CA2341775A1 - Inducible expression system - Google Patents

Abstract

The invention concerns an inducible expression system using nucleotide sequences coding for a transcriptional activator of eukaryotic or viral origin and a recombinant adenoviral vector comprising a gene of interest placed under the control of a promoter inducible in trans by said transcriptional activator. The invention also concerns a recombinant adenoviral vector bearing a first expression cassette coding for a transcriptional activator and a second cassette bearing a gene of interest placed under the control of a promoter inducible in trans by said transcriptional activator. The invention further concerns an infectious viral particle, its preparation method, a eukaryotic cell and a pharmaceutical composition comprising such a vector or expression system as well as their use for therapeutic or prophylactic purposes.

Description

SYSTEME D'EXPRESSION INDUCTIBLE
La présente invention concerne un système d'expression inductible mettant en oeuvre les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel et un vecteur adénoviral recombinant comportant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible en trans par ledit activateur transcriptionnel sous une forme activée. Elle a également pour objet un vecteur adénoviral recombinant portant une première cassette d'expression codant pour ledit activateur transcriptionnel et une seconde cassette portant un gène d'intérêt placé
sous le contrôle d'un promoteur inductible en trans par ledit activateur transcriptionnel. L'invention a également pour objet une particule virale infectieuse, une cellule, une composition pharmaceutique comprenant un tel vecteur ou système d'expression ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique, notamment chez l'homme.
La thérapie génique se définit comme le transfert d'information génétique dans une cellule ou un organisme hôte. Le premier protocole appliqué à l'homme a été initié aux Etats Unis en septembre 1990 sur un patient génétiquement immunodéficient en raison d'une mutation affectant le gène codant pour l'Adénine Désaminase (ADA). Il s'agissait de corriger ou remplacer le gène défectueux dont le dysfonctionnement est à l'origine d'une maladie génétique par un gène fonctionnel. Le succès relatif de cette première expérimentation a encouragé
le développement de cette technologie qui a été depuis étendue au traitement d'autres maladies aussi bien génétiques qu'acquises (cancers, maladies infectieuses comme le SII3A...) dans le but de délivrer in situ des gènes thérapeutiques améliorant la pathologie. La plupart des stratégies utilisent des vecteurs pour véhiculer le gène thérapeutique vers sa cible cellulaire. De nombreux vecteurs tant viraux que synthétiques ont été développés au cours de ces dernières années et ont fait l'objet INDUCTIBLE EXPRESSION SYSTEM
The present invention relates to an inducible expression system using implementing the nucleotide sequences coding for an activator transcriptional and a recombinant adenoviral vector comprising a gene of interest placed under the control of a promoter inducible in trans by said activator transcriptional in an activated form. It also relates to an adenoviral vector recombinant carrying a first expression cassette coding for said transcriptional activator and a second cassette carrying a gene of interest square under the control of a promoter inducible in trans by said activator transcriptional. The invention also relates to a viral particle infectious, a cell, a pharmaceutical composition comprising such a vector or expression system and their use for purposes therapeutic or prophylactics. The invention is of particular interest for prospects for gene therapy, especially in humans.
Gene therapy is defined as the transfer of genetic information in a host cell or organism. The first protocol applied to humans was initiated in the United States in September 1990 on a genetically treated patient immunodeficient due to a mutation affecting the gene encoding adenine Deaminase (ADA). This involved correcting or replacing the defective gene whose the dysfunction is at the origin of a genetic disease by a gene functional. The relative success of this first experiment encouraged the development of this technology which has since been extended to treatment others both genetic and acquired diseases (cancers, infectious diseases as SII3A ...) in order to deliver therapeutic genes in situ improving the pathology. Most strategies use vectors to convey the uncomfortable therapeutic towards its cellular target. Many vectors, both viral and synthetics have been developed in recent years and have made the object

-2-de nombreuses publications accessibles à l'homme du métier.
L'intérêt des adénovirus à titre de vecteurs de thérapie génique a déjà été
évoqué dans de nombreux documents de l'art antérieur. Ils infectent de nombreux types cellulaires, aussi bien des cellules en division que quiescentes, sont non S intégratifs et peu pathogènes. En outre, ils possédent un tropisme naturel pour les voies respiratoires. Ces propriétés particulières font des adénovirus des vecteurs de choix pour de nombreuses applications thérapeutiques et même vaccinales. A
titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 kb qui porte une trentaine de gènes intervenant dans le cycle viral. Les gènes précoces (El à E4 ; E pour early en anglais} sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome. Les régions E1, E2 et E4 sont essentielles à
la réplication virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l'est pas. Les gènes tardifs (I,1 à LS ; L pour late signifiant tardif en anglais) codent majoritairement pour les protéines de structure et recouvrent en partie les unités de transcription précoces.
Ils sont pour la plupart transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP
(pour Major Late Promoter en anglais). En outre, le génome adénoviral porte à ses extrémités des régions agissant en cis essentielles à l'encapsidation constituées de séquences terminales inversées (ITR) situées aux extrémités 5' et 3' et d'une région d'encapsidation qui suit l'ITR 5'.
Les vecteurs adénoviraux actuellement utilisés dans les protocoles de thérapie génique sont dépourvus de la majeure partie de la région E1 afin d'éviter leur dissémination dans l'environnement et l'organisme hôte. Des délétions supplémentaires dans la région E3 permettent d'accroître les capacités de clonage.
Les gènes d'intérêt sont introduits dans (ADN viral à la place de Tune ou (autre région délétée. Cependant, Yimmunogénécité potentielle des protéines virales encore exprimées peut dans certaines applications particulières s'opposer à la persistance des cellules transduites et à l'expression stable du transgène.
Ces inconvénients ont justifié ia construction de vecteurs de nouvelles générations qui -2-numerous publications accessible to those skilled in the art.
The interest of adenoviruses as gene therapy vectors has already been mentioned in many documents of the prior art. They infect with numerous cell types, both dividing and quiescent, are no Integrative and not very pathogenic. In addition, they have a natural tropism for the respiratory tracts. These particular properties make adenoviruses vectors of choice for many therapeutic and even vaccine applications. AT
As an indication, their genome consists of a linear DNA molecule and double strand of around 36 kb which carries around thirty genes involved in the viral cycle. The early genes (E1 to E4; E for early in English} are divided into 4 regions scattered throughout the genome. The regions E1, E2 and E4 are essential to viral replication while the E3 region involved in the modulation of the anti-adenovirus immune response in the host is not. The genes late (I, 1 at LS; L for late meaning late in English) mainly code for the structural proteins and partially cover the transcription units early.
They are mostly transcribed from the late major promoter MLP
(for Major Late Promoter in English). In addition, the adenoviral genome leads to its ends of cis-acting regions essential for packaging made up of reverse terminal sequences (ITRs) located at the 5 'and 3' ends and a region packaging which follows ITR 5 '.
The adenoviral vectors currently used in the protocols for gene therapy are devoid of most of the E1 region so to avoid their dissemination in the environment and the host organism. Deletions in the E3 region will increase the capacity of cloning.
The genes of interest are introduced into (viral DNA in place of Tune or (other deleted region. However, the potential immunogenicity of viral proteins still expressed may in certain particular applications oppose the persistence of transduced cells and stable expression of the transgene.
These disadvantages justified the construction of news vectors generations who

-3-conservent les régions en cis (ITRs et séquences d'encapsidation) essentielles à
l'encapsidation mais comportent des modificaxions génétiques supplémentaires visant à supprimer l'expression in vivo de la plupart des gènes viraux (voir par exemple la demande internationale W094/28152). A cet égard, un vecteur dît 5 minimal, déficient pour l'ensemble des fonctions adénovirales représente une alternative de choix.
La plupart des vecteurs développés à l'heure actuelle sont basés sur une expression constitutive du transgène. Or il peut être souhaitable de limiter l'expression du gène thérapeutique à un nombre restreint de types cellulaires.
10 L'expression tissu-spécifique peut être médiée par le biais de promoteurs et d'enhancers tissu-spécifiques ou de systèmes d'expression inductibles répondant à un événement cellulaire ou temporel spécifique.
De nombreux systèmes d'expression inductibles proposés actuellement reposent sur l'emploi de promoteurs régulés par des facteurs de transcription 15 endogènes activés par un ligand inducteur particulier (hormones stéroïdes, interféron, métaux lourds...). Un premier inconvénient est que ces systèmes nécessitent la présence des facteurs activateurs endogènes au sein de la cellule cible. De plus, le niveau d'expression basal est souvent élevé en raison d'une activation «bruit du fond» due aux substances cellulaires endogènes, qui peut 20 générer des effets secondaires non négligeables.
Un certain nombre de systèmes d'expression basés sur l'utilisation de facteurs procaryotiques ont été mis en évidence au cours de ces dernières années.
On peut citer par exemple ceux des opérons bactériens tétracycline (Gossen et Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-551), lactose (Miller et 25 Reznikoff (Eds), The operons, Cold Spring Harbor Laboratory), tryptophane (Yanofsky et al., 1981, Nucleic acids Res. 9, 6647-6668), de la protéine 16 du virus simplex de l'herpès (protéine trcms-activatrice VP16), ou de la protéine Gal4 de levure (Webster et al., 1988, Cell 52, 169-178).
D'une manière générale, l'opéron de résistance à la tétracycline est codé par -3-keep essential cis regions (ITRs and packaging sequences) at packaging but involve additional genetic modifications aimed at suppressing the expression in vivo of most viral genes (see through example international application W094 / 28152). In this regard, a vector says 5 minimal, deficient for all adenoviral functions represents a alternative of choice.
Most of the vectors developed today are based on a constitutive expression of the transgene. However it may be desirable to limit expression of the therapeutic gene to a limited number of cell types.
10 Tissue-specific expression can be mediated through promoters and tissue-specific enhancers or inducible expression systems respondent to a specific cellular or temporal event.
Many inducible expression systems currently offered are based on the use of promoters regulated by transcription factors 15 endogenous activated by a specific inducing ligand (steroid hormones, interferon, heavy metals ...). A first drawback is that these systems require the presence of endogenous activating factors within the cell target. In addition, the basal level of expression is often high due to a “background noise” activation due to endogenous cellular substances, which can 20 generate significant side effects.
A number of expression systems based on the use of prokaryotic factors have been highlighted in recent years.
We can quote for example those of the bacterial tetracycline operons (Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-551), lactose (Miller and 25 Reznikoff (Eds), The operons, Cold Spring Harbor Laboratory), tryptophan (Yanofsky et al., 1981, Nucleic acids Res. 9, 6647-6668), from protein 16 of herpes simplex virus (trcms-activator protein VP16), or the protein Gal4 yeast (Webster et al., 1988, Cell 52, 169-178).
Generally, the tetracycline resistance operon is coded by

-4-le transposon TnlO (I-fillen et al., 1984, J. Mol. Biol. 172, 185-201). La régulation est assurée par une courte séquence nucléotidique dite "opérateur" (tet O) qui constitue un site de fixation de divers régulateurs. Ainsi, la fixation du répresseur tétracycline (tet R) ou de l'antibiotique tétracycline diminue considérablement le -4-the Tn10 transposon (I-fillen et al., 1984, J. Mol. Biol. 172, 185-201). The regulation is ensured by a short nucleotide sequence called "operator" (tet O) which constitutes a site for fixing various regulators. So fixing the repressor tetracycline (tet R) or tetracycline antibiotic decreases considerably the

5 niveau de transcription. Au contraire, un effet d'activation est obtenu en mettant en oeuvre une protéine, désignée dans la littérature "trans-activateur tétracycline (tTA)" qui résulte de la fusion entre le tet R et les 130 acides aminés C-terminaux du domaine d'activation de la protéine VP 16 du virus simplex de l'herpès.
L'expression d'un gène rapporteur placé sous le contrôle de plusieurs copies de tet 10 O en amont de séquences de base de la transcription (TATA box, site d'initiation de la transcription..) est détectable par co-expression du tTA et inhibée par ajout de tétracycline. La Tétracycline lie le tTA et empêche ainsi la transcription.
Ce système est fonctionnel dans un contexte vecteur rétroviral (Paulus et al., 1996, J.
Virol. 70, 62-67) et adénoviral (Neering et al., 1996, Blood 4, 1147-1155 ;
1 S Yoshida and Hamada, 1997, Biochem. Biophy. Comm. 230, 426-430 ; Massie et al., 1998, J. Virol. 72, 2289-2296). Dans ce dernier cas, le trans-activateur est fourni en trans soit par infection d'une lignée établie exprimant le tTA par un vecteur adénoviral contenant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'éléments tet0 et du promoteur CMV soit par co-infection des cellules par deux vecteurs 20 adénoviraux, l'un contenant la cassette d'intérêt et l'autre exprimant le tTA. Un système réverse dans lequel l'expression du transgène est activée en présence de la tétracycline, a été développé en mutant la protéine de fusion tTA (Gossen et al., 1995, Science 268, 1766-1769). La protéine modifiée riTA ne lie en effet les éléments tet0 qu'en présence de tétracycline. Une autre variante selon laquelle 25 l'expression est contrôlée à deux niveaux (en absence de tétracycline et en présence d'oestradiol), est obtenue en fusionnant le tTA au domaine de liaison au ligand du récepteur aux oestrogènes (Iida et al., 1996, J. Virol. 70, 6054-6059).
Un autre système inductible repose sur l'emploi de récepteurs endogènes afin de remédier à l'immunogénicité potentielle des trans-activateurs procaryotiques. A cet égard, les récepteurs des hormones stéroïdes ont fait l'objet de nombreuses publications. On peut citer plus particulièrement les récepteurs aux glucocorticoïdes (GR) (Israël et Kaufinan, 1989, Nucleic Acids Res. 17, 4589-4604), à la progestérone (PR) (Gronemeyer et al., 1987, EMBO J. 6, 3985-3994) 5 et aux oestrogènes (ER) (Klein-Hitpa(3 et al., 1986, Cell 46,1053-1061 ;
Koike et al., 1987, Nucleic Acids Res. IS, 2499-2513). Leur mode d'action est variable puisqu'ils sont capables de trans-activer ou de trans-réprimer la transcription selon la cellule cible, le ligand hormonal et les éléments de régulation employés.
Pour ce qui est de la trans-activation, le récepteur stéroïdien est sous sa forme inactive 10 complexé à divers facteurs cellulaires dont certaines protéines de choc thermique (hsp pour heat shock protein en angïais). La fixation d'un ligand agoniste (hormone stéroïde) entraîne un changement de la conformation du récepteur. Cette activation s'accompagne de la dissociation des facteurs cellulaires, d'une translocation nucléaire et augmente la capacité du récepteur à fixer une courte séquence d'ADN
15 spécifique (séquence cible), ce qui permet l'interaction avec la machinerie transcriptionnelle et l'induction de la transcription. Pour remplir leur fonction, ces récepteurs sont généralement organisés en 3 domaines fonctionnels, respectivement un domaine de trans-activation permettant l'activation de la transcription, un domaine de liaison à l'ADN (séquence cible) et un domaine de liaison au ligand 20 (DLL).
Des récepteurs modifiés répondant préférentiellement à des ligands synthétiques non naturels sont également proposés dans la littérature. Par exemple, Wang et al. (1994, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 8180-8184) ont construit une chimère activable par la molécule RU486 mais pas par la progestérone endogène, 25 qui résulte de la fusion du domaine de liaison au ligand du récepteur tronqué de la progestérone (OPR), du domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure Gal4 et du domaine de trans-activation de la protéine VP16. Toutefois, l'activité
basale reste élevée et la protéine chimère peut potentiellement interférer avec les facteurs transcriptionnels cellulaires. Des variants des récepteurs ER et GR modifiés dans 5 level of transcription. On the contrary, an activation effect is obtained by putting using a protein, designated in the literature "trans-activator tetracycline (tTA) "which results from the fusion between tet R and the 130 amino acids C-terminals of the activation domain of the protein VP 16 of the herpes simplex virus.
The expression of a reporter gene placed under the control of several copies early 10 O upstream of basic transcription sequences (TATA box, site initiation transcription ..) is detectable by co-expression of tTA and inhibited by addition tetracycline. Tetracycline binds tTA and thus prevents transcription.
This system is functional in a retroviral vector context (Paulus et al., 1996, J.
Virol. 70, 62-67) and adenoviral (Neering et al., 1996, Blood 4, 1147-1155;
1 S Yoshida and Hamada, 1997, Biochem. Biophy. Comm. 230, 426-430; Massie and al., 1998, J. Virol. 72, 2289-2296). In the latter case, the trans-activator East supplied in trans either by infection of an established line expressing tTA by a adenoviral vector containing a gene of interest placed under control elements tet0 and the CMV promoter either by coinfection of the cells with two vectors 20 adenovirals, one containing the cassette of interest and the other expressing tTA. A
reverse system in which the expression of the transgene is activated in the presence of tetracycline, was developed by mutating the fusion protein tTA (Gossen et al., 1995, Science 268, 1766-1769). The modified protein riTA does indeed bind tet0 elements only in the presence of tetracycline. Another variant according to which The expression is controlled at two levels (in the absence of tetracycline and in presence estradiol), is obtained by fusing tTA to the binding domain at ligand of estrogen receptor (Iida et al., 1996, J. Virol. 70, 6054-6059).
Another inducible system relies on the use of endogenous receptors to address the potential immunogenicity of trans-activators prokaryotic. In this regard, steroid hormone receptors have made the object many publications. Mention may be made more particularly of the receptors to the glucocorticoids (GR) (Israel and Kaufinan, 1989, Nucleic Acids Res. 17, 4589-4604), progesterone (PR) (Gronemeyer et al., 1987, EMBO J. 6, 3985-3994) 5 and to estrogens (ER) (Klein-Hitpa (3 et al., 1986, Cell 46, 1053-1061;
Koike and al., 1987, Nucleic Acids Res. IS, 2499-2513). Their mode of action is variable since they are able to trans-activate or trans-repress the transcription according to the target cell, the hormonal ligand and the regulatory elements used.
For this which is trans-activation, the steroid receptor is in its form inactive 10 complexed with various cellular factors including certain shock proteins thermal (hsp for heat shock protein in English). The fixation of an agonist ligand (hormone steroid) causes a change in the conformation of the receptor. This activation is accompanied by dissociation of cellular factors, translocation nuclear and increases the receptor's ability to fix a short sequence DNA
15 specific (target sequence), allowing interaction with machinery transcription and induction of transcription. To fulfill their function, these receivers are generally organized into 3 functional areas, respectively a trans-activation domain allowing activation of transcription, a DNA binding domain (target sequence) and a ligand binding domain 20 (DLL).
Modified receptors preferentially responding to ligands unnatural synthetics are also proposed in the literature. Through example, Wang et al. (1994, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 8180-8184) have constructed a chimera activatable by the molecule RU486 but not by endogenous progesterone, 25 which results from the fusion of the ligand binding domain of the receptor truncated from the progesterone (OPR), from the DNA binding domain of the yeast protein Gal4 and the trans-activation domain of the protein VP16. However, the activity basal stays high and the chimeric protein can potentially interfere with factors cell transcriptional. Modified ER and GR receptor variants in

-6-leurs domaines de liaison au ligand ont également été décrits. Ainsi, le mutant ERT
obtenu par substitution de la glycine en position 521 du récepteur ER par une arginine, est incapable de fixer les oestrogènes endogènes, mais peut être activé par des ligands synthétiques tel que le Tamoxifen, pour activer la transcription régulée 5 par la séquence cible ERE (pour estrogen responsive element). Un variant analogue a également été construit pour le récepteur GR, modifié en position par substitution de l'isoleucine par une thréonine (Roux et al., 1996, Molecular Endocrynology 10, 1214-1226). Ce variant désigné GRd"' est incapable de fixer les glucocorticoïdes endogènes, mais peut être activé par des ligands synthétiques tels 10 que la Dexaméthasone. Une fois activé, il reconnaît la séquence cible GRE
(pour glucocorticoïde responsive element ; Cato et al., 1986, EMBO J. S, 2237-2240) et stimule la transcription du promoteur qui lui est associé.
Un autre système d'expression inductible utilise le récepteur stéroïdien d'insecte répondant à l'ecdysone (EcR). Le récepteur est activé par l'ecdysone et 15 forme un hétérodimère avec la protéine ultraspiracle (USP) de la Drosophile qui se fixe à une séquence cible spécifique (EcRE pour ecdysone responsive element) pour activer la transcription. No et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351) ont créé un récepteur mutant VgEcR obtenu par fusion du DLL du récepteur EcR, d'un hybride entre le domaine de liaison à l'ADN des récepteurs 20 EcR et GR et du domaine de trans-activation de VP 16. Le mutant peut former, en présence de l'ecdysone ou de son analogue muristone A, un hétérodimère avec la protéine USP ou son homologue humain, le récepteur de l'acide rétinoïque X
(RXR), et activer la transcription de gènes placés sous le contrôle d'une séquence hybride (5xE/GRE) comprenant les motifs répondant aux récepteurs EcR et GR.
25 Un tel système évite une éventuelle activation endogène.
Un autre système d'expression inductible décrit dans la littérature met en oeuvre les immunophilines. Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032) ont développé un système à deux composantes assemblées en présence d'un ligand.
Plus précisemment, la première composante est une fusion entre le facteur de -7_ transcription ZFHD1 (portant un domaine de liaison à l'ADN) et l'immunophiline FKBP 12 et la deuxième composante est une fission entre Ie domaine de trans-activation du facteur NFxB p65 et FRAP (FKBP 12-rapamycine-associated protein). Le trans-activateur est activé sous forme d'un hétérodimère associant les 5 deux composantes et la rapamycine liant les portions FKBP12 et FRAP qui peut induire l'expression d'un transgène placé sous le contrôle des éléments-cibles de ZFHD 1.
Enfin, Dolwick et al. (1993, Mol. Phanma.col. 44, 911-917) ont identifié le récepteur aryl hydrocarbon (AhR) impliqué dans le métabolisme des xénobiotiques 10 et des substances chimiques élaborées par l'homme. L'AhR, sous forme inactive est complexé à divers facteurs cellulaires dont la protéine chaperonne hsp90.
La fixation d'un ligand xénobiotique induit la dissociation du complexe, la translocation du AhR dans le noyau, la formation d'un hétérodimère avec la protéine Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ; Hoi~'man et al., 15 1991, Science 252, 954-958). La fixation de fhétérodimère sur les éléments cibles de l'ADN nommés XRE (pour xenobiotique responsive elements) induit la transcription des séquences géniques en aval. La séquence XRE est présente dans la région promotrice de nombreux gènes codant pour des enzymes impliquées dans le métabolisme de drogues, telles que glutathione-S-transférase ou cytochrome 20 P4501 Al . AhR et Arnt possèdent un domaine responsable de la reconnaissance de la séquence cible, de f hétérodimérisation et de la liaison au ligand. La majorité des études de trans-activation par le biais du complexe AhR/Arnt utilise le ligand 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) La présente invention propose un système d'expression inductible mettant 25 en oeuvre un vecteur adénoviral comportant un gène d'intérêt dont l'expression est régulée par un trans-activateur activable par l'apport de molécules pharmacologiques exogènes. Ce système est basé plus particulièrement sur l'utilisation d'un récepteur stéroïdien. Une fois activé, le complexe récepteur/ligand va se fixer sur sa séquence cible et permettre une activation en trans de _g_ l'expression du gène thérapeutique. On a maintenant construit un vecteur adénoviral recombinant contenant, en remplacement de la région E1, une cassette d'expression du récepteur stéroïdien mutant GRde" exprimé de façon constitutive par le promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV) et, en remplacement de la S région E3, une cassette d'expression du gène facteur IX (FIX) humain placé
en aval du promoteur du virus MMTV (mouse mammary tumor virus) contenant la séquence cible GRE. Les expériences qui suivent montrent la fonctionnalité
d'un tel système inductible in vitro et in vivo. De façon analogue, le récepteur ERT a également été inséré dans la région E1 d'un adénovirus sous le contrôle du 10 promoteur CMV. Dans ce ca.s, la cassette inductible du gène FIX est régulée par la séquence ERE associée au promoteur minimal du gène TK (thymidine kinase) de HSV (herpès simplex virus). Le troisième système étudié dans le cadre de la présente invention met en oeuvre le récepteur modifié VgEcR et le récepteur humain RXR dont les séquences ont été introduites dans la région E1 d'un 15 adénovirus. La cassette inductible présente dans la région E3 place l'ADNc du FIX
sous Ie contrôle des éléments hybrides SxE/GRE.
La finalité de la présente invention est de remédier aux inconvénients des vecteurs de thérapie génique actuels, en améliorant notamment la spécificité
(activation par des substances exogènes non toxiques et non par des facteurs 20 cellulaires endogènes) et l'inductibilité (activité basale en l'absence d'inducteur minimale et forte expression du transgène à l'état activé). L'objet de la présente invention peut être appliqué à divers protocoles de thérapie génique nécessitant l'expression de molécules solubles, telles que des molécules antitumorales (anticorps, cytokines, chimiokines) ou dans tous les cas où l'expression du gène 25 thérapeutique devra être régulée en fonction des besoins de l'organisme. Il permet également l'analyse des gènes dont l'expression est cytotoxique ou réduite à
certaines étapes du développement.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un système d'expression inductible comprenant (i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel d'origine eucaryote ou virale et placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte , et (ü) un vecteur adénoviral recombinant comportant un gène d'intérét placé
sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
Aux fins de la présente invention, le terme «activateur transcriptionnel»
10 définit un polypeptide ou un ensemble de polypeptides exerçant une action positive sur la transcription c'est à dire ayant la capacité d'initier ou de stimuler la transcription d'un gène quelconque à partir d'éléments de régulation appropriés répondant audit activateur transcriptionnel. L'effet positif sur la transcription est de préférence médié directement par la liaison de l'activateur aux éléments de 1 S régulation mais peut l' être indirectement par l' intermédiaire de facteurs) cellulaire(s). De préférence, on a recours à un activateur transcriptionnel ligand-dépendant apte à lier une séquence d'ADN caractéristique (séquence cible) et à
activer le promoteur qui lui est associé. De tels activateurs transcriptionnels sont décrits dans l'état de la technique. On indique également que dans le cadre de la 20 présente invention, l'activateur transcriptionnel peut être un polypeptide unique sous forme de monomère ou de muitimère (de préférence dimère) ou encore peut résulter de l'association d'un ensemble de polypeptides formant un hétéromère (de préférence un ensemble de deux polypeptides formant un hétérodimère).
L'activateur transcriptionnel en usage dans la présente invention peut être dérivé
25 d'un organisme quelconque d'origine eucaryote ou virale, notamment d'une levure, d'un insecte, d'un vertébré ou d'un virus ou peut avoir une origine mixte c'est à
dire être formé de composantes d'origines diverses.
Un activateur transcriptionnel convenant à la mise en oeuvre de la présente invention comprend au moins 3 types de domaines fonctionnels, respectivement un domaine de trans-activation, un domaine de liaison à l'ADN (séquence cible) et un domaine de liaison au ligand (DLL). Dans le cadre de la présente invention, l'ordre des différents domaines est sans importance. De plus, ils peuvent être répartis dans la séquence en acides aminés de manière continue ou discontinue (avec S éventuellement un chevauchement des résidus impliqués dans chaque fonction) et localisés sur un ou les polypeptide(s) formant ledit activateur transcriptionnel. Par ailleurs, il peut comprendre plusieurs domaines d'un même type. Un exemple adéquate est constitué par l'hétérodimère développé par Rivera et al. (1996, Nat.
Med. 2, 1028-1032) activé par la liaison de la rapamycine aux portions FKBP12 10 et FRAP.
Le terme «domaine de liaison au ligand» fait référence à la portion de l'activateur transcriptionnel qui interagit avec un ligand-inducteur approprié.
L'interaction DLL-inducteur place l'activateur transcriptionnel en état activé, étape nécessaire à l'activation transcriptionnelle. Le DLL est de préférence localisé à
15 l'extrémité C-terminale du ou d'un polypeptide composant ledit activateur transcriptionnel.
Le terme «domaine de liaison à l'ADN» fait référence à la portion de l'activateur transcriptionnel qui interagit avec la séquence d'ADN cible présente au sein du promoteur inductible contrôlant l'expression du gène d'intérêt et 20 spécifique de l'activateur transcriptionnel choisi. Ladite séquence cible est généralement placée en amont d'une région promotrice contenant au moins une TATA box et est composée de motifs reconnus par l'activateur transcriptionnel.
Ces motifs peuvent former une structure particulière (palindrome, répétitions en orientation sens ou inversée ...etc). Les séquences cibles adaptées à chaque 25 activateur transcriptionnel sont décrites dans la littérature. Pour illustrer, on peut citer - la séquence cible GRE (pour glucocorticoïd responsive element) comportant un motif TGTTCT (ou son complémentaire) reconnu par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur GR ou d'un analogue (GRa"'). Un exemple préféré est constitué par la séquence 5'GGTACANNNTGTTCT3' où N représente un nucléotide quelconque ;
- la séquence cible ERE (pour oestrogen responsive element) comportant un motif 5'AGGTCA3' (ou son complémentaire) reconnu par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur ER
ou d'un analogue (ERT). Un exemple préféré est constitué par la séquence S'AGGTCANNNTGACC3' où N représente un nucléotide quelconque ;
10 - la séquence cible UAS (pour upstream activating sequence) de séquence S' CGGAGTACTGTCCTCCG3' (ou son complémentaire) reconnue par un domaine de liaison à l'ADN
dérivé du récepteur Gal 4 de levure ou d'un analogue ;
- la séquence cible EcRE (pour ecdysone responsive element) 15 comportant un motif GACAAG (ou son complémentaire} reconnu par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur EcR ou d'un analogue. Un exemple préféré est constitué par la séquence 5'GACAAGGGTTCAATGCACTTGTC3' ;
- ia séquence SxE/GRE de séquence S'AGGTCA?~TAGAACA3' (ou 20 son complémentaire) reconnue par un domaine de liaison à l'ADN
hybride entre EcR et GR ou d'un analogue, - la séquence cible 5' TAATTANGGGNG3' où N représente un nucléotide quelconque, reconnue par Ie facteur de transcription 25 - la séquence cible XRE (pour xenobiotique responsive element) de séquence 5 'CCTCCAGGCTTCTTCTCACGCAACTCC3' reconnue par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur AhR ou d' un analogue.

Le terme «domaine de trans-activatiom> fait référence à la portion de l'activateur transcriptionnel qui interagit avec la machinerie cellulaire pour initier ou stimuler la transcription génique dépendante de la séquence cible répondant audit activateur. Ce domaine peut être issu d'un facteur de transcription classique S (NFxB, SP-1...) ou d'un facteur ligand-dépendant (récepteur stéroïdien, immunophiline, AhR...). Un domaine comprenant les 130 acides aminés C-terminaux de VP 16 convient tout particulièrement.
La trans-activation induite par l'activateur transcriptionnel en usage dans le cadre de la présente invention peut être vérifiée simplement par des techniques conventionnelles, par exemple en suivant l'expression d'un gène donné placé
sous le contrôle de la séquence cible adéquate ou la synthèse de son produit d'expression (analyse selon Northern, Western, immunofluorescence...etc) en présence du récepteur activé par l'inducteur. Un protocole détaillé est donné
dans les exemples ci-après. Une différence d'un facteur d'au moins 2, avantageusement d'au moins 5 et, de préférence, d'au moins 10 reflète la capacité de trans-activation du système d'expression selon l'invention.
On peut illustrer ces définitions par l'exemple du récepteur GR. Son domaine de trans-activation est localisé dans la partie N-terminale entre les résidus 272 et 400 (Jonat et al., 1990, Cell 62, 1189-1204), le domaine de liaison à
l'ADN
de 66 acides aminés entre les résidus 421 et 487 (Lucibello et al., 1990, EMBO
J.
9, 2827-2834) et le domaine de liaison au ligand hormonal d'environ 300 acides aminés dans la partie C-terminale (Kerpolla et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13, 3 791 ). Ce dernier domaine comprend également les séquences responsables pour la dimérisation du GR, sa localisation nucléaire et l'intéraction avec les protéines hsp. La trans-activation est médiée par la liaison d'un dimère de récepteur à
la séquence cible GRE.
Avantageusement, l'activateur transcriptionnel inclu dans le système d'expression inductible selon l'invention comporte tout ou partie d'un domaine dérivé d'un récepteur d'hormones stéroïdes choisi parmi le groupe constitué
par les récepteurs oestrogène (ER), glucocorticoïde (GR), progestérone (PR), Vitamine D, ecdysone (EcR), minéralocorticoïde, androgène, hormone thyroïde, acide rétinoïque et acide rétinoïque X ou encore d'une immunophiline ou d'un récepteur aryl hydrocarbon (AhR).
Dans le cadre de la présente invention, on peut mettre en oeuvre un récepteur modifié. Avantageusement, le récepteur modifié a perdu sa capacité
d'activation par un inducteur naturel et acquis une capacité d'activation par un inducteur non naturel et retient la capacité de trans-activation du récepteur natif.
L'homme de l'art connaît la ou les modifications à effectuer à cet égard.
Elles peuvent être diverses (délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs résidus du récepteur naturel) et concerner un ou plusieurs domaines. De manière préférée, le domaine fonctionnel modifié présente une identité de séquence avec son equivalent natif d'au moins 70 %, avantageusement d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 % et, de manière tout à fait préférée d'au moins 95%.
15 Seion un premier mode de réalisation, on a recours à un récepteur modifié
dans son DLL de manière à être activable par un inducteur non naturel. Des exemples préférés sont constitués par les mutants GRde'' (I747T) et ERT
(G521R) déjà cités.
On peut également envisager de mettre en oeuvre un activateur transcriptionnel chimère comprenant des polypeptides ou fragments polypeptidiques variés. Avantageusement, il résulte de la fission ou de l'association de domaines fonctionnels d'origines différentes. En effet, il est possible d'échanger les domaines fonctionnels entre les différents récepteurs et toutes les combinaisons possibles entrent dans le cadre de la présente invention. Par exemple, pour réduire 25 l'interférence avec les complexes récepteurs / ligands endogènes, on peut envisager de remplacer le domaine de liaison à l'ADN d'un récepteur stéroïdien par celui d'un récepteur non humain (d'origine virale ou animale ou d'eucaryote inférieur), par exemple un récepteur stéroïdien animal, un récepteur de levure(Gal4)..., la seule condition étant d'adapter la séquence cible au domaine de liaison à
l'ADN
retenu. Une telle adaptation est à la portée de l'homme de l'art. A titre indicatif, lorsque le domaine de liaison à l'ADN est issu de Gal4, le promoteur inductible mis en oeuvre contiendra les éléments UAS (LJpstream Activating Sequences) répondant à Gal4. Par ailleurs, le domaine de trans-activation peut être issu de n'importe quel domaine d'activation transcriptionnel connu, notamment de la protéine 16 du virus herpès simplex (VP16) ou de la p65 du facteur NFKB et en particulier, de son extrémité C-terminale. Un activateur transcriptionnel associant un DLL dérivé d'un récepteur stéroïdien, un domaine de trans-activation dérivé
de 10 VP16 et un domaine de liaison à l'ADN de Gal4 ou d'un récepteur stéroïdien convient à la mise en oeuvre de la présente invention. A cet égard, on utilisera de préférence les résidus 1 à 74 de Gal4. Mais d'autres combinaisons sont également envisageables.
Par ailleurs, on peut employer également un domaine fonctionnel hybride 1 S entre des fragments polypeptidiques différents. Un exemple possible est constitué
par un domaine de liaison à l'ADN hybride entre les récepteurs EcR et GR, reconnaissant une séquence cible hybride comportant les motifs répondant à
l'ecdysone et aux glucocorticoïdes.
Un activateur transcriptionnel préféré dans le cadre de la présente invention 20 est choisi parmi (i) un polypeptide désigné GRdeX comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivés d'un récepteur aux glucocorticoïdes, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de l'isoieucine en position 747 par une thréonine ;
25 (ü) un polypeptide désigné ERT comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivé d'un récepteur à
I'oestrogène, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de la glycine en position 521 par une arginine ;

WO 00/12741 PCT/i<R99/02051 (iii) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un DLL dérivé du récepteur à l'ecdysone, un domaine de liaison à l'ADN hybride dérivé de ceux des récepteurs EcR et GR et un domaine de trans-activation dérivé de la protéine virale VP 16 et un second polypeptide dérivé de la protéine USP de drosophile ou d'un homologue tel que le récepteur de l'acide rétinoïque X (RXR) humain ;
(iv) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un domaine de liaison à l'ADN dérivé du facteur de transcription ZFHD 1 et un DLL dérivé de f immunophiline FKBP 12 et un second polypeptide comportant un domaine de trans-activation dérivé du facteur NF~cB p65 et un DLL dérivé de FRAP (FKBP 12-rapamycine-associated protein) ; et {v) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide dérivé
du récepteur AhR et un deuxième polypeptide dérivé de la protéine Arnt.
De préférence, les activateurs transcriptionnels (i) et (ü) sont sous forme d'homodimères et (iii) (iv) et (v) sont sous forme d'hétérodimères associant le premier et le second polypeptide et, éventuellement, l'inducteur.
Selon un mode de réalisation tout à fait avantageux, l'activateur transcriptionnel est activé par liaison à un inducteur non naturel et n'est pas ou peu activé par un composé humain naturel.
Le terme «inducteur non naturel» se réfère à un composé qui n'est pas trouvé naturellement dans l'organisme humain ou animal à qui la thérapie utilisant le système d'expression inductible selon l'invention est destinée. Il s'agit de préférence d'un inducteur synthétique qui n'est pas trouvé naturellement dans un organisme humain et dont la structure est légèrement différente de celle d'un composé humain (endogène). Aux fins de la présente invention, un inducteur non naturel est capable d'activer l'activateur transcriptionnel en usage dans le cadre de la présente invention, en particulier par liaison au DLL, afin d'initier ou stimuler la transcription dépendante de la séquence cible répondant audit activateur.
Le choix d'un inducteur non naturel adapté à l'activateur transcriptionnel retenu est à la portée de l'homme de l'art sur la base de l'état de la technique.
L'activation de l'activateur transcriptionnel par l'inducteur non naturel peut se faire par une interaction covalente ou non covalente (électrostatique, hydrophobe, liaison 5 hydrogène ... etc). Par ailleurs, l'inducteur peut être constitué par un composé
unique ou par un ensemble de molécules. Il appartient de préférence à la, famille des stéroïdes, rétinoïdes, acides gras, vitamines, hormones, xénobiotiques ou antibiotiques.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit inducteur non naturel est 10 une substance synthétique administrable par voie orale. De préférence, il est choisi parmi le groupe constitué par la déxaméthasone, le tamoxifène, le muristérone A, l'ecdysone, la rapamycine et le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) ou un analogue quelconque de ces composés, de préférence peu ou pas toxique.
Les séquences codant pour l'activateur transcriptionnel compris dans le 15 système d'expression inductible selon l'invention sont placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés permettant l'expression dans une cellule ou un organisme hôte. Le terme «éléments de régulation appropriés» regroupent l'ensemble des éléments permettant la transcription desdites séquences en ARN
et la traduction en protéine. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance 20 particulière. II peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote, procaryote ou même virale. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène endogène. Par ailleurs, il peut être constitutif ou régulable. En outre, iI
peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice 25 versa, introduire un site de restriction...... On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycérate Kinase), MT
(metallothioneine ; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Vrus), le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur TK-HSV-1, le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus) et les promoteurs gouvernant l'expression des gènes adénoviraux tardifs (MLP) et précoces (ElA, E2A, E3 ou E4). Mais, il peut également être intéressant de réguler l'expression de l'activateur transcriptionnel. Selon une première variante, son expression peut être contrôlée par sa séquence cible spécifique (autoactivation 5 et/ou activation par le récepteur sauvage endogène activé par le ligand endogène).
Par exemple, on aura recours aux éléments ERE ou GRE pour l'expression d'un activateur transcriptionnel comportant un domaine de liaison à l'ADN dérivé de ER ou GR (ERT ou GRd°"). i3ne autre possibilité est l'emploi d'un promoteur régulable choisi parmi ceux de l'art antérieur. A cet égard, l'utilisation d'un 10 promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumorale ou cancéreuse peut être avantageuse. On peut citer notamment les promoteurs des gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J.
Clin.
Invest. 96, 2775-2782), CEA (pour carcinoma embryonic antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), 15 tyrosinose surexprimé dans les mélanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res.
53, 3860-3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et al., 1994, Gene Therapy I, 170-175) et a-fétoprotéine surexprimée dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465). On indique que le promoteur précoce du Cytomégalovirus (CMV) est tout particulièrement préféré.
20 Bien entendu, les éléments de régulation appropriés peuvent en outre comprendre des éléments additionnels améliorant l'expression (séquence intronique, séquence terminatrice de la transcription...) ou encore le maintien dans une cellule hôte. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art.
Lorsque l'activateur transcriptionnel en usage dans le cadre de la présente 25 invention est composé par un ensemble de polypeptides, ceux-ci peuvent être produits à partir de séquences nucléotidiques polycistroniques (placées sous le contrôle d'un promoteur unique) mettant en oeuvre un site d'initiation de la traduction de type IRES pour initier la traduction du second cistron. On peut également employer un promoteur bidirectionnel dirigeant l'expression de deux gènes placés de part et d'autre. On peut aussi générer des cassettes d'expression indépendantes comportant chacones des éléments de régulation appropriés tels que ceux cités auparavant. Les cassettes peuvent être portées par un même vecteur d'expression au par des vecteurs différents.
5 Les séquences employées dans le cadre de la présente invention peuvent être obtenues par les techniques classiques de biologie moléculaire, par exemple par criblage de banque à l'aide de sondes spécifiques, par immunocriblage de banque d'expression, par PCR au moyen d'amorces adéquates ou par synthèse chimique. Les mutants peuvent être générés à partir des séquences natives par 10 substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides en mettant en oeuvre les techniques de mutagénèse dirigée, de PCR, de digestion par les enzymes de restriction et ligation ou encore par synthèse chimique. La fonctionnalité
des mutants et des constructions peut être vérifiée par les techniques de l'art.
La deuxième composante du système d'expression inductible selon 15 l'invention est un vecteur adénoviral recombinant comportant au moins un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé
en trans par ledit activateur transcriptionnel.
On aura de préférence recours à un vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie d'au moins une région essentielle à la réplication sélectionnée parmi les 20 régions E1, E2, E4 et L1 à L5, afin d'éviter sa propagation au sein de l'organisme hôte ou de fenvironnement. Une délétion de la majorité de la région El est préférée. Avantageusement, elle s'étend des nt 454 à 3328 mais peut également englober des séquences additionnelles en 5' et 3' à la condition de ne pas interférer avec la fonction d'encapsidation. De préférence, le gène pIX n'est pas inclu dans 25 la délétion de E1. En outre, elle peut être combinée à d'autres modifications) touchant notamment les régions E2, E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles défectives sont complémentées en Crans au moyen d'une lignée de complémentation etlau d'un virus auxilliaire. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération défectifs pour les fonctions E1 et ou E1 et E2 (voir par exemple les demandes internationales W094/28152 et W097/04119). Pour illustrer ce mode de réalisation, on peut citer un vecteur combinant une délétion au sein de la région E 1 et une mutation thermosensible affectant le gène DBP (pour DNA Binding Protein en anglais) de la région E2A
5 (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339). Pour ce qui est de la région E4, elle peut être délétée en totalité ou en partie. Une délétion partielle de la région E4 à
l'exception des séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) 3 et/ou 6/7 est avantageuse dans la mesure où elle ne nécessite pas de complémentation de la fonction E4 (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). Dans le 10 but d'augmenter les capacités de clonage, le vecteur adénoviral recombinant peut en outre être dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle.
Selon cette alternative, il peut être intéressant de conserver néanmoins les séquences E3 codant pour les polypeptides permettant l'échappement au système immunitaire de l'hôte, notamment la glycoprotéine gpl9k (Gooding et al., 1990, Critical Review 15 of Immunology 10, 53-71). Selon une autre alternative, on peut employer un vecteur adénoviral minimal retenant essentiellement les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la région d'encapsidation et défectif pour l'ensemble des fonctions virales.
Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral du système d'expression 20 inductible selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. II peut dériver du génome d'un adénovirus humain ou animal (canin, aviaire, bovin, murin, ovin, porcin, simien...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 25 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176 ; Spibey et Cavanagh, J.
Gen.
Virol., 1989, 70: 165-172 ; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60: 21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5.
Le gène d'intérêt en usage dans la présente invention, peut être issu d'un organisme eucaryote, d'un procaryote d'un parasite ou d'un vinas autre qu'un adénovims. II peut être isolé par toute technique conventionnelle dans le domaine 5 de l'art, par exemple par clonage, PCR ou synthèse chimique. Il peut être de type génomique (comportant tout ou partie de l'ensemble des introns), de type ADN
complémentaire (ADNc, dépourvu d'intron) ou de type mixte (minigène). Par ailleurs, il peut coder pour un ARN antisens et/ou un ARN messager (ARNm) qui sera ensuite traduit en polypeptide d'intérêt celui-ci pouvant être (i) intracellulaire, 10 (ü) incorporé dans Ia membrane de la cellule hôte ou (iii) secrété. II peut s'agir d'un polypeptide tel que trouvé dans la nature (natif), d'une portion de celui-ci (tronqué), d'un mutant présentant notamment des propriétés biologiques améliorées ou modifiées ou encore d'un polypeptide chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses. Par ailleurs, le gène d'intérêt peut coder pour un 15 ARN anti-sens, un ribozyme, ou encore un polypeptide d'intérêt.
Parmi les polypeptides d'intérêt utilisables, on peut citer plus particulièrement les chémokines et cytokines (interféron a, (3 ou y, interleukine (IL), notamment l'IL,-2, l'IL-6, l'IL-10 ou encore l'IL-12, facteur nécrosant des tumeurs (TNF), facteur stimulateur de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), 20 MIP-loc, MIP-lai, RANTES, protéine de chémoattraction des monocytes telle que MCP-1...), les récepteurs cellulaires (notamment reconnus par le virus HIV), les ligands de récepteur, les facteurs de coagulation (Facteur VIII, Facteur IX, thrombine, protéine C), les facteurs de croissance (FGF pour Fibroblast Growth Factor, VEGF pour Vascular Endothelial Growth Factor), les enzymes (uréase, 25 rénine, métalloprotéinase, nitric oxide synthétase NOS, SOD, catalase, lécithine cholestérol acyl transférase LCAT...), les inhibiteurs d'enzyme (al-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteur de protéase virale, PAI-1 pour plasminogen activator inhibitor), les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I
ou II

ou polypeptides agissant sur (expression des gènes correspondants, les polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement, les polypeptides agissant positivement ou négativement sur l'apoptose (Bax" Bcl2, BcIX...), les agents cytostatiques (p21, p 16, Rb), les 5 immunoglobulines en totalité ou en partie (Fab, ScFv...), les toxines, les immunotoxines, les apolipoprotéines (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), les inhibiteurs d'angiogénèse (angiostatine, endostatine...), les marqueurs (ji-galactosidase, luciférase....) ou tout autre polypeptide ayant un effet thérapeutique pour l'affection ciblée.
10 Plus précisemment, dans le but de traiter un dysfonctionnement héréditaire, on utilisera une copie fonctionnelle du gène défectueux, par exemple un gène codant pour le facteur VIII ou IX dans le cadre de (hémophilie A ou B, la dystrophine (ou minidystrophine) dans le cadre des myopathies de Duchenne et Becker, l'insuline dans le cadre du diabète, la protéine CFTR (Cystic Fibrosis 15 Transmembrane Conductance Regulator) dans le cadre de la mucoviscidose.
S'agissant d'inhiber (initiation ou la progression de tumeurs ou cancers, on mettra de préférence en oeuvre un gène d'intérêt codant pour un ARN anti-sens, un ribozyme, un produit cytotoxique (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique, produit des gènes de levure 20 FCYI et FURI codant pour l'uracyle phosphoribosyl transférase et la cytosine désaminase.....), une immunoglobuline, un inhibiteur de la division cellulaire ou des signaux de transduction, un produit d'expression d'un gène suppresseur de tumeur (p53, Rb, p73, DCC....), un polypeptide stimulateur du système immunitaire, un antigène associé à une tumeur (MUC-1, BRCA-l, antigènes précoces ou tardifs 25 (E6, E7, Ll, L2...) d'un virus à papillome HPV....), éventuellement en combinaison avec un gène de cytokine. Enfin, dans le cadre d'une thérapie anti-HIV, on peut avoir recours à un gène codant pour un polypeptide immunoprotecteur, un épitope antigénique, un anticorps (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195), le domaine extracellulaire du récepteur CD4 (sCD4 ; Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86) une immunoadhésine (par exemple un hybride CD4-immunoglobuline IgG ; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531 ; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670), une immunotoxine (par exemple fusion de l'anticorps 2F5 ou de l'immunoadhésine CD4-2F5 à l'angiogénine ; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5 5494-5499), un variant trans-dominant (EP 0614980, W095/16780), un produit cytotoxique tel que l'un de ceux mentionné ci-dessus ou encore un IFNa, ou Vii.
Un des gènes d'intérêt peut également être un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées ou transduites. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une 10 résistance à l'antibiotique 6418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT
(Chloramphenicol Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme de l'art.
Par ailleurs, la cassette d'expression du gène d'intérêt peut, en outre, 15 inclure des éléments additionnels améliorant son expression ou son maintien dans la cellule hôte (origines de réplication , éléments d'intégration dans le génome cellulaire, séquences introniques, séquences poly A de terminaison de la transcription, leaders tripartites...). Ces éléments sont connus de l'homme de l'art.
En outre, le gène d'intérêt peut également comporter en amont de la région 20 codante une séquence codant pour un peptide signal permettant sa sécretion de la cellule hôte. Le peptide signal peut être celui du gène en question ou hétérologue (issu d'un gène quelconque sécrété ou synthétique).
La cassette d'expression du gène d'intérêt peut être insérée à un endroit quelconque du génome adénoviral. Avantageusement, elle est introduite en 25 remplacement de la région E3. Lorsque le vecteur adénoviral recombinant comporte plusieurs gènes d'intérêt, ceux-ci peuvent être placés sous le contrôle des mêmes éléments génétiques (cassette polycistronique utilisant un site interne d'initiation de la traduction de type IRES pour réinitier la traduction du second cistron) ou d'éléments indépendants. Dans ce cas, ils peuvent être insérés dans une même région adénovirale (par exemple en remplacement de E3) ou dans des régions différentes (par exemple en remplacement de E3 et d'une autre région délétée).
Dans le cadre de la présente invention, l'expression du gène d'intérêt est 5 contrôlée par un promoteur inductible par un activateur transcriptionnel tel que défini ci-avant. Au sens de la présente invention, un promoteur inductible comprend au moins une séquence cible répondant à l'activateur transcriptionnel mis en oeuvre et associée de manière opérationnelle à un promoteur minimal.
Les séquences cibles ont été définies auparavant et sont décrites dans la littérature 10 accessible à l'homme de l'art (pour rappel, ERE, GI:tE, EcRE, UAS, SxE/GRE, XRE...). On indique que l'on peut employer une séquence homologue modifiée par rapport à la séquence native mais exerçant une fonction de régulation similaire ou améliorée. Ces modifications peuvent résulter de l'addition, de la délétion et/ou de la substitution d'un ou plusieurs nucléotides ou de fusion entre deux séquences 15 cibles différentes. On peut mettre en oeuvre une ou plusieurs séquences cibles, par exemple de 1 à 25, avantageusement de 1 à 10 et, de préférence, de 1 à 7, éventuellement placées en tandem et dans une orientation quelconque par rapport à la TATA box. Elles) est (sont) généralement insérées) dans le promoteur inductible en amont du promoteur minimal, jusqu'à plusieurs centaines de paires 20 de bases de celui-ci. Un exemple de promoteur inductible par un activateur transcriptionnel dérivé du GR, est le LTR du virus MMTV (mouse mammary tumor virus) qui contient l' élément GRE et des séquences promotrices adéquates.
Un promoteur minimal comprend essentiellement une TATA box et un site d'initiation de la transcription fonctionnels dans une cellule ou un organisme hôte.
25 Ces éléments sont classiques dans le domaine de l'art concerné. On peut citer plus particulièrement les promoteurs minimaux des gènes TK, CMV et HSP (promoteur minimal du gène de protéine de choc thermique de drosophile dépourvu de l'enhancer).
En outre, le promoteur inductible en usage dans le cadre de la présente invention peut comporter des éléments supplémentaires améliorant le niveau de transcription ou le limitant à certains tissus particuliers (de type enhancer). Ces éléments supplémentaires peuvent de manière alternative être insérés dans une région génique non codante.
5 Selon un premier mode de réalisation, les séquences nucléotidiques codant pour l'activateur transcriptionnel et leurs éléments de régulation sont portées par le vecteur adénoviral recombinant du système d'expression selon l'invention.
Les cassettes d'expression du gène d'intérêt et de l'activateur transcriptionnel peuvent être localisées dans la même région du génome adénoviral ou en des endroits 10 différents et en orientation sens ou anti-sens l'une par rapport à l'autre.
L'orientation anti-sens est préférée. Un exemple préféré est fourni par un vecteur El' E3- dans lequel chacune des cassettes est insérée à la place des séquences adénovirales délétées.
Selon une autre variante, les séquences nucléotidiques sont portées par un 15 vecteur d'expression indépendant autre que le vecteur adénoviral recombinant en usage dans le système d'expression selon l'invention. Il peut s'agir d'un vecteur synthétique (lipides cationiques, liposomes polymères ...), d'un plasmide ou encore d'un vecteur viral. Il peut être éventuellement associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle edou la stabilité du vecteur. Ces substances 20 sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art (voir par exemple Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 11 S-121 ;
Hodgson et Solaiman , 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342 ; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides notamment cationiques, de liposomes, de 25 protéines nucléaires ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc...) et des lipides neutres (DOPE).
Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. II peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre 5 d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagène), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de replication assurant l'initiation de la replication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par 10 exemple, on retiendra l'origine ColEl pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/BBNAl si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, Lupton et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542 ;
Yates et al., Nature 313, 812-815). II peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées 15 (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à
un antibiotique...). Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire).
20 S'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un vines associé à l'adénovirus (AAV), d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un parvovirus, d'un poxvirus (fowlpox, canaripox, virus de la vaccine notamment de la souche MVA (Modified Virus Ankara) ou Copenhagen... etc) ou d'un foamyvirus. On aura de préférence recours à un 25 vecteur non réplicatif et, éventuellement, non intégratif.
Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour l'application cancer. Un vecteur rétroviral convenant à la mise en oeuvre de la présente invention comporte les séquences terminales LTR, une région d'encapsidation et les séquences nucléotidiques codant pour l'activateur transcriptionnel dont l'expression est contrôlée par le promoteur rétroviral (dans le LTR 5') ou par un promoteur interne tel que cité ci-dessus. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (marin, primate, felin, humain etc...) et en 5 particulier du MoMuLV (Moloney marine leukemia virus), MVS (Marine sarcome virus) ou Friend marine retrovirus (Fb29). II est propagé dans une lignée d'encapsidation capabie de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + ~-12 etc...). Le vecteur 10 rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTRs (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes françaises 94 08300 et 97 05203).
15 Un vecteur adénoviral convient tout particulièrement pour l'expression de l'activateur transcriptionnel envisagé dans le cadre de la présente invention.
On aura de préférence recours à un vecteur défectif ayant l'une des caractéristiques précitées. En particulier, les vecteurs adénoviraux recombinant (portant la cassette d'expression inductible du gène d'intérêt) et indépendant (portant la cassette 20 d'expression de l'activateur transcriptionnel) sont de préférence tous deux déficients pour la fonction E 1 par délétion de tout ou partie de la région E
1 ou mutation non fonctionnelle. Le cas échéant, l'un ou l'autre ou les deux peuvent être en outre déficients) pour au moins l'une des fonctions E2, E4, Ll, L2, L3, L4 et/ou L5. De même, une délétion de tout ou partie de la région E3 peut être 25 envisagée pour l'un ou les deux vecteurs.
Selon un mode de réalisation avantageux, les vecteurs viraux (vecteur adénoviral recombinant et, le cas échéant, ledit vecteur viral indépendant) faisant partie du système d'expression selon l'invention peuvent être sous la forme de vecteur ADN ou de particule virale infectieuse.

La présente invention concerne également un vecteur adénoviral recombinant comprenant (i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur 5 expression dans une cellule ou un organisme hôte, et (ü} un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
Le vecteur adénoviral recombinant selon l'invention peut coder pour un activateur transcriptionnel ayant les caractéristiques définies auparavant qui, sous 10 forme activé par un inducteur tel que décrit précédemment, a la capacité
d'initier ou d'activer la transcription d'un gène contrôlé par un promoteur inductible comprenant une séquence cible spécifique dudit activateur transcriptionnel telle que décrite ci-dessus.
De manière alternative, le vecteur adénoviral recombinant selon l'invention 15 peut coder pour un activateur transcriptionnel procaryotique et, notamment, un polypeptide comprenant un DLL et un domaine de liaison à l'ADN dérivé d'un répresseur de l'opéron tétracycline (tetR) et un domaine d'activation de la transcription quelconque. II s'agit de préférence du polypeptide désigné dans ia littérature <ctrans-activateur tétracycline» tTA (Gossen et Bujard, 1992, Proc. Natl.
20 Acad. Sci. USA 89, 5547-SS1) dans lequel le tetR isolé du transposon TnlO
est fusionné en phase aux 130 acides aminés C-terminaux de la protéine virale VP16.
Dans ce cas, on mettra en oeuvre un inducteur non naturel activant le tTA, tel que la doxycycline, la tétracycline ou un analogue agoniste. Bien entendu, les caractéristiques de ia cassette d'expression inductible du gène d'intérêt sont les 25 mêmes que précédemment, mis à part la présence d'une ou plusieurs séquences) cibles) répondant à l'activateur transcriptionnel procaryotique. S'agissant de tTA, la séquence cible est constituée par l'opérateur tétracycline (tet0). Dans le cadre de la présente invention, on préfère tout particulièrement la combinaison "tet O -promoteur minimal" donnant lieu à un promoteur dont le niveau de base de la transcription est naturellement très faible mais activable par l'inducteur tTA
et répressible par la tétracycline.
ll n'est pas nécessaire de revenir sur le squelette du vecteur adénoviral recombinant selon l'invention dans la mesure où il répond aux caractéristiques déjà
5 mentionnées.
La présente invention concerne également une particule virale infectieuse comprenant un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention.
Les techniques de préparation des vecteurs adénoviraux sont largement documentées dans la littérature. Dans un premier temps, le génome est reconstitué
10 par recombinaison homologue dans la lignée 293 (voir notamment Graham et Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocole ; Ed E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ) ou dans Escherichia coli (Chantier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810 ;
W096/17070). Il est ensuite nécessaire de propager le vecteur afin de constituer 15 un stock de particules virales le contenant. On utilise à cet effet des lignées de complémentation fournissant en crans les produits d'expression viraux pour lesquels le vecteur est defectif. Par exemple, les virus délétés de E 1 peuvent être propagés dans la lignée 293, établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). Pour ce qui est des 20 vecteurs de seconde génération, on peut avoir recours à des lignées complémentant deux fonctions virales essentielles, telles que celles décrites par Yeh et al.
(1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak et Graham (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995 Gene Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J.
Virol.
72, 2022-2033) et dans les demandes internationales W094/28152 et 25 W097/04119. Une autre alternative repose sur l'emploi d'un élément viral supplémentaire, désigné "virus auxiliaire" pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives d'un vecteur adénoviral recombinant. Les virus auxiliaires de l'art antérieur consistent en un génome adénoviral, éventuellement délété
d'une région essentielle pour laquelle le vecteur recombinant ne nécessite pas de complémentation.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale, selon lequel (i) on introduit un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention dans 5 une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée, (ü) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite 10 particule virale, et (iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
Bien entendu, la particule virale peut être récupérée du surnageant de culture mais également des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation 1 S pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifi.~gation notamment à travers un gradient de chlorure de césium...).
La présente invention concerne également une cellule eucaryote comprenant un système d'expression inductible, un vecteur adénoviral recombinant 20 selon l'invention ou infectée par une particule virale selon l'invention.
Aux fins de la présente invention, une telle cellule est constituée par toute cellule transfectable par un vecteur ou infectable par une particule virale, tels que définis ci-avant. Une cellule de mammifère et notamment humaine convient tout particulièrement. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine quelconque, notamment 25 hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), muscuïaire (cellule satellite, myocyte, myoblaste, muscle lisse...), cardiaque, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique un système d'expression inductible, un vecteur adénoviral recombinant, une particule virale ou une cellule hôte seion l'invention en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique (y compris 5 immunothérapie) et s'adresse plus particulièrement aux maladies prolifératives (cancers, tumeurs, dysplasies...etc), aux maladies infectieuses et notamment virales (induites par les virus de l'hépatite B ou C, le HIV, l'herpès, les rétrovirus....etc), aux maladies génétiques (mucoviscidose, myopathies, hémophilie, diabète...) et aux maladies cardiovasculaires (resténose, ischémie, dislipidémie...).
10 Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle en vue d'une administration par voie locale, parentérale ou digestive. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Les voies d'administration envisageables sont multiples. On peut 15 citer par exemple la voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale, intrapulmonaire ou intratrachéale. Pour ces trois derniers modes de réalisation, une administration par aérosol ou instillation est avantageuse.
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois 20 après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et les doses de virus appropriées varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu, de la pathologie, du gène d'intérêt à transférer, de la voie d'administration.
A titre indicatif, les préparations à base de particules virales peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 10'4 ufp (unités formant des plages), 25 avantageusement 105 et 1013 ufp et, de préférence, 106 et 1012 ufp. Lorsque l'on met en oeuvre un ou des vecteur(s), des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, 0,5 à 5 mg peuvent être envisagées.

La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un S
excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même que des agents de solubilisation, de stabilisation, de préservation. Une composition préférée est sous forme injectable. Elle peut être formulée en solution aqueuse, saline (phosphate, monosodique, disodique, magnésium, potassium....) ou isotonique.
Elle peut être présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche (poudre, lyophilisat...) susceptible d'être reconstituée de manière extamporanée par un diluant approprié.
La présente invention est également relative à l'utilisation thérapeutique ou 10 prophylactique d'un système d'expression inductible, d'un vecteur adénoviral recombinant, d'une particule virale ou d'une cellule hôte selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au transfert et à l'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte et, en particulier, au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique. Selon une première possibilité, le 15 médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde appropriée...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules 20 musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient après une étape d'amplification éventuelle.
La prévention et le traitement de nombreuses pathologies peuvent être envisagés.
Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers, tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée. Parmi les applications 25 envisageables, on peut citer les cancers du sein, de l'utérus (notamment ceux induits par les papillomas virus), de la prostate, du poumon, de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'oesophage, du larynx du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie etc...). Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles lisses de la paroi vasculaire (resténose). Enfin pour ce qui est des maladies infectieuses, l'application au SIDA peut être envisagée.
L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement des 5 maladies par thérapie génique, caractérisée en ce que i'on administre à un organisme ou à une cellule hôte ayant besoin d'un tel traitement un système d'expression inductible, un vecteur adénoviral recombinant, une particule virale ou une cellule hôte selon l'invention.
Enfin, l'invention concerne également un activateur transcriptionnel 10 comprenant un DLL et un domaine de trans-activation dérivé d'un récepteur stéroïdien et un domaine de liaison à l'ADN hétérologue, notamment dérivé de la protéine de levure Gal4. Un tel activateur transcriptionnel est obtenu en échangeant par les techniques de biologie moléculaire le domaine de liaison à l'ADN du récepteur stéroïdien par celui de Gal4 (en particulier porté par les résidus 1 à 74).
15 Un hybride ERT ou GRd°" et Gal4 est tout à fait préféré.
On indique que l'ensemble des dénominations utilisées dans la présente demande sont conventionnelles dans le domaine de l'art et que la portée inclut aussi les équivalents fonctionnels, c'est à dire tout polypeptide, domaine, gène, composé obtenu par modification d'un polypeptide, domaine, gène, composé natif 20 et présentant une activité de même nature, voire sensiblement augmentée.
La Figure 1 est une représentation schématique de la quantité de FIX
produite 144 h après transfection transitoire des cellules 293 par les plasmides pTG13064 (CMV-GRde"), pTG6242 (LTR MMTV-FIX, sens) et pTG13063 (LTR
25 MMTV-FIX, anti-sens).
La Figure 2 : Évaluation de l'effet Dose / Réponse Dexaméthasone dans des cellules A549. L'infection des cellules est réalisée avec une MOI = 50 avec AdTG13092 ou AdTG13088. L'induction par la dexaméthasone est réalisée en faisant varier la concentration de 10'9 à 10''M.
La Figure 3 : Représentation schématique des constructions AdTG13075, AdTG13088, AdTG13092 et AdTG13245.
La Figure 4 (a, b, c et d) : Evaluation in vivo du système inductible Grdex 5 / Dexaméthasone avec les différentes constructions testées dans les souris C57B1/6. Les valeurs présentées sont les moyennes des valeurs mesurées dans chacune des souris traitées.
La Figure 5 (a, b, c et d) : Evaluation in vivo du système inductible Grdex Dexaméthasone avec les différentes constructions testées dans les souris SCòD.
10 Les valeurs présentées sont les moyennes des valeurs mesurées dans chacune des souris traitées.
La Figure 6 : Evaluation d'un effet Dose / Réponse Dexaméthasone in vivo dans des souris SCID.
La Figure 7 : Représentation schématique de vecteurs adénoviraux dérivant 15 du plasmide pTg6401 de première et de deuxième générations.
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES
20 Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ou une édition plus récente) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de clonage sont réalisées 25 dans les souches E. coli SK (hsdR, mcrA), DHSa [(recAl, endAl, hodRl7 (r-m-), supE44 thi-1, gyrA (nalr)] ou NM522 (supE, thi, (lac-proAB), OhsdS, (r-m-), (F' proAB, lacIq, ZOM15) et celles de recombinaison homologue dans la souche E.
coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN
polymérise I d'E. coli (Klenow, Boehringer Mannheim). Les fragments d'ADN
sont purifiés à l'aide du kit de purification d'ADN GeneCleanllR (BiolOlInc.).
Par 5 ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, on a recours aux lignées 10 cellulaires 293 (Graham et al, 1977, supra ; disponible à l'ATCC sous la référence CRL1573), A549 E1+ (WO94/28152), A549 (ATCC CCL-185) et Vero (ATCC
CCL-81). Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées. Les cellules sont maintenues en culture à 37°C en atmosphère humide enrichie à 5% de COZ dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagie Medium, Gibco BRL) 15 complémenté avec 1 mM de glutamine, 1% d'acides aminés (Gibco BRL), 40pg/1 de gentamycine et 10% de sérum de veau foétal (SVF,Gibco BRL). La transfection et la transduction des cellules est réalisée selon les techniques de l'art (précipitation au phosphate de calcium...) 20 EXEMPLE 1 . Construction d'un vecteur adénoviral co-exprimant l'activateur transcriptionnel ERT et le gène FIX régulé par les séquences ERE.
L'ADNc du gène sauvage ER est contenu dans le plasmide pSGI-HEO
25 (Tors et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989). Le domaine de liaison aux oestrogènes du récepteur ER (fragment BamHI XbaI) est remplacé par celui du mutant ERT
(G521R) porté par le fragment NotI-XbaI de pCre-ERT (Feil et al., 1996, Proc.
Natl. Aca.d. Sci. USA 93, 10887-10890). Les séquences ERT sont insérées dans le site EcoRI du vecteur de transfert pTG6600. A titre indicatif, pTG6600 est un vecteur p polyII (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) dans lequel sont insérées les séquences Ad5 1 à 458, le promoteur précoce CMV, les séquences d'épissage hybrides trouvées dans le plasmide pCI (Promega Corp, comprenant le site 5 donneur d'épissage de l'intron 1 du gène ~i-globine humaine et le site accepteur d'épissage du gène d'immunoglobuline de souris), les séquences de polyadénylation du virus SV40 et les séquences Ad5 3328-5788. Une telle construction est à la portée de l'homme de l'art. Le vecteur ainsi obtenu pTG6237 contient la cassette d'expression CMV-ERT présente dans la région E1. La 10 construction finale désignée pTG6246 est reconstituée par recombinaison homologue (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810) entre le fragment Pacl Bst EII isolé du vecteur précédent et pTG4656 linéarisé par CIaI. Ce dernier est un plasmide adénoviral E1- E3- contenant dans E1 Ie gène LacZ sous le contrôle du promoteur MLP (décrit dans la demande FR97 06757). Ainsi le génome 15 adénoviral porté par pTG6246 comprend la cassette CMV-ERT dans la région E1 et est délété de la région E3.
L'ADNc du FIX humain (Anson et al, 1984, EMBO J. 3, 1053-1060) est cloné sous forme d'un fragment BamHI isolé d'un plasmide de l'art antérieur (par exemple décrit dans le brevet 88 14635) et inséré en aval du promoteur minimal 20 TK-HSV précédé de la séquence ERE (Klein-Hitpass et al., 1986, Cell 46,1053-1061). La cassette est introduite dans le site BgIII de pTG4664 en orientation sens et antisens (donnant respectivement pTG13227 et pTG13228). Le plasmide pTG4664 comprend les nucléotides 25838 à 320004 de l'Ad5 délétés des nucléotides 27871 à 30748 de la région E3. Une recombinaison homologue avec 25 le plasmide pTG6401 digéré par SfrI (comportant le génome Ad5 délété des régions E1 et E3) permet de générer les vecteurs adénoviraux E1- E3- portant la cassette inductible ERF./TKp-FïX en orientation sens et antisens dans la région E3.
La construction sens (correspondant au sens de transcription de E3) est dénommée pTG13235 et la construction anti-sens pTG13236.
Les vecteurs doublement recombinants contenant les cassettes d'expression CMV-ERT et EREfTKp-FIX à la place des régions E1 et E3 respectivement sont générés par recombinaison homologue entre les fragments portant la cassette 5 inductible FIX isolés des vecteurs pTG13227 et pTG13228 et le vecteur pTG6246.
On obtient pTG13233 et pTG13234 selon l'orientation de la cassette inductible.
EXEMPLE 2 . Construction d'un vecteur adénoviral co-exprimant l'activateur transcriptionnel GRde= et le gène FIX régulé par 10 les séquences GRE.
L'ADNc du récepteur GRdex porté par le fragment EcoRI (2,7Kb) du plasmide pHGl (Kumar et al., 1987, Cell Sl, 941-951) est cloné dans le site EcoRI
du vecteur pTG6600, pour donner pTG13064. Le vecteur adénoviral pTG13075 15 contenant la cassette d'expression CMVp-GRdex en remplacement de la région EI
et délété de la majorité de la région E3 est obtenu par recombinaison homologue entre le fragment Pacl Bst EII isolé du vecteur précédent et pTG4656 linéarisé
par CIaI.
Le fragment BamHI contenant l'ADNc du FIX humain est inséré en aval 20 du LTR de MMTV contenant la séquence GRE (Cato et al., 1986, EMBO J. S, 2237-2240). La cassette est ensuite introduite en orientation sens et antisens dans le site BgIII de pTG4664 bordant les séquences E3 délétées. Les vecteurs de transfert sont désignés pTG6242 (sens) et pTG13063 (anti-sens). Une recombinaison homologue avec le plasmide pTG6401 digéré par SfrI (comportant 25 Ie génome adénoviral délété des régions E1 et E3) permet de générer les vecteurs adénoviraux E1' E3' portant la cassette inductible LTR MMTV-FIX en orientation sens et antisens dans la région E3. La construction sens (identique au sens de transcription de E3) est dénommée pTG13082 et la construction anti-sens pTGI 3088.
Une recombinaison homologue avec le plasmide pTG13075 permet de générer les vecteurs adénoviraux E l' E3' portant la cassette inductible LTR
MM'TV-FIX en orientation sens et antisens dans la région E3 et la cassette CMV-5 GRd"'' dans la région E1. La construction sens (identique au sens de transcription de E3) est dénommée pTG13083 et la. constriction anti-sens pTG13092 (sens de transcription inverse pour les cassettes FIX et GRdex)_ EXEMPLE 3 . Construction d'un vecteur adénoviral co-exprimant 10 l'activateur transcriptionnel VgEcR et le gène FIX régulé par tes séquences 5zE/GRE.
Le plasmide pVgRXR (In Vitrogen) comprend les deux sous-unités composant l'activateur transcritionnel activable par l'ecdysone ou son analogue 15 muristérone A. La première est composée du récepteur de l'ecdysone (VgEcR) modifié au niveau de trois acides aminés du domaine de liaison à l'ADN de façon à obtenir une séquence analogue à celle du récepteur GR et fusionné en phase au domaine de trans-activation de VP16 et la seconde du récepteur de l'acide rétinoïque humain RXR (No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-20 3351). Les deux ADNc codant pour VgEcR et RXR dirigés par les promoteurs CMV et RSV respectivement sont modifiés par introduction d'un intron en 5' des séquences codantes (intron de pCI pour CMVp-VgEcR et intron (3-globine de lapin pour RSVP-RXR) et sont introduits dans la région El d'un vecteur adénoviral selon la technique précédente.
25 Les séquences codant pour le FIX humain sont introduites en aval d'un promoteur inductible comprenant la séquence cible SxE/GRE couplée au promoteur minimal ~hsp (pIND ; In Vitogen). Comme précédemment, la cassette est introduite dans les deux orientations dans le site BgIII de pTG4664. La recombinaison homologue avec pTG6401 digéré par SfrI permet de générer les plasmides portant la cassette inductible dans la région E3 en orientation sens ou ante-sens.
On obtient le vecteur adénoviral doublement recombinant par S recombinaison homologue avec le vecteur de transfert contenant les séquences VgEcR et RXR.
EXEMPLE 4 : Production des adénovirus.
10 Les vecteurs adénoviraux recombinants contenant les cassettes d'expression des activateurs et/ou du FIX sont libérés des plasmides correspondants (pTG13083, pTG13092, pTG13233, pTG13234...) par digestion PacI avant d'être transfectés dans la lignée de complémentation 293. Le lysat cellulaire est récolté, soumis à trois étapes successives de 15 congélation/décongélation afin de libérer les particules virales puis clarifié par centrifugation à 3500 rpm pendant 5 min. Les virions présents dans le surnageant peuvent être éventuellement amplifiés par passage sur une lignée permissive (293 ou A 549-E1+) et purifiés sur gradient de chlorure de césium selon les techniques de l'art. Le stock adénoviral est dialysé dans un tampon de formulation approprié
20 tel que décrit dans W098/02522 (par exemple saccharose 1M, NaCI 150 mM, MgCl2 lmM, Tris-HCI 10 mM et Tween 80 0,1 %). Le titre viral est déterminé en unités infectieuses par dosage de la protéine DBP par immunoffuorescence (L,usky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2032) ou en nombre de particules virales par mesure spectrophotométrique à 260 nm.
25 Un vecteur contrôle est construit en insérant l'ADNc du facteur IX humain sous le contrôle du promoteur CMV isolé du plasmide pCI (Proméga). La cassette d'expression constitutive est introduite dans la région E3, donnant pTG13231 (orientation sens) et pTG13232 (orientation anti-sens). Les virions sont produits selon la même méthodologie que ci-dessus.
Une recombinaison homologue entre les plasmides pTG13231 et pTG13232 et le plasmide pTG6401 linéarisé par Srfl permet d'obtenir respectivement les plasmides pTG13244 et pTG13245 portant la cassette 5 d'expression constitutive CMV-FIX en orientation sens et antisens dans la région E3.
EXEMPLE 5 : Evaluation in vitro du système inductible par GRdei.
10 Les vecteurs de transfert pTG13064, pTG6242 et pTG13063 portant respectivement les cassettes CMV-GRdeX, LTR MMTV-FIX (sens) et LTR
MMTV-FIX (anti-sens) sont transfectées de manière transitoire dans les cellules 293 (Spg d'ADN pour 106 cellules). En outre, le plasmide pTG13064 est co-transfecté avec soit pTG6242 ou pTG13063. Les cultures sont poursuivies en 15 présence de dexaméthasone (10~ M) ou en son absence. Les surnageants cellulaires sont prélevés 48, 96, 120 et 144 heures après transfection et la quantité
de FIX produite est déterminée par ELISA (kit Asserachrom ; Diagnostica Stago).
Les résultats présentés dans la Figure 1 montrent une induction de la production de FIX en présence de l'activateur GRdeX activé par la dexaméthasone. Le 20 récepteur exprimé par pTG13064 est donc fonctionnel dans la mesure où à
l'état activé (en présence de dexaméthasone), il peut se fixer sur les motifs GRE du MMTV et induire la transcription du gène FIX. L'activité basale du système est très faible. En effet, la quantité de FIX produite en l'absence de dexaméthasone ou de pTG13064 est faible, voire négligeable.
25 La cinétique d'expression du FIX en fonction du temps montre que le niveau de production maximal est atteint 120 h après la transfection. Au delà, la concentration stagne ce qui peut s'expliquer par l'état des cellules (à
confluence) et un appauvrissement du milieu et probablement en dexaméthasone.

L'efficacité du système a également été évalué par infection adénovirale en présence de dexaméthasone ou non. Les cellules hôtes non permissives Vero ou A549 sont infectées par les virions AdTG13083 ou AdTG13092 portant les cassettes CMV-GRd"' et MMTV-FIX (sens pour le premier virus et anti-sens pour 5 le second) ou co-infectées par les adénovirus AdTG13075 (CMV-GRdeX> et AdTG13082 (MMTV-FIX sens) ou AdTG13088 (MMTV-FIX anti-sens). On utilise une MOI (multiplicité d'infection) de 100 pour les expériences d'infection et 50 pour chacun des virus dans les cas de co-infection. La quantité de F1X
produite dans les surnageants de culture est dosée par ELISA.
10 Dans les cellules Vero, l'expression du FIX n'est quantifiable qu'après infection par les virions AdTG13092 portant les deux cassettes et en présence de l'inducteur. Aucune induction n'a lieu en absence de dexaméthasone ou du récepteur GRd"'. Il est à noter que ces cellules n'expriment pas le GR
sauvage.
En cellule A549, le FIX est produit en présence de dexaméthasone dans les 15 cellules infectées par AdTG13088 ou AdTG13092. II est à noter que ces cellules expriment le GR sauvage. Cependant le niveau de FIX est différé dans le temps en l'absence de GRd"' (virion AdTG13088).
En conclusion, le système inductible mettant en oeuvre le récepteur GRd' et la dexaméthasone est fonctionnel dans les constructions dans lesquelles la 20 cassette inductible MMTV-FIX est en orientation anti-sens (AdTG13088 et AdTG13092). Par ailleurs, le système d'induction en cis (cassettes portées par un seul virus) est sensiblement plus productif qu'un système en trans mettant en oeuvre deux virus, notamment dans les cellules Vero.
Par ailleurs, l'étude a été reproduite en faisant varier les MOI. Les cellules 25 Vero sont infectées par le virus AdTG13092 à une MOI de 10, 50 ou 100. A
titre de contrôle, on utilise l'AdTG13075. Le dosage du FIX est effectué 48 et 72 h après l'infection. On observe une production de FIX quelque soit la MOI
employée, mais le niveau optimal d'expression est obtenu pour une MOI de 50.

On a également fait varier la concentration en inducteur de 10-9 à 10-5 M.
A forte concentration, la dexaméthasone s'avère cytotoxique se traduisant par une moindre expression du FIX. A faible concentration (10-g M et au delà), l'induction n'est pas efficace. L'optimum se situe à 10-~ M.
S Une analyse de l'effet « dose-réponse » plus détaillée a été conduite en faisant varier la concentration en Dexaméthasone de 10'9 à 10-' M. Cette étude a été réalisée en cellules A549 exprimant le récepteur GR sauvage. Une activation peut par conséquent avoir lieu par le biais de ce récepteur activable par la Dexaméthasone. En réalité, on observe pour une concentration en Dexaméthasone 10 de 10-8 M, que l'expression du Facteur IX ne peut être induite qu'après infection par le vecteur AdTG13092 codant pour le récepteur modifié GRd°". Cette concentration est ailleurs trop faible pour permettre l'activation du récepteur GR
endogène (Figure 1). Par conséquent, nous avons montré que l'induction du gène rapporteur peut se faire de façon contrôlée et sélective, y compris en présence du 15 récepteur GR sauvage, en utilisant des doses de ligand plus faibles. Cet aspect est important en vue d'applications in vivo, conditions naturelles pour lesquelles le récepteur GR sauvage est exprimé.
EXEMPLE 6 : Evaluation in vivo du système inductible par GRdex.
Le virus AdTG13092 est injecté par voie intraveineuse à des souris immunocompétentes C57B1/6 à raison de 4x108 ou 8x108 ui. La dexaméthasone est administrée aux animaux par voie intrapéritonéale à une concentration de ltg pendant 3 jours consécutifs (à J0, J1 et J2). Les sérum sont prélevés régulièrement à partir du 3ième jour suivant l'infection et la quantité de FIX
produite est évaluée par ELISA. On observe dans ces conditions une production significative de FIX.

WO 00/12741 PCTlFR99/02051 EXEMPLE 7 : Evaluation in vivo du système inductibte GRdex dans des souris immunocompétentes.
Les virus AdTG13092, AdTG13088 et AdTG13245 sont injectés par voie 5 intraveineuse à des souris immunocompétentes C57BI/6 à raison de 5X108 iu.
Les virus AdTG13088 et AdTG13075 (Figure 3) sont également co-injectés à raison de SXlOg iu chacun.
La phase d'induction est réalisée en injectant par voie intrapéritonéale 100 p.g de Dexaméthasone pendant 3 jours consécutifs (à JO-JI-J2, J21-J22-J23 IO et J42-J43-J44).
Les sérums des souris traitées sont prélevés à différents temps afin d'évaluer la production du Facteur IX par la technique ELISA.
Les résultats (Figures 4a, b, c et d) montrent que - l'expression du gène rapporteur Facteur IX est induite par la 15 Dexaméthasone aussi bien après injection du vecteur AdTG13092 contenant la cassette d'expression du trans-activateur GRd"' ainsi que la cassette inductible MMTV-FIX, qu'après co-injection de deux vecteurs portant chacun l'une de ces cassettes d'expression ;
- l'expression du FIX est également induite par la Dexaméthasone après 20 injection du vecteur AdTG13088 seul. Dans ce cas, le niveau d'expression du FIX reste stable au cours des trois inductions. Cette induction est réalisée par le biais du récepteur GR sauvage, exprimé par les cellules murines et activable par la Dexaméthasone. Néanmoins, on peut noter qu'à la première induction, le niveau d'expression du FIX
25 est 10 fois inférieur à celui obtenu dans le cas des souris exprimant le récepteur modifié GRd"' .
- aucune expression n'est détectée en absence de Dexaméthasone, quel que soit le vecteur injecté. On peut valablement en conclure que les WO 00/12'741 PCT/FR99/02051 quantités de glucocorticoïdes endogènes sont trop faibles pour permettre l'activation du promoteur MMTV via le récepteur GR
sauvage ;
- en présence du récepteur modifié GRd"', le niveau d'expression du F1X
5 est comparable au promoteur constitutif CMV.
EXEMPLE 8 : Evaluation in vitro du système inductible par GRd°z dans des souris immunodéficientes.
10 Les virus AdTG13092, AdTG13088 et AdTG13245 (voir Figure 3) sont injectés par voie intraveineuse à des souris immunodéficientes scidlscid à
raison de 5X108 iu. Les virus AdTG13088 et AdTG13075 sont également co-injectés à
raison de SXlOg iu chacun. L'induction est réalisée en injectant par voie intrapéritonéale 100 pg de Dexaméthasone pendant 3 jours consécutifs (à JO-Jl-J2, 15 J21-J22-J23 et J42-J43-J44).
Les sérums des souris sont prélevés à différents temps afin d'évaluer la production du FIX par la technique ELISA.
Les résultats (Figures Sa, b, c et d) sont comparables à ceux observés dans le cas de souris immunocompétentes 20 - l'expression du FIX est induite après injection de Dexaméthasone chez les souris exprimant le récepteur modifié GRa"' (injection AdTG13092 ou AdTG13088+AdTG13075). Le niveau d'induction chute d'un log après la deuxième et la troisième injections de ligand, puis reste stable pendant la durée de l'expérience (7 mois). Les niveaux d'induction sont 25 comparables en cis (injection d'un vecteur adénoviral unique) et en trans (injection de deux vecteurs adénoviraux} ;
- l'expression du FIX est induite par la Dexaméthasone après injection du vecteur AdTG13088, par le biais du récepteur GR sauvage. Le WO 00/12741 PC'f/FR99/02051 niveau d'induction est stable au cours du temps ;
- aucune expression basale du FIX n'est détectée en absence de Dexaméthasone, quel que soit le vecteur injecté ;
- le niveau d'induction en présence du GRd~' est comparable à
S l'expression du gène liée au promoteur constitutif CMV (du moins lors de la première induction) ;
- des études complémentaires ont permis de montrer la présence de l'ADN viral par Southern blot, ainsi que l'expression du GRd"' par Northern blot, après injection du vecteur AdTG13092 ou AdTG13075 10 (au moins jusqu'à 56 jours après injection des vecteurs adénoviraux).
EXEMPLE 9 : Evaduation d'une dose-réponse in vivo dans des souris immunodéficientes..
15 Les vecteurs AdTG13092 et AdTG13088 sont injectés par voie intraveineuse à des souris immunodéficientes scidlscid à raison de 5X108 iu.
L'induction est réalisée en injectant par voie intrapéritonéale 50 ou 5 lzg de Dexaméthasone pendant 3 jours consécutifs (à JO-J1-J2 et J21-J22-J23). Les sérums sont prélevés à différents temps afin d'évaluer la production du FIX
par 20 ELISA.
Des études préalables ont permis de montrer que l'injection de 3X100 p,g, 3X50 pg ou 3X20 pg de Dexaméthasone permet d'obtenir des niveaux d'induction équivalents. Dans cette étude, les inventeurs ont identifié une dose de ligand permettant d'activer l'expression du gène rapporteur via le récepteur modifié
GRa"' 25 apporté par un vecteur adénoviral (AdTG13092), mais incapable d'activer cette expression par le biais du GR endogène (injection AdTG13088).
L'injection de 3X5 p.g de Dexaméthasone permet d'activer l'expression du FIX en présence du GRd"', mais est incapable d' activer cette expression par l'intermédiaire du GR endogène (Figure 6). Cette dose permet par conséquent d'activer l'expression du transgène de façon contrôlée et sélective, même en présence du récepteur sauvage.
5 EXEMPLE 10 : Mise au point d'un système d'ezpression inductible capable de prévenir le développement d'une réponse immunitaire après administration in vivo de vecteur adénoviral.
Les vecteurs adénoviraux représentent un système de choix pour transférer 10 un gène thérapeutique chez un patient. Cependant, l'expression du transgène est généralement transitoire. Pour cette raison, il est nécessaire de répéter les administrations du vecteur adénoviral afin d'assurer une expression prolongée du gène thérapeutique. Malheureusement, une première injection d'adénovirus entraîne fréquemment le développement d'une réponse immunitaire qui empêche 15 toute nouvelle administration. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont développé une nouvelle approche reposant sur l'expression d'une molécule immunosuppressive capable d'empêcher la mise en place de cette réponse immunitaire anti-adénovirus. Pour cela, les inventeurs ont inséré le gène codant pour l'interleukine-10 (IL,-10) dans un système d'expression inductible porté
par 20 un vecteur adénoviral. L'expression régulée et contrôlée de l'iL-10 permet ainsi la mise au point de protocoles pour lesquels la réadministration de vecteurs portant le gène thérapeutique est possible.
a) Implication de la réponse immunitaire dans la persistance des adénovirus 25 recombinants - Réponse immunitaire cellulaire Vecteur délété des régions EI et E3 L'importance de la réponse immunitaire a été mise en évidence lors d'expériences réalisées dans des souris immunocompétentes ou immunodéficientes (Yang Y., F. A. Nunes, K. Berencsi, E. E. Furth, E. Gijncz~l and J. M. Wilson.
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4407-4411). Ainsi, l'expression du gène rapporteur IacZ est transitoire après injection du vecteur adénoviral dans des souris immunocompétentes, mais stable dans des souris immunodéficientes. Ces études 5 suggèrent donc que les cellules transduites sont détnzites par les lymphocytes T
cytotoxiques (CTL). En outre, il a été montré que la génération des CTL est induite par les particules virales injectées, et non seulement par les protéines virales néo-synthétisées.
10 vecteur délété des régions El, E3 et E4 ou E2a Les délétions des régions E4 ou E2a font disparaître toute expression résiduelle de protéine virale. Toutefois, la toxicité n'est pas diminuée en éliminant la région E2a. Par contre la délétion de la région E4 conduit à une diminution significative de la toxicité hépatique après injection intraveineuse. Malgré
une 15 persistance de l'ADN, l'expression du transgène est toutefois souvent réduite de façon importante.
- Réponse immunitaire humorale Plus de 85% de la population mondiale est immunisée contre l'adénovinus 20 et possède des anticorps anti-adénovirus dirigés contre les sérotypes 2 ou 5. Si aucune ré-infection ne se produit, le titre en anticorps neutralisants chute pour atteindre un niveau indétectable au bout de 2 ans. Ces anticorps peuvent empêcher la fixation du virus sur le récepteur membranaire et sa translocation dans le cytoplasme.
25 Quelles que soient les délétions du génome adénoviral, le système immunitaire humoral est susceptible de reconnaître les protéines de la capside virale et de produire des anticorps neutralisants anti-adénovirus. Des stratégies d'immunosuppression sont donc requises pour permettre une réadministration.

b) Stratégie d'immunosuppression de la réponse immunitaire humorale L'interleukine-10 est connue pour avoir des propriétés immunosuppressives et a montré des résultats prometteurs dans le cas des rejets de greffe et dans des traitements anti-inflammatoires. L'IL-10 est secrétée par de 5 nombreuses cellules (monocytes / macrophages, cellules T, cellules B après activation par un antigène) et a de nombreuses cellules cibles (dont les monocytes / macrophages, les cellules B, les cellules T, les neutrophiles et les cellules endothéliales). Elle a un effet pléïotropique et possède des activités immunostimulatrices ou immunosuppressives selon le type cellulaire. Les 10 interleukines-10 humaine et de rat sont très homologues, 84 % d'homologie au niveau nucléotidique et 73% au niveau protéique.
L'II,-10 a un effet immunosuppresseur sur les monocytes/macrophages.
Elle inhibe la production des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines, ainsi que l'expression du CMH de classe II et des molécules de co-stimulation. Elle 15 limite aussi la durée de la réponse inflammatoire des granulocytes et des éosinophiles.
A l'opposé, l'IL-10 stimule la viabilité, la sécrétion d'anticorps et l'expression du CMH de classe II des lymphocytes B. Elle possède également un rôle de stimulation sur les mastocytes et sur les cellules T CD8+.
Globalement, l'IL-20 10 a toutefois un très fort effet immunosuppresseur.
Les propriétés anti-inflammatoires et immunosuppressives de l'II,-10 pourraient intervenir dans la suppression de la production d'anticorps neutralisants contre fadénovin.is recombinant. En effet, la co-injection d'adénovirus codant pour l'IL-10 et pour la ~i-galactosidase empêche l'induction de la réponse immunitaire 25 contre le virus et la production de CTL, permettant ainsi une expression prolongée du gène rapporteur .
Cependant, une immunosuppression prolongée est associée à des effets secondaires non négligeables il est donc souhaitable d'obtenir une immunosuppression de façon transitoire et régulable.

c) Système inductible selon l'invention Le système que nous avons développé est basé sur l'induction par les hormones. En effet, celles-ci vont se fixer sur leur récepteur nucléaire, constitué
5 d'un domaine de fixation à l'hormone, d'un domaine de fixation à l'ADN et d'un domaine de transactivation. Après changement conformationnel et fixation sur les éléments cibles localisés au niveau de l'ADN, la transcription du gène situé
en aval du promoteur régulable sera ainsi activée. Afin d'éviter toutefois l'activation par les hormones endogènes, éléments non contrôlables, les inventeurs ont choisi 10 d'utiliser des récepteurs modifiés au niveau du domaine de fixation à
l'hormone.
Ces récepteurs mutés tels que les récepteurs aux oestrogènes ou à la progestérone sont capables de répondre à des ligands exogènes synthétiques, mais pas aux hormones endogènes.
Les inventeurs ont développé un système basé sur le récepteur aux 1 S glucocorticoïdes modifié, GRd"', capable d'induire l'expression du transgène situé
en aval des éléments GRE (Glucocorticoïd Responsive Element) après activation par la dexaméthasone, mais pas pa.r les glucocorticoïdes endogènes. Au cours de cette étude, différents vecteurs adénoviraux exprimant fIL-10 de façon inductible ont été générés, afin d'évaluer leurs effets sur la réponse immunitaire anti-20 adénovirus.
d) Génération des vecteurs adénoviraux Tous les vecteurs adénoviraux dérivent du plasmide pTg6401 comportant le génome de l'adénovirus humain de type 5 délété des nucléotides 459 à 3327 25 (région )E1) et des nucléotides 28 592 à 30 470 (région )E3).
Insert en E1 : Le gène modifié GRd'~ est introduit dans la région El du génome de l'adénovirus de type 5 par recombinaison homologue entre le plasmide pTg6401 et le plasmide de transfert contenant l'ADNc GRd"' sous contrôle du promoteur CMV (Cytomegalovims), d'un intron chimérique (pCI; Promega) et d'un signal de polyadénylation du SV40.
Insert en E3 : L'ADNc de fIL-10 de rat (Feng L., W.W. Tang, J.C. Chang 5 and C.B. Wilson. 1993. Biochem. Biophys Res. Commun.. 192 :452-45) a été
obtenu par PCR inverse sur les ARNm totaux de cellules de rat au moyen des oligonucléotides OTG12237 (CTAGTCTAGA CCACCATGCT TGGCTCAGCA
CTGCT=SEQ ID N° 1) et OTG12243 (TTTATAGCGG CCGCTCAATT
TTTCATTTTG AGTG=SEQ ID N° 2), par 30 cycles de dénaturation (1 minute 10 à 95°C), hybridation des amorces (1 minute à 65°C) et extension (1 minute à
72°C). L'ADNc est placé en aval de 4 éléments de réponse aux glucocorticoïdes GRE (Glucocorticoïd Responsive Element) contenus dans le promoteur LTR du MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus). Cette cassette d'expression est introduite dans le plasmide de transfert délété de la région E3 dans l'orientation 15 anti-sens par rapport à la région E3 sauvage de l'adénovirus.
Une recombinaison homoiogue de ce vecteur de transfert avec les vecteurs adénoviraux Ad-GRd~' ou pTg6401 permet de générer respectivement soit un vecteur portant la cassette d'expression de l'activateur en E1 et la cassette inductible en E3 en orientation antisens (Ad-GRd"'-MMTV/IL,-10-E4 sauvage) soit 20 un vecteur contenant uniquement la cassette d'induction en E3 (Ad-DEl-MMTV/11,10-E4 sauvage).
L'ADNc de l'IL-10 de rat a également été placé sous contrôle du promoteur CMV. Cette cassette d'expression constitutive a été insérée dans la région E3 de pTg6401 en orientation antisens (Ad-DEI-CMV/11,10).
25 Toutes les constructions de deuxième génération sont obtenues par recombinaison homologue entre le plasmide de transfert contenant les cadres de lecture 3 et 4 (ORF3,4) de la région E4 et les vecteurs de première génération précédents.
L'ensemble des constructions de première et de deuxième générations sont illustrées dans la Figure 7.
e) Evaluation de l'expression de l'IL-10 in vitro Transfection transitoire dans des cellules 293 Les cellules 293 sont transfectées par les plasmides de transfert contenant les cassettes d'expression de l'interleukine-10 de rat en présence ou non de la cassette d'expression de l'activateur GRd"'. Elles sont mises en culture en présence ou non de dexaméthasone ( 10-' M) en DMEM 10% S VF. Les surnageants sont prélevés à différents temps afin d'analyser l'expression du transgène.

Validation in vitro des adénovirus recombinants dans des cellules A549 et IfERO
Les cellules A549 et VERO sont ensemencées la veule à 3.105 cellules dans des plaques de 6 puits. Les cellules sont infectées à une MOI de 50 avec les 15 différents préstocks viraux dans 250 pl DMEM 2% SVF. Après 30 minutes d'adsorption à 37°C, 3m1 de DMEM 2% SVF sont r'àjoutés sur les cellules en présence ou non de dexaméthasone 10-'M. Les surnageants sont prélevés à
différents temps afin d'analyser l'expression du transgène.
20 Quantification de 1 'expression de I 'IL-! 0 de rat par test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) La détection de l'IL-10 de rat est réalisée à l'aide du kit OptEIA~
(Pharmingen). Les kits sont utilisés selon les spécifications des fabricants.
L'induction de l'IL-10 par la dexaméthasone a été évaluée par transfection 25 transitoire des plasmides de transfert dans des cellule 293. La capacité
d'induction est analysée en co-transfectant le vecteur de transfert MMTV-IL10 avec ie vecteur exprimant le trans-activateur GRd'~. La transfection du plasmide MMTV-IL10 seul indiquera le niveau d'expression de l'IL-10 en absence du trans-activateur. De plus, le niveau d'induction est comparé à l'expression constitutive de l'IL-10 sous contrôle du promoteur CMV, en transfectant également ce plasmide dans les cellules 293. L'induction est réalisée en présence ou non de dexaméthasone à
une concentration de 10' M. Les surnageants de culture sont prélevés 72 et 120 heures après la transfection afin de quantifier l'IL-10 par kit ELISA . La co-transfection 5 des plasmides MMTV-IL,10 et GRd"' en présence de dexaméthasone permet l'induction de l'IL-10 (50 ng / ml à 120 H post-transfection).
Les inventeurs ont démontré que l'apport du trans-activateur GRd"' et du ligand dexaméthasone permet une induction de l'expression de l'IL,-10 sous contrôle du promoteur inductible MMTV.
10 L'efficacité d'induction de l'IL-10 par la dexaméthasone couplée au GRC"' a été évaluée in vitro par infection des cellules humaines A549 et des cellules simiennes VERO avec les vecteurs Ad-MMTV-IL10 ~ AdGRd"' ou Ad-GRd'~-MMTV-IL10. Ces deux types d'infection permettent d'évaluer l'efficacité
d'induction en trans ou en cis. Les cultures cellulaires sont réalisées en présence 15 ou non de dexaméthasone 10'' M. Les quantités d'IL-10 obtenues seront comparées à celle obtenues après infection par Ad-CMVIL-10 exprimant cette cytokine de façon constitutive. D'autre part, l'induction de l'IL,-10 est comparée à celle du facteur TX humain inséré dans les mêmes constructions, évaluées in vitro au préalable. Les surnageants sont prélevés à 24, 48, 72 et 96 heures post-infection 20 afin de quantifier l'IL-10 et le facteur IX produits, au moyen de kits ELISA .
En cellules VERO, l'expression de l'II,-10 est induite lorsque les cellules sont co-infectées par Ad-MMTV-IL10 + Ad-CMV-GRa"' en présence de dexaméthasone, pour atteindre 50,8 ng/ml 96 heures après infection. En absence du ligand, I'IL-10 est à peine détectable (1,2 ng/ml). Au contraire, en absence du 25 trans-activateur GRd~', aucune induction significative de l'expression de l'IL-10 ne peut être notée (3 ng/ml en présence de dexaméthasone, correspondant à
l'expression résiduelle obtenue en transfection transitoire ; 0,7 ng/ml en absence de dexaméthasone).
Les inventeurs ont donc pu démontrer qu'en cellules VERO, l'expression de l'IL-10 peut être induite par la dexaméthasone couplée au GRd"' en « trams », lorsque les deux cassettes d'expression sont portées par deux vecteurs adénoviraux différents.
En cellules AS49, ils ont également pu vérifier la fonctionnalité du système S inductible en « trans ». En effet, la concentration en IL-10 atteint 32,3 ng/ml en présence de dexaméthasone après co-infection par les vecteurs Ad-MMTV-IL,10 + Ad-CMV-GRd"'. En absence de ligand, la cytolcine est indétectable.
L'expression de l'IL-10 est également induite par la dexaméthasone après infection par le vecteur Ad-MMTV-IL10 seul. Cette activation se fait par le biais du récepteur GR
10 sauvage exprimé par les cellules A549.

LISTE DE SEQUENCES
<110> TRANSGENE
<120> SYSTEME D'EXPRESSION INDUCTIBLE
<130> D17688 <140>
<141>
<160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 35 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> OTG12237 <400> 1 ctagtctaga ccaccatgct tggctcagca ctgct 35 <210> 2 <211> 34 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> OTG12243 <220>
<400> 2 tttatagcgg ccgctcaatt tttcattttg agtg 34 -6-their ligand binding domains have also been described. So the ERT mutant obtained by substitution of glycine at position 521 of the ER receptor with a arginine, is unable to fix endogenous estrogens, but may be activated by synthetic ligands such as Tamoxifen, to activate transcription regulated 5 by the target sequence ERE (for estrogen responsive element). A variant analog was also built for the GR receiver, modified in position by replacing isoleucine with a threonine (Roux et al., 1996, Molecular Endocrynology 10, 1214-1226). This variant designated GRd "'is unable to fix the endogenous glucocorticoids, but can be activated by synthetic ligands such 10 than Dexamethasone. Once activated, it recognizes the GRE target sequence (for glucocorticoid responsive element; Cato et al., 1986, EMBO J. S, 2237-2240) and stimulates transcription of the promoter associated with it.
Another inducible expression system uses the steroid receptor insect responding to ecdysone (EcR). The receiver is activated by ecdysone and 15 forms a heterodimer with Drosophila Ultraspiracle Protein (USP) who attaches to a specific target sequence (EcRE for ecdysone responsive element) to activate transcription. No et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351) created a VgEcR mutant receptor obtained by fusion of the DLL of EcR receptor, a hybrid between the DNA binding domain of receptors 20 EcR and GR and the trans-activation domain of VP 16. The mutant can train, in presence of ecdysone or its muristone analog A, a heterodimer with protein USP or its human counterpart, the retinoic acid receptor X
(RXR), and activate the transcription of genes placed under the control of a sequence hybrid (5xE / GRE) comprising the motifs responding to the EcR and GR receptors.
Such a system avoids possible endogenous activation.
Another inducible expression system described in the literature highlights works immunophilins. Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032) have developed a two-component system assembled in the presence of a ligand.
More precisely, the first component is a fusion between the factor of -7_ transcription ZFHD1 (carrying a DNA binding domain) and immunophilin FKBP 12 and the second component is a fission between the trans-activation of factor NFxB p65 and FRAP (FKBP 12-rapamycin-associated protein). The trans-activator is activated in the form of a heterodimer associating the 5 two components and rapamycin linking the FKBP12 and FRAP portions which can induce the expression of a transgene placed under the control of target elements of ZFHD 1.
Finally, Dolwick et al. (1993, Mol. Phanma.col. 44, 911-917) identified the aryl hydrocarbon receptor (AhR) involved in the metabolism of xenobiotics 10 and man-made chemicals. The AhR, in the form inactive is complexed with various cellular factors including the chaperone protein hsp90.
The fixation of a xenobiotic ligand induces the dissociation of the complex, the translocation of AhR into the nucleus, the formation of a heterodimer with the Arnt protein (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator; Hoi ~ 'man and al., 1991, Science 252, 954-958). The fixation of the heterodimer on the elements targets of DNA called XRE (for xenobiotic responsive elements) induces the transcription of gene sequences downstream. XRE sequence is present in the promoter region of many genes encoding enzymes involved in drug metabolism, such as glutathione-S-transferase or cytochrome 20 P4501 Al. AhR and Arnt have an area responsible for recognition of the target sequence, heterodimerization and ligand binding. The majority of trans-activation studies through the AhR / Arnt complex uses the ligand 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) The present invention provides an inducible expression system using 25 uses an adenoviral vector comprising a gene of interest of which the expression is regulated by a trans-activator activatable by the supply of molecules exogenous pharmacological. This system is based more particularly on the use of a steroid receptor. Once activated, the complex receptor / ligand will bind to its target sequence and allow trans activation of _g_ expression of the therapeutic gene. We have now built a vector recombinant adenoviral containing, in place of the E1 region, a cassette expression of the mutant steroid GRde receptor "expressed so constitutive by the early cytomegalovirus (CMV) promoter and, in place of the S region E3, a human factor IX (FIX) gene expression cassette placed in downstream of the promoter of the MMTV virus (mouse mammary tumor virus) containing the GRE target sequence. The following experiments show the functionality of a such an inducible system in vitro and in vivo. Similarly, the receiver ERT a also been inserted into the E1 region of an adenovirus under the control of 10 CMV promoter. In this case, the inducible FIX gene cassette is regulated through the ERE sequence associated with the minimal promoter of the TK gene (thymidine kinase) HSV (herpes simplex virus). The third system studied in the framework of the present invention implements the modified VgEcR receptor and the receptor human RXR whose sequences have been introduced into the E1 region of a 15 adenovirus. The inducible cassette present in the E3 region places the cDNA
FIX
under the control of the SxE / GRE hybrid elements.
The purpose of the present invention is to remedy the drawbacks of current gene therapy vectors, in particular by improving the specificity (activation by non-toxic exogenous substances and not by factors 20 endogenous cells) and inducibility (basal activity in the absence inductor minimal and strong expression of the transgene in the activated state). The object of the present invention can be applied to various gene therapy protocols requiring expression of soluble molecules, such as anti-tumor molecules (antibodies, cytokines, chemokines) or in all cases where the expression of uncomfortable 25 therapy should be regulated according to the needs of the body. he allows also the analysis of genes whose expression is cytotoxic or reduced to certain stages of development.
This is why the present invention relates to an expression system.

inducible including (i) the nucleotide sequences coding for a transcriptional activator of eukaryotic or viral origin and placed under the control of the elements of regulation appropriate to their expression in a cell or organism host, and (ü) a recombinant adenoviral vector comprising a gene of interest placed under the control of an inducible promoter capable of being activated in trans by said transcriptional activator.
For the purposes of the present invention, the term "transcriptional activator"
10 defines a polypeptide or a set of polypeptides exerting an action positive on the transcription, i.e. having the capacity to initiate or stimulate the transcription of any gene from regulatory elements appropriate responding to said transcriptional activator. The positive effect on transcription is preferably mediated directly by the binding of the activator to the elements of 1 S regulation but can be indirectly via factors) cell (s). Preferably, a transcriptional activator is used ligand-dependent capable of binding a characteristic DNA sequence (target sequence) and activate the associated promoter. Such activators transcriptional are described in the state of the art. It also indicates that in the context of the 20 present invention, the transcriptional activator can be a polypeptide unique in the form of monomer or muitimer (preferably dimer) or else can result from the association of a set of polypeptides forming a heteromer (of preferably a set of two polypeptides forming a heterodimer).
The transcriptional activator in use in the present invention can be derivative 25 of any organism of eukaryotic or viral origin, in particular of a yeast, an insect, vertebrate or virus or may have a mixed origin it's at to say to be formed of components of various origins.
A transcriptional activator suitable for the implementation of this invention includes at least 3 types of functional areas, respectively a trans-activation domain, a DNA binding domain (target sequence) and a ligand binding domain (DLL). In the context of the present invention, the order of different areas is unimportant. In addition, they can be spread across the amino acid sequence continuously or discontinuously (with S possibly an overlap of the residues involved in each function) and localized on one or more polypeptides forming said activator transcriptional. Through elsewhere, it may include several areas of the same type. An example adequate is the heterodimer developed by Rivera et al. (1996, Nat.
Med. 2, 1028-1032) activated by the binding of rapamycin to the FKBP12 portions 10 and FRAP.
The term "ligand binding domain" refers to the portion of the transcriptional activator which interacts with a ligand-inducer appropriate.
DLL-inducer interaction places the transcriptional activator in state activated step necessary for transcriptional activation. The DLL is preferably located at The C-terminal end of or of a polypeptide composing said activator transcriptional.
The term "DNA binding domain" refers to the portion of the transcriptional activator that interacts with the target DNA sequence present within the inducible promoter controlling the expression of the gene of interest and 20 specific to the transcriptional activator chosen. Said target sequence East generally placed upstream of a promoter region containing at least one TATA box and is made up of patterns recognized by the transcriptional activator.
These patterns can form a particular structure (palindrome, repetitions in sense or reverse orientation ... etc). Target sequences adapted to each 25 transcriptional activators are described in the literature. For illustrate, we can to quote - the GRE target sequence (for glucocorticoid responsive element) with a recognized TGTTCT motif (or its complementary) by a DNA binding domain derived from the GR receptor or from a analog (GRa "'). A preferred example is the sequence 5'GGTACANNNTGTTCT3 'where N represents a nucleotide any;
- the ERE target sequence (for estrogen responsive element) with a 5'AGGTCA3 'motif (or its complementary) recognized by a DNA binding domain derived from the ER receptor or an analog (ERT). A preferred example is the sequence S'AGGTCANNNTGACC3 'where N represents a any nucleotide;
10 - the target sequence UAS (for upstream activating sequence) of sequence S 'CGGAGTACTGTCCTCCG3' (or its complementary) recognized by a DNA binding domain derived from the yeast Gal 4 receptor or the like;
- the EcRE target sequence (for ecdysone responsive element) 15 with a recognized GACAAG motif (or its complementary}
by a DNA binding domain derived from the EcR receptor or an analog. A preferred example is the sequence 5'GACAAGGGTTCAATGCACTTGTC3 ';
- the sequence SxE / GRE of sequence S'AGGTCA? ~ TAGAACA3 '(or 20 complementary) recognized by a DNA binding domain hybrid between EcR and GR or an analog, - the target sequence 5 'TAATTANGGGNG3' where N represents a any nucleotide recognized by the transcription factor 25 - the target sequence XRE (for xenobiotic responsive element) of sequence 5 'CCTCCAGGCTTCTTCTCACGCAACTCC3' recognized by a DNA binding domain derived from the receptor AhR or an analog.

The term "domain of trans-activatiom" refers to the portion of the transcriptional activator that interacts with cellular machinery to initiate or stimulate gene transcription dependent on the target sequence responding audit activator. This domain can come from a transcription factor classic S (NFxB, SP-1 ...) or a ligand-dependent factor (steroid receptor, immunophilin, AhR ...). A domain comprising the 130 amino acids C-VP 16 terminals are particularly suitable.
Trans-activation induced by the transcriptional activator in use in the scope of the present invention can be verified simply by techniques conventional, for example by following the expression of a given gene placed under control of the appropriate target sequence or the synthesis of its product expression (analysis according to Northern, Western, immunofluorescence ... etc) in presence of the receiver activated by the inductor. A detailed protocol is given in the examples below. A difference of a factor of at least 2, advantageously at least 5 and preferably at least 10 reflects the ability to trans-activation of the expression system according to the invention.
These definitions can be illustrated by the example of the GR receiver. His trans-activation domain is located in the N-terminal part between residues 272 and 400 (Jonat et al., 1990, Cell 62, 1189-1204), the binding domain to DNA
of 66 amino acids between residues 421 and 487 (Lucibello et al., 1990, EMBO
J.
9, 2827-2834) and the hormone ligand binding domain of about 300 acids amines in the C-terminal part (Kerpolla et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13, 3,791). The latter domain also includes the sequences responsible for the dimerization of GR, its nuclear localization and the interaction with protein hsp. Trans-activation is mediated by the binding of a receptor dimer to the GRE target sequence.
Advantageously, the transcriptional activator included in the system of inducible expression according to the invention comprises all or part of a domain derived from a steroid hormone receptor selected from the group consisting through estrogen (ER), glucocorticoid (GR), progesterone (PR) receptors, Vitamin D, ecdysone (EcR), mineralocorticoid, androgen, thyroid hormone, retinoic acid and retinoic acid X or an immunophilin or a aryl hydrocarbon (AhR) receptor.
In the context of the present invention, it is possible to implement a modified receiver. Advantageously, the modified receiver has lost its capacity activation by a natural inducer and acquired an activation capacity by a unnatural inducer and retains the trans-activation capacity of the receptor native.
Those skilled in the art know the modification (s) to be made in this regard.
They can be diverse (deletion, substitution and / or addition of one or more residues of the natural receptor) and concern one or more fields. Of way preferred, the modified functional domain has a sequence identity with its native equivalent of at least 70%, advantageously at least 80%, of preferably at least 90% and most preferably at least 95%.
15 According to a first embodiment, a modified receiver is used in its DLL so as to be activated by an unnatural inducer. Of preferred examples are the GRde '' (I747T) and ERT mutants (G521R) already cited.
One can also consider implementing an activator chimeric transcription comprising polypeptides or fragments various polypeptides. Advantageously, it results from fission or the association functional areas of different origins. Indeed, it is possible to change the functional areas between the different receptors and all combinations possible are within the scope of the present invention. For example, for reduce 25 interference with endogenous receptor / ligand complexes, one can consider to replace the DNA binding domain of a steroid receptor with that a non-human receptor (of viral or animal origin or of eukaryote inferior), for example an animal steroid receptor, a yeast receptor (Gal4) ..., the the only condition being to adapt the target sequence to the binding domain to DNA
restrained. Such an adaptation is within the reach of those skilled in the art. As indicative, when the DNA binding domain is from Gal4, the promoter inducible put will contain the UAS (LJpstream Activating Sequences) elements responding to Gal4. Furthermore, the trans-activation domain can come from of any known domain of transcriptional activation, including protein 16 of the herpes simplex virus (VP16) or of the p65 of factor NFKB and in particular, from its C-terminal end. A transcriptional activator teaming up a DLL derived from a steroid receptor, a derived trans-activation domain of 10 VP16 and a DNA binding domain of Gal4 or a steroid receptor suitable for the implementation of the present invention. In this regard, we will use preferably residues 1 to 74 of Gal4. But other combinations are also possible.
In addition, a hybrid functional domain can also be used.
1 S between different polypeptide fragments. A possible example is constituted by a hybrid DNA binding domain between the EcR and GR receptors, recognizing a hybrid target sequence comprising the motifs corresponding to ecdysone and glucocorticoids.
A preferred transcriptional activator in the context of the present invention 20 is chosen from (i) a polypeptide designated GRdeX comprising a DNA binding domain, a trans-activation domain and a DLL derived from an aux receptor glucocorticoids, said receptor being modified in its DLL, in particular by substitution of the isoieucine at position 747 with a threonine;
(Ü) a polypeptide designated ERT comprising a DNA binding domain, a trans-activation domain and a DLL derived from a receptor for Estrogen, said receptor being modified in its DLL, in particular by substitution of glycine at position 521 with an arginine;

WO 00/12741 PCT / i <R99 / 02051 (iii) a transcriptional activator comprising a first polypeptide containing a DLL derived from the ecdysone receptor, a domain of binding to hybrid DNA derived from those of the EcR and GR receptors and a trans-activation domain derived from viral protein VP 16 and a second polypeptide derived from the Drosophila protein USP or a homolog such as the human retinoic acid X (RXR) receptor;
(iv) a transcriptional activator comprising a first polypeptide having a DNA binding domain derived from the factor of transcription ZFHD 1 and a DLL derived from f immunophilin FKBP 12 and a second polypeptide comprising a trans-activation domain derived from factor NF ~ cB p65 and a DLL derived from FRAP (FKBP 12-rapamycin-associated protein); and {v) a transcriptional activator comprising a first derived polypeptide AhR receptor and a second polypeptide derived from the Arnt protein.
Preferably, the transcriptional activators (i) and (ü) are in the form homodimers and (iii) (iv) and (v) are in the form of heterodimers associating the first and second polypeptide and, optionally, the inducer.
According to an entirely advantageous embodiment, the activator transcriptional is activated by binding to an unnatural inducer and is not little or no activated by a natural human compound.
The term "unnatural inducer" refers to a compound which is not found naturally in the human or animal organism to which therapy using the inducible expression system according to the invention is intended. It's about of preferably a synthetic inductor which is not found naturally in a human organism and whose structure is slightly different from that of a human compound (endogenous). For the purposes of the present invention, a non-inductor natural is capable of activating the transcriptional activator in use in the frame of the present invention, in particular by linking to the DLL, in order to initiate or stimulate the transcription dependent on the target sequence responding to said activator.
The choice of an unnatural inducer adapted to the selected transcriptional activator East within the reach of ordinary skill in the art on the basis of the state of the art.
Activation of the transcriptional activator by the unnatural inducer can be done by a covalent or non-covalent interaction (electrostatic, hydrophobic, bond 5 hydrogen ... etc). Furthermore, the inductor can be constituted by a compound single or by a set of molecules. It belongs preferably to the, family of steroids, retinoids, fatty acids, vitamins, hormones, xenobiotics or antibiotics.
According to an advantageous embodiment, said unnatural inductor is 10 a synthetic substance which can be administered orally. Preferably, it is chosen among the group consisting of dexamethasone, tamoxifen, muristerone AT, ecdysone, rapamycin and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) or any analog of these compounds, preferably little or not toxic.
The sequences coding for the transcriptional activator included in the 15 inducible expression system according to the invention are placed under the control of appropriate regulatory elements allowing expression in a cell or a host organism. The term "appropriate regulatory elements" includes all the elements allowing the transcription of said sequences into RNA
and protein translation. Among these, the promoter is important 20 particular. It can be isolated from any gene of eukaryotic origin, prokaryote or even viral. Alternatively, it may be the natural promoter of the gene endogenous. Furthermore, it can be constitutive or regulable. In addition, iI
may be modified to enhance promoter activity, delete region transcription inhibitor, make a constitutive promoter regulable or vice 25 versa, introduce a restriction site ...... We can mention, as examples, the eukaryotic promoters of the PGK (Phospho Glycerate Kinase), MT genes (metallothioneine; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), the promoter SV40 virus (Simian Vrus), RSV LTR (Rous Sarcoma Virus), TK-HSV-1 promoter, the early promoter of the CMV virus (Cytomegalovirus) and promoters governing late adenoviral gene expression (MLP) and early (ElA, E2A, E3 or E4). But, it can also be interesting to regulate the expression of the transcriptional activator. According to a first variant, its expression can be controlled by its specific target sequence (self-activation 5 and / or activation by the endogenous wild-type receptor activated by the ligand endogenous).
For example, we will use the elements ERE or GRE for the expression of a transcriptional activator comprising a DNA binding domain derived from ER or GR (ERT or GRd ° "). Another possibility is the use of a promoter adjustable chosen from those of the prior art. In this regard, the use of a 10 promoter stimulating expression in a tumor or cancer cell may be advantageous. Muc-1 gene promoters may be mentioned in particular overexpressed in breast and prostate cancer (Chen et al., 1995, J.
Clin.
Invest. 96, 2775-2782), CEA (for carcinoma embryonic antigen) overexpressed in colon cancers (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), 15 Tyrosinosis overexpressed in melanomas (Vile et al., 1993, Cancer Res.
53, 3860-3864), ERB-2 overexpressed in breast and pancreatic cancers (Harris and al., 1994, Gene Therapy I, 170-175) and a-fetoprotein overexpressed in liver cancers (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465). It says that the Cytomegalovirus (CMV) early promoter is particularly preferred.
20 Of course, the appropriate regulatory elements may further include additional elements improving expression (sequence intronics, transcription terminator sequence ...) or the keeping in a host cell. Such elements are known to those skilled in the art.
When the transcriptional activator in use in the context of this 25 invention is composed by a set of polypeptides, these can be produced from polycistronic nucleotide sequences (placed under the control of a single promoter) implementing an initiation site for IRES-type translation to initiate the translation of the second cistron. We can also employ a two-way promoter directing the expression of two genes placed on both sides. We can also generate cassettes expression independent, each comprising appropriate regulatory elements such as than those cited above. Cassettes can be carried by the same vector of expression by different vectors.
The sequences used in the context of the present invention can be obtained by conventional molecular biology techniques, by example by bank screening using specific probes, by immuno-screening of expression bank, by PCR using suitable primers or by synthesis chemical. Mutants can be generated from native sequences by 10 substitution, deletion and / or addition of one or more nucleotides in putting in implements the techniques of site-directed mutagenesis, PCR, digestion by enzymes restriction and ligation or by chemical synthesis. Functionality of mutants and constructs can be verified by the techniques of art.
The second component of the inducible expression system according to The invention is a recombinant adenoviral vector comprising at least one uncomfortable of interest placed under the control of an inducible promoter likely to be activated in trans by said transcriptional activator.
We will preferably use an adenoviral vector devoid of any or part of at least one region essential for the selected replication from 20 regions E1, E2, E4 and L1 to L5, in order to avoid its propagation within the organism host or environment. A deletion of the majority of the El region is favorite. Advantageously, it extends from nt 454 to 3328 but can also include additional 5 'and 3' sequences provided they do not interfere with the packaging function. Preferably, the pIX gene is not included in 25 the deletion of E1. In addition, it can be combined with other changes) affecting in particular the regions E2, E4 and / or L1-L5, insofar as the defective essential functions are complemented in Crans by means of a complementation line and the virus of an auxiliary virus. In this regard, we can to have use of defective second generation vectors for functions E1 and or E1 and E2 (see for example international applications W094 / 28152 and W097 / 04119). To illustrate this embodiment, we can cite a vector combining a deletion within the E 1 region and a heat-sensitive mutation affecting the DNA Binding Protein (DBP) gene from the E2A region 5 (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339). As for the region E4, she may be deleted in whole or in part. A partial deletion of the region E4 to exception of sequences coding for open reading frames (ORF) 3 and or 6/7 is advantageous insofar as it does not require supplementation of the E4 function (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). In the 10 aim to increase cloning capabilities, the recombinant adenoviral vector can furthermore be devoid of all or part of the non-essential E3 region.
According to this alternative, it may be interesting to keep the E3 sequences coding for polypeptides allowing escape to the immune system of the host, including the gpl9k glycoprotein (Gooding et al., 1990, Critical Review 15 of Immunology 10, 53-71). Another alternative is to use a minimal adenoviral vector essentially retaining ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5 'and 3' and the packaging region and defective for all viral functions.
Furthermore, the origin of the adenoviral vector of the expression system 20 inducible according to the invention, can be varied as well from the point of view of the species that of the serotype. It can be derived from the genome of a human or animal adenovirus (canine, avian, bovine, murine, sheep, pig, simian ...) or a hybrid comprising adenoviral genome fragments of at least two origins different. Mention may more particularly be made of the CAV-1 or CAV-2 adenoviruses 25 of canine origin, DAV of avian origin or Bad of type 3 of origin bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176; Spibey and Cavanagh, J.
Gen.
Virol., 1989, 70: 165-172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal and al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). However, we will prefer a vector adenoviral of human origin preferably derived from a serotype C adenovirus, especially type 2 or 5.
The gene of interest in use in the present invention can be derived from a eukaryotic organism, a prokaryotic organism of a parasite or a vinas other than adenovims. It can be isolated by any conventional technique in the field 5 of the art, for example by cloning, PCR or chemical synthesis. It can be from type genomics (including all or part of all introns), DNA type complementary (cDNA, devoid of intron) or mixed type (minigene). Through elsewhere, it can code for an antisense RNA and / or a messenger RNA (mRNA) which will then be translated into a polypeptide of interest, which may be (i) intracellular, (Ü) incorporated into the membrane of the host cell or (iii) secreted. He can act a polypeptide as found in nature (native), a portion of it this (truncated), of a mutant having in particular biological properties improved or modified or a chimeric polypeptide from the fusion sequences of various origins. Furthermore, the gene of interest can encode for a 15 antisense RNA, a ribozyme, or even a polypeptide of interest.
Among the polypeptides of interest which can be used, there may be mentioned more particularly chemokines and cytokines (interferon a, (3 or y, interleukin (IL), in particular IL, -2, IL-6, IL-10 or even IL-12, a necrotizing factor of tumors (TNF), colony stimulating factor (GM-CSF, C-CSF, M-CSF ...), 20 MIP-loc, MIP-lai, RANTES, monocyte chemoattraction protein such than MCP-1 ...), cellular receptors (in particular recognized by the HIV virus), the receptor ligands, clotting factors (Factor VIII, Factor IX, thrombin, protein C), growth factors (FGF for Fibroblast Growth Factor, VEGF for Vascular Endothelial Growth Factor), enzymes (urease, 25 renin, metalloproteinase, nitric oxide synthetase NOS, SOD, catalase, lecithin cholesterol acyl transferase LCAT ...), enzyme inhibitors (al-antitrypsin, antithrombin III, viral protease inhibitor, PAI-1 for plasminogen activator inhibitor), class I major histocompatibility complex antigens or II

or polypeptides acting on (expression of the corresponding genes, the polypeptides capable of inhibiting viral, bacterial or parasitic or its development, the polypeptides acting positively or negatively on apoptosis (Bax "Bcl2, BcIX ...), cytostatic agents (p21, p 16, Rb), 5 immunoglobulins in whole or in part (Fab, ScFv ...), toxins, immunotoxins, apolipoproteins (ApoAI, ApoAIV, ApoE ...), inhibitors angiogenesis (angiostatin, endostatin ...), markers (ji-galactosidase, luciferase ....) or any other polypeptide having a therapeutic effect for affection targeted.
10 More precisely, in order to treat an inherited dysfunction, we will use a functional copy of the defective gene, for example a gene encoding factor VIII or IX in the context of (hemophilia A or B, the dystrophin (or minidystrophin) in the context of Duchenne muscular dystrophy and Becker, insulin for diabetes, CFTR protein (Cystic Fibrosis 15 Transmembrane Conductance Regulator) in the context of cystic fibrosis.
With regard to inhibiting (initiation or progression of tumors or cancers, we will put preferably using a gene of interest coding for an antisense RNA, a ribozyme, a cytotoxic product (thymidine kinase from virus simplex herpes 1 (TK-HSV-1), ricin, cholera toxin, diphtheria, gene product yeast 20 FCYI and FURI encoding uracyl phosphoribosyl transferase and cytosine deaminase .....), an immunoglobulin, an inhibitor of cell division or some transduction signals, an expression product of a suppressor gene tumor (p53, Rb, p73, DCC ....), an immune stimulator polypeptide, a tumor associated antigen (MUC-1, BRCA-1, early or late antigens 25 (E6, E7, Ll, L2 ...) of an HPV papilloma virus ....), possibly in combination with a cytokine gene. Finally, as part of anti-HIV therapy, can use a gene encoding an immunoprotective polypeptide, a epitope antigenic, an antibody (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195), the CD4 receptor extracellular domain (sCD4; Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86) an immunoadhesin (e.g. a CD4-immunoglobulin hybrid IgG; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670), an immunotoxin (e.g. fusion of the 2F5 antibody or angiogenin CD4-2F5 immunoadhesin; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5 5494-5499), a trans-dominant variant (EP 0614980, W095 / 16780), a product cytotoxic such as one of those mentioned above or an IFNa, or Vii.
One of the genes of interest can also be a selection gene allowing to select or identify the transfected or transduced cells. We can quote the neo genes (coding for neomycin phosphotransferase) conferring a 10 resistance to antibiotic 6418, dhfr (Dihydrofolate Reductase), CAT
(Chloramphenicol Acetyl transferase), pac (Puromycin Acetyl-Transferase) or still gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase). In a way generally, the selection genes are known to those of skill in the art.
Furthermore, the expression cassette for the gene of interest can, in addition, 15 include additional elements improving expression or maintenance in the host cell (origins of replication, elements of integration in the genome cell, intronic sequences, poly A termination sequences transcription, tripartite leaders ...). These elements are known to the man of art.
In addition, the gene of interest can also comprise upstream of the region 20 coding a sequence coding for a signal peptide allowing its secretion of the host cell. The signal peptide can be that of the gene in question or heterologous (from any secreted or synthetic gene).
The gene of interest expression cassette can be inserted at a location any of the adenoviral genome. Advantageously, it is introduced in 25 replacement of the E3 region. When the recombinant adenoviral vector contains several genes of interest, these can be placed under the control of same genetic elements (polycistronic cassette using an internal site of initiation of IRES type translation to reinitiate translation of second cistron) or independent elements. In this case, they can be inserted in same adenoviral region (for example as a replacement for E3) or in different regions (for example to replace E3 and another region deleted).
In the context of the present invention, the expression of the gene of interest is 5 controlled by a promoter inducible by a transcriptional activator such than defined above. Within the meaning of the present invention, an inducible promoter includes at least one target sequence responding to the transcriptional activator implemented and operationally associated with a minimal promoter.
The target sequences have been defined previously and are described in the literature 10 accessible to those skilled in the art (as a reminder, ERE, GI: tE, EcRE, UAS, SxE / GRE, XRE ...). It is indicated that a homologous sequence modified by relation to the native sequence but exercising a regulatory function similar or improved. These modifications can result from the addition, deletion and / or substitution of one or more nucleotides or fusion between two sequences 15 different targets. One or more sequences can be implemented targets, by example from 1 to 25, advantageously from 1 to 10 and, preferably, from 1 to 7, possibly placed in tandem and in any orientation by report at the TATA box. They) are (are) generally inserted) in the promoter inducible upstream of the minimum promoter, up to several hundred pairs 20 basics of it. An example of promoter inducible by an activator transcriptional derivative of GR, is the LTR of MMTV virus (mouse mammary tumor virus) which contains the GRE element and promoter sequences adequate.
A minimal promoter essentially comprises a TATA box and a site initiation of functional transcription in a cell or organism host.
These elements are conventional in the field of the art concerned. We can quote more particularly the minimal promoters of the TK, CMV and HSP genes (promoter of the Drosophila heat shock protein gene lacking enhance it).
In addition, the inducible promoter in use in the context of this invention may include additional elements improving the level of transcription or limiting it to certain specific tissues (such as enhancer). These additional elements can alternatively be inserted in a non-coding gene region.
5 According to a first embodiment, the nucleotide sequences encoding for the transcriptional activator and their regulatory elements are worn by the recombinant adenoviral vector of the expression system according to the invention.
The expression cassettes of the gene of interest and of the transcriptional activator can be located in the same region of the adenoviral genome or in places 10 different and in direction or antisense orientation with respect to each other.
The anti-sense orientation is preferred. A preferred example is provided by a vector El 'E3- in which each of the cassettes is inserted in place of the sequences deleted adenovirals.
According to another variant, the nucleotide sequences are carried by a 15 independent expression vector other than the adenoviral vector recombinant in use in the expression system according to the invention. It can be a vector synthetic (cationic lipids, polymer liposomes ...), of a plasmid or again of a viral vector. It can possibly be associated with one or more substances improving the transfection efficiency or the stability of the vector. These substances 20 are widely documented in the literature accessible to humans of art (see for example Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 11 S-121;
Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). By way of illustration but not limiting it may be polymers, in particular cationic lipids, liposomes, 25 nuclear proteins or neutral lipids. These substances can to be used alone or in combination. A possible combination is a vector recombinant plasmid associated with cationic lipids (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc ...) and neutral lipids (DOPE).
The choice of plasmids which can be used in the context of the present invention is vast. They can be cloning and / or expression vectors. In a way generally, they are known to those skilled in the art and many of them are commercially available but it is also possible to build them where the modify by genetic manipulation techniques. We can cite as Examples of the plasmids derived from pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) or even Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). Preferably, a plasmid used in the framework of the present invention contains an origin of replication ensuring initiation of replication in a producer cell and / or a cell host (by 10 example, the ColEl origin will be retained for a plasmid intended to be produced in E. coli and the oriP / BBNAl system if you want it to be self-replicating in a mammalian host cell, Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542 ;
Yates et al., Nature 313, 812-815). It may further comprise a gene for selection to select or identify transfected cells 15 (complementation of an auxotrophy mutation, gene coding for resistance to an antibiotic...). Of course, it can include elements additional improving its maintenance and / or stability in a given cell (sequence cer who promotes the monomeric maintenance of a plasmid (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, integration sequences in the cell genome).
20 Being a viral vector, a vector deriving from a adenovirus, a retrovirus, a vines associated with adenovirus (AAV), a virus herpes, an alphavirus, a parvovirus, a poxvirus (fowlpox, canaripox, vaccinia virus, in particular of the MVA (Modified Virus Ankara) strain or Copenhagen ... etc) or a foamyvirus. We will preferably use a 25 non-replicative and, possibly, non-integrative vector.
Retroviruses have the property of infecting and integrating mainly in dividing cells and in this regard are particularly suitable for the cancer application. A retroviral vector suitable for the implementation of the present invention includes the LTR terminal sequences, a region packaging and nucleotide sequences encoding the activator transcriptional whose expression is controlled by the retroviral promoter (in LTR 5 ′) or by an internal promoter as mentioned above. It can drift of a retroviruses of any origin (marine, primate, feline, human, etc.) and in 5 particular of MoMuLV (Moloney marine leukemia virus), MVS (Marine sarcoma virus) or Friend marine retrovirus (Fb29). It is propagated in a line packaging capability to provide the gag, pol viral polypeptides in trans and or env necessary for the constitution of a viral particle. Such lines are described in the literature (PA317, Psi CRIP GP + ~ -12 etc ...). The vector 10 retroviral according to the invention may include modifications in particular to level LTRs (replacement of the promoter region with a eukaryotic promoter) or of the packaging region (replacement by an packaging region heterologous, for example type VL30) (see French applications 94 08 300 and 97 05203).
An adenoviral vector is particularly suitable for the expression of the transcriptional activator envisaged in the context of the present invention.
We will preferably use a defective vector having one of the characteristics mentioned above. In particular, the recombinant adenoviral vectors (carrying the cassette of inducible expression of the gene of interest) and independent (carrying the cassette 20 expression of the transcriptional activator) are preferably both deficient for function E 1 by deletion of all or part of region E
1 or non-functional mutation. Either or both can also be deficient) for at least one of the functions E2, E4, Ll, L2, L3, L4 and / or L5. Similarly, a deletion of all or part of the E3 region can be 25 envisaged for one or both vectors.
According to an advantageous embodiment, the viral vectors (vector recombinant adenoviral and, where appropriate, said independent viral vector) doing part of the expression system according to the invention may be in the form of vector DNA or infectious viral particle.

The present invention also relates to an adenoviral vector recombinant including (i) the nucleotide sequences coding for a transcriptional activator placed under the control of the regulatory elements appropriate to their 5 expression in a host cell or organism, and (ü} a gene of interest placed under the control of an inducible promoter capable of being activated in trans by said transcriptional activator.
The recombinant adenoviral vector according to the invention can code for a transcriptional activator with the characteristics defined above who under 10 form activated by an inductor as described above, has the capacity to initiate or activate the transcription of a gene controlled by an inducible promoter comprising a specific target sequence of said transcriptional activator such as described above.
Alternatively, the recombinant adenoviral vector according to the invention 15 can code for a prokaryotic transcriptional activator and, in particular, a polypeptide comprising a DLL and a DNA binding domain derived from a tetracycline operon repressor (tetR) and an activation domain of any transcription. It is preferably the polypeptide designated in ia literature <tetracycline activator "tTA (Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl.
20 Acad. Sci. USA 89, 5547-SS1) in which the tetR isolated from the TnlO transposon East fused in phase to the 130 C-terminal amino acids of the viral protein VP16.
In this case, we will use an unnatural inducer activating tTA, such than doxycycline, tetracycline or an agonist analogue. Of course, characteristics of the inducible expression cassette of the gene of interest are the 25 same as before, apart from the presence of one or more sequences) targets) responding to the prokaryotic transcriptional activator. is about tTA, the target sequence is made up of the tetracycline operator (tet0). In the frame of the present invention, very particularly preferred the combination "tet O -minimum promoter "giving rise to a promoter whose basic level of transcription is naturally very weak but can be activated by the tTA inducer and repressible by tetracycline.
There is no need to go back to the skeleton of the adenoviral vector recombinant according to the invention insofar as it meets the characteristics already 5 mentioned.
The present invention also relates to an infectious viral particle comprising a recombinant adenoviral vector according to the invention.
Adenoviral vector preparation techniques are widely used documented in the literature. At first, the genome is reconstructed 10 by homologous recombination in line 293 (see in particular Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocol; Ed EJ Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ) or in Escherichia coli (Chantier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810;
W096 / 17070). It is then necessary to propagate the vector in order to constitute 15 a stock of viral particles containing it. For this purpose, bloodlines of complementation providing in notches the viral expression products for which the vector is defective. For example, viruses deleted from E 1 can be propagated in line 293, established from embryonic kidney cells human (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). In terms of 20 second generation vectors, we can use lines complementing two essential viral functions, such as those described by Yeh et al.
(1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak and Graham (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995 Gene Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J.
Virol.
72, 2022-2033) and in international applications W094 / 28152 and 25 W097 / 04119. Another alternative is to use a viral element additional, designated "helper virus" to complement at least part the defective functions of a recombinant adenoviral vector. Viruses auxiliaries of the prior art consist of an adenoviral genome, possibly deleted of a essential region for which the recombinant vector does not require complementation.
The invention also relates to a method for preparing a particle.
viral, according to which (i) a recombinant adenoviral vector according to the invention is introduced into 5 a complementation cell capable of complementing in trans said vector, so as to obtain a complementation cell transfected, (ü) said transfected complementation cell is cultured in appropriate conditions to allow the production of said 10 viral particles, and (iii) recovering said viral particle in cell culture.
Of course, the viral particle can be recovered from the supernatant of culture but also cells. One of the commonly used methods consists in lysing the cells by consecutive cycles of freezing / thawing 1 S to collect the virions in the lysis supernatant. These can to be amplified and purified according to the techniques of the art (chromatographic process, ultracentrifi. ~ gation in particular through a gradient of chloride of cesium ...).
The present invention also relates to a eukaryotic cell comprising an inducible expression system, an adenoviral vector recombinant 20 according to the invention or infected with a viral particle according to the invention.
For the purposes of the present invention, such a cell is constituted by any cell transfectable by a vector or infectable by a viral particle, as defined above before. A
mammalian and in particular human cell is particularly suitable. he can be a primary or tumor cell of any origin, in particular 25 hematopoietic (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ...), muscular (satellite cell, myocyte, myoblast, muscle smooth...), cardiac, pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
The present invention also relates to a composition pharmaceutical inducible expression system, adenoviral vector recombinant, a viral particle or a host cell according to the invention in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
A composition according to the invention is more particularly intended for preventive or curative treatment of diseases by gene therapy (including 5 immunotherapy) and is more particularly intended for diseases proliferative (cancers, tumors, dysplasias ... etc), infectious diseases and in particular viral (induced by hepatitis B or C viruses, HIV, herpes, retrovirus .... etc), genetic diseases (cystic fibrosis, myopathies, hemophilia, diabetes ...) and to the cardiovascular diseases (restenosis, ischemia, dislipidemia ...).
A composition according to the invention can be manufactured so conventional for administration by local, parenteral or digestive. In particular, a therapeutically effective amount is associated of the therapeutic or prophylactic agent to an acceptable support from a point of view pharmaceutical. There are many possible routes of administration. We can 15 mention for example the intragastric, subcutaneous, intracardiac route, intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonary or intratracheal. For these last three modes of embodiment, administration by aerosol or instillation is advantageous.
The administration can take place in single or repeated dose one or more time 20 after a certain interval. Route of administration and doses virus depending on various parameters, for example, the individual, pathology, the gene of interest to be transferred, the route of administration.
As indicative, preparations based on viral particles may be formulated under form of doses between 104 and 10'4 pfu (units forming ranges), Advantageously 105 and 1013 pfu and preferably 106 and 1012 pfu. When one implements one or more vector (s), doses comprising from 0.01 to 100 mg DNA, preferably 0.05 to 10 mg and most preferably 0.5 to 5 mg can be considered.

The formulation may also include a diluent, an adjuvant or a S
pharmaceutically acceptable excipient, as well as agents solubilization, stabilization, preservation. A preferred composition East in injectable form. It can be formulated in aqueous, saline solution (phosphate, monosodium, disodium, magnesium, potassium ....) or isotonic.
It can be presented as a single dose or multidose in liquid form or dry (powder, lyophilisate ...) capable of being reconstituted so extamporanized by an appropriate diluent.
The present invention also relates to the therapeutic use or Prophylactic of an inducible expression system, a vector adenoviral recombinant, of a viral particle or of a host cell according to the invention for the preparation of a medicament intended for the transfer and expression of said gene of interest in a host cell or organism and, in particular, at treatment of human or animal body by gene therapy. According to a first possibility, the 15 drug can be administered directly in vivo (e.g.
injection intravenously, in an accessible tumor, in the lungs by aerosol, in the vascular system by means of an appropriate probe ...). We can also adopt the ex vivo approach which consists in removing cells from the patient (cells bone marrow strains, peripheral blood lymphocytes, cells 20 muscles ...), to transfect or infect them in vitro according to art techniques and readminister them to the patient after a possible amplification step.
The prevention and treatment of many pathologies can be considered.
A
preferred use is to treat or prevent cancers, tumors and diseases resulting from unwanted cell proliferation. Among the applications 25 possible, there may be mentioned breast and uterine cancers (in particular those induced by papillomas virus), prostate, lung, bladder, liver, colon, pancreas, stomach, esophagus, larynx of the system nervous central and blood (lymphomas, leukemia etc ...). It is also useful in the framework of cardiovascular disease, for example to inhibit or delay the proliferation of smooth muscle cells in the vascular wall (restenosis). Finally in the case of infectious diseases, the application to AIDS may be considered.
The invention also extends to a method for the treatment of 5 diseases by gene therapy, characterized in that i'm administered to a organism or host cell in need of such treatment a system of inducible expression, a recombinant adenoviral vector, a particle viral or a host cell according to the invention.
Finally, the invention also relates to a transcriptional activator 10 comprising a DLL and a trans-activation domain derived from a receptor steroid and a heterologous DNA binding domain, in particular derived from the yeast protein Gal4. Such a transcriptional activator is obtained in exchanging by molecular biology techniques the DNA binding domain of steroid receptor by that of Gal4 (in particular carried by residues 1 at 74).
An ERT or GRd ° "and Gal4 hybrid is most preferred.
It is indicated that all of the names used in this are conventional in the art field and that the scope includes also functional equivalents, i.e. any polypeptide, domain, uncomfortable, compound obtained by modification of a polypeptide, domain, gene, native compound 20 and having an activity of the same nature, or even significantly increased.
Figure 1 is a schematic representation of the amount of FIX
produced 144 h after transient transfection of 293 cells by plasmids pTG13064 (CMV-GRde "), pTG6242 (LTR MMTV-FIX, sense) and pTG13063 (LTR
25 MMTV-FIX, anti-sense).
Figure 2: Evaluation of the Dexamethasone Dose / Response Effect in A549 cells. Cell infection is carried out with an MOI = 50 with AdTG13092 or AdTG13088. Dexamethasone induction is performed in varying the concentration from 10'9 to 10''M.
Figure 3: Schematic representation of AdTG13075 constructions, AdTG13088, AdTG13092 and AdTG13245.
Figure 4 (a, b, c and d): In vivo evaluation of the Grdex inducible system 5 / Dexamethasone with the various constructs tested in the mice C57B1 / 6. The values presented are the means of the values measured in each of the treated mice.
Figure 5 (a, b, c and d): In vivo evaluation of the Grdex inducible system Dexamethasone with the different constructs tested in SCòD mice.
10 The values presented are the means of the values measured in each of treated mice.
Figure 6: Evaluation of a Dexamethasone Dose / Response Effect in vivo in SCID mice.
Figure 7: Schematic representation of adenoviral vectors derived First and second generation plasmid pTg6401.
The present invention is illustrated, without being limited, by the following examples.
EXAMPLES
20 The constructions described below are made according to the techniques general of genetic engineering and molecular cloning, detailed in Maniatis and al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY or a more recent edition) or as recommended by manufacturer when using a commercial kit. The cloning steps are carried out 25 in E. coli SK (hsdR, mcrA), DHSa [(recAl, endAl, hodRl7 (rm-) strains ), supE44 thi-1, gyrA (nalr)] or NM522 (supE, thi, (lac-proAB), OhsdS, (rm-), (F ' proAB, lacIq, ZOM15) and those of homologous recombination in strain E.
coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). Regarding the restriction site repair, the technique used is a filling the protruding 5 'ends with the large fragment of DNA
polymerizes I of E. coli (Klenow, Boehringer Mannheim). DNA fragments are purified using the GeneCleanllR DNA purification kit (BiolOlInc.).
Through 5 elsewhere, the adenoviral genome fragments used in the various constructions described below, are indicated precisely according to their position in the nucleotide sequence of the Ad5 genome as disclosed in the bank Genebank data under the reference M73260.
With regard to cell biology, we use cell lines 10 cell phones 293 (Graham et al, 1977, supra; available from ATCC as reference CRL1573), A549 E1 + (WO94 / 28152), A549 (ATCC CCL-185) and Vero (ATCC
CCL-81). It is understood that other cell lines may be used. The cells are maintained in culture at 37 ° C. in a humid atmosphere enriched with 5% of COZ in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagie Medium, Gibco BRL) 15 supplemented with 1 mM glutamine, 1% amino acids (Gibco BRL), 40pg / 1 gentamycin and 10% fetal calf serum (SVF, Gibco BRL). Transfection and the transduction of the cells is carried out according to the techniques of the art (precipitation with calcium phosphate ...) EXAMPLE 1. Construction of a co-expressing adenoviral vector the ERT transcriptional activator and the FIX gene regulated by ERE sequences.
The cDNA of the wild-type ER gene is contained in the plasmid pSGI-HEO
25 (Tors et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989). The area of liaison to estrogens of the ER receptor (BamHI XbaI fragment) is replaced by that of the ERT mutant (G521R) carried by the NotI-XbaI fragment of pCre-ERT (Feil et al., 1996, Proc.
Natl. Aca.d. Sci. USA 93, 10887-10890). ERT sequences are inserted in the EcoRI site of the transfer vector pTG6600. As an indication, pTG6600 is a vector p polyII (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) in which are inserted Ad5 sequences 1 to 458, the CMV early promoter, splicing sequences hybrids found in the plasmid pCI (Promega Corp, comprising the site 5 intron 1 splice donor of the human ~ i-globin gene and the site acceptor splicing of the mouse immunoglobulin gene), the sequences of polyadenylation of the SV40 virus and the Ad5 sequences 3328-5788. Such a construction is within the reach of those skilled in the art. The vector thus obtained pTG6237 contains the CMV-ERT expression cassette present in the E1 region. The 10 final construct designated pTG6246 is reconstituted by recombination homologous (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810) between the fragment Pacl Bst EII isolated from the previous vector and pTG4656 linearized by CIaI. This last East an adenoviral plasmid E1- E3- containing in E1 the LacZ gene under the control of the MLP promoter (described in application FR97 06757). So the genome 15 adenoviral carried by pTG6246 includes the CMV-ERT cassette in the E1 region and is deleted from the E3 region.
The human FIX cDNA (Anson et al, 1984, EMBO J. 3, 1053-1060) is cloned as a BamHI fragment isolated from a plasmid of the prior art (through example described in patent 88 14635) and inserted downstream of the minimum promoter 20 TK-HSV preceded by the sequence ERE (Klein-Hitpass et al., 1986, Cell 46,1053-1061). The cassette is introduced into the BgIII site of pTG4664 in orientation meaning and antisense (giving pTG13227 and pTG13228 respectively). The plasmid pTG4664 includes nucleotides 25838 to 320004 of Ad5 deleted from nucleotides 27871 to 30748 of the E3 region. Homologous recombination with The plasmid pTG6401 digested with SfrI (comprising the genome Ad5 deleted from regions E1 and E3) makes it possible to generate the adenoviral vectors E1- E3- carrying the ERF./TKp-FïX inducible cassette in sense and antisense orientation in the region E3.
The construction sense (corresponding to the transcription direction of E3) is referred to as pTG13235 and the anti-sense construction pTG13236.
Doubly recombinant vectors containing the expression cassettes CMV-ERT and EREfTKp-FIX in place of regions E1 and E3 respectively are generated by homologous recombination between the fragments carrying the cassette 5 inducible FIX isolated from the vectors pTG13227 and pTG13228 and the vector pTG6246.
PTG13233 and pTG13234 are obtained according to the orientation of the inducible cassette.
EXAMPLE 2. Construction of a co-expressing adenoviral vector the GRde = transcriptional activator and the FIX gene regulated by 10 GRE sequences.
The cDNA of the GRdex receptor carried by the EcoRI fragment (2.7Kb) of the plasmid pHGl (Kumar et al., 1987, Cell Sl, 941-951) is cloned into the site EcoRI
of the vector pTG6600, to give pTG13064. The adenoviral vector pTG13075 15 containing the CMVp-GRdex expression cassette replacing the region EI
and deleted from the majority of the E3 region is obtained by recombination counterpart between the Pacl Bst EII fragment isolated from the previous vector and linearized pTG4656 through CIaI.
The BamHI fragment containing the human FIX cDNA is inserted downstream 20 of the MMTV LTR containing the GRE sequence (Cato et al., 1986, EMBO J. S, 2237-2240). The cassette is then introduced in sense and antisense orientation in the BgIII site of pTG4664 bordering the deleted E3 sequences. Vectors transfer are designated pTG6242 (sense) and pTG13063 (antisense). A
homologous recombination with the plasmid pTG6401 digested with SfrI (comprising 25 The adenoviral genome deleted from regions E1 and E3) makes it possible to generate the vectors adenoviral E1 'E3' carrying the LTR MMTV-FIX inducible cassette in orientation sense and antisense in the region E3. The construction meaning (identical to the meaning of transcript of E3) is called pTG13082 and the antisense construct pTGI 3088.
Homologous recombination with the plasmid pTG13075 makes it possible to generate the adenoviral vectors E the E3 'carrying the inducible LTR cassette MM'TV-FIX in sense and antisense orientation in the E3 region and the CMV- cassette 5 GRd "'' in region E1. The construction sense (identical to the sense of transcription of E3) is called pTG13083 and the. anti-sense constriction pTG13092 (sense of reverse transcription for FIX and GRdex tapes) _ EXAMPLE 3. Construction of a co-expressing adenoviral vector 10 the VgEcR transcriptional activator and the FIX gene regulated by your 5zE / GRE sequences.
The plasmid pVgRXR (In Vitrogen) comprises the two subunits component the transcriptional activator activatable by ecdysone or its similar 15 muristerone A. The first consists of the ecdysone receptor (VgEcR) modified at three amino acids in the DNA binding domain of way to obtain a sequence analogous to that of the GR receptor and fused in phase at VP16 trans-activation domain and the second acid receptor human retinoic RXR (No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-20 3351). The two cDNAs encoding VgEcR and RXR directed by the promoters CMV and RSV respectively are modified by introduction of an intron in 5 'of the coding sequences (pCI intron for CMVp-VgEcR and intron (3-globin from rabbit for RSVP-RXR) and are introduced into the El region of a vector adenoviral according to the previous technique.
The sequences coding for human FIX are introduced downstream of a inducible promoter comprising the SxE / GRE target sequence coupled to minimal promoter ~ hsp (pIND; In Vitogen). As before, the cassette is introduced into the two orientations in the BgIII site of pTG4664. The homologous recombination with pTG6401 digested with SfrI makes it possible to generate the plasmids carrying the inducible cassette in the E3 region in sense orientation or ante-sense.
The doubly recombinant adenoviral vector is obtained by S homologous recombination with the transfer vector containing the sequences VgEcR and RXR.
EXAMPLE 4 Production of adenoviruses.
10 Recombinant adenoviral vectors containing cassettes of expression of activators and / or FIX are released from plasmids corresponding (pTG13083, pTG13092, pTG13233, pTG13234 ...) by digestion PacI before being transfected into the complementation line 293. The lysate cell is harvested, subjected to three successive stages of 15 freeze / thaw to release the virus particles and then clarified by centrifugation at 3500 rpm for 5 min. The virions present in the supernatant can be optionally amplified by passing over a permissive line (293 or A 549-E1 +) and purified on a cesium chloride gradient according to the techniques art. The adenoviral stock is dialyzed in a formulation buffer appropriate As described in WO98 / 02522 (for example 1M sucrose, 150 mM NaCl, LmM MgCl2, 10 mM Tris-HCl and 0.1% Tween 80). Viral titer is determined in infectious units by assay of the protein DBP by immunofuorescence (L, usky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2032) or in number of viral particles per measured spectrophotometric at 260 nm.
25 A control vector is constructed by inserting the human factor IX cDNA
under the control of the CMV promoter isolated from the plasmid pCI (Proméga). The tape constitutive expression is introduced into the E3 region, giving pTG13231 (sense orientation) and pTG13232 (anti-sense orientation). Virions are products according to the same methodology as above.
Homologous recombination between plasmids pTG13231 and pTG13232 and the plasmid pTG6401 linearized by Srfl makes it possible to obtain respectively the plasmids pTG13244 and pTG13245 carrying the cassette 5 of CMV-FIX constitutive expression in sense and antisense orientation in the region E3.
EXAMPLE 5: In vitro evaluation of the system inducible by GRdei.
10 The transfer vectors pTG13064, pTG6242 and pTG13063 carrying respectively the CMV-GRdeX, LTR MMTV-FIX (direction) and LTR cassettes MMTV-FIX (antisense) are transiently transfected in the cells 293 (DNA spg per 106 cells). In addition, the plasmid pTG13064 is co-transfected with either pTG6242 or pTG13063. Cultures are continued in 15 presence of dexamethasone (10 ~ M) or in its absence. Supernatants cells are removed 48, 96, 120 and 144 hours after transfection and the amount of FIX produced is determined by ELISA (Asserachrom kit; Diagnostica Stago).
The results presented in Figure 1 show an induction of production of FIX in the presence of the activator GRdeX activated by dexamethasone. The 20 receptor expressed by pTG13064 is therefore functional insofar as at the state activated (in the presence of dexamethasone), it can be attached to the GRE motifs of the MMTV and induce transcription of the FIX gene. The basal activity of the system is very weak. Indeed, the quantity of FIX produced in the absence of dexamethasone or of pTG13064 is low, if not negligible.
25 The kinetics of expression of the FIX as a function of time shows that the maximum production level is reached 120 h after transfection. Beyond, the concentration stagnates which can be explained by the state of the cells (at confluence) and a depletion of the environment and probably in dexamethasone.

The effectiveness of the system was also evaluated by adenoviral infection in presence of dexamethasone or not. Vero non-permissive host cells or A549 are infected with the AdTG13083 or AdTG13092 virions carrying the CMV-GRd "'and MMTV-FIX cassettes (sense for the first virus and antisense for 5 the second) or co-infected with the adenovirus AdTG13075 (CMV-GRdeX> and AdTG13082 (MMTV-FIX sense) or AdTG13088 (MMTV-FIX antisense). We uses an MOI (multiplicity of infection) of 100 for experiments infection and 50 for each virus in the case of co-infection. The amount of F1X
produced in the culture supernatants is assayed by ELISA.
10 In Vero cells, the expression of the FIX cannot be quantified until after infection with AdTG13092 virions carrying the two cassettes and in the presence of the inductor. No induction takes place in the absence of dexamethasone or GRd receptor "'. It should be noted that these cells do not express GR
wild.
In cell A549, the FIX is produced in the presence of dexamethasone in the 15 cells infected with AdTG13088 or AdTG13092. It should be noted that these cells express wild GR. However the level of FIX is delayed over time in the absence of GRd "'(virion AdTG13088).
In conclusion, the inducible system implementing the GRd 'receptor and dexamethasone is functional in constructs in which the 20 inducible MMTV-FIX cassette is in anti-sense orientation (AdTG13088 and AdTG13092). In addition, the cis induction system (cassettes carried by a virus alone) is significantly more productive than a trans system putting in works with two viruses, notably in Vero cells.
Furthermore, the study was reproduced by varying the MOI. Cells 25 Vero are infected with the AdTG13092 virus at an MOI of 10, 50 or 100. A
title the AdTG13075. The FIX assay is carried out 48 and 72 h after infection. We observe a production of FIX whatever the ME
employed, but the optimal level of expression is obtained for an MOI of 50.

The inducer concentration was also varied from 10-9 to 10-5 M.
At high concentrations, dexamethasone proves to be cytotoxic, resulting in a least expression of the FIX. At low concentration (10-g M and above), induction is not effective. The optimum is 10- ~ M.
S A more detailed analysis of the dose-response effect was carried out in varying the concentration of Dexamethasone from 10'9 to 10- 'M. This study at was carried out in A549 cells expressing the wild-type GR receptor. A
activation can therefore take place through this receptor which can be activated by the Dexamethasone. In reality, we observe for a concentration of Dexamethasone 10 of 10-8 M, that the expression of Factor IX can only be induced after infection by the vector AdTG13092 coding for the modified GRd ° "receptor. This elsewhere is too low to allow activation of the GR receiver endogenous (Figure 1). Therefore, we have shown that induction of the gene reporter can be done in a controlled and selective manner, including presence of 15 wild-type GR receptor, using lower ligand doses. This aspect is important for in vivo applications, natural conditions for which the wild-type GR receptor is expressed.
EXAMPLE 6 In vivo evaluation of the system inducible by GRdex.
AdTG13092 virus is injected intravenously into mice immunocompetent C57B1 / 6 at a rate of 4x108 or 8x108 iu. Dexamethasone is administered to animals intraperitoneally at a concentration of ltg for 3 consecutive days (on D0, D1 and D2). Serums are collected regularly from the 3rd day following infection and the amount of FIX
produced is evaluated by ELISA. We observe under these conditions a production significant of FIX.

WO 00/12741 PCTlFR99 / 02051 EXAMPLE 7 In Vivo Evaluation of the GRdex Inducible System in immunocompetent mice.
The viruses AdTG13092, AdTG13088 and AdTG13245 are injected by the 5 intravenously to immunocompetent C57BI / 6 mice at a rate of 5 × 10 8 iu.
The AdTG13088 and AdTG13075 viruses (Figure 3) are also co-injected at the right of SXlOg iu each.
The induction phase is carried out by injecting intraperitoneally 100 pg of Dexamethasone for 3 consecutive days (at OJ-JI-J2, J21-J22-J23 IO and J42-J43-J44).
The sera of the treated mice are collected at different times in order to to evaluate the production of Factor IX by the ELISA technique.
The results (Figures 4a, b, c and d) show that - the expression of the Factor IX reporter gene is induced by 15 Dexamethasone as well after injection of the vector AdTG13092 containing the expression cassette for the GRd "trans-activator" as well as the inducible MMTV-FIX cassette, only after co-injection of two vectors each carrying one of these expression cassettes;
- the expression of FIX is also induced by Dexamethasone after 20 injection of the vector AdTG13088 alone. In this case, the level of FIX expression remains stable during the three inductions. This induction is carried out through the wild-type GR receptor, expressed by murine cells and activatable by Dexamethasone. However, we can note that at the first induction, the level of expression of the FIX
25 is 10 times lower than that obtained in the case of mice expressing the modified GRd receiver "'.
- no expression is detected in the absence of Dexamethasone, which whatever the injected vector. We can validly conclude that the WO 00 / 12'741 PCT / FR99 / 02051 amounts of endogenous glucocorticoids are too low to enable activation of the MMTV promoter via the GR receptor wild;
- in the presence of the modified GRd "'receptor, the level of expression of F1X
5 is comparable to the constitutive promoter CMV.
EXAMPLE 8 In vitro evaluation of the system inducible by GRd ° z in immunodeficient mice.
10 The viruses AdTG13092, AdTG13088 and AdTG13245 (see Figure 3) are injected intravenously into immunosuppressed mice scidlscid at Reason to 5X108 iu. The AdTG13088 and AdTG13075 viruses are also co-injected with reason for SXlOg iu each. Induction is achieved by injecting intraperitoneal 100 pg Dexamethasone for 3 consecutive days (at OJ-Jl-D2, 15 J21-J22-J23 and J42-J43-J44).
Mouse sera are collected at different times to assess the production of the FIX by the ELISA technique.
The results (Figures Sa, b, c and d) are comparable to those observed in the case of immunocompetent mice 20 - expression of the FIX is induced after injection of Dexamethasone in mice expressing the modified GRa "'receptor (injection AdTG13092 or AdTG13088 + AdTG13075). Induction level drops by one log after the second and third ligand injections, then remains stable for the duration of the experiment (7 months). Induction levels are 25 comparable in cis (injection of a single adenoviral vector) and in trans (injection of two adenoviral vectors};
- the expression of FIX is induced by Dexamethasone after injection of the vector AdTG13088, through the wild-type GR receptor. The WO 00/12741 PC'f / FR99 / 02051 induction level is stable over time;
- no basal FIX expression is detected in the absence of Dexamethasone, regardless of the vector injected;
- the level of induction in the presence of GRd ~ 'is comparable to S the expression of the gene linked to the constitutive promoter CMV (at least during of the first induction);
- additional studies have shown the presence of viral DNA by Southern blot, as well as expression of GRd "'by Northern blot, after injection of the vector AdTG13092 or AdTG13075 10 (at least up to 56 days after injection of the adenoviral vectors).
EXAMPLE 9 Evasion of a dose response in vivo in mice immunodeficient ..
The vectors AdTG13092 and AdTG13088 are injected by the intravenously to scidlscid immunodeficient mice at a rate of 5X108 iu.
Induction is carried out by injecting 50 or 5 lzg of intraperitoneally Dexamethasone for 3 consecutive days (on OJ-J1-J2 and J21-J22-J23). The sera are taken at different times to assess the production of FIX
through 20 ELISA.
Preliminary studies have shown that the injection of 3X100 p, g, 3X50 pg or 3X20 pg of Dexamethasone provides induction levels equivalent. In this study, the inventors identified a dose of ligand enabling the expression of the reporter gene via the modified receptor GRa "' 25 provided by an adenoviral vector (AdTG13092), but incapable of activating this expression through endogenous GR (injection AdTG13088).
The injection of 3X5 μg of Dexamethasone makes it possible to activate the expression of FIX in the presence of GRd "', but is unable to activate this expression by through endogenous GR (Figure 6). This dose therefore allows activate the expression of the transgene in a controlled and selective manner, even in presence of wild receptor.
5 EXAMPLE 10: Development of an inducible pressure system capable of prevent the development of an immune response after in vivo administration of adenoviral vector.
Adenoviral vectors represent a system of choice for transferring 10 a therapeutic gene in a patient. However, expression of the transgene East generally transient. For this reason, it is necessary to repeat the adenoviral vector administrations to ensure prolonged expression of therapeutic gene. Unfortunately, a first injection of adenovirus frequently results in the development of an immune response that prevents 15 any new administration. In the context of the present invention, the inventors have developed a new approach based on the expression of a molecule immunosuppressive capable of preventing the development of this response anti-adenovirus immune system. For this, the inventors have inserted the gene coding for interleukin-10 (IL, -10) in a carried inducible expression system through 20 an adenoviral vector. The regulated and controlled expression of the iL-10 allows so the development of protocols for which the re-administration of vectors wearing the therapeutic gene is possible.
a) Involvement of the immune response in the persistence of adenoviruses 25 recombinants - Cellular immune response Deleted vector of EI and E3 regions The importance of the immune response was highlighted during experiments carried out in immunocompetent or immunodeficient mice (Yang Y., FA Nunes, K. Berencsi, EE Furth, E. Gijncz ~ l and JM Wilson.
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 4407-4411). So the expression of the gene IacZ reporter is transient after injection of the adenoviral vector into mouse immunocompetent, but stable in immunodeficient mice. These studies 5 therefore suggest that the transduced cells are detected by the T cells cytotoxic (CTL). In addition, it has been shown that the generation of CTLs is induced by the injected viral particles, and not only by the viral protein neo-synthesized.
10 deleted vector of regions El, E3 and E4 or E2a The deletions of the E4 or E2a regions remove any expression residual viral protein. However, the toxicity is not reduced in eliminating the E2a region. On the other hand, the deletion of the E4 region leads to a decrease significant of hepatic toxicity after intravenous injection. Despite a DNA persistence, however transgene expression is often reduced by importantly.
- Humoral immune response Over 85% of the world's population is immune to adenovinus 20 and has anti-adenovirus antibodies directed against serotypes 2 or 5. If no re-infection occurs, the neutralizing antibody titer drops for reach an undetectable level after 2 years. These antibodies can avoid fixation of the virus on the membrane receptor and its translocation in the cytoplasm.
25 Whatever the deletions of the adenoviral genome, the system immune system is likely to recognize capsid proteins viral and to produce neutralizing anti-adenovirus antibodies. Strategies immunosuppression are therefore required to allow re-administration.

b) Immunosuppression strategy for the humoral immune response Interleukin-10 is known to have properties immunosuppressive and has shown promising results in the case of releases transplant and anti-inflammatory treatments. IL-10 is secreted by of 5 numerous cells (monocytes / macrophages, T cells, B cells after activation by an antigen) and has many target cells (including monocytes / macrophages, B cells, T cells, neutrophils and cells endothelial). It has a pleiotropic effect and has activities immunostimulatory or immunosuppressive depending on the cell type. The 10 human and rat interleukins-10 are very homologous, 84% homology at nucleotide level and 73% at protein level.
II, -10 has an immunosuppressive effect on monocytes / macrophages.
It inhibits the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines, so than expression of MHC class II and co-stimulation molecules. She 15 also limits the duration of the inflammatory response of granulocytes and eosinophils.
In contrast, IL-10 stimulates the viability, the secretion of antibodies and MHC class II expression of B cells. It also has a role of stimulation on mast cells and CD8 + T cells.
Overall, the IL-20 10 however has a very strong immunosuppressive effect.
The anti-inflammatory and immunosuppressive properties of II, -10 may be involved in suppressing the production of antibodies neutralizers against recombinant fadenovin.is. Indeed, the co-injection of adenovirus encoding for IL-10 and for ~ i-galactosidase prevents induction of the response immune 25 against virus and CTL production, allowing expression prolonged of the reporter gene.
However, prolonged immunosuppression is associated with side effects.
not insignificant secondary it is therefore desirable to obtain a immunosuppression transiently and controllably.

c) Inducible system according to the invention The system we have developed is based on induction by hormones. Indeed, these will attach to their nuclear receptor, constituted 5 of a hormone binding domain, a DNA binding domain and of a transactivation domain. After conformational change and fixation on the target elements located at the DNA level, the transcription of the gene located downstream of the regulatable promoter will thus be activated. In order to avoid however activation by endogenous hormones, uncontrollable elements, the inventors have chosen 10 to use modified receptors at the binding domain the hormone.
These mutated receptors such as estrogen receptors or progesterone are able to respond to synthetic exogenous ligands, but not to endogenous hormones.
The inventors have developed a system based on the receptor for 1 S modified glucocorticoids, GRd "', capable of inducing the expression of transgene located downstream of the GRE (Glucocorticoïd Responsive Element) elements after activation by dexamethasone, but not by endogenous glucocorticoids. During of this study, different adenoviral vectors expressing fIL-10 in a inducible were generated, to assess their effects on the anti-immune response 20 adenovirus.
d) Generation of adenoviral vectors All the adenoviral vectors derive from the plasmid pTg6401 comprising the genome of the human adenovirus type 5 deleted from nucleotides 459 to 3327 25 (region) E1) and nucleotides 28,592 to 30,470 (region) E3).
Insert in E1: The modified GRd '~ gene is introduced into the El region of Adenovirus type 5 genome by homologous recombination between the plasmid pTg6401 and the transfer plasmid containing the cDNA GRd "'under the control of CMV promoter (Cytomegalovims), a chimeric intron (pCI; Promega) and a polyadenylation signal from SV40.
Insert in E3: The rat fIL-10 cDNA (Feng L., WW Tang, JC Chang 5 and CB Wilson. 1993. Biochem. Biophys Res. Commun. 192: 452-45) was obtained by reverse PCR on the total mRNA of rat cells using the oligonucleotides OTG12237 (CTAGTCTAGA CCACCATGCT TGGCTCAGCA
CTGCT = SEQ ID N ° 1) and OTG12243 (TTTATAGCGG CCGCTCAATT
TTTCATTTTG AGTG = SEQ ID N ° 2), per 30 denaturation cycles (1 minute 10 to 95 ° C), hybridization of the primers (1 minute at 65 ° C) and extension (1 minute to 72 ° C). The cDNA is placed downstream of 4 elements of response to glucocorticoids GRE (Glucocorticoïd Responsive Element) contained in the LTR promoter of MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus). This expression cassette is introduced into the deleted E3 region transfer plasmid in orientation 15 antisense to the wild E3 region of the adenovirus.
Homoiogue recombination of this transfer vector with the vectors Adenoviral Ad-GRd ~ 'or pTg6401 can generate either a vector carrying the E1 activator expression cassette and the cassette inducible in E3 in antisense orientation (Ad-GRd "'- MMTV / IL, -10-E4 wild) is A vector containing only the E3 induction cassette (Ad-DEl-MMTV / 11.10-E4 wild).
The rat IL-10 cDNA was also placed under the control of the CMV promoter. This constitutive expression cassette was inserted into the E3 region of pTg6401 in antisense orientation (Ad-DEI-CMV / 11,10).
25 All second generation constructions are obtained by homologous recombination between the transfer plasmid containing the frames of reading 3 and 4 (ORF3,4) of the E4 region and the first generation vectors previous.
All of the first and second generation constructions are illustrated in Figure 7.
e) Evaluation of the expression of IL-10 in vitro Transient transfection in 293 cells 293 cells are transfected with transfer plasmids containing expression cassettes for rat interleukin-10 in the presence or absence of the expression cassette for the GRd "activator. They are cultured in presence or not dexamethasone (10- 'M) in DMEM 10% S VF. The supernatants are taken at different times to analyze the expression of the transgene.

In vitro validation of recombinant adenoviruses in A549 cells and IfERO
A549 and VERO cells are seeded at 3.105 cells in 6-well plates. The cells are infected at an MOI of 50 with the 15 different viral presocks in 250 pl DMEM 2% SVF. After 30 minutes adsorption at 37 ° C, 3m1 of DMEM 2% FCS are added to the cells in presence or absence of dexamethasone 10-'M. The supernatants are taken from different times in order to analyze the expression of the transgene.
Quantification of the expression of IL-! 0 rat per ELISA test (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) The detection of rat IL-10 is carried out using the OptEIA kit ~
(Pharmingen). The kits are used according to manufacturers' specifications.
Dexamethasone induction of IL-10 was assessed by transfection 25 transient transfer plasmids into 293 cells.
induction is analyzed by co-transfecting the transfer vector MMTV-IL10 with ie vector expressing the GRd trans-activator ~. The transfection of the plasmid MMTV-IL10 alone will indicate the level of expression of IL-10 in the absence of the trans-activator. Of more, the level of induction is compared with the constitutive expression of IL-10 under control of the CMV promoter, by also transfecting this plasmid into the 293 cells. Induction is performed with or without dexamethasone at a concentration of 10 'M. Culture supernatants are taken 72 and 120 hours after transfection to quantify IL-10 by ELISA kit. The co-transfection 5 of the plasmids MMTV-IL, 10 and GRd "'in the presence of dexamethasone allows induction of IL-10 (50 ng / ml at 120 H post-transfection).
The inventors have demonstrated that the contribution of the GRd "activator" and dexamethasone ligand allows induction of IL expression, -10 under control of the inducible MMTV promoter.
10 Efficiency of induction of IL-10 by dexamethasone coupled with GRC "' was evaluated in vitro by infection of human A549 cells and cells simians VERO with the vectors Ad-MMTV-IL10 ~ AdGRd "'or Ad-GRd' ~ -MMTV-IL10. These two types of infection make it possible to assess the effectiveness induction in trans or cis. Cell cultures are performed in presence 15 or not dexamethasone 10 '' M. The quantities of IL-10 obtained will be compared to that obtained after infection with Ad-CMVIL-10 expressing this constitutively cytokine. On the other hand, the induction of IL, -10 is compared to that of the human TX factor inserted in the same constructions, evaluated in vitro beforehand. The supernatants are removed at 24, 48, 72 and 96 hours post-infection 20 in order to quantify the IL-10 and factor IX produced, using kits ELISA.
In VERO cells, expression of II, -10 is induced when cells are co-infected with Ad-MMTV-IL10 + Ad-CMV-GRa "'in the presence of dexamethasone, to reach 50.8 ng / ml 96 hours after infection. In absence of ligand, IL-10 is barely detectable (1.2 ng / ml). On the contrary, in absence of 25 GRd ~ 'trans-activator, no significant induction of expression of IL-10 does may be noted (3 ng / ml in the presence of dexamethasone, corresponding to the residual expression obtained in transient transfection; 0.7 ng / ml in absence dexamethasone).
The inventors were therefore able to demonstrate that in VERO cells, the expression IL-10 can be induced by dexamethasone coupled to GRd "'en" trams ", when the two expression cassettes are carried by two vectors adenoviral different.
In AS49 cells, they were also able to check the functionality of the system S inducible in "trans". Indeed, the IL-10 concentration reaches 32.3 ng / ml in presence of dexamethasone after co-infection with the vectors Ad-MMTV-IL, 10 + Ad-CMV-GRd "'. In the absence of ligand, cytolcine is undetectable.
The expression IL-10 is also induced by dexamethasone after infection with Ad-MMTV-IL10 vector alone. This activation is done through the receiver GR
10 wild expressed by A549 cells.

LIST OF SEQUENCES
<110> TRANSGENE
<120> INDUCTIBLE EXPRESSION SYSTEM
<130> D17688 <140>
<141>
<160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 35 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> OTG12237 <400> 1 ctagtctaga ccaccatgct tggctcagca ctgct 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> OTG12243 <220>
<400> 2 tttatagcgg ccgctcaatt tttcattttg agtg 34

Claims (34)

REVENDICATIONS 1. Système d'expression inductible comprenant:
(i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel d'origine eucaryote ou virale, placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte, et (ii) un vecteur adénoviral recombinant comportant un gène d'intérêt placé
sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel. 1. Inducible expression system comprising:
(i) the nucleotide sequences encoding a transcriptional activator of eukaryotic or viral origin, placed under the control of the elements of regulation appropriate to their expression in a cell or organism host, and (ii) a recombinant adenoviral vector comprising a gene of interest placed under the control of an inducible promoter capable of being activated by trans by said transcriptional activator. 2. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel comprend au moins un domaine de trans-activation, un domaine de liaison à l'ADN et un domaine de liaison au ligand (DLL). 2. Expression system according to claim 1, characterized in that said transcriptional activator comprises at least one trans-activation domain, a DNA binding domain and a ligand binding domain (DLL). 3. Système d'expression selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel comporte tout ou partie d'un domaine dérivé d'un récepteur d'hormones stéroïdes choisi parmi le groupe constitué par les récepteurs oestrogène (ER), glucocorticoïde (GR), progestérone (PR), Vitamine D, ecdysone (EcR), minéralocorticoïde, androgène, hormone thyroïde, acide rétinoïque et acide rétinoïque X ou encore d'une immunophiline ou d'un récepteur aryl hydrocarbon (AhR). 3. Expression system according to claim 2, characterized in that said transcriptional activator comprises all or part of a domain derived from a steroid hormone receptor selected from the group consisting of receivers estrogen (ER), glucocorticoid (GR), progesterone (PR), Vitamin D, ecdysone (EcR), mineralocorticoid, androgen, thyroid hormone, retinoic acid and acid retinoic X or an immunophilin or an aryl hydrocarbon receptor (AhR). 4. Système d'expression selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel est choisi parmi:

(i) un polypeptide désigné GR dex comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivés d'un récepteur aux glucocorticoïdes, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de l'isoleucine en position 747 par une thréonine ;
(ii) un polypeptide désigné ER T comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivé d'un récepteur à
l'oestrogène, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de la glycine en position 521 par une arginine ;
(iii) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un DLL dérivé du récepteur à l'ecdysone, un domaine de liaison à l'ADN hybride dérivé de ceux des récepteurs EcR et GR et un domaine de trans-activation dérivé de la protéine virale VP 16 et un second polypeptide dérivé de la protéine USP de drosophile ou d'un homologue tel que le récepteur de l'acide rétinoïque X (RXR) humain ;
(iv) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un domaine de liaison à l'ADN dérivé du facteur de transcription ZFHD1 et un DLL dérivé de l'immunophifine FKBP12 et un second polypeptide comportant un domaine de trans-activation dérivé du facteur NFxB p65 et un DLL dérivé de FRAP (FKBP 12-rapamycine-associated protein); et (v) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide dérivé
du récepteur AhR et un second polypeptide dérivé de la protéine Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator). 4. Expression system according to claim 3, characterized in that said transcriptional activator is chosen from:

(i) a polypeptide designated GR dex comprising a DNA binding domain, a trans-activation domain and a DLL derived from an aux receptor glucocorticoids, said receptor being modified in its DLL, in particular by substitution of isoleucine at position 747 by a threonine;
(ii) a polypeptide designated ER T comprising a DNA binding domain, a trans-activation domain and a DLL derived from a receptor at estrogen, said receptor being modified in its DLL, in particular by substitution of glycine at position 521 by an arginine;
(iii) a transcriptional activator comprising a first polypeptide comprising a DLL derived from the ecdysone receptor, a domain of hybrid DNA binding derived from those of the EcR and GR receptors and a trans-activation domain derived from the viral protein VP 16 and a second polypeptide derived from Drosophila USP protein or a homolog such as human retinoic acid X receptor (RXR);
(iv) a transcriptional activator comprising a first polypeptide comprising a DNA-binding domain derived from factor ZFHD1 transcript and a DLL derived from the immunophifin FKBP12 and a second polypeptide comprising a trans-activation domain derived from NFxB factor p65 and a FRAP-derived DLL (FKBP 12-rapamycin-associated protein); and (v) a transcriptional activator comprising a first polypeptide derived of the AhR receptor and a second polypeptide derived from the Arnt protein (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator). 5. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce en ce que ledit activateur transcriptionnel comprend un DLL et un domaine de trans-activation dérivé d'un récepteur stéroïdien et un domaine de liaison à l'ADN
hétérologue, notamment dérivé de la protéine de levure Gal4. 5. Expression system according to one of claims 1 to 4, characterized in this in that said transcriptional activator comprises a DLL and a domain of trans-activation derived from a steroid receptor and a DNA binding domain heterologous, in particular derived from the yeast protein Gal4. 6. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel est activé par liaison d'un inducteur non naturel et n'est pas ou peu activé par un composé humain naturel. 6. Expression system according to one of claims 1 to 5, characterized in that said transcriptional activator is activated by binding an inducer not natural and is not or only slightly activated by a natural human compound. 7. Système d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit inducteur non naturel est une substance synthétique administrable par voie orale. 7. Expression system according to claim 6, characterized in that said non-natural inducer is a synthetic substance that can be administered by oral. 8. Système d'expression selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit inducteur est choisi parmi le groupe constitué par la déxaméthasone, le tamoxifène, le muristérone A, l'ecdysone, la rapamycine et le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine ou un analogue de ces composés. 8. Expression system according to claim 7, characterized in that said inducer is chosen from the group consisting of dexamethasone, tamoxifen, muristerone A, ecdysone, rapamycin and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin or an analog of these compounds. 9. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt code pour un ARN anti-sens, un ribozyme, ou encore un polypeptide d'intérêt. 9. Expression system according to one of claims 1 to 8, characterized in that said gene of interest encodes an antisense RNA, a ribozyme, or even a polypeptide of interest. 10. Système d'expression selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit polypeptide d'intérêt est choisi parmi le groupe constitué par les chémokines, les cytokines, les récepteurs cellulaires, les ligands, les facteurs de coagulation, la protéine CFTR, l'insuline, la dystrophine, les facteurs de croissance, les enzymes, les inhibiteurs d'enzyme, les polypeptides à effet anti-tumoral, les polypeptides capables d'inhiber une infection bactérienne, parasitaire ou virale, les polypeptides agissant sur l'apoptose, les agents cytostatiques, les immunoglobulines, les apolipoprotéines, les produits cytotoxiques, les produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, les antigènes associés aux tumeurs, les immunotoxines, les inhibiteurs d'angiogénèse et les marqueurs. 10. Expression system according to claim 9, characterized in that said polypeptide of interest is chosen from the group consisting of chemokines, them cytokines, cellular receptors, ligands, factors of clotting, the CFTR protein, insulin, dystrophin, growth factors, enzymes, enzyme inhibitors, polypeptides with an anti-tumor effect, polypeptides capable of inhibiting a bacterial, parasitic or viral infection, the polypeptides acting on apoptosis, cytostatic agents, immunoglobulins, apolipoproteins, cytotoxic products, expression products of Genoa tumor suppressors, tumor associated antigens, immunotoxins, angiogenesis inhibitors and markers. 11. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce ledit promoteur inductible comprend une ou plusieurs séquence(s) cible(s) répondant à un activateur transcriptionnel tel que défini dans l'une des revendications 2 à 8. 11. Expression system according to one of claims 1 to 10, characterized in this said inducible promoter comprises one or more target sequence(s) responding to a transcriptional activator as defined in one of claims 2 to 8. 12. Système d'expression selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite séquence cible est une séquence ERE, GRE, EcR, UAS, 5xE/GRE, XRE ou une séquence cible répondant au facteur de transcription ZFDH-1. 12. Expression system according to claim 11, characterized in that said target sequence is an ERE, GRE, EcR, UAS, 5xE/GRE, XRE sequence or a target sequence responding to the ZFDH-1 transcription factor. 13. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques et leurs éléments de régulation sont portés par ledit vecteur adénoviral recombinant. 13. Expression system according to one of claims 1 to 12, characterized in this that said nucleotide sequences and their regulatory elements are doors by said recombinant adenoviral vector. 14. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques et leurs éléments de régulation sont portés par un vecteur d'expression indépendant autre que ledit vecteur adénoviral recombinant. 14. Expression system according to one of claims 1 to 12, characterized in this that said nucleotide sequences and their regulatory elements are doors by an independent expression vector other than said adenoviral vector recombinant. 15. Système d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit vecteur indépendant est un vecteur synthétique, un plasmide ou un vecteur viral, notamment dérivé d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus associé à
l'adénovirus (AAV), d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un parvovirus, d'un poxvirus (fowlpox, canaripox, virus de la vaccine.) ou d'un foamyvirus. 15. Expression system according to claim 14, characterized in that said independent vector is a synthetic vector, a plasmid or a vector viral, in particular derived from an adenovirus, a retrovirus, a virus associated with adenovirus (AAV), a herpes virus, an alphavirus, a parvovirus, of one poxvirus (fowlpox, canaripox, vaccinia virus.) or a foamyvirus. 16. Système d'expression selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé
en ce que ledit vecteur adénoviral recombinant et, le cas échéant, ledit vecteur adénoviral indépendant sont déficients pour la fonction E1 par délétion de tout ou partie de la région E1 ou mutation non fonctionnelle de cette dernière. 16. Expression system according to one of claims 13 to 15, characterized in this that said recombinant adenoviral vector and, where appropriate, said vector adenoviral independent are deficient for the E1 function by deletion of all or part of the E1 region or a non-functional mutation of the latter. 17. Système d'expression selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral recombinant et/ou ledit vecteur adénoviral indépendant est/sont en outre déficient(s) pour au moins l'une des fonctions E2, E4, L1, L2, L3, L4 et/ou L5. 17. Expression system according to claim 16, characterized in that said recombinant adenoviral vector and/or said independent adenoviral vector is are additionally deficient in at least one of the functions E2, E4, L1, L2, L3, L4 and/or L5. 18. Système d'expression selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral recombinant et/ou ledit vecteur adénoviral indépendant est/sont en outre dépourvu(s) de tout ou partie de la région non essentielle E3. 18. Expression system according to claim 16 or 17, characterized in that that said recombinant adenoviral vector and/or said adenoviral vector independent is/are additionally devoid of all or part of the non-essential region E3. 19. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral recombinant et, le cas échéant, ledit vecteur indépendant sont sous forme de particules virales infectieuses. 19. Expression system according to one of claims 1 to 18, characterized in this that said recombinant adenoviral vector and, where appropriate, said vector independent are in the form of infectious viral particles. 20. Vecteur adénoviral recombinant comprenant (i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte, et (ii) un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel. 20. Recombinant adenoviral vector comprising (i) the nucleotide sequences encoding a transcriptional activator placed under the control of regulatory elements appropriate to their expression in a host cell or organism, and (ii) a gene of interest placed under the control of an inducible promoter capable of being activated in trans by said transcriptional activator. 21. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 20, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques codent pour un activateur transcriptionnel selon l'une des revendications 2 à 6 ou pour un activateur transcriptionnel procaryotique, notamment un polypeptide comprenant un DLL et un domaine de liaison à l'ADN dérivé d'un répresseur de l'opéron tétracycline. 21. Recombinant adenoviral vector according to claim 20, characterized in this that said nucleotide sequences code for an activator transcriptional according to one of claims 2 to 6 or for a transcriptional activator prokaryotic, in particular a polypeptide comprising a DLL and a domain of binding to DNA derived from a repressor of the tetracycline operon. 22. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques codent pour le polypeptide tTA
comprenant un répresseur de l'opéron tétracycline (tetR) fusionné en phase à un domaine d'activation de la transcription dérivé de la protéine virale VP16. 22. Recombinant adenoviral vector according to claim 21, characterized in this that said nucleotide sequences code for the tTA polypeptide including a repressor of the tetracycline operon (tetR) fused in frame to a domain activation of transcription derived from the viral protein VP16. 23. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que ledit inducteur non naturel est tel que défini dans la revendication 7 ou 8 ou est constitué par la doxycycline ou la tétracycline. 23. Recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 22, characterized in that said unnatural inducer is as defined in the claim 7 or 8 or consists of doxycycline or tetracycline. 24. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt est tel que défini dans la revendication 9 ou 10. 24. Recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 23, characterized in that said gene of interest is as defined in the claim 9 or 10. 25. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisé en ce que ledit promoteur inductible est tel que défini dans la revendication 11 ou 12 ou comprend une ou plusieurs séquence(s) cible(s) tetO. 25. Recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 24, characterized in that said inducible promoter is as defined in the claim 11 or 12 or comprises one or more tetO target sequence(s). 26. Vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral recombinant est tel que défini dans l'une des revendications 16 à 18. 26. Recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 25, characterized in that said recombinant adenoviral vector is as defined in one of claims 16 to 18. 27. Particule virale infectieuse comprenant un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26. 27. Infectious viral particle comprising a recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 26. 28. Procédé de préparation d'une particule virale selon la revendication 27, dans lequel:
(i) on introduit un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26 dans une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée, (ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et (iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire. 28. Process for the preparation of a viral particle according to claim 27, in which:
(i) introducing a recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 26 in a complementation cell capable to complement said vector in trans, so as to obtain a transfected complementation cell, (ii) said transfected complementation cell is cultured in appropriate conditions to enable the production of said viral particle, and (iii) said viral particle is recovered in the cell culture. 29. Cellule eucaryote comprenant un système d'expression selon l'une des revendications 1 à 19, un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26 ou une particule virale infectieuse selon la revendication 27. 29. Eukaryotic cell comprising an expression system according to one of claims 1 to 19, a recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 26 or an infectious viral particle according to claim 27. 30. Composition pharmaceutique comprenant un système d'expression selon l'une des revendications 1 à 19, un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26, une particule virale infectieuse selon la revendication 27 ou une cellule eucaryote selon la revendication 29 et un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique. 30. Pharmaceutical composition comprising an expression system according to one of claims 1 to 19, a recombinant adenoviral vector according to one of claims 20 to 26, an infectious viral particle according to claim 27 or a eukaryotic cell according to claim 29 and an acceptable carrier of a point from a pharmaceutical point of view. 31. Composition pharmaceutique selon la revendication 30, caractérisée en ce en ce qu'elle est sous forme injectable. 31. Pharmaceutical composition according to claim 30, characterized in that in what it is in injectable form. 32. Utilisation d'un système d'expression selon l'une des revendications 1 à
19, d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26, d'une particule virale infectieuse selon la revendication 27 ou d'une cellule eucaryote selon la revendication 29, pour la préparation d'un médicament destiné au transfert et à l'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte. 32. Use of an expression system according to one of claims 1 to 19, of a recombinant adenoviral vector according to one of Claims 20 to 26, of one infectious viral particle according to claim 27 or of a cell eukaryotic according to claim 29, for the preparation of a medicament intended for transfer and expression of said gene of interest in a host cell or organism. 33. Utilisation d'un système d'expression selon l'une des revendications 1 à
19, d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26, d'une particule virale infectieuse selon la revendication 27 ou d'une cellule eucaryote selon la revendication 29, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies par thérapie génique. 33. Use of an expression system according to one of claims 1 to 19, of a recombinant adenoviral vector according to one of Claims 20 to 26, of one infectious viral particle according to claim 27 or of a cell eukaryotic according to claim 29, for the preparation of a medicament intended for treatment of diseases by gene therapy. 34. Activateur transcriptionnel comprenant un DLL et un domaine de trans-activation dérivé d'un récepteur stéroïdien et un domaine de liaison à l'ADN
hétérologue, notamment dérivé de la protéine de levure Gal4. 34. Transcriptional activator comprising a DLL and a trans-activation derived from a steroid receptor and a DNA binding domain heterologous, in particular derived from the yeast protein Gal4.