CA2330242A1 - Polypeptides with beta-secretase type activity - Google Patents

Abstract

The invention concerns novel peptides and their pharmaceutical use. More particularly, the invention concerns novel polypeptides having a .beta.-secretase type activity characterised in that they are capable of specifically cleaving the natural .beta.-amyloid peptide precursor (APP).

Description

POLYPEPTIDES POSSEDANT UNE ACTIVITE DE TYPE ~i-SECRETASE
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides possédant une activité de type ~3-secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel du peptide (3-amyloïde (APP).
Les individus atteints par la maladie d'Alzheimer présentent des symptômes caractéristiques d'altérations de la mémoire, de perte des capacités intellectuelles et des fonctions cognitives. Ces changements pathologiques s'accompagnent d'une atrophie neuronale, d'une déplétion importante d'un certain type de récepteurs et également d'une réduction des connexions synaptiques. Ce syndrome comporte la présence de plaques séniles et de dégénérescences neurofibrillaires en quantités très importantes, principalement dans le cortex cérébral, l'hippocampe, le noyau amygdalien et dans les vaisseaux sanguins corticaux.
Les plaques dites séniles sont des structures sphériques qui s'établissent lentement sur une dizaine d'années dans les espaces extracellulaires de l'hippocampe, du cortex et d'autres régions cérébrales. Leur constituant majeur est le peptide ~i amyloïde (A(3) associé à d'autres protéines anormales. Ces structures sont entourées par des axones et des neurones anormaux.
Les dégénérescences neurofibrillaires sont dues à une accumulation de faisceaux denses de fibres anormales dans le cytoplasme de certains neurones et principalement des cellules pyramidales du cortex. Ces enchevëtrements neurofibrillaires sont constitués d'une forme particulière de la proteine tau qui, associée à d'autres protéines, donne des paires de neurofilaments hélicoïdaux qui perturbent la conduction de l'influx nerveux. POLYPEPTIDES HAVING ~ i-SECRETASE ACTIVITY
The present invention relates to new polypeptides and their use pharmaceutical. More particularly, the present invention relates to new polypeptides having an activity of the type ~ 3-secretase characterized in that they are capable of specifically cleaving the natural precursor of the peptide (3-amyloid (APP).
Individuals with Alzheimer's disease have symptoms characteristics of memory impairment, loss of capacity intellectual and cognitive functions. These pathological changes are accompanied by neuronal atrophy, significant depletion of a certain type of receptor and also a reduction in synaptic connections. This syndrome involves presence of senile plaques and neurofibrillary degeneration in very quantities important, mainly in the cerebral cortex, the hippocampus, the nucleus tonsil and in cortical blood vessels.
The so-called senile plates are spherical structures which are established slowly over a decade in the extracellular spaces of the seahorse, of the cortex and other brain regions. Their major constituent is peptide ~ i amyloid (A (3) associated with other abnormal proteins. These structures are surrounded by abnormal axons and neurons.
Neurofibrillary degenerations are due to an accumulation of dense bundles of abnormal fibers in the cytoplasm of certain neurons and mainly pyramidal cells of the cortex. These tangles neurofibrillaries are made up of a particular form of the tau protein who, associated with other proteins, gives pairs of helical neurofilaments who disrupt the conduction of nerve impulses.

2 Des formes familiales de cette maladie ont été répertoriées et semblent résulter de modifications génétiques variées qui toutes provoquent l'accumulation anormale du peptide A(i. Ces dernières, très hétérogènes, ont été en particulier associées à diverses mutations sur les chromosomes 1,14 et 21. Ce dernier a d'autant plus suscité l'intérêt qu'il porte le gène codant pour la protéine précurseur du A(3. On comprend donc l'apparition précoce (55 ans) de la maladie d'Alzheimer chez les sujets atteints du Syndrome de Down (trisomie 21 ).
Il est à noter que les individus affectés par des formes familiales de la maladie ne représentent qu'un faible pourcentage parmi les sujets atteints.
Dans la quasi-totalité des cas de maladie d'Alzheimer non liés aux formes familiales, les individus agés de plus de 70 ans présentent des plaques séniles dans diverses régions du cerveau. Leur répartition est en revanche différente selon le type de démence concernée.
D'une masse moléculaire de 4 kDa, le peptide A~3 humain est généré par clivages protéolytiques de son précurseur (APP) aux sites Met596-Asps9~ et Va1636-I1e63~. La molécule libérée est constituée de 39 (à 42) acides aminés dont la séquence protéique est la suivante DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA
En solution aqueuse, ce peptide adopte un arrangement tridimensionnel de type feuillet (3 plissé. Sa partie COOH-terminal très hydrophobe lui confère des propriétés d'agrégation dont le taux d'oligomérisation est fonction du pH
(formation maximale à pH=5.4) et de la concentration du peptide. De plus, la séquence comprise entre les résidus GIy25 et Met35 confère à ce peptide des propriétés neurotrophiques et neurotoxiques.
Le peptide A(3 est un produit naturel secrété par les cellules et détectable dans le sang et le liquide cérébro-spinal. Bien que ce peptide soit neurotoxique, sa production n'est cependant pas suffisante à la formation des plaques amyloïdes. Un WO 99/b4587 PCT/FR99/01326 2 Familial forms of this disease have been identified and appear to be result from various genetic modifications which all cause the accumulation abnormal peptide A (i. The latter, very heterogeneous, have been particular associated with various mutations on chromosomes 1,14 and 21. The latter has especially more aroused the interest he carries the gene coding for the precursor protein from A (3.
therefore includes the early onset (55 years) of Alzheimer's disease in subjects with Down Syndrome (Down's syndrome).
It should be noted that individuals affected by familial forms of sickness represent only a small percentage among those affected.
In almost all cases of Alzheimer's disease not linked to the forms family, individuals over 70 have plaques senile in various regions of the brain. Their distribution is however different according to the type dementia affected.
With a molecular mass of 4 kDa, the human A ~ 3 peptide is generated by proteolytic cleavages of its precursor (APP) at the Met596-Asps9 ~ sites and Va1636-I1e63 ~. The molecule released consists of 39 (to 42) amino acids, the sequence protein is as follows DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA
In aqueous solution, this peptide adopts a three-dimensional arrangement of sheet type (3 pleated. Its very hydrophobic COOH-terminal part gives it of aggregation properties whose oligomerization rate is a function of pH
(training maximum at pH = 5.4) and the concentration of the peptide. In addition, the sequence understood between residues GIy25 and Met35 gives this peptide properties neurotrophic and neurotoxic.
Peptide A (3 is a natural product secreted by cells and detectable in blood and cerebrospinal fluid. Although this peptide is neurotoxic, her however, production is not sufficient for plaque formation amyloids. A

WO 99 / b4587 PCT / FR99 / 01326

3 "processing" altéré ou une surexpression de son précurseur prédisposeraient au dépôt du A(3 dans le cerveau.
Le transcrit primaire du précurseur du peptide (3-amyloïde (APP) subit un épissage alternatif pour générer des ARNm codant pour au moins 5 isoformes de 563, 695, 714, 751 et 770 acides aminés (a.a.), exprimées de façon ubiquitaire dans les tissus et dont le taux diffère suivant le type cellulaire.
Les isoformes APP695 et 751 sont cependant restreintes exclusivement au système nerveux central et périphérique (notamment au niveau des synapses dans les astrocytes et des neurones) où ils peuvent jouer un rôle dans l'activité
physiologique des synapses. Les isoformes APP751, APP563 et APP770 contiennent un "insert"
de 56 a.a. homologue à l'inhibiteur de protéase de type "Kunitz". Par ailleurs, la forme secrétée de fAPP751 est identique à la nexine II, un inhibiteur de protéase impliqué
dans la régulation des sérines protéases extracellullaires.
L'APP est une glycoprotéine d'environ 120 kDa présentant les caractéristiques 1 S d'un récepteur de surface de type II. Bien que la fonction réelle de l'APP
n'ait pas encore été élucidée, des études ont montré que cette glycoprotéine pourrait jouer un rôle dans la régulation de la croissance cellulaire ainsi que dans les interactions d'adhésion dans l'inflammation, la regénération et la réponse immunitaire.
Toutes les isoformes de l'APP sont insérées dans le réticulum endoplasmique grâce à leur séquence "signal". Le précurseur est ensuite ciblé vers l'appareil de Golgi où il subit différentes modifications post-traductionnelles pour ëtre ensuite ancré dans la membrane. Sous l'action de différentes protéases, l'APP peut alors y subir divers clivages (voir figure 1 ), dont certains sont majoritaires L'activité protéasique, appelée a-secrétase, clive à l'intérieur de la séquence A(3 entre les résidus Lys6~2 et Leu6~3 de l'APP695 pour générer un fragment NHZ-terminal secrété (désigné sAPPa : APPa soluble) et contenant les 16 premiers a.a. du A(3. 3 altered "processing" or an overexpression of its precursor would predispose to deposit of A (3 in the brain.
The primary transcript of the peptide precursor (3-amyloid (APP) undergoes a alternative splicing to generate mRNAs encoding at least 5 isoforms of 563, 695, 714, 751 and 770 amino acids (aa), expressed ubiquitously in the tissues and whose rate differs depending on the cell type.
The APP695 and 751 isoforms are however restricted exclusively to central and peripheral nervous system (especially at the synapses in the astrocytes and neurons) where they can play a role in activity physiological synapses. The isoforms APP751, APP563 and APP770 contain an "insert"
of 56 aa homolog to the protease inhibitor of the "Kunitz" type. Otherwise, the form secreted from fAPP751 is identical to nexin II, a protease inhibitor involved in the regulation of extracellullary serine proteases.
APP is a glycoprotein of around 120 kDa with the characteristics 1 S of a type II surface receiver. Although the actual function of the APP
don't have further elucidated, studies have shown that this glycoprotein could play a role in the regulation of cell growth as well as in interactions adhesion in inflammation, regeneration and immune response.
All APP isoforms are inserted into the endoplasmic reticulum thanks to their "signal" sequence. The precursor is then targeted to the Golgi apparatus where it undergoes different post-translational modifications to then be anchored in the membrane. Under the action of different proteases, APP can then undergo various cleavages (see Figure 1), some of which are the majority Protease activity, called a-secretase, cleaves inside the sequence A (3 between residues Lys6 ~ 2 and Leu6 ~ 3 of APP695 to generate a fragment NHZ-secret terminal (designated sAPPa: soluble APPa) and containing the first 16 yy A (3.

4 L'activité protéasique, appelée (3-secrétase, clive la liaison peptidique du doublet Met596-Asps9~ au sein du précurseur pour libérer un fragment APP NH~-terminal secrété (désigné sAPPp: APPp soluble) délété totalement du A (3.
La 3'"'e activité protéasique, appelée y-secrétase, pourrait aussi agir entre les résidus Va1636 à IIe63~ du précurseur pour générer une proforme secrétée APP., contenant le A (3.
Le constituant majeur des plaques séniles, qui apparaissent aussi bien dans les formes familiales que non familiales de la maladie d'Alzheimer est le peptide ~3-amyloïde {A(3).
Le peptide A(3 résulte du clivage de son précurseur, l'APP, au site Mets96-Asp59~ de l'APP selon une activité protéasique de type ~3-secrétase et au site Va1636 -Iie63~ selon une activité protéasique de type y-secrétase.
Parmi les formes les formes familiales de la maladie d'Alzheimer, une mutation en relation avec le site de clivage (3-secrétase a été identifiée. Il s'agit de la double mutation "suédoise" de l'APP (Lys59s-Met596~Asn-Leu dans l'APP695) et qui présente une production accrue du peptide A~3 (donc une augmentation de la maturation de l'APP en faveur de la voie amyloïdogénique).
Cependant, il n'en demeure pas moins que dans la très grande majorité des cas de maladie d'Alzheimer, l'APP est dans sa forme naturelle avec un site de clivage ~i-secrétase non muté.
Certaines protéases issues de l'homme, du rat ou du singe ont été étudiées par divers auteurs et sont supposées être impliquées dans la maturation du précurseur APP.
Parmi ces enzymes on peut citer tout particulièrement les sérine protéases 1 et 2 (Abraham et al. ( I99I ), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796;
Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948; Matsumoto et al. (1994), Neurosciences Letters, 195, I71-174) ainsi que la Cathepsine G-like (Razzaboni et al.
(1992), Brain Research, 589, 207-2I6). Ces enzymes d'origine humaine ou simienne, clivent au niveau du site Met596-Asp597 de I'APP selon une activité protéasique de type (3-secrétase, cependant, elles ont été mises en évidence ou partiellement purifiées à partir de patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
Etant donné que la formation du peptide ~i-amyloïde résulte de l'action d'enzyme de type (3-secrétase sur l'APP, on comprend l'importance de l'identification 4 The protease activity, called (3-secretase), cleaves the peptide bond of doublet Met596-Asps9 ~ within the precursor to release an APP NH fragment ~ -secret terminal (designated sAPPp: soluble APPp) completely deleted from A (3.
The 3 '"' e protease activity, called y-secretase, could also act between the residues Va1636 to IIe63 ~ of the precursor to generate a deep secreted APP., containing the A (3.
The major constituent of senile plaques, which also appear in the familial than non-familial forms of Alzheimer's disease is the peptide ~ 3-amyloid {A (3).
Peptide A (3 results from the cleavage of its precursor, APP, at the Mets96- site Asp59 ~ of APP according to a protease activity of the type ~ 3-secretase and at the site Va1636 -Iie63 ~ according to a protease activity of the y-secretase type.
Among the family forms of Alzheimer's disease, one mutation related to the cleavage site (3-secretase has been identified.
this is the double "Swedish" mutation of APP (Lys59s-Met596 ~ Asn-Leu in APP695) and who shows an increased production of the peptide A ~ 3 (therefore an increase in the maturation of APP in favor of the amyloidogenic pathway).
However, the fact remains that in the vast majority of cases of Alzheimer's disease, APP is in its natural form with a site of cleavage ~ i-non-mutated secretase.
Certain proteases from humans, rats and monkeys have been studied by various authors and are believed to be involved in the maturation of the precursor APP.
Among these enzymes, mention may be made most particularly of serine proteases 1 and 2 (Abraham et al. (I99I), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796;
Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948; Matsumoto et al. (1994), Neuroscience Letters, 195, I71-174) as well as G-like Cathepsin (Razzaboni et al.
(1992), Brain Research, 589, 207-2I6). These enzymes of human or simian origin, cleave at level of the APP Met596-Asp597 site according to a protease-type activity (3-secretase, however, they have been highlighted or partially purified from of patients with Alzheimer's disease.
Since the formation of the peptide ~ i-amyloid results from the action enzyme type (3-secretase on APP, we understand the importance of identification

5 et de la caractérisation de système{s) enzymatiques) de type ~3-secrétase responsables) sélectivement de la maturation post-traductionnelle du précurseur du peptide (3-amyloïde au niveau du site Met596-Asps9~ dans les cellules humaines ne provenant pas de patients atteints par la maladie d'Alzheimer. La connaissance de ces nouveaux systèmes enzymatiques permettent ainsi d'envisager la préparation de nouvelles molécules utilisables pharmaceutiquement et notamment capables d'intervenir sur le métabolisme du peptide (3-amyloïde dans des formes non familiales de la maladie d'Alzheimer.
La présente invention résulte donc de l'identification et de la caractérisation par la demanderesse de polypeptides possédant une activité catalytique vis-à-vis du précurseur du peptide (3-amyloïde (APP) de type p-secrétase. Au contraire des autres protéases identifiées, les polypeptides de la présente invention ont une spécificité
d'action envers la forme naturelle de fAPP. La présente invention découle en particulier de la mise en évidence d'un polypeptide de 70 kDa, capable de cliver les formes non mutées de l'APP.
Un premier objet de l'invention concerne donc des polypeptides ou leurs variants possédant une activité de type ~3-secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précuseur naturel du peptide (3-amyloïde (APP).
Au sens de la présent invention, le terme variant désigne toute molécule ayant la même activité que les polypeptides de l'invention, obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, 5 and the characterization of system (s) enzymatic) type ~ 3-secretase responsible) selectively for the post-translational maturation of precursor of peptide (3-amyloid at the Met596-Asps9 ~ site in human cells born not from patients with Alzheimer's disease. The knowledge of these new enzymatic systems thus make it possible to envisage the preparation of new molecules which can be used pharmaceutically and in particular capable to intervene on the metabolism of the peptide (3-amyloid in non-family Alzheimer's disease.
The present invention therefore results from the identification and characterization by the applicant for polypeptides having a catalytic activity with live of precursor of the peptide (3-amyloid (APP) of the p-secretase type.
other proteases identified, the polypeptides of the present invention have a specificity of action towards the natural form of fAPP. The present invention follows from in particular the demonstration of a 70 kDa polypeptide capable of cleave them non-mutated forms of APP.
A first subject of the invention therefore relates to polypeptides or their variants having a ~ 3-secretase activity characterized in that they are capable of specifically cleaving the natural precursor of the peptide (3-amyloid (APP).
Within the meaning of the present invention, the term variant designates any molecule having the same activity as the polypeptides of the invention, obtained by modification of genetic and / or chemical nature of the peptide sequence. By modification of nature genetic and / or chemical, we can hear any mutation, substitution, deletion,

6 addition, et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels variants peuvent être générés dans des buts différents, tel que celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance aux protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés biologiques. Parmi les variants résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partiE hétérologue supplémentaire liée à l'extrëmité. Le terme variant comprend également des polypeptides homologues aux polypeptides décrits dans la présente invention, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'autres organismes.
Le substrat que clivent les polypeptides de l'invention ne présente pas de mutation dans sa séquence peptidique et en particulier le précurseur du peptide [3-amyloïde ne porte pas la double mutation suédoise. Les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont capables de cliver sélectivement la liaison peptidique du doublet Mets9b-Asps9~ au sein de la forme native ou naturelle de l'APP. En particulier, les polypeptides de l'invention ne clivent pas les formes d'APP ayant la mutation suédoise (Lyss9s-Mets96~Asn-Leu). Cette dernière ayant été mise en évidence à partir de prélèvements réalisés sur le cerveau de patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
Les polypeptides selon l'invention ont été purifiés à partir de cellules humaines de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer et sont capables de cliver exclusivement l'APP dans sa forme naturelle au niveau de la liaison peptidique du doublet Mets96-Asps9'.
Les polypeptides de l'invention sont caractérisés en ce que leur activité
n'est pas dépendante d'un second substrat et/ou d'un ligand. On peut citer à titre d'exemples les ions et plus particulièrement des cations tels que les cations magnésiques ou calciques. En effet, d'autres protéines comme les sérines protéases 1 et 2 ou la Cathepsine G-like ayant une activité protéasique, nécéssitent la présence du calcium pour être actives.

WO 99/64586 addition, and / or modification of one or more residues. Such variants can be generated for different purposes, such as improving their levels of production, that of increasing its resistance to proteases, that of increasing and / or modify sound activity, or that of giving it new biological properties. Among the variants resulting from an addition, mention may, for example, be made of the polypeptides chimeras with an additional heterologous party linked to the extremity. The term variant also includes polypeptides homologous to the polypeptides described in the present invention, from other cellular sources and in particular from other cells organizations.
The substrate cleaved by the polypeptides of the invention does not have any mutation in its peptide sequence and in particular the precursor of peptide [3-amyloid does not carry the Swedish double mutation. The polypeptides of the invention or their variants are capable of selectively cleaving the peptide bond of doublet Mets9b-Asps9 ~ within the native or natural form of the APP. In particular, the polypeptides of the invention do not cleave the APP forms having the mutation swedish (Lyss9s-Mets96 ~ Asn-Leu). The latter having been highlighted from brain samples from patients with the disease Alzheimer's.
The polypeptides according to the invention were purified from cells human subjects not affected by Alzheimer's disease and are capable of cleave exclusively APP in its natural form at the peptide bond of doublet Mets96-Asps9 '.
The polypeptides of the invention are characterized in that their activity is not not dependent on a second substrate and / or a ligand. We can cite as examples ions and more particularly cations such as magnesium cations or calcium. Indeed, other proteins such as serine proteases 1 and 2 or the Cathepsin G-like having protease activity, requires the presence of calcium to be active.

WO 99/6458

7 PCT/FR99/01326 Les polypeptides selon l'invention possèdent une masse moléculaire comprise entre 65 et 75 kDa et préférentiellement leur masse moléculaire est d'environ 70 kDa.
Leur point isoéléctrique est compris entre 6.0 et 7.0 et de préférence est égal à 6Ø
Ces polypeptides sont des endopeptidases de la famille des sérines protéases.
Préférentiellement, ces endopeptidases sont de type chymotrypsine sensible. En effet, le profil d'inhibition montre que ces endopeptidases sont totalement inhibées par le PMSF (Phenylmethane-sulfonil fluoride) et partiellement inhibées par le pefablock, le TPCK(L-1-Chloro-3-[4tosylamido)-4-phenyl-2-butanone), la benzamidine. En outre, elles sont totalement résistantes à l'inhibition par l'antipapaïne.
Les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont caractérisés par une activité (3-secrétase maximale à un pH compris entre 7 et 8.
L'invention a également pour objet des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques capables de cliver au site Mets96-Asp59~ le précurseur du peptide (3-amyloïde. De tels composés sont obtenus par reproduction des motifs actifs du polypeptide selon l'invention par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques et qui soient compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation de polypeptides tels que décrits ci-avant pour la préparation de molécules non peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ces polypeptides qui sont importants pour leur activité et la reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
Selon une variante de l'invention, les polypeptides ou leurs variants comprennent en outre une séquence signal permettant une localisation cellulaire précise. Parmi les séquences utilisables, on peut citer de manière préférée, la séquence du peptide signal de lgkB, le peptide signal de l'APP, les peptides signal des 7 PCT / FR99 / 01326 The polypeptides according to the invention have a molecular mass included between 65 and 75 kDa and preferably their molecular mass is approximately 70 kDa.
Their isoelectric point is between 6.0 and 7.0 and preferably is equal to 6Ø
These polypeptides are endopeptidases of the serine protease family.
Preferably, these endopeptidases are of the sensitive chymotrypsin type. In effect, the inhibition profile shows that these endopeptidases are completely inhibited speak PMSF (Phenylmethane-sulfonil fluoride) and partially inhibited by pefablock, the TPCK (L-1-Chloro-3- [4tosylamido) -4-phenyl-2-butanone), benzamidine. In outraged, they are completely resistant to inhibition by antipapain.
The polypeptides of the invention or their variants are characterized by a activity (maximum 3-secretase at a pH between 7 and 8.
A subject of the invention is also non-peptide or non-peptide compounds.
exclusively peptide capable of cleaving at the Mets96-Asp59 ~ site precursor of peptide (3-amyloid. Such compounds are obtained by reproduction of the motifs active of the polypeptide according to the invention by non-peptide or non-peptide structures exclusively peptide and which are compatible with a use pharmaceutical. In this regard, the invention relates to the use of polypeptides such as described above for the preparation of non-peptide molecules, or not exclusively peptide, pharmacologically active, by determination of structural elements of these polypeptides which are important for their activity and the reproduction of these elements by non-peptide or non-peptide structures exclusively peptide. A subject of the invention is also pharmaceutical compositions.
comprising one or more molecules thus prepared.
According to a variant of the invention, the polypeptides or their variants further include a signal sequence for localization cellular precise. Among the sequences which can be used, mention may preferably be made of:
the lgkB signal peptide sequence, APP signal peptide, peptides signal of

8 sous-unités des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine musculaires et centraux etc...
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de purification enzymatique des polypeptides de l'invention, possédant une activité de type (3-secrétase et capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel de l'APP.
Ce procédé comporte les étapes suivantes - le surnageant de la culture cellulaire est tout d'abord concentré sur membranes.
- le produit de concentration subit ensuite les diffërentes étapes de la purification avec notamment une centrifugation sur membrane tangentielle suivie d'une chromatographie d'exclusion et d'une chromatographie échangeuse d'ions puis d'une chromatographie d'interactions hydrophobes et enfin d'une nouvelle chromatographie d'exclusion.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire. Cette lignée a été sélectionnée parmi de nombreuses autres lignées humaines (voir Matériel et Méthodes) provenant d'origines diverses mais de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer. Ces lignées ont été utilisées pour la recherche des polypeptides de l'invention ou de leurs variants. Ainsi, ces lignées cellulaires humaines sont représentatives du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et sont capables de réaliser le métabolisme normal du précurseur du peptide ~3 amyloïde conduisant à sa production. De manière préférée la lignée cellulaire séléctionnée est la lignée THP 1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte.
Les lignées cellulaires décrites précédemment sont notamment utilisées comme hôte pour la mise en évidence de composés (ligands, antagonistes, agonistes) capables d'inhiber l'interactiôn entre les polypeptides de l'invention et leur substrat. 8 nicotinic muscle acetylcholine receptor subunits and central etc ...
Another subject of the invention consists of a purification process enzymatic of the polypeptides of the invention, having an activity of the type (3-secretase and capable of specifically cleaving the natural precursor of the APP.
This process includes the following steps - the cell culture supernatant is firstly concentrated on membranes.
- the concentration product then undergoes the various stages of the purification with in particular centrifugation on a tangential membrane followed exclusion chromatography and ion exchange chromatography then hydrophobic interaction chromatography and finally a new exclusion chromatography.
The present invention also relates to the use of a line cellular. This line was selected among many other lines human (see Materials and Methods) coming from diverse origins but from topics not affected by Alzheimer's disease. These lines were used for the research polypeptides of the invention or their variants. So these lines cell phones are representative of the Central or Peripheral Nervous System and of the Immune system and are able to carry out the normal metabolism of the precursor of the amyloid peptide ~ 3 leading to its production. So favorite the cell line selected is the THP 1 line (ATCC TIB 202) derived from monocyte.
The cell lines described above are used in particular as a host for the detection of compounds (ligands, antagonists, agonists) capable of inhibiting the interaction between the polypeptides of the invention and their substrate.

9 Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier, ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide de l'invention ou de l'un de ses variants puis par prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour leur faculté à inhiber, au moins en partie, l'interaction entre le dit polypeptide et le précurseur du peptide (3-amyloïde et/ou pour d'inhiber au moins en partie l'activité (3-secrétase des polypeptidés de l'invention vis-à-vis du précurseur naturel du peptide (3-amyloïde. En particulier, ces anticorps sont utilisés comme médicament, notamment pour le traitement de maladies neurodégénératives tel que la maladie d'Alzheimer.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables d'inhiber, au moins en partie, l'interaction du polypeptide et le précurseur du peptide (3-amyloïde et/ou de moduler ou d'inhiber au moins en partie l'activité ~i-secrétase des polypeptides de l'invention.
La mise en évidence et/ou l'isolement de tels composés est réalisé selon les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que exprimant un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.

Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'activité (3-secrétase des polypeptides de l'invention. A partir de ces molécules agonistes ou antagonistes, il est possible par des techniques classiques connues de l'homme du métier et notamment 5 par séquençage d'obtenir leurs séquences nucléotidiques correspondantes.
Ainsi selon une variante de l'invention, il peut être particulièrement avantageux de faire exprimer in situ des molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention à partir de leurs séquences nucléotidiques. La préparation de ces molécules et leur expression in vivo, ex-vivo et/ou in vitro, nécessitent que 9 Another subject of the invention resides in antibodies or fragments polyclonal or monoclonal antibodies directed against a polypeptide such as defined above. Such antibodies can be generated by known methods of the skilled person. In particular, these antibodies can be prepared by immunization of an animal against a polypeptide of the invention or of one of his variants then by blood collection and isolation of antibodies. These antibody can also be generated by preparing hybridomas according to the techniques known to those skilled in the art. Antibodies or antibody fragments according to the invention can in particular be used for their ability to inhibit, at least in part, the interaction between said polypeptide and the precursor of the peptide (3-amyloid and / or for to at least partially inhibit the activity (3-secretase of the polypeptides of the invention vis-à-vis the natural precursor of the peptide (3-amyloid. In particular, these antibodies are used as medicine, especially for the treatment of diseases neurodegenerative such as Alzheimer's disease.
Another object of the present invention relates to a method of identification of compounds capable of inhibiting, at least in part, the interaction of the polypeptide and the peptide precursor (3-amyloid and / or to modulate or inhibit at least part ~ i-secretase activity of the polypeptides of the invention.
The detection and / or isolation of such compounds is carried out according to the steps following - we put in contact a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, with a recombinant cell such than expressing a polypeptide of the invention under conditions allowing interaction between said polypeptide and said molecule in case the latter has a affinity for said polypeptide, and, - the molecules linked to said polypeptide are detected and / or isolated the invention.

In one particular mode, this method of the invention is suitable for implementing evidence and / or isolation of agonists and antagonists of activity (3-secretase polypeptides of the invention. From these agonist molecules or antagonists it is possible by conventional techniques known to those skilled in the art and especially 5 by sequencing to obtain their corresponding nucleotide sequences.
Thus according to a variant of the invention, it can be particularly advantageous to have agonist or antagonist molecules expressed in situ of polypeptides of the invention from their nucleotide sequences. The preparation of these molecules and their expression in vivo, ex-vivo and / or in vitro, require that

10 leurs séquences nucléotidiques soient portées par un vecteur viral ou plasmidique et soient transfectées au moyen dudit vecteur dans des cellules hôtes appropriées.
La présente invention concerne également l'utilisation des polypeptides définis précédemment ou de leurs variants pour la mise en évidence de ligands ainsi que de composés capables d'inhiber, au moins en partie, l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide ~3-amyloïde etlou d'inhiber l'activité
(3-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou d'intervenir dans la métabolisme du précurseur naturel du peptide (3-amyloïde et/ou de ralentir la production du peptide (3-amyloïde.
En effet, la présente invention se rapporte également à une méthode de mise en évidence de molécules pouvant influencer l'activité des polypeptides de l'invention.
Cette méthode de "screening" comporte les étapes suivantes - on met en contact les polypeptides de l'invention qui présentent une activité
de type (3-secrétase avec une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées.
- on met en contact le mélange réactionel décrit dans l'étape précédente avec le substrat des polypeptides de l'invention qui est préférentiellement l'APP
dans sa forme naturelle Their nucleotide sequences are carried by a viral vector or plasmid and are transfected with said vector into host cells appropriate.
The present invention also relates to the use of the polypeptides previously defined or their variants for the detection of ligands so than compounds capable of inhibiting, at least in part, the interaction between the polypeptide and the precursor of the peptide ~ 3-amyloid etlou to inhibit the activity (3-secretase of the polypeptides of the invention or their variants and / or to intervene in the metabolism of the natural precursor of the peptide (3-amyloid and / or to slow down the production of the peptide (3-amyloid.
Indeed, the present invention also relates to a method of setting evidence of molecules that can influence the activity of the invention.
This screening method involves the following steps - The polypeptides of the invention which have a activity type (3-secretase with a molecule or mixture containing different molecules, possibly not identified.
- the reaction mixture described in the previous step is brought into contact with the substrate of the polypeptides of the invention which is preferably APP
in his natural form

11 - on mesure l'activité ~i-secrétase sur l'APP
- on détecte et/ou on isole les molécules qui ont eu un effet sur l'activité
~i-secrétase des polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs de par leur capacité à interférer au niveau de l'activité ~i-secrétase des polypeptides de l'invention vis-à-vis du précurseur naturel du peptide ~i-amyloïde peuvent, en effet, permettre de traiter certaines affections neurologiques et notamment la maladie d'Alzheimer.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif soit un polypeptide tel que défini ci-avant soit les molécules agonistes, antogonistes ou ligands définis précédemment.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps tel que défini ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps, ligands et/ou séquences nucléotidiques déftnis ci-avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour inhiber au moins en partie l'interaction des polypeptides de l'invention ou de leurs variants avec le précurseur naturel du peptide ~3-amyloïde et/ou pour inhiber au moins en partie l'activité (3-secrétase et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide (3-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide (3-amyloïde. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de . maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer. 11 - we measure the activity ~ i-secretase on the APP
- we detect and / or isolate the molecules that have had an effect on the activity ~ i-secretase of the polypeptides of the invention.
Another subject of the invention relates to the use of a ligand or of a modulator identified and / or obtained according to the process described above as drug. Such ligands or modulators by their ability to interfere at level of activity ~ i-secretase of the polypeptides of the invention vis-à-vis the precursor natural peptide ~ i-amyloid can, in fact, treat some neurological conditions and in particular Alzheimer's disease.
The invention also relates to any pharmaceutical composition comprising as active ingredient is a polypeptide as defined above either the agonist, antogonist or ligand molecules defined above.
It also relates to any pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least one antibody or an antibody fragment such as defined above, and / or an antisense oligonucleotide.
Furthermore, it also relates to pharmaceutical compositions in which peptides, antibodies, ligands and / or nucleotide sequences defined below before are associated with each other or with other active ingredients.
The pharmaceutical compositions according to the invention can be used to at least partially inhibit the interaction of the polypeptides of the invention or from their variants with the natural precursor of the ~ 3-amyloid peptide and / or for inhibit at less activity (3-secretase and / or intervene on the metabolism of peptide precursor (3-amyloid to inhibit or slow the production of peptide (3-amyloid. It is more preferably pharmaceutical compositions intended for the treatment of. neurodegenerative diseases such as for example the Alzheimer's disease.

12 Un autre objet de la présente invention est l'utilisation des molécules décrites auparavant (ligands, anticorps ou fragments d'anticorps, antagonistes, agonistes) pour inhiber au moins en partie l'interaction des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et du précurseur naturel du peptide (3-amyloïde et/ou pour inhiber, au moins en partie, l'activité ~-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide ~i-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide (3-amyloïde. De manière préférée l'utilisation de ces molécules est envisagée comme médicament, notamment pour le traitement des maladies neurodégénératives et en particulier pour le traitement de la maladie d'Alzheimer.
Selon une variante de l'invention, les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont utilisés pour intervenir sur le métabolisme du peptide (3-amyloïde.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les polypeptides ou leurs variants définis ci-avant sont utilisés pour mettre en évidence des ligands ou des composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre les polypeptides de l'invention ou leurs variants et le précurseur naturel du peptide (3-amyloïde et/ou pour inhiber, au moins en partie, l'activité (3-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide ~i-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide ~3-amyloïde.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les polypeptides de l'invention et surtout leurs antagonistes, agonistes, anticorps et ligands sont préférentiellement associés à un ou des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour être formulés en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Ils sont de préférence utilisés sous une forme injectable.
Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par 12 Another object of the present invention is the use of molecules described previously (ligands, antibodies or fragments of antibodies, antagonists, agonists) for at least partially inhibit the interaction of the polypeptides of the invention or their variants and of the natural precursor of the peptide (3-amyloid and / or to inhibit, at least in part, the ~ -secretase activity of the polypeptides of the invention or their variants and / or intervene on the metabolism of the precursor of the peptide ~ i-amyloid for inhibit or slow down the production of the peptide (3-amyloid. Preferably the use of these molecules is envisaged as a medicament, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases and in particular for the treatment of the disease Alzheimer's.
According to a variant of the invention, the polypeptides of the invention or their variants are used to intervene on the metabolism of the peptide (3-amyloid.
According to another embodiment of the invention, the polypeptides or their variants defined above are used to highlight ligands or of compounds capable of at least partially inhibiting the interaction between polypeptides of the invention or their variants and the natural precursor of the peptide (3-amyloid and / or for inhibit, at least in part, the activity (3-secretase of the polypeptides of the invention or of their variants and / or intervene on the metabolism of the precursor of the peptide ~ i-amyloid to inhibit or slow down the production of the ~ 3-amyloid peptide.
For their use according to the present invention, the polypeptides of the invention and especially their antagonists, agonists, antibodies and ligands are preferably associated with one or more pharmaceutical vehicles acceptable to be formulated for topical, oral administration, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. They are preferably used in an injectable form.
he can in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, chloride sodium, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, through

13 addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
La présente invention sera plus amplement détaillée à l'aide des exemples ci dessous considérés de manière descriptive et non limitative.
Lésende des figures Figure 1 : Topographie et sites de clivage de l'APP.
Figure 2 : description du procédé de purification des polypeptides de l'invention.
Figure 3 : analyse par immunoblot du clivage par les polypeptides de l'invention des précurseurs complets d'origine membranaire du peptide (3-amyloide "normal"
(APP-1 S K595M596) et "double muté" (APP- N59sLs96). Mise en évidence de la spécificité de clivage des polypeptides de l'invention envers le précurseur d'origine membranaire du peptide (3-amyloide "normal" (APP- KM).
Pour chacun des précurseurs (APP-NL et APP-KM), la colonne 1 représente les membranes non incubées sans enzyme, la colonne 2 représente les membranes 20 incubées à 37° C sans enzyme, alors que la colonne 3 correspond aux membranes incubées à 37° C avec les polypeptides de l'invention présentant une activité de type ~i-secrétase.
MATERIELS ET METHODES 13 addition according to the case of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutions.
The present invention will be explained in greater detail with the aid of the examples below.
below considered in a descriptive and nonlimiting manner.
Legend of the figures Figure 1: APP topography and cleavage sites.
Figure 2: description of the purification process of the polypeptides of the invention.
FIG. 3: immunoblot analysis of the cleavage by the polypeptides of the invention of complete precursors of membrane peptide origin (3-amyloid "normal"
(APP-1 S K595M596) and "double mutated" (APP-N59sLs96). Highlighting the specificity of cleavage of the polypeptides of the invention towards the original precursor membrane of peptide (3-amyloid "normal" (APP-KM).
For each of the precursors (APP-NL and APP-KM), column 1 represents membranes not incubated without enzyme, column 2 represents the membranes 20 incubated at 37 ° C without enzyme, while column 3 corresponds to membranes incubated at 37 ° C with the polypeptides of the invention having a type activity ~ i-secretase.
MATERIALS AND METHODS

14 Origine des lunées cellulaires On a utilisé 13 lignées cellulaires humaines d'origine variée pour Ia recherche des enzymes de maturation:
Systme nerveux central SW 1088 ATCC HTB Astrocytome SW 1788 ATCC HTB Astrocytome U-138 MG ATCC HTB Glioblastome U-373 MG ATCC HTB Gliobastome,astrocytome,grade Systme nerveux priphrigue HMCB ATCC CRL
9607 Bowes melanoma Hs27 ATCC CRL
1634 Newborn foreskin MRCS ATCC CCL Lung, diploid Systme immunitaire DAKIKI ATCC TIB B-cell, Ig A secretipg H9 ATCC HTB T-cell lymphoma IM-9 ATCC CCL Lymphoblast,Ig secreting K-562 ATCC CCI Chronic myelogenous leukemia RPMI 1788 ATCC CCL Peripheral blond, IgM
156 secreting THP 1 ATCC TIB Monocyte Culture Cellulaire Après décongélation, les cellules, selon leur origine, sont mises en culture soit dans le milieu «DMEM» soit dans le milieu «RPMI 1640» en présence de 10% de sérum de veau foetal. Ces cultures ont été réalisées dans des flacons de 1 litre à 37°C
avec un renouvellement des milieux de cultures tous les 2 à 3 jours. Selon la lignée cellulaire étudiée, une période de 2 à 5 mois est nécessaire pour obtenir un volume de 18 litres de milieu de culture. La dernière étape de culture se fait pendant 48 heures en absence de sérum de veau foetal et de rouge de phénol. Ces cultures cellulaires sont ensuite centrifugées pour récupérer le surnageant qui servira à la purification des enzymes.
Les lignées cellulaires HMCB, U-373 MG, U-138 MG, MRCS et Hs27 ont été
cultivées dans le milieu «DMEM» alors que les lignées SW 1088, SW 1783, K-562, H9, DAKIKI, THPI, RPMI 1788 et IM-9 l'ont été dans le milieu «RPMI 1640».
~35 Purification enzymatigue Les 18 litres de surnageant de chaque culture cellulaire sont concentrés sur membranes ULTRASETTET"' (FILTRON) ayant un seuil de coupure de lOkDa, puis le produit de concentration obtenu a servi à la purification des activités protéolytiques selon le protocole suivant:
5 - La première étape consiste en une centrifugation sur membrane tangentielle à 7000 rpm. Plus particulièrement, la concentration est réalisée sur membrane ULTRAFREE~ (MILLIPORE) ayant un seuil de coupure de lOlcDa - Puis il est procédé à une chromatographie d'exclusion. Suivant un mode particulier de l'invention la chromatographie d'exclusion à été réalisée sur colonne séphacryl S-10 100 (Pharmacia) dont les limites d'exclusion sont 103 Da et 105 Da.
- Une chromatographie d'échange d'ions représente la troisième étape du procédé. Il a été utlisé notamment une colonne Q-sépharose (Pharmacia) dont le gel est constitué
d'anions forts. La colonne est éluée par un gradient salin de 0 à 1 M en utilisant le solvant A (Tris 25mM, pH 7.5) et le solvant B {Tris 25mM, NaCI 1M, pH 7.5). 14 Origin of cellular moon 13 human cell lines of various origins were used for Ia research maturing enzymes:
Central nervous system SW 1088 ATCC HTB Astrocytoma SW 1788 ATCC HTB Astrocytome U-138 MG ATCC HTB Glioblastoma U-373 MG ATCC HTB Gliobastoma, astrocytoma, grade Peripheral nervous system HMCB ATCC CRL
9607 Bowes melanoma Hs27 ATCC CRL
1634 Newborn foreskin MRCS ATCC CCL Lung, diploid Immune system DAKIKI ATCC TIB B-cell, Ig A secretipg H9 ATCC HTB T-cell lymphoma IM-9 ATCC CCL Lymphoblast, Ig secreting K-562 ATCC CCI Chronic myelogenous leukemia RPMI 1788 ATCC CCL Peripheral blond, IgM
156 secreting THP 1 ATCC TIB Monocyte Cellular culture After thawing, the cells, depending on their origin, are cultured is in the “DMEM” medium or in the “RPMI 1640” medium in the presence of 10% of fetal calf serum. These cultures were carried out in flasks of 1 liter at 37 ° C
with a renewal of the culture media every 2 to 3 days. According to line cell studied, a period of 2 to 5 months is necessary to obtain a volume of 18 liters of culture medium. The last stage of cultivation is done during 48 hours in the absence of fetal calf serum and phenol red. These cultures cell phones are then centrifuged to recover the supernatant which will be used for the purification of enzymes.
The HMCB, U-373 MG, U-138 MG, MRCS and Hs27 cell lines were cultivated in the “DMEM” medium while the lines SW 1088, SW 1783, K-562, H9, DAKIKI, THPI, RPMI 1788 and IM-9 were in the “RPMI 1640” environment.
~ 35 Enzymatic purification The 18 liters of supernatant from each cell culture are concentrated on ULTRASETTET "'membranes (FILTRON) having a cutoff threshold of 10kDa, then the concentration product obtained was used to purify the activities proteolytics according to the following protocol:
5 - The first step consists of centrifugation on a tangential membrane at 7000 rpm. More particularly, the concentration is carried out on a membrane ULTRAFREE ~ (MILLIPORE) having a cutoff threshold of lOlcDa - Then an exclusion chromatography is carried out. According to a mode particular of the invention the exclusion chromatography was carried out on a column Sephacryl S-10 100 (Pharmacia) whose exclusion limits are 103 Da and 105 Da.
- Ion exchange chromatography represents the third step of the process. He has been used including a Q-Sepharose column (Pharmacia) whose gel is constituted strong anions. The column is eluted by a salt gradient from 0 to 1 M in using the solvent A (25mM Tris, pH 7.5) and solvent B (25mM Tris, 1M NaCl, pH 7.5).

15 - L'avant dernière étape consiste en une chromatographie d'interactions hydrophobes, en particulier sur colonne phényl-sepharose-6 (Pharmacia) ayant un haut degré
de substitution (40~mo1/g de gel). Cette colonne a été éluée avec un gradient de sulfate d'ammonium de 1 à 0 M en utilisant le solvant A (Tris 25mM, (NH.~)Z S04 1 M, pH
7.5) et le solvant B (Tris 25mM, pH 7.5).
- Enfin, la dernière étape est une chromatographie d'exclusion, réalisée en particulier sur colonne TSKgeI G2000SW (Interchim) dont le gel est constitué de supports rigides de silice, greffés avec un groupement hydrophile. L'éluant est un tampon Tris 25mM, pH 7.5 contenant 250mM NaCI.
Tests enzymatiaues Le suivi des activités ~i-secrétase a été réalisé par des tests utilisant différents peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur APP
au niveau du site de clivage enzymatique de type (3-secrétase (Tableau 1 ). 15 - The penultimate step consists of interaction chromatography hydrophobic, in particular on a phenyl-sepharose-6 column (Pharmacia) having a high degree of substitution (40 ~ mo1 / g of gel). This column was eluted with a gradient of sulfate 1 to 0 M ammonium using solvent A (25 mM Tris, (NH. ~) Z S04 1 M, pH
7.5) and solvent B (25 mM Tris, pH 7.5).
- Finally, the last step is an exclusion chromatography, carried out in particular on TSKgeI G2000SW column (Interchim) whose gel consists of supports rigid silica, grafted with a hydrophilic group. The eluent is a Tris buffer.
25mM, pH 7.5 containing 250mM NaCl.
Enzymatic tests Monitoring of ~ i-secretase activities was carried out by tests using different peptides mimicking or reproducing the amino acid sequence of the precursor APP
at the enzymatic cleavage site of the (3-secretase) type (Table 1).

16 Pour la réalisation du peptide chromophore, 5 pl de peptide Z-Val-Lys-Met-MCA (7-amino-6-methylcoumarin), dilué au 1/1000, sont incubés avec 5 ul de surnageant pendant 6 heures à 37°C. La réaction est stoppée par addition de 3 ul de HCI O,1N, et l'activité enzymatique est déterminée par une mesure de la fluorescence S du chromophore AMC libre à 460nm.
Des peptides synthétiques, de tailles différentes, mimant ou reproduisant le site de clivage enzymatique de type (3-secrétase ont été synthétisés pour être utilisés comme substrats dans l'étude de la caractérisation et de la spécificité des enzymes.(tableau 1 ) On incube 5 pl de surnageant avec 5 ul de peptide pendant 6 heures à
37°C.
La réaction est stoppée par addition de 3 ul de HCI 0,1 N, et l'activité
enzymatique est déterminée par mesure de la densité optique à 215 nm des fragments de clivage préalablement séparés par HPLC.
Les sites de clivage sont déduits par détermination de la séquence des fragments résultant du clivage.
Le pourcentage de clivage [%= 100(Ao-A~)/Ao) de chaque substrat peptidique a été évalué en mesurant l'absorbance à 215 nm (A) du substrat incubé en l'absence (Ao) et en la présence (A~) de l'enzyme dans des conditions expérimentales identiques (temps d'incubation, pH et concentration).
Le pourcentage d'inhibition [%= 100(Io-h)/Io) de chaque substrat incubé en la présence de l'enzyme a été évalué en mesurant l'absorbance à 21 S nm pour un substrat peptidique ou la fluorescence à 460 nm pour le substrat Z-Val-Lys-Met-MCA en l'absence (Io) et en la présence (I~) de l'inhibiteur dans les mêmes conditions expérimentales.
Les précurseurs APP normal (APP-KS95Ms96) et APP possédant la double mutation "suédoise" (APP-N59sLs96) ont été obtenus à partir d'extraits membranaires de cellules d'insectes infectées par le baculovirus contenant les gènes humains codant 16 For the production of the chromophore peptide, 5 μl of Z-Val-Lys-Met- peptide MCA (7-amino-6-methylcoumarin), diluted to 1/1000, are incubated with 5 μl of supernatant for 6 hours at 37 ° C. The reaction is stopped by addition of 3 μl of HCI O, 1N, and the enzyme activity is determined by measuring the fluorescence S of the AMC chromophore free at 460nm.
Synthetic peptides, of different sizes, mimicking or reproducing the enzymatic cleavage site of type (3-secretase have been synthesized to be used as substrates in the study of the characterization and specificity of enzymes. (Table 1) 5 μl of supernatant is incubated with 5 μl of peptide for 6 hours at 37 ° C.
The reaction is stopped by adding 3 μl of 0.1 N HCI, and the activity enzymatic is determined by measuring the optical density at 215 nm of the cleavage fragments previously separated by HPLC.
The cleavage sites are deduced by determining the sequence of the fragments resulting from cleavage.
The percentage of cleavage [% = 100 (Ao-A ~) / Ao) of each peptide substrate was evaluated by measuring the absorbance at 215 nm (A) of the incubated substrate in the absence (Ao) and in the presence (A ~) of the enzyme under experimental conditions identical (incubation time, pH and concentration).
The percentage inhibition [% = 100 (Io-h) / Io) of each substrate incubated in the presence of the enzyme was assessed by measuring the absorbance at 21 S nm for a substrate peptide or fluorescence at 460 nm for the substrate Z-Val-Lys-Met-MCA in the absence (Io) and in the presence (I ~) of the inhibitor in the same conditions experimental.
The normal APP precursors (APP-KS95Ms96) and APP having double "Swedish" mutation (APP-N59sLs96) were obtained from extracts membranes insect cells infected with baculovirus containing the genes humans coding

17 pour ces précurseurs. Ces extraits membranaires, incubés avec les polypeptides de l'invention ayant une activité ~i-secrétase purifiés, sont analysés par immunoblot en utilisant l'anticorps WO-2 (Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914) dirigé contre les premiers acides aminés du peptide j3 amyloïde et l'anticorps monoclonal 22C11 (Boehringer Mannhein; Hilbich C. (1993) Journal of Biochemical Chemistry, 268, 26571-26577) dirigé contre le motif NHa-terminal du précurseur.
EXEMPLES
Exemple 1. Mise en évidence des activités enzymatigues Cet exemple a pour but de mettre en évidence des activités enzymatiques dans des lignées cellulaires humaines de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer.
Deux approches ont été utilisées pour la mise en évidence des protéases susceptibles d'être impliquées dans la maturation de l'APP humain.
Approche ImmunoloQiAUe:
A partir des 13 lignées cellulaires humaines décrites dans Matériel et Méthodes, la recherche des activités enzymatiques a été réalisée à l'aide de l'anticorps monoclonal 22C 11 pour sélectionner les lignées cellulaires ayant la capacité
de produire des quantités mesurables d'APP au niveau de la membrane et dans le milieu de culture cellulaire. L'anticorps monoclonal WO-2 a été utilisé pour révéler et identifier les différents sites de clivage de l'APP.
Les résultats sont les suivants 17 for these precursors. These membrane extracts, incubated with the polypeptides of the invention having a purified ~ i-secretase activity, are analyzed by immunoblot in using the antibody WO-2 (Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914) raised against the first amino acids of the amyloid j3 peptide and the antibody monoclonal 22C11 (Boehringer Mannhein; Hilbich C. (1993) Journal of Biochemical Chemistry, 268, 26571-26577) directed against the NHa-terminal motif of precursor.
EXAMPLES
Example 1. Demonstration of the enzymatic activities The purpose of this example is to demonstrate enzymatic activities in human cell lines of subjects not affected by the disease Alzheimer's.
Two approaches were used to demonstrate proteases likely to be involved in the maturation of human APP.
ImmunoloQiAUe approach:
From the 13 human cell lines described in Materials and Methods, the search for enzymatic activities was carried out using the antibody 22C 11 monoclonal to select cell lines with the capacity of produce measurable amounts of APP at the membrane level and in the middle cell culture. The monoclonal antibody WO-2 was used to reveal and identify the different APP cleavage sites.
The results are as follows:

18 - l'anticorps monoclonal 22C11 a permis de sélectionner 8 lignées cellulaires (HMCB, MRCS, Hs27, SW 1088, SW 1783, H9, THP 1 et IM-9) sur les 13 testées au total. Pour les cellules choisies, l'analyse par immunoblot a aussi montré une différence de masse moléculaire entre l'APP membranaire (120 kDa) et les APP
solubles (110-100 kDa). Ceci indique que le précurseur a subi, au niveau de sa séquence COOH-terminale, un ou plusieurs clivages) enzymatique(s).
- L'analyse par immunoblot des entités moléculaires générées dans les 8 lignées sélectionnées à permis de révéler et d'identifier au moyen de l'anticorps monoclonal WO-2 les différents sites de clivage de l'APP et de montrer que le précurseur du peptide A[i a subit une maturation différentielle. ' Ainsi, cette approche a permis de sélectionner des lignées cellulaires ayant la capacité de produire des quantités mesurables d'APP au niveau de la membrane et dans le milieu de culture cellulaire et de montrer des clivages enzymatiques dans le précurseur du peptide A[i.
Substrats pepddigues:
Les peptides [KMD]APP(-5,+5) et Z-Val-Lys-Met-MCA (voir Matériel et Méthodes), dérivés de l'APP et mimant le site de clivage, ont été utilisés comme substrats pour la mise en évidence des différentes activités enzymatiques présentes dans les 8 lignées cellulaires.
Une analyse combinée (HPLC, composition en acides aminés et détermination des séquences) des fragments générés par clivage du substrat [KMD]APP(-5,+5) a été
réalisée dans les lignées sélectionnées. En effet, après incubation du substrat [KMDJAPP(-5,+5) avec les surnageants, les fragments générés ont été d'abord séparés par HPLC sur une colonne reverse phase RPC i 8 (VYDAC) éluée par un gardient de 5-40% d'acétonétrile / 0.05% TFA. La séquence et/ou la composition en acides aminés de ces fragments ont été déterminés par les techniques classiques. 18 - the monoclonal antibody 22C11 made it possible to select 8 cell lines (HMCB, MRCS, Hs27, SW 1088, SW 1783, H9, THP 1 and IM-9) out of the 13 tested at total. For the selected cells, the immunoblot analysis also showed a difference in molecular mass between membrane APP (120 kDa) and APP
soluble (110-100 kDa). This indicates that the precursor has undergone, at its COOH-terminal sequence, one or more enzymatic cleavages.
- Analysis by immunoblot of the molecular entities generated in the 8 lines selected to permit to reveal and identify by means of the antibody monoclonal WO-2 the different APP cleavage sites and show that the precursor of peptide A [ia undergoes differential maturation. '' Thus, this approach made it possible to select cell lines having the ability to produce measurable amounts of APP at the membrane level and in cell culture medium and show enzyme cleavages in the precursor of peptide A [i.
Pepddigues substrates:
The peptides [KMD] APP (-5, + 5) and Z-Val-Lys-Met-MCA (see Materials and Methods), derived from APP and mimicking the cleavage site, were used as substrates for the demonstration of different enzymatic activities present in the 8 cell lines.
A combined analysis (HPLC, amino acid composition and determination sequences) fragments generated by cleavage of the substrate [KMD] APP (-5, + 5) a summer performed in the selected lines. Indeed, after incubation of the substrate [KMDJAPP (-5, + 5) with the supernatants, the fragments generated were first separated by HPLC on a reverse phase RPC i 8 column (VYDAC) eluted with a keep from 5-40% acetonetrile / 0.05% TFA. The sequence and / or composition in amino acids of these fragments were determined by techniques classics.

19 Les résultats de cette analyse ont permis d'identifier un clivage majoritaire au niveau de la liaison peptidique Met ~-Asp+' (correspondant au site Met596-Asp59' dans fAPP entier) et 2 clivages minoritaires au niveau des liaisons Ser 5-Glus {correspondant au site Ser592-G1u593 dans l'APP entier) et Ala+z-Glu+3 (correspondant au site A1a598-G1u599 dans fAPP entier) dans chacune des 8 lignées sélectionnées.
Une analyse du profil d'inhibition des activités enzymatiques des 8 lignées cellulaires, vis à vis du substrat fluorescent Z-Val-Lys-Met-MCA, a été
également effectuée (Tableau 2).
Les résultats de cette dernière analyse ont permis de révéler l'existence d'activités enzymatiques majeures de type sérine (inhibition par l'aprotinine et le pefabloc) et métallo-protéase (inhibition par l'EDTA et le phosphoramidon) dans chacune des lignées sélectionnées (Tableau 2) Exemple 2. Purification et caractérisation de l'activité- Gi-secrétase Cet exemple a pour but de décrire la purification et de mettre en évidence les caractéristiques des polypeptides de l'invention ayant une activité (3-secrétase.
Sur la base de la sélection des 8 lignées cellulaires humaines et des résultats obtenus dans l'exemple 1, la lignée cellulaire THP-1 a été choisie, en raison de son cycle cellulaire rapide permettant d'obtenir de grandes quantités de protéines, pour être utilisée comme modèle pour la purification de l'activité (3-secrétase recherchée selon le protocole de purification décrit dans "Matériels et Méthodes".
Une analyse de l'activité résiduelle des fractions présentant des activités protéolitiques vis-à-vis des substrats Z-Val-Lys-Met-MCA et [KMDJAPP(-5,+5) a été réalisé dans le but de poursuivre la purification des polypeptides de l'invention. A
chaque étape de purification,,les différentes fractions ont été d'abord mises en contact avec le peptide Z-Val-Lys-Met-MCA afin d'isoler les fractions présentant des activités endoprotéolytiques. Ces dernières fractions sont ensuite testées vis-à-vis du peptide [KMD]APP(-5,+S) afin d'isoler celles qui clivent préférentiellement ce substrat peptidique au niveau de la liaison peptidique Met'-Asp+' {correspondant au site Met596-Asps9~ dans fAPP entier). Les résultats de ces travaux ont permis de mettre en évidence différentes fractions présentant des activités endoprotéolytiques, S isolées à partir de surnageants des 8 cultures cellulaires sélectionnées, en utilisant en parallèle ces deux substrats.
Lors de la dernière étape du procédé de purification qui est une chromotographie d'exclusion sur colonne TSK 2000 (voir dans Matériel et Méthodes pour les caractéristiques), plusieurs fractions protéiques ont été obtenues.
10 La mesure de l'activité résiduelle de ces fractions vis-à-vis du peptide [KMD]APP(-5,+S) a permis d'obtenir une seule fraction ayant urie activité de type (3-secrétase. Sa caractérisation a été effectuée par la mesure du poids moléculaire en éléctrophorèse sur gel de polyacrilamide, la mesure du point isoéléctrique, la recherche de l'activité maximale en fonction du pH ainsi que le profil d'inhibition par 15 des inhibiteurs classiques ("Matériels et Méthodes") L'analyse par électrophorèse a été réalisée sur un gel de polyacrylamide 4-19 The results of this analysis made it possible to identify a majority divide at level of the Met ~ -Asp + 'peptide bond (corresponding to the Met596- site Asp59 'in whole fAPP) and 2 minority cleavages at the level of the Ser 5-Glus bonds {corresponding to the Ser592-G1u593 site in the entire APP) and Ala + z-Glu + 3 (corresponding at site A1a598-G1u599 in whole fAPP) in each of the 8 lines selected.
An analysis of the inhibition profile of the enzymatic activities of the 8 lines cells, vis-à-vis the fluorescent substrate Z-Val-Lys-Met-MCA, was also performed (Table 2).
The results of this last analysis revealed the existence of activities major serine enzymes (inhibition by aprotinin and pefabloc) and metallo-protease (inhibition by EDTA and phosphoramidon) in each of selected lines (Table 2) Example 2. Purification and characterization of the activity-Gi-secretase The purpose of this example is to describe the purification and to highlight the characteristics of the polypeptides of the invention having an activity (3-secretase.
Based on the selection of 8 human cell lines and results obtained in Example 1, the THP-1 cell line was chosen, due of his rapid cell cycle to obtain large amounts of proteins, for be used as a model for the purification of activity (3-secretase wanted according to the purification protocol described in "Materials and Methods".
An analysis of the residual activity of the fractions presenting activities proteolitics towards Z-Val-Lys-Met-MCA and [KMDJAPP (-5, + 5) a substrates was carried out in order to further purify the polypeptides of the invention. AT
each purification step, the different fractions were first put in touch with the peptide Z-Val-Lys-Met-MCA in order to isolate the fractions having endoproteolytic activities. These latter fractions are then tested for opposite peptide [KMD] APP (-5, + S) in order to isolate those which preferentially cleave this peptide substrate at the Met'-Asp + 'peptide bond {corresponding to Met596-Asps9 ~ site in entire fAPP). The results of this work have enabled of highlight different fractions presenting activities endoproteolytics, S isolated from supernatants from the 8 selected cell cultures, in using in parallel these two substrates.
In the last step of the purification process which is a exclusion chromotography on TSK 2000 column (see in Material and Methods for the characteristics), several protein fractions were obtained.
10 The measurement of the residual activity of these fractions with respect to the peptide [KMD] APP (-5, + S) made it possible to obtain a single fraction having an activity of type (3-secretase. Its characterization was carried out by measuring the weight molecular in polyacrilamide gel electrophoresis, measurement of the isoelectric point, research of the maximum activity according to the pH as well as the profile inhibition by 15 classic inhibitors ("Materials and Methods") The electrophoresis analysis was carried out on a polyacrylamide gel 4-

20% sur Phast-system (Pharmacie) en conditions dénaturantes ou normales et montre une bande de masse moléculaire voisine de 70 kDa.
Le maximun d'activité, vis-à-vis du peptide [KMD]APP(-S,+5), a été observé
20 à des pH situés entre 7 et 8.
Le profil d'inhibition de cette fraction, vis à vis du peptide [KMD]APP(-5,+S), montre qu'il s'agit d'une sérine protéase: les pourcentages d'inhibition calculés étant respectivement de 100% pour le PMSF, 75% pour le pefablock, 25% pour le TPCK, 10% pour la benzamidine et de 0% pour l'antipapaïne.
Cet exemple décrit donc le procédé de purification ainsi que la recherche et la mise en évidence des différentes caractéristiques des polypeptides de l'invention ayant une activité (3-secrétase.
Exemple 3. Spécificité de l'activité 13-secrétase ~30 20% on Phast-system (Pharmacy) under denaturing or normal conditions and watch a band of molecular mass close to 70 kDa.
The maximum activity, vis-à-vis the peptide [KMD] APP (-S, + 5), was observed 20 at pH values between 7 and 8.
The inhibition profile of this fraction, with respect to the peptide [KMD] APP (-5, + S), shows that it is a serine protease: the percentages calculated inhibition being respectively 100% for the PMSF, 75% for the pefablock, 25% for the TPCK, 10% for benzamidine and 0% for antipapain.
This example therefore describes the purification process as well as the research and the highlighting of the different characteristics of the polypeptides of the invention having an activity (3-secretase.
Example 3. Specificity of the 13-secretase activity ~ 30

21 Cet exemple décrit l'analyse de l'activité (3-secrétase des polypeptides de l'invention.
Cette spécificité a été analysée en utilisant différents substrats, tel que - des peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur au niveau du site de clivage et décrits dans le tableau 1.
- le précurseur du peptide (3 amyloïde dans sa forme naturelle et mutée (mutation suédoise) Les polypeptides de l'invention ont été mis en contact avec les différents substrats et le pourcentage de clivage de ces substrats à été calculé. Les résulats sont présentés dans le Tableau 3.
Pour les peptides synthétiques, l'analyse des données, regroupées dans le tableau 3, fait apparaître les caractéristiques concernant l'importance de quelques sous-sites impliqués dans la reconnaissance du substrat par cette (3 secrétase et permettent du conclure que 1) Les sous-sites P, et PZ sont essentiels (Partie A du tabieau 3) et ce quelque soit la taille des substrats. II a été remarqué que la double mutation (Lys-Met~Asn-Leu) abolit totalement le clivage enzymatique.
2) Les sous-sites PZ et P, sont interactifs ou coopératifs (Partie B du tableau 3) En effet, une simple substitution en P2 (Lys~Asn) ou en Pi (Met~Leu) décroît uniquement le taux de clivage alors que la double mutation dite "suédoise"
abolit la reconnaissance du substrat.
La substitution du résidu en PZ (Lys~Arg) se traduit par une différence entre les taux de clivage des peptides ayant Leu en P~ ([KLD]-APP(-5,+$) et [RLD]-APP(-5,+5)) plus importante que celle observée pour les substrats ayant Met en Pi ([KMD]-APP(-5,+S) et [RMD]-APP(-5,+5)) 21 This example describes the analysis of the activity (3-secretase of the polypeptides of the invention.
This specificity was analyzed using different substrates, such as - peptides mimicking or reproducing the amino acid sequence of precursor at the cleavage site and described in Table 1.
- the precursor of the peptide (3 amyloid in its natural and mutated form (Swedish transfer) The polypeptides of the invention were brought into contact with the various substrates and the percentage of cleavage of these substrates was calculated. The results are presented in Table 3.
For synthetic peptides, data analysis, grouped in the Table 3, shows the characteristics concerning the importance of a few subsites involved in the recognition of the substrate by this (3 secretase and let us conclude that 1) The subsites P, and PZ are essential (Part A of Table 3) and this some or the size of the substrates. It has been noted that the double mutation (Lys-Met ~ Asn-Leu) completely abolishes the enzymatic cleavage.
2) The PZ and P sub-sites are interactive or cooperative (Part B of table 3) Indeed, a simple substitution for P2 (Lys ~ Asn) or Pi (Met ~ Leu) decreases only the cleavage rate whereas the so-called "Swedish" double mutation abolish it recognition of the substrate.
The substitution of the residue for PZ (Lys ~ Arg) results in a difference between rates for cleavage of peptides having Leu in P ~ ([KLD] -APP (-5, + $) and [RLD] -APP (-5, + 5)) greater than that observed for substrates having Met in Pi ([KMD] -APP (-5, + S) and [RMD] -APP (-5, + 5))

22 3) La taille etlou le volume du résidu en P, sont importants (Partie C
Tabl.3):
Le taux de clivage enzymatique décroît quand la contrainte exercée sur le squelette peptidique par la chaine latérale du sous-site P, augmente. En effet, ies expériences réalisée permettent d'obtenir un classement du taux de clivage en fonction de la substitution effectuée [KMD]-APP(-5,+5) > (KLD]-APP(-5,+5) > [KID]-APP(-5,+5) > [KVD]-APP(-5,+5) 4) Le résidu du sous-site P', est nécessairement Asp ou Glu (Partie D Tab.3):
En effet,les résultats ont montrés que la mutation de Asp par Asn ou Gin n'abolit pas le clivage du substrat; de plus,le clivage se produit au site Ala-Glu équivalent du site Met-Asn; en outre, le pseudo site Ala-Glu n'est accessible que dans le substrat naturel car, dans les mêmes conditions d'expériences, le taux de clivage du fragment APP(1,5) n'est que de 35%.
I S Ainsi, sur la base des résultats obtenus précédemment avec les polypeptides de l'invention au niveau de la spécificité de clivage de type (3-secrétase, on peut envisager l'obtention d'inhibiteurs compétitifs avec le site de clivage Met-Asp de nature peptidique, pseudo-peptidique ou non peptidique.
Pour les précurseurs d'origine membranaire du peptide [3 amyloïde, les produits de clivage des précurseurs complets (full-length) "normal" (APP-K59sMsv6) et "double muté" (APP- NS95Ls96) par les polypeptides pour lesquels l'activité
(3-secrétase a mise en évidence dans les exemples I et 2, ont été révélés par imrnunoblot en utilisant les anticorps 22C 11 et WO-2 (voir Matériel et Méthodes).
L'analyse des molécules par ces anticorps montre que le pourcentage de clivage du précurseur APP-KM augmente alors que celui du précurseur APP-NL
reste quasiment nul, et ce quel que soit les temps d'incubation au contact de l'enzyme. En effet, les résulats présentés dans la figure 3, montrent que 22 3) The size and / or the volume of the P residue are important (Part C
Table 3):
The rate of enzymatic cleavage decreases when the stress exerted on the skeleton peptide by the side chain of subsite P, increases. Indeed, ies experiences performed allow a classification of the cleavage rate according to the substitution made [KMD] -APP (-5, + 5)> (KLD] -APP (-5, + 5)> [KID] -APP (-5, + 5)> [KVD] -APP (-5, + 5 ) 4) The residue of the subsite P ', is necessarily Asp or Glu (Part D Tab.3):
Indeed, the results showed that the mutation of Asp by Asn or Gin does not abolish cleavage of the substrate; moreover, the cleavage occurs at the Ala-Glu site equivalent of the site Met-Asn; in addition, the Ala-Glu pseudo site is only accessible in the substrate natural because, under the same experimental conditions, the cleavage rate of the fragment APP (1.5) is only 35%.
IS Thus, on the basis of the results obtained previously with the polypeptides of the invention in terms of the specificity of type (3-secretase, can consider obtaining competitive inhibitors with the Met- cleavage site Asp of peptide, pseudo-peptide or non-peptide nature.
For precursors of membrane origin of the amyloid peptide [3, the "normal" full-length precursor cleavage products (APP-K59sMsv6) and "double mutated" (APP-NS95Ls96) by the polypeptides for which the activity (3-secretase demonstrated in Examples I and 2, were revealed by imrnunoblot using antibodies 22C 11 and WO-2 (see Materials and Methods).
Analysis of the molecules by these antibodies shows that the percentage of cleavage of the APP-KM precursor increases while that of the APP-NL precursor rest almost zero, regardless of the incubation times in contact with the enzyme. In Indeed, the results presented in Figure 3, show that

23 . pour les membranes bac.NL, c'est à dire les membranes incubées comportant le précurseur APP-NL, les mêmes bandes sont retrouvées quelquesoit les conditions d'expérience (colonnes 1, 2, et 3 ). Ainsi on ne constate pas de clivage par les polypeptides de l'invention .
pour les membranes bac.WT, c'est à dire les membranes incubées comportant le précurseur naturel APP-KM, une nouvelle bande vers 12 kDa est apparue dans la colonne 3 par comparaison aux deux autres colonnes. La colonne représente les membranes non incubées sans enzyme, la colonne 2 représente les membranes incubées à 37° C sans enzyme, alors que la colonne 3 correspond aux membranes incubées à 37° C avec les polypeptides de l'invention présentant une activité de type /3-secrétase. Il est à noter que la différence d'intensité
des bandes entre les colonnes 1 et 2 des membranes bac.WT est due à la quantité de produit de départ déposé sur le gel.
L'analyse par l'anticorps WO-2 à permis de révéler cette nouvelle bande de masse moléculaire d'environ 12 kDa et qui correspond au fragment COOH terminal issu du clivage du précurseur par la (3 secrétase au niveau de la liaison Met-Asp. Cette analyse permet de conclure au clivage du précurseur naturel APP-KM par les polypeptides de l'invention .
Ce résultat indique donc que le précurseur APP-KM, et non le précurseur APP-NL, a été clivé de façon sélective, et confirme les données obtenues avec les peptides substrats APP de 10, 20 ou 40 acides aminés.
En outre, cet exemple démontre que les polypeptides de l'invention isolés précédemment ont une activité de type (3-secrétase spécifique du précurseur naturel du peptide (3 amyloïde. 23 . for bac.NL membranes, i.e. incubated membranes with the APP-NL precursor, the same bands are found whatever the conditions experience (columns 1, 2, and 3). So there is no cleavage by the polypeptides of the invention.
for bac.WT membranes, i.e. incubated membranes containing the natural precursor APP-KM, a new band around 12 kDa is appeared in column 3 compared to the other two columns. The column represents the membranes not incubated without enzyme, column 2 represents the membranes incubated at 37 ° C without enzyme, while column 3 corresponds to membranes incubated at 37 ° C with the polypeptides of the invention presenting a / 3-secretase activity. It should be noted that the difference in intensity tapes between columns 1 and 2 of the bac.WT membranes is due to the amount of product of departure deposited on the gel.
Analysis by the antibody WO-2 made it possible to reveal this new band of molecular mass of about 12 kDa and which corresponds to the terminal COOH fragment resulting from the cleavage of the precursor by (3 secretase at the level of the Met-Asp. This analysis leads to the conclusion that the natural precursor APP-KM is cleaved by polypeptides of the invention.
This result therefore indicates that the APP-KM precursor, and not the precursor APP-NL, has been selectively cleaved, and confirms the data obtained with the APP substrate peptides of 10, 20 or 40 amino acids.
In addition, this example demonstrates that the polypeptides of the invention isolated previously have a specific activity (3-secretase specific for the precursor natural peptide (3 amyloid.

24 Pe tides s uences en acides amins P p p' APP(1,+5) Asp AEFR ' [KMD]-APP(-5,+5)sEV lys AEFR
Met Asp [RMD]-APP(-5,+5)SEV ~ AEFR
Met Asp [KLD]-APP(-5,+5)SEV lys AEFR
Leu Asp [RLDJ-APP(-5,+5)sEV ~ AEFR
feu Asp [NLD]-APP(-5,+5)SEV ,qsn AEFR
Leu Asp [NMD]-APP(-5,+5)SEV ,qsn EFR
Met Asp [K!D]-APP(-5,+5)SEV lys AEFR
ll~-Asp [KVD]-APP(-5,+5)SEV lys AEFR
~I
Asp [KMN]-APP(-5,+5)SEV lys AEFR
Met Asn [KMQ]-APP(-5,+5)SEV lys AEFR
Met GIn [KM]-APP(-10,+10)KTEEISEV lys AEFRHDSGY
Met Asp [NL]-APP(-10,+10)KTEEISEV , qsn AEFRHDSGY
~
ASp [KL]-APP(-10,+10)KTEEISEV lys AEFRHDSGY
Leu Asp [NM]-APP(-10,+10)KTEEISEV , qsn AEFRHDSGY
Met Asp ~~~ [KM]-APP(-20,+20)TRPGSLTNIKTEEISEVlys AEFRHDSGYEVHHQKLVFF
Met Asp [NL]-APP(-20,+20)TRPGSLTNIKTEEISEVqsn AEFRHDSGYEVHHQKLVFF
, ~
AS

Tableau 1: tableau des peptides de différentes tailles mimant ou reproduisant le site de clivage de la ~i-secrétase, synthétisés pour être utilisés comme substrat dans la caractérisation et la specifité enzymatique du polypeptide selon l'invention.

Inhibiteurs Li nes cellulaires HMCB H9 Hs27 IM-~9 MRC-s THP-1 S1N1088SW17 Standard 100 100 100 100 100 100 100 100 (0.1 mM) EDTA ~ ,~9 ~ 71 ,~, ~ ~g gz (3. 3 mM) pepstatine 100 100 88 100 99 100 100 100 (10 ~M) ' chymostatine95 87 72 97 75 7~ 100 100 ~M ) ( 5 aprotinine 90 100 40 97 97 93 100 100 (0.8 ~M) pefabloc _53 ~ )3 97 ~ ~4 91 5~

(3.3 ~.M) phosphoramido97 ~ 83 79 66 89 70 76 _ ~ - -M) captopril 96 87 97 100 100 100 100 100 (60 ~.M) Tableau 2: Profil d'inhibition des activités enzymatiques des 8 lignées cellulaires sélectionnées vis à vis du peptide Z-Val-Lys-Met-MCA, exprimé en pourcentage d'activité.

Peptides ~ clivage(%) ~~ liaison clivée ~A)-Mutation suédoise:effet de la ta111e [KMD]-APP(-5,+5) 65 Met'Asp NLD -APP -5,+5 0 [KM]-APP(-10,+10) 45 non dtermine -APP
-10,+10 [KM]-APP(-20,+20) 90 non dtermine -20,+20 _____ IIN~s)-MUtation sueaolse:importance des sous-site P2 et P,IIII
[NMD]-APP(-5,+5) 45 Met'Asp [KMD]-APP(-5,+5) 65 ~ Met'Asp [KLD]-APP(-5,+5) 80 Leu'Asp NLD -APP -5,+5 0 [KMD]-APP(-5,+5) 65 Met'Asp [RMD]-APP(-5,+5) 80 Met'Asp [KLD]-APP(-6,+5) 60 Leu'Asp RLD -APP -5,+5 20 Leu'As C
-Substitution en P~

[KMD]-APP(-5,+5) 65 Met'Asp [KLD]-APP(-5,+5) 60 Leu'Asp [KID]-APP(-5,+5) 40 Ile'Asp KVD -APP -5,+5 15 Val'As D
-Substitution en P', [KMD]-APP(-5,+5) 65 Met'Asp [KMN]-APP(-5,+5) 70 Ala'Glu [KMQ)-APP(-5,+5) 80 Ala'Glu APP(1,+5) 35 Ala'Glu Tableau 3 : résultats de l'analyse de la spécificité enzymatique du polypeptide de l'invention en utilisant des peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur APP, au niveau du site de clivage.

WO 99/64587 PCT/FR99/o1326 Références 1)-Nelson et al. (1993), Journal of neurochemistry, 61, 567-577.
2)-Sahasrabuche et al. (1993),Journal of Biological Chemistry, 268, 16699-3)-Higaki et al. (1996), Journal of Biological Chemistry, 271, 31885-31893 4}-Abraham et al. ( 1991 ), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796.
5)-Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948.
6)-Matsumoto et al. (1994), Neurosciences Letters, 195, 171-174.
7)-Razzaboni et al. ( 1992), Brain Research, 589, 207-216.
8)-Lel'age et al. (1995), FEBS Letters, 377, 267-270.
9)-Itoh et al. (1997), Journal of Biological Chemistry, 272, 22389-22392 10)-Papastoisis et al., (1994), Biochemistry, 33, 192-199.
11)-Thompson et al., (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun., 213, 66-73 12)-Sch~nlein et al., (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 45-53 13j- Ida N.et al.(1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914 "Analysis of heterogeneous f3A4 peptides in human cerebrodpinal fluid and blond by a newly-developed sensitive Western blot assay". 24 Small acid s uences amins P pp ' APP (1, + 5) Asp AEFR ' [KMD] -APP (-5, + 5) sEV lys AEFR
Met Asp [RMD] -APP (-5, + 5) SEV ~ AEFR
Met Asp [KLD] -APP (-5, + 5) SEV lys AEFR
Leu Asp [RLDJ-APP (-5, + 5) sEV ~ AEFR
fire Asp [NLD] -APP (-5, + 5) SEV, qsn AEFR
Leu Asp [NMD] -APP (-5, + 5) SEV, qsn EFR
Met Asp [K! D] -APP (-5, + 5) SEV lys AEFR
ll ~ -Asp [KVD] -APP (-5, + 5) SEV lys AEFR
~ I
Asp [KMN] -APP (-5, + 5) SEV lys AEFR
Met Asn [KMQ] -APP (-5, + 5) SEV lys AEFR
Met Gin [KM] -APP (-10, + 10) KTEEISEV lys AEFRHDSGY
Met Asp [NL] -APP (-10, + 10) KTEEISEV, qsn AEFRHDSGY
~
ASp [KL] -APP (-10, + 10) KTEEISEV lys AEFRHDSGY
Leu Asp [NM] -APP (-10, + 10) KTEEISEV, qsn AEFRHDSGY
Met Asp ~~~ [KM] -APP (-20, + 20) TRPGSLTNIKTEEISEVlys AEFRHDSGYEVHHQKLVFF
Met Asp [NL] -APP (-20, + 20) TRPGSLTNIKTEEISEVqsn AEFRHDSGYEVHHQKLVFF
, ~
AS

Table 1: table of peptides of different sizes mimicking or reproducing the ~ i-secretase cleavage site, synthesized to be used as substrate in the characterization and enzymatic specificity of the polypeptide according to the invention.

Li inhibitors nes cell phones HMCB H9 Hs27 IM- ~ 9 MRC-s THP-1 S1N1088SW17 Standard 100 100 100 100 100 100 100 100 (0.1 mM) EDTA ~, ~ 9 ~ 71, ~, ~ ~ g gz (3. 3 mM) pepstatin 100 100 88 100 99 100 100 100 (10 ~ M) ' chymostatin 95 87 72 97 75 7 ~ 100 100 ~ M) (5 aprotinin 90 100 40 97 97 93 100 100 (0.8 ~ M) pefabloc _53 ~) 3 97 ~ ~ 4 91 5 ~

(3.3 ~ .M) phosphoramido97 ~ 83 79 66 89 70 76 _ ~ - -M) captopril 96 87 97 100 100 100 100 100 (60 ~ .M) Table 2: Profile of inhibition of the enzymatic activities of the 8 lines cell phones selected with respect to the Z-Val-Lys-Met-MCA peptide, expressed as a percentage of activity.

Peptides ~ cleavage (%) ~~ cleaved bond ~ A) -Swedish mutation: effect of ta111e [KMD] -APP (-5, + 5) 65 Met'Asp NLD -APP -5, + 5 0 [KM] -APP (-10, + 10) 45 not determined -APP
-10, + 10 [KM] -APP (-20, + 20) 90 not determined -20, + 20 _____ IIN ~ s) -MUtation sueaolse: importance of sub-sites P2 and P, IIII
[NMD] -APP (-5, + 5) 45 Met'Asp [KMD] -APP (-5, + 5) 65 ~ Met'Asp [KLD] -APP (-5, + 5) 80 Leu'Asp NLD -APP -5, + 5 0 [KMD] -APP (-5, + 5) 65 Met'Asp [RMD] -APP (-5, + 5) 80 Met'Asp [KLD] -APP (-6, + 5) 60 Leu'Asp RLD -APP -5, + 5 20 Leu'As VS
-Substitution in P ~

[KMD] -APP (-5, + 5) 65 Met'Asp [KLD] -APP (-5, + 5) 60 Leu'Asp [KID] -APP (-5, + 5) 40 Ile'Asp KVD -APP -5, + 5 15 Val'As D
-Substitution in P ', [KMD] -APP (-5, + 5) 65 Met'Asp [KMN] -APP (-5, + 5) 70 Ala'Glu [KMQ) -APP (-5, + 5) 80 Ala'Glu APP (1, + 5) 35 Ala'Glu Table 3: results of the analysis of the enzyme specificity of polypeptide the invention using peptides mimicking or reproducing the sequence of acids amines of the APP precursor, at the cleavage site.

WO 99/64587 PCT / FR99 / o1326 References 1) -Nelson et al. (1993), Journal of neurochemistry, 61, 567-577.
2) -Sahasrabuche et al. (1993), Journal of Biological Chemistry, 268, 16699-3) -Higaki et al. (1996), Journal of Biological Chemistry, 271, 31885-31893 4} -Abraham et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796.
5) -Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948.
6) -Matsumoto et al. (1994), Neurosciences Letters, 195, 171-174.
7) -Razzaboni et al. (1992), Brain Research, 589, 207-216.
8) -Lel'age et al. (1995), FEBS Letters, 377, 267-270.
9) -Itoh et al. (1997), Journal of Biological Chemistry, 272, 22389-22392 10) -Papastoisis et al., (1994), Biochemistry, 33, 192-199.
11) -Thompson et al., (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun., 213, 66-73 12) -Sch ~ nlein et al., (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 45-53 13d- Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914 "Analysis of heterogeneous f3A4 peptides in human cerebrodpinal fluid and blond by a newly-developed sensitive Western blot assay ".

Claims (29)

REVENDICATIONS 1. Polypeptide possédant une activité de type .beta.-secrétase caractérisé en ce qu'il est capable de cliver de manière spécifique le précuseur naturel du peptide .beta.-amyloïde (APP). 1. Polypeptide possessing a .beta.-secretase type activity characterized in this that it is capable of specifically cleaving the natural precursor of peptide .beta.-amyloid (APP). 2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le précurseur du peptide .beta.-amyloïde (APP) ne porte pas de mutation dans sa séquence protéique. 2. Polypeptide according to claim 1 characterized in that the precursor of .beta.-amyloid peptide (APP) does not carry a mutation in its sequence protein. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide purifié à partir de cellules humaines de sujet non atteint par la maladie d'Alzheimer. 3. Polypeptide according to claim 1 or 2 characterized in that it is of one polypeptide purified from human cells of subject not affected by the sickness of Alzheimer's. 4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il - possède une masse moléculaire d'environ 70 Kda.
- possède un point isoéléctrique d'environ 6.0 - est une endopeptidase de la famille des sérines protéases - est une endopeptidase de type chymotrypsine sensible - atteint une activité maximale à un pH compris entre 7 et 8. 4. Polypeptide according to one of claims 1 to 3 characterized in that it - has a molecular mass of approximately 70 Kda.
- has an isoelectric point of about 6.0 - is an endopeptidase from the serine protease family - is a sensitive chymotrypsin-like endopeptidase - reaches maximum activity at a pH between 7 and 8. 5. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce que son activité
n'est pas dépendante d'un second subtrat et/ou ligand. 5. Polypeptide according to claim 4 characterized in that its activity is not not dependent on a second substrate and/or ligand. 6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que son activité
n'est pas dépendante d'ions et de préférence de cations calciques ou magnésiques. 6. Polypeptide according to claim 5 characterized in that its activity is not not dependent on ions and preferably on calcium or magnesium cations. 7. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable de cliver au site .beta.-secrétase le précurseur du peptide .beta.-amyloïde, obtenu par reproduction des motifs actifs du polypeptide selon les revendications 1 à 6 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques. 7. Non-peptide or non-exclusively peptide compound capable of cleaving at the .beta.-secretase site the precursor of the .beta.-amyloid peptide, obtained by reproduction of active units of the polypeptide according to claims 1 to 6 by structures Nope peptides or not exclusively peptides. 8. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence signal. 8. Polypeptide according to one of claims 1 to 7 characterized in that it further includes a signal sequence. 9. Polypeptide selon la revendication 8 caractérisé en ce que la séquence signal est choisie parmi la séquence du peptide signal de IgkB, le peptide signal de l'APP, les peptides signal des sous-unités des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine musculaires et centraux . 9. Polypeptide according to claim 8 characterized in that the sequence signal is chosen from the sequence of the signal peptide of IgkB, the signal peptide of the APP, nicotinic receptor subunit signal peptides of acetylcholine muscles and cores. 10. Procédé de purification à partir de cellules provenant de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer, d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes:
-le surnageant de la culture cellulaire est prélèvé puis concentré
-le produit de concentration est à nouveau concentré sur membrane tangentielle -le produit obtenu est ensuite purifié par chromatographies successives et notamment par chromatographies d'exclusion, échangeuses d'ions et d'interaction hydrophes. 10. Method of purification from cells originating from subjects not reached by Alzheimer's disease, of a polypeptide according to one of Claims 1 at 9 characterized in that the following steps are carried out:
-the cell culture supernatant is removed and then concentrated -the concentration product is again concentrated on a membrane tangential -the product obtained is then purified by successive chromatographies and in particular by exclusion chromatography, ion exchange and of interaction hydrophs. 11. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine représentative du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et capable de réaliser le métabolisme normal du précurseur du peptide .beta. amyloïde pour la production des polypeptides de l'invention définis selon les revendications 1 à 9. De manière préférée la lignée cellulaire sélectionnée est la lignée THP1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte. 11. Use of a Representative Human Cell Line of the System Central or Peripheral Nervous and Immune System and capable of realize the normal metabolism of the .beta peptide precursor. amyloid for production of the polypeptides of the invention defined according to claims 1 to 9.
favorite the selected cell line is the THP1 line (ATCC TIB 202) derived from monocyte. 12. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine représentative du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et capable de réaliser le métabolisme normal du précurseur du peptide .beta. amyloïde pour la mise en évidence de composés capables d'inhiber l'interaction entre le polypeptide selon les revendications 1 à 9 et son substrat. De manière préférée la lignée cellulaire sélectionnée est la lignée THP1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte. 12. Use of a Representative Human Cell Line of the System Central or Peripheral Nervous and Immune System and capable of realize the normal metabolism of the .beta peptide precursor. amyloid for evidence of compounds capable of inhibiting the interaction between the polypeptide according to the claims 1 to 9 and its substrate. Preferably the selected cell line is the line THP1 (ATCC TIB 202) from monocyte. 13. Anticorps ou fragment d'anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé
contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 et en ce qu'il possède la faculté
d'inhiber au moins en partie l'interaction entre le dit polypeptide et le précurseur du peptide .beta.-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide tel que défini selon la revendication 1 et/ou d'intervenir sur le métabolisme du peptide .beta.-amyloïde. 13. Antibody or antibody fragment characterized in that it is directed versus a polypeptide according to one of claims 1 to 9 and in that it has the faculty to inhibit at least in part the interaction between the said polypeptide and the precursor of .beta.-amyloid peptide and/or to inhibit the activity of the polypeptide such as defined according to claim 1 and/or to intervene in the metabolism of the .beta.- peptide amyloid. 14. Procédé de mise en évidence ou d'isolement de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction du polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 et le précurseur du peptide .beta.-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité
dudit polypeptide, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée exprimant un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 9 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où
celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide. 14. Method for detecting or isolating compounds capable of to inhibit at least in part the interaction of the polypeptide according to one of the claims 1 to 9 and the .beta.-amyloid peptide precursor and/or to inhibit the activity said polypeptide, characterized in that the following steps are carried out:
a - a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, with a recombinant cell expressing a polypeptide as defined according to one of claims 1 to 9 in terms allowing the interaction between said polypeptide and said molecule in the case where it would have an affinity for said polypeptide, and, b - the molecules bound to said polypeptide are detected and/or isolated. 15. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 9, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 14. 15. Ligand of a polypeptide as defined according to claims 1 to 9, capable of being obtained according to the process of claim 14. 16. Ligand selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un antagoniste, d'un agoniste ou d'un inhibiteur du polypeptide défini selon les revendications 1 à 9. 16. Ligand according to claim 15, characterized in that it is a antagonist, of an agonist or of an inhibitor of the polypeptide defined according to the claims 1 to 9. 17. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un inhibiteur du polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9. 17. Pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least an inhibitor of the polypeptide according to one of claims 1 to 9. 18. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13 et/ou un ligand selon la revendication 15. 18. Pharmaceutical composition comprising as active principle at least an antibody or antibody fragment according to claim 13 and/or a ligand according claim 15. 19. Compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13, ligands et/ou séquences nucléotidiques correspondantes définis selon la revendication 15 sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs. 19. Pharmaceutical compositions in which the peptides, antibodies or antibody fragment according to claim 13, ligands and/or sequences nucleotides corresponding defined according to claim 15 are associated with each other or with other active ingredients. 20. Composition selon l'une des revendications 17 à 19 destinée à inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide .beta.-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide. 20. Composition according to one of claims 17 to 19 intended to inhibit the least in part the interaction between the polypeptide and the peptide precursor .beta.-amyloid and/or inhibit the activity of the polypeptide. 21. Composition selon l'une des revendications 17 à 20 destinée à intervenir sur le métabolisme du peptide .beta.-amyloïde et de préférence pour inhiber ou ralentir la production de peptide .beta.-amyloïde. 21. Composition according to one of claims 17 to 20 intended to intervene on .beta.-amyloid peptide metabolism and preferably to inhibit or slow down production of .beta.-amyloid peptide. 22. Composition selon l'une des revendications 17 à 21 destinée au traitement des maladies neurodégénératives. 22. Composition according to one of claims 17 to 21 intended for treatment of neurodegenerative diseases. 23. Composition selon la revendication 22 destinée au traitement de la maladie d'Alhzeimer. 23. Composition according to claim 22 intended for the treatment of Alzheimer's disease. 24. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13 et/ou un ligand selon la revendication 15 pour inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide .beta.-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide et/ou intervenir sur le métabolisme du peptide .beta.-amyloïde. 24. Use of an antibody or antibody fragment according to claim 13 and/or a ligand according to claim 15 for inhibiting at least in part the interaction between the polypeptide and the .beta.-amyloid peptide precursor and or to inhibit the activity of the polypeptide and/or to intervene in the metabolism of the peptide .beta.-amyloid. 25. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13 et/ou un ligand selon la revendication 15 comme médicament, notamment pour le traitement des maladies neurodégénératives et en particulier la maladie d'Alhzeimer. 25. Use of an antibody or antibody fragment according to claim 13 and/or a ligand according to claim 15 as medicament, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases and in particular the disease of Alzeimer. 26. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et notamment la maladie d'Alhzeimer. 26. Use of the polypeptides according to claims 1 to 9 for the preparation of a medicament for the treatment of diseases neurodegenerative and in particular Alzheimer's disease. 27. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 9 pour la mise en évidence de ligands des polypeptides et/ou de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide .beta.-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide et/ou d'intervenir sur le métabolisme du peptide .beta.-amyloïde. 27. Use of the polypeptides according to claims 1 to 9 for the setting evidence of polypeptide ligands and/or compounds capable of inhibiting to least in part the interaction between the polypeptide and the peptide precursor .beta.-amyloid and/or to inhibit the activity of the polypeptide and/or to intervene on the .beta.-amyloid peptide metabolism. 28. Méthode de mise en évidence de molécules qui modifient l'activité des polypeptides de l'invention, comportant les étapes suivantes:
- on met en contact les polypeptides de l'invention qui présente une activité
de type .beta.-secrétase avec une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées.
- on met en contact le mélange réactionnel décrit dans l'étape précédente avec le subtrat des polypeptides de l'invention qui est préférentiellement l'APP dans sa forme naturelle - on mesure l'activité .beta.-secrétase sur l'APP
- on détecte et/ou on isole les molécules qui modifient l'activité .beta.-secrétase des polypeptides de l'invention. 28. Method for detecting molecules which modify the activity of polypeptides of the invention, comprising the following steps:
- the polypeptides of the invention which exhibit an activity are brought into contact of .beta.-secretase type with a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified.
- the reaction mixture described in the previous step is brought into contact with the substrate of the polypeptides of the invention which is preferentially the APP in its natural form - the .beta.-secretase activity on the APP is measured - molecules that modify .beta.- activity are detected and/or isolated secretase polypeptides of the invention. 29. Vecteur viral ou plasmidique contenant les séquences nucléotidiques des molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention pour la transfection dans des cellules hôtes appropriées, des dites séquences et l'expression in vivo, ex-vivo et/ou in vitro des dites molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention 29. Viral vector or plasmid containing the nucleotide sequences of agonist or antagonist molecules of the polypeptides of the invention for the transfection into appropriate host cells of said sequences and the expression in vivo, ex-vivo and/or in vitro of said agonist or antagonist molecules of polypeptides of the invention