la Dox n'est pas neutre pour la viabilité de la population de cellule.
Par contre, on observe dans les lignées jurkat transgéniques une variation de cette population R2 qui est dépendante du transgène exprimé. De fait, on note le gradient du nombre de cellules mortes suivant G-ERA >G-CVS >N-CVS >N-ERA >JrtTA
35% 20% 15% 11 % 10%
II est donc intéressant de noter que les glycoprotéines virales exprimées provoquent une mort cellulaire plus importante que les nucléoprotéines, quelque soit leur origine. Cependant, ce sont indéniablement les cellules exprimant la glycoprotéine de la souche ERA qui possèdent le phénotype le plus marqué. La condensation de la chromatine et la fragmentation de l'ADN nucléaire, qui conduisent à une modification morphologique des noyaux cellulaires, sont un des phénotypes caractéristique de l'apoptose. Nous avons étudié ces phénomènes en effectuant un marquage des noyaux avec du Hoechst 33342 (0,5mg/ml). Les 5 résultats obtenus sont représentés sur la Fig 5. Par rapport à une culture cellulaire qui ne présente pas de cellules mourant d'apoptose, les cultures cellulaires apoptotiques présentent de nombreuses cellules où le noyau cellulaire est entièrement déstructuré et même fragmenté en plusieurs composants globulaires. Les cellules ont été observées au microscope à fluorescence inversé
10 puis nous avons réalisé une analyse d'image à l'aide du logiciel Metamorph offline pour dénombrer les cellules en apoptose terminale, c'est a dire présentant un noyau fragmenté. Les données de le figure 5 montrent bien que c'est la lignée JrtTA-G.ERA qui présente le plus de cellules en apoptose (28.2%). Ces résultats confirment les résultats obtenus par l'analyse de la taille et de la granulométrie 15 des cellules, la protéine G-ERA est la protéine pro-apoptogène principale.
Nous avons, de plus vérifier que le fait de mettre en présence le surnageant de culture de cellules JrtTA-G.ERA induite par la Dox, sur des cellules Jurkat naïves n'entrainait pas l'apoptose de ces cellules. Ce résultat indique que l'apoptose mise en évidence dans les études précédentes est bien 20 consécutive à l'expression de la protéine, et n'est pas du à une action à
distance par libération de médiateurs solubles.
6. Caractérisation moléculaire de l'aaoptose viro-induite Nous avons établi que parmi les quatres protéines virales exprimées, la
Lors de l'apoptose, les cellules subissent des changements morphologiques caractéristiques dont certains peuvent être mesurés par cytométrie de flux. Les cellules mortes, formant la population R2, sont caractérisées par une forte granulosité (SSC : Side Light Scatter) et par une réduction de leur taille (FSC : Forward Light Scatter). En revanche, les cellules vivantes, formant la population R1 présentent une granulosité moindre et une plus grande taille. Les résultats sont présentés dans la Fig 4. Dans toutes les cultures nous observons la présence d'une population R2. Après traitement par la Dox, les cellules Jurkat rtTA présentent un niveau de base de 10% de cellules mortes qui pourraient correspondre à des cellules en apoptose . Ce résultat montre que la présence du transactivateur inverse au sein des cellules et l'induction par la Dox n'est pas neutre pour la viabilité de la population de cellule.
Par contre, on observe dans les lignées jurkat transgéniques une variation de cette population R2 qui est dépendante du transgène exprimé. De fait, on note le gradient du nombre de cellules mortes suivant G-ERA >G-CVS >N-CVS >N-ERA >JrtTA
35% 20% 15% 11 % 10%
II est donc intéressant de noter que les glycoprotéines virales exprimées provoquent une mort cellulaire plus importante que les nucléoprotéines, quelque soit leur origine. Cependant, ce sont indéniablement les cellules exprimant la glycoprotéine de la souche ERA qui possèdent le phénotype le plus marqué. La condensation de la chromatine et la fragmentation de l'ADN nucléaire, qui conduisent à une modification morphologique des noyaux cellulaires, sont un des phénotypes caractéristique de l'apoptose. Nous avons étudié ces phénomènes en effectuant un marquage des noyaux avec du Hoechst 33342 (0,5mg/ml). Les 5 résultats obtenus sont représentés sur la Fig 5. Par rapport à une culture cellulaire qui ne présente pas de cellules mourant d'apoptose, les cultures cellulaires apoptotiques présentent de nombreuses cellules où le noyau cellulaire est entièrement déstructuré et même fragmenté en plusieurs composants globulaires. Les cellules ont été observées au microscope à fluorescence inversé
10 puis nous avons réalisé une analyse d'image à l'aide du logiciel Metamorph offline pour dénombrer les cellules en apoptose terminale, c'est a dire présentant un noyau fragmenté. Les données de le figure 5 montrent bien que c'est la lignée JrtTA-G.ERA qui présente le plus de cellules en apoptose (28.2%). Ces résultats confirment les résultats obtenus par l'analyse de la taille et de la granulométrie 15 des cellules, la protéine G-ERA est la protéine pro-apoptogène principale.
Nous avons, de plus vérifier que le fait de mettre en présence le surnageant de culture de cellules JrtTA-G.ERA induite par la Dox, sur des cellules Jurkat naïves n'entrainait pas l'apoptose de ces cellules. Ce résultat indique que l'apoptose mise en évidence dans les études précédentes est bien 20 consécutive à l'expression de la protéine, et n'est pas du à une action à
distance par libération de médiateurs solubles.
6. Caractérisation moléculaire de l'aaoptose viro-induite Nous avons établi que parmi les quatres protéines virales exprimées, la
25 glycoprotéine de la souche ERA était la protéine la plus pro-apoptogène.
Nous avons donc décidé de commencer à étudier quels pouvaient être les mécanismes qui permettent de déclencher le processus apoptotique. II avait été
précédemment montré dans le laboratoire que l'apoptose viro-induite par le virus rabique était dépendante de la voie des caspases (caspases 8 et 3), nous nous sommes donc attachés à étudier ce qu'il en était pour la protéine G-ERA
exprimée.
Nous avons donc décidé de commencer à étudier quels pouvaient être les mécanismes qui permettent de déclencher le processus apoptotique. II avait été
précédemment montré dans le laboratoire que l'apoptose viro-induite par le virus rabique était dépendante de la voie des caspases (caspases 8 et 3), nous nous sommes donc attachés à étudier ce qu'il en était pour la protéine G-ERA
exprimée.
26 La mesure de l'activation des caspases a été réalisée 18h post-induction en cytométrie de flux dans les cultures de cellules JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS ainsi que les cellules témoin JrtTA. Ceci a été
effectué en utilisant l'inhibiteur de caspases marqué avec un fluorochrome FITC-VAD-FMK (Promega, France) directement sur les cellules non fixées et dans leur milieu de culture. Cette molécule, qui permet la détection de la totalité des caspases activées, pénètre dans la cellule et se fixe de façon irréversible à
celles-ci réalisant ainsi un marquage " in situ " de ces protéases. Après lavages des cellules et fixation, le marquage peut être détecté au cytomêtre en flux.
Nous avons pu constater que cette méthodologie permettait bien la détection des caspases activées par cytométrie de flux. Cependant, nous avons aussi observé
que la quantification de l'activation spécifique était difficile du fait de la présence d'un bruit de fond important. Dans cette expérience, il n'a pas été possible de conclure pour les lignées Jurkat transgéniques exprimant les nucléoprotéines.
Néanmoins, cette analyse a permis de montrer que la GERA induisait une nette activation des caspases alors que celle-ci est plus faible pour GCVS.
Dans le but de caractériser plus avant les caspases impliquées, nous avons analysé l'état d'activation de deux d'entre elles : la caspase 1 (activatrice des cytokines et pro-inflammatoire) et la caspase 8 (caspase initiatrice). Ces expériences ont été réalisées en suivant la même procédure expérimentale que ci-dessus mais en utilisant cette fois-ci des substrats à haute activité
spécifique que sont FAM-YVAD-FMK pour la caspase 1, ou FAM-LETD-FMK pour la caspase 8 (Intergen, France). Les résultats sont présentés Figures 6 et 7.
L'analyse au cytofluorimètre fait apparaître des différences nettes entre ERA et CVS, nous constatons que l'expression de la protéine G-ERA dans les cellules Jurkat provoque l'activation de la caspase 8 de façon importante.
Ainsi nous observons 19% d'activation alors que l'expression de la protéine G-CVS
conduit seulement à une activation de 5% et celle de N-CVS à 3%. Nous observons un autre profil, concernant la caspase 1 pro-inflammatoire.
L'expression de la protéine G-ERA conduit seulement à une activation de 7%
alors que la protéine G-CVS induit une forte activation (23%), l'expression de la protéine N-CVS, quant à elle, donne une activation de 12%. La protéine N-ERA
effectué en utilisant l'inhibiteur de caspases marqué avec un fluorochrome FITC-VAD-FMK (Promega, France) directement sur les cellules non fixées et dans leur milieu de culture. Cette molécule, qui permet la détection de la totalité des caspases activées, pénètre dans la cellule et se fixe de façon irréversible à
celles-ci réalisant ainsi un marquage " in situ " de ces protéases. Après lavages des cellules et fixation, le marquage peut être détecté au cytomêtre en flux.
Nous avons pu constater que cette méthodologie permettait bien la détection des caspases activées par cytométrie de flux. Cependant, nous avons aussi observé
que la quantification de l'activation spécifique était difficile du fait de la présence d'un bruit de fond important. Dans cette expérience, il n'a pas été possible de conclure pour les lignées Jurkat transgéniques exprimant les nucléoprotéines.
Néanmoins, cette analyse a permis de montrer que la GERA induisait une nette activation des caspases alors que celle-ci est plus faible pour GCVS.
Dans le but de caractériser plus avant les caspases impliquées, nous avons analysé l'état d'activation de deux d'entre elles : la caspase 1 (activatrice des cytokines et pro-inflammatoire) et la caspase 8 (caspase initiatrice). Ces expériences ont été réalisées en suivant la même procédure expérimentale que ci-dessus mais en utilisant cette fois-ci des substrats à haute activité
spécifique que sont FAM-YVAD-FMK pour la caspase 1, ou FAM-LETD-FMK pour la caspase 8 (Intergen, France). Les résultats sont présentés Figures 6 et 7.
L'analyse au cytofluorimètre fait apparaître des différences nettes entre ERA et CVS, nous constatons que l'expression de la protéine G-ERA dans les cellules Jurkat provoque l'activation de la caspase 8 de façon importante.
Ainsi nous observons 19% d'activation alors que l'expression de la protéine G-CVS
conduit seulement à une activation de 5% et celle de N-CVS à 3%. Nous observons un autre profil, concernant la caspase 1 pro-inflammatoire.
L'expression de la protéine G-ERA conduit seulement à une activation de 7%
alors que la protéine G-CVS induit une forte activation (23%), l'expression de la protéine N-CVS, quant à elle, donne une activation de 12%. La protéine N-ERA
27 n'active ni la caspase 1 ni la caspase 8. En suivant cette méthodologie, il s'est avéré assez difficile de quantifier avec précision en double marquage les cellules qui étaient positives à la fois pour la détection de la protéine virale et pour l'activation des caspases1/8. En effet comme nous l'avions dit précédemment, la mesure de l'expression se fait plutôt sur les cellules de faible granulométrie et de grande taille. Alors que les caspases activées sont principalement détectées sur les cellules de plus grande granulométrie et de taille plus faible.
II est cependant clair à la vue de ces résultats que l'expression de la protéine G-ERA est un facteur principal de déclenchement de l'apoptose dans les cellules Jurkat. Ce processus implique la voie des caspases et plus précisément la caspase 8 initiatrice. Contrairement à la souche CVS, la glycoprotéine de souche ERA ne semble pas activer la caspase 1.
Discussion et Perspectives Ce travail a permis de mettre en place un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage dans un modèle cellulaire de lymphocytes humains (cellules Jurkat). A l'aide de ce modèle, nous avons établi que 1 ) l'expression de la protéine G-ERA dans les lymphocytes cibles Jurkat rtTA
induit l'apoptose, 2) au cours de cette apoptose, la voie des caspases est activée, 3) la protéine G-ERA induit l'activation de la caspase 8 initiatrice 4) la protéine G-ERA
a finalement perdu la capacité d'activer la caspase 1 pro-inflammatoire qui reste la caractéristique des protéines de la souche non apoptotique CVS.
Ces résultats confirment les résultats précédemment établis au laboratoire selon lesquels, l'apoptose viro-induite par le virus rabique se caractérise principalement par une activation de la voie des caspases (8 et 3) et que la caspase 1 est plutôt activée par la souche CVS. La souche CVS étant non apoptotique, ces résultats suggèrent que la caspase 1 n'est certainement pas impliquée dans le phénomène d'apoptose. II se pourrait, au contraire, qu'elle participe à l'inflammation. Le fait que la protéine N-ERA ne soit pas activatrice de caspases apoptotiques démontre ce qui avait été suggéré sur la base de l'analyse des cinétiques (46) c'est à dire que la protéine G et non la N
induitt l'apoptose..
II est cependant clair à la vue de ces résultats que l'expression de la protéine G-ERA est un facteur principal de déclenchement de l'apoptose dans les cellules Jurkat. Ce processus implique la voie des caspases et plus précisément la caspase 8 initiatrice. Contrairement à la souche CVS, la glycoprotéine de souche ERA ne semble pas activer la caspase 1.
Discussion et Perspectives Ce travail a permis de mettre en place un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage dans un modèle cellulaire de lymphocytes humains (cellules Jurkat). A l'aide de ce modèle, nous avons établi que 1 ) l'expression de la protéine G-ERA dans les lymphocytes cibles Jurkat rtTA
induit l'apoptose, 2) au cours de cette apoptose, la voie des caspases est activée, 3) la protéine G-ERA induit l'activation de la caspase 8 initiatrice 4) la protéine G-ERA
a finalement perdu la capacité d'activer la caspase 1 pro-inflammatoire qui reste la caractéristique des protéines de la souche non apoptotique CVS.
Ces résultats confirment les résultats précédemment établis au laboratoire selon lesquels, l'apoptose viro-induite par le virus rabique se caractérise principalement par une activation de la voie des caspases (8 et 3) et que la caspase 1 est plutôt activée par la souche CVS. La souche CVS étant non apoptotique, ces résultats suggèrent que la caspase 1 n'est certainement pas impliquée dans le phénomène d'apoptose. II se pourrait, au contraire, qu'elle participe à l'inflammation. Le fait que la protéine N-ERA ne soit pas activatrice de caspases apoptotiques démontre ce qui avait été suggéré sur la base de l'analyse des cinétiques (46) c'est à dire que la protéine G et non la N
induitt l'apoptose..
28 Les séquences primaires des glycoprotéines des souches CVS et ERA
montrent que ces deux protéines divergent entre elles par seulement 6 acides aminés. Pourtant ces 6 différences se traduisent par un phénotype très tranché
vis à vis de l'apoptose. On peut se demander pourquoi et comment cette glycoprotéine peut accomplir cette tâche. Nous pourrions pour expliquer le fonctionnement différent des deux protéines, formuler deux hypothèses 1 ) G-ERA contrairement à G-CVS serait clivée par la caspase 8 initiatrice au niveau d'un site potentiel non consensuel de clivage.
2) G-ERA interagirait avec la pro-caspase 8 et provoquerait son activation, alors que la G-CVS serait dépourvue de cette propriété.
- Hvaothèse 1 : G-ERA, contrairement à G-CVS serait clivée par la casaase 8 II a été établi dans deux maladies humaines, maladie de Huntington et mucovisidose, que le dysfonctionnement cellulaire est directement lié à
l'agrégation de protéines dans la cellule. II semblerait, en effet, que la forme mutante de l'huntingtine (maladie de Huntington) ou de la CFTR ( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) entraine la perte de fonctionnalité de la structure qui dégrade les protéines anormales, le protéasome (49). II semble donc que l'accumulation toxique de certaines protéines puisse induire la perte de l'intégralité cellulaire, et provoquer la mort de la cellule. Un mauvais fonctionnement du protéasome pourrait être à l'origine d'autres maladies neurodégénératives comme, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, et l'ataxie Spinocérébrale (50-53). La maladie de Huntington se caractérise par la génération de fragments protéolytiques N-terminaux de l'huntingtine, contenant des répétitions de plusieurs glutamine, qui s'agrègent dans le noyau et le cytoplasme des neurones. L'accumulation de la forme pathologique de l'huntingtine résulterait d'un clivage anormal par les caspases (54).
L'huntingtine serait clivée par la caspase 6 au niveau de la séquence IVLD qui est un site potentiel non consensuel de clivage des caspases du groupe III (55, 56). Nous pourrions faire l'hypothèse que d'une façon similaire à ce qui est observé
avec
montrent que ces deux protéines divergent entre elles par seulement 6 acides aminés. Pourtant ces 6 différences se traduisent par un phénotype très tranché
vis à vis de l'apoptose. On peut se demander pourquoi et comment cette glycoprotéine peut accomplir cette tâche. Nous pourrions pour expliquer le fonctionnement différent des deux protéines, formuler deux hypothèses 1 ) G-ERA contrairement à G-CVS serait clivée par la caspase 8 initiatrice au niveau d'un site potentiel non consensuel de clivage.
2) G-ERA interagirait avec la pro-caspase 8 et provoquerait son activation, alors que la G-CVS serait dépourvue de cette propriété.
- Hvaothèse 1 : G-ERA, contrairement à G-CVS serait clivée par la casaase 8 II a été établi dans deux maladies humaines, maladie de Huntington et mucovisidose, que le dysfonctionnement cellulaire est directement lié à
l'agrégation de protéines dans la cellule. II semblerait, en effet, que la forme mutante de l'huntingtine (maladie de Huntington) ou de la CFTR ( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) entraine la perte de fonctionnalité de la structure qui dégrade les protéines anormales, le protéasome (49). II semble donc que l'accumulation toxique de certaines protéines puisse induire la perte de l'intégralité cellulaire, et provoquer la mort de la cellule. Un mauvais fonctionnement du protéasome pourrait être à l'origine d'autres maladies neurodégénératives comme, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, et l'ataxie Spinocérébrale (50-53). La maladie de Huntington se caractérise par la génération de fragments protéolytiques N-terminaux de l'huntingtine, contenant des répétitions de plusieurs glutamine, qui s'agrègent dans le noyau et le cytoplasme des neurones. L'accumulation de la forme pathologique de l'huntingtine résulterait d'un clivage anormal par les caspases (54).
L'huntingtine serait clivée par la caspase 6 au niveau de la séquence IVLD qui est un site potentiel non consensuel de clivage des caspases du groupe III (55, 56). Nous pourrions faire l'hypothèse que d'une façon similaire à ce qui est observé
avec
29 l'huntingtine, la G-ERA serait clivée par les caspases ce qui induirait une agrégation anormale de la protéine entrainant une altération de la fonction du protéasome et la mort de la cellule. Au contraire, la G-CVS ne serait pas clivée par les caspases, ne s'accumulerait pas de façon anormale et n'induirait donc pas l'apoptose. Cette hypothèse peut être avancée puisque l'analyse des séquences protéiques des glyprotéines des souches CVS et ERA met en évidence l'existence d'un site potentiel non consensuel de clivage par les caspases du groupe III. L'analyse précise montre que pour ERA, le site IVLD
est en fait muté en 481VED51, alors que pour CVS il est muté en 48WED51. II
conviendrait donc maintenant d'établir que le site IVED est fonctionnel alors que le site WED ne l'est pas, en étudiant si ces glycoprotéines sont clivées par des caspases du groupe III (les caspases iniatrices). Par la suite , il serait intéressant d'identifier 2) la nature de la caspase qui serait responsable du clivage 3) si les produits de clivage s'accumulent dans le cytoplasme (et éventuellement dans le noyau), 4) et si dans ce cas la fonctionnalité du protéasome est altérée.
Cette hypothèse, si elle se vérifiait, expliquerait pourquoi l'on observe un engorgement du cytoplasme par les antigènes viraux dans le cas de l'infection des cellules Jurkat par la souche ERA et pas dans le cas de CVS.
- Hyaothèse 2 : G-ERA, interagirait avec la pro-caspase 8 et provoguerait son activation.
Nos expériences ont montré que les cellules qui expriment la protéine G
de la souche ERA activent la caspase 8. Lors de la voie d'activation de la caspase 8 initiatrice par transduction du signal via l'interaction Fas-UFas, il y a recrutement du zymogène (pro-caspase8) au niveau du DISC par l'interaction du domaine effecteur de mort DED de FADD avec les DED de la procaspase 8. Ceci conduit à l'activation protéolytique de la pro-caspase 8 et au relarguage de la caspase 8 activée dans le cytoplasme (57). L'apoptose rabique ne peut pas être induite par la seule incubation des cellules avec du virus non réplicatif. Ce qui permet d'exclure que le virus de la rage induise l'apoptose par interaction avec des récepteurs membranaires, comme Fas. II est vraisemblable que Fas ne soit pas impliqué dans l'apoptose rabique puisque l'addition d'anticorps anti-Fas n'augmente pas l'apoptose (58). II faut donc penser que c'est la synthèse intracellulaire de la protéine G de la souche ERA qui provoque directement ou indirectement cette activation de la caspase 8. II est intéressant de noter qu'entre 5 les acides aminés 254 et 417 de la protéine G, on trouve une séquence qui présente une homologie avec les deux DED (A et B) de la procaspase 8.
Néanmoins, cette séquence est conservée entre les souches CVS et ERA, il est donc vraisemblable que s'il y a une différence fonctionnelle, entre les glycoprotéines ERA et CVS, cela ne se passe pas au niveau des séquences 10 primaires. Les prédictions des structures secondaires de ces 2 protéines effectuées avec le logiciel peptidestructure de GCG ( Genetic Computer Group, Université du Wisconsin, USA ) montrent que les mutations, présentes de part et d'autre de cette séquence, provoquent des repliements différents de la protéine G. On peut donc émettre l'hypothèse que ceci pourrait éventuellement conduire à
15 une exposition de cette séquence d'homologie avec les DED pour la souche ERA
à la surface des trimères de G et au contraire à son masquage pour CVS. II a été
démontré qu'en l'absence de Fas-UFas et FADD, la procaspase 8 pouvait être activée par une activité autoprotéolytique médiée par l'interaction de molécules de procaspases 8 entre elles, suite à l'interaction de leurs DED (59, 60). II
20 pourrait être envisagé que lors de sa synthèse et de sa maturation post-traductionelle la glycoprotéine de la souche ERA puisse jouer un rôle de catalyseur dans l'oligomérisation des molécules de pro-caspase 8. La mise en évidence d'une interaction entre la protéine G-ERA et la pro-caspase 8 au niveau de leur DED pourrait être envisagée en 1 ) réalisant des expériences de co-25 immunoprécipitation, en utilisant un anticorps anti-caspase 8, par exemple l'anticorps monoclonal Ab-3 (Oncogene) réagissant avec la pro-caspase 8. On s'attendrait dans le cas, où notre hypothèse est vérifiée, à co-immunoprécipiter la protéine G-ERA et pas la protéine G-CVS. Ce résultat serait vérifié en réalisant l'immunoprécipitation réciproque en utilisant un anticorps anti-G pour voir s'il y a
est en fait muté en 481VED51, alors que pour CVS il est muté en 48WED51. II
conviendrait donc maintenant d'établir que le site IVED est fonctionnel alors que le site WED ne l'est pas, en étudiant si ces glycoprotéines sont clivées par des caspases du groupe III (les caspases iniatrices). Par la suite , il serait intéressant d'identifier 2) la nature de la caspase qui serait responsable du clivage 3) si les produits de clivage s'accumulent dans le cytoplasme (et éventuellement dans le noyau), 4) et si dans ce cas la fonctionnalité du protéasome est altérée.
Cette hypothèse, si elle se vérifiait, expliquerait pourquoi l'on observe un engorgement du cytoplasme par les antigènes viraux dans le cas de l'infection des cellules Jurkat par la souche ERA et pas dans le cas de CVS.
- Hyaothèse 2 : G-ERA, interagirait avec la pro-caspase 8 et provoguerait son activation.
Nos expériences ont montré que les cellules qui expriment la protéine G
de la souche ERA activent la caspase 8. Lors de la voie d'activation de la caspase 8 initiatrice par transduction du signal via l'interaction Fas-UFas, il y a recrutement du zymogène (pro-caspase8) au niveau du DISC par l'interaction du domaine effecteur de mort DED de FADD avec les DED de la procaspase 8. Ceci conduit à l'activation protéolytique de la pro-caspase 8 et au relarguage de la caspase 8 activée dans le cytoplasme (57). L'apoptose rabique ne peut pas être induite par la seule incubation des cellules avec du virus non réplicatif. Ce qui permet d'exclure que le virus de la rage induise l'apoptose par interaction avec des récepteurs membranaires, comme Fas. II est vraisemblable que Fas ne soit pas impliqué dans l'apoptose rabique puisque l'addition d'anticorps anti-Fas n'augmente pas l'apoptose (58). II faut donc penser que c'est la synthèse intracellulaire de la protéine G de la souche ERA qui provoque directement ou indirectement cette activation de la caspase 8. II est intéressant de noter qu'entre 5 les acides aminés 254 et 417 de la protéine G, on trouve une séquence qui présente une homologie avec les deux DED (A et B) de la procaspase 8.
Néanmoins, cette séquence est conservée entre les souches CVS et ERA, il est donc vraisemblable que s'il y a une différence fonctionnelle, entre les glycoprotéines ERA et CVS, cela ne se passe pas au niveau des séquences 10 primaires. Les prédictions des structures secondaires de ces 2 protéines effectuées avec le logiciel peptidestructure de GCG ( Genetic Computer Group, Université du Wisconsin, USA ) montrent que les mutations, présentes de part et d'autre de cette séquence, provoquent des repliements différents de la protéine G. On peut donc émettre l'hypothèse que ceci pourrait éventuellement conduire à
15 une exposition de cette séquence d'homologie avec les DED pour la souche ERA
à la surface des trimères de G et au contraire à son masquage pour CVS. II a été
démontré qu'en l'absence de Fas-UFas et FADD, la procaspase 8 pouvait être activée par une activité autoprotéolytique médiée par l'interaction de molécules de procaspases 8 entre elles, suite à l'interaction de leurs DED (59, 60). II
20 pourrait être envisagé que lors de sa synthèse et de sa maturation post-traductionelle la glycoprotéine de la souche ERA puisse jouer un rôle de catalyseur dans l'oligomérisation des molécules de pro-caspase 8. La mise en évidence d'une interaction entre la protéine G-ERA et la pro-caspase 8 au niveau de leur DED pourrait être envisagée en 1 ) réalisant des expériences de co-25 immunoprécipitation, en utilisant un anticorps anti-caspase 8, par exemple l'anticorps monoclonal Ab-3 (Oncogene) réagissant avec la pro-caspase 8. On s'attendrait dans le cas, où notre hypothèse est vérifiée, à co-immunoprécipiter la protéine G-ERA et pas la protéine G-CVS. Ce résultat serait vérifié en réalisant l'immunoprécipitation réciproque en utilisant un anticorps anti-G pour voir s'il y a
30 co-immunoprécipitation de la pro-caspase 8 avec la protéine G-ERA et pas avec G-CVS. Cette hypothèse fournirait une explication sur le phénomène d'activation
31 d'une des caspases initiatrices majeures : la caspase 8 qui pourrait activer en cascade les autres caspases.
La deuxième hypothèse n'est pas antinomique de la première puisqu'elle expliquerait comment les premières molécules de glycoprotéines peuvent être clivées par des caspases. En effet, la glycoprotéine G-ERA pouvant être responsable de l'oligomérisation de la pro-caspase 8, qui par action autoprotéolytique devient active, pourrait être ensuite éventuellement clivée par la caspase 8 au niveau du site potentiel non consensuel de clivage.
Exemple 2: Mise en évidence de la suaériorité de la présentation d'antis~ènes sous formes de corps apoptotiaues par rapport à celle de cellules infectées intactes en terme de réponse en anticorps Lors de l'infection d'une cellule par un virus, la physiologie cellulaire est perturbée et ces modifications peuvent conduire à l'apoptose. La désagrégation de l'intégrité de la cellule infectée conduit à la génération de corps apoptotiques qui contiennent, en plus de morceaux de noyaux et de cytoplasme, des antigènes viraux. De nombreuses évidences expérimentales attestent maintenant que ces structures sont des immunopotentiateurs extrêmement efficaces lorsqu'ils sont pris en charge par certaines cellules présentatrices d'antigènes CPA (Cellules dendritiques) et qu'il y a présentation des antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I . Aussi, est-il pertinent d'envisager que la possibilité
d'induire de façon spécifique et contrôlée l'apoptose puisse être utilisé pour augmenter le pouvoir immunostimulateur de vaccins générés par génie génétique. II serait donc intéressant et innovateur de caractériser une protéine virale pro-apoptotique qui stimulerait la réponse des cellules B du système immunitaire. Ceci serait particulièrement important pour les vaccins dérivés de vecteurs recombinants ou de molécules d'acide nucléique.
La Demanderesse montre que les corps apoptotiques, générés lors de l'apoptose des cellules lymphoblastoides infectées par le virus rabique, contiennent au moins deux des protéines virales : la glycoprotéine G et la nucléoprotéine N. Expérimentalement, la Demanderesse a établi dans un modèle murin que les animaux vaccinés avec des corps apoptotiques produisent
La deuxième hypothèse n'est pas antinomique de la première puisqu'elle expliquerait comment les premières molécules de glycoprotéines peuvent être clivées par des caspases. En effet, la glycoprotéine G-ERA pouvant être responsable de l'oligomérisation de la pro-caspase 8, qui par action autoprotéolytique devient active, pourrait être ensuite éventuellement clivée par la caspase 8 au niveau du site potentiel non consensuel de clivage.
Exemple 2: Mise en évidence de la suaériorité de la présentation d'antis~ènes sous formes de corps apoptotiaues par rapport à celle de cellules infectées intactes en terme de réponse en anticorps Lors de l'infection d'une cellule par un virus, la physiologie cellulaire est perturbée et ces modifications peuvent conduire à l'apoptose. La désagrégation de l'intégrité de la cellule infectée conduit à la génération de corps apoptotiques qui contiennent, en plus de morceaux de noyaux et de cytoplasme, des antigènes viraux. De nombreuses évidences expérimentales attestent maintenant que ces structures sont des immunopotentiateurs extrêmement efficaces lorsqu'ils sont pris en charge par certaines cellules présentatrices d'antigènes CPA (Cellules dendritiques) et qu'il y a présentation des antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I . Aussi, est-il pertinent d'envisager que la possibilité
d'induire de façon spécifique et contrôlée l'apoptose puisse être utilisé pour augmenter le pouvoir immunostimulateur de vaccins générés par génie génétique. II serait donc intéressant et innovateur de caractériser une protéine virale pro-apoptotique qui stimulerait la réponse des cellules B du système immunitaire. Ceci serait particulièrement important pour les vaccins dérivés de vecteurs recombinants ou de molécules d'acide nucléique.
La Demanderesse montre que les corps apoptotiques, générés lors de l'apoptose des cellules lymphoblastoides infectées par le virus rabique, contiennent au moins deux des protéines virales : la glycoprotéine G et la nucléoprotéine N. Expérimentalement, la Demanderesse a établi dans un modèle murin que les animaux vaccinés avec des corps apoptotiques produisent
32 beaucoup plus d'anticorps que les animaux injectés avec des cellules infectées entières. La Demanderesse donne donc un avantage innovateur de la stimulation des cellules B. Ces résultats suggèrent que les corps apoptiques pris en charge par les CPA peuvent être une source importante d'antigènes efficacement présentée au système immunitaire. Ils suggèrent aussi que l'inclusion d'une protéine pro-apoptotique dans un vaccin généré par génie génétique pourrait être un facteur déterminant d'amélioration de ces vaccins. L'adjonction de la protéine G ERA qui est dérivée d'une souche vaccinale communément utilisé en médecine vétérinaire est une garantie de satisfaction aux contraintes de biosécurité.
Résultats Pouvoir immunogiène des corps apoptotiaues Des cellules Wehi ont été infectées par la souche ERA du virus de la rage à une multiplicité d'infection de trois ce qui permet d'obtenir 80% de cellules infectées après 48h de culture. Deux jours après infection, l'apoptose viro induite de ces cellules reste minoritaire bien que les antigènes viraux soit déjà en cours de synthèse. Quarante-huit heures après infection, l'apoptose est alors induite par un traitement à la céramide, qui génère la formation de corps apoptotiques.
En parallèle des cellules non infectées sont traitées de la même manière. Les contrôles de l'effet potentiateur des corps apoptotiques consistent en des cellules infectées et non infectes non traitées à la céramide. Pour annuler l'effet vaccinant du virus vivant, les préparations sont inactivées aux UV (inactivation de100%
du pouvoir infectieux du virus). La présence des corps apoptotiques a été
vérifiée par immunohistochimie et mesurée par ELISA (Cell death detection Elisa kit) qui détecte les nucléosomes. La quantité d'antigènes viraux injectés a été mesurée par quantification ELISA de la protéine N (Montano-Hirose et al, 1995, Res.
Virol., 146, 217-224). La dose efficace par injection intrapéritonéale est de 200 à
400 ng par souris.
Résultats Pouvoir immunogiène des corps apoptotiaues Des cellules Wehi ont été infectées par la souche ERA du virus de la rage à une multiplicité d'infection de trois ce qui permet d'obtenir 80% de cellules infectées après 48h de culture. Deux jours après infection, l'apoptose viro induite de ces cellules reste minoritaire bien que les antigènes viraux soit déjà en cours de synthèse. Quarante-huit heures après infection, l'apoptose est alors induite par un traitement à la céramide, qui génère la formation de corps apoptotiques.
En parallèle des cellules non infectées sont traitées de la même manière. Les contrôles de l'effet potentiateur des corps apoptotiques consistent en des cellules infectées et non infectes non traitées à la céramide. Pour annuler l'effet vaccinant du virus vivant, les préparations sont inactivées aux UV (inactivation de100%
du pouvoir infectieux du virus). La présence des corps apoptotiques a été
vérifiée par immunohistochimie et mesurée par ELISA (Cell death detection Elisa kit) qui détecte les nucléosomes. La quantité d'antigènes viraux injectés a été mesurée par quantification ELISA de la protéine N (Montano-Hirose et al, 1995, Res.
Virol., 146, 217-224). La dose efficace par injection intrapéritonéale est de 200 à
400 ng par souris.
33 Quatre groupes de 8 souris BALB/c syngéniques des cellules Wehi ont été
injectées avec un même volume des quatre préparations suivantes ~ Wehi infectées intactes ~ Wehi non infectées intactes ~ Wehi infectées fragmentées en corps apoptotiques ~ Wehi non infectées fragmentées en corps apoptotiques L'effet rappel a été mesuré après injection au jour 21 de vaccin entier antirabique (souche PM, production sur cellule VERO). Les titres en anticorps spécifiques du virus de la rage présents dans les sérums sont mesurés par test immuno-enzymatiques. Les résultats sont exprimés de la façon suivante : 1) Titre pour les cellules={Titre obtenu pour les cellules infectées intactes - Titre obtenu pour les cellules non infectées intactes}, 2) Titre pour les corps apoptotiques={Titre obtenu pour les cellules infectées fragmentées en corps apoptotiques - Titre obtenu pour les cellules non infectées fragmentées en corps apoptotiques}.
Les résultats de ces expériences sont représentés sur les Figures 8 et 9.
Comme on le voit, l'injection de corps apoptotiques conduit à une immunostimulation de la réponse B. De plus l'effet de la vaccination de rappel (hétérologue pour les cellules ou les corps apoptotiques) indique une très forte immunopotentiation chez les souris ayant reçu une injection primaire de corps apoptotiques.
Conclusion Nous avions montré que les corps apoptotiques, générés lors de l'apoptose des cellules lymphoblastoides infectées par le virus rabique (souche ERA), contiennent au moins deux des protéines virales : la glycoprotéine G et la nucléoprotéine N. Expérimentalement nous avons établi ici, dans un modèle murin, que les animaux vaccinés avec des corps apoptotiques produisent plus d'anticorps que les animaux injectés avec des cellules infectées entières.
Nous
injectées avec un même volume des quatre préparations suivantes ~ Wehi infectées intactes ~ Wehi non infectées intactes ~ Wehi infectées fragmentées en corps apoptotiques ~ Wehi non infectées fragmentées en corps apoptotiques L'effet rappel a été mesuré après injection au jour 21 de vaccin entier antirabique (souche PM, production sur cellule VERO). Les titres en anticorps spécifiques du virus de la rage présents dans les sérums sont mesurés par test immuno-enzymatiques. Les résultats sont exprimés de la façon suivante : 1) Titre pour les cellules={Titre obtenu pour les cellules infectées intactes - Titre obtenu pour les cellules non infectées intactes}, 2) Titre pour les corps apoptotiques={Titre obtenu pour les cellules infectées fragmentées en corps apoptotiques - Titre obtenu pour les cellules non infectées fragmentées en corps apoptotiques}.
Les résultats de ces expériences sont représentés sur les Figures 8 et 9.
Comme on le voit, l'injection de corps apoptotiques conduit à une immunostimulation de la réponse B. De plus l'effet de la vaccination de rappel (hétérologue pour les cellules ou les corps apoptotiques) indique une très forte immunopotentiation chez les souris ayant reçu une injection primaire de corps apoptotiques.
Conclusion Nous avions montré que les corps apoptotiques, générés lors de l'apoptose des cellules lymphoblastoides infectées par le virus rabique (souche ERA), contiennent au moins deux des protéines virales : la glycoprotéine G et la nucléoprotéine N. Expérimentalement nous avons établi ici, dans un modèle murin, que les animaux vaccinés avec des corps apoptotiques produisent plus d'anticorps que les animaux injectés avec des cellules infectées entières.
Nous
34 apportons aussi une évidence innovatrice de la stimulation des cellules B par les corps apoptotiques.
Ces résultats suggèrent que les corps apoptotiques pris en charge par les CPA peuvent être une source importante d'antigènes efficacement présentés au système immunitaire. Ils suggèrent aussi que l'inclusion d'une protéine pro-apoptotique dans un vaccin généré par génie génétique pourrait être un facteur déterminant d'amélioration de ces vaccins qui sont le plus souvent de faibles immunogènes (vecteurs recombinants, ADN/ARN vaccin).
Exemale 3: Induction de l'aaoatose des cellules NT-2-N aar la souche ERA.
Les cellules de carcinome embryonnaire (CE) sont les « cellules souches » (CS) qui existent dans certaines tumeurs de la lignée germinale, les tératocarcinomes. Comme les cellules CS, les cellules CE humaines prolifèrent extensivement in vitro et dans les tératomes formés in vivo après injection chez des animaux immunocompromis. Cependant, contrairement aux cellules CS, les cellules CE humaines sont aneuploïdes et ne se différencient qu'en certains types cellulaires bien précis (Stem Cells : Scientific progress and future research directions, June 2001, NIH report, http://www.nih.~ov/news/stemcell/scireport.htm). Ainsi les cellules N Tera 2D1 peuvent se différencier en cultures pures de neurones humains post-mitotiques (les NT2-N) après induction de la différenciation des N Tera 2D1 par l'acide rétinoique all-trans, puis traitement par des inhibiteurs de mitose et purification par trypsination ménagée (Andrews, P.W., 1998, APMIS, 106, 158-167). Les cellules NT2-N possèdent tous les marqueurs spécifiques de neurones humains différenciés (Guillemain, I., The Journal Of Comparative Neurology, 2000, 422, 380-395). Elles peuvent établir in vitro des contacts synaptiques entre elles et des contacts fonctionnels avec des astrocytes en co-culture. Ces cellules sont à l'heure actuelle le meilleur des modèles car elles offrent la possibilité de cultiver en grande quantité des neurones humains post-mitotiques présentant un état physiologique homogène. Ces cellules ont été utilisées pour des essais thérapeutiques cliniques de phase II de reconstitution de cellules nerveuses (Thompson, T.P., Neurosurgery, 1999, 45, 4, 741-752). La culture et l'obtention de NT2-N sont couramment maîtrisées dans l'UP de Neuroimmunologie virale depuis maintenant 1 an.
Des cultures de NT2-N ont été mises en culture sur des chambres 5 individuelles de type labteck traitées par de la polylysine et de la laminine, traitement qui permet leur adhésion. Après 48 h de culture, les corps cellulaires expriment et l'antigène Neurofilament 200 (Nf) des axones. Sur les cellules non infectées, la présence de protéines de neurofilaments a été détectée par un anticorps spécifique anti-Nf (Anti Neurofilament 200, sigma, USA, no. N4142).
10 Ces cellules ont été soit infectées par le virus rabique souche ERA (pro-apoptotique) à une multiplicité d'infection de 5, soit non infectées. 24 h post-infection les cellules ont été fixées par de l'acétone 80% (30 mn à 4 °C) suivi d'une incubation de 20 mn dans de l'éthanol pur.
L'intégrité du noyau cellulaire ou sa fragmentation pris comme marqueur 15 d'apoptose, a été mis en évidence par une coloration au Hoechst 33342 à 1 Ng~NI.
La présence des antigènes viraux dans les cellules infectées a été réalisé
grâce à un anticorps anti-nucléocapside rabique (Anti Nucléocapside rabique, Sanofi Diagnostic Pasteur, no. 72114).
20 Les résultats présentés dans la figure 13, montrent que les cellules NT2-N
sont marquées spécifiquement par l'anticorps anti-Nf attestant ainsi leur caractère de neurones. Les cellules infectées par le virus ERA présentent une fluorescence ponctiforme caractéristique de la nucléocapside rabique. Les cellules infectées présentent une désagrégation de la structure nucléaire, 25 visualisée par la coloration au Hoechst 33342, qui est caractéristique du processus apoptotique.
Dans un deuxième temps, les cellules NT2-N ont été infectées soit avec la souche ERA, soit avec la souche CVS (non apoptogène en cellules Jurkat) ou bien non infectées et 24 h post infection la quantité de neurones en apoptose a 30 été évaluée après coloration au Hoechst. Les résultats sont représentés sur la figure 16. On voit que la souche ERA génère une apoptose neuronale (18,55%) qui est significativement plus importante que le témoin de cellules non infectées (2,8%) ou les cellules infectées par CVS (4%).
La souche ERA (non pathogène) du virus rabique, à la différence de la souche CVS (pathogène), est donc capable de déclencher une apoptose neuronale comme elle le fait dans les cellules de la lignées lymphoblastique.
Bien que la présente invention ait été décrite par rapport aux réalisations concrètes et privilégiées, il apparaîtra toutefois évident aux personnes versées dans l'art ou la science en cause qu'il est possible d'introduire un certain nombre de variation et modifications sans déroger à la portée de l'invention décrite dans ce document.
BIBLIOGRAPHIE
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Ces résultats suggèrent que les corps apoptotiques pris en charge par les CPA peuvent être une source importante d'antigènes efficacement présentés au système immunitaire. Ils suggèrent aussi que l'inclusion d'une protéine pro-apoptotique dans un vaccin généré par génie génétique pourrait être un facteur déterminant d'amélioration de ces vaccins qui sont le plus souvent de faibles immunogènes (vecteurs recombinants, ADN/ARN vaccin).
Exemale 3: Induction de l'aaoatose des cellules NT-2-N aar la souche ERA.
Les cellules de carcinome embryonnaire (CE) sont les « cellules souches » (CS) qui existent dans certaines tumeurs de la lignée germinale, les tératocarcinomes. Comme les cellules CS, les cellules CE humaines prolifèrent extensivement in vitro et dans les tératomes formés in vivo après injection chez des animaux immunocompromis. Cependant, contrairement aux cellules CS, les cellules CE humaines sont aneuploïdes et ne se différencient qu'en certains types cellulaires bien précis (Stem Cells : Scientific progress and future research directions, June 2001, NIH report, http://www.nih.~ov/news/stemcell/scireport.htm). Ainsi les cellules N Tera 2D1 peuvent se différencier en cultures pures de neurones humains post-mitotiques (les NT2-N) après induction de la différenciation des N Tera 2D1 par l'acide rétinoique all-trans, puis traitement par des inhibiteurs de mitose et purification par trypsination ménagée (Andrews, P.W., 1998, APMIS, 106, 158-167). Les cellules NT2-N possèdent tous les marqueurs spécifiques de neurones humains différenciés (Guillemain, I., The Journal Of Comparative Neurology, 2000, 422, 380-395). Elles peuvent établir in vitro des contacts synaptiques entre elles et des contacts fonctionnels avec des astrocytes en co-culture. Ces cellules sont à l'heure actuelle le meilleur des modèles car elles offrent la possibilité de cultiver en grande quantité des neurones humains post-mitotiques présentant un état physiologique homogène. Ces cellules ont été utilisées pour des essais thérapeutiques cliniques de phase II de reconstitution de cellules nerveuses (Thompson, T.P., Neurosurgery, 1999, 45, 4, 741-752). La culture et l'obtention de NT2-N sont couramment maîtrisées dans l'UP de Neuroimmunologie virale depuis maintenant 1 an.
Des cultures de NT2-N ont été mises en culture sur des chambres 5 individuelles de type labteck traitées par de la polylysine et de la laminine, traitement qui permet leur adhésion. Après 48 h de culture, les corps cellulaires expriment et l'antigène Neurofilament 200 (Nf) des axones. Sur les cellules non infectées, la présence de protéines de neurofilaments a été détectée par un anticorps spécifique anti-Nf (Anti Neurofilament 200, sigma, USA, no. N4142).
10 Ces cellules ont été soit infectées par le virus rabique souche ERA (pro-apoptotique) à une multiplicité d'infection de 5, soit non infectées. 24 h post-infection les cellules ont été fixées par de l'acétone 80% (30 mn à 4 °C) suivi d'une incubation de 20 mn dans de l'éthanol pur.
L'intégrité du noyau cellulaire ou sa fragmentation pris comme marqueur 15 d'apoptose, a été mis en évidence par une coloration au Hoechst 33342 à 1 Ng~NI.
La présence des antigènes viraux dans les cellules infectées a été réalisé
grâce à un anticorps anti-nucléocapside rabique (Anti Nucléocapside rabique, Sanofi Diagnostic Pasteur, no. 72114).
20 Les résultats présentés dans la figure 13, montrent que les cellules NT2-N
sont marquées spécifiquement par l'anticorps anti-Nf attestant ainsi leur caractère de neurones. Les cellules infectées par le virus ERA présentent une fluorescence ponctiforme caractéristique de la nucléocapside rabique. Les cellules infectées présentent une désagrégation de la structure nucléaire, 25 visualisée par la coloration au Hoechst 33342, qui est caractéristique du processus apoptotique.
Dans un deuxième temps, les cellules NT2-N ont été infectées soit avec la souche ERA, soit avec la souche CVS (non apoptogène en cellules Jurkat) ou bien non infectées et 24 h post infection la quantité de neurones en apoptose a 30 été évaluée après coloration au Hoechst. Les résultats sont représentés sur la figure 16. On voit que la souche ERA génère une apoptose neuronale (18,55%) qui est significativement plus importante que le témoin de cellules non infectées (2,8%) ou les cellules infectées par CVS (4%).
La souche ERA (non pathogène) du virus rabique, à la différence de la souche CVS (pathogène), est donc capable de déclencher une apoptose neuronale comme elle le fait dans les cellules de la lignées lymphoblastique.
Bien que la présente invention ait été décrite par rapport aux réalisations concrètes et privilégiées, il apparaîtra toutefois évident aux personnes versées dans l'art ou la science en cause qu'il est possible d'introduire un certain nombre de variation et modifications sans déroger à la portée de l'invention décrite dans ce document.
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J., Zhang, T'., Rasper, D., Roy, S., Thornberry, N., Pinsky, L., Kakizuka, A., Ross, C. A., Nicholson, D.
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G0. Muzio, M., Stockwell, B. R., Stennïcke, Ii. R., Salvesen, G. S. & Dixit, V. M. (1998) Jl3iol Client 273, 2926-30. ' ABRÉVIATIONS
ADN Acide Dsoxyribonuclique AIF Apoptosis IlJdrrCirrg ICICIor' Apaf I Apoptotic protease uctivatig factor I
ARN Acide Ribonuclique BIIK-21 l3ah>> Har.ster- Kidrre3~-2l (rein de hamster nouveau-n) BSR Fibroblaste de Rein de Hamster CAV Chicke Aenvia Lrrrs CMV Cytorngal~Vinas CVS (:hcrlleryre l~rnr.s Starrdcrr'd (Souche ('.VS du virus de la rage) DED Deatlt F ffector 1)onrcri DISC Deatlt h rdrrcig Sigrrcrlig (,'onrplex Dox Doxycycline ERA Fvely-Rokiticki-Abelselh (Souche vaccinale du virus de la rage) FADD Fcrs-cr.ssocicrted deatlr d011JCir IJr'Otellr FI'I'C F'lrrorescei i.sothiocyaate (Isothiocyanate de Fluorscine) Flury LEP Flrny Lcnv hgg PCTSSGrge (Faible passage chez l'embryon de poulet) Flury IiEP Ilrny Iligh l:gg l'as.sage (Haut passage chez l'embryon de poulet) ICAM-I Inter-C.'elhrlar Adhe.Sio molecule (Molcule d'adhsion inter-cellulaire) IFN-'y Interfron-y IL Inter-leukine MCP-1 Monocyte ('henrotactic l'rotei-I
MomuLV lhloloey Marine Lerrkemia Grns (Virus Moloney de la leucmie nrurine) PBS l'hocphcrte Rrrffer Saline (Solution 'fanrpone au phosphate) PE I'hycorythr~ne PFA Paraformaldhyde PM l'ittma-ll~foore PV l'Cr.Sterll'l)l'oChICtiolr 6'irrr.s (Virus de production Pasteur) P'fP Pore Transitoire de permabilit RE Rticulurn Endoplasmique RT Reverse 7rascrihtcrse ('franscriptase inverse) PCR Polymerase (.'haie Reactio (raction de Polymrisation en Chaine) rtTA Reverse 7i'cuzsactivaterrr 7tracyclie SAD .Street Alabanra Dog SNC Systme Nerveux Central SVF Srum de Veau Foetal TNF-a T rmor Necrosis Firctor (Facteur de Ncrose Tumorale) TRE T trac~~clie-IZe.spo.cive Elerem (lment de rponse la ttracycline) VII-~ Virus de l'Innnuno-dficience humaine FL'I'C-VAD-FMK Analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone
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G0. Muzio, M., Stockwell, B. R., Stennïcke, Ii. R., Salvesen, G. S. & Dixit, V. M. (1998) Jl3iol Client 273, 2926-30. ' ABRÉVIATIONS
ADN Acide Dsoxyribonuclique AIF Apoptosis IlJdrrCirrg ICICIor' Apaf I Apoptotic protease uctivatig factor I
ARN Acide Ribonuclique BIIK-21 l3ah>> Har.ster- Kidrre3~-2l (rein de hamster nouveau-n) BSR Fibroblaste de Rein de Hamster CAV Chicke Aenvia Lrrrs CMV Cytorngal~Vinas CVS (:hcrlleryre l~rnr.s Starrdcrr'd (Souche ('.VS du virus de la rage) DED Deatlt F ffector 1)onrcri DISC Deatlt h rdrrcig Sigrrcrlig (,'onrplex Dox Doxycycline ERA Fvely-Rokiticki-Abelselh (Souche vaccinale du virus de la rage) FADD Fcrs-cr.ssocicrted deatlr d011JCir IJr'Otellr FI'I'C F'lrrorescei i.sothiocyaate (Isothiocyanate de Fluorscine) Flury LEP Flrny Lcnv hgg PCTSSGrge (Faible passage chez l'embryon de poulet) Flury IiEP Ilrny Iligh l:gg l'as.sage (Haut passage chez l'embryon de poulet) ICAM-I Inter-C.'elhrlar Adhe.Sio molecule (Molcule d'adhsion inter-cellulaire) IFN-'y Interfron-y IL Inter-leukine MCP-1 Monocyte ('henrotactic l'rotei-I
MomuLV lhloloey Marine Lerrkemia Grns (Virus Moloney de la leucmie nrurine) PBS l'hocphcrte Rrrffer Saline (Solution 'fanrpone au phosphate) PE I'hycorythr~ne PFA Paraformaldhyde PM l'ittma-ll~foore PV l'Cr.Sterll'l)l'oChICtiolr 6'irrr.s (Virus de production Pasteur) P'fP Pore Transitoire de permabilit RE Rticulurn Endoplasmique RT Reverse 7rascrihtcrse ('franscriptase inverse) PCR Polymerase (.'haie Reactio (raction de Polymrisation en Chaine) rtTA Reverse 7i'cuzsactivaterrr 7tracyclie SAD .Street Alabanra Dog SNC Systme Nerveux Central SVF Srum de Veau Foetal TNF-a T rmor Necrosis Firctor (Facteur de Ncrose Tumorale) TRE T trac~~clie-IZe.spo.cive Elerem (lment de rponse la ttracycline) VII-~ Virus de l'Innnuno-dficience humaine FL'I'C-VAD-FMK Analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone
Claims (34)
1- Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il induit la formation de corps apoptotiques capable de stimuler chez un vertébré une réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt.
2- Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la réponse humorale est de type B dépendante.
3- Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il active la voie des caspases.
4- Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il active la caspase-8 initiatrice.
5- Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par:
a) une glycoprotéine G issue d'un virus de la rage, ladite glycoprotéine présentant une séquence comprenant au moins une proline en position 27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 ; et b) un fragment d'au moins 100 acides aminés de la protéine telle que définie en a).
a) une glycoprotéine G issue d'un virus de la rage, ladite glycoprotéine présentant une séquence comprenant au moins une proline en position 27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 ; et b) un fragment d'au moins 100 acides aminés de la protéine telle que définie en a).
6- Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que sa séquence comprend également une thréonine en position 89.
7- Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 2.
8- Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que le virus de la rage est de souche ERA.
9- Polypeptide chimérique, caractérisée en ce qu'il comprend au moins un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 9 associée à une séquence exogène.
10-Polypeptide chimérique selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence exogène est un épitope B et/ou un épitope T.
11-Polynucléotide isolé ou purifié, caractérisée en ce qu'il code pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12-Polynucléotide selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO :1.
13-Oligonucléotide purifié caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO 8.
14-Oligonucléotide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est utilisé
comme sonde ou comme amorce.
comme sonde ou comme amorce.
15-Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il contient une cassette d'expression incluant un polynucléotide tel que défini à la revendication 11.
16-Vecteur recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les virus recombinants et les plasmides recombinants possédant une origine de réplication eucaryote.
17-Vecteur pRevTRE.G.ERA déposé à la C.N.C.M., le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2760.
18-Vecteur pRevTRE.N.ERA déposée à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2761.
19-Vecteur pRev-TRE-G-CVS déposée à la C.N.C.M, le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2758.
20-Vecteur pRev-TRE-N-CVS déposée à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2759.
21-Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide selon la revendication 11 ou 12.
22-Cellule hôte selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est intégré de façon stable ou sous forme épisomale.
23-Cellule hôte selon la revendication 21 ou la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle est d'origine lymphoblastique.
24-Cellule hôte transfectée par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 15 à 20.
25-Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
26-Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle contient des corps apoptotiques capable de stimuler chez un mammifère une réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
27-Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication 26, caractérisée en ce que lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir d'une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25.
28-Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication 27, caractérisée en ce que lesdits corps apoptotiques sont préparés par transfection ou micro-injection d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
29-Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un élément choisi dans le groupe constitué par - un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ;
- un polynucléotide selon la revendication 11 ;
- un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 20 ; et - une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25.
- un polynucléotide selon la revendication 11 ;
- un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 20 ; et - une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25.
30-Méthode d'induction d'une immunité humorale contre un antigène d'intérêt, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration à un mammifère d'une composition immunogène ou vaccinale selon l'une quelconque des revendications 26 à 29.
31-Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à
10, ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 20 ou d'une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25 ou de corps apoptotiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 26 à 28 pour la préparation d'un vaccin ou d'un adjuvant de l'immunité.
10, ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 20 ou d'une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 21 à 25 ou de corps apoptotiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 26 à 28 pour la préparation d'un vaccin ou d'un adjuvant de l'immunité.
32-Utilisation selon la revendication 31, caractérisé en ce que ledit vaccin ou ledit adjuvant de l'immunité induit une réponse humorale contre un antigène d'intérêt chez un vertébré.
33-Utilisation selon la revendication 32, caractérisée en ce que ledit vaccin ou ledit adjuvant de l'immunité est destiné à la prévention ou au traitement des encéphalites virales, de la rage, de cancer, de neuropathologie.
34-Utilisation selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, caractérisée en ce que ledit vaccin ou ledit adjuvant de l'immunité est destiné à un usage humain ou animal.
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| Woodward | A Cup of Lane's Tea at night, keeps her cheerful, well and bright |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Dead |