CA2193263A1 - Adenovirus comportant un gene codant pour une no synthase - Google Patents
Adenovirus comportant un gene codant pour une no synthaseInfo
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Abstract
Recombinant adenovirus comprising a gene coding for an NO synthase, its use in the treatment of restenosis and corresponding pharmaceutical compositions.
Description
WO 96101902 r~.~r~
~ 1 ADFNovrRus COMPORTANT UN GFNE COD~NT POUR UNE NO
SYNT~A~
La présente invention concerne un adénovirus ~L-~ ~,., h r s comportant un gène codant pour une NO sy-nthase. Elle concerne également des c~n~ c r1 -~ permettant l'i ' Iocale et efficace de ces virus 'et plus I ~-', leur utilisation pour le traitement de la resténose.
Les d~ r~- sont des désordres du ~ . des l;p~ t~ lr~lY)r~- h1r~ du transport, dans le sang et les fluides p' ~ de 10 lipides comme le cholestérol et les iLigly~,fLilles. Elles conduisent à des pathologies ~ p.~ . Iiées le~ ,iivemclll à rLy~lellOleslelulelllie ou rhypertri~;lyl ' ~ '' ~ .
terles que notamment l'ilillélu~,léLui~r,.
L'dll~r~ lf~ a est la cause principale des infarctus du myocarde et est '' de près de la moitié du taux de mor-alité dans les pays développf~s.
15 I~Ly~ r~q~ r ns ,1~ erle se traduit I ~ l ' par la formation, au niveau de laparoi des grosses artères, de plaques constituées de cholestérol, lipu~.. ' cellules spumeuses et/ou tissus fibreux. V ~ '' '' t, ces plaques ' '' sont la ~r~ ~AI r r . r d'une réponse ~ '' ~ e excessive à ume lésion chronique au niveau de l'~ ~ ' des parois ar-érieLLes. Ce type de plaque ~.;I._.ulll~ i est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosimt,,--'.1F- des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui - chez les patients les plus atteints.
La technique cl';-a,M~ pl-~l F est la thérapie la plus ~:UI ' mise en oeuvre pour rétablir la circulation sanguine à travers l'ar-ère ainsi obstruée. Toutefois, dans environ 4036 des cas, cette technique échoue du fait de resténose, ~;u~u i~_ à
la blessure mécanique de la paroi artérielle. Cette seconde pathologie est liée à la migration et la ~ 1 rrl~ rl de ceDlules ' lisses vasculaires (CMLV) qui premment place en rabsence de la protection etlou du l t~ exercé5 par le5 ceriules r~nrl~-thf~liA1F~: de l'intima.
Un traitement proposé pour contrer cette ~lulil'él~iiull des cerLules CMLV, ~ consiste à les supprimer par ~' ~ ~ de substances chimiques ou protéiques adéquates. C'est ainsi que des dérivés de psolarènes sont incorporés dans les cerlules ~luli~ ive~ de manière à les sensibiLiser à raction de la lumière [March et al, Circulation, ~Z 184-191, (1993)]. De même, certaines cytotoxines, constituées d'ume ~EUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
~ 1 ADFNovrRus COMPORTANT UN GFNE COD~NT POUR UNE NO
SYNT~A~
La présente invention concerne un adénovirus ~L-~ ~,., h r s comportant un gène codant pour une NO sy-nthase. Elle concerne également des c~n~ c r1 -~ permettant l'i ' Iocale et efficace de ces virus 'et plus I ~-', leur utilisation pour le traitement de la resténose.
Les d~ r~- sont des désordres du ~ . des l;p~ t~ lr~lY)r~- h1r~ du transport, dans le sang et les fluides p' ~ de 10 lipides comme le cholestérol et les iLigly~,fLilles. Elles conduisent à des pathologies ~ p.~ . Iiées le~ ,iivemclll à rLy~lellOleslelulelllie ou rhypertri~;lyl ' ~ '' ~ .
terles que notamment l'ilillélu~,léLui~r,.
L'dll~r~ lf~ a est la cause principale des infarctus du myocarde et est '' de près de la moitié du taux de mor-alité dans les pays développf~s.
15 I~Ly~ r~q~ r ns ,1~ erle se traduit I ~ l ' par la formation, au niveau de laparoi des grosses artères, de plaques constituées de cholestérol, lipu~.. ' cellules spumeuses et/ou tissus fibreux. V ~ '' '' t, ces plaques ' '' sont la ~r~ ~AI r r . r d'une réponse ~ '' ~ e excessive à ume lésion chronique au niveau de l'~ ~ ' des parois ar-érieLLes. Ce type de plaque ~.;I._.ulll~ i est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosimt,,--'.1F- des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui - chez les patients les plus atteints.
La technique cl';-a,M~ pl-~l F est la thérapie la plus ~:UI ' mise en oeuvre pour rétablir la circulation sanguine à travers l'ar-ère ainsi obstruée. Toutefois, dans environ 4036 des cas, cette technique échoue du fait de resténose, ~;u~u i~_ à
la blessure mécanique de la paroi artérielle. Cette seconde pathologie est liée à la migration et la ~ 1 rrl~ rl de ceDlules ' lisses vasculaires (CMLV) qui premment place en rabsence de la protection etlou du l t~ exercé5 par le5 ceriules r~nrl~-thf~liA1F~: de l'intima.
Un traitement proposé pour contrer cette ~lulil'él~iiull des cerLules CMLV, ~ consiste à les supprimer par ~' ~ ~ de substances chimiques ou protéiques adéquates. C'est ainsi que des dérivés de psolarènes sont incorporés dans les cerlules ~luli~ ive~ de manière à les sensibiLiser à raction de la lumière [March et al, Circulation, ~Z 184-191, (1993)]. De même, certaines cytotoxines, constituées d'ume ~EUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
2 1 ~3263 WO 96/01902 r~.l/rl~ C '~
protéine de fusion entre un fragment de toxine de plante ou bactériemne et un facteur de croissance, ont également été utilisées à ces fins rPickering et al, J. Clin. Invest., 2L 724-729 (1993); Biro et al, Circ. Res., :ZL 640 645, (1992); Casscerls et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89. 7159-7163, (1992)].
Toutefois, ces traitements ne donnent pas entière satisfaction en raison notamment de leur faible spécificité, Ieur efficacité moyenne et un délai d'action important.
La présente invention a l pour objet de proposer une nouveLe méthode, par thérapie genique, l "" efficace et sélective pour le traitement de la resténose post 6 ~. .
L'approche retenue dans le cadre de la présente invention, se distingue totalement de ce qui précède et consiste à interverlir au niveau de l'expression d'un des facteurs impliqués dans la uluL'u.aLù-l des CMLV. ~ " t, elle vise à
augmenter la teneur d'un facteur jouimt um rôle d'agent bloquant à l'égard de cette 15 t,lulir~ L~.L
Plus l ' t, la présente invention vise à accroitre la ~ en monoxyde d'azote, NO, au niveau de la paroi vasculaire, soumise à rh.~g:u~ ;., via 1'. . de la NO synthase, enzyme catalysant la synthèse de NO à partir d'arginine.
On peut admettre que les quantités de NO, produites à l'état ~ i,iolog.~lu~ par les ceLIules ~ ~' ' " ' , . ' aux ~ nécessaires à l'intégrité, i.e. au bon r - ' de la paroi vasculaire. La destruction mécanique de r. '.( ' "~ ' .~, à 1' ,, I ' ~ conduit donc à une baisse de la prcduction de NO.
L....... t, il est établi que la r~ n p~ q~ des taux de NO
est capable d'interférer avec la l ' ' des CMLV observée lors de la resténose [McNamara et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 193(1), 291-296, (1993)] ont notamment montré que 1' ' de L-arginine, précurseur de NO, réduit l'h~ . ' ~ mtimale dans un modèle de sténose p~ l ' chez le lapin.
L'expression de NO synthase, selon la présente invention, ' au niveau de la paroi: ' q..,' . permet ~ , de rétablir rapidement des suffisantes en NO, d'améliorer ainsi le l~,.no~l..~_ vasculaire via la v~~ DRF dépendante et de bénéficier en outre des effets associés i..~ti comme ume inhibition de la ~luLf~aLuil des CMLV et une réduction de I'agrégation l' . Par aiLeurs, NO est également impliqué dans les 2 1 q3263 WO 96101902 r~,l/r. ~.. 3 d' ~- V ' (Ziche et al., J t'lin T .~t. 94, 2036-2044 (1994). Cette activité - g O' , est reflétée in vitro par la capacité de donneurs de NO tels que le SNP (sodium l ' ) à s~muler la croissance et la migration des cellules '~ ' " ' (Ziche et al., J.Chin. Invest. 94, 2036-2044 (1994). NO pourrait donc 5 agir comme un facteur autocrine de la néuv ~ important dans les situations d'ischérnie notamment .l.yu~.,..Ly.~.
La présente invention ~ rapporte l , ~ à un adenovirus comportant au moins un gène codant, en totalité ou non, pour l'intégralité ou une 10 partie active d'une enzyme catalysant la synthèse de l'oxyde d'azote.
Les avar~ages de la pré~nte invention résident notamment dans la forte capacité des adénovirus de l'invention à infecter les cerlules ' ~_ lis~s vasculaires en IJluliffélaLi~l. Ceci permet d'utiliser des quantités ' ~. faibles de principe actif (&d~.~.~..~ ' '.~, et permet également une action efficace très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à très hauts niveaux les gènes introduits, ce qui leur confère une action i' , , tres efficace. En raison de leur caractère episomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance Lmitée dans les cellules I "~ ve:. et donc un effet transitoire l ' adapté à reffet i' ~ . recherché.
Le monoxyde d'azote est connu pour intervenir au niveau de l'activité
biologique de EDRF (: ' ' ' derived relaxing factor). EDRF joue un role important au niveau de la régulation notamrnent du flux sanguin en inhibant les des muscles mous et ragrégation I ' , ' e [Radomski et al., Lancet 2, 1057-1058 (1987)]. Il faut noter que NO est également présent dans le plasma sous la forme de g , S . ' ' liés à des protéines telles que ralbumine. Les S-nitroso-protéines ainsi générées, plus stables que NO, sont , ' ' , du moins t, de l'activité EDRF. Outre leurs propriétés v ' ' les S-nitroso-protéines sont également de puissants agents ~ ~ r' l '' ' [Simon et al. ~. .~ . ;. .~. l~ . . .- - and Tl ' , L~. 791-799 (1993)]. Dans le cas des maladies ~.diuv ' eO, une production altérée de EDRF est associée à la ~,' de l' ' '' u~ et de l'hy~.~ JII pulmonaire et s~ A Le monoxyde d'azote est également reconnu comme ' t, au niveau du système nerveux, à titre de r~... et comrne participant, au niveau du système ~ _, à ractivité ~ . . des lI~ Plus ~ t, le monoxyde d'azote a été décrit comme un agent capable d'agim" sur la ~uLît~al;ull des 2~ 93263 wo 96/0~902 r~ c . . ~13 CMLV puisqu'in vitro, diff6rents composés, donneuts de NO, inhibent la mitogénèse des CMLV en culture [Garg et al., J. Clin.lnvest., ~, 1774-1777, (1989)].
Les enzymes ~ '' de la production en monoxyde d'azote dans chacun de ces systèmes, désignées ci-après NO synthases sont, ~ , réparties 5 en trois catégories dites isoforme 1, isoforme 11 et isoforme m.
- La NO synthase dite isoforme I, est exprimée de manière continue et dépendante du calcium, au niveau des cellules du cerveau. Cette NO synthase neuronale est constitutive. Elle 2 récemment été clonée chez l'homme [Nakane M., Schmidt H.H, Pollock J.S., ForstmaM U., et Murad F; Lett. ~l~i (2) 175- 180 (1993)1.
L'isoforme Iï est exprimée dans les ll~l ,' ~ murins et induite par le TNF ou l'IL 1. La 1 ' ~ des NOS de type inductible est pri~rir:llPm.ont leur capacité àproduire de fortes - de NO en réponse à certaines cytokines. Dans le cadre de la présente invention, on peut l r '' ' envisager leur expression sous 15 contrôle d'un promoteur exogène, viral ou non, ne contenant pas d'élément de réponse aux cytokines. Le controle de la production en monoxyde d'azote est, dans ce cas, assuré par un promoteur présent dans l'~e..~,v,.us. Deux NO synthases humaines inductibles ont notamment été clonées [Geller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ~Q, 3491-3495 (1993) et Charles et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90. 11419-11423 (1993)].
- En ce qui concerne risoforme m, elle est exprimée dans les cellules ~ '~ ' " ' et est calcium- ~ s~ ~ Cette isoforme dite ~ v~ ou; '.( ~" ' .
est ' exprimée dans la paroi vasculaire et associée à ractivité EDRF. La NO synthase ~ '~ ' " ' humaine a été clonée Panssens et al. J Bio. Chem. 267.
14519-145~ (1992) et Marsden et al. FEBS Lett. 307. 287-293 (1992)]. De part sespropriétés d'EDRF, le monoxyde d'azote produit par cette NO synthase joue un rôle essentiel dans la relaxation des CMLV.
Selon la présente invention, tout gène codant pour l'intégralité ou seulement une partie active d'une NO synthase ou un de ses dérivés et ~I.,f;~ -. " codant pour l'une de ces trois isoformes de NO synthases peut être incorporé dans un adenovirus en vue de son expression in vivo. Par dérivé de NO synthase, on entend désigner tout pvl.~l;..e obtenu par ~.r '' et consenant une activité
WO 96101902 2 1 9 3 2 6 3 P.l~r~
.
biologique. Par ....- I f;- -:; . on doit entendre toute mutation, ~ délétion, addition ou, ..I;r;, -l:.... de nature génétique et/ou chimique.
La NO synthase, ou son dérivé, produit dans le cadre de la présente invention peut être une NO synthase humaine ou une NO synthase animale. Il peut en particulier 5 s'agir d'une NO synthase bovine.
La séquence d'ADN codant pour la NO synthase ou un de ses dérivés, utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une ~ hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel 10 seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences ~,~ 1 ou De manière ~ v v , on utilise un ADNc ou un ADNg.
Selon un mode préféré de l'invention, il s'agit une séquence d'ADNc codant pour une NO synthase humaine.
Pour la ~~ ~ 'h ~ 1 ~ des adénovirus selon l'invention, différents sérotypes peuvent être utilises. Il existe en effet de nombreux sérotypes .I'~d;..vv.l~, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfèrecependant utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ~exemple:
Mavl, Beard et al., Virology ~ 81, (1990)], ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'~ vv~.s d'origine animale est un adénovirus canin, plus l un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Cornme indiqué ci-avant, les adéno~irus selon rinvention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. t' ' t, le génome des adénovir~s défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la ceLIule infectée. Ces régions peuvent être sOie eliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-~ " . soit subsdtuées par d'autres séquences et notamment par le gène suicide. r.. ~ t, r~d~.vvllus defectif wo 96/01902 2 1 9 3 2 6 3 . ~I/r~ s ~
conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires h .. des particules virales.
r ,r, .. ~ t, les adénovirus défectifs de l'invention ~ A ' les lTR, une séquence perrnettant 1'~ et le gène codant pour une enzyme NO
synthase. Encore plus ~ rf~ t, dans le génome des adénovirus de l'ulvention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, LI-L5 sont non ' Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par sup~ totale, "" délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les genes considérés. De terles "~ peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes Les adénovirus ' défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de rhomme du métier [Levrero et al., Gene, 101, 195, (1991), EP 185 573; Grabam, EMBO J. ~, 2917, (1984)]. En particulier, ils peuvent être préparés par ' homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène codant pour la NO synthase. La .
homologue se prcduit après co-i C_Liun desdits adénovirus et plasmide dans une lignée ceDlulaire appropriée. La lignée ceDlulaire utilisée doit de préférence (i) être r ~ par lesdits éléments, et (u), comporter les séquences capables de , ' ' Ia partie du génome de rh~:l~luv~u~ défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de l~. ' A titre d'exemple de lignée, on peut Ia lignée de rein ~ humain 293 [Graham et al., J. Gen. Virol.
~, 59, (1977)] qui contient t, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de, u. ~ de vecteurs dérivés des adénavirus ont également été décrites dans les demandes n~ Fl~ 93 05954 et FR 93 08596, Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés etpurifiés selon les techniques classiques de biologie I '' ' comme irlustré dans les exemples.
Av ~ t, dans les adénovirus de l'invention, le gene codant pour une enzyme NO synthase est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les ceLlules infectées. ll peut s'agir du propre promoteur du gène, d'un promoteur h. l; . . .1O~ ou d'un promoteur b,~ ' ' , N( t, il peut s'agir de promoteurs issus de genes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de WO96~0l90~ 2 1 ~3263 I_llrl ~ ,i3 séquences ~JIUI~UtLiC~.s issues du génome de la ceLule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences IJlUnlVt i~ issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les plUlllVt~ ElA, MLP,CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'~ oll peuvent être modifiées 5 par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant Ime expression tissu-spécifique. Il peut en effet être I ' ' intéressant d'utiliser des signaux d~J~JII actifs s~' ~, ou ~ t dans les cellules . - ..1~ .
Iisses vasculaires de préférence en division, de manière à ce que le gène ' ' r '' 1 ne soit exprimé et ne produise son effet que lorsque le virus a ~r~ . infecté
10 une cellule musculaire lisse vasculaire.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on utili~ un adénovirus IC ~ ' ' défectif r , ~ un gène codant pour une NO synthase sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.
La pré~nte invention vi~ l'utilisation des adénovirus ~lon l'invention à des fins i' I , et plus I " ~ leur application pour le traitement de la resténose. Cette application peut notamment être étendue aux situations u .k.~ ; d'ischémie où les propriétés de NO comme relais: ~g ag peuvent être Llvul.lL~ exploitées. Leur utilisation est également I~IIV' v 20 pour le traitement de ~ liées au système nerveux central.
Un autre objet de la pré~nte invention concerne donc une, au moins un adénovirus 1. ' défectif selon l'invention associé le cas échéant à un excipient Wll.. ' ' Les doses d~d~l'vv--~ ' ' cléfectif utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode .1' ' utilisé, de la pathologie wncernée ou enwre de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus ' selon l'invention sont 30 formulés et administrés sous forme de doses wmprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 101~ pfu/mL Le terme pfu (nplaque forming unit") wrrespond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, puis mesure, g~ ' ' nprès 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de " du titre pfu d'une solution virale sont bien J ' ' dans la littérature.
WO96/01902 2 1 93263 P~,~/r~S.'~ ~13 Un autre objet de rinvention concerne toute cellule de ~' infectée par un ou plusieurs adénovirus ' défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus ' ' . t, rinvention concerne toute population de cerlules hurnaines infectée par ces adénovirus. n peut s'agir en particulier de cellules; ' ' ' ' cellules ' ~ Iisses, ceriules neuronales, cellules tumorales, etc.
Les cellules selon rinvention peuvent être issues de cultures prirnaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l~omme du métier, puis mises en culture dans des conditions pennettant leur ~uLr&~Li~ . S'agissant plus ' ' de '-l '' ceux-ci peuvent etre aisément obtenus à partir de 10 biopsies, par ex~nple selon la technique décrite par Ham [Methods CerBiol. 21a (1980) 255]. Ces oeDiules peuvent être utilisées dh~h.lu..; pour l'infection par les adénovirus, ou conservées, par exemple par ~.~ng~ n pour r~ ~ de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les oellules selon rinvention peuvent également être des cultures ' ~ obtenues par exemple à partir de 15 banques préétablies.
Les oellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus ' ~ . pour leur conférer la capacité de produire de la NO synthase. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l~ornme du métier. En particulier, selon le type de oellules utilisé et le nombre de copies de virus par oerlule désiré, 20 I'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité alJIJlv~ lorsque les oellules sont destinées à une ~' in vivo. Les doses d'~.l'..~,vl.us ' ~ utilisées pour rinfection des oerules peuvent être adaptées par l'homme du méder selon le but recherc}~é. Les conditions décrites ci-avant pour r 25 in vivo peuvent être appliquées à rinfeclion in vitro.
Un autre objet de rrnvention conoerne un implant ~des cerlules marnmifère infectées par un ou plusieurs adénovirus ' ~défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrioe; " ' I~ t, les implants selon Frnvention CUI~ ' 105 à 101~ oellules. Plus I ~ " t, ils en CC.~ ' 106 8 108.
Plus I '' t, dans les implants de l'invention, la matrice " ' ~ ~ comprend un composé gelifiant et ~.. " un support permettant l'ancrage des oellules.
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Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des ceLules ~ dans une matrioe ayant la ~ ': ~ d'un gel, et pour favoriser rancrage des ceLules sur le support, le cas écl~éant. Différents agents d'adhésion oeLulaire peuvent donc etre 5 utilises comrne gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les ~Iy~. ~gl~, ~, la ~' les lectines, ragarose etc.
Comme indiqué ci-avant, les ~ ~ .c:l: . selon rinvention, a~ ' un support permettant rancrage des oeLules. Le terme ancrage désigne toute forme d' biologique et/ou chimique eVou physique er~aiinant 10 radhésion eVou la fixation des oellules sur le support. Par aiLeurs, les oeLules peuvent soit recouvlir le support utilisé, soit pénétrer à rintérieur de oe support, soit les deux.
On préfère utiliser dans le cadre de rinvention un support solide, non toxique eVou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de ~ul~; ~ ' ' ;l~leCPTFE) ou un support d'origine biologique comme par exernple un greffon veineux.Les irnplants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de r~ ~ - En particulier, l" ,' peut être effec~ee au niveau de la cavité
1 ' ' e, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le systeme nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon rinvention sont l ' ' 20 avantageux en oe sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produiti' li , dans rorganisme: CeLe-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicitéd'infection et par le nombre de oeDlules implantées. Ensuite, la libération peut etre contrôlée soit par le retrait de rimplant, oe qui arrête d'~ i le traitement, soit par l'ulilisation de rystèmes d'~oll régulable, permettant d'induire ou de réprimer 25 r~ , des gènes i' Par ailleurs, il a été noté que les propriétés ' ~ ~ 'og, de NO sont étroitement oontcolées par des réactions d'oxydation. En particulier, la ' ' de NO- par l'ion superoxyde aboutit à la formlation d'ion ~u~ ONOO- et par 30 conséquent à la perte de l'activité EDRF. Selon White et al.
[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2L 10441048, (1994)], oe processus d'oxydation est impLqué dans le du.. ' l~, de 1' ' u~l~u~;. Deux .. ~
, " ~ sont en fait mis en jeu: la réduction de l'activité guanylate cyclase des CMLV inhérente à l'ma~,Liv~liu.l de NO et 1'~ ~ de l'oxydation des 35 L~u~u~L.~,, résultant de l'apparition de pc.u~
2 i 93263 --wo s6Jol902 P_l/r- ~13 .
L'assosiation d'un traitement anti-oxydant à 1' ~ de l'activité NO
synthase peut par conséquent être souhaitable afin de conserver le bénéfice i- , . Iié à la production locale de NO. Dans cette perspective, I' conjointe de '' A ~ rd~' dismutase SOD [Wlute et al., Proc.Natl.Acad.SciUSA, 2L
1044-1048, (1994)] permet de garantir l'u.l~ vasculaire de la production d'ion ~ On peut I ~ envisager de procéder à une ' ~ ~
conjointe d'un adénovirus selon l'invention avec au moins un second adenovirus comportant un gène codant pour une superoxyde disrnutase ou encore de met~e en oeuvre un adénovirus selon rinvention comportant outre le gène codant pour une NO
s,vnthase, un gène codant pour une superox,vde disrnutase.
L'adénovitus et la ~ . l' , , selon la présente invention, constituent dea mo~vens l ' ' avantageux pour le traitement de la resténose p~t. ~ . .
La présente invention sera plus ~ .'' décrite à raide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
L~n~ r~-c Figure 1: R~ du vecteur pXLCMV-hum NOS
Figure 2: Re~L~.,Ia~ic,n du vecteur pXLRSV-humNOS
Figure 3: T ''' ' de la NOS neuronale humaine sur CMLV; r .
20 par le vecteur pXLRSV-humNOSn.
Figure 4: Validation du vecteur pXLRSV-humNOSn sur CMLV (mise en évidence de ractivite NOS par mesure de la converaion d'arginine en citmlline).
WO96/01902 2 1 9 32 6 3 ~ rJ u~ [9l3 .
r~ ' b- ' ~
Les méthodes l utiTisées en biologie ~ telles que les extractions ~ ~ d'ADN 1~ qu la ~ , d'ADN ~ en gradient de chlorure de césium, r;'~ 1 ' ' sur gels d'agarose ou d'~,lyLull; ;k, la 5 r '~ de fragments d'ADN par ~'~ " les extractions de protéines au phénol ~ au phénol- -' U~ull.~-t la IJl~;~;.4Li~)ll d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de r l l -1, la j r ' dans F~ ' ~ ~ coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont -~~~- décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 10 Laboratory-~ Cold Spring Harbor, N.Y., (1982); Ausubel F.M. et al. (eds), ~Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, (1987)].
Les plasrnides de ty~e pBR322, pl~C et les phages de la série M13 sont d'origine ~ (Bethesda Research T ~
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent etre séparés selon leur taille 15 par él~i~u~Lu~ en gels d'agarose ou d'..ul~l~.u.l~,, extraits au phénol ou par un mélange l- 1,'. - uçull~e~ précipités à l'éthanol puis incubés en présence de rADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les .~ - du '.~
Le ".:rpl; .~,.. des extrémités 5' 1"~ peut être effectué par le fragment de Rlenow de l'ADN Pol~ ' I d'E. coli (Biolabs) selon les 20 .~lf~ r;.~ du ' La destruction des extrémités 3' pl~ ' ~ est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (13iolabs) utilisée selon les ~ du fabricant. La destruction des extrémités 5' 1 ' ~ est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase Sl.
La _' ' dirigée in vitro par ol;~5~16ui~ , ' ~, peut 25 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et aT. [Nucleic Acids Res. 1 8749-8764, (1985)] en utiTisant le kit distribué par Amersham.
L~s ~ ;r;~ e -L.r . de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [~ûl~ catalyzed Chain ~eaction, Saiki R.K. et aT., Science ~Q, 1350-1354 (1985); Mullis R.B. et FaToona F.A., Meth. Enzym. 1~, 335-350, (1987)] peut30 être effectuée en utilisant un "DNA therrnal c~cler" (Perkin Elmer Cetus) selon les y~. r;. ~ du fabricant.
La vérification des séquences " ", peut être effectuee par la méthode développi~e par Sanger et al. [Proc. Natd. Acad Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
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F ' 1: C ' . '' du vecteur PXLCMV-humNOS porlant le gène codant pour la NO synthase sous le controle du L" . précoce du ' . ;. ~ (figure 1) Cet exemple décrit la ~ uuliu~l d'un vecteur contenant l'ADNc codant 5 pour la NO svnthase ~ 1r humaine, sous le contrôle d'un promoteur constitué
par le promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), ainsi qu'une régiûn de l'hd~,..uvhusAd5 nécessaire à la L~
Le fragment EcoRI de l'ADNc de la NO svnthase; k ' ' ' humaine, décrit par Jarssens et al. [J. Biol. Chem. 2Ç:Z, 14519-14522, (1992)] a été recloné
10 dans r''' , II SK + (STRATAGENE), dans l'~ ~ mettant les bases 5' de l'ADNc du côté du site Not I de pT~ , Un site Sal I est créé par ~ ' de deux, ' ~ ' ' appariés au niveau du site Not 1.
Le fragment Cla I-Sal I du plasmide résultant contient l'ADNc de la NO
synthase i k ' ' '~ humaine. Ce fragment a été inséré, entre les sites Cla I et Sal I, dans le plasmide PXL2375 (PCT/FR94/00422) qui comprend les séquences du promoteur précoce du ~ uus (CMV) et les régions Ad5 permettant la ~ . . r , Le plasmide obtenu a été désigné PXLCMV-humNOS.
E '- 2: ~' ~ du vecteur pXLRSV-humNOSn portant la NO
20 synthare neuronale humaine (type 1) sous le controle du ~,.. LTR-RSV
(figure 2):
Cet exemple décrit la Wll~ll UUliUII d'un vecteur contenant l'ADNc codant pour la NO
synthase neuronale humaine, sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du 25 vr;us de sarcome de Rous (LTR-RSV), ainsi qu'une région de l'hu.,nu~llus Ad5 nécessarre à la l~ ' ~ h~-rnr~ g~.o Le fragment EcoRI de rADNc de la NO synthase neuronale humaine, cloné dans le vec~Nr pcDNAI (Nakane et al, FELS 316: 175-180, 1993), a été recloné dans le 30 vecteur plC-20H dans l'~ ~ mettant l'extrémité 5' de l'ADNc de la NOS
neuronale du côté du site Cla I (Marsh et al., Gene 32: 431~35, 1984). Le fragment Cla I-Sal I du plasmide résultant a été inséré entre les sites Cla I et Sal I du plasmide pXL-RSV-LPL (Ei~ 94 06758) qui comprend les séquences du ptomoteur LTR-RSV
et les régions Ad5 permettart la l~ ' ~ homol(~ P Le plasmide obtenu a été
35 designé pXLRSV-humNOSn.
wo s6/o~so~ 2 1 9 3 2 6 3 r~l/r-- . ,13 F. ' 3: Controle de l'activité des vecteurs porhnt le gène codant pour une NO synthase sur rlodèles de culture ceUulaire in vi~ro L'activité des vecteurs contenant l'ADNc de NO synthase est controlée sur des modèles i~l vi~o. Les ceLlules sont j r 'C par les vecteurs contenant les différentes isoformes de NO synthase (cf. exemple 1,2). La .' de l'activité
NO synthase des cerlules b permet de comparer l'activité des NO synthases ainsi que l'efficacité des ~,~, utilises (ex.: ~SV-LTR, CMV1 La quantits de N02-/N03-, pr~duits d'oxydation de NO, est determinée dans le surnageant de culture par la méthode de Ciriess ou si nécessaire par des méthodes plus sensibles [Misko et al., Analytical F ' y 214, 11-16, (1993)]. Par ailleurs, ractivité NO svnthase " ' c~ peut etre quantifiée de manière directe, par mesure de la conversion d'argimne en citrulline [Nakane et al., FEBS Letters, ~lk, 1~5-180, (1993)]. L'activité des NO synthases est sensible à
raddition de N- ''yl-L-arginine~ T ~. t, l', ~ ;.". du calcium est associée à une stimulation de l'activité de la NO sy-nthase neuronale et;
Différents modèles cellulaires sont dév,sloppés Des clones stables exprimant les NO synthases sont ~ à partir des lignées cellulaires CHO. Des transitoires sont aussi effectuées sur d'autres modèles cellulaires tels que les cellules ' lisses vasculaires de rat et de lapin.
La, u~,hOll pXLRSV-humNOSn (~f ~ , ' 2) a ainsi été validée in vi~ro sur cvlture primaire de cellules ' ~ lisses de lapin. Brièvement, ainsi que le montre la figure 3, la présence de la NOS a éte contrôlée par à l'aide d'anticorps spécifiques de la NOS neuronale (anti-NOS
B220-1, Interchim). En paraUèle, ractivité NO synthase a été mesurée par la méthode de conversion d'argimne en citrulline (cf supra). Ainsi, l'activité NOS reflétée par la présence de citrulline tritiée est mise en évidence dans les cellules ' ~ ~ lisses de lapin; r '~ par le plasmide pXLRSV-humNOSn. Cette activité NOS n'est pas retrouvée dans les ceUules i ' ' p,ar le plasmide pXLRSV-humNOSn.
Cette activité NOS n'est pas retrouvée dans les cellules I r ~f par un plasmide témoin exprimant le gène de la b gol~ 1~ de E. Coli sous le contrôle du promoteur L'rR-RSV (cf. figure 4).
wo96/01902 21 9 3 2 6 3 ~ I/r~ 13 Par aiLIeurs, afin de vérifier la 1, " des vecteurs et compléter les données initiales de Garg et Hassid rJ. Clin. Invest., ~, 1774-1777, (1989)],1'effet de 1'., ~ de la NO synthase est également mesurée sur la ~JluLf~aL;vll des cerluleslisses vasculaires de lapin. Nous avons ~,., ' ~' démontré dans 5 notre modèle ceLlulaire de CMLV de lapin que les donneurs de NO tels que le SNP
ou rh~hv~ ' ~ réduisent la l)luLr~allùn de CMLV de lapin incubées en présence de ~ optimales de sérum de veau foetal. A forte, l'effet des donneurs de NO est également associée à une mort ceriulaire qui s'apparente à
rapoptose. Nous avons ainsi mis en évidence une r. c"~ I n.. ~ ' , de 10 I'ADN en oligomères de 180 paires de bases.
4: C ~ d'un a ' . ;. ~ . ~ ' ~ contenant une séquence codant pour une NO synthrâse Le plasmide décrit dans l'exemple 1 est linéarisé et .l,l,. f., l~ pour la ~ homologue avec le vecteur adénoviral déficient dans les cellules 15 helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et EllB) d'adénovirus.
Plus 1,. ~ l'hd~f.vvllus Ad-CMV-humNOS a été obtenu par ~ homologue in vivo entre l'hd~,..vvlll~5 mutant Ad-dll324 [1'1- ,, ,ya et al., Cerl ~L 543, (1982)] et le plasmide pXL-CMV humNOS, 20 selon le protocole suivant: le plasmide pXL-CMV humNOS linéarise et r~d~.lvvh~la Ad-dll324, linéarisé par renzyme Clal, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en pr~sence de phosphate de calcium, pour permettre la ' ~ hnn~nlnguP
L'adénovirus ' ~ Ad-RSV-NOSn contenant une séquence codant pour une NO synthase neuronale humaine a été construit de manière similaire, le plasmide 25 pXLRSV-humNOSn ayant éte linéarisé par l'enzyme Fsp I. Les adénovirus ' ~ ainsi générés ont été _'1--1~ ' par l ~ sur plaque. Après isolement, rADN de l'~l~ vvh~ ~ 1 - - a été amplifié dans la lignée cerlulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'ad~.~)vll~ défectif ' ~ non purifié ayant un titre d'environ 101~ pfulml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par . . ~r ~ '- sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52, 456, 1973). Les adénovirus Ad-CMV-humNOS et Ad-RSV-humNOSn peuvent etre conservés à ~30~C dans 20% de glycérol.
WO 96/01902 2 1 9 3 2 6 3 P~rJ~ c ~ n3 E ' 5: Validation in n/ro de 1'~ Ad-CMV.NOS
contenant une séquence contenant pour une NO synthase Les cellules ' ~ lisses vasculaires sont I ' ' ' 'infectées par l'ud~ vil~ [Lee et al., Circulation Research ;73. 797-807, (1993)]. La quantité de NO générée est alors mesurée ainsi que l'effet de la production de NO sur la ~Lu~ 4aLun ceLlulaire par les techniques décrites dans rexcmple 3. La l~lvlif;.aLv cerlulaire est determinée par mesure d'il~,v~l~uluLu~l de BrdU dans rADN (Ceri Fr '~' AssayRPN210,Amersnam).
protéine de fusion entre un fragment de toxine de plante ou bactériemne et un facteur de croissance, ont également été utilisées à ces fins rPickering et al, J. Clin. Invest., 2L 724-729 (1993); Biro et al, Circ. Res., :ZL 640 645, (1992); Casscerls et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89. 7159-7163, (1992)].
Toutefois, ces traitements ne donnent pas entière satisfaction en raison notamment de leur faible spécificité, Ieur efficacité moyenne et un délai d'action important.
La présente invention a l pour objet de proposer une nouveLe méthode, par thérapie genique, l "" efficace et sélective pour le traitement de la resténose post 6 ~. .
L'approche retenue dans le cadre de la présente invention, se distingue totalement de ce qui précède et consiste à interverlir au niveau de l'expression d'un des facteurs impliqués dans la uluL'u.aLù-l des CMLV. ~ " t, elle vise à
augmenter la teneur d'un facteur jouimt um rôle d'agent bloquant à l'égard de cette 15 t,lulir~ L~.L
Plus l ' t, la présente invention vise à accroitre la ~ en monoxyde d'azote, NO, au niveau de la paroi vasculaire, soumise à rh.~g:u~ ;., via 1'. . de la NO synthase, enzyme catalysant la synthèse de NO à partir d'arginine.
On peut admettre que les quantités de NO, produites à l'état ~ i,iolog.~lu~ par les ceLIules ~ ~' ' " ' , . ' aux ~ nécessaires à l'intégrité, i.e. au bon r - ' de la paroi vasculaire. La destruction mécanique de r. '.( ' "~ ' .~, à 1' ,, I ' ~ conduit donc à une baisse de la prcduction de NO.
L....... t, il est établi que la r~ n p~ q~ des taux de NO
est capable d'interférer avec la l ' ' des CMLV observée lors de la resténose [McNamara et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 193(1), 291-296, (1993)] ont notamment montré que 1' ' de L-arginine, précurseur de NO, réduit l'h~ . ' ~ mtimale dans un modèle de sténose p~ l ' chez le lapin.
L'expression de NO synthase, selon la présente invention, ' au niveau de la paroi: ' q..,' . permet ~ , de rétablir rapidement des suffisantes en NO, d'améliorer ainsi le l~,.no~l..~_ vasculaire via la v~~ DRF dépendante et de bénéficier en outre des effets associés i..~ti comme ume inhibition de la ~luLf~aLuil des CMLV et une réduction de I'agrégation l' . Par aiLeurs, NO est également impliqué dans les 2 1 q3263 WO 96101902 r~,l/r. ~.. 3 d' ~- V ' (Ziche et al., J t'lin T .~t. 94, 2036-2044 (1994). Cette activité - g O' , est reflétée in vitro par la capacité de donneurs de NO tels que le SNP (sodium l ' ) à s~muler la croissance et la migration des cellules '~ ' " ' (Ziche et al., J.Chin. Invest. 94, 2036-2044 (1994). NO pourrait donc 5 agir comme un facteur autocrine de la néuv ~ important dans les situations d'ischérnie notamment .l.yu~.,..Ly.~.
La présente invention ~ rapporte l , ~ à un adenovirus comportant au moins un gène codant, en totalité ou non, pour l'intégralité ou une 10 partie active d'une enzyme catalysant la synthèse de l'oxyde d'azote.
Les avar~ages de la pré~nte invention résident notamment dans la forte capacité des adénovirus de l'invention à infecter les cerlules ' ~_ lis~s vasculaires en IJluliffélaLi~l. Ceci permet d'utiliser des quantités ' ~. faibles de principe actif (&d~.~.~..~ ' '.~, et permet également une action efficace très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à très hauts niveaux les gènes introduits, ce qui leur confère une action i' , , tres efficace. En raison de leur caractère episomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance Lmitée dans les cellules I "~ ve:. et donc un effet transitoire l ' adapté à reffet i' ~ . recherché.
Le monoxyde d'azote est connu pour intervenir au niveau de l'activité
biologique de EDRF (: ' ' ' derived relaxing factor). EDRF joue un role important au niveau de la régulation notamrnent du flux sanguin en inhibant les des muscles mous et ragrégation I ' , ' e [Radomski et al., Lancet 2, 1057-1058 (1987)]. Il faut noter que NO est également présent dans le plasma sous la forme de g , S . ' ' liés à des protéines telles que ralbumine. Les S-nitroso-protéines ainsi générées, plus stables que NO, sont , ' ' , du moins t, de l'activité EDRF. Outre leurs propriétés v ' ' les S-nitroso-protéines sont également de puissants agents ~ ~ r' l '' ' [Simon et al. ~. .~ . ;. .~. l~ . . .- - and Tl ' , L~. 791-799 (1993)]. Dans le cas des maladies ~.diuv ' eO, une production altérée de EDRF est associée à la ~,' de l' ' '' u~ et de l'hy~.~ JII pulmonaire et s~ A Le monoxyde d'azote est également reconnu comme ' t, au niveau du système nerveux, à titre de r~... et comrne participant, au niveau du système ~ _, à ractivité ~ . . des lI~ Plus ~ t, le monoxyde d'azote a été décrit comme un agent capable d'agim" sur la ~uLît~al;ull des 2~ 93263 wo 96/0~902 r~ c . . ~13 CMLV puisqu'in vitro, diff6rents composés, donneuts de NO, inhibent la mitogénèse des CMLV en culture [Garg et al., J. Clin.lnvest., ~, 1774-1777, (1989)].
Les enzymes ~ '' de la production en monoxyde d'azote dans chacun de ces systèmes, désignées ci-après NO synthases sont, ~ , réparties 5 en trois catégories dites isoforme 1, isoforme 11 et isoforme m.
- La NO synthase dite isoforme I, est exprimée de manière continue et dépendante du calcium, au niveau des cellules du cerveau. Cette NO synthase neuronale est constitutive. Elle 2 récemment été clonée chez l'homme [Nakane M., Schmidt H.H, Pollock J.S., ForstmaM U., et Murad F; Lett. ~l~i (2) 175- 180 (1993)1.
L'isoforme Iï est exprimée dans les ll~l ,' ~ murins et induite par le TNF ou l'IL 1. La 1 ' ~ des NOS de type inductible est pri~rir:llPm.ont leur capacité àproduire de fortes - de NO en réponse à certaines cytokines. Dans le cadre de la présente invention, on peut l r '' ' envisager leur expression sous 15 contrôle d'un promoteur exogène, viral ou non, ne contenant pas d'élément de réponse aux cytokines. Le controle de la production en monoxyde d'azote est, dans ce cas, assuré par un promoteur présent dans l'~e..~,v,.us. Deux NO synthases humaines inductibles ont notamment été clonées [Geller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ~Q, 3491-3495 (1993) et Charles et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90. 11419-11423 (1993)].
- En ce qui concerne risoforme m, elle est exprimée dans les cellules ~ '~ ' " ' et est calcium- ~ s~ ~ Cette isoforme dite ~ v~ ou; '.( ~" ' .
est ' exprimée dans la paroi vasculaire et associée à ractivité EDRF. La NO synthase ~ '~ ' " ' humaine a été clonée Panssens et al. J Bio. Chem. 267.
14519-145~ (1992) et Marsden et al. FEBS Lett. 307. 287-293 (1992)]. De part sespropriétés d'EDRF, le monoxyde d'azote produit par cette NO synthase joue un rôle essentiel dans la relaxation des CMLV.
Selon la présente invention, tout gène codant pour l'intégralité ou seulement une partie active d'une NO synthase ou un de ses dérivés et ~I.,f;~ -. " codant pour l'une de ces trois isoformes de NO synthases peut être incorporé dans un adenovirus en vue de son expression in vivo. Par dérivé de NO synthase, on entend désigner tout pvl.~l;..e obtenu par ~.r '' et consenant une activité
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.
biologique. Par ....- I f;- -:; . on doit entendre toute mutation, ~ délétion, addition ou, ..I;r;, -l:.... de nature génétique et/ou chimique.
La NO synthase, ou son dérivé, produit dans le cadre de la présente invention peut être une NO synthase humaine ou une NO synthase animale. Il peut en particulier 5 s'agir d'une NO synthase bovine.
La séquence d'ADN codant pour la NO synthase ou un de ses dérivés, utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une ~ hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel 10 seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences ~,~ 1 ou De manière ~ v v , on utilise un ADNc ou un ADNg.
Selon un mode préféré de l'invention, il s'agit une séquence d'ADNc codant pour une NO synthase humaine.
Pour la ~~ ~ 'h ~ 1 ~ des adénovirus selon l'invention, différents sérotypes peuvent être utilises. Il existe en effet de nombreux sérotypes .I'~d;..vv.l~, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfèrecependant utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ~exemple:
Mavl, Beard et al., Virology ~ 81, (1990)], ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'~ vv~.s d'origine animale est un adénovirus canin, plus l un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Cornme indiqué ci-avant, les adéno~irus selon rinvention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. t' ' t, le génome des adénovir~s défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la ceLIule infectée. Ces régions peuvent être sOie eliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-~ " . soit subsdtuées par d'autres séquences et notamment par le gène suicide. r.. ~ t, r~d~.vvllus defectif wo 96/01902 2 1 9 3 2 6 3 . ~I/r~ s ~
conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires h .. des particules virales.
r ,r, .. ~ t, les adénovirus défectifs de l'invention ~ A ' les lTR, une séquence perrnettant 1'~ et le gène codant pour une enzyme NO
synthase. Encore plus ~ rf~ t, dans le génome des adénovirus de l'ulvention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, LI-L5 sont non ' Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par sup~ totale, "" délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les genes considérés. De terles "~ peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes Les adénovirus ' défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de rhomme du métier [Levrero et al., Gene, 101, 195, (1991), EP 185 573; Grabam, EMBO J. ~, 2917, (1984)]. En particulier, ils peuvent être préparés par ' homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène codant pour la NO synthase. La .
homologue se prcduit après co-i C_Liun desdits adénovirus et plasmide dans une lignée ceDlulaire appropriée. La lignée ceDlulaire utilisée doit de préférence (i) être r ~ par lesdits éléments, et (u), comporter les séquences capables de , ' ' Ia partie du génome de rh~:l~luv~u~ défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de l~. ' A titre d'exemple de lignée, on peut Ia lignée de rein ~ humain 293 [Graham et al., J. Gen. Virol.
~, 59, (1977)] qui contient t, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de, u. ~ de vecteurs dérivés des adénavirus ont également été décrites dans les demandes n~ Fl~ 93 05954 et FR 93 08596, Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés etpurifiés selon les techniques classiques de biologie I '' ' comme irlustré dans les exemples.
Av ~ t, dans les adénovirus de l'invention, le gene codant pour une enzyme NO synthase est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les ceLlules infectées. ll peut s'agir du propre promoteur du gène, d'un promoteur h. l; . . .1O~ ou d'un promoteur b,~ ' ' , N( t, il peut s'agir de promoteurs issus de genes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de WO96~0l90~ 2 1 ~3263 I_llrl ~ ,i3 séquences ~JIUI~UtLiC~.s issues du génome de la ceLule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences IJlUnlVt i~ issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les plUlllVt~ ElA, MLP,CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'~ oll peuvent être modifiées 5 par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant Ime expression tissu-spécifique. Il peut en effet être I ' ' intéressant d'utiliser des signaux d~J~JII actifs s~' ~, ou ~ t dans les cellules . - ..1~ .
Iisses vasculaires de préférence en division, de manière à ce que le gène ' ' r '' 1 ne soit exprimé et ne produise son effet que lorsque le virus a ~r~ . infecté
10 une cellule musculaire lisse vasculaire.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on utili~ un adénovirus IC ~ ' ' défectif r , ~ un gène codant pour une NO synthase sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.
La pré~nte invention vi~ l'utilisation des adénovirus ~lon l'invention à des fins i' I , et plus I " ~ leur application pour le traitement de la resténose. Cette application peut notamment être étendue aux situations u .k.~ ; d'ischémie où les propriétés de NO comme relais: ~g ag peuvent être Llvul.lL~ exploitées. Leur utilisation est également I~IIV' v 20 pour le traitement de ~ liées au système nerveux central.
Un autre objet de la pré~nte invention concerne donc une, au moins un adénovirus 1. ' défectif selon l'invention associé le cas échéant à un excipient Wll.. ' ' Les doses d~d~l'vv--~ ' ' cléfectif utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode .1' ' utilisé, de la pathologie wncernée ou enwre de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus ' selon l'invention sont 30 formulés et administrés sous forme de doses wmprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 101~ pfu/mL Le terme pfu (nplaque forming unit") wrrespond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, puis mesure, g~ ' ' nprès 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de " du titre pfu d'une solution virale sont bien J ' ' dans la littérature.
WO96/01902 2 1 93263 P~,~/r~S.'~ ~13 Un autre objet de rinvention concerne toute cellule de ~' infectée par un ou plusieurs adénovirus ' défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus ' ' . t, rinvention concerne toute population de cerlules hurnaines infectée par ces adénovirus. n peut s'agir en particulier de cellules; ' ' ' ' cellules ' ~ Iisses, ceriules neuronales, cellules tumorales, etc.
Les cellules selon rinvention peuvent être issues de cultures prirnaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l~omme du métier, puis mises en culture dans des conditions pennettant leur ~uLr&~Li~ . S'agissant plus ' ' de '-l '' ceux-ci peuvent etre aisément obtenus à partir de 10 biopsies, par ex~nple selon la technique décrite par Ham [Methods CerBiol. 21a (1980) 255]. Ces oeDiules peuvent être utilisées dh~h.lu..; pour l'infection par les adénovirus, ou conservées, par exemple par ~.~ng~ n pour r~ ~ de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les oellules selon rinvention peuvent également être des cultures ' ~ obtenues par exemple à partir de 15 banques préétablies.
Les oellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus ' ~ . pour leur conférer la capacité de produire de la NO synthase. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l~ornme du métier. En particulier, selon le type de oellules utilisé et le nombre de copies de virus par oerlule désiré, 20 I'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité alJIJlv~ lorsque les oellules sont destinées à une ~' in vivo. Les doses d'~.l'..~,vl.us ' ~ utilisées pour rinfection des oerules peuvent être adaptées par l'homme du méder selon le but recherc}~é. Les conditions décrites ci-avant pour r 25 in vivo peuvent être appliquées à rinfeclion in vitro.
Un autre objet de rrnvention conoerne un implant ~des cerlules marnmifère infectées par un ou plusieurs adénovirus ' ~défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrioe; " ' I~ t, les implants selon Frnvention CUI~ ' 105 à 101~ oellules. Plus I ~ " t, ils en CC.~ ' 106 8 108.
Plus I '' t, dans les implants de l'invention, la matrice " ' ~ ~ comprend un composé gelifiant et ~.. " un support permettant l'ancrage des oellules.
WO96101902 2 1 9 26~ P~/r~
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des ceLules ~ dans une matrioe ayant la ~ ': ~ d'un gel, et pour favoriser rancrage des ceLules sur le support, le cas écl~éant. Différents agents d'adhésion oeLulaire peuvent donc etre 5 utilises comrne gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les ~Iy~. ~gl~, ~, la ~' les lectines, ragarose etc.
Comme indiqué ci-avant, les ~ ~ .c:l: . selon rinvention, a~ ' un support permettant rancrage des oeLules. Le terme ancrage désigne toute forme d' biologique et/ou chimique eVou physique er~aiinant 10 radhésion eVou la fixation des oellules sur le support. Par aiLeurs, les oeLules peuvent soit recouvlir le support utilisé, soit pénétrer à rintérieur de oe support, soit les deux.
On préfère utiliser dans le cadre de rinvention un support solide, non toxique eVou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de ~ul~; ~ ' ' ;l~leCPTFE) ou un support d'origine biologique comme par exernple un greffon veineux.Les irnplants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de r~ ~ - En particulier, l" ,' peut être effec~ee au niveau de la cavité
1 ' ' e, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le systeme nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon rinvention sont l ' ' 20 avantageux en oe sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produiti' li , dans rorganisme: CeLe-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicitéd'infection et par le nombre de oeDlules implantées. Ensuite, la libération peut etre contrôlée soit par le retrait de rimplant, oe qui arrête d'~ i le traitement, soit par l'ulilisation de rystèmes d'~oll régulable, permettant d'induire ou de réprimer 25 r~ , des gènes i' Par ailleurs, il a été noté que les propriétés ' ~ ~ 'og, de NO sont étroitement oontcolées par des réactions d'oxydation. En particulier, la ' ' de NO- par l'ion superoxyde aboutit à la formlation d'ion ~u~ ONOO- et par 30 conséquent à la perte de l'activité EDRF. Selon White et al.
[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2L 10441048, (1994)], oe processus d'oxydation est impLqué dans le du.. ' l~, de 1' ' u~l~u~;. Deux .. ~
, " ~ sont en fait mis en jeu: la réduction de l'activité guanylate cyclase des CMLV inhérente à l'ma~,Liv~liu.l de NO et 1'~ ~ de l'oxydation des 35 L~u~u~L.~,, résultant de l'apparition de pc.u~
2 i 93263 --wo s6Jol902 P_l/r- ~13 .
L'assosiation d'un traitement anti-oxydant à 1' ~ de l'activité NO
synthase peut par conséquent être souhaitable afin de conserver le bénéfice i- , . Iié à la production locale de NO. Dans cette perspective, I' conjointe de '' A ~ rd~' dismutase SOD [Wlute et al., Proc.Natl.Acad.SciUSA, 2L
1044-1048, (1994)] permet de garantir l'u.l~ vasculaire de la production d'ion ~ On peut I ~ envisager de procéder à une ' ~ ~
conjointe d'un adénovirus selon l'invention avec au moins un second adenovirus comportant un gène codant pour une superoxyde disrnutase ou encore de met~e en oeuvre un adénovirus selon rinvention comportant outre le gène codant pour une NO
s,vnthase, un gène codant pour une superox,vde disrnutase.
L'adénovitus et la ~ . l' , , selon la présente invention, constituent dea mo~vens l ' ' avantageux pour le traitement de la resténose p~t. ~ . .
La présente invention sera plus ~ .'' décrite à raide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
L~n~ r~-c Figure 1: R~ du vecteur pXLCMV-hum NOS
Figure 2: Re~L~.,Ia~ic,n du vecteur pXLRSV-humNOS
Figure 3: T ''' ' de la NOS neuronale humaine sur CMLV; r .
20 par le vecteur pXLRSV-humNOSn.
Figure 4: Validation du vecteur pXLRSV-humNOSn sur CMLV (mise en évidence de ractivite NOS par mesure de la converaion d'arginine en citmlline).
WO96/01902 2 1 9 32 6 3 ~ rJ u~ [9l3 .
r~ ' b- ' ~
Les méthodes l utiTisées en biologie ~ telles que les extractions ~ ~ d'ADN 1~ qu la ~ , d'ADN ~ en gradient de chlorure de césium, r;'~ 1 ' ' sur gels d'agarose ou d'~,lyLull; ;k, la 5 r '~ de fragments d'ADN par ~'~ " les extractions de protéines au phénol ~ au phénol- -' U~ull.~-t la IJl~;~;.4Li~)ll d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de r l l -1, la j r ' dans F~ ' ~ ~ coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont -~~~- décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 10 Laboratory-~ Cold Spring Harbor, N.Y., (1982); Ausubel F.M. et al. (eds), ~Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, (1987)].
Les plasrnides de ty~e pBR322, pl~C et les phages de la série M13 sont d'origine ~ (Bethesda Research T ~
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent etre séparés selon leur taille 15 par él~i~u~Lu~ en gels d'agarose ou d'..ul~l~.u.l~,, extraits au phénol ou par un mélange l- 1,'. - uçull~e~ précipités à l'éthanol puis incubés en présence de rADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les .~ - du '.~
Le ".:rpl; .~,.. des extrémités 5' 1"~ peut être effectué par le fragment de Rlenow de l'ADN Pol~ ' I d'E. coli (Biolabs) selon les 20 .~lf~ r;.~ du ' La destruction des extrémités 3' pl~ ' ~ est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (13iolabs) utilisée selon les ~ du fabricant. La destruction des extrémités 5' 1 ' ~ est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase Sl.
La _' ' dirigée in vitro par ol;~5~16ui~ , ' ~, peut 25 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et aT. [Nucleic Acids Res. 1 8749-8764, (1985)] en utiTisant le kit distribué par Amersham.
L~s ~ ;r;~ e -L.r . de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [~ûl~ catalyzed Chain ~eaction, Saiki R.K. et aT., Science ~Q, 1350-1354 (1985); Mullis R.B. et FaToona F.A., Meth. Enzym. 1~, 335-350, (1987)] peut30 être effectuée en utilisant un "DNA therrnal c~cler" (Perkin Elmer Cetus) selon les y~. r;. ~ du fabricant.
La vérification des séquences " ", peut être effectuee par la méthode développi~e par Sanger et al. [Proc. Natd. Acad Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
WOg6/01902 21 932G3 ~l/r~S 1513 .
F ' 1: C ' . '' du vecteur PXLCMV-humNOS porlant le gène codant pour la NO synthase sous le controle du L" . précoce du ' . ;. ~ (figure 1) Cet exemple décrit la ~ uuliu~l d'un vecteur contenant l'ADNc codant 5 pour la NO svnthase ~ 1r humaine, sous le contrôle d'un promoteur constitué
par le promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), ainsi qu'une régiûn de l'hd~,..uvhusAd5 nécessaire à la L~
Le fragment EcoRI de l'ADNc de la NO svnthase; k ' ' ' humaine, décrit par Jarssens et al. [J. Biol. Chem. 2Ç:Z, 14519-14522, (1992)] a été recloné
10 dans r''' , II SK + (STRATAGENE), dans l'~ ~ mettant les bases 5' de l'ADNc du côté du site Not I de pT~ , Un site Sal I est créé par ~ ' de deux, ' ~ ' ' appariés au niveau du site Not 1.
Le fragment Cla I-Sal I du plasmide résultant contient l'ADNc de la NO
synthase i k ' ' '~ humaine. Ce fragment a été inséré, entre les sites Cla I et Sal I, dans le plasmide PXL2375 (PCT/FR94/00422) qui comprend les séquences du promoteur précoce du ~ uus (CMV) et les régions Ad5 permettant la ~ . . r , Le plasmide obtenu a été désigné PXLCMV-humNOS.
E '- 2: ~' ~ du vecteur pXLRSV-humNOSn portant la NO
20 synthare neuronale humaine (type 1) sous le controle du ~,.. LTR-RSV
(figure 2):
Cet exemple décrit la Wll~ll UUliUII d'un vecteur contenant l'ADNc codant pour la NO
synthase neuronale humaine, sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du 25 vr;us de sarcome de Rous (LTR-RSV), ainsi qu'une région de l'hu.,nu~llus Ad5 nécessarre à la l~ ' ~ h~-rnr~ g~.o Le fragment EcoRI de rADNc de la NO synthase neuronale humaine, cloné dans le vec~Nr pcDNAI (Nakane et al, FELS 316: 175-180, 1993), a été recloné dans le 30 vecteur plC-20H dans l'~ ~ mettant l'extrémité 5' de l'ADNc de la NOS
neuronale du côté du site Cla I (Marsh et al., Gene 32: 431~35, 1984). Le fragment Cla I-Sal I du plasmide résultant a été inséré entre les sites Cla I et Sal I du plasmide pXL-RSV-LPL (Ei~ 94 06758) qui comprend les séquences du ptomoteur LTR-RSV
et les régions Ad5 permettart la l~ ' ~ homol(~ P Le plasmide obtenu a été
35 designé pXLRSV-humNOSn.
wo s6/o~so~ 2 1 9 3 2 6 3 r~l/r-- . ,13 F. ' 3: Controle de l'activité des vecteurs porhnt le gène codant pour une NO synthase sur rlodèles de culture ceUulaire in vi~ro L'activité des vecteurs contenant l'ADNc de NO synthase est controlée sur des modèles i~l vi~o. Les ceLlules sont j r 'C par les vecteurs contenant les différentes isoformes de NO synthase (cf. exemple 1,2). La .' de l'activité
NO synthase des cerlules b permet de comparer l'activité des NO synthases ainsi que l'efficacité des ~,~, utilises (ex.: ~SV-LTR, CMV1 La quantits de N02-/N03-, pr~duits d'oxydation de NO, est determinée dans le surnageant de culture par la méthode de Ciriess ou si nécessaire par des méthodes plus sensibles [Misko et al., Analytical F ' y 214, 11-16, (1993)]. Par ailleurs, ractivité NO svnthase " ' c~ peut etre quantifiée de manière directe, par mesure de la conversion d'argimne en citrulline [Nakane et al., FEBS Letters, ~lk, 1~5-180, (1993)]. L'activité des NO synthases est sensible à
raddition de N- ''yl-L-arginine~ T ~. t, l', ~ ;.". du calcium est associée à une stimulation de l'activité de la NO sy-nthase neuronale et;
Différents modèles cellulaires sont dév,sloppés Des clones stables exprimant les NO synthases sont ~ à partir des lignées cellulaires CHO. Des transitoires sont aussi effectuées sur d'autres modèles cellulaires tels que les cellules ' lisses vasculaires de rat et de lapin.
La, u~,hOll pXLRSV-humNOSn (~f ~ , ' 2) a ainsi été validée in vi~ro sur cvlture primaire de cellules ' ~ lisses de lapin. Brièvement, ainsi que le montre la figure 3, la présence de la NOS a éte contrôlée par à l'aide d'anticorps spécifiques de la NOS neuronale (anti-NOS
B220-1, Interchim). En paraUèle, ractivité NO synthase a été mesurée par la méthode de conversion d'argimne en citrulline (cf supra). Ainsi, l'activité NOS reflétée par la présence de citrulline tritiée est mise en évidence dans les cellules ' ~ ~ lisses de lapin; r '~ par le plasmide pXLRSV-humNOSn. Cette activité NOS n'est pas retrouvée dans les ceUules i ' ' p,ar le plasmide pXLRSV-humNOSn.
Cette activité NOS n'est pas retrouvée dans les cellules I r ~f par un plasmide témoin exprimant le gène de la b gol~ 1~ de E. Coli sous le contrôle du promoteur L'rR-RSV (cf. figure 4).
wo96/01902 21 9 3 2 6 3 ~ I/r~ 13 Par aiLIeurs, afin de vérifier la 1, " des vecteurs et compléter les données initiales de Garg et Hassid rJ. Clin. Invest., ~, 1774-1777, (1989)],1'effet de 1'., ~ de la NO synthase est également mesurée sur la ~JluLf~aL;vll des cerluleslisses vasculaires de lapin. Nous avons ~,., ' ~' démontré dans 5 notre modèle ceLlulaire de CMLV de lapin que les donneurs de NO tels que le SNP
ou rh~hv~ ' ~ réduisent la l)luLr~allùn de CMLV de lapin incubées en présence de ~ optimales de sérum de veau foetal. A forte, l'effet des donneurs de NO est également associée à une mort ceriulaire qui s'apparente à
rapoptose. Nous avons ainsi mis en évidence une r. c"~ I n.. ~ ' , de 10 I'ADN en oligomères de 180 paires de bases.
4: C ~ d'un a ' . ;. ~ . ~ ' ~ contenant une séquence codant pour une NO synthrâse Le plasmide décrit dans l'exemple 1 est linéarisé et .l,l,. f., l~ pour la ~ homologue avec le vecteur adénoviral déficient dans les cellules 15 helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et EllB) d'adénovirus.
Plus 1,. ~ l'hd~f.vvllus Ad-CMV-humNOS a été obtenu par ~ homologue in vivo entre l'hd~,..vvlll~5 mutant Ad-dll324 [1'1- ,, ,ya et al., Cerl ~L 543, (1982)] et le plasmide pXL-CMV humNOS, 20 selon le protocole suivant: le plasmide pXL-CMV humNOS linéarise et r~d~.lvvh~la Ad-dll324, linéarisé par renzyme Clal, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en pr~sence de phosphate de calcium, pour permettre la ' ~ hnn~nlnguP
L'adénovirus ' ~ Ad-RSV-NOSn contenant une séquence codant pour une NO synthase neuronale humaine a été construit de manière similaire, le plasmide 25 pXLRSV-humNOSn ayant éte linéarisé par l'enzyme Fsp I. Les adénovirus ' ~ ainsi générés ont été _'1--1~ ' par l ~ sur plaque. Après isolement, rADN de l'~l~ vvh~ ~ 1 - - a été amplifié dans la lignée cerlulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'ad~.~)vll~ défectif ' ~ non purifié ayant un titre d'environ 101~ pfulml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par . . ~r ~ '- sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52, 456, 1973). Les adénovirus Ad-CMV-humNOS et Ad-RSV-humNOSn peuvent etre conservés à ~30~C dans 20% de glycérol.
WO 96/01902 2 1 9 3 2 6 3 P~rJ~ c ~ n3 E ' 5: Validation in n/ro de 1'~ Ad-CMV.NOS
contenant une séquence contenant pour une NO synthase Les cellules ' ~ lisses vasculaires sont I ' ' ' 'infectées par l'ud~ vil~ [Lee et al., Circulation Research ;73. 797-807, (1993)]. La quantité de NO générée est alors mesurée ainsi que l'effet de la production de NO sur la ~Lu~ 4aLun ceLlulaire par les techniques décrites dans rexcmple 3. La l~lvlif;.aLv cerlulaire est determinée par mesure d'il~,v~l~uluLu~l de BrdU dans rADN (Ceri Fr '~' AssayRPN210,Amersnam).
Claims (24)
1. Adénovirus recombinant défectif comportant au moins un gène codant, en tout ou partie, pour l'intégralité ou une partie active d'une NO synthase ou l'un de ses dérivés.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la NO synthase est une NO synthase endothéliale.
3. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la NO synthase est une NO synthase neuronale.
4. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la NO synthase est une NO synthase inductible.
5. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène est une séquence d'ADNc.
6. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène est une séquence d'ADNg.
7. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour une NO synthase bovine.
8. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour une NO synthase humaine.
9. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le gène est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées.
10. Adénovirus selon la revendication 9 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs viraux, de préférence le promoteur LTR-RSV et CMV.
11. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'adénovirus comprend outre le gène, les ITR et une séquence permettant l'encapsidation.
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce que l'adénovirus comprend outre le gène, les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et danslequel le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel.
13. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine humaine, choisi de préférence parmi les sérotypes Ad2 et Ad5.
14. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine animale, choisi de préférence parmi lesadénovirus canins.
15. Utilisation d'un adenovirus selon l'une des revendications précédentes pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose.
16. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un adénovirus tel que défini dans les revendications de 1 à
14 associé à un excipient convenable.
14 associé à un excipient convenable.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10 4 et 10 14 pfu/ml, et de préférence 10 6 à 10 10 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
18. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 14.
19. Cellule selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine.
20. Cellule selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine de type endothéliale, neuronale, de muscles lisses ou tumorale.
21. Implant comprenant des cellules infectées selon les revendications 18 à 20 et une matrice extracellulaire.
22. Implant selon la revendication 21 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant choisi de préférence parmi le collagène, la gélatine, les glucosaminoglycans, la fibronectine, l'agarose et les lectines.
23. Implant selon les revendication 21 ou 22 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend également un support permettant l'ancrage des cellules infectées.
24. Implant selon la revendication 23 caractérisé en ce que le support est constitué préférentiellement par des fibres de polytétrafluoroéthylène.
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