BRPI9816369B1 - FERMENTATIVE PRODUCTION OF USEFUL INDUSTRIAL COMPOUNDS USING CHEMICALLY DEFINED MEDIA - Google Patents
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Description
PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE COMPOSTOS ÚTEIS EM ESCALA INDUSTRIAL USANDO MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS (Pedido dividido do PI 9807362-1, depositado em 20/02/1998) Campo da Invenção A presente invenção se refere ao campo da fermentação, isto é, à produção fermentativa de compostos úteis, como metabólitos primários ou secundários, proteínas ou peptídeos farmacêuticos ou enzimas industriais.FERMENTATIVE PRODUCTION OF INDUSTRIAL SCALE USE COMPOUNDS USING CHEMICALLY DEFINED MEDIA (Split Order PI 9807362-1, filed 02/20/1998) Field of the Invention The present invention relates to the field of fermentation, that is, to the fermentative production of compounds. such as primary or secondary metabolites, pharmaceutical proteins or peptides, or industrial enzymes.
Fundamentos da Invenção Muitos compostos úteis são fabricados por produção fermentativa em grandes fermentadores em escala industrial, isto é, o microorganismo que produz um composto útil de interesse é cultivado sob condições controladas, em um fermentador de 10 a 300 m3. Nos atuais processos de fermentação em escala industrial, o organismo de produção é tipicamente fermentado em um meio de fermentação complexo. Entende-se como meio complexo, um meio compreendendo uma fonte de nitrogênio e/ou carbono complexa, como farelo de soja, farelo de semente de algodão, líquor de infusão de milho, extrato de levedura, hidrolisado de caseína, melado e outros.Background of the Invention Many useful compounds are manufactured by fermentative production in large industrial scale fermenters, that is, the microorganism that produces a useful compound of interest is cultivated under controlled conditions in a 10 to 300 m3 fermenter. In today's industrial scale fermentation processes, the production organism is typically fermented in a complex fermentation medium. A complex medium means a medium comprising a source of complex nitrogen and / or carbon, such as soybean meal, cottonseed meal, corn infusion liquor, yeast extract, casein hydrolyzate, molasses and others.
As vantagens de meios complexos são que as matérias-primas complexas constituintes não são caras, estão prontamente disponíveis e formam uma fonte de nutrientes completa ou quase completa para o microorganismo, contendo uma fonte de carbono e nitrogênio, assim como vitaminas e minerais. Além disso, a mistura de macromoléculas biológicas presentes em matérias-primas complexas, como proteínas, carboidratos, lipídios e outras, precisam ser degradadas por enzimas excretadas pelo microorganismo antes de seu consumo. Em consequência, pequenas moléculas consumíveis se tornam disponíveis uniformemente por todo o fermentador e durante o processo de fermentação, evitando dessa forma, gradientes de concentração e problemas de mistura e mantendo o nível dessas pequenas moléculas consumíveis abaixo de concentrações repressoras. Além disso, essas macromoléculas, assim como ácidos orgânicos também presentes em meios complexos, conferem ao meio uma capacidade de tamponamento, facilitando, dessa maneira, o controle do pH.The advantages of complex media are that the constituent complex raw materials are not expensive, readily available and form a complete or nearly complete source of nutrients for the microorganism, containing a source of carbon and nitrogen, as well as vitamins and minerals. In addition, the mixture of biological macromolecules present in complex raw materials, such as proteins, carbohydrates, lipids and others, must be degraded by enzymes excreted by the microorganism before their consumption. As a result, small consumable molecules become uniformly available throughout the fermenter and during the fermentation process, thereby avoiding concentration gradients and mixing problems and keeping the level of these small consumable molecules below repressive concentrations. Moreover, these macromolecules, as well as organic acids also present in complex media, give the medium a buffering capacity, thus facilitating pH control.
Além dessas vantagens, meios de fermentação complexos têm várias desvantagens importantes. De maneira mais importante, matérias-primas complexas têm uma composição quimicamente indefinida e uma qualidade variável, por exemplo, devido a variações sazonais e a diferentes origens geográficas. Como a composição de meios de fermentação tem uma influência importante sobre os parâmetros de fermentação, como viscosidade, transferência de calor e transferência de oxigênio, matérias-primas complexas são uma importante causa de variabilidade no processo. Além disso, prejudica o processamento a jusante e podem influenciar de maneira adversa a qualidade do produto final. Por exemplo, caldos de fermentação, em particular de microorganismos filamentosos, podem apresentar uma menor capacidade de filtração quando se usam matérias-primas complexas.In addition to these advantages, complex fermentation media have several important disadvantages. More importantly, complex raw materials have a chemically undefined composition and varying quality, for example due to seasonal variations and different geographical origins. Because the composition of fermentation media has an important influence on fermentation parameters such as viscosity, heat transfer and oxygen transfer, complex raw materials are a major cause of process variability. In addition, it impairs downstream processing and may adversely influence the quality of the final product. For example, fermentation broths, in particular filamentous microorganisms, may have a lower filtration capacity when using complex raw materials.
Matérias-primas complexas também podem conter compostos que, indesejavelmente, se acumulam no ou são co-isolados com o produto final. Metais pesados, pesticidas ou herbicidas são exemplos de compostos indesejáveis que podem estar presentes em matérias-primas complexas. Além disso, matérias-primas complexas podem conter ou podem levar a formação de toxinas.Complex raw materials may also contain compounds that undesirably accumulate in or are co-isolated with the final product. Heavy metals, pesticides or herbicides are examples of undesirable compounds that may be present in complex raw materials. In addition, complex raw materials may contain or may lead to toxin formation.
Desvantagens adicionais são que meios complexos geram um cheiro desagradável durante a esterilização e produzem correntes de refugos indesejáveis. A despeito das desvantagens acima identificadas em associação com o uso de meios complexos, esses meios ainda são preferidos para processos de fermentação industrial em grande escala. Há várias razões pelas quais meios não contendo matérias-primas complexas, isto é, meios quimicamente definidos, não foram considerados para uso em processos de fermentação em escala industrial. Uma razão óbvia e encontrada nas vantagens associadas ao uso de meios complexos. De maneira mais importante, os rendimentos de produtos que seriam obtidos com o uso de meios quimicamente definidos em escala industrial foram tipicamente considerados como substancialmente menores que os obtidos usando-se meios contendo matérias-primas complexas. Além disso, cepas microbianas altamente produtoras, que foram desenvolvidas para processos industriais em meios complexos, podem não reter seu bom desempenho em meios quimicamente definidos. Uma razão para o desempenho insatisfatório em um meio quimicamente definido pode ser que as atuais cepas industriais sofreram varias rodadas de mutagênese e seleção, sem consideração de seu desempenho em meios quimicamente definidos.Further disadvantages are that complex media generate an unpleasant smell during sterilization and produce undesirable waste streams. Despite the disadvantages identified above in connection with the use of complex media, these media are still preferred for large scale industrial fermentation processes. There are several reasons why media not containing complex raw materials, ie chemically defined media, have not been considered for use in industrial scale fermentation processes. An obvious reason is found in the advantages associated with the use of complex media. More importantly, product yields that would be obtained using chemically defined media on an industrial scale were typically considered to be substantially lower than those obtained using media containing complex raw materials. In addition, highly producing microbial strains that have been developed for industrial processes in complex media may not retain their good performance in chemically defined media. One reason for poor performance in a chemically defined medium may be that current industrial strains have undergone several rounds of mutagenesis and selection without regard to their performance in chemically defined media.
Meios quimicamente definidos foram aplicados, até agora, apenas para fins de pesquisa, isto é, culturas laboratoriais em placas de petri e/ou balões com agitação, ou em uma escala fermentativa relativamente pequena, tipicamente não excedendo um volume de cerca de 20 - 40 1. Veja, por exemplo, a produção fermentativa de metabólitos secundários, como penicilina (Jarvis e Johnson, J. Am. Chem. Soc. 69, 3010 - 3017 (1947); Stone e Farrell, Science 104, 445 - 446 (1946); White et al., Arch. Biochem. 8 , 303 - 309 (1945)), ácido clavulânico (Romero et al., Appl. Env. Microbial. 52, 892 - 897 ( 1986)) e eritromicina (Bushell et al., Microbial. 143, 475 - 480 (1997)).Chemically defined media have so far been applied for research purposes only, ie laboratory cultures in petri dishes and / or shake flasks, or on a relatively small fermentative scale, typically not exceeding a volume of about 20-40 µm. 1. See, for example, the fermentative production of secondary metabolites such as penicillin (Jarvis and Johnson, J. Am. Chem. Soc. 69, 3010-3017 (1947); Stone and Farrell, Science 104, 445-446 (1946). ); White et al., Arch. Biochem. 8, 303-309 (1945)), clavulanic acid (Romero et al., Appl. Env. Microbial. 52, 892 - 897 (1986)) and erythromycin (Bushell et al. Microbial 143, 475-480 (1997)).
Entretanto, investigações referentes ao usa de meios quimicamente definidos nessas pequenas escalas de pesquisa não proporcionam nenhum ensinamento para aqueles versados na técnica quanto à aplicabilidade desses meios a processos de fermentação industrial em grande escala para fins de produção, tipicamente com uma escala de volume de cerca de 10 m3 ou mais.However, investigations into the use of chemically defined media in these small research scales provide no teaching for those skilled in the art as to the applicability of these media to large scale industrial fermentation processes for production purposes, typically with a volume scale of about 10 m3 or more.
Para evitar os problemas associados ao uso de receitas convencionais para meios complexos na atual prática industrial, seria desejável aplicar receitas quimicamente definidas a fermentações em escala industrial.To avoid the problems associated with using conventional recipes for complex media in current industrial practice, it would be desirable to apply chemically defined recipes to industrial scale fermentations.
Aqui, descrevemos o uso de meios quimicamente definidos para processos de fermentação em escala industrial, que permitem - em combinação com uma cepa adequada - a produção de compostos úteis, como metabólitos primários ou secundários, proteínas ou peptídios farmacêuticos, ou enzimas industriais, em um rendimento economicamente atraente.Here we describe the use of chemically defined media for industrial scale fermentation processes which allow - in combination with a suitable strain - the production of useful compounds, such as primary or secondary metabolites, pharmaceutical proteins or peptides, or industrial enzymes, in a economically attractive yield.
Sumário da Invenção A presente invenção apresenta um processo industrial para a produção de um composto útil, compreendendo as etapas de fermentação de uma cepa microbiana em um meio de fermentação que seja um meio quimicamente definido, essencialmente composto por constituintes quimicamente definidos, e de recuperação do composto útil do caldo de fermentação. A presente invenção também apresenta um processo para a preparação e/ou aperfeiçoamento de uma cepa microbiana produtora de um composto útil de interesse, que seja capaz de ser fermentada em escala industrial em um meio quimicamente definido, compreendendo as etapas de: submissão de uma cepa de origem adequada a um tratamento mutagênico selecionado no grupo dos meios físicos e mutagênicos químicos, e/ou transformação de DNA, - triagem dos mutantes e/ou transformantes resultantes quanto ao seu desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido e seu nível de produção do composto útil de interesse, - seleção de mutantes com um desempenho de crescimento similar ou melhor em um meio quimicamente definido e/ou melhor nível de produção do composto útil de interesse, em comparação com a cepa de origem.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides an industrial process for producing a useful compound comprising the steps of fermentation of a microbial strain in a fermentation medium that is a chemically defined medium consisting essentially of chemically defined constituents and of recovering the same. useful compound of the fermentation broth. The present invention also provides a process for the preparation and / or enhancement of a microbial strain producing a useful compound of interest which is capable of being fermented on an industrial scale in a chemically defined medium, comprising the steps of: submitting a strain suitable for a mutagenic treatment selected from the group of physical and chemical mutagenic media, and / or DNA transformation, - screening of the resulting mutants and / or transformants for their growth performance in a chemically defined medium and their level of production. useful compound of interest, - selection of mutants with similar or better growth performance in a chemically defined medium and / or better level of production of the useful compound of interest as compared to the source strain.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção descreve o uso de meios de fermentação quimicamente definidos para a fermentação em escala industrial de uma cepa microbiana adequada, a cepa microbiana adequada sendo capaz de produzir um composto útil. ' Em toda a descrição da invenção1, um processo de fermentação em escala industrial ou processo industrial deve ser entendido como englobando um processo de fermentação em uma escala de volume que seja > 10 m3, de preferência > 25 m3, mais preferivelmente > 50 m3, mais preferivelmente ainda > 100 m3. O termo "quimicamente definido" deve ser entendido como sendo usado para meios de fermentação que sejam essencialmente compostos por constituintes quimicamente definidos. Um meio de fermentação que seja essencialmente composto por constituintes quimicamente definidos inclui um meio que não contenha uma fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa, isto é, que não contenha matérias-primas complexas com uma composição quimicamente indefinida. Um meio de fermentação que seja essencialmente composto por constituintes quimicamente definidos também pode incluir um meio que compreenda uma quantidade essencialmente pequena de uma fonte de nitrogênio e/ou carbono complexa, uma quantidade, conforme definida abaixo, que tipicamente não seja suficiente para manter o crescimento do microorganismo e/ou garantir a formação de uma quantidade suficiente de biomassa.Detailed Description of the Invention The present invention describes the use of chemically defined fermentation media for the industrial scale fermentation of a suitable microbial strain, the appropriate microbial strain being capable of producing a useful compound. Throughout the description of the invention, an industrial scale fermentation process or industrial process should be understood to encompass a volume scale fermentation process that is> 10 m3, preferably> 25 m3, more preferably> 50 m3, more preferably still> 100 m3. The term "chemically defined" is to be understood to be used for fermentation media that are essentially composed of chemically defined constituents. A fermentation medium that is essentially composed of chemically defined constituents includes a medium that does not contain a complex carbon and / or nitrogen source, that is, which does not contain complex raw materials of chemically undefined composition. A fermentation medium that is essentially composed of chemically defined constituents may also include a medium comprising an essentially small amount of a complex nitrogen and / or carbon source, an amount as defined below that is typically not sufficient to maintain growth. microorganism and / or to ensure that sufficient biomass is formed.
Com relação a isso, matérias-primas complexas têm uma composição quimicamente indefinida devido ao fato de, por exemplo, essas matérias-primas conterem muitos compostos diferentes, dentre os quais compostos heteropoliméricos complexos, e terem uma composição variável devido a variações sazonais e diferenças de origem geográfica. Exemplos típicos de matérias-primas complexas que funcionam como fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa na fermentação são farelo de soja, farelo de semente de algodão, líquor de infusão de milho, extrato de levedura, hidrolisado de caseína, melado e outras.In this regard, complex raw materials have a chemically undefined composition because, for example, these raw materials contain many different compounds, including complex heteropolymeric compounds, and have variable composition due to seasonal variations and differences in geographical origin. Typical examples of complex raw materials that function as a source of complex carbon and / or nitrogen in fermentation are soybean meal, cottonseed meal, corn infusion liquor, yeast extract, casein hydrolyzate, molasses and others.
Uma quantidade essencialmente pequena de uma fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa pode estar presente no meio quimicamente definido de acordo com a invenção, por exemplo, como resquício do inóculo para a fermentação principal. O inóculo para a fermentação principal não e necessariamente obtido por fermentação em um meio quimicamente definido. Mais frequentemente, resquícios do inóculo serão detectáveis pela presença de uma pequena quantidade de uma fonte de nitrogênio complexa no meio quimicamente definido para a fermentação principal.An essentially small amount of a complex carbon and / or nitrogen source may be present in the chemically defined medium according to the invention, for example as an inoculum remnant for the main fermentation. The inoculum for the main fermentation is not necessarily obtained by fermentation in a chemically defined medium. More often, remnants of the inoculum will be detectable by the presence of a small amount of a complex nitrogen source in the chemically defined medium for the main fermentation.
Pode ser vantajoso usar uma fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa no processo de fermentação do inóculo para a fermentação principal, por exemplo, para acelerar a formação de biomassa, isto é, para aumentar a taxa de crescimento do microorganismo e/ou facilitar o controle do pH interno. Pela mesma razão, pode ser vantajoso adicionar uma quantidade essencialmente pequena de uma fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa, por exemplo, extrato de levedura, ao estágio inicial da fermentação principal, particularmente para acelerar a formação de biomassa no estágio inicial do processo de fermentação.It may be advantageous to use a complex carbon and / or nitrogen source in the inoculum fermentation process for the main fermentation, for example to accelerate biomass formation, i.e. to increase the growth rate of the microorganism and / or facilitate internal pH control. For the same reason, it may be advantageous to add an essentially small amount of a complex carbon and / or nitrogen source, for example yeast extract, to the early stage of the main fermentation, particularly to accelerate biomass formation at the early stage of the fermentation process. fermentation.
Uma quantidade essencialmente pequena de uma fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa que possa estar presente no meio quimicamente definido de acordo com a invenção e definida como sendo uma quantidade de no máximo cerca de 10 % da quantidade total de carbono e/ou nitrogênio (Kjeldahl N) que está presente no meio quimicamente definido, de preferência uma quantidade de no máximo 5% da quantidade total de carbono e/ou nitrogênio, mais preferivelmente uma quantidade de no máximo 1% da quantidade total de carbono e/ou nitrogênio. Mais preferivelmente, nenhuma fonte de carbono e/ou nitrogênio complexa esta presente no meio quimicamente definido de acordo com a invenção.An essentially small amount of a complex carbon and / or nitrogen source that may be present in the chemically defined medium according to the invention and defined as an amount of at most about 10% of the total amount of carbon and / or nitrogen ( Kjeldahl N) which is present in the chemically defined medium, preferably an amount of at most 5% of the total amount of carbon and / or nitrogen, more preferably an amount of at most 1% of the total amount of carbon and / or nitrogen. More preferably, no source of carbon and / or complex nitrogen is present in the chemically defined medium according to the invention.
Deve-se entender que o termo "meio quimicamente definido", conforme usado na presente invenção, inclui um meio em que todos os componentes necessários são adicionados ao meio antes do início do processo de fermentação, e também inclui um meio em que parte dos componentes necessários são adicionados antes do início e parte e adicionada ao meio durante o processo de fermentação. A presente invenção também expõe que cepas microbianas são capazes de converter, em escala industrial, as matérias-primas simples dè meios quimicamente definidos em uma quantidade economicamente atraente de produto. Surpreendentemente, descobriu-se que a produtividade de cepas microbianas em meios quimicamente definidos, quando medida em escala industrial, pode ser comparável, ou, em alguns casos, até superior, a sua produtividade em meios complexos.It is to be understood that the term "chemically defined medium" as used herein includes a medium in which all necessary components are added to the medium prior to the start of the fermentation process, and also includes a medium in which part of the components required are added before the start and part and added to the medium during the fermentation process. The present invention also discloses that microbial strains are capable of converting, on an industrial scale, simple raw materials of chemically defined media into an economically attractive amount of product. Surprisingly, it has been found that the productivity of microbial strains in chemically defined media, when measured on an industrial scale, can be comparable, or in some cases even higher, to their productivity in complex media.
Uma vantagem adicional do uso de meios quimicamente definidos e que a transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida e a transferência de dióxido de carbono da fase líquida para a fase gasosa são substancialmente melhoradas em comparação com o uso de meios complexos. Conforme é do conhecimento daqueles versados na técnica, as concentrações de oxigênio dissolvido e de dióxido de carbono dissolvido são dois importantes fatores para o escalonamento de um processo de fermentação, e podem determinar a exeqüibilidade econômica de um processo industrial. A melhor transferência de massa obtida com o uso de meios quimicamente definidos pode ser atribuída a ausência nesses meios de quantidades substanciais de compostos que promovam a coalescência de bolhas de gás. Compostos promotores de coalescência podem ser encontrados, por exemplo, entre certos compostos hidrofóbicos e/ou poliméricos presentes em matérias-primas complexas. A coalescência de bolhas de gás tipicamente resulta em um menor coeficiente de transferência de massa (van't Riet e Tramper, em: Basic Bioreactor Design, pp. 236 - 273 (1991)). A transferência de oxigênio frequentemente é um fator limitativo em processos de fermentação, particularmente em fermentações de microorganismos filamentosos. A melhor capacidade de transferência de oxigênio obtida quando a fermentação é efetuada usando-se um meio quimicamente definido de acordo com a invenção proporciona uma maneira muito mais barata de otimização da produtividade, do que investimentos em equipamentos, como ingresso de energia, enriquecimento com oxigênio do ar de entrada ou pressão do fermentador.An additional advantage of using chemically defined media is that the oxygen transfer from the gas phase to the liquid phase and the carbon dioxide transfer from the liquid phase to the gas phase are substantially improved compared to the use of complex media. As those skilled in the art are aware, dissolved oxygen and dissolved carbon dioxide concentrations are two important factors for the escalation of a fermentation process, and may determine the economic feasibility of an industrial process. The best mass transfer obtained using chemically defined media can be attributed to the absence in these media of substantial amounts of compounds that promote gas bubble coalescence. Coalescing promoting compounds can be found, for example, among certain hydrophobic and / or polymeric compounds present in complex raw materials. Coalescence of gas bubbles typically results in a lower mass transfer coefficient (van't Riet and Tramper, in: Basic Bioreactor Design, pp. 236 - 273 (1991)). Oxygen transfer is often a limiting factor in fermentation processes, particularly in filamentous microorganism fermentations. The improved oxygen transfer capability obtained when fermentation is performed using a chemically defined medium according to the invention provides a much cheaper way to optimize productivity than equipment investments such as energy ingress, oxygen enrichment. inlet air or fermenter pressure.
Em processos de fermentação industrial, microorganismos filamentosos, como bactérias filamentosas, como Actinomycetes, ou fungos filamentosos, como Penicillium ou Aspergillus, são tipicamente cultivados com uma morfologia de pelota. Com relação a isso, proteínas e peptídeos presentes em meios de fermentação complexos têm a tendência a produzir pelotas penugentas, que facilmente se desmancham em micélios dispersados com hifas muito longas e ramificadas, em consequência das altas taxas de crescimento, que são tipicamente obtidas com o uso de meios complexos. Portanto, uma morfologia de pelota penugenta geralmente pode causar uma viscosidade de caldo indesejavelmente alta. O uso de meios quimicamente definidos têm uma influência favorável sobre a morfologia, por exemplo, para produzir uma pelota mais rígida, que não se desmancha facilmente durante a fermentação. Dessa maneira, pode-se obter uma diminuição significativa da viscosidade de caldos de fermentação filamentosos com o uso de meios quimicamente definidos. Como uma baixa viscosidade do caldo de fermentação e vantajosa para a formação do produto, o controle da viscosidade e da maior importância em processos de fermentação em escala industrial.In industrial fermentation processes, filamentous microorganisms such as filamentous bacteria such as Actinomycetes or filamentous fungi such as Penicillium or Aspergillus are typically grown with a pellet morphology. In this regard, proteins and peptides present in complex fermentation media have a tendency to produce fuzzy pellets, which easily dissolve into very long, branched hyphae dispersed as a result of the high growth rates that are typically obtained with the pellet. use of complex media. Therefore, a fuzzy pellet morphology can usually cause an undesirable high broth viscosity. The use of chemically defined media has a favorable influence on morphology, for example to produce a stiffer pellet, which does not easily melt during fermentation. Thus, a significant decrease in the viscosity of filamentous fermentation broths can be achieved by the use of chemically defined media. As a low viscosity fermentation broth and advantageous for product formation, viscosity control is of the utmost importance in industrial scale fermentation processes.
Outra vantagem do uso de meios quimicamente definidos e encontrada no processamento a jusante do produto. Para certas combinações de cepa-produto, particularmente quando cepas filamentosas são fermentadas, o processamento a jusante é significativamente melhorado com o usa de meios quimicamente definidos.Another advantage of using chemically defined media is found in downstream processing of the product. For certain strain-product combinations, particularly when filamentous strains are fermented, downstream processing is significantly improved using chemically defined media.
Um meio quimicamente definido para uso no processo da invenção deve conter, tipicamente, os chamados elementos estruturais e os chamados catalíticos.A chemically defined medium for use in the process of the invention should typically contain so-called structural elements and so-called catalytic elements.
Elementos estruturais são aqueles elementos que são constituintes de macromoléculas microbianas, isto é, hidrogênio, oxigênio, carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre.Structural elements are those elements that are constituents of microbial macromolecules, ie hydrogen, oxygen, carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur.
Os elementos estruturais hidrogênio, oxigênio, carbono e nitrogênio estão tipicamente contidos na fonte de carbono e nitrogênio. Fósforo e enxofre são tipicamente acrescentados como íons fosfato e sulfato e/ou tiossulfato. 0 tipo de fonte de carbono e nitrogênio que é usada no meio quimicamente definido não é crítico para a invenção, contanto que a fonte de carbono·β nitrogênio tenha essencialmente um caráter quimicamente definido.The structural elements hydrogen, oxygen, carbon and nitrogen are typically contained in the carbon and nitrogen source. Phosphorus and sulfur are typically added as phosphate and sulfate and / or thiosulfate ions. The type of carbon and nitrogen source that is used in the chemically defined medium is not critical to the invention as long as the carbon source β nitrogen is essentially chemically defined.
De preferência, seleciona-se uma fonte de carbono no grupo que consiste em carboidratos, como glicose, lactose, frutose, sacarose, maltodextrinas, amido e inulina, glicerol, óleos vegetais, hidrocarbonetos, alcoóis, como metanol e etanol, ácidos orgânicos, como acetato e ácidos alcanóicos superiores. Mais preferivelmente, seleciona-se uma fonte de carbono no grupo que consiste em glicose, sacarose e óleo de soja. Mais preferivelmente ainda, a fonte de carbono é glicose. Deve-se entender que o termo "glicose" inclui xaropes de glicose, isto é, composições de glicose contendo oligômeros de glicose em quantidades definidas. A fonte de nitrogênio é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em uréia, amônia, nitrato, sais de amônio, como sulfato de amônio, fosfato de amônio e nitrato de amônio e aminoácidos, como glutamato e lisina. Mais preferivelmente, a fonte de nitrogênio e selecionada no grupo que consiste em amônia, sulfato de amônio e fosfato de amônio. Mais preferivelmente ainda, a fonte de nitrogênio é amônia. O uso de amônia como a fonte de nitrogênio tem a vantagem de a amônia poder agir, além disso, como um agente de controle do pH. No caso de se usarem sulfato de amônio e/ou fosfato de amônia como fonte de nitrogênio, parte da ou toda a exigênio de enxofre e/ou fósforo do microorganismo pode ser atendida.Preferably, a carbon source is selected from the group consisting of carbohydrates such as glucose, lactose, fructose, sucrose, maltodextrins, starch and inulin, glycerol, vegetable oils, hydrocarbons, alcohols such as methanol and ethanol, organic acids such as acetate and higher alkanoic acids. More preferably, a carbon source is selected from the group consisting of glucose, sucrose and soybean oil. Most preferably, the carbon source is glucose. It is to be understood that the term "glucose" includes glucose syrups, that is, glucose compositions containing glucose oligomers in defined amounts. The nitrogen source is preferably selected from the group consisting of urea, ammonia, nitrate, ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium phosphate and ammonium nitrate and amino acids such as glutamate and lysine. More preferably, the nitrogen source is selected from the group consisting of ammonia, ammonium sulfate and ammonium phosphate. Most preferably, the nitrogen source is ammonia. The use of ammonia as the nitrogen source has the advantage that ammonia can also act as a pH control agent. If ammonium sulfate and / or ammonium phosphate are used as a source of nitrogen, part or all of the microorganism's sulfur and / or phosphorus requirements can be met.
Elementos catalíticos são aqueles elementos que são constituintes de enzimas ou co-fatores de enzimas. Esses elementos são, por exemplo, magnésio, ferro, cobre, cálcio, manganês, zinco, cobalto, molibdênio, selênio, boro.Catalytic elements are those elements that are enzyme constituents or enzyme cofactors. These elements are, for example, magnesium, iron, copper, calcium, manganese, zinc, cobalt, molybdenum, selenium, boron.
Próximo a esses elementos estruturais e catalíticos, cátions, como íons potássio e sódio, devem estar presentes para agirem como um contra-íons e para o controle do pH e osmolaridade intracelular.Next to these structural and catalytic elements, cations such as potassium and sodium ions must be present to act as a counterion and to control pH and intracellular osmolarity.
Compostos que podem ser opcionalmente incluídos em um meio quimicamente definido são agentes quelantes, como ácido cítrico, e agentes de tamponamento, como fosfato de mono- e dipotássio, carbonato de cálcio, e outros. Agentes de tamponamento são adicionados, de preferência, quando se lida com processos sem um controle de pH externo. Além disso, um agente antiespumante pode ser dosado antes do e/ou durante o processo de fermentação.Compounds that may optionally be included in a chemically defined medium are chelating agents, such as citric acid, and buffering agents, such as mono- and dipotassium phosphate, calcium carbonate, and the like. Buffering agents are preferably added when dealing with processes without an external pH control. In addition, a defoaming agent may be dosed prior to and / or during the fermentation process.
Macromoléculas e ácidos orgânicos que estão presentes em meios complexos conferem uma capacidade de tamponamento a esses meios. Devido a ausência desses compostos em meios quimicamente definidos, o controle do pH e mais difícil em meios quimicamente definidos, do que em complexos. A presente · invenção mostra que um controle de pH em que: um ácido ou uma base possa ser dosada, dependendo do desenvolvimento do pH no caldo, permite um perfil de pH apropriado em um processo em escala industrial quimicamente definido.Macromolecules and organic acids that are present in complex media confer buffering capacity to these media. Due to the absence of these compounds in chemically defined media, pH control is more difficult in chemically defined media than in complexes. The present invention shows that a pH control wherein: an acid or base may be metered, depending on the pH development in the broth, permits an appropriate pH profile in a chemically defined industrial scale process.
Vitaminas se referem a um grupo de compostos orgânicos estruturalmente não relacionados, que são necessários para o metabolismo normal de microorganismos. Sabe-se que microorganismos variam amplamente em sua capacidade de sintetizar as vitaminas que requerem. Uma vitamina deve ser adicionada ao meio de fermentação de um microorganismo incapaz de sintetizar essa vitamina. Tipicamente, meios de fermentação quimicamente definidos para leveduras ou bactérias ou para certos fungos inferiores, por exemplo, Mucorales, podem ser suplementados com uma ou mais vitaminas. Fungos superiores mais frequentemente não tem exigências vitamínicas.Vitamins refer to a group of structurally unrelated organic compounds that are required for normal metabolism of microorganisms. Microorganisms are known to vary widely in their ability to synthesize the vitamins they require. A vitamin should be added to the fermentation medium of a microorganism unable to synthesize this vitamin. Typically, chemically defined fermentation media for yeast or bacteria or certain lower fungi, for example Mucorales, may be supplemented with one or more vitamins. Higher fungi most often have no vitamin requirements.
As vitaminas são selecionadas do grupo da tiamina, riboflavina, piridoxal, acido nicotínico ou nicotinamida, ácido pantotênico, cianocobalamina, acido fólico, biotina, ácido lipóico, purinas, pirimidinas, inositol, colina e heminas.The vitamins are selected from the group of thiamine, riboflavin, pyridoxal, nicotinic acid or nicotinamide, pantothenic acid, cyanocobalamin, folic acid, biotin, lipoic acid, purines, pyrimidines, inositol, choline and hemines.
Elementos estruturais e catalíticos e, opcionalmente, vitaminas são necessárias para o crescimento do microorganismo, isto é, para a formação de biomassa. A quantidade de compostos necessários, isto é, compostos compreendendo elementos estruturais e catalíticos e, opcionalmente, vitaminas a serem adicionadas ao meio quimicamente definido dependerá principalmente da quantidade de biomassa que se deva formar no processo de fermentação. A quantidade de biomassa formada pode variar amplamente, tipicamente de cerca de 10 a cerca de 150 g/1 de caldo de fermentação. Em geral, fermentações que produzam uma quantidade de biomassa que seja menor que cerca de 10 g/1 não são industrialmente relevantes.Structural and catalytic elements and optionally vitamins are required for the growth of the microorganism, that is, for the formation of biomass. The amount of compounds required, i.e. compounds comprising structural and catalytic elements and, optionally, vitamins to be added to the chemically defined medium will depend mainly on the amount of biomass to be formed in the fermentation process. The amount of biomass formed may vary widely, typically from about 10 to about 150 g / l fermentation broth. In general, fermentations producing less than about 10 g / l biomass are not industrially relevant.
Além disso, a quantidade ótima de cada constituinte de um meio definido, assim como quais compostos são essenciais e quais não são essenciais dependerá do tipo de microorganismo que é submetido à fermentação em um meio definido, da quantidade de biomassa e do produto a ser formado. O uso de meios quimicamente definidos, portanto, permite vantajosamente a variação da concentração de cada componente do meio, independentemente dos outros componentes, facilitando, dessa maneira, a otimização da composição do meio.In addition, the optimal amount of each constituent of a defined medium, as well as which compounds are essential and which are non-essential, will depend on the type of microorganism that is fermented in a defined medium, the amount of biomass and the product to be formed. . The use of chemically defined media, therefore, advantageously allows for varying the concentration of each medium component independently of the other components, thereby facilitating the optimization of medium composition.
Para a formação do produto, pode ser necessário suplementar o meio quimicamente definido com compostos adicionais e/ou aumentar a concentração de certos compostos já presentes no meio quimicamente definido, acima do nivel que é necessário para o crescimento do microorganismo. A função desses compostos pode ser a de induzir e/ou intensificar a produção de um composto desejado pelo microorganismo, ou podem funcionar como um precursor para um composto desejado.For product formation, it may be necessary to supplement the chemically defined medium with additional compounds and / or to increase the concentration of certain compounds already present in the chemically defined medium above the level required for growth of the microorganism. The function of such compounds may be to induce and / or enhance the production of a desired compound by the microorganism, or may function as a precursor to a desired compound.
Exemplos de compostos a serem suplementados é/ou adicionados em quantidade aumentada a um meio quimicamente definido são: sulfato em uma quantidade aumentada para a produção de compostos de β-lactamo, compostos contendo nitrogênio em uma quantidade aumentada para a produção de aminoácidos, particularmente aminoácidos básicos, acido fenilacético para a produção de penicilina G, acido fenoxiacético para a produção de penicilina V, acido adípico para a produção de adipil-7-ADCA e adipil-7-ACA, acido propiônico para a produção de eritromicina.Examples of compounds to be supplemented and / or added in an increased amount to a chemically defined medium are: sulfate in an increased amount for the production of β-lactam compounds, nitrogen-containing compounds in an increased amount for the production of amino acids, particularly amino acids. basic, phenylacetic acid for the production of penicillin G, phenoxyacetic acid for the production of penicillin V, adipic acid for the production of adipil-7-ADCA and adipil-7-ACA, propionic acid for the production of erythromycin.
Em um processo de fermentação industrial de acordo com a invenção, a quantidade total da fonte de carbono adicionada ao meio quimicamente definido, expressa como quantidade de carbono/litro de meio, pode variar de 10 a 200 g de C/l, de preferência de 20 a 200 g de C/l. A quantidade total de fonte de nitrogênio adicionada ao meio quimicamente definido pode variar de 0,5 a 50 g de N/l, de preferência de 1 a 25 g de N/l, em que N e expresso como nitrogênio Kjeldahl. A razão entre fonte de carbono e de nitrogênio em uma fermentação pode variar consideravelmente, com o que um determinante da razão ótima entre fonte de carbono e de nitrogênio e a composição elementar do produto a ser formado.In an industrial fermentation process according to the invention, the total amount of carbon source added to the chemically defined medium, expressed as amount of carbon / liter of medium, may range from 10 to 200 g of C / l, preferably of 20 to 200 g C / l. The total amount of nitrogen source added to the chemically defined medium may range from 0.5 to 50 g of N / l, preferably from 1 to 25 g of N / l, where N is expressed as Kjeldahl nitrogen. The ratio of carbon to nitrogen source in a fermentation can vary considerably, thus determining the optimal ratio of carbon to nitrogen source to the elemental composition of the product to be formed.
Compostos adicionais requeridos para o crescimento de um microorganismo, como fosfato, sulfato ou elementos residuais, devem ser adicionados usando-se as faixas de concentração indicadas na Tabela 1 como diretriz. As faixas de concentração desses compostos adicionais podem variar entre diferentes classes de microorganismos, isto é, entre fungos, leveduras e bactérias.Additional compounds required for the growth of a microorganism, such as phosphate, sulfate or residual elements, should be added using the concentration ranges given in Table 1 as a guideline. The concentration ranges of these additional compounds may vary between different classes of microorganisms, that is, between fungi, yeast and bacteria.
As concentrações de vitaminas se encontram genericamente na faixa de 0,1 (biotina) a 500 (mioinositol) mg/1.Tipicamente, a quantidade de componentes do meio necessária para o crescimento de um microorganismo pode ser determinada com relação a quantidade de fonte de carbono usada na fermentação, pois a quantidade de biomassa formada será determinada basicamente pela quantidade de fonte de carbono usada.Vitamin concentrations are generally in the range of 0.1 (biotin) to 500 (myoinositol) mg / 1. Typically, the amount of medium components required for the growth of a microorganism can be determined with respect to the amount of source of carbon used in fermentation because the amount of biomass formed will be determined basically by the amount of carbon source used.
Tabela 1. Faixas de concentração típicas de componentes do meio, além da fonte de carbono e nitrogênio, necessários para o crescimento de várias classes de microorganismos (g/1) ·________________________________________________________ 1 A quantidade basal de fosfato necessária será de 0,5 - 1% do peso seco da biomassa. Para processos por bateladas em escala relativamente pequena, fosfato extra será requerido para controle do pH. 2 Sulfato também pode ser dosado com o titulador, como K+ ou Na+. 3 Sulfato pode ser (parcialmente) substituído por cloreto como contra-íon nos elementos residuais, ou vice-versa . 4 Para alguns elementos residuais, limites inferiores são difíceis de definir. Sua exigência, por exemplo, pode ser atendida pela presença em outros componentes do meio, por exemplo, sulfato ferroso, água, pequenas quantidades de extrato de levedura e outros. 5 Fosfato e sulfato são adicionados como sais de potássio, amônio e/ou sódio, com a preferência de K > NH4 > Na.Table 1. Typical concentration ranges of media components, besides carbon and nitrogen source, required for growth of various classes of microorganisms (g / 1) · ________________________________________________________ 1 The basal amount of phosphate required will be 0.5 - 1 % of dry weight of biomass. For relatively small scale batch processes, extra phosphate will be required for pH control. 2 Sulphate can also be dosed with the titrator such as K + or Na +. 3 Sulphate may be (partially) substituted by chloride as counterion in the residual elements, or vice versa. 4 For some residual elements, lower boundaries are difficult to define. Their requirement, for example, can be met by the presence in other components of the medium, for example ferrous sulfate, water, small amounts of yeast extract and others. Phosphate and sulfate are added as potassium, ammonium and / or sodium salts, preferably K> NH 4> Na.
Um processo de fermentação industrial de acordo com a invenção usando um meio quimicamente definido pode ser efetuado como um processo de fermentação por bateladas, bateladas repetidas, bateladas com alimentação, bateladas com alimentação repetida ou contínuo.An industrial fermentation process according to the invention using a chemically defined medium may be carried out as a batch, repeated batch, fed batch, repeated or continuous batch batch fermentation process.
Em um processo por bateladas, todos os componentes do meio são adicionados diretamente, como um todo, ao meio antes do início do processo de fermentação.In a batch process all medium components are added directly as a whole to the medium before the fermentation process begins.
Em um processo por bateladas repetidas, ocorre uma colheita parcial do caldo, acompanhada por uma suplementação parcial do meio completo, opcionalmente repetida várias vezes.In a repeated batch process, a partial stock collection occurs, accompanied by a partial supplementation of the complete medium, optionally repeated several times.
Em um processo por bateladas com alimentação, nenhum ou parte dos compostos compreendendo um ou mais dos elementos estruturais e/ou catalíticos é adicionado ao meio antes do inicio da fermentação, e todos ou a parte restante, respectivamente, dos compostos compreendendo um ou mais dos elementos estruturais e/ou catalíticos e alimentada durante o processo de fermentação. Os compostos que são selecionados para alimentação podem ser alimentados juntos ou separados entre si ao processo de fermentação.In a feed batch process, none or part of the compounds comprising one or more of the structural and / or catalytic elements is added to the medium prior to the start of fermentation, and all or the remainder, respectively, of the compounds comprising one or more of the compounds. structural and / or catalytic elements and fed during the fermentation process. Compounds that are selected for feed may be fed together or separated from each other in the fermentation process.
Particularmente em um processo de fermentação em que o meio de fermentação original e diluído cerca de duas ou mais vezes por uma alimentação de compostos compreendendo um ou mais dos elementos estruturais, a alimentação também pode compreender elementos catalíticos e componentes de meio adicionais, próximo aos elementos estruturais.Particularly in a fermentation process wherein the original fermentation medium is diluted about two or more times by a compound feed comprising one or more of the structural elements, the feed may also comprise additional catalytic elements and media components next to the feed elements. structural.
Em um processo de fermentação por bateladas com alimentação repetidas ou contínuo preferido, o meio de partida completo e adicionalmente alimentado durante a fermentação. O meio de partida pode ser alimentado juntamente com ou separado da(s) alimentação(ões) de elementos estruturais.In a preferred continuous or repeated feed batch fermentation process, the starting medium is complete and additionally fed during fermentation. The starting medium may be fed together with or separate from the structural element feed (s).
Em um processo por bateladas com alimentação repetidas, parte do caldo de fermentação compreendendo a biomassa é removido a intervalos de tempo regulares, ao passo que, em um processo contínuo, a remoção de parte do caldo de fermentação ocorre continuamente. O processo de fermentação é, desse modo, reabastecido com uma porção de meio fresco correspondente a quantidade de caldo de fermentação retirado.In a repeated feed batch process, part of the fermentation broth comprising the biomass is removed at regular intervals, whereas in a continuous process, part of the fermentation broth is removed continuously. The fermentation process is thus replenished with a portion of fresh medium corresponding to the amount of fermentation broth removed.
Em uma modalidade preferida da invenção, aplica-se um processo por bateladas com alimentação ou por bateladas com alimentação repetidas, em que a fonte de carbono e/ou nitrogênio e/ou fosfato são alimentados ao processo de fermentação. Em uma modalidade mais preferida, a fonte dè carbono e nitrogênio e alimentada ao processo de fermentação.In a preferred embodiment of the invention, a feed batch or repeat feed batch process is applied wherein the carbon and / or nitrogen and / or phosphate source is fed to the fermentation process. In a more preferred embodiment, the carbon and nitrogen source is fed to the fermentation process.
Mais preferivelmente, a fonte de carbono e nitrogênio, assim como o fosfato são alimentados. Com relação a isso, uma fonte de carbono preferida é a glicose, e uma fonte de nitrogênio preferida é amônia e/ou sais de amônio. 0 uso de um processo por bateladas com alimentação tipicamente permite o uso de uma quantidade consideravelmente maior de fonte de carbono e nitrogênio do que a usada em um processo por bateladas. Especificamente, a quantidade de fonte de carbono e nitrogênio aplicada em um processo por bateladas com alimentação pode ser pelo menos cerca de duas vezes maior que a maior quantidade aplicada em um processo por bateladas. Isso, por sua vez, leva a uma quantidade consideravelmente maior de biomassa formada em um processo por bateladas com alimentação.More preferably, the source of carbon and nitrogen as well as phosphate are fed. In this regard, a preferred carbon source is glucose, and a preferred nitrogen source is ammonia and / or ammonium salts. The use of a feed batch process typically allows the use of a considerably greater amount of carbon and nitrogen source than is used in a batch process. Specifically, the amount of carbon and nitrogen source applied to a batch feed process can be at least about twice as large as the largest amount applied to a batch process. This in turn leads to a considerably larger amount of biomass formed in a feed batch process.
Um aspecto adicional da presente invenção se refere a opção de processamento a jusante do caldo de fermentação.A further aspect of the present invention relates to the downstream processing option of the fermentation broth.
Após terminado o processo de fermentação, o produto útil pode ser opcionalmente recuperado do caldo de fermentação usando-se tecnologia padronizada desenvolvida para o composto útil de interesse. A tecnologia de processamento a jusante relevante a ser aplicada dessa forma depende da natureza e da localização celular do composto útil. Em primeiro lugar a biomassa é separada do fluido de fermentação usando-se, por exemplo, centrifugação ou filtração. 0 composto útil é, então, recuperado da biomassa, no caso de o produto útil estar acumulado dentro ou associado com as células microbianas. De outra forma, quando o produto útil e excretado pela célula microbianâ, e recuperado do fluido de fermentação. O uso de um meio quimicamente definido na produção fermentativa industrial de um composto útil de interesse produz uma grande vantagem no processamento a jusante, pois a quantidade de subprodutos e substancialmente menor do que quando se usam meios complexos. Além disso, a qualidade do produto e melhorada, pois nenhum subproduto indesejável e co-isolado com o composto de interesse.Upon completion of the fermentation process, the useful product may optionally be recovered from the fermentation broth using standard technology developed for the useful compound of interest. The relevant downstream processing technology to be applied in this manner depends on the nature and cellular location of the useful compound. Firstly the biomass is separated from the fermentation fluid using, for example, centrifugation or filtration. The useful compound is then recovered from the biomass if the useful product is accumulated within or associated with microbial cells. Otherwise, when the useful product is excreted by the microbial cell, it is recovered from the fermentation fluid. The use of a chemically defined medium in the industrial fermentative production of a useful compound of interest yields a major advantage in downstream processing because the amount of byproducts is substantially less than when using complex media. In addition, product quality is improved as no undesirable by-products are co-isolated with the compound of interest.
Em ainda outro aspecto da presente invenção, identifica-se uma cepa adequada para um processo de fermentação industrial usando um meio quimicamente definido.In yet another aspect of the present invention, a suitable strain is identified for an industrial fermentation process using a chemically defined medium.
Uma cepa microbiana adequada para um processo de fermentação industrial usando um meio quimicamente definido pode ser qualquer cepa de tipo selvagem produtora de um composto útil de interesse, contanto que a cepa do tipo selvagem tenha um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido. Além disso, uma cepa microbiana adequada para um processo de fermentação industrial usando um meio quimicamente definido pode ser uma cepa que seja obtida e/ou aperfeiçoada por submissão de uma cepa de interesse original a um tratamento mutagênico clássico ou a uma transformação de DNA recombinante, também contanto que a cepa microbiana mutante ou transformada resultante tenha um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido. Dessa forma, dependerá do desempenho de crescimento da cepa original em um meio quimicamente definido se as cepas mutantes ou transformadas resultantes deverão ter um desempenho de crescimento similar em um meio quimicamente definido, em comparação com o da cepa de origem. , Entende-se que uma cepa microbiana tenha um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido quando a cepa tem uma taxa de crescimento específica (μ) em meio quimicamente definido que é > 0,05 h'1, de preferência > 0,1 h"1, mais preferivelmente > 0,2 h"1, mais preferivelmente ainda > 0,4 h'1. O desempenho de crescimento de uma cepa microbiana em um meio quimicamente definido e convenientemente analisada por fermentação da cepa em um meio quimicamente definido em uma escala relativamente pequena, por exemplo, uma cultura em balão com agitação e/ou uma fermentação laboratorial de 10 1. É preferível incluir uma fermentação laboratorial de 10 1, com um controle de pH, temperatura e concentração de oxigênio, na análise do desempenho de crescimento.A suitable microbial strain for an industrial fermentation process using a chemically defined medium may be any wild type strain producing a useful compound of interest, provided that the wild type strain has good growth performance in a chemically defined medium. In addition, a microbial strain suitable for an industrial fermentation process using a chemically defined medium may be a strain that is obtained and / or enhanced by subjecting a strain of original interest to classical mutagen treatment or recombinant DNA transformation, also provided that the resulting mutated or transformed microbial strain has good growth performance in a chemically defined medium. Thus, it will depend on the growth performance of the original strain in a chemically defined medium whether the resulting mutant or transformed strains should have similar growth performance in a chemically defined medium compared to the source strain. It is understood that a microbial strain has a good growth performance in a chemically defined medium when the strain has a specific growth rate (μ) in a chemically defined medium that is> 0.05 h'1, preferably> 0, 1h "1, more preferably> 0.2h" 1, more preferably still> 0.4h'1. The growth performance of a microbial strain in a chemically defined medium is conveniently analyzed by fermentation of the strain in a chemically defined medium on a relatively small scale, for example a shaking balloon culture and / or a 10 1 laboratory fermentation. It is preferable to include a 10 1 laboratory fermentation with pH, temperature and oxygen concentration control in the growth performance analysis.
Em uma modalidade da invenção, cepas microbianas que possam ser fermentadas em um meio quimicamente definido são Obtidas e/ou aperfei9oadas por submissão de uma cepa de interesse original a um tratamento mutagênico clássico, usando meios físicos, como irradiação com UV, ou um mutagênico químico adequado, como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina ou sulfonato de etilmetano. Em outra modalidade da invenção, cepas microbianas que possam ser fermentadas em um meio quimicamente definido são obtidas e/ou aperfeiçoadas por submissão de uma cepa de interesse original a tecnologia de DNA recombinante, com o que a cepa original e transformada com um ou mais genes funcionais de interesse.In one embodiment of the invention, microbial strains that can be fermented in a chemically defined medium are obtained and / or perfected by subjecting a strain of original interest to classical mutagen treatment using physical means such as UV irradiation or a chemical mutagen. suitable, such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or ethyl methane sulfonate. In another embodiment of the invention, microbial strains that can be fermented in a chemically defined medium are obtained and / or enhanced by subjecting a strain of original interest to recombinant DNA technology, whereby the original strain is transformed with one or more genes. of interest.
Em geral, a presente invenção considera dois grupos de cepas de interesse originais para submissão a mutagênese clássica e/ou transformação de DNA. Em uma modalidade da invenção, uma cepa de interesse original e selecionada no grupo de cepas que tem um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido, mas que precisam ser aperfeiçoadas com relação a seu nível de produção do composto de interesse. Em outra modalidade da invenção, uma cepa de interesse original e selecionada no grupo de cepas que tem um elevado nível de produção de um composto de interesse, mas que tem um desempenho de crescimento relativamente ruim em um meio quimicamente definido. Cepas microbianas com uma taxa de crescimento específico que seja menor que cerca de 0,05 h'1 são entendidas como tendo um desempenho de crescimento relativamente ruim em um meio quimicamente definido.In general, the present invention contemplates two groups of original strains of interest for submission to classical mutagenesis and / or DNA transformation. In one embodiment of the invention, an original strain is selected from the group of strains that has good growth performance in a chemically defined medium but needs to be refined with respect to its production level of the compound of interest. In another embodiment of the invention, an original strain is selected from the group of strains that has a high level of production of a compound of interest, but has relatively poor growth performance in a chemically defined medium. Microbial strains with a specific growth rate that is less than about 0.05 h -1 are understood to have relatively poor growth performance in a chemically defined medium.
Ambos os processos, o tratamento mutagênico clássico e o processo de transformação de DNA, são seguidos por triagem dos mutantes ou transformantes resultantes quanto ao seu desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido, assim como seu nível de produção de um composto de interesse. Selecionam-se cepas mutantes ou transformantes que tem um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido e/ou um melhor nível de produção de um composto de interesse, em comparação com a cepa de origem.Both processes, the classical mutagenic treatment and the DNA transformation process, are followed by screening of the resulting mutants or transformants for their growth performance in a chemically defined medium, as well as their level of production of a compound of interest. Mutant or transformant strains that have good growth performance in a chemically defined medium and / or a better level of production of a compound of interest are selected compared to the source strain.
Deve-se notar que algumas cepas microbianas, em particular cepas industriais que já tenham sido submetidas a um amplo tratamento mutagênico para melhorar os níveis de produção, podem ter um desempenho ruim ou podem não crescer em um meio quimicamente definido. Esse desempenho ruim ou falta de crescimento de uma cepa submetida à mutagênese pode ser causado pelo fato de o crescimento em um meio quimicamente definido nunca ter sido aplicado como critério para a seleção de mutantes apropriados. Por exemplo, é possível que a cepa submetida à mutagênese possua uma mutação que cause uma exigência de crescimento desconhecida (mutação auxotrófica desconhecida).It should be noted that some microbial strains, in particular industrial strains that have already undergone extensive mutagenic treatment to improve production levels, may perform poorly or may not grow in a chemically defined medium. This poor performance or lack of growth of a mutagenized strain may be caused by the fact that growth in a chemically defined medium has never been applied as a criterion for the selection of appropriate mutants. For example, the mutagenized strain may have a mutation that causes an unknown growth requirement (unknown auxotrophic mutation).
Cepas microbianas que são adequadas para fermentação industrial usando um meio quimicamente definido incluem cepas filamentosas e não filamentosas. Por exemplo, cepas microbianas que são adequadas para fermentação em um meio 15 quimicamente definido incluem cepas fúngicas, como Aspergillus, Penicillium ou Mucorales, cepas de leveduras, como Saccharomyces, Pichia, Phaffia ou Kluyveromyces, e cepas bacterianas, como Actinomycetes. O uso de meios quimicamente definidos de acordo com a invenção e particularmente vantajoso para a fermentação industrial de microorganismos filamentosos. O processo de acordo com a invenção usando um meio quimicamente definido e adequado para a produção fermentativa, em escala industrial, de qualquer composto útil de interesse, incluindo raetabólitos primários ou secundários, proteínas ou peptídeos farmacêuticos, ou enzimas industriais. Compostos úteis preferidos são metabólitos secundários, como antibióticos ou compostos de β-lactamo, particularmente antibióticos de β-lactamo.Microbial strains that are suitable for industrial fermentation using a chemically defined medium include filamentous and non-filamentous strains. For example, microbial strains that are suitable for fermentation in a chemically defined medium include fungal strains such as Aspergillus, Penicillium or Mucorales, yeast strains such as Saccharomyces, Pichia, Phaffia or Kluyveromyces, and bacterial strains such as Actinomycetes. The use of chemically defined media according to the invention is particularly advantageous for the industrial fermentation of filamentous microorganisms. The process according to the invention using a chemically defined medium suitable for the industrial-scale fermentative production of any useful compound of interest, including primary or secondary metabolites, pharmaceutical proteins or peptides, or industrial enzymes. Preferred useful compounds are secondary metabolites such as antibiotics or β-lactam compounds, particularly β-lactam antibiotics.
Exemplos de combinações cepa-produto incluem A. niger, por exemplo, A. niger CBS 513.88, para amiloglicosidase, A. oryzae para α-amilase, A. terreus, por exemplo, A. terreus CBS 456.95, para lovastatina, Mortierella alpina para ácido araquidônico ou lipídio contendo ácido araquidônico, Mucro miehei para protease, P. chrysogenum, por exemplo, P. chrysogenum CBS 455.95 ou outras cepas adequadas, para compostos de β-lactamo (penicilina G ou V) , Streptomyces clavuligerus, por exemplo S. clavuligerus ATCC 27064, para ácido clavulânico, Pichia ciferrii, por exemplo, P. ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10, para tetraacetil- fitoesfingosina, Phaffia rhodozyma, por exemplo, P. rhodozyma CBS 6938, para astaxantina, Saccharopolyspora erythraea para eritromicina, K. lactis para lactase, Streptomyces natalensis para natamicina. A presente invenção também considera o uso de cepas microbianas que sejam transformadas com um ou mais genes funcionais de interesse, resultando em uma cepa transformada que pode superexpressar um produto que já seja produzido pela cepa, ou resultando em uma cepa transformada pode expressar não produzido naturalmente pela cepa.Examples of strain-product combinations include A. niger, for example, A. niger CBS 513.88, for amyloglycosidase, A. oryzae for α-amylase, A. terreus, for example, A. terreus CBS 456.95, for lovastatin, Mortierella alpina for arachidonic acid or lipid containing arachidonic acid, Mucro miehei for protease, P. chrysogenum, for example, P. chrysogenum CBS 455.95 or other suitable strains, for β-lactam compounds (penicillin G or V), Streptomyces clavuligerus, for example S. clavuligerus ATCC 27064, for clavulanic acid, Pichia ciferrii, for example, P. ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10, for tetraacetylphyphosphingosine, Phaffia rhodozyma, for example, P. rhodozyma CBS 6938, for astaxanthin, Saccharopolraea erythra erythromycin, K. lactis for lactase, Streptomyces natalensis for natamycin. The present invention also contemplates the use of microbial strains that are transformed with one or more functional genes of interest, resulting in a transformed strain that may overexpress a product that is already produced by the strain, or resulting in a transformed strain may express non-naturally produced. by the strain.
Portanto, é deixado para a escolha daqueles versados na técnica qual cepa será selecionada para transformação, contanto que a cepa selecionada tenha um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido. Por exemplo, pode-se selecionar uma cepa para transformação que já tenha sido submetida a um ou mais tratamentos mutagênicos. Alternativamente, pode-se selecionar uma cepa mutagenizada ou do tipo selvagem. Após a análise do nível de expressão de um composto desejado, os transformantes obtidos após a transformação de uma cepa selecionada com um ou mais genes funcionais de interesse devem ser analisados quanto ao seu desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido.Therefore, it is left to the choice of those skilled in the art which strain will be selected for transformation as long as the selected strain has good growth performance in a chemically defined medium. For example, you can select a strain for transformation that has already undergone one or more mutagenic treatments. Alternatively, a mutagenized or wild type strain may be selected. Following analysis of the expression level of a desired compound, transformants obtained after transformation of a selected strain with one or more functional genes of interest should be analyzed for their growth performance in a chemically defined medium.
Exemplos de cepas recombinantes que produzem um produto não produzido naturalmente pela cepa são: * Streptomyces lividans, por exemplo, S. lividans TK21, contendo um cassete de expressão que permite a expressão de glicose isomerase, o gene que codifica a glicose isomerase se originando, por exemplo, de Actinoplanes missouriensis, * Penicillium chrysogenum, por exemplo, P. chrysogenum CBS 455.95, contendo um ou mais cassetes de expressão de uma expandase e, opcionalmente, de uma hidroxilase e/ou uma acetiltransferase, os genes que codificam a expandase, hidroxilase e acetiltransferase se originando, por exemplo, de Acremonium chrysogenum ou Streptomyces clavuligerus, o que permite a produção de compostos de cefalosporina, como 7-ADCA ou 7ACA, usando acido adípico (veja EP 532341) ou ácido 3-carboximetiltiopropiônico (veja WO 95/04148) como precursor de cadeia colateral, * Aspergillus niger, por exemplo, Aspergillus niger CBS 513.88, contendo um cassete de expressão que permite a expressão de lactoferrina humana (veja WO 93/22348) ou quimosina bovina. * Kluyveromyces lactis, contendo um cassete de expressão que permite a expressão de quimosina bovina ou fosfolipase A2, insulina ou albumina humana recombinante.Examples of recombinant strains that produce a product not naturally produced by the strain are: Streptomyces lividans, for example, S. lividans TK21, containing an expression cassette that allows expression of glucose isomerase, the gene that encodes glucose isomerase, e.g. from Actinoplanes missouriensis, * Penicillium chrysogenum, e.g. P. chrysogenum CBS 455.95, containing one or more expansionase expression cassettes and optionally a hydroxylase and / or an acetyltransferase, the genes encoding the expandase, hydroxylase and acetyltransferase originating, for example, from Acremonium chrysogenum or Streptomyces clavuligerus, which allows the production of cephalosporin compounds such as 7-ADCA or 7ACA using adipic acid (see EP 532341) or 3-carboxymethylthiopropionic acid (see WO 95 / 04148) as a side chain precursor, * Aspergillus niger, for example Aspergillus niger CBS 513.88, containing an expression cassette allowing and the expression of human lactoferrin (see WO 93/22348) or bovine chymosin. * Kluyveromyces lactis, containing an expression cassette allowing expression of bovine chymosin or phospholipase A2, insulin or recombinant human albumin.
Exemplos de cepas recombinantes que superproduzem uma enzima já produzida pela cepa são: * A. niger, por exemplo, A. niger CBS 513.88, contendo um cassete de expressão que permite a superexpressão de fitase (veja EP 420358) ou endoxilanase I (veja EP 463706). A presente invenção é exemplificada por um processo de fermentação em escala industrial que usa um meio quimicamente definido para a produção de glicose isomerase por uma cepa de Streptomyces recombinante, e pelo uso vantajoso de meios quimicamente definidos para fermentação de Penicillium em grande escala, em comparação com meios complexos.Examples of recombinant strains that overproduce an enzyme already produced by the strain are: A. niger, for example, A. niger CBS 513.88, containing an expression cassette that allows overexpression of phytase (see EP 420358) or endoxylanase I (see EP 463706). The present invention is exemplified by an industrial scale fermentation process using a chemically defined medium for the production of glucose isomerase by a recombinant Streptomyces strain, and by the advantageous use of chemically defined medium for large scale Penicillium fermentation in comparison. with complex media.
Exemplos adicionais se referem a meios quimicamente definidos que podem ser usados para medir o desempenho de crescimento e a produtividade de uma cepa de interesse, quando cultivada nesse meio em pequena escala, para identificar cepas microbianas que sejam adequadas para a produção fermentativa de um composto útil em escala industrial em um meio quimicamente definido.Additional examples refer to chemically defined media that can be used to measure the growth performance and productivity of a strain of interest when grown on this medium on a small scale to identify microbial strains that are suitable for the fermentative production of a useful compound. on an industrial scale in a chemically defined medium.
Breve Descrição das Figuras Figura 1. Esquema de pWGx.GIT.Brief Description of the Figures Figure 1. pWGx.GIT Scheme.
Figura 2. Desenvolvimento de glicose isomerase total produzida durante a fermentação.Figure 2. Development of total glucose isomerase produced during fermentation.
Exemplo 1 Produção industrial de glicose isomerase usando Streptomyces lividans Construção de uma cepa de Streptomyces produtora de glicose isomerase O gene de glicose isomerase do Actinoplanes missouriensis foi originalmente clonado como um fragmento de DNA de 5,0 kb em E. coli K12 cepa JM101.Example 1 Industrial Glucose Isomerase Production Using Streptomyces lividans Construction of a Glucose Isomerase-producing Streptomyces Strain The Actinoplanes missouriensis glucose isomerase gene was originally cloned as a 5.0 kb DNA fragment into E. coli K12 strain JM101.
Descobriu-se que um fragmento de 1,7 kb interno ao fragmento de 5,0 kb representava a sequência de codificação completa da glicose isomerase de A. missouriensis e sua região reguladora a montante (veja também Amore e Hollenberg (1989), Nucl. Acids Res. 17, 7515).A 1.7 kb fragment internal to the 5.0 kb fragment was found to represent the complete coding sequence for A. missouriensis glucose isomerase and its upstream regulatory region (see also Amore and Hollenberg (1989), Nucl. Acids Res. 17, 7515).
Um mutante de glicose isomerase exibindo maior termoestabilidade foi obtido alterando-se dentro do gene da glicose isomerase o tripleto AAG, que codifica lisina, na posição 253 da proteína de glicose isomerase, para CGG, que codifica arginina (Quax et al. (1991), Bio/Technology 9, 738 - 742).A glucose isomerase mutant exhibiting enhanced thermostability was obtained by altering within the glucose isomerase gene the triplet AAG encoding lysine at position 253 of the glucose isomerase protein for CGG encoding arginine (Quax et al. (1991)). , Bio / Technology 9, 738-742).
Para a clonagem em Streptomyces, o plasmídeo piJ4 86 (Ward et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 203, 468 - 478) foi usado como vetor. O fragmento de DNA de A. missouriensis de 1.737 pares de bases que codifica glicose isomerase foi combinado com o fragmento de DNA Psti grande de piJ486. O plasmídeo resultante, chamado de pWGx.GIT, continha essencialmente a região de replicação do plasmídeo piJIOl, o gene de resistência a tioestreptona e o fragmento de DNA de A. missouriensis que codifica GIT. Um mapa esquemático do pWGx.GIT é dado na Figura 1. A cepa produtora de glicose isomerase foi construída por transformação de Streptomyces lividans cepa TK21 (Hopwood et al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra) com o plasmídio pWGx.GIT.For Streptomyces cloning, plasmid pi 1486 (Ward et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 203, 468-478) was used as a vector. The 1737 base pair A. missouriensis DNA fragment encoding glucose isomerase was combined with the large piJ486 Psti DNA fragment. The resulting plasmid, called pWGx.GIT, essentially contained the replicon region of plasmid piJIO1, the thioestreptone resistance gene, and the GIT-encoding A. missouriensis DNA fragment. A schematic map of pWGx.GIT is given in Figure 1. The glucose isomerase producing strain was constructed by transformation of Streptomyces lividans strain TK21 (Hopwood et al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation , Norwich, England) with plasmid pWGx.GIT.
Produção industrial de glicose isomerase Um banco de células funcionais de uma cepa de produção construída conforme mencionado no Exemplo 1 foi preparado escolhendo-se uma colônia resistente a tioestreptona e cultivando-a em 20 ml de Caldo Triptona Soja contendo tioestreptona (SO mg/1) em um balão com agitação de 100 ml, a 30°C durante 40 - 48 horas e agitação a 280 rpm.Industrial Glucose Isomerase Production A functional cell bank of a production strain constructed as mentioned in Example 1 was prepared by choosing a thioestreptone resistant colony and growing it in 20 ml of thiostreptone-containing Sodium Tryptone Broth (SO mg / 1). in a 100 ml stirred flask at 30 ° C for 40 - 48 hours and stirring at 280 rpm.
Um micélio equivalente a 1 ml do banco de células funcionais (fresco ou armazenado como micélio congelado a -80°C) foi inoculado em 100 ml de meio de crescimento de inóculo em um balão com agitação de 500 ml, contendo 16 g/1 de Bactopeptona (Difco 0123/01), 4 g/1 de Bacto soytone (Difco 0436/01), 20 g/1 de hidrolisado de caseína (Merck 2239), 10 g/1 de fosfato de dipotassio.3 aq (Merck, Reagente de Anal.), 16,5 g/1 de glicose.1 aq, 0,6 g/1 de óleo de soja e 50 mg/1 de tioestreptona. 0 pH do meio e ajustado em 7,0 com hidróxido de sódio e/ou ácido sulfúrico antes da esterilização. Glicose e tioestreptona são adicionadas separadamente após a esterilização. Tioestreptona e dissolvida em DMSO em uma concentração de 50 g/1 e esterilizada por filtração em um filtro Nalgene de 0,2 m. A cultura e cultivada durante 24 horas a 30°C em um agitador incubador a 280 rpm. 50 ml da cultura totalmente crescida são transferidos para 6 1 do meio de crescimento de inóculo de segunda fase, com uma composição similar ao meio anteriormente mencionado, exceto por uma concentração dupla de glicose (33 g/1 de glicose.1 aq) , antiespumante extra (SAG5693, 0,6 g/1; um antiespumante de silicic da Basildon Company) e sem tioestreptona. A glicose e novamente esterilizada separadamente em uma solução a 5 0% e adicionada ap6s a esterilização do meio (60 minutos, 121°C). A cultura e cultivada durante 36 horas em uma coluna de bolhas esterilizada, aerada com 840 1 de ar estéril/h, com um bocal contendo 4 furos com um diâmetro de 2 mm, e a temperatura e mantida a 22°C. Alternativamente, essa fase pode ser realizada em baldes de agitação (por exemplo, 12 x 500 ml de meio em baldes Erlenmeyer com anteparos de 2 1) , com razões de inoculação similares e agitada a 280 rpm em um agitador incubador orbital. A cultura de crescimento completo é transferida assepticamente para um fermentador de inóculo contendo 4,5 m3 de meio de inóculo, contendo 16,3 kg de ácido cítrico. 1 aq, 70,8 g de sulfato de ferro. 7 aq, 109 g de sulfato de zinco. 7 aq, 109 g de sulfato de manganês. 1 aq, 32,7 g de dicloreto de cobalto.6 aq, 5,45 g de molibdato de dissódio.2 aq, 5,45 g de acido bórico, 5,45 g de sulfato de cobre.5 aq, 10,9 kg de sulfato de diamônio, 10,9 de sulfato de magnésio. 7 aq, 463 g de cloreto de cálcio.2 aq, 1.090 g de óleo de soja, 21,8 kg de fosfato de monopotássio e 139 kg de glicose. 1 aq e 5,9 kg de extrato de levedura (levedo de cerveja) com 10% de nitrogênio Kjeldahl com base no peso seco) . 0 meio e preparado da seguinte maneira: todos os componentes, exceto a glicose são carregados na sequência indicada em aproximadamente 2.700 1 de água de torneira. O pH e ajustado em 4,5 com hidróxido de sódio e/ou acido fosfórico, e o meio é esterilizado a 122°C durante 60 minutes. A glicose é esterilizada em 1.000 1 de água a pH 4,5, durante 60 minutes a 122°C em um recipiente separado. Ap6s resfriamento de ambas as partes, a glicose é transferida assepticamente para o recipiente de inóculo. Após a mistura de ambas as partes, o pH é ajustado em 7,0 3 com amônia, e o volume e ajustado com água estéril a 4,5 m3. A temperatura da fermentação é controlada em 30°C, e o fermentador é aerado a 0,5 - 1,0 vvm, enquanto o pH e mantido em 7,0 ± 0,1 com amônia gasosa, e o excesso de pressão e mantido em 1,3 - 1,4 bar. A formação de espuma e controlada, caso necessário, com uma mistura esterilizada de óleo de soja e um antiespumante de silício, como SAG5693, a uma razão de 3:1. A concentração de oxigênio e mantida acima de 25% da saturação do ar por ajuste da velocidade do agitador (0,5 a 3 Kw/m3) . A cultura é transferida para a fermentação principal antes que toda a glicose seja consumida (como em todas as fases de crescimento anteriores) e antes que a taxa de captação de oxigênio exceda um nível de 30 mmoles/1 de volume de caldo.h. O meio de fermentação principal contem 245,1 kg de ácido cítrico. 1 aq, 1.062 g de sulfato de ferro. 7 aq, 1.634 g de sulfato de zinco.7 aq, 1.634 g de sulfato de manganês.1 aq, 490 g de dicloreto de cobalto. 6 aq 1 82 g de molibdato de dissódio.2 aq 1 82 g de acido bórico, 82 g de sulfato de cobre.5 aql 16314 kg de sulfato de diamônio, 16314 de sulfato de magnésio.7 aq, 6194 g de cloreto de cálcio.2 aql 16,3 g de óleo de soja, 327 kg de fosfato de monopotássio, 880 kg de extrato de levedo de cerveja (10% de Kj-N com base no peso seco) e 556 kg de glicose. 1 aq. O meio e preparado conforme descrito para a fermentação do inóculo (a glicose e esterilizada separadamente). Para a glicose, pode-se usar, alternativamente, um xarope de açúcar DE-95. O volume do meio antes da inoculação e de 65 m3 após o pH ser corrigido a 710 com amônia.A mycelium equivalent to 1 ml of the functional cell bank (fresh or stored as frozen mycelium at -80 ° C) was inoculated into 100 ml of inoculum growth medium in a 500 ml shake flask containing 16 g / 1 of Bactopepton (Difco 0123/01), 4 g / 1 soytone Bacto (Difco 0436/01), 20 g / 1 casein hydrolyzate (Merck 2239), 10 g / 1 dipotassium phosphate.3 aq (Merck, Reagent Anal.), 16.5 g / l aq glucose, 0.6 g / l soybean oil and 50 mg / l thioestreptone. The pH of the medium is adjusted to 7.0 with sodium hydroxide and / or sulfuric acid prior to sterilization. Glucose and thioestreptone are added separately after sterilization. Thioestreptone is dissolved in DMSO at a concentration of 50 g / l and sterilized by filtration on a 0.2 m Nalgene filter. The culture is grown for 24 hours at 30 ° C on an incubator shaker at 280 rpm. 50 ml of the fully grown culture is transferred to 6 1 of the second-stage inoculum growth medium, with a composition similar to the aforementioned medium except for a double glucose concentration (33 g / 1 glucose aq), defoamer extra (SAG5693, 0.6 g / 1; a Basildon Company silicic defoamer) and without thioestreptone. The glucose is separately sterilized separately in a 50% solution and added after sterilization of the medium (60 minutes, 121 ° C). The culture is grown for 36 hours in a sterile 840 l aerated sterile air column / hr, with a nozzle containing 4 holes with a diameter of 2 mm, and the temperature maintained at 22 ° C. Alternatively, this step may be performed in shaking buckets (eg 12 x 500 ml medium in Erlenmeyer buckets with 2 L bulkheads) with similar inoculation ratios and shaken at 280 rpm on an orbital incubator shaker. The complete growth culture is aseptically transferred to an inoculum fermenter containing 4.5 m3 inoculum medium containing 16.3 kg citric acid. 1 aq, 70.8 g of iron sulfate. 7 aq, 109 g of zinc sulfate. 7 aq, 109 g of manganese sulfate. 1 aq, 32.7 g cobalt dichloride.6 aq, 5.45 g disodium molybdate.2 aq, 5.45 g boric acid, 5.45 g copper sulfate.5 aq, 10.9 kg diammonium sulfate, 10.9 magnesium sulfate. 7 aq, 463 g of calcium chloride aq, 1,090 g of soybean oil, 21.8 kg of monopotassium phosphate and 139 kg of glucose. 1 aq and 5.9 kg of yeast extract (brewer's yeast) with 10% Kjeldahl nitrogen based on dry weight). The medium is prepared as follows: All components except glucose are loaded in the sequence indicated in approximately 2,700 l of tap water. The pH is adjusted to 4.5 with sodium hydroxide and / or phosphoric acid, and the medium is sterilized at 122 ° C for 60 minutes. Glucose is sterilized in 1,000 l of water at pH 4.5 for 60 minutes at 122 ° C in a separate container. Upon cooling of both parts, glucose is aseptically transferred to the inoculum container. After mixing both parts, the pH is adjusted to 7.0 3 with ammonia, and the volume is adjusted with 4.5 m3 sterile water. The fermentation temperature is controlled at 30 ° C, and the fermenter is aerated at 0.5 - 1.0 vvm, while the pH is maintained at 7.0 ± 0.1 with gaseous ammonia, and excess pressure is maintained. at 1.3 - 1.4 bar. Foaming is controlled, if necessary, with a sterile mixture of soybean oil and a silicon defoamer such as SAG5693 at a ratio of 3: 1. Oxygen concentration is maintained above 25% of air saturation by agitator speed adjustment (0.5 to 3 Kw / m3). The culture is transferred to the main fermentation before all glucose is consumed (as in all previous growth phases) and before the oxygen uptake rate exceeds a level of 30 mmol / l broth volume.h. The main fermentation medium contains 245.1 kg of citric acid. 1 aq, 1.062 g of iron sulfate. 7 aq, 1.634 g zinc sulfate.7 aq, 1.634 g manganese sulphate.1 aq, 490 g cobalt dichloride. 6 aq 1 82 g of disodium molybdate.2 aq 1 82 g of boric acid, 82 g of copper sulphate.5 aql 16314 kg of diammonium sulphate, 16314 of magnesium sulphate.7 aq, 6194 g of calcium chloride 2 aql 16.3 g of soybean oil, 327 kg of monopotassium phosphate, 880 kg of brewer's yeast extract (10% Kj-N based on dry weight) and 556 kg of glucose. 1 aq. The medium is prepared as described for inoculum fermentation (glucose is sterilized separately). For glucose, a DE-95 sugar syrup may alternatively be used. Medium volume before inoculation and 65 m3 after pH is corrected to 710 with ammonia.
Prepara-se uma alimentação de glicose a 275 a 550 g de glicose/1 de solução de alimentação, como glicose.1 aq ou como equivalentes de glicose de um xarope DE > 90. 0 pH e ajustado a 4,5 - 5,0 com uma solução de acido fosf6rico. A esterilização e feita por bateladas (122°C, 45 minutes) ou continuamente, mediante um choque térmico ou conjunto de filtros. A fermentação principal é controlada em 3 0°C ± 015 e o pH em 7 1 0 ± 01 1 (por meio de um controle de pH usando amônia e acido fosfôrico). 0 fluxo de ar e ajustado em 0,5 -1,5 vvm, de preferência 0,7 vvm, o excesso de pressão e de 0,5 - 1,5 bar, e o fermentador e agitado com turbinas Rushton a uma intensidade de 01 5 a 3 Kw/m3 1 para evitar que a concentração de oxigênio caia abaixo de 0,2 mmoles/1, conforme medida na altura do agitador do fundo. A alimentação de glicose e iniciada quando ocorre uma súbita queda na taxa de captação de oxigênio, e a concentração de oxigênio dissolvido aumenta, assim como o pH, que vai de 6,9 a 7,1. A concentração de glicose no caldo deve ser << 0,2 g/1 nesse momento. A taxa de alimentação de glicose e equivalente a 93 kg de glicose/h, inicialmente subindo linearmente para 186 kg/h 64 horas ap6s o início da alimentação. Após 100 horas de alimentação a 186 kg/h, a taxa de alimentação e aumentada para 298 kg de glicose/h, ate aproximadamente 200 horas de alimentação. A formação de espuma e controlada por dosagem de óleo de soja esteril a 5,5 kg/h ou, alternativamente, em injeções de 45 kg a cada 8 horas durante as primeiras 100 horas de fermentação. Caso necessário, um controle de espuma adicional e feito com uma mistura de óleo de soja e um antiespumante de silício, como SAG471 (antiespumante de silfcio da Basildon), a uma razão de 3:1. A concentração de amônia e mantida entre 750 e 1.500 mg/1, medindo-se a cada 12 horas e adicionando-se sulfato de amônia estéril em porções equivalentes a 500 mg de amônia/1, assim que o nível estiver abaixo de 1. 000 mg/1. A concentração de fosfato no filtrado de cultura deve ser mantida acima de 500 mg de P04/1 pela adição de fosfato de monopotassio estéril em porções equivalentes 500 mg/1. A produção de glicose isomerase pode ser medida como proteína colhida e purificada do caldo, seguido por processos de determinação de proteínas conhecidas da técnica ou ensaiada em um ensaio enzimático aplicado a uma amostra de caldo estabilizada. As amostras de caldo são estabilizadas pesando-se 2 g de caldo e adicionando-se 5 ml de solução estabilizadora contendo 12 g/1 de tris- hidroximetilaminometano e 2,4 g/1 de CoCl2 .6 aq, que e subsequentemente aquecida durante 30 minutos a 73°C. Após resfriamento, 42 ml de amostra estabilizada são misturados com 0,8 ml de solução de glicose (contendo 27,25 g/1 de tampão Tris/HCl, pH 81 2, glicose 67 56 g/1 de MgC12.6 aq, 22,33 g/1 de Na2-EDTA.2 aq e 5 mg/1 de Triton X-100) e incubados a 60°C. A atividade e determinada medindo-se as taxas de conversão de glicose em frutose, expressas como GU/g. (1 GU é a quantidade de enzima requerida para a formação de 1 mol de frutose/min.) Usando-se a atividade especifica de 12 Unidades por mg de proteína, a quantidade de proteína por kg de caldo pode ser determinada.A glucose feed is prepared at 275 to 550 g glucose / l feed solution, either as glucose.1 aq or as glucose equivalents of a DE> 90 syrup. PH adjusted to 4.5 - 5.0 with a solution of phosphoric acid. Sterilization is done by batching (122 ° C, 45 minutes) or continuously by a thermal shock or filter set. The main fermentation is controlled at 30 ° C ± 015 and the pH at 710 ± 01 1 (by a pH control using ammonia and phosphoric acid). The air flow is adjusted to 0.5-1.5 vvm, preferably 0.7 vvm, the excess pressure is 0.5-1.5 bar, and the fermenter is stirred with Rushton turbines at an intensity of 01 5 to 3 Kw / m3 1 to prevent oxygen concentration from falling below 0.2 mmoles / 1 as measured at the bottom stirrer height. Glucose feeding begins when there is a sudden drop in oxygen uptake rate, and dissolved oxygen concentration increases, as does the pH, which goes from 6.9 to 7.1. The glucose concentration in the broth should be << 0.2 g / 1 at this time. The glucose feed rate is equivalent to 93 kg of glucose / h, initially rising linearly to 186 kg / h 64 hours after the start of feeding. After 100 hours of feeding at 186 kg / hr, the feeding rate is increased to 298 kg of glucose / hr until approximately 200 hours of feeding. Foaming is controlled by dosing sterile soybean oil at 5.5 kg / hr or alternatively in 45 kg injections every 8 hours during the first 100 hours of fermentation. If necessary, an additional foam control is made with a mixture of soybean oil and a silicon defoamer such as SAG471 (Basildon silicon defoamer) at a ratio of 3: 1. Ammonia concentration is maintained between 750 and 1,500 mg / 1, measured every 12 hours and sterile ammonium sulfate added in portions equivalent to 500 mg of ammonia / 1 as soon as the level is below 1 000. mg / 1. The phosphate concentration in the culture filtrate should be maintained above 500 mg P04 / 1 by the addition of sterile monopotassium phosphate in 500 mg / 1 equivalent portions. Glucose isomerase production can be measured as harvested and purified broth protein, followed by protein determination procedures known in the art or assayed in an enzyme assay applied to a stabilized broth sample. The broth samples are stabilized by weighing 2 g of broth and adding 5 ml of stabilizer solution containing 12 g / l trishydroxymethylaminomethane and 2.4 g / l CoCl2.6 aq, which is subsequently heated for 30 minutes. minutes at 73 ° C. After cooling, 42 ml of stabilized sample is mixed with 0.8 ml of glucose solution (containing 27.25 g / 1 Tris / HCl buffer, pH 81 2, glucose 67 56 g / 1 MgC12.6 aq, 22 33 g / l Na2-EDTA.2 aq and 5 mg / l Triton X-100) and incubated at 60 ° C. Activity is determined by measuring glucose to fructose conversion rates, expressed as GU / g. (1 GU is the amount of enzyme required to form 1 mol of fructose / min.) Using the specific activity of 12 Units per mg of protein, the amount of protein per kg of broth can be determined.
Na Figura 2, indica-se a quantidade total de enzima produzida.In Figure 2, the total amount of enzyme produced is indicated.
Conforme demonstrado neste exemplo, 850 kg da enzima podem ser fabricados em uma operação de produção por bateladas com alimentação.As shown in this example, 850 kg of the enzyme can be manufactured in a feed batch production operation.
Exemplo 2 Produção de penicilina v Conidiosporos de um P. chrysogenum CBS 455.95 (ou outra cepa adequada derivada de Wisconsin 54.1255 por mutação e seleção quanto a maior produtividade, de preferência na receita apresentada abaixo) são inoculados a 105 - 106 conidios/ml em um meio de produção contendo: glicose.H20, 5; lactose. H20, 80; (NH2) 2co, 41 5; (NH4)2S04, 11 1; Na2S04, 21 9; KH2 P04, 2; solução de elementos residuais (ácido HP04.3H201 41 8; ácido citrico.H201 150; Fe804 .7H201 155 MgSOl.7H20 I 150Ϊ H3B03 1010075; Cu804 .5H201 0124; CO804 .7H201 01 375; ZnS04.7H201 11 5; Mn804 · H201 21 28; CaC12 · 2H2 01 0,9 9), 10 (ml/l) ; solução de fenoxiacetato de potássio 10%1 pH 7, 75 (ml/l) (pH antes da esterilização de 6, 5) . A cultura e incubada a 25°C em um agitador orbital a 280 rpm durante 144 - 168 horas. Ao termino da fermentação, o micélio é removido por centrifugação ou filtração, e a quantidade determinada, e o meio e ensaiado quanto a penicilina formada por processos de HPLC bem conhecidos na técnica.Example 2 Production of penicillin v Conidiospores of a P. chrysogenum CBS 455.95 (or other suitable Wisconsin-derived strain 54.1255 by mutation and selection for higher productivity, preferably in the recipe presented below) are inoculated at 105 - 106 conidios / ml in one. production medium containing: glucose.H20.5; lactose. H2 O, 80; (NH 2) 2co, 415; (NH 4) 2 SO 4, 11 1; Na2 SO4, 219; KH2 P04.2; residual element solution (HP04.3H201 41 8; citric acid.H201 150; Fe804 .7H201 155 MgSOl.7H20 I 150Ϊ H3B03 1010075; Cu804 .5H201 0124; CO804 .7H201 01 375; ZnS04.7H201 11 5; Mn804 · H201 21 28; CaCl2 · 2H2 01 0.9), 10 (ml / l); 10% potassium phenoxyacetate solution 1 pH 7.75 (ml / l) (pH before sterilization 6.5). The culture is incubated at 25 ° C on an orbital shaker at 280 rpm for 144 - 168 hours. At the end of the fermentation, the mycelium is removed by centrifugation or filtration, and the amount determined, and the medium is assayed for penicillin formed by HPLC procedures well known in the art.
Exemplo 3 Fermentação de Penicillium em grande escala com meios complexos e definidos Penicillium chrysogenum Wisconsin 54.1255 foi otimizado para crescimento e produção de penicilina em um meio quimicamente definido por mutação e seleção em meios definidos conforme descrito no Exemplo 2. Fermentações por bateladas com alimentação foram realizadas em uma escala de 60 m3 com um meio complexo, conforme descrito por Hersbach et al. (Biotechnology of Industrial Antibiotics, pp. 45-1401 Marcei Dekker Inc.1 19841 Tabela 4, Meio B, incluindo os sais, conforme mencionado em Meio A) I contendo 50 kg/m3 de sólidos de Infusão de Milho. Paralelamente, realizou-se uma fermentação em um meio definido, conforme apresentado no Exemplo 2, em que as dosagens foram dobradas por causa do caráter de alta densidade celular dessas fermentações por bateladas com alimentação, ao passo que lactose e uréia foram omitidas. A glicose foi alimentada ao fermentador, mantendo-se a concentração de glicose abaixo de 2 g/1 para evitar repressão por glicose. Amônio, sulfato de diamônio e ácido fenilacético foram alimentados ao fermentador para controlar o pH e as concentrações de amônio, sulfato e ácido fenilacético nas faixas desejadas (Hersbach, 1984) . t:· Como a transferência de oxigênio e um importante parâmetro na determinação da exequibilidade econômica de um processo de fermentação industrial, o desempenho dos processos de fermentação acima foi analisado determinando-se a extensão da transferência de oxigênio em cada processo. Uma boa medida da transferência de oxigênio obtida em um processo de fermentação e o valor de kLa relativo, conforme determinado em um sistema. KLa e definido como o coeficiente de transferência de oxigênio e é calculado de acordo com Van't Riet e Tramper (Basic Biorector Design,20 Marcei Dekker Inc. (1991), pp. 236 - 273).Example 3 Large-Scale Penicillium Fermentation with Complex and Defined Media Penicillium chrysogenum Wisconsin 54.1255 was optimized for growth and production of penicillin in a chemically defined medium by mutation and selection in defined media as described in Example 2. Feed batch batch fermentations were performed. on a 60 m3 scale with a complex medium as described by Hersbach et al. (Biotechnology of Industrial Antibiotics, pp. 45-1401 Marcei Dekker Inc.1 19841 Table 4, Medium B, including salts, as mentioned in Medium A) I containing 50 kg / m3 Corn Infusion solids. At the same time, fermentation was performed in a defined medium, as shown in Example 2, where dosages were doubled because of the high cell density character of these feed-fed batches, while lactose and urea were omitted. Glucose was fed to the fermenter, maintaining glucose concentration below 2 g / 1 to prevent repression by glucose. Ammonium, diammonium sulfate and phenylacetic acid were fed to the fermenter to control pH and ammonium sulfate and phenylacetic acid concentrations in the desired ranges (Hersbach, 1984). As oxygen transfer is an important parameter in determining the economic feasibility of an industrial fermentation process, the performance of the above fermentation processes was analyzed by determining the extent of oxygen transfer in each process. A good measure of the oxygen transfer obtained in a fermentation process is the relative kLa value as determined in a system. KLa is defined as the oxygen transfer coefficient and is calculated according to Van't Riet and Tramper (Basic Biorector Design, 20 Marcei Dekker Inc. (1991), pp. 236 - 273).
Verificou-se que a capacidade de transferência de oxigênio, calculada como o valor KLa, era entre 10 e 20% mais elevada no meio quimicamente definido do que no meio complexo, durante a parte principal da fermentação.The oxygen transfer capacity, calculated as the KLa value, was found to be between 10 and 20% higher in the chemically defined medium than in the complex medium during the main part of the fermentation.
Exemplo 4 Produção de 7-ADCA 0 processo descrito no Exemplo 2 e modificado usando-se um P. chrysogenum CBS 455.95 (ou outra cepa adequada derivada de Wisconsin 54.1255 por r:mt3.<;5.o e seleção quanto a maior produtividade, de preferência na receita apresentada abaixo) que e transformado com um cassete de expressão de expandase, em que a região de codificação de expandase possui o promotor IPNS, conforme descrito em EP 532341, e usando-se uma solução de adipato de potássio a 10%, em vez de fenoxiacetato, e usando-se uma modificação do meio acima, contendo 400 ml de uma solução de adipato de potássio a 10%1 pH 5,5, em vez de fenoxiacetato (pH do meio antes da esterilização de 5,5, em vez de 6,5). 0 adipoil-7-ADCA resultante e subsequentemente convertido em 7-ADCA usando-se o processo de desacilação enzimática substancialmente conforme descrito no Exemplo 4 ou 5 da WO 95/04148.Example 4 Production of 7-ADCA The process described in Example 2 and modified using a P. chrysogenum CBS 455.95 (or other suitable Wisconsin-derived strain 54.1255 by r: mt3. <; preferably in the recipe shown below) which is transformed with an expandase expression cassette, wherein the expandase coding region has the IPNS promoter as described in EP 532341, and using a 10% potassium adipate solution, instead of phenoxyacetate, and using a modification of the above medium containing 400 ml of a 10% potassium adipate solution 1 pH 5.5 instead of phenoxyacetate (medium pH prior to sterilization of 5.5, instead of 6.5). The resulting adipoyl-7-ADCA is subsequently converted to 7-ADCA using the enzymatic deacylation procedure substantially as described in Example 4 or 5 of WO 95/04148.
Exemplo 5 Produção de lova.sta.tina Conidiosporos de Aspergillus terreus cepa CBS 456.95 (ou cepas derivadas dela por mutação e seleção quanto a maior produtividade, de preferência em qualquer uma das receitas apresentadas abaixo) são inoculados a 105 - 106 conidios/ml, em um meio de produção contendo (g/1): dextrose, 40; CH3COONH4 1 212 ; Na.S04 1 4; KH2 P04 1316 ; K2HP04 .3H2 01 3511; solução de elementos residuais (veja acima, Ex. 2) I 10 (ml/1). A cultura e incubada a 28°C em um agitador orbital a 220 rpm durante 144 - 168 horas. Ao término da fermentação, 0 micélio e removido por centrifugação ou filtração e a quantidade calculada, e meio é ensaiado quanto a lovastatina formada por processos de HPLC bem conhecidos da técnica.Example 5 Production of lova.sta.tina Aspergillus terreus conidiospores strain CBS 456.95 (or strains derived therefrom by mutation and selection for highest yield, preferably in any of the recipes shown below) are inoculated at 105 - 106 conidios / ml, in a production medium containing (g / 1): dextrose, 40; CH3COONH4 1 212; Na.S04 14; KH2 P04 1316; K2HP04 .3H2 01 3511; residual element solution (see above, Ex. 2) I 10 (ml / 1). The culture is incubated at 28 ° C on an orbital shaker at 220 rpm for 144 - 168 hours. At the end of the fermentation, the mycelium is removed by centrifugation or filtration and the amount calculated, and medium is assayed for lovastatin formed by HPLC procedures well known in the art.
Exemplo 6 Produção de acido clavulânico Streptomyces clavuligerus cepa ATCC 27064 ou um mutante dele e inoculado em um meio de pre-cultura consistindo em (g/1): (NH4 ) 2804 1 2175; KH2 P04 1 01 5; Mg804 .7H20, 0,5; CaC12 .2H20, 01 01; acido 3 -(N-morfolino) propanossulfonico, 21; glicerol, 19,9; succinate de s6dio, 5,5; solução de elementos residuais (ZnS04 .7H201 218; citrato férrico de amônio, 217; CuSO.SH 201 01125; MnS04 .H2 01 1; CoC12 . 6H20, 011; Na2 B4 07 .10H201 0116 ; Na2MoO. 2H 201 01 054)1 0 1 06 (ml/l). A cultura e incubada em um agitador orbital a 220 rpm, a 28°C durante 4 8 - 72 horas, e usada para inocular 20 volumes de meio de produção contendo (g/1) : (NH4 ) 2 804 1 2; asparagina, 4; KH2 P04, 11 5; MgS04.7H2 01 01 5; CaC12 · 2H201 0 1 01; acido 3-(N-morfolino) propanossulfonico, 21; glicerol, 191 9; succinate de s6dio, 51 5; solução de elementos residuais (veja acima)1 0 1 06 (ml/l); FeS04 .7H20, 0,5; MnC12 .4H20, 0,1; 20 ZnS04 • 7H2 0, 01 1. A incubação e continuada durante 144 horas, de preferência em um balão Erlenmeyer de 500 ml com anteparos, contendo 50 ml de volume de cultura. Ao termino da fermentação, o micélio e removido por centrifugação ou filtração, e a quantidade calculada, e o filtrado e ensaiado por processos de HPLC bem conhecidos na técnica.Example 6 Production of clavulanic acid Streptomyces clavuligerus strain ATCC 27064 or a mutant thereof and inoculated into a preculture medium consisting of (g / 1): (NH4) 2804 1 2175; KH2 P04 1 01 5; Mg804.7H20, 0.5; CaCl2 .2H2 O, 01.01; 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid, 21; glycerol, 19.9; sodium succinate, 5.5; solution of residual elements (ZnSO4 .7H201 218; ferric ammonium citrate 217; CuSO.SH 201 01125; MnSO4 .H2 01 1; CoC12.6H20.011; Na2 B4 07 .10H201 0116; Na2MoO. 2H 201 01 054) 1 0106 (ml / l). The culture is incubated on an orbital shaker at 220 rpm at 28 ° C for 48 - 72 hours and used to inoculate 20 volumes of production medium containing (g / 1): (NH4) 2 804 1 2; asparagine, 4; KH2 P04, 115; MgSO4.7H2 01 01 5; CaCl2 · 2H201 0 1 01; 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid, 21; glycerol, 1919; sodium succinate, 525; residual element solution (see above) 1 0 1 06 (ml / l); FeSO 4 .7H 2 O, 0.5; MnCl 2 · 4H 2 O, 0.1; 20 ZnSO4 • 7H2 0.01 1. Incubation is continued for 144 hours, preferably in a 500 ml Erlenmeyer bulkhead flask containing 50 ml culture volume. At the end of fermentation, the mycelium is removed by centrifugation or filtration, and the amount calculated, and the filtrate is assayed by HPLC procedures well known in the art.
Exemplo 7 Produção de amiloglicosidase Aspergillus niger cepa CBS 513.88 ou um mutante dele e inoculado a 105 - 106 conidiosporos/ml em um meio de germinação consistindo em (g/1): K2HP04.3H20, 0,75; KH2PO, 6,6; citrato de Na3 .3H20, 5,3; acido citrico.H2 0, 0,45; gli- cose .H20, 25; (NHq) 2S04 , 8; NaCl, 0,5; MgS04 . 7H2 0, 0,5; Fe- S0, . 7H2 0, 0,1; ZnS04 . 7H2 0, 0,05; CaC12 , 0,005; CuS04 . 5H2 0, 0,0025; Mn804 .4H20, 0,0005; H3B03, 0,0005; Na2Mo04 . 2H20, 1 0,0005; EDTA, 0,13; Tween80, 3.Example 7 Production of Amyloglycosidase Aspergillus niger strain CBS 513.88 or a mutant thereof and inoculated at 105 - 106 conidiospores / ml in a germination medium consisting of (g / 1): K2HP04.3H20, 0.75; KH 2 PO, 6.6; Na 3 · 3H 2 O citrate, 5.3; citric acid.H 2 O, 0.45; glucose, H2 O, 25; (NHq) 264.8; NaCl, 0.5; MgSO4. 7H2 O, 0.5; Fe-SO,. 7H2 O, 0.1; ZnSO4. 7H2 O, 0.05; CaCl2, 0.005; CuS04. 5H 2 O, 0.0025; Mn804.4H20, 0.0005; H3B03, 0.0005; Na2Mo04. 2H20, 0.0005; EDTA, 0.13; Tween80,3.
Caso necessário, 50 g/ml de arginina e/ou prolina podem ser adicionados para melhorar a germinação. A cultura e incubada em um agitador orbital durante 48 - 72 horas a 33°C, 295 rpm, e, então, usada para inocular 10 - 20 volumes de um meio de produção consistindo em (g/1) : KH2P04 , 1-5; NaH2 P04 . H2 0, 0,5; citrato de Na3 .3H20, 53; acido cítrico, H20, 4,05; polímeros de dextrose, 70; ( NH4 ) 2804 , 8; (NaCl, MgS04 · 7H20, FeS04 · 7H20, ZnS04 · 7H20, CaC12 , CUSO4.5H20I MnS04.4H20I H3B03, Na2Mo04.2H20 I EDTA): iguais ao meio de germinação. A incubação é continuada durante 96 horas, de preferência em um balão Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de meio. Ao término da fermentação, centrifugação ou filtração, o micélio é removido por quantidade calculada, e o filtrado e ensaiado quanto a atividade amilolítica.If necessary, 50 g / ml arginine and / or proline may be added to improve germination. The culture is incubated on an orbital shaker for 48 - 72 hours at 33 ° C, 295 rpm, and then used to inoculate 10 - 20 volumes of a production medium consisting of (g / 1): KH2PO4, 1-5 ; NaH2 P04. H2 O, 0.5; Na 3 · 3H 2 O citrate, 53; citric acid, H2 O, 4.05; dextrose polymers, 70; (NH 4) 2804.8; (NaCl, MgSO4 · 7H2O, FeSO4 · 7H2O, ZnSO4 · 7H2O, CaCl2, CUSO4.5H2O MnSO4.4H2O H3B03, Na2MoO4.2H2O EDTA): equal to the germination medium. Incubation is continued for 96 hours, preferably in a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml medium. At the end of fermentation, centrifugation or filtration, the mycelium is removed by calculated amount, and the filtrate is assayed for amylolytic activity.
Exemplo 8 Produção de astaxantina Phaffia rhodozyma cepa CBS 693 8 ou um mutante dela e inoculada em 25 ml de um meio de pre-cultura contendo 5 (g/1) : extrato de levedura 10; peptona, 20; glicose, 20. A cultura e incubada durante 72 horas a 20°C, em um balão Erlenmeyer de 100 ml com anteparos, em um agitador orbital a2 7 5 rpm. 1 ml da pre-cultura é então usado para inocular 100 ml de um meio de produção contendo (g/1): glicose, 30; NH4 Cll 4183; MgS04 .7H201 0188; NaCll 0 1 06; solução de elementos residuais (acido (NH ) 2 Fe(S04 ) 2 . 6H2 01 90; ZnS04 . 7H2 01 1617 ;CaC12 · 6H201 01 15; cítrico.H20I 50; CuS04 · 5H2 01 215;MnS04 · 4H2 01 2; 01 4 N) I 0 13 (ml/1) ; solução de vitaminas (mioinositoll 40; acido nicotínico, 2; D-pantotenato de Cal 2; vitamina Bll 2; acido p.aminobenz6ico, 11 2; vitamina B61 012; biotina, 01 008; em H2S04 a 01 07 N) 1 5 (ml/1); Pluronicl 0,04; KH2P01, 1; hidrogênio ftalato de potássio, 20 (pH antes daesterilização de 5,4). A incubação ê continuada durante 96 horas, de preferência em um balão Erlenmeyer e 500 ml com anteparos. Ao termino da fermentação, o teor de astaxantina da biomassa (quantidade calculada) e determinado por extração com solvente e medição da densidade 6ptica do extrato a 470 - 490.Example 8 Production of Astaxanthin Phaffia rhodozyma strain CBS 693 8 or a mutant thereof and inoculated into 25 ml of a preculture medium containing 5 (g / 1): yeast extract 10; peptone, 20; glucose, 20. The culture is incubated for 72 hours at 20Â ° C in a 100 ml Erlenmeyer bulkhead flask on an orbital shaker at 25 rpm. 1 ml of the preculture is then used to inoculate 100 ml of a production medium containing (g / 1): glucose, 30; NH4 Cl1 4183; MgSO4 .7H201 0188; NaCl 11106; solution of residual elements (acid (NH) 2 Fe (S04) 2. 6H2 01 90; ZnS04.7H2 01 1617; CaCl2 · 6H201 01 15; citric.H20I 50; CuS04 · 5H2 01 215; MnS04 · 4H2 01 2; 01 4 N) 10 13 (ml / 1); vitamin solution (myoinositoll 40; nicotinic acid, 2; Cal 2 D-pantothenate; vitamin B11 2; p.aminobenzoic acid, 11 2; vitamin B61 012; biotin, 01 008; in H 2 SO 4 to 01 07 N) 1 5 ( ml / 1); Pluronicl 0.04; KH2P01.1; potassium hydrogen phthalate, 20 (pH before sterilization of 5.4). Incubation is continued for 96 hours, preferably in an Erlenmeyer flask and 500 ml with shields. At the end of the fermentation, the astaxanthin content of the biomass (calculated amount) is determined by solvent extraction and measurement of the extract's optical density at 470 - 490.
Exemplo 9 Produção de ácido araquidônico Um frasco de 1 ml de uma suspensão de Mortierella alpina cepa ATCC 16266 armazenado aberto assepticamente e o conteúdo e usado para inocular 500 ml de um meio de produção contendo (g/1) : glicose, 70; extrato de levedura, 01 5; NH4N03 3 (ml/1); (pH antes da esterilização de 71 0). A cultura e incubada em um balão de agitação de 2 litros com anteparos, a 25°C durante 72 horas em um agitador orbital a 250 rpm. Ao termino da fermentação, a quantidade de biomassa e o teor de acido araquidonico da biomassa são determinados, ap6s centrifugação, secagem por congelamento e extração com solvente, por processos de GC bem conhecidos na técnica.Example 9 Arachidonic Acid Production A 1 ml vial of a suspension of stored aseptically opened Mortierella alpina strain ATCC 16266 and the contents is used to inoculate 500 ml of a production medium containing (g / 1): glucose, 70 ° C; yeast extract, 01 5; NH4 NO3 3 (ml / 1); (pH before sterilization of 71 0). The culture is incubated in a 2 liter bulkhead shake flask at 25 ° C for 72 hours on an orbital shaker at 250 rpm. At the end of the fermentation, the biomass amount and the arachidonic acid content of the biomass are determined after centrifugation, freeze drying and solvent extraction by GC methods well known in the art.
Exemplo 10 Produção de eritromicina Saccharopolyspora erythraea cepa NRRL2338 ou um mutante dela (selecionado quanta a maior produtividade, de preferência na receita apresentada abaixo) e inoculada em 25 ml de um meio de pre-cultura contendo (g/1): amido solúvel, 15; NaCl, 5; farelo de soja, 15; CaC031 10; extrato de levedura, 5; sólidos de infusão de milhol 5; CoC12 .6H201 670 1 de uma solução a 1 g/1. A cultura e incubada em um balao de agitação e 100 ml sem anteparos, a 32 - 34°C durante 3 dias a 250 rpm em um agitador-incubador. 0,4 ml da cultura são inoculados em 25 ml de um meio de produção estéril contendo (g/1): ácido cítrico. H20, 2 (NH4 ) 2 S04 , 2; MgS04 .7H20, 2; CaC12 .2H20, 0,085; KH2 P04 , 0,25; HEPES ( acido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanossulfonico)), 5; glicose, 1,5; amido solúvel, 20; óleo de soja, 0,4; solução de elementos residuais (gramas em 250 10 ml de água destilada: acido cítrico. H20, 621 5i FeS04.7H20, 0,8215; CuS04 .5H20, 0,0625; COC12.H2 0, 0,375; H3B03 , 0,0625; ZnS04 .7H20, 1,25; MnS0,l .H20, 1,25;Example 10 Production of Erythromycin Saccharopolyspora erythraea strain NRRL2338 or a mutant thereof (selected for highest yield, preferably in the recipe shown below) and inoculated into 25 ml of a preculture medium containing (g / 1): soluble starch, 15 ; NaCl, 5; soybean meal, 15; CaC031 10; yeast extract, 5; millol infusion solids 5; CoC12.6H201 670 1 of a 1 g / 1 solution. The culture is incubated in a 100 ml unblocked shake flask at 32-34 ° C for 3 days at 250 rpm in a shaker-incubator. 0.4 ml of the culture is inoculated into 25 ml of a sterile production medium containing (g / 1): citric acid. H2 O, 2 (NH4) 2 SO4.2; MgSO 4 .7H 2 O 2; CaCl 2 .2H 2 O, 0.085; KH2 P04, 0.25; HEPES (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N '- (2-ethanesulfonic acid)), 5; glucose, 1.5; soluble starch, 20; soybean oil, 0.4; solution of residual elements (grams in 250 10 ml of distilled water: citric acid. H2 O, 621.5i FeSO4.7H2 O, 0.8215; CuSO4 .5H2 O, 0.0625; COC12.H2 O, 0.375; H3B03, 0.0625; ZnSO 4 .7H 2 O, 1.25; MnSO 0, 1 H 2 O, 1.25;
Na2Mo04 .2H20, 0,0625), 3,6 ml/l. pH =7, 0. A cada balao, adicionam-se 0,25 ml de n-propanol. A cultura é incubada em um balão de agitação de 100 ml com anteparos, a 32 - 34°C durante 5 dias em um agitador- incubador a 300 rpm. Ao termino da fermentação, o caldo é centrifugado, e a quantidade de biomassa calculada. 0 teor de eritromicina do sobrenadante e medido per processos de HPLC conhecidos na técnica.Na 2 MoO 4 (2H 2 O, 0.0625), 3.6 ml / l. pH = 7.0. To each flask, 0.25 ml of n-propanol is added. The culture is incubated in a 100 ml bulkhead shake flask at 32-34 ° C for 5 days on a shaker-incubator at 300 rpm. At the end of the fermentation, the broth is centrifuged and the amount of biomass calculated. The erythromycin content of the supernatant is measured by HPLC procedures known in the art.
Exemplo 11 Produção de P-caroteno Uma suspensão de esporos de Blakeslea trispora CBS 130.59 e usada para inocular 114 ml de meio de pré-cultura (extrato de levedura, 10 g/1; peptona, 20 g/1; glicose, 20 g/1) em um balão de agitação de 500 ml sem anteparos. A pré-cultura e incubada durante 42 h em um agitador rotativo a 250 rpm a 26°C. A biomassa e colhida por filtração é lavada 3 vezes com 100 ml de água desmineralizada estéril, para remover os componentes do meio de pré-cultura. Subsequentemente, a biomassa é homogeneizada por mistura até que sobrem apenas pequenos fragmentos, e ressuspendida em 40 ml de água desmineralizada. 0 meio de produção e preparado em porções de 100 ml em balões de agitação com anteparos. A composição do meio de produção e a seguinte (em g/1): glicose, 40; monoidrato de asparagina, 2; KH2 P04 , 0,5; MgS04 . 7H2 01 0,25. Além disso, adiciona-se uma solução de elementos residuais (0,3 ml/1) com a seguinte composição (em g/1) (NH4 ) 2 Fe(S04 ) 2 • 6H2 0, 90; ZnS04 · 7H20, ácido cítrico H20, 50; 161 7;Example 11 Production of β-Carotene A suspension of Blakeslea trispora CBS 130.59 spores is used to inoculate 114 ml of preculture medium (yeast extract, 10 g / 1; peptone, 20 g / 1; glucose, 20 g / 1) in a 500 ml agitation flask without bulkheads. The preculture is incubated for 42 h on a rotary shaker at 250 rpm at 26 ° C. The biomass and collected by filtration is washed 3 times with 100 ml of sterile demineralized water to remove components from the preculture medium. Subsequently, the biomass is homogenized by mixing until only small fragments are left, and resuspended in 40 ml of demineralized water. The production medium is prepared in 100 ml portions in bulkhead shake flasks. The composition of the production medium is as follows (in g / 1): glucose, 40; asparagine monohydrate, 2; KH 2 P04, 0.5; MgSO4. 7H2 01 0.25. In addition, a solution of residual elements (0.3 ml / l) having the following composition (in g / l) (NH4) 2 Fe (SO4) 2 • 6H2 0.90 is added; ZnSO 4 · 7H 2 O, citric acid H 2 O, 50; 161 7;
CuS04 · 5H2 0, 2,5; MnS04 · 4H20, 2; H3B03 , 2; Na2Mo04 · 2H2 0, 2; Kl, 01 5; em H2 S04 a 0,4 N. Antes da esterilizaçãol o pH do meio e ajustado em 6,2. Os balões são esterilizados durante 20 minutes a 120°C e, ap6s a esterilização, adicionam-se 0,05 ml de uma solução a 1 mg/ml de cloridrato de tiamina em água desmineralizada (esterilizada por filtração) As culturas de produção são inoculadas com 0,5 a 10 ml da suspensão de micélio fragmentado preparada acima.CuSO4 · 5H2 O, 2.5; MnSO4 · 4H20.2; H3B03.2; Na 2 Mo 4 · 2H 2 0.2; Kl, 01-5; in 0.4 N H2 SO4. Prior to sterilization, the pH of the medium is adjusted to 6.2. The flasks are sterilized for 20 minutes at 120 ° C and after sterilization 0.05 ml of a 1 mg / ml solution of thiamine hydrochloride in demineralized (filter sterilized) water are added. Production cultures are inoculated 0.5 to 10 ml of the fragmented mycelium suspension prepared above.
As culturas são incubadas durante 139 h em um agitador rotativo (250 rpm; 26°C). A biomassa fúngica é colhida por filtração, lavada com água desmineralizada para remover os componentes do meio e quantificada. A quantidade de β-caroteno produzida é determinada por extração com acetona e medição da extinção a 450 nm da fração de acetona em um espectrofotômetro.The cultures are incubated for 139 h on a rotary shaker (250 rpm; 26 ° C). The fungal biomass is collected by filtration, washed with demineralized water to remove medium components and quantified. The amount of β-carotene produced is determined by acetone extraction and measuring extinction at 450 nm of the acetone fraction on a spectrophotometer.
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