CA2078138A1 - Artificial stimulation process of cells and ovocytes culture device - Google Patents

Abstract

The present invention concerns a process for artificially stimulating a group of cells reproducing the effect of the biochemical regulation mechanism, controlled in natural physiological conditions by an internal oscillator, comprising the steps below: a) the cells are placed in in vitro culture for a given time; b) the ells are placed in the pulsing medium after the culture medium has been removed; c) the cells are subjected to pulses generated by an electric field; d) the cells are once more placed in the culture medium; e) the previous stages are repeated a certain number of times; f) cells in a uniform active state are obtained. It also concerns a device for the culture of ovocytes facilitating the operation of the process.

Description

~091/139'77 PCT/FR91/00200 PROCEDE DE STlMULATlON ARTIFlClELLE DE CELLULES ET
~5rrrF DE CUL~URE D'O~OCYTE~
__ __.__ La présente invention concerne un procédé de stimulation - artificielle des cellules en particulier d'ovocytes, ladite stimulation étant modulab~e dans le temps, et un dispositif de culture de cellules perme~tan~
la m Ise en oeuvre du procédé.
La présente invention se rapporte à la stimulation de cellules, en particulier d'ovocytes ou d'oeufs fécondés, par un mécanisme bio-chirnique régulé dans les conditions physiolo~iques par un oscillateur i nterne.
11 s'agit notamment d'une procédure de clonage des embrvons d'animaux et, en particulier d'obtention d'ovocytes receveurs cornpétents pour la greffe d'un noyau cellulaire dans un état homogène.
Le clonage d'embryons d'animaux domestiques est la voie perme~tant de remédier à la variabilité génétique induite par la fécondation et de standardiser les améliorations généIiques d'une race.
Lors de la fécondation, I'entrée du spermatozolde va avoir deux grandes fonctions:
- apport du génome haplolde mâle, - activation du développement qui restructure le noyau mâle par le cytoplasme de l'ovocyte et favorise les intéractions noyau-cytoplasme.
11 s'écoule en moyenne 12 à 20 heures entre la fécondation et la première division cellulaire, pendant lesquelles un ensemble de phénomènes ont lieu, les deux ~énomes paternel e~ maternel ayant des rôles complementaires pour un développement ultérieur de l'embryon (Surani et al. 1984, Nature 308, 54~-550), rnais on n'en connait pas le mécanisme exact.
e clonage d'un embryon est une mé~hode qui vise ~ obtenir le plus d'animaux vivants à la suite du transfert des noyaux cellulaires de cet embryon ~qui contient plusieurs cellules~ dans des ovocytes enuclées et activés. Les deux fonc~ions de la fécondation son~ dissociées. Afin d'obtenir un développement ulterieur de l'oeuf, il faut procéder à une activation de I'ovocyte receveur avant la greffe nucléaire. L'activation peut aussi s'appliquer aux premières heures du développement de l'oeuf fécondé.
On sait que les oeufs de mammifères peuvent être ac~ivés artificiellement par difforents stimulis physiques ou chimiques, qu'il s'a~isse .,;
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~ 5rrrF CUL ~ URE D'O ~ OCYTE ~
__ __.__ The present invention relates to a stimulation method - artificial cells, in particular oocytes, said stimulation being modulab ~ e over time, and a cell culture device allows ~ tan ~
the implementation of the method.
The present invention relates to cell stimulation, in particular of oocytes or fertilized eggs, by a bio-chirnic regulated in physiological conditions by an oscillator internal.
This is in particular a procedure for cloning the embrons animals and, in particular, obtaining suitable recipient oocytes for transplanting a cell nucleus in a homogeneous state.
Cloning pet embryos is the way allows so much to remedy the genetic variability induced by fertilization and standardize the genetic improvements of a breed.
During fertilization, the entry of the sperm will have two main functions:
- contribution of the male haploid genome, - activation of the development which restructures the male nucleus by the oocyte cytoplasm and promotes nucleus-cytoplasm interactions.
There is an average of 12 to 20 hours between fertilization and first cell division, during which a set of phenomena take place, the two ~ paternal and maternal enomes having complementary roles for further development of the embryo (Surani et al. 1984, Nature 308, 54 ~ -550), but we do not know the exact mechanism.
he cloning of an embryo is a method which aims to obtain the more live animals as a result of the transfer of cell nuclei from this embryo ~ which contains several cells ~ in enucleated oocytes and activated. The two functions of fertilization are dissociated. In order to get subsequent development of the egg, activation of The recipient oocyte before the nuclear transplant. Activation can also apply to the first hours of development of the fertilized egg.
We know that mammalian eggs can be ac ~ ivated artificially by different physical or chemical stimuli, whether it becomes .,;
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tlVO ~1/13977 PCI/FR91/00200 de chocs électriques, ~hermiques ou osmotiques, d'enzymes ou d'agen~s anesthésiques (Kaufman ~lH 1983 - Early mammalian development -parthenogene~ic studies - Cambridge University Press). Cependant, I'activation est toujours identifiée à un stimulus unique, limité dans le 5 temps, supposé mimer la pénétration du spermatozolde dans I'oeuf. Aucun de ces traitements ne reproduit la série de chan~ements physiolog~ques se produisant dans l'oeuf après la pénétration du spermatozolde.
On ne connait que quelques cas d'activation parthénogenéti~ue de l'ovocyte de vache (Menezo et al. 1976 - Commission of the European 10 Coimmuni~ies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. Eur 5491); aucune méthode vraiment fiable et précise d'activation des ovocytes de bovins n'est disponible. L'activation expérimentale par Iréthanol présente de nombreux inconvénients: grande variabilité des résultats en fonction de l'âge des ovocytes (Cuthbertson, 1983 ; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).
En ce qui concerne le clonage d'embryons, les premiers résultats incontestés ont été obtenus par S. Willadsen en 1986 chez la brebis. Ils ont été suivis par ceux de Prather et al en 1987 chez la vache, et en 1989 chez la truie. Chez la lapine, les premiers individus issus de 20 clonage ont été obtenus par Stice et Robl en 1988. Les ~aux de succès de ces expériences rapportés dans les publications ne dépassent généralemen~
pas 4 %. Toutefois, des sociétés américaines (Granada Genetics, Houston, Texas) ou Canadienne (Alta Genetics, Callgary, Alberta), semblent rnaîtriser la procéJure de clonage chez les bovins. Il est dit qu'une centaine 25 de veaux aurait déjà été obtenue sur le continent nord-américain. Cette prise en main industrielle reflète l'intérêt que susci~e le clonage d'embryon chez les bovins. kAais les techniques ont-elles vraiment progressé ?
Les procédures décrites dans les publications se ressemblent.
Les ovocytes utilisés ont subi une période de vieillissement de 6 à 10 30 heures. Ce veillissement es~ rendu nécessaire pour favoriser l'activation (aucune technique classique d'activation ne permet d'activer des ovocytes fraîchement ovulés même chez les bovins (Ware et al. 1989). Les chromosomes or~anisés sur 13 métaph.se 11 sont prélevés en "aveugle" dans ' ' , .~

-~ 2~ 138 ~0 91/13977 PCl`/FR91/00200 la region du premier globule polaire, mais des techniques de visualisation des chromosomes par fluorescence sont mises en oeuvre. Une cellule embryonnaire provenant d'une morula est introduite sous la zone pellucide et la fusion est obtenue par des impulsions de champs électriques.
L'activation de l'ovocyte est généralement provoquée par la procédure de fusion cellulaire; dans certains cas, elle n'est pas décrite. Deux chercheurs ont pu obtenir un agneau à la suite du transfert dans un ovocyte d'un noyau provenant d'une cellule du bouton embryonnaire (Smith a~ Wilmut, L989).
Toutefois, le niveau des resultats et la complexité des mécanismes en jeu tels que le stade de différenciation du noyau, la phase du cycle cellulaire, l'état de l'ovocyte receveur~ son âge! la procédure dIactivation ne permettent pas de comprendre pou~quoi certains embryons se développent et d'autres non. De nombreuses théories pour expliquer les échecs comme celle fondée sur l'ac~ivité de transcription du noyau l 5 transplanté ont été contredites par quelques résultats expérimentaux.
Des données nouvelles sont apparues sur les mécanismes physiologiques déclenchés par la fécondation et notamment en ce qui concerne les rythmes des variations de niveau du calcium libre et des seconds messagers comme l'lnositol (1,6,5)-tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. l981; Cuthbertson ~ Cobbold, 1985; Miyazaki et al.
1986; Miyazaki, 1988). L'activité périodique de ces seconds messagers pourrait régul~er les synthèses des acides nucléiques (ADN et ARNs) et des protéines (Basset et al. 1968; Rodan et al. 1978).
Le processus est déclenché par le spermatozolde dans les secondes qui suivent la fécondation~ La chaîne de réactions qui aboutit à la production d'lnsP3 semble dépendre d'un influx d'ions calcium. L'lnsP3 se lie à un récepteur spécifique qui contrôle l'activité d'un canal calcique situe sur la membrane intracellulaire d'un réservoir intracellulaire de calcium.
Le calcium ainsi libéré active des protéines spécifiques, qui elles-mêmes activent des processus spécifiques, par exemple la complexation calcium-` calmoduline, I'activation de kinase etc. Le calcium est considéré comme I'activateur principal du métabolisme. Ce cycle de réactions se reprodui~ à
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20rl~ 3~
r~O 91tl3977 PCI`/FR91/00200 une fréquence de l'ordre de la minute durant plusleurs heures ~1cCulloh et al. 1983; Igusa ~c Miyazaki, 1983-1986 ~ liyazaki et al. 1986; .~/liyazaki;
1 9~S).
Cette activité rythmique, due a un système de si~nau~
5 intracellulaires émis à une fréquence propre, semble dépendre de la presence de pronuclei male et femelle car elle n'a pu etre observée sur des oeufs parthénogénétiques activés par des méthodes classiques ~Cuthberston et al. 1981; Cuthbertson d( cobbold, 1985; Miyazaki, 1988). `
L'injection dans des ovocytes d'une protéine G ~guanosine 10 -5'-0-(3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induit plusieurs cycles de liberation decalcium, mais ne permet pas de maintenir cette activité au-delà du quatrième (Swann, Igusa ~c Miyazaki, 1989).
Les contributions génétiques respectives de l'ovocyte et du spermatozolde sont très documentées chez la souris. Ces études montrent 15 que le développement normal à terme d'un embryon dépend de la présence permanente durant tout le prernier cycle cellulaire des deux pronuclei parentaux (PN) ~Surani ~ Barton 1983; Mc(;rath ~ Solter, 1984; Surani et al. 1986; Mann ~ Lovell - Badge, 1986, 1988).
La production de jeunes par clona~e ne peut être réalisée dans 20 la pratique que si l'on dispose de procedés fiables et reproductibles. La qualité de l'activation de I'oeuf joue dans le développement un rôle important jusque là ignoré.
La maîtrise de l'activation comprise comme phénomène rythmique s'etendant sur tout le premier cycle cellulaire es~ essentielle, 25 non seulement pour produire en routine des ovocytes activés et synchrones mais aussi pour faire bénéficier des oeufs "clonés" de ce type d'activation imposee pour se développer normalement.
La présente invention concerne donc un procédé de stimula-tion artifieiel, notamment à long terme, d'un ensemble de cellules 30 reproduisant l'effet d'un mecanisme de régulation biochimique, contrôlé
dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suiv~ntes:

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~0 91/13977 PCT/FR91/00200 a) les cellules sont placées en culture in vitro, pendant un temps détermine, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, 5 c) on soumet les cellules a une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, `
e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, et f) on ob~ient les cellules dans un état activé homogène.
L'élimination du milieu de culture sera de préférence 10 complétée par un lavage des cellules par le milieu d'impulsion.
Ce procédé de stimulation bien qu'il puisse être utilisé dans un grand nombre de procédés, a été mis au point dans le cadre de l'activation des ovocytes en vue du clonage d'embryons. Des études récentes ont en effet montré que dans les oeufs de mammifères, la fécondation est 15 accompagnée d'une augmentation transitoire de la concentralion intracel-lulaire de calcium libre ([Ca2 ]i]' suivie d'une série d'oscillations de cette concentration, qui dure au moins 4 heures.
On ignore encore par quel moyen le spermatozoïde déclenche ces variations de [Ca2 ]i~ ainsi que les fonc~ions biologiques exactes de ces 20 oscillations de Ca2 de longue durée. Cependant, elles semblent caracté-ristiques des oeufs fécondés et niont jamais été observées quand les ovocytes sont artiiiciellement activés (Miyazaki 1988 - J. Cell. Biol. 106, ; 345-353).
Le procédé développé dans la présente invention va donc 25 permettre de stimuler périodiquement les ovocytes par des influx de calcium au niveau de la membrane plasmique.
En effet, en introduisant dans le milieu d'impulsion des ions Ca2t, ceux-ci vont pouvoir péné~rer dans la cellule par l'électroporation, c'est-à-dire la création de "pores" générées par l'impulsion électrique.
Au-delà des phénomènes immédiats provoqués dans l'ovocyte comme l'expulsion du globule polaire, les effets de cette stimulation se ; ~manifesteront sur les stades ultérieurs du développement de i'embryon, alors meme que le ~raitement a cessé. C'est ainsi que les phénomènes de compaction et de cavitation poùrront être affectés.

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~-'0 91/13977 PCl/FR91/00200 Ce procédé peut s'appliquer au~ ovocytes fraich~ment ovulés, obtenus par stimulation hormonale de la femelle. L'activation des oYocy~es dans les condi~ions définies de fréquence, d'intensi~é et de durée provoque l'expulsion du deuxième globule polaire. On peut alors prélever les 5 chromosomes qui se ~rouvent en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. On dispose d'ovocytes dans le même état physiologique possédant un pronucleus.
On introduit alors un blastomère sous la zone pellucide et on procède à la fusion cellulaire par action d'un champ électrique.
Le procédé peut alors s'appliquer aux embryons clones ainsi obtenus, af in d'améliorer leur développement, c'est-à-dire de régulariser les divisions cellulaires et d'obtenir la compaction.
La stimulation par ce procédé peut s'appliquer à des ovocytes fraichement ovulés placés en présence d'un inhibiteur. de l'expulsion du 15 deuxième ~lobule polaire, comme la cytochalasine a, qui maintient un état diploîde. On obtient ainsi une population d'embryons parthenogénétiques, qui pourront être implantés dans des femelles receveuses et présenteront un développement synchrone du foetus et des annexes embryonnaires.
Ces expériences d'abord menées sur des ovocytes de lapine ont 20 été confirmées sur des ovocytes de souris, réputés réfractaires à l'activation juste après l'ovulation. Les performances du procédé sont donc reproduc-tibles d'une espèce à l'autre. La méthode d'activation pourra certainement s'appliquer à des ovocytes fraichemen~ ovulés de bovin ou d'ovin.
Si l'on soustrait les ovocytes en cours de traitement, ils 25 régressent et on obtient certains artefacts, comme des ovocytes en métaphase 111 reproductibles à volonté, et qui offrent de nouvelles possibilités d'études, notamment sur la dynamique du cytosquelette et I'activation du génome.
Le procédé a é~é conçu sur la base des effets des~champs 30 électriques sur les membranes plasmiques.
Il a été montré (Zimrnermann, 1982) que des impulsions de champs électriques de l'ordre de 1 à 3 kVcm-l et d'une durée de quelques ys peuvent créer des micropores dans la ~membrane plasmique et é~ablir une . , ... . . .

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2~7~1~g ~1VO 91/13977 PCl/FR91/00200 communication directe entre les milieux inlra et extra cellulaire. Il a été
ainsi possible par exemple de faire pénétrer du calcium dans des ovocytes d'oursin en les exposant à des impulsions de champs électriques en presence d'ions calcium (Rossignol et al 1983). L'amplitude de ces influx peut être S modulée par la durée de l'impulsion de ch~mp électriqu~.
I.e procédé implique la conlugaison d'une méthode de culture in vitro d'un lot d'ovocytes (ou ernbryons) par perfusion entre deux électrodes et d'une méthode de lavage avec une solution non conductrice, contenant du calcium 0 à 30 ~M, dans laquelle sont délivrées les impulsions.
10La présence d'une solution très faiblemenl conductrice, par exemple une ~-solution isotomique de glucose contenant les ions Ca, au moment d'une impulsion permet de faire apparaître un champ électrique en~re les électrodes. Une présence excessive d'ions diminue l'effet "champ élec-trique".
15De manière préférée, la concentration en ions Ca2~ est comprise entre 8 et 20 ~M. De bons résulta~s sont obtenus par exemple pour une concentration en ions Ca2~ valant 10 ~ ou bien 16 IIM.
L'alternance d'une période de culture et d'une période de lavage permet de soumettre fréquemment les ovocytes à des stimula~ions ~dans un milieu 20 ionique très bien déf ini.
Ce procédé peut s'étendre à la stimulation des cellules par tou~e une gamme de signaux simples ou complexes ioniques ou molécu-laires ~ des concentrations variables qui seront déterminés par la composition du milieu d'impulsion.
Ce procédé permet de moduler la fréquence du signal par la durée entre deux lavages, et son amplitude par la durée de l'impulsion électrique.
11 es~ impératif de rernplacer totalement le milieu de culture par Ia solution d'impulsion, car l'intensité du courant due à des excès d'ions 30 provenant du milieu de culture détruirait les ovocytes. Juste après I'impulsion, la solution d'impulsion est remplacée par le milieu de culture, les ovocytes ne pouvant pas survivre dans la solu~ion d'impulsion.
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n'O 91/13977 PC~/FP~91/00200 Ce procédé peut être piloté par l'intermédiaire d'un lo~iciel qui permettra de créer des traitement de stimulation selon des équationS
spécifiques. exporentielles, sinusoldales, suites de Fourier ou autres.
L'un des aspects de la présente invention est le trailement 5 simultané d'un ensemble d'ovocytes~ qui seront ainsi obtenus, activés dans le même état physiolo~ique. Les ~reffes de noyau pourront ainsi être réalisées sur des ovocytes physiologiquement identiques.
Lors du clonage, la séquence et les phases du cycle cellulaire durant lesquelles sont enchaînées les opérations ont des conséquences très 10 importantes sur le remodelage des noyaux et sur le développement ultér ieur.
Il est extrêmement intéressant de pouvoir s~andardiser les différentes phases du traitement des ovocytes~ afin d'obtenir une bonne reproductibilité du procédé.
La présente invention concerne donc un systeme dynamique, fonctionnant en continu et pouvant être automatisé, réalisé par un dispositif permettant la succession automatique des étapes de lavage, de stimulation et l'acquisition des paramètres de stimulation.
Ce disposi~if est caractérisé par le fait qu~il assure llimmobi-20 lisation des cellules pendant les différen~es phases du traitement.
Différents modes de réalisation de ce dispositif apparaissent . ~ .
sur les figures 1 et 3.
Il est constitué d'une enceinte comportant au moins unearrivée de fluide (10, Il) et une sortie de fluide (6) et, est caractérisé en 25 ce qu'à la partie inférieure de llenceinte se trouvent un ou plusieurs orifices (4) don~ la géométrie est telle qulelle sloppose au passage des cellules et en ce que le liquide entrant dans llenceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qulelle assure sensiblement le blocage des cellules sur le ou les orifices, 30 une partie du fluide étant évacuée par débordement.
Ce dispositif permet de retenir les cellules sans les abimer ni in~roduire une con~rain~e mécanique parasi~e. En ou~re, il perme~ à ~o~

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~0 91/13977 Pa~/FR91/00200 moment de replacer, prélever ou déplacer des cellules. Ce dispositif permet donc de placer successivement les cellules dans des milieux de composltion chimique de différentes natures, durant des périodes et selon une fréquence variables.

L'enceinte comporte sur ses parois internes deux élec~rodes, de préférence parallèles, et le ou les orifices sont alignés à égale distance des électrodes, baignant dans le milieu correspondant à la phase du trai ~ement en cours.

Grâce à ce dispositif, on peut à volonté cultiver les cellules ou bien dans le milieu d'impulsion faire pénétrer dans la cellule traitée7 un ion, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe.

Ce dispositif permet en particulier le traitement dans une même enceinte d'un ensemble d'ovocytes, en grand nombre, sans qu'il soit nécessaire de les placer dans des compartiments séparés.

En particulier, le dispositif comporte au moins deux arrivées de f luide, qui peuvent être superposées.

L'évacuation des fluides pourra egalement se faire latéra-lement.

A chaque milieu arrivant successivement dans la chambre, 20 correspond une tubulure d'injection distincte.

Au mornent de l'injection du milieu d'impulsion, un système d'aspiration adapté sur le dispositif d'arrivée du milieu de culture permet la succion d'une petite quantite du milieu d'impulsion qui pénètre dans la canalisation d'arrivée du milieu de culture; on évite ainsi que les ions du 25 milieu de culture pénètrent dans la chambre durant les lavages. La circulation des flux de milieu est représentée par des flèches sur la f i gure 3.

Ces milieux, aussi bien le milieu de culture que le milieu d'impulsion, sont en circulation continue, et c'est ce flux de liquide qui par 30 effet de succion assure le maintien des ovocytes entre les électrodes pendant les renouvellements du milieu.

Les compositions des m.lieux de culture sont connues et dépendent des cellules en culture. Le milieu d'impulsion est généralement -.

2~7~3~ ~
-'0 91~13977 PS:~/FR91/{)0200 cons~itue d'un milieu non ionique pour assurer un effet de champ. Il s'agira d'une solution isotonique par exemple de glucose.
La présence d'une grande quantité d'ions peut gravement nuire aux cellules lors de l'impulsion. Il est donc nécessaire de laver les cellules avec le milieu d'impulsion pour éliminer les ions contenus dans le milieu de cult lre.
Ce dispositif peut être conçu comme une chambre d'activation, dont la capacité peut être adaptée au nombre de cellules que l'on souhaite traiter simultanément.
Les caractéristiques du procédé mettant en oeuvre le dispositif, peuven~ varier largement et ne sont en général limitées que par ?
des conditions telles que les durées de lavage. Ainsi, la fréquence des irnpulsions est limitée par la durée de lavage rninimum par le milieu d'impulsion.
Les paramètres du procédé et du dispositif clest-à-dire les arrivées et les sorties de fluide, de même que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions électriques arrivant dans les électrodes sont gérées par un système électronique.
Les caractéristiques des impulsions électriques en elles-mêmes peuvent varier et dépendre des cellules et des buts recherchés.
En général, les champs électriques varient de 1 à 3 Kv. cm 1 et l'impulsion électrique aube durée de 10 lls à 2 000 ~s.
La fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de s~imulation.
L'organisation des tubulures qui débouchent dans la chambre permet d'injecter des milieux sans que les ovocytes soient décrochés par les bulles de gaz qui finissent par se former dans les canalisations. De plus, la structure de distribution des milieux permet de limiter considérablement la contamination ionique du milieu de stimula~ion par les ions du milieu de culture. ;`

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Les pompes d'injection des milieux peuven~ être commandées par un microordinateur qui déterminera les séquences de lavage répétables tout en maintenant les cellules entre les électrodes.
Ce dispositif pourra s'appliquer au traitement des cellules par toute substance que l'on souhaite faire pénétrer dans l'espace intracellu-laire. La composition du milieu d'impulsion determinera la pénétration de cette substance selon un gradient de concentration.
Lors d'une culture cellulaire, on pourra provoquer, à un moment déterminé, qui peut être unique, I'entrée dans l'ensemble des cellules de la substance souhaitée. Pour cela on remplacera le milieu de culture par le milieu d'impulsion et on déclenchera l'impulsion de champ - électrique, la durée de l'impulsion déterminant la quantité de substance qui pénètre. Ce milieu d'impulsion pourra alors etre évacué et les cellules remises en culture dans un milieu approprié. L'avantage de ce système est qu'il permet de traiter simultanément un ensemble de cellules qui sont ainsi synchronisées. Il fonctionne en continu e~ évite toute manipulation des cellules, assurznt ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande rapidité d'exécution. Ceci permet une standardisation des conditions et facilite le transfert de technologies.
On peut envisager de faire pénétrer dans les cellules un ion ou une molécule simple. Ce disposi~if peu~ aussi s'appliquer à la stimulation des cellules par une molécule plus complexe, ou à la pénétration de ; fragments d'ADN, ou d'épisome.
Ce dispositif sera utilisé pour réaliser une stimulation cyclique des cellules, plusieurs séquences de base étant réalisées ~i successivement, l'intensité, la durée et la fréquence des impulsions pilotées par l'intermédiaire d'un microordinateur.
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~0 91/13977 PCr/lFR91/002~0 Ce disposi~if perme~ la réalisation du procédé d'activation et de svnchronisation d'ovocytes, par des stimulations répétees par Ca2, en vue du clonage d'embryons d'animaux domestiques.
5Un mode de réalisation de la chambre est représenté en figure 1.
Les ovocytes I sont placés sur une fente rectiligne 4, réalisée par la juxtaposition de deux plaques de verre 3 et 5, dont l'ecartement est inférieur au diamètre des ovocytes. Les milieux, milieu de culture et milieu 10d'impulsion, arrivent dans la parti~ supérieure de la chambre chacun par une tubulure distincte, respectivement 10 et 11, évitant une con~amination réci proque.
Le milieu 9 correspondant a la phase de traitement en cours arrive en c~ntinu et est évacué par une tubulure 6 située à un niveau plus 15bas que celui des ovocytes. Ce courant de liquide maintient par succion les ovocytes plaqués sur le fond de la chambre.
Sur les parois internes de la chambre se trouvent deux électrodes de platine 2 et 7, parallèles, de 1 cm de long.
L'enceinte 8 est thermostatée à 38C.
20Chaque milieu arrive dans la chambre après passage par un système retenant les bulles de gaz de taille importante.
Ce système est constitué d'un ballon de verre dans lequel le liquide arrive. De ce ballon part une tige d'or per~orée de trous de petit diamètre; après passage à travers cette tige, les bulles de gaz de taille 25importante sont retenues et le liquide arrive dans la chambre par une tubulure courte.
Des lapines ont été superovulées par injection de FSH et de LH, et les ovocytes prélevés dans les oviductes. Après traitement 5 mn par la hyaluronidase, les ovocytes sont placés dans la chambre d'activation, 30dans le milieu B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282, 1967-1970) à 38C, dans une atmosphère à 5 % de CO~
Les ovocytes peuvent immédiatement être soumis au traitement d'activation, au~une période de ~ viellissement n'es~ nécessaire.

1 . ~ ~ ' 2 ~ 7 ~
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~O 91~13977 PCr/FlR91/03)2û0 lls sont soumis pendant 90 minutes à une série d'impulsions de champ électrique. à un rythme d'une i~npulsion toutes les 4 minutes, soit 22 impulslons de durée decroissante dissipant une éner~ie totale 1250 ujoules, d~une duree totale de 14 868 ~Is, le champ électrique a une valeur de 1,8 Kv. cm~ 1.
Avant chaque impulsion, le milieu de culture est remplacé par un milieu d'impulsion constitué d'une solution isotonique de glucose contenant CaC12 1 0~M.
A la fin du traitement d'activation, tous les ovocytes ont deux globules polaires bien formés. On obtient donc au même moment, à
quelques minutes près, une population homogène d'ovocytes activés dans le meme état physiologique. Cela présen~e deux atouts: le premier est de pouvoir ~oujours réaliser les greffes de noyau dans des oeufs physiologi-quement identiques, le second, plus pratique, est de pouvoir opérer au moment où les chromosomes (haploldes) se trouvent tous en fin de télophase jus~e sous le deuxième globule polaire. Ce repérage naturel de I'endroit où se trouvent les chromosornes facilite leur retr~it en "aveugle"
et permet, sans avoir recours à des techniques de marquage fluorescent, d'enchaîner rapidement les étapes de manipulations.
On peut alors effectuer le prélèvement des chromosomes. On remarque que les deux globules polaires ne sont pas toujours accolés ~certains sont à l'opposé l'un de l'autre, c'est pourquoi le premier ~lobule polaire n'est pas un bon rnarqueur de l'endroit où se trouven~ les chromo-somes maternels). L'efficacité de cette opération, vérifiée par la présence ultérieure d'un pronucleus, est supérieure à 80 %. Un blastomère est ensuite introduit sous la zone pellucide. Quinze à 20 ovocytes peuvent être manipulés en 1 heure.
On procède ensuite à la fusion cellulaire. La méthode de fusion cellulaire dérive des travaux de Zimmerman sur les champs électriques. La procédure a été affinée. (Ozil et Modlinski 1986, J. Embryol.
Exp. Morph. 96, 211-228).
On obtient 100 % de fusion. Il sera possible ~e réaliser automatiquernent, sous le contrôle d'un logiciel, I'alignement et la fusion cellulaire dans la charnbre de stimulation. Cette procédure permettra de limiter la durée des manipulations e~ de standardiser les conditions expérimentales.

'-. ' ~ ~ ... ..

~/0 91/13977 PCT/FR91/00200 EXEMPLE I

MATERIELS ET METHODES

On a induit une superovulation chez les femelles de lapin sexuellement matures d'espèces variées par injection sous-cutanée d'hormone stimulant le follicule ~FSH) et d'hormone lutéinisante (LH) en accord avec la technique décrite par Kennely et Foote (1965) et modifée par Thibault (communication personnelle). Les femelles ont reçu 2 mg de FSH en cinq injections à 12 heures d'intervalle: 0,250, 0,250, 0.650, 0,650 et 0!250 mg. 12 heures plus tard? avant la saillie par un mâle vasectomisé, on leur a injecté 0,33 mg de LH.
Les ovocytes ont éte récupérés à partir des oviductes 12-l5 h après la saillie par lavage par une solution saline de phosphate tamponné
l 5 (PBS). Ils ont été incubés pendant 5 mimJtes dans l'hyaluronidase t300 i.u.rnl- I dans du PBS) pour éliminer les cellules folliculaires. Après le traitement, les ovocytes ont été cultivés à 38 dans du milieu B2 (Ménézo 1976) dans une atmosphère à 5 % de C02.

Méthode et proccdure expérimentaie La perméabilité membranaire des ovocytes de lapin fraiche-ment ovulées a été transitoirement augmentée par ouverture des pores par une impulsion induite par un champ électrique en présence de Ca2 10 IIM
contenu dans une solution de glucose 0,3 M - 1~ MOhm H20 ~milieu d'impulsion). Il est admis que, pendant que les pores sont ouverts, un fl-lx d'ions circule selon les gradients de concentration à travers la membrane cellulaire vers l'in~érieur du cytosol comme cela a déja été montré dans des ovc~cytes d'oursin (Rossignol et al, 1983). Ainsi, I'influx ioni~e peut être ajusté dans ces conditions soit par la différence de concentration ionique entre l'interieur et lIextérieur de la cellule soit par la durée des impulsions.
La procédure expérimentale pour un flux ionique induit électriquement était similaire à celle précédemment décrite pour la fusion par champ électrique d'embryons de lapin à deux cellules (Ozil et Modlinski 1986). Les ovocytes sont cultivés avec du milieu Ml6 (Whittingham, 1971) à
38C dans une charnbre spécialement conSue. Avant chaque impulsion, le , ~7~3~
~O 91/13977 PCr/FR91/0020û

milieu de culture est automatiquement remplacé par le milieu d'impulsion.
Les détails de la chambre sont décrits dans la figure 1. Chaque impulsion é~alt composée de deux impulsions alternatives afin d'éviter " une électrophorèse latérale " (~affe 1977) des protéines de membrane qui 5 pourrai~ intervenir après plusieurs impulsions de la meme polarité ~Poo, 1981). L'amplitude du signal ionique etait modulé à travers la durée de l'impulsion. Le processus en entier était contrôlé par un mlcro-ordinateur IBM PC-AT 286 par l'in~ermédiaire d'une interface Tektronix Ml 5010 avec un pro~ramme écrit en MS-BASIC. Le Yoltage réel et le courant entre les électrodes étaient mesurés par un oscilloscope Tektronix 77041 monté avec un convertisseur numérique programrnable 7D20 et un amplificateur 7A22.
Le rythme des impulsions électriques et la durée totale du traitement étaient les mêmes pour tous les traitements, c'est-à-dire appliquer une impulsion toutes les quatres minutes pendant 90 minutes.
15 Ces valeurs ont été choisies parce qu'elles s'accordent bien avec la fréquence et la durée moyenne de l'hyperpolarisation du potentiel de membrane des ovocytes de lapin pendant la fécondation (22 oscillations biphasiques du potentiel membranaire pendant les premières 90 minutes suivant la fusion sperme-oeuf, une impulsion toute les 4 minutes -McCulloh 20 et al., 1983). On sait que la variation du potentiel de membrane reflète le passa~e de 1< basé sur des canaux activés par le calcium et qu'elles corstituent donc un indicateur fiable de [Ca2~]i (Miyazaki et Igusa 1982).
L'amplitude de champs électriques tl.8 kVcm-l) etait constante pour tout les groupes expérimentaux.
Traitement des o~cytes Les effets des différents paramètres du traitement sur - liactivation des ovocytes ont été étudiés dans quatre groupes expérimen-30 taux.

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.~0 91/13977 PCT/FRgl/00200 Groupe A - Environnement expéFimental : .
Afin de tester l'effet des conditions expérimentales (perfusion continue. remplacement du milieu de culture et impulsions électriques), des 5 ovocytes fraichement ovules et des oeufs fecondés soumis à 22 doubles impulsions de 900 ~s dans le milieu d'impulsion dépourvu de Ca2 ~la première impulsion est donnée 13 à 15 heures après la saillie). Après le traitement, les oeufs fécondés ont été transférés dans des receveuses pour déterminer la survie à terme. Les ovocytes non fécondés ont été cultivés in 10 vitro et le taux d'activation parthenogénétique a été noté.

Groupe B - ions calcium et durée des impulsions _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ;
L'effet de la durée des impulsions a été ét~dié dans le milieu d'impulsion contenant du CaC12 10 ~M. Le traitemen~ pour lequel les ovocytes ne sont pas activés a été considéré comme étan~ la durée minimum et celui résulta nt dans la Iyse des ovocytes a été considéré
comrne étant la durée maximum. Un jeu de six traitements avec 22 doubles impulsions constantes a été choisi arbitrairement. Ces traitements on~ une durée d'impulsions égale à 200, 300, 600, 900, 1200 et 1500 lls respective-ment. L'effet de la présence d'ions Na+ et Mg2+ à une concentration de 10 M dans le milieu d'impulsion a été testé avec 22 doubles impulsions constantes d'une durée de 900 IJs Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-______________ ___ __ :
~énétique ____.__---- -- ~

Le traitement avec 22 doubles impulsions de durée constante révèle la valeur de la durée de l'impulsion pour laquelle les effets maximum et minimum sont enregistrés. Ces traitements constants ne produisent pas un taux élevé d'activation avec un type uniforme d'oeufs parthéno~énétiques. Afin de vérifier si une réduction progressive des ."~
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~ 2~7~3g ` ~
WO 91/13977 PC~/FR9ltO0200 stimuli calcium dans un trai~ement donné a un effet sur ie type de réac~ion parthénogénétique, les ovocytes ont été soumis à des trai~ements dans lesquels la durée des impulsions décroissait peu à peu selon une relation exponentielle négative. Quatre traitements ont été testés en accord avec la durée maximum de la première impulsion. La figure 2 donne la courbe des durées d'impulsions pour ces traitements.
Une relation exponen~ielle négative (D~u)-e (axutb)~c) en~re I'indice de l'impulsion (I à 22) et la durée d'impulsion (1500 ~s à 200 us) a été choisie arbitrairement pour trouver la valeur de chaque impulsion au cours du traitement.
~vec D(u): durée d'impulsion du cycle (u).
Le coefficient a détermine la pente de décroissance de cette relation.
Le coefficient b détermine la durée de la première impulsion.
Le coefficient c détermine la durée de la dernière impulsion.
Les coefficients a et c sont constants et égaux respectivement à -0,4 et 200.
b = 5,9920 pour le traitement I
= 6,5 510 pour le traitement 11 6,9080 pour le traitement 111 = 7,1700 pour le traitement IV.
Groupe D - Modulation du champ électrique et développement in vitro _ _ __~_~_________._________ __ ________________ ______ __ ____ _ _ _ ___ ____ .
Les oeufs sont traités en présence de 8 ~gml- I de cytocha-lasine ~ dans le milieu de cùlture pour bloquer l'expulsion du second globule polaire et obtenir une population uniforme d'oeufs parthéno-génétiques diploides. Deux traitements ont é~é appliqués au groupe C, le traitement I qui est le traitement faible avec une durée totale d'impulsion égale à l l 228 ~JS et le traitement 111 qui est le traitement fort avec une durée de 14 868~s. Les oeufs parthénogéné~iques ont été cultivés in vitro jusqu'au stade blastocyste et l'influence des deux traitements a été évalué
par le taux de formation de blastocyste~
. .
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~VO 91/13977 PCI/FR91/00200 1~ .

Viabili~é au delà de l'implantation des embryons parthénogénétiques d i plo i des Les embryons au stade 4-cellules ont été transplantés dans les oviductes de receveuses. Les oeufs fécondés ont également été transplantés dans la corne opposée de quelques receveus~es afin de comparer le développement parthénogénétique au développement normal. Les receveu-ses ont été autopsiées entre le Jour 8.5 et le jour 13 de la gestation et le nombre de sites d'implantation de foetus vivants a été noté.

RESULTATS

Groupe A - Effet de l'environnement expérimental (contrôles) 1 5 __ ____ __________ _____ __ .
Quant le milieu dlimpulsion ne contient pas d'électrolytes, aucun des ovocytes ~105) n'est activé. L'environnement expérimental et les conditions de cul~ure c'est-à-dire le remplacemen~ du milieu de culture avant chaque impulsion par un milieu d'impulsion ne contenant pas d'électrolytes et le traitement par des impulsions électriques relativement fortes (2 x 1.8 kVcm-lx900l1s x 22 fois, c'est-à-dire une durée totale d'impulsions de 30 600 lls) n'a pas d'effet visible sur les ovocytes fraîchement ovulés mais les condi~ions ne permettent pas de déclencher le développernent. Par contre 41 % t9/22j des oeufs fécondés traités de la 2 5 même manière se sont développés à terme démontrant ainsi que le traitement par des impulsions électriques de haut voltage n'a pas d'effet contraire sur la capacité de développement des ovocytes fécondés. Il n'était pas possible de remplacer totalement le milieu de culture par le milieu d'impulsion avant chaque impulsion. Le courant mesure pendant l'impulsion révèle que la conductivité du milieu d'irnpulsion est au moins de 15 %
supérieure à celle du milieu d'impulsions mesurée entre les électrodes avant expérience et avant la premiere injection de milieu de culture.
Pendant l'experimentation, des ions provenant du milieu de culture sont encore présents pendant les impulsions et ceci modifie le signal ionique.
Ces variations du micro-environnement n'apparaissent pas comme ayant un quelconque effet significatif sur l'activation ou le développement embryonnaire. Dans ce~te série d'expérimentations, les oeufs sont lavés par :, . . , :.

J ~
~0 91/13977 PCT/FR91/002ûO

le milieu d'impulsion pendant 45 secondes toutes les quatre minutes. Cette p~riode pendant laquelle les oeufs ne sont pas dans le milieu de culture n~a pas d'effe~ significatif sur l'activation ou sur la survie à terme.

5 Groupe ~ - ions calcium et durée de l'impulsion _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Le tableau I résume les résultats de l'expérimentation dans lequel le taux d'activation a été testé en relation avec la durée d'impulsion en présence de CaC12 lO ,uM.
I0 L'apparition de pronuclei après 3 ou 4 heures de culture sert de marqueur pour l'activation parthénogénétique. Ces résultats mon~rent clairement que l'activation parthénogénétique est déclenchée qaand le milieu d'impulsion contient Ca~ lO IIM.
De plus, le taux d'activation est directement relié à la durée 15 de l'impulsion qui contrôle indirectement la stimulation par le calcium. La durée des stimuli ioniques n'influence pas seulement le taux d'activation mais aussi la configuration nucléaire des ovocytes parthénogénétiquement activés d'age postovulatoire semblables.
Plus la durée d'impulsion est longue, plus la proportion d'oeufs 20 activés est élevée mais plus la proportion d'ovocytes contenant des micronuclei est importante.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-~; _ __ ______ _ __ __ ___ _ _ ,, génétique.
Les résultats sont résumés dans le tableau 11. La relation entre le type d'activation parthénogénétique et chaque traitement est égalernent montrée dans le tableau 111. Quand la durée de l'impulsion est réduite, tous les ovocytes sont activés et la majorité (91 %~ d'entre eux ont un 30 pronucleus unique et deux globules polaires quand la rnéiose est terminée.
Ainsi, la modulation des stimuli de calcium à travers la durée de l'impulsion semble être effective et influence les premières étapes du développement.
Dans cette étude, I'â~e des ovocytes était sirnilaire et ne peut donc pas affec~er les résultats.

.

.~0 91/13977 PCr/FR91/00200 2~

Groupe D - Effet de la modulation de champ électrique sur le ..
5 développement in vitro d'ovocytes activés par parthénogénèse.
_ _ _ _ _ _, _ _ _ _ _ , Les résulta~s sont résumés dans le tableau 111. Aucune différence visible dans le développemenl de chaque groupe n'a pu ê~re notée jusqu'à la Iroisièrne division.
Dans les embryons parthénagénétiques produits par le traitement 1, une proportion plus faible d'embryons présente une compaction et ceux qui se compactent sont irréguliers. Par eontre, la majorilé des embryons produits par le traitement 111 se compacte e~ se développe jusqu'au stade de blastocyste.
Ces résultats montrent que la forme du stimulus d'activation a un effet profond sur la capacité des embryons parthéno~énétiques à se développer jusqu'au stade de blastocyste in vitro.

Viabilité post-implantation des oeufs parthénogénetiques diploldes.
2~
13 receveuses sont devenues gravides et ont été autopsiées -entre le jour 8.5 et le jour 13. Les résultats sont résumés dans le tableau IV.
Bien que les embryons parthénogénétiques soient plus peti~s que les embryons de contrôle, ils appa!aissent morphologiquement normaux selon les critères définis pour le lapin. Le rapport entre la tail!e des annexes embryonnaires et celle du foetus est grossièrement équivalent pour les embryons obtenus par fécondation ou par parthéno~énèse.
Ainsi, il semble que le développement ~éneral des embryons parthénogénétiques, le foetus et ses tissus trophoblastiques soit ralenti.
Les foetus morts ont plusieurs anomalies et il n'était pas possible de les classifier.

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~ ~ 7 ~
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~O ~1/13977 P~/FR91/00200 Tableau I -Effet de la présence d'ions calcium et durée de l'impulsion électrique sur l'activation des ovocytes de lapin Durée Nomb-e Nombre % % d'ovocytes activés avec d'impulsion d'ovocytes Iyses (%) activés I PN+PBI 2PN 2PN#
(~s) ~PB2 ~PB I -PB I

200 ~s 47 0 (0) 13 83 17 0 300 ~s 99 0 (0) 62 68 25 7 60011s 85 0 (0) 98 71 19~ 10 900 ~s 63 0 (0) 100 62 14 24 1 200 lls 97 5 ~5) 100 57.29 14 l 5 1 500 ~s 50 3 ~6) 100 30 l ~ 53 Tableau 2 - Effet de la modulation du champ électrique sur l'activation TraitementNornbre % % ovocytes activés avec . i d'ovocvtesactivation I PN+PBl 2PN 2PN#
~PB2 ~ PBI -PBl : :

11 15l 99 89 9 111 l 18 lO0 91 9 0 IV 96 lO0 70 25 5 # Pronuclei anormaux, petits micronuclei i ~

,:

~VO 91/13977 2 a ~ /FR9l/002oo Tableau 3 -Effet de la modulation de champ électrique sur le développement d'oeufs parthénogénétiques in vitro Traitement Nombre ,6 Nombre Nombre Nombre d'ovocytes activa_on cultivés !norulae blastocystes compact (/0) (6) 98 91 69 25(36) 23 (33) 111 352 100 244 244(100) 216 (88) Tableau 4 -15 Developpement post-implantal:ion d'oeuis parthénogénétiques soumis au traitement 111.

Jour de l'autopsie J 8-9 J 9-10 J10-11 J 12-13 Total Nombre d'oeufs ~: transférés 21 26 50 68 165 ,~
, Nombre d'implan-tations 9 3 15 23 50 , % cumulé (42,8) ~21,2) (27,8) (30,3) .', Nombre de foetus - vivants 8 3 7 0 18 .
. ~ % cumulé (88,8) (91,6) (66,6) (36) ' : "
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: . 2 ~
tlVO ~ 1/13977 PCI / FR91 / 00200 electric shock, ~ hermetic or osmotic, enzymes or agents ~ s anesthetics (Kaufman ~ 1H 1983 - Early mammalian development -parthenogene ~ ic studies - Cambridge University Press). However, Activation is always identified with a single stimulus, limited in the 5 times, supposed to mimic the penetration of the sperm into the egg. No of these treatments only reproduces the series of physiological changes producing in the egg after penetration of the sperm.
Only a few cases of parthenogenetic activation are known.
of the cow oocyte (Menezo et al. 1976 - Commission of the European 10 Coimmuni ~ ies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. Eur 5491); no really reliable and precise method of activating oocytes cattle is not available. Experimental activation with Irethanol has many disadvantages: great variability in results depending on the age of the oocytes (Cuthbertson, 1983; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).
As regards the cloning of embryos, the first undisputed results were obtained by S. Willadsen in 1986 at the sheep. They were followed by those of Prather et al in 1987 in cows, and in 1989 in the sow. In the rabbit, the first individuals from 20 cloning were obtained by Stice and Robl in 1988. The successes of these experiences reported in publications do not generally exceed ~
not 4%. However, American companies (Granada Genetics, Houston, Texas) or Canadian (Alta Genetics, Callgary, Alberta), appear master the cloning procedure in cattle. It is said that a hundred 25 calves have already been obtained on the North American continent. This industrial handling reflects the interest that aforementioned embryonic cloning in cattle. kHas the techniques really progressed?
The procedures described in the publications are similar.
The oocytes used have undergone an aging period of 6 to 10 30 hours. This aging is ~ made necessary to promote activation (no conventional activation technique can activate oocytes freshly ovulated even in cattle (Ware et al. 1989). The gold chromosomes ~ aniseed on 13 metaph.se 11 are taken "blind" in '', . ~

- ~ 2 ~ 138 ~ 0 91/13977 PCl` / FR91 / 00200 the region of the first polar body, but visualization techniques chromosomes by fluorescence are used. A cell embryo from a morula is introduced under the pellucid zone and the fusion is obtained by pulses of electric fields.
The activation of the oocyte is usually caused by the procedure of cell fusion; in some cases, it is not described. Two researchers were able to obtain a lamb following the transfer into an oocyte of a nucleus from an embryonic button cell (Smith a ~ Wilmut, L989).
However, the level of results and the complexity of mechanisms involved such as the nucleus differentiation stage, the phase of the cell cycle, the state of the recipient oocyte ~ its age! the procedure of activation do not allow to understand why some embryos develop and others do not. Many theories to explain failures like that based on kernel transcription activity l 5 transplanted patients were contradicted by some experimental results.
New data appeared on the mechanisms physiological triggered by fertilization and especially with regard to concerns the rhythms of variations in the level of free calcium and second messengers like lnositol (1,6,5) -tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. 1981; Cuthbertson ~ Cobbold, 1985; Miyazaki et al.
1986; Miyazaki, 1988). The periodic activity of these second messengers could regulate the synthesis of nucleic acids (DNA and RNAs) and proteins (Basset et al. 1968; Rodan et al. 1978).
The process is triggered by the sperm in the seconds after fertilization ~ The chain of reactions that leads to the lnsP3 production seems to depend on an influx of calcium ions. The lnsP3 is binds to a specific receptor that controls the activity of a calcium channel located on the intracellular membrane of an intracellular calcium reservoir.
The calcium thus released activates specific proteins, which themselves activate specific processes, for example calcium complexation `calmodulin, kinase activation etc. Calcium is considered The main activator of metabolism. This cycle of reactions occurs again ~
(( :

20rl ~ 3 ~
r ~ O 91tl3977 PCI` / FR91 / 00200 a frequency of the order of a minute for several hours ~ 1cCulloh and al. 1983; Igusa ~ c Miyazaki, 1983-1986 ~ liyazaki et al. 1986; . ~ / liyazaki;
1 9 ~ S).
This rhythmic activity, due to a system of si ~ nau ~
5 intracellulars emitted at a natural frequency, seems to depend on the presence of male and female pronuclei because it could not be observed on Parthenogenetic eggs activated by classical methods ~ Cuthberston et al. nineteen eighty one; Cuthbertson d (cobbold, 1985; Miyazaki, 1988). ``
Injection into oocytes of a protein G ~ guanosine 10 -5'-0- (3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induces several decalcium release cycles, but does not allow this activity to be maintained beyond fourth (Swann, Igusa ~ c Miyazaki, 1989).
The respective genetic contributions of the oocyte and the sperm are well documented in mice. These studies show 15 that the normal term development of an embryo depends on the presence permanent throughout the first cell cycle of the two pronuclei parental (PN) ~ Surani ~ Barton 1983; Mc (; rath ~ Solter, 1984; Surani and al. 1986; Mann ~ Lovell - Badge, 1986, 1988).
The production of young people by clona ~ e cannot be carried out in 20 practice only if reliable and reproducible processes are available. The quality of egg activation plays a role in development important until then ignored.
Control of activation understood as a phenomenon rhythmic extending over the entire first cell cycle is essential, 25 not only for routine production of activated and synchronous oocytes but also to benefit from "cloned" eggs with this type of activation imposed to develop normally.
The present invention therefore relates to a method of stimulating artificial, particularly long-term, tion of a set of cells 30 reproducing the effect of a controlled biochemical regulatory mechanism under natural physiological conditions by an internal oscillator, characterized in that it comprises the following steps:

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2 ~ 7 ~
~ 0 91/13977 PCT / FR91 / 00200 a) the cells are placed in culture in vitro, for a time determined, b) the cells are placed in the pulse medium, after elimination of the culture centre, 5 c) the cells are subjected to a pulse generated by an electric field, d) the cells are again placed in the culture medium, `
e) the preceding steps are repeated a certain number of times, and f) the cells are obtained in a homogeneous activated state.
The elimination of the culture medium is preferably 10 supplemented by washing the cells with the pulse medium.
This stimulation process although it can be used in a large number of processes have been developed as part of activation of oocytes for the cloning of embryos. Recent studies have indeed shown that in mammalian eggs, fertilization is 15 accompanied by a transient increase in the intracellular concentration of free calcium ([Ca2] i] 'followed by a series of oscillations of this concentration, which lasts at least 4 hours.
It is not yet known how the sperm triggers these variations of [Ca2] i ~ as well as the exact biological functions of these 20 long-term Ca2 oscillations. However, they seem to be character-of fertilized eggs and have never been observed when oocytes are artificially activated (Miyazaki 1988 - J. Cell. Biol. 106, ; 345-353).
The process developed in the present invention will therefore 25 allow periodic stimulation of oocytes by influxes of calcium in the plasma membrane.
Indeed, by introducing ions into the pulse medium Ca2t, these will be able to penetrate into the cell by electroporation, that is to say the creation of "pores" generated by the electric pulse.
Beyond the immediate phenomena caused in the oocyte like the expulsion of the polar body, the effects of this stimulation are ; ~ will manifest on the later stages of the development of the embryo, even then the ~ processing has stopped. This is how the phenomena of compaction and cavitation may be affected.

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~ -'0 91/13977 PCl / FR91 / 00200 This process can be applied to ~ freshly ovulated oocytes, obtained by hormonal stimulation of the female. Activation of oYocy ~ es in the condi ~ ions defined frequency, intensity ~ é and duration causes the expulsion of the second polar body. We can then take the 5 chromosomes which reopen at the end of telophase just below the second polar body. We have oocytes in the same physiological state having a pronucleus.
A blastomer is then introduced under the pellucid zone and proceeds to cell fusion by the action of an electric field.
The process can then be applied to cloned embryos as well to improve their development, that is to say to regularize cell divisions and get compaction.
Stimulation by this process can be applied to oocytes freshly ovulated placed in the presence of an inhibitor. of the expulsion of 15 second ~ polar lobule, like cytochalasin a, which maintains a state diploid. We thus obtain a population of parthenogenetic embryos, which can be implanted in recipient females and will present a synchronous development of the fetus and embryonic appendages.
These experiments, first carried out on rabbit oocytes, 20 have been confirmed on mouse oocytes, reputed to be refractory to activation just after ovulation. The performance of the process is therefore reproduced from one species to another. The activation method can certainly apply to freshly ovulated oocytes from cattle or sheep.
If you subtract the oocytes during treatment, they 25 regress and some artifacts like oocytes are obtained metaphase 111 reproducible at will, and which offer new possibilities for studies, in particular on the dynamics of the cytoskeleton and Genome activation.
The process was designed based on the effects of the fields 30 electrical on plasma membranes.
It has been shown (Zimrnermann, 1982) that impulses from electric fields of the order of 1 to 3 kVcm-l and lasting a few ys can create micropores in the ~ plasma membrane and ablate a . , ... . .

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2 ~ 7 ~ 1 ~ g ~ 1VO 91/13977 PCl / FR91 / 00200 direct communication between inlra and extra cellular media. He was thus possible for example to bring calcium into oocytes sea urchin by exposing them to pulses of electric fields in the presence calcium ions (Rossignol et al 1983). The magnitude of these inflows can be S modulated by the duration of the pulse of electric ch ~ mp ~.
Ie process involves the conlugation of a culture method in vitro of a batch of oocytes (or ernbryons) by infusion between two electrodes and a method of washing with a non-conductive solution, containing calcium 0 to 30 ~ M, in which the pulses are delivered.
10The presence of a very weakly conductive solution, for example a ~ -isotomic solution of glucose containing Ca ions, at the time of pulse allows an electric field to appear in ~ re electrodes. An excessive presence of ions reduces the "electric field" effect stick. "
15 Preferably, the concentration of Ca2 ~ ions is between 8 and 20 ~ M. Good results ~ s are obtained for example for a concentration of Ca2 ~ ions equal to 10 ~ or 16 IIM.
The alternation of a culture period and a washing period allows frequently subject the oocytes to stimuli ~ ions ~ in a medium 20 ionic very well defined.
This process can be extended to the stimulation of cells by tou ~ e a range of simple or complex ionic or molecular signals laires ~ varying concentrations which will be determined by the composition of the pulse medium.
This process modulates the signal frequency by the duration between two washes, and its amplitude by the duration of the pulse electric.
11 es ~ imperative to completely replace the culture medium by the pulse solution, because the intensity of the current due to excess ions 30 from the culture medium would destroy the oocytes. Just after The pulse, the pulse solution is replaced by the culture medium, oocytes cannot survive in the impulse solu ~ ion.
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n'O 91/13977 PC ~ / FP ~ 91/00200 This process can be controlled via a lo ~ iciel which will create stimulation treatments according to equations specific. exporential, sinusoldale, Fourier sequences or others.
One of the aspects of the present invention is trailering 5 simultaneous of a set of oocytes ~ which will be thus obtained, activated in the same physiological state. The ~ core reffes could thus be performed on physiologically identical oocytes.
During cloning, the sequence and phases of the cell cycle during which operations are chained have very serious consequences 10 important things about nucleus remodeling and development ulterior.
It is extremely interesting to be able to standardize the different phases of oocyte processing ~ in order to obtain good reproducibility of the process.
The present invention therefore relates to a dynamic system, operating continuously and can be automated, realized by a device allowing the automatic succession of washing steps, stimulation and acquisition of stimulation parameters.
This disposi ~ if is characterized by the fact that ~ it ensures llimmobi-20 reading cells during the different phases of treatment.
Different embodiments of this device appear . ~.
in Figures 1 and 3.
It consists of an enclosure comprising at least one fluid inlet (10, II) and a fluid outlet (6) and, is characterized in 25 that at the bottom of the enclosure there are one or more orifices (4) don ~ the geometry is such that it is opposed to the passage of cells and in that the liquid entering the enclosure is withdrawn, at the less in part, through the openings, creating a depression such that it substantially blocks the cells on the orifice (s), 30 part of the fluid being evacuated by overflow.
This device makes it possible to retain cells without damaging them or in ~ roduire con con rain ~ e parasi ~ e mechanical. In or ~ re, it allows ~ to ~ o ~

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2 ~ 7 ~
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~ 0 91/13977 Pa ~ / FR91 / 00200 when to replace, remove or move cells. These measures therefore makes it possible to successively place the cells in mediums of chemical composition of different natures, during periods and according to variable frequency.

The enclosure has on its internal walls two elements, preferably parallel, and the hole (s) are aligned at equal distance electrodes, immersed in the medium corresponding to the phase of the treatment in progress.

Thanks to this device, cells can be cultivated at will or else in the impulse medium to penetrate into the treated cell7 a ion, a molecule, a complex chemical or biological substance.

This device allows in particular the treatment in a even pregnant with a large number of oocytes, without it being necessary to place them in separate compartments.

In particular, the device has at least two arrivals of f luide, which can be superimposed.

The evacuation of fluids can also be done laterally.

lement.

At each medium arriving successively in the room, 20 corresponds to a separate injection tube.

At the same time as the injection of the pulse medium, a system of suction adapted on the device of arrival of the culture medium allows sucking a small amount of the pulse medium which enters the culture medium inlet pipe; this prevents the ions of the 25 culture media enter the chamber during the washings. The circulation of medium flows is represented by arrows on the fi gure 3.

These media, both the culture medium and the medium of impulse, are in continuous circulation, and it is this flow of liquid which by 30 suction effect keeps the oocytes between the electrodes during environmental renewals.

The compositions of the culture media are known and depend on the cells in culture. The pulse medium is usually -.

2 ~ 7 ~ 3 ~ ~
-'0 91 ~ 13977 PS: ~ / FR91 / {) 0200 cons ~ itue of a nonionic medium to ensure a field effect. It will be of an isotonic solution, for example of glucose.
The presence of a large amount of ions can seriously harm to cells during the pulse. It is therefore necessary to wash the cells with the pulse medium to remove the ions contained in the medium cult lre.
This device can be designed as an activation chamber, whose capacity can be adapted to the number of cells you want treat simultaneously.
The characteristics of the process using the device, can vary widely and are generally only limited by?
conditions such as wash times. So the frequency of impulses is limited by the minimum wash time by the medium impulse.
The parameters of the process and the device are to say the fluid inflows and outflows, as well as frequency, duration and the intensity of the electrical pulses arriving in the electrodes are managed by an electronic system.
The characteristics of electrical pulses in themselves may vary and depend on the cells and the objectives sought.
In general, the electric fields vary from 1 to 3 Kv. cm 1 and the electric pulse dawn duration of 10 lls at 2000 ~ s.
The frequency and duration of the pulses may vary depending on during the different stages of the same simulation process.
The organization of the tubes that open into the room allows media to be injected without the oocytes being taken down by the gas bubbles which eventually form in the pipes. In addition, the distribution structure of the media considerably limits the ionic contamination of the stimulation medium ~ ion by the ions of the culture. ; `

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~ 0 91 / t3977 PCl / FR91 / 00200 He .

Media injection pumps can be ordered by a microcomputer which will determine the repeatable washing sequences while holding the cells between the electrodes.
This device could be applied to the treatment of cells by any substance that one wishes to penetrate into the intracellular space laire. The composition of the pulse medium will determine the penetration of this substance according to a concentration gradient.
During cell culture, we can provoke, at a determined moment, which can be unique, the entry in the set of cells of the desired substance. For that we will replace the middle of culture by the pulse medium and we will trigger the field pulse - electric, the duration of the pulse determining the quantity of substance which enters. This pulse medium can then be evacuated and the cells re-cultured in an appropriate medium. The advantage of this system is that it allows to simultaneously treat a set of cells which are thus synchronized. It works continuously e ~ avoids any manipulation cells, thus ensuring better reproducibility and greater great speed of execution. This allows standardization of conditions and facilitates technology transfer.
We can consider getting an ion into the cells or a simple molecule. This disposi ~ if little ~ also apply to stimulation cells by a more complex molecule, or at the penetration of ; DNA, or episome fragments.
This device will be used to perform stimulation cyclic of the cells, several basic sequences being produced ~ i successively, the intensity, duration and frequency of the controlled pulses via a microcomputer.
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~ 0 91/13977 PCr / lFR91 / 002 ~ 0 This disposi ~ if perme ~ carrying out the activation process and ochronization of oocytes, by repeated stimulation by Ca2, in view of the cloning of domestic animal embryos.
5An embodiment of the chamber is shown in figure 1.
Oocytes I are placed on a rectilinear slit 4, made by the juxtaposition of two glass plates 3 and 5, the spacing of which is smaller than the diameter of the oocytes. The media, culture medium and medium 10 of impulse, arrive in the upper part of the room each by separate tubing, respectively 10 and 11, avoiding con ~ amination reci close.
The medium 9 corresponding to the current treatment phase arrives in c ~ ntinu and is evacuated by a tube 6 located at a higher level 15 lower than that of oocytes. This current of liquid maintains by suction oocytes plated on the bottom of the chamber.
On the inner walls of the chamber are two platinum electrodes 2 and 7, parallel, 1 cm long.
The enclosure 8 is thermostatically controlled at 38C.
20Every medium arrives in the room after passing through a system retaining large gas bubbles.
This system consists of a glass balloon in which the liquid is coming. From this balloon leaves a golden rod per ~ decorated with small holes diameter; after passing through this rod, the gas bubbles of size 25 important are retained and the liquid arrives in the room by a short tubing.
Rabbits were superovulated by injection of FSH and LH, and oocytes taken from the oviducts. After treatment 5 min by hyaluronidase, the oocytes are placed in the activation chamber, 30in the middle B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282, 1967-1970) at 38C, in an atmosphere with 5% CO ~
Oocytes can be immediately subjected to activation treatment, at ~ a period of ~ aging is ~ necessary.

1. ~ ~ ' 2 ~ 7 ~
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~ O 91 ~ 13977 PCr / FlR91 / 03) 2û0 They are subjected for 90 minutes to a series of pulses of electric field. at a rate of one pulse every 4 minutes, or 22 pulses of decreasing duration dissipating a total energy ~ ie 1250 ujoules, of a total duration of 14,868 ~ Is, the electric field has a value of 1.8 Kv. cm ~ 1.
Before each pulse, the culture medium is replaced by an impulse medium consisting of an isotonic solution of glucose containing CaC12 1 0 ~ M.
At the end of the activation treatment, all the oocytes have two well-formed polar cells. So we get at the same time, at within a few minutes, a homogeneous population of activated oocytes in the same physiological state. This has two advantages: the first is to be able ~ to always carry out the core grafts in physiologic eggs only identical, the second, more practical, is to be able to operate at when the chromosomes (haplold) are all at the end of telophase jus ~ e under the second polar body. This natural location of The place where the chromosornes are located facilitates their retr ~ it in "blind"
and allows, without resorting to fluorescent labeling techniques, to quickly follow the manipulation steps.
The chromosomes can then be removed. We note that the two polar cells are not always joined ~ some are opposite each other, that's why the first ~ lobule polar is not a good marker of where the chromo-maternal somes). The effectiveness of this operation, verified by the presence of a pronucleus, is greater than 80%. A blastomer is then introduced under the pellucid zone. Fifteen to 20 oocytes can be handled in 1 hour.
The cell fusion is then carried out. The method of cell fusion derives from Zimmerman's field work electric. The procedure has been refined. (Ozil and Modlinski 1986, J. Embryol.
Exp. Morph. 96, 211-228).
100% fusion is obtained. It will be possible to carry out automatically, under software control, alignment and merging cell in the stimulation chamber. This procedure will limit the duration of the manipulations e ~ standardize the conditions experimental.

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~ / 0 91/13977 PCT / FR91 / 00200 EXAMPLE I

MATERIALS AND METHODS

Superovulation was induced in female rabbits sexually mature of various species by subcutaneous injection follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) in agreement with the technique described by Kennely and Foote (1965) and modified by Thibault (personal communication). Females received 2 mg of FSH in five injections 12 hours apart: 0.250, 0.250, 0.650, 0.650 and 0! 250 mg. 12 hours later? before the projection by a vasectomized male, they were injected with 0.33 mg of LH.
The oocytes were recovered from the oviducts 12-15 h after protruding by washing with buffered phosphate saline l 5 (PBS). They were incubated for 5 mimJtes in t300 hyaluronidase iurnl- I in PBS) to remove follicular cells. After the treatment, the oocytes were cultured at 38 in B2 medium (Ménézo 1976) in an atmosphere containing 5% CO 2.

Experimental method and procedure The membrane permeability of fresh rabbit oocytes-ovulated was transiently increased by opening the pores by a pulse induced by an electric field in the presence of Ca2 10 IIM
contained in a 0.3 M glucose solution - 1 ~ MOhm H20 ~ medium pulse). It is accepted that, while the pores are open, a fl-lx of ions circulates according to the concentration gradients through the membrane cell towards the inside of the cytosol as has already been shown in sea urchin ova (Rossignol et al, 1983). Thus, the ion influx can be adjusted under these conditions either by the difference in ionic concentration between the interior and the exterior of the cell, either by the duration of the impulses.
The experimental procedure for an induced ion flux electrically was similar to that previously described for fusion by electric field of two-cell rabbit embryos (Ozil and Modlinski 1986). Oocytes are cultured with Ml6 medium (Whittingham, 1971) at 38C in a specially designed hinge. Before each pulse, the , ~ 7 ~ 3 ~
~ O 91/13977 PCr / FR91 / 0020û

culture medium is automatically replaced by the pulse medium.
The details of the chamber are described in Figure 1. Each pulse é ~ alt composed of two alternative impulses in order to avoid "a lateral electrophoresis "(~ affe 1977) of membrane proteins which 5 could ~ intervene after several pulses of the same polarity ~ Poo, nineteen eighty one). The amplitude of the ion signal was modulated over the duration of the impulse. The entire process was controlled by a microcomputer IBM PC-AT 286 through a Tektronix Ml 5010 interface with a program written in MS-BASIC. The actual Yoltage and the current between electrodes were measured by a Tektronix 77041 oscilloscope mounted with a programmable digital converter 7D20 and an amplifier 7A22.
The rhythm of the electrical impulses and the total duration of the treatment were the same for all treatments, i.e.
apply a pulse every four minutes for 90 minutes.
15 These values were chosen because they fit well with the frequency and mean duration of hyperpolarization of the potential membrane of rabbit oocytes during fertilization (22 oscillations biphasic membrane potential during the first 90 minutes following sperm-egg fusion, one pulse every 4 minutes -McCulloh 20 et al., 1983). We know that the variation of the membrane potential reflects the increased from 1 <based on calcium activated channels and that they thus constitute a reliable indicator of [Ca2 ~] i (Miyazaki and Igusa 1982).
The amplitude of electric fields tl.8 kVcm-l) was constant for all experimental groups.
Treatment of o ~ cytes The effects of different treatment parameters on - the activation of oocytes were studied in four experimental groups.

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. ~ 0 91/13977 PCT / FRgl / 00200 Group A - Experimental environment :.
In order to test the effect of experimental conditions (infusion keep on going. culture medium and electrical impulses), 5 eggs freshly ova and fertilized eggs subjected to 22 doubles pulses of 900 ~ s in the pulse medium devoid of Ca2 ~ la first impulse is given 13 to 15 hours after the projection). After the treatment, the fertilized eggs were transferred to recipients for determine term survival. Unfertilized oocytes were grown in 10 vitro and the rate of parthenogenetic activation was noted.

Group B - calcium ions and pulse duration _ _ _ _ _ _ _ _ _ _;
The effect of the duration of the pulses has been eti ~ ed in the middle pulse containing CaC12 10 ~ M. The treatment for which oocytes are not activated was considered to be etan ~ the duration minimum and that resulting in the oysis of the oocytes was considered comrne being the maximum duration. A set of six treatments with 22 doubles constant pulses was chosen arbitrarily. These treatments have ~ a pulse duration equal to 200, 300, 600, 900, 1200 and 1500 lls respectively-is lying. The effect of the presence of Na + and Mg2 + ions at a concentration of 10 M in the pulse medium was tested with 22 double pulses constants with a duration of 900 IJs Group C - pulse modulation and type of partheno activation ______________ ___ __:
~ enetic ____.__---- - ~

Treatment with 22 double pulses of constant duration reveals the value of the pulse duration for which the effects maximum and minimum are recorded. These constant treatments do not not produce a high activation rate with a uniform type of egg partheno ~ enetics. In order to verify whether a gradual reduction in . "~
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~ 2 ~ 7 ~ 3g `~
WO 91/13977 PC ~ / FR9ltO0200 calcium stimuli in a given treatment has an effect on the type of reaction parthenogenetic, the oocytes were subjected to treatment in which the duration of the pulses gradually decreased according to a relation exponential negative. Four treatments were tested in accordance with the maximum duration of the first pulse. Figure 2 shows the curve of pulse durations for these treatments.
A negative exponen ~ ielle relation (D ~ u) -e (axutb) ~ c) en ~ re The pulse index (I to 22) and the pulse duration (1500 ~ s at 200 us) a was chosen arbitrarily to find the value of each pulse at during treatment.
~ with D (u): cycle pulse duration (u).
The coefficient a determines the slope of decrease of this relationship.
The coefficient b determines the duration of the first pulse.
The coefficient c determines the duration of the last pulse.
The coefficients a and c are constant and equal respectively at -0.4 and 200.
b = 5.9920 for treatment I
= 6.5 510 for treatment 11 6.9080 for treatment 111 = 7.1700 for IV treatment.
Group D - Electric field modulation and in vitro development _ _ __ ~ _ ~ _________._________ __ ________________ ______ __ ____ _ _ _ ___ ____.
The eggs are treated in the presence of 8 ~ gml- I of cytocha-lasine ~ in the middle of the block to block the expulsion of the second polar body and get a uniform population of partheno- eggs diploid genetics. Two treatments were applied to group C, the treatment I which is the weak treatment with a total pulse duration equal to ll 228 ~ JS and treatment 111 which is strong treatment with a duration of 14,868 ~ s. Parthenogenous eggs were cultured in vitro up to the blastocyst stage and the influence of the two treatments was evaluated by the rate of blastocyst formation ~
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~ VO 91/13977 PCI / FR91 / 00200 1 ~.

Viabili ~ é beyond the implantation of parthenogenetic embryos di plo i des The 4-cell stage embryos were transplanted into recipient oviducts. The fertilized eggs were also transplanted in the opposite horn of a few recipients ~ es in order to compare the parthenogenetic development to normal development. The recipients her were autopsied between Day 8.5 and day 13 of gestation and number of implantation sites for living fetuses has been noted.

RESULTS

Group A - Effect of the experimental environment (controls) 1 5 __ ____ __________ _____ __.
When the pulse medium does not contain electrolytes, none of the oocytes ~ 105) is activated. The experimental environment and ass conditions ~ ure that is to say the replacement of the culture medium before each pulse by a pulse medium not containing of electrolytes and treatment with relatively electrical impulses strong (2 x 1.8 kVcm-lx900l1s x 22 times, i.e. a total duration of pulses of 30,600 lls) has no visible effect on oocytes freshly ovulated but the condi ~ ions do not trigger the develop. On the other hand 41% t9 / 22d of the fertilized eggs treated with 2 5 similarly developed over time, thus demonstrating that the treatment with high voltage electrical pulses has no effect contrary to the development capacity of fertilized oocytes. He was not not possible to completely replace the culture medium with the medium pulse before each pulse. Current measures during pulse reveals that the conductivity of the pulse medium is at least 15%
greater than that of the pulse medium measured between the electrodes before experiment and before the first injection of culture medium.
During the experiment, ions from the culture medium are still present during the pulses and this changes the ion signal.
These variations in the micro-environment do not appear to have a any significant effect on activation or development embryonic. In this ~ te series of experiments, the eggs are washed by :, . . ,:.

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~ 0 91/13977 PCT / FR91 / 002ûO

the pulse medium for 45 seconds every four minutes. This period during which the eggs are not in the culture medium n ~ a no significant effect on activation or on long-term survival.

5 Group ~ - calcium ions and pulse duration _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Table I summarizes the results of the experiment in which the activation rate was tested in relation to the pulse duration in the presence of CaC12 lO, uM.
I0 The appearance of pronuclei after 3 or 4 hours of culture serves of marker for parthenogenetic activation. These results show clearly that parthenogenetic activation is triggered when the pulse medium contains Ca ~ lO IIM.
In addition, the activation rate is directly related to the duration 15 of the pulse which indirectly controls stimulation by calcium. The duration of ionic stimuli does not only influence activation rate but also the nuclear configuration of parthenogenetically oocytes similar postovulatory age.
The longer the pulse duration, the higher the proportion of eggs 20 activated, but the higher the proportion of oocytes containing micronuclei is important.
Group C - pulse modulation and type of partheno activation ~; _ __ ______ _ __ __ ___ _ _ ,, genetic.
The results are summarized in Table 11. The relationship between the type of parthenogenetic activation and each treatment is equal shown in Table 111. When the pulse duration is reduced, all the oocytes are activated and the majority (91% ~ of them have a 30 single pronucleus and two polar cells when rneiosis is over.
Thus, the modulation of calcium stimuli over time of the impulse seems to be effective and influences the early stages of development.
In this study, the age of the oocytes was syrnilar and could not therefore not affect the results.

.

. ~ 0 91/13977 PCr / FR91 / 00200 2 ~

Group D - Effect of electric field modulation on the ..
5 in vitro development of oocytes activated by parthenogenesis.
_ _ _ _ _ _, _ _ _ _ _, The results are summarized in Table 111. None visible difference in the development of each group could not be noted up to the third division.
In parthenagenetic embryos produced by the treatment 1, a lower proportion of embryos compaction and those that compact are irregular. On the other hand, the majority of embryos produced by treatment 111 compacts e ~ se develops up to the blastocyst stage.
These results show that the shape of the activation stimulus has a profound effect on the ability of partheno ~ enetic embryos to develop up to the blastocyst stage in vitro.

Post-implantation viability of diploid parthenogenetic eggs.
2 ~
13 recipients became pregnant and were autopsied -between day 8.5 and day 13. The results are summarized in Table IV.
Although parthenogenetic embryos are smaller than control embryos, they appear morphologically normal according to the criteria defined for the rabbit. The relationship between the size of the appendices embryonic and that of the fetus is roughly equivalent for embryos obtained by fertilization or by partheno ~ enesis.
Thus, it seems that the eneral development of embryos parthenogenetics, the fetus and its trophoblastic tissue is slowed down.
Dead fetuses have several anomalies and it was not possible to classify them.

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~ O ~ 1/13977 P ~ / FR91 / 00200 Table I -Effect of the presence of calcium ions and duration of the electrical pulse on activation of rabbit oocytes Duration Number Number%% oocytes activated with pulse rate of activated Iyses oocytes (%) I PN + PBI 2PN 2PN #
(~ s) ~ PB2 ~ PB I -PB I

200 ~ s 47 0 (0) 13 83 17 0 300 ~ s 99 0 (0) 62 68 25 7 60011s 85 0 (0) 98 71 19 ~ 10 900 ~ s 63 0 (0) 100 62 14 24 1,200 lls 97 5 ~ 5) 100 57.29 14 l 5 1,500 ~ s 50 3 ~ 6) 100 30 l ~ 53 Table 2 - Effect of modulation of the electric field on activation Treatment Number%% oocytes activated with. i ovulation activation I PN + PBl 2PN 2PN #
~ PB2 ~ PBI -PBl::

11 15l 99 89 9 111 l 18 lO0 91 9 0 IV 96 l00 70 25 5 # Abnormal pronuclei, small micronuclei i ~

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~ VO 91/13977 2 a ~ / FR9l / 002oo Table 3 -Effect of electric field modulation on egg development in vitro parthenogenetics Treatment Number, 6 Number Number Number cultured oocyte activa_on! norulae blastocysts compact (/ 0) (6) 98 91 69 25 (36) 23 (33) 111 352 100 244 244 (100) 216 (88) Table 4 -15 Post-implantation development: ion of parthenogenetic eyes subject to treatment 111.

Day of autopsy D 8-9 J 9-10 J10-11 J 12-13 Total Number of eggs ~: transferred 21 26 50 68 165 , ~
, Number of plans-tations 9 3 15 23 50 , cumulative% (42.8) ~ 21.2) (27.8) (30.3) . ', Number of fetuses - alive 8 3 7 0 18 .
. ~ cumulative% (88.8) (91.6) (66.6) (36) ': "
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3 8 , /0 91/13977 PCr/FR91/00200 DEVELOPPEMENT PARTHENOGETIQUE

Des ovocytes fraIchement collectés (13 h après la saillie avec un mâle vasectomisé) son; soumis à un traitement standard comprenant 22 impulsions tune tou~es les 4 minutes) et dont leur durée totale est égale à
22 47511s (référence de travail: lex 1370).
La concentration en calcium dans la solution dtimpulsion est I'unique variable. Cinq valeurs ont été choisies: 10, 12, 14, 16, 18, 25l1M de calcium. Le tableau ci-dessous récapitule les résultats. ;
' __ Nb d~ N~ N~ Nb de ~ T~ Nb Nb ~au!~ Nb T~us Ta~
c~ um tr~nstor~ o-uh oouf~ r-c~ d~ d'oeuh d'im~ d'im- ~o~ to~ h~
1 5 par vw~ ~ sur 10~ plan- pl~n~ v~v~n~
~ 9~ t~on r~c~u ta~ian~ t~on vau~o d~L$ s~
_ , _ _ __ q~d~ ~. .
1 011M 2 61 31 1 50~C 31 2 6% 1 3~/. 3Y.
1 2IJM 3 79 26 3 100~ 79 29 37Y~, 16 ~% 0%
1 4uM _ 4 90 23 4 1~% 90 28 31% 19 21% 7%
2 0 1 ~uM 7 89 13 ~ 86% 81 31 3~% 21 26YI, 23Yo . . 1 8L~M 4 85 21 1 25Yo 3C'7 3 1 OY9 3 1 0Q~O 1 0Y, 20~YM 3 80 20 2 67% 49 9 18% 5 t 0!-~ o~
totat 2:~ ~ 4% 381~ 102 29% 6S 64Y~ ~3-S -', Sur un total de 23 transplantation, le taux de gestation global, ;~ 30 tous traitements confondus, est de 74 %. Parmi les receveuses qui sont devenues gravides, le taux d'implantation enregistre au 1,5e jour de .-~
gestation (la durée de gestation chez la lapine est de 29 jours) est de 28 %.

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- ., 78~
~0 91/13977 PCI /FIR91/00200 2l~

~; La présence de foetus a pu être observée dans 64 % des cas e~ 28 %
d'entre eux étaient encore vivants au moment cle l'autopsie. Ces résultats globau~ sont nettement au-dessus des résultats obtenus par les méthodes classiques: chez les souris, I'obtention de foetus à ~ll est très rare, 5Toutefois, le resultat le plus important réside dans l'effet de la concentra~ion en calcium au moment des impulsions sur le dévelop-~;~ pement post-implantatoire. La figure 2 montre clairement que les taux d'implantation et de survie à Jll dépendent directement de ce paramètre.
Le développement optimum a été obtenu avec une concentration de 1611M.
lODans ce cas, nous avons obtenu un taux d'implantation record de 38 % (31 implantations sur 81 oeufs transplantés), dont 26 % de foetus. La comparaison morphologique des différents foetus obtenus révèle que c'est avec 16~M de calcium que les foetus ont la taille la plus grande.
Par ailleurs, nous avons observé que la presence de milieu de ISculture résiduel dans la proportion de ItlOOOO en plus des 1611M de calcium est capable de modifier considérablement le développement car les annexes embryonnaires se développent mais les foe~us sont pratiquement inexis-tants.
Les paramètres de lavage doivent donc permettre de limiter la 20présence de milieu de culture résiduel au moment des impulsions. La présence de milieu résiduel augmente le nombre d'espèces ioniques susceptibles de pénétrer dans l'ovocyte au moment de l'électroperméabi-.Iisa~ion de la membrane.
''; ~' ACTIV~TION DE L'OVOCYTE DE~ SC)URIS FRAICHEMENT OVULE

: ~Des ovocytes de souris fraîchement ovulés (l2 h post HCG) 30 sont soumis à des traitements comprenant 33 impulsions, une toutes les 4 minutes durant 2 heures i2 minutes.
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`-j 2~78138 ,~Cl3 91~13977 25 PCr~FR91~00200 Les ~raitements sont menés pour des concen~ra~ions en calcium dans la solution d'impulsion valant successivement 4~3M, 8~3M, 12~3.~,t,et 1 6u~1 et pour des durées d'impulsions ~ariables.
Les dvnamiql.3es de formation du pronucleus peuvent ê~re 5 contrôlées en fonction de la concentra~ion en calcium dans la solution d'impulsion et la durée tota'3e des impulsions électriques (Vitullo, Ozil.
-: 1991) .

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Freshly collected oocytes (13 h after the mating with a male vasectomized) sound; undergoing standard treatment including 22 pulses tune every 4 minutes) and whose total duration is equal to 22 47511s (working reference: lex 1370).
The calcium concentration in the pulse solution is The only variable. Five values were chosen: 10, 12, 14, 16, 18, 25l1M de calcium. The table below summarizes the results. ;
'' __ Nb d ~ N ~ N ~ Nb from ~ T ~ Nb Nb ~ au! ~ Nb T ~ us Ta ~
c ~ um tr ~ nstor ~ o-uh oouf ~ rc ~ d ~ d'euh im ~ im- ~ o ~ to ~ h ~
1 5 by vw ~ ~ out of 10 ~ plan- pl ~ n ~ v ~ v ~ n ~
~ 9 ~ t ~ on r ~ c ~ u ta ~ ian ~ t ~ on vau ~ od ~ L $ s ~
_, _ _ __ q ~ d ~ ~. .
1 011M 2 61 31 1 50 ~ C 31 2 6% 1 3 ~ /. 3Y.
1 2IJM 3 79 26 3 100 ~ 79 29 37Y ~, 16 ~% 0%
1 4uM _ 4 90 23 4 1 ~% 90 28 31% 19 21% 7%
2 0 1 ~ uM 7 89 13 ~ 86% 81 31 3 ~% 21 26YI, 23Yo . . 1 8L ~ M 4 85 21 1 25Yo 3C'7 3 1 OY9 3 1 0Q ~ O 1 0Y, 20 ~ YM 3 80 20 2 67% 49 9 18% 5 t 0! - ~ o ~
totat 2: ~ ~ 4% 381 ~ 102 29% 6S 64Y ~ ~ 3-S -', Out of a total of 23 transplants, the overall pregnancy rate, ; ~ 30 all treatments combined, is 74%. Among the recipients who are become pregnant, the implantation rate registers at the 1.5th day of .- ~
gestation (the gestation period in rabbits is 29 days) is 28%.

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-., 78 ~
~ 0 91/13977 PCI / FIR91 / 00200 2l ~

~; The presence of a fetus could be observed in 64% of cases e ~ 28%
of them were still alive at the time of the autopsy. These results globau ~ are clearly above the results obtained by the methods conventional: in mice, obtaining fetuses at ~ ll is very rare, 5However, the most important result is the effect of the calcium concentration ~ at the moment of the impulses on the develop-~; ~ post-implantation. Figure 2 clearly shows that the rates implantation and Jll survival depend directly on this parameter.
The optimum development was obtained with a concentration of 1611M.
lIn this case, we achieved a record implantation rate of 38% (31 implantations on 81 transplanted eggs), 26% of which are fetuses. The morphological comparison of the different fetuses obtained reveals that it is with 16 ~ M of calcium the fetuses are the largest.
Furthermore, we observed that the presence of Residual culture in the proportion of ItlOOOO in addition to the 1611M of calcium is able to modify development considerably since the appendices embryonic develop but the foe ~ us are practically inexistent aunts.
The washing parameters must therefore make it possible to limit the 20 presence of residual culture medium at the time of the pulses. The presence of residual medium increases the number of ionic species likely to enter the oocyte when electropermeabi-.Iisa ~ ion of the membrane.
''; ~ ' ACTIVITY OF THE OVOCYTE OF ~ SC) URIS FRESHLY OVULATED

: ~ Freshly ovulated mouse oocytes (12 h post HCG) 30 are subjected to treatments comprising 33 pulses, one every 4 minutes for 2 hours i2 minutes.
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`-j 2 ~ 78138 , ~ Cl3 91 ~ 13977 25 PCr ~ FR91 ~ 00200 The ~ raitements are carried out for concen ~ ra ~ ions in calcium in the pulse solution successively worth 4 ~ 3M, 8 ~ 3M, 12 ~ 3. ~, t, and 1 6u ~ 1 and for pulse durations ~ ariable.
Pronucleus formation dvnamiql.3es may be re ~
5 controlled according to the concentration ~ calcium ion in the solution of impulse and the total duration of electrical impulses (Vitullo, Ozil.
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Claims (26)

REVENDICATIONS 1. Procédé de stimulation artificielle d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène. 1. Method of artificial stimulation of a set of cells reproducing the effect of a biochemical regulatory mechanism, controlled under natural physiological conditions by an oscillator internal, characterized in that it comprises the following stages:
a) the cells are placed in culture in vitro for a determined time, b) the cells are placed in the pulse medium, after elimination of the culture centre, c) the cells are subjected to a pulse generated by an electric field, d) the cells are again placed in the culture medium, e) the preceding steps are repeated a number of times, f) cells are obtained in a homogeneous activated state. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'applique à des ovocytes animaux fraîchement ovulés. 2. Method according to claim 1, characterized in that applies it to freshly ovulated animal oocytes. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérise en ce que l'impulsion provient d'un champ de 1 à 3 kV.cm-1. 3. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the pulse comes from a field of 1 to 3 kV.cm-1. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'impulsion de champ électrique a une durée de 10 µs à 2000 µs. 4. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the electric field pulse has a duration of 10 µs to 2000 µs. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fréquence des impulsions est modulée par la durée entre deux lavages. 5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the pulse frequency is modulated by the duration between two washes. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de stimulation. 6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the frequency and duration of the pulses may vary over the different stages of the same stimulation process. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'un milieu sensiblement non ionique. 7. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the pulse medium consists of a substantially non-medium ionic. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion contient un ion ou un mélange d'ions, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe, qui va pénétrer dans la cellule traitée. 8. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the pulse medium contains an ion or a mixture of ions, a molecule, a complex chemical or biological substance, which will penetrate in the treated cell. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé pénétrant dans la cellule a un rôle de messager. 9. Method according to claim 8, characterized in that the compound entering the cell has a messaging role. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé
en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'une solution isotonique de glucose et contient des ions Ca2+. 10. Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that the pulse medium consists of an isotonic solution of glucose and contains Ca2 + ions. Il. Procédé selon l'une des revendication 1 à 10, caractérisé
en ce que la concentration en ions Ca2+ est comprise entre 8 et 30 µM. He. Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that the concentration of Ca2 + ions is between 8 and 30 µM. 12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé
en ce que les ovocytes sont traités par un inhibiteur de l'expulsion du globule polaire et constitueront une population d'oeufs parthénogénétiques diploïdes. 12. Method according to one of claims 6 to 11, characterized in that the oocytes are treated with an inhibitor of the expulsion of polar body and will constitute a population of parthenogenetic eggs diploids. 13. Procédé selon les revendications 1 et 3 à 11, caractérisé
en ce qu'après l'étape f) on prélève les chromosomes de l'ovocyte, sous le deuxième globule polaire, ces ovocytes servant ensuite de récepteur pour une greffe de noyau provenant d'embryons à cloner. 13. Method according to claims 1 and 3 to 11, characterized in that after step f) the chromosomes are removed from the oocyte, under the second polar body, these oocytes then serving as receptors for a nucleus transplant from embryos to be cloned. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé
en ce que les cellules traitées sont des oeufs greffés. 14. Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that the treated cells are grafted eggs. 15. Dispositif destiné notamment à la culture des ovocytes, permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à
14, du type comportant au moins une enceinte destinée à recevoir les ovocytes, ladite enceinte comportant au moins une arrivée de fluide et une sortie de fluide, caractérisé en ce que à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des ovocytes et en ce que le fluide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des ovocytes sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement, et en ce que l'enceinte comporte deux parois latérales sur lesquelles sont placées des électrodes. 15. Device intended in particular for the culture of oocytes, allowing the implementation of the method according to one of claims 1 to 14, of the type comprising at least one enclosure intended to receive the oocytes, said enclosure comprising at least one fluid inlet and one fluid outlet, characterized in that at the bottom of the enclosure there are one or more orifices the geometry of which is such that opposes the passage of oocytes and in that the fluid entering the enclosure is removed, at least in part, through the orifices, creating a depression such as to substantially block the oocytes on the orifice (s), part of the fluid being discharged by overflow, and in that the enclosure has two side walls on which are placed electrodes. 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que les électrodessont parallèles, et en ce que le ou les orifices sont alignés à
égale distance des électrodes. 16. Device according to claim 15, characterized in that the electrodes are parallel, and in that the orifice (s) are aligned with equal distance from the electrodes. 17. Dispositif selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux arrivées de fluide. 17. Device according to one of claims 15 and 16, characterized in that it comprises at least two fluid inlets. 18. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que les deux arrivées de fluide sont superposées. 18. Device according to one of claims 15 to 17, characterized in that the two fluid inlets are superimposed. 19. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 15, caractérisé en ce que l'orifice est un orifice unique constitué par une fente rectiligne dont la largeur est inférieure au diamètre des ovocytes et dont la longueur permet de traiter dans la même enceinte un grand nombre d'ovocytes. 19. Device according to one of claims 15 to 15, characterized in that the orifice is a single orifice constituted by a slot straight whose width is less than the diameter of the oocytes and whose the length allows to treat in the same enclosure a large number oocytes. 20. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'enceinte peut être isolée et placée dans une atmosphère de composition définie et/ou stérile. 20. Device according to one of claims 15 to 19, characterized in that the enclosure can be isolated and placed in a atmosphere of defined and / or sterile composition. 21. Dispositif selon l'une des revendication 15 à 20, caractérisé en ce que le fluide arrive dans l'enceinte par une tubulure courte, après passage par un système évitant l'arrivée de bulles de gaz de taille importante. 21. Device according to one of claims 15 to 20, characterized in that the fluid arrives in the enclosure by a tube short, after passing through a system preventing the arrival of gas bubbles from large size. 22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que le système est constitué d'un ballon de verre dans lequel arrive le fluide et d'une tuyauterie d'évacuation qui comprend un tube perforé de trous de très petit diamètre qui débouchent au voisinage du centre du ballon, ladite tuyauterie se raccordant sur la tubulure. 22. Device according to claim 21, characterized in that the system consists of a glass balloon into which the fluid arrives and discharge piping which includes a tube perforated with very small diameter which open in the vicinity of the center of the ball, said piping connecting to the tubing. 23. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que l'arrivée supérieure permet l'injection de milieu d'impulsion et en ce que l'arrivée inférieure est munie d'un système d'aspiration permettant la succion d'une petite quantité du milieu d'impulsion, lors de l'injection dudit milieu d'impulsion. 23. Device according to one of claims 15 to 22, characterized in that the upper inlet allows the injection of medium impulse and in that the lower inlet is fitted with a system suction allowing the suction of a small amount of the medium pulse, during the injection of said pulse medium. 24. Dispositif selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions arrivant dans les électrodes sont variables et gérées par un système électronique. 24. Device according to one of claims 16 to 23, characterized in that the frequency, duration and intensity of the pulses arriving in the electrodes are variable and managed by a system electronic. 25. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il permet de réaliser l'alignement des ovocytes et la fusion cellulaire par action d'une impulsion calibrée, générée par un champ électrique. 25. Device according to one of claims 15 to 24, characterized in that it allows the alignment of the oocytes and the cell fusion by action of a calibrated pulse, generated by a field electric. 26. Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que le traitement de fusion cellulaire est automatiquement géré par un système électronique. 26. Device according to claim 25, characterized in that cell fusion processing is automatically managed by a system electronic.