BRPI1103229B1 - MICROPARTICULATE PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING ANTIPARASITARIES FOR PROLONGED SUBCUTANEOUS THERAPY, USE OF THESE PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF A MEDICINE AND METHOD OF TREATING PARASITES - Google Patents

Abstract

composições farmacêuticas microparticuladas contendo antiparasitários para terapia subcutânea prolongada, uso das ditas composições farmacêuticas para a produção de um medicamento e método de tratamento de parasitoses. a inovação ora proposta se refere a uma composição farmacêutica contendo anfotericina b, chalcona nitrada (ch8) ou glucantime encapsulados em micropartículas de polímeros biodegradáveis de liberação lenta, ao processo de encapsulamento do fármaco no interior das partículas;ao uso destas composições farmacêuticas, a um medicamento e ao tratamento de parasitoses.microparticulate pharmaceutical compositions containing antiparasitic drugs for prolonged subcutaneous therapy, use of said pharmaceutical compositions for the production of a medicament and method of treating parasites. the innovation now proposed refers to a pharmaceutical composition containing amphotericin b, chalcone nitrada (ch8) or glucantime encapsulated in microparticles of biodegradable polymers of slow release, to the process of encapsulating the drug inside the particles; to the use of these pharmaceutical compositions, to a medicine and the treatment of parasites.

Description

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

A invenção se refere a uma composição farmacêutica contendo anfotericina B ou compostos antimoniais tais como, antimoniato de meglumina, estibogluconato de sódio e tartarato de potássio e antimonio (III) hidratado (Sb111), ou ainda uma chalcona nitrada, que nesse caso seria a 3-nitro-2-hidroxi- 4,6-dimetoxichalconas que resolvemos denominá-la de CH8. Essas chalconas nitradas(CH8) encapsulados em partículas de polímeros biodegradáveis de liberação lenta. Esta invenção também se refere ao uso destas composições farmacêuticas, a um medicamento e ao tratamento de parasitoses.The invention relates to a pharmaceutical composition containing amphotericin B or antimonial compounds such as meglumine antimoniate, sodium stibogluconate and potassium tartrate and hydrated antimony (III) (Sb111), or a nitrated chalcone, which in this case would be 3 -nitro-2-hydroxy-4,6-dimethoxyhalhals that we decided to call it CH8. These nitrated chalcones (CH8) encapsulated in particles of biodegradable polymers of slow release. This invention also concerns the use of these pharmaceutical compositions, a medicament and the treatment of parasites.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

As doenças parasitárias, entre elas a malária, as leishmanioses, as tripanossomes, além de outras, são consideradas um dos grandes problemas de saúde pública no mundo. Estas doenças, porém, se concentram nos países que apresentam populações de baixa renda, como por exemplo, países da África, Ásia e América do Sul. Isso ocorre em grande parte devido à falta de políticas públicas na área de saúde e saneamento básico, esses países possuem os maiores números de casos e mortes por essas parasitoses.Parasitic diseases, including malaria, leishmaniasis, trypanosomes, among others, are considered one of the major public health problems in the world. These diseases, however, are concentrated in countries with low-income populations, such as countries in Africa, Asia and South America. This is largely due to the lack of public policies in the area of health and basic sanitation, these countries have the highest numbers of cases and deaths from these parasites.

Negligenciadas pelo setor privado, o controle dessas endemias depende, quase que exclusivamente, de iniciativas governamentais (universidades, institutos de pesquisa e laboratórios oficiais), havendo uma grande carência de alternativas para o tratamento quimioterápico. A abordagem terapêutica para estas parasitoses é complicada pelo aparecimento de resistência, tal qual mencionado para os agentes anticancerígenos, havendo também nestes casos a necessidade um esforço contínuo visando o desenvolvimento de novos fármacos.Neglected by the private sector, the control of these endemic diseases depends, almost exclusively, on government initiatives (universities, research institutes and official laboratories), with a great lack of alternatives for chemotherapy treatment. The therapeutic approach for these parasites is complicated by the emergence of resistance, as mentioned for anticancer agents, and in these cases there is also the need for a continuous effort aimed at the development of new drugs.

A leishmaniose é um complexo de doenças causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania, que podem causar no homem e em outros vertebrados um espectro de formas clínicas. Essas podem ser classificadas em forma Tegumentar, que inclui as formas cutânea simples, difusa e mucocutânea, frequentemente desfigurantes, e forma Visceral muitas vezes letal. Estima-se que haja no mundo 12 milhões de pessoas infectadas, e uma incidência anual de 0,5 milhão de casos da forma visceral e 1,5 a 2 milhões de casos da forma tegumentar (WHO, 2004). A Leishmaniose Visceral foi recentemente priorizada pela Organização Mundial de Saúde, junto com a dengue e a tripanossomíase africana, como doenças tropicais de categoria 1 (reemergentes e/ou fora de controle) (REMME et al., 2002). O Brasil ocupa posição ímpar, pois é endêmico para ambas as formas Tegumentar (simples, mucocutânea e difusa) e Visceral, com uma média anual de 30 mil e 4mil casos notificados, respectivamente, e grau de letalidade para esta última de 8,5%. Aqui, a maioria dos casos ocorre nas regiões Norte e Nordeste, com crescimento recente de casos nas regiões Centro- Oeste, Sudeste e DF (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006 e 2007a e b). A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), como são coletivamente chamadas as diferentes formas de leishmanioses tegumentares da América Latina, são causadas por espécies do parasito diferentes das que ocorrem no Velho Mundo. Mais de 80% dos casos são causados pela Leishmania (V) braziliensis, seguida da Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (L.) amazonensis (MINISTÉRIO DA SAÚDE 2007a). O parasito existe como promastigota flagelado no vetor flebotomíneo, e como amastigota aflagelado dentro de fagócitos mononucleares do hospedeiro vertebrado. A localização intracelular privilegiada dificulta o acesso de fármacos ativos, o que torna esta doença de difícil tratamento.Leishmaniasis is a complex of diseases caused by several species of protozoa of the genus Leishmania, which can cause a spectrum of clinical forms in humans and other vertebrates. These can be classified as Tegumentary form, which includes simple, diffuse and mucocutaneous cutaneous forms, often disfiguring, and Visceral form, often lethal. It is estimated that there are 12 million infected people worldwide, and an annual incidence of 0.5 million cases in the visceral form and 1.5 to 2 million cases in the cutaneous form (WHO, 2004). Visceral Leishmaniasis was recently prioritized by the World Health Organization, along with dengue and African trypanosomiasis, as tropical diseases of category 1 (reemerging and / or out of control) (REMME et al., 2002). Brazil occupies a unique position, as it is endemic for both Tegumentary (simple, mucocutaneous and diffuse) and Visceral forms, with an annual average of 30,000 and 4,000 reported cases, respectively, and a lethality rate of 8.5% for the latter. . Here, most cases occur in the North and Northeast regions, with a recent increase in cases in the Midwest, Southeast and DF regions (MINISTRY OF HEALTH, 2006 and 2007a and b). American Tegumentary Leishmaniasis (LTA), as the different forms of Latin American tegumentary leishmaniasis are collectively called, are caused by different parasite species than those that occur in the Old World. More than 80% of cases are caused by Leishmania (V) braziliensis, followed by Leishmania (V.) guyanensis and Leishmania (L.) amazonensis (MINISTRY OF HEALTH 2007a). The parasite exists as a flagellated promastigote in the phlebotomine vector, and as an aflagellate amastigote within mononuclear phagocytes of the vertebrate host. The privileged intracellular location makes it difficult to access active drugs, which makes this disease difficult to treat.

A terapia de pacientes com leishmaniose ainda se baseia no uso de antimoniais pentavalentes. Os sais antimoniais são obtidos sinteticamente a partir do ácido antimônico e da N-metil-glucamina. A administração intramuscular ou endovenosa do antimoniato é rapidamente absorvida, de forma que após 48 horas 90% da dose inicial já foi excretada pelos riqs. Faz-se necessário, altas doses repetidas para manter o nível terapêutico do antimônio nos tecidos. Com isso, surge uma diversidade de efeitos colaterais como mialgia, pancreatite, pancitopenia, hepato e cardiotoxicidade. A pancreatite parece ser a causa frequente de náuseas e dores abdominais (GASSER et al, 1994).The therapy of patients with leishmaniasis is still based on the use of pentavalent antimonials. Antimonials salts are obtained synthetically from antimonic acid and N-methyl-glucamine. Intramuscular or intravenous administration of the antimoniate is rapidly absorbed, so that after 48 hours, 90% of the initial dose has already been excreted by the riqs. Repeated high doses are necessary to maintain the therapeutic level of antimony in the tissues. As a result, a variety of side effects arise, such as myalgia, pancreatitis, pancytopenia, hepato and cardiotoxicity. Pancreatitis appears to be a frequent cause of nausea and abdominal pain (GASSER et al, 1994).

A intolerância ou refratariedade do paciente ao tratamento com antimoniais levam ao uso da pentamidina ou da anfotericina B como drogas de segunda escolha, ambas também administradas por via intramuscular ou endovenosa. A pentamidina tem eficácia semelhante aos antimoniais (TUON et al 2008), mas produz outros efeitos colaterais como hipoglicemia, diabetes, taquicardia, hipotensão, nefrotoxidade e dores locais na administração na dose de 4mg/kg.dia alternados, durante 30 dias pela via intramuscular. A anfotericina B é um antibiótico poliênico isolado da bactéria Streptomyces sp, usado inicialmente como fármaco antifúngico, especialmente em infecções sistêmicas. É indicada como tratamento alternativo para a leishmaniose visceral e mucocutânea, é considerada a droga que apresenta falha terapêutica mais baixa, sendo que, em regiões refratárias aos antimoniais, como na índia, já é tida como medicamento de primeira linha. A dose recomendada é de 0,75- 1mg/kg.dia por 20 dias, administrados através de infusões endovenosas lentas em geral com internação do paciente (BERN et al., 2006). A Anfotericina B, também é indicada para o tratamento de pacientes imunocomprometidos, como pacientes HIV positivos, que embora seja mais ativa que os antimoniais, produz graves efeitos colaterais. Esses efeitos são explicados por sua afinidade também pelo colesterol na membrana da célula humana, mesmo que em menor extensão que ao ergosterol e por sua insolubilidade. Os principais efeitos relatados são hipocalemia, cardio e nefrotoxidade (CROFT &COOMBS, 2003). Algumas alternativas de tratamento estão sendo estudadas, como modificações na dose e duração. Uma alternativa com grande potencial de aplicação seria usar, os sistemas de carreamento e liberação de fármacos, destacando-se como uma das áreas da indústria farmacêutica mais promissora, devido à possibilidade de resgatar drogas ativas que foram descartadas por sua toxidez ou baixa biodisponibilidade e o alto custo no descobrimento e desenvolvimento de novas moléculas ativas.The patient's intolerance or refractoriness to treatment with antimonials leads to the use of pentamidine or amphotericin B as drugs of second choice, both also administered intramuscularly or intravenously. Pentamidine has similar efficacy to antimonials (TUON et al 2008), but it produces other side effects such as hypoglycemia, diabetes, tachycardia, hypotension, nephrotoxicity and local pains at the dose of 4mg / kg. alternating day, for 30 days through the intramuscular route . Amphotericin B is a polyenic antibiotic isolated from the bacterium Streptomyces sp, used initially as an antifungal drug, especially in systemic infections. It is indicated as an alternative treatment for visceral and mucocutaneous leishmaniasis, it is considered the drug with the lowest therapeutic failure, and in regions refractory to antimonials, such as in India, it is already considered a first-line medication. The recommended dose is 0.75-1mg / kg.day for 20 days, administered through slow intravenous infusions in general with hospitalization of the patient (BERN et al., 2006). Amphotericin B is also indicated for the treatment of immunocompromised patients, such as HIV positive patients, which although it is more active than antimonials, produces serious side effects. These effects are explained by its affinity also for cholesterol in the human cell membrane, even if to a lesser extent than for ergosterol and for its insolubility. The main reported effects are hypokalemia, cardio and nephrotoxicity (CROFT & COOMBS, 2003). Some treatment alternatives are being studied, such as changes in dose and duration. An alternative with great potential for application would be to use the drug delivery and delivery systems, standing out as one of the most promising areas of the pharmaceutical industry, due to the possibility of rescuing active drugs that were discarded due to their toxicity or low bioavailability and the high cost in the discovery and development of new active molecules.

Os problemas mais comuns que costumam impedir a aprovação de fármacos potencialmente eficazes são sua rápida metabolização no organismo e os efeitos tóxicos decorrentes de sua baixa solubilidade plasmática e/ou sua ação indiscriminada sobre células sadias. Idealménte, um fármaco de efeito sistêmico deve permanecer na circulação o tempo necessário para seu efeito terapêutico, dentro de uma faixa segura de alta eficácia combinada à baixa toxidez, e um mínimo de doses repetitivas. Além de protegê-lo contra a degradação prematura e promover sua solubilização, o encapsulamento de um fármaco em micro e nanopartículas apropriadas pode ajudar a direcioná-lo para o seu tecido ou célula alvo. Os sistemas de liberação controlada de fármacos apresentam várias vantagens em relação aos sistemas convencionais, tais como: 1) Maior controle da liberação do principio ativo, diminuindo o aparecimento de doses tóxicas e subterapêuticas; 2) Utilização de menor quantidade do principio ativo; 3) Resultando em menor custo; 4) Maior intervalo de administração; melhor aceitação do tratamento pelo paciente e a possibilidade de direcionamento do principio ativo para seu alvo específico.The most common problems that usually prevent the approval of potentially effective drugs are their rapid metabolism in the body and the toxic effects resulting from their low plasma solubility and / or their indiscriminate action on healthy cells. Ideally, a drug with a systemic effect should remain in circulation for as long as necessary for its therapeutic effect, within a safe range of high efficacy combined with low toxicity, and a minimum of repetitive doses. In addition to protecting it from premature degradation and promoting its solubilization, the encapsulation of a drug in appropriate micro and nanoparticles can help to direct it to your target tissue or cell. Controlled drug delivery systems have several advantages over conventional systems, such as: 1) Greater control over the release of the active principle, reducing the appearance of toxic and subtherapeutic doses; 2) Use of a smaller amount of the active ingredient; 3) Resulting in lower cost; 4) Longer administration interval; better acceptance of treatment by the patient and the possibility of directing the active ingredient to its specific target.

Os primeiros a serem desenvolvidos, e únicos já aprovados para uso sistêmico endovenoso, são os lipossomas. A partir da década de 1980 vários polímeros biodegradáveis foram e estão sendo utilizados no preparo de micro e nanopartículas, incluindo os polímeros sintéticos poli-(lático-co- glicólico) (PLGA), além dos biopolímeros quitosana e polihidroxialcanoatos (PHA). De tamanho mais reduzido, na ordem de 1-10 nm, temos a ciclodextrina; e mais recentemente os polímeros esféricos e ramificados, os dendrímeros, que estão sendo estudados quanto à sua viabilidade farmacêutica. Alguns destes sistemas já foram estudados para melhorar a solubilidade e/ou diminuir a toxidez dos antimoniais e da anfotericina B na leishmaniose (ROSSI-BERGMANN e FREZARD, 2007). Devido ao fato da Leishmania infectar quase que exclusivamente macrófagos, o uso de sistemas particulados constituiria uma excelente ferramenta para levar fármacos para a célula infectada, em contato íntimo com os parasites, reduzindo sua toxidez para outras células e o aparecimento de efeitos colaterais. Além disso, limitações farmacocinéticas podem ser contornadas pela liberação lenta dos lipídeos ou polímeros biodegradáveis que constituem as partículas, reduzindo assim sua dosagem.The first to be developed, and the only ones already approved for intravenous systemic use, are liposomes. Since the 1980s, several biodegradable polymers have been and are being used in the preparation of micro and nanoparticles, including synthetic poli- (lactic-co-glycolic) polymers (PLGA), in addition to chitosan and polyhydroxyalkanoates (PHA) biopolymers. Smaller in size, on the order of 1-10 nm, we have cyclodextrin; and more recently, spherical and branched polymers, dendrimers, which are being studied for their pharmaceutical viability. Some of these systems have already been studied to improve the solubility and / or decrease the toxicity of antimonials and amphotericin B in leishmaniasis (ROSSI-BERGMANN and FREZARD, 2007). Due to the fact that Leishmania infects almost exclusively macrophages, the use of particulate systems would be an excellent tool to bring drugs to the infected cell, in close contact with the parasites, reducing their toxicity to other cells and the appearance of side effects. In addition, pharmacokinetic limitations can be circumvented by the slow release of the lipids or biodegradable polymers that make up the particles, thus reducing their dosage.

Os lipossomos foram as primeiras partículas delineadas para vetorização de drogas antileishmaniais. Hoje em dia, a única formulação comercialmente disponível e aprovada para o uso humano para o tratamento da leishmaniose é a Anfotericina B encapsulada em lipossomos unilamelares carregados negativamente (Ambisome®) (SUNDAR & RAI, 2002). Recentes estudos relacionados com a toxicidade e efetividade de formulações lipossomais de antimoniato de meglumina em cães com leishmaniose visceral demonstraram que a formulação reduziu significantemente a carga parasitária da medula óssea dos cães e não provocou mudanças significantes nas funções hepáticas e renais na dose (6.5 mg Sb/kg/dose) com quatro doses (4 dias de intervalos) (FRÉZARD, F. & MICHALICK, M. S. M, 2008).Liposomes were the first particles designed for the vectorization of antileishmanial drugs. Today, the only formulation commercially available and approved for human use for the treatment of leishmaniasis is Amphotericin B encapsulated in negatively charged unilamellar liposomes (Ambisome®) (SUNDAR & RAI, 2002). Recent studies related to the toxicity and effectiveness of liposomal meglumine antimoniate formulations in dogs with visceral leishmaniasis have shown that the formulation significantly reduced the parasitic load on the bone marrow of dogs and did not cause significant changes in liver and kidney function at the dose (6.5 mg Sb / kg / dose) with four doses (4 days intervals) (FRÉZARD, F. & MICHALICK, MS M, 2008).

A aplicação clínica de formulações de anfotericina B associada a lipídeos levou a uma melhora notável na quimioterapia de leishmaniose. Essas formulações associadas a lipídeos como o AmBisome®, encapsulada em lipossomos unilamelares, o Abelcet®, incorporada em complexo lipídico; e o Amphocil®, como uma suspensão coloidal em colesterol foram avaliadas em testes clínicos para leishmaniose visceral e mucocutânea. Das três formulações, o AmBisome® demonstrou maior eficiência favorecendo sua aprovação pelo FDA (Food and Drug Administration). Os efeitos colaterais diminuíram principalmente a nefrotoxidade, por diminuir sua eliminação renal, além de aumentar sua meia vida plasmática. Outra vantagem é a possibilidade de se administrar doses maiores do fármaco em menor espaço de tempo. Porém, o fator limitante do uso dessas formulações lipossomais é o alto da fosfatidilcolina, o que inviabiliza o acesso ao tratamento por grande parte da população afetada (GOLENSER et al. 1999).The clinical application of amphotericin B formulations associated with lipids has led to a notable improvement in leishmaniasis chemotherapy. These formulations associated with lipids such as AmBisome®, encapsulated in unilamellar liposomes, Abelcet®, incorporated in a lipid complex; and Amphocil®, as a colloidal suspension in cholesterol were evaluated in clinical tests for visceral and mucocutaneous leishmaniasis. Of the three formulations, AmBisome® demonstrated greater efficiency favoring its approval by the FDA (Food and Drug Administration). Side effects mainly decreased nephrotoxicity, by decreasing its renal elimination, in addition to increasing its plasma half-life. Another advantage is the possibility of administering larger doses of the drug in less time. However, the limiting factor in the use of these liposomal formulations is the high level of phosphatidylcholine, which prevents access to treatment by a large part of the affected population (GOLENSER et al. 1999).

Os sistemas poliméricos micro e nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos que incluem cápsulas e esferas. Sua maior vantagem em relação aos lipossomos é a maior estabilidade, podendo ser liofilizados para armazenagem. Fatores como tipo e proporção dos polímeros na formulação determinam características importantes como estabilidade e estrutura cristalina e biodegradabilidade, que influencia na velocidade de liberação do fármaco (SCHAFFAZICK &GUTERRES, 2003). O polímero de poli (lactídeo), ou PLA, é um dos mais estudados para aplicação biológica, por sua alta biodegradabilidade e biocompatibilidade, já tendo inclusive uso clínico aprovado na constituição de fios de suturas e próteses ortopédicas biodegradáveis. As nanoesferas de PLA já foram também testadas com certo sucesso como carreadoras de vários antileishmaniasis, como a primaquina, pentamidina, bacopasaponina e atovaquona, para o tratamento experimental da leishmaniose visceral por via endovenosa. Na leishmaniose cutânea, As nanopartículas de PLA de 200 nm foram testadas com sucesso pelo nosso grupo, na veiculação da chalcona nitrada(CHδ) DMC para o tratamento subcutâneo de camundongos infectados com L. amazonensis (TORRES- SANTOS et al., 1999).Polymeric micro and polymeric nanoparticles systems are drug carrier systems that include capsules and spheres. Its greatest advantage over liposomes is its greater stability, which can be lyophilized for storage. Factors such as type and proportion of polymers in the formulation determine important characteristics such as stability and crystalline structure and biodegradability, which influences the speed of drug release (SCHAFFAZICK & GUTERRES, 2003). The poly (lactide) polymer, or PLA, is one of the most studied for biological application, due to its high biodegradability and biocompatibility, and has even been approved for clinical use in the constitution of suture threads and biodegradable orthopedic prostheses. PLA nanospheres have also been tested with some success as carriers of various antileishmaniasis, such as primaquine, pentamidine, bacopasaponine and atovaquone, for the experimental treatment of visceral leishmaniasis intravenously. In cutaneous leishmaniasis, the 200 nm PLA nanoparticles were successfully tested by our group in the delivery of the nitrated chalcone (CHδ) DMC for the subcutaneous treatment of mice infected with L. amazonensis (TORRES-SANTOS et al., 1999).

Os primeiros registros do uso de partículas poliméricas para veiculação de antileishmaniais datam de 1987, quando micropartículas de poliacrilamida com diâmetro superior a 1pm foram utilizadas para complexação do antimonial pentavalente estibogluconato de sódio (DHANARAJUA, M. D. et al., 2006; ESPUELAS, M. S. et al., 2002). Como mencionado acima, por seu tamanho relativamente grande, as micropartículas não são indicadas para uso parenteral pelo risco de formação de êmbolos e trombos nos capilares sanguíneos, sendo seu uso terapêutico geralmente restrito às vias subcutânea, intramuscular, oral ou intranasal. Até hoje nenhuma formulação polimérica foi disponibilizada comercialmente para tratamento da leishmaniose humana. Além do PLA, o PLGA também é interessante como sistema de liberação controlada de drogas. Este polímero também já foi aprovado pelo FDA, como estruturas biodegradáveis usadas em parafusos e tachas ortopédicos, fios de sutura e sistemas de reparo de menisco e cartilagem (ELIAZ e KOST, 2000). Além disso, o PLGA é amplamente utilizado na medicina cosmética no preenchimento subcutâneo de rugas, com alto grau de aceitação pelos pacientes. Os medicamentos formulados em polímeros e aprovados para uso humano são todos dirigidos para o tratamento do câncer em microcápsulas poliméricas (> 1000 nm) e têm aplicação potencial nos casos em que interessa a formação de depósitos para liberação local lenta e contínua, como por exemplo, em vacinas ou tratamentos crônicos localizados.The first records of the use of polymeric particles for the transmission of antileishmanials date back to 1987, when polyacrylamide microparticles with a diameter greater than 1pm were used to complex the pentavalent antimonial sodium stibogluconate (DHANARAJUA, MD et al., 2006; ESPUELAS, MS et al ., 2002). As mentioned above, due to their relatively large size, microparticles are not indicated for parenteral use because of the risk of emboli and thrombus formation in blood capillaries, their therapeutic use being generally restricted to the subcutaneous, intramuscular, oral or intranasal routes. To date, no polymeric formulation has been commercially available for the treatment of human leishmaniasis. In addition to PLA, PLGA is also interesting as a controlled drug delivery system. This polymer has also been approved by the FDA, as biodegradable structures used in orthopedic screws and tacks, sutures and meniscus and cartilage repair systems (ELIAZ and KOST, 2000). In addition, PLGA is widely used in cosmetic medicine in subcutaneous filling of wrinkles, with a high degree of acceptance by patients. Medicines formulated in polymers and approved for human use are all directed to the treatment of cancer in polymeric microcapsules (> 1000 nm) and have potential application in cases where the formation of deposits for slow and continuous local release, such as, vaccines or chronic localized treatments.

O primeiro produto de PLGA aprovado pelo FDA foi o LupronDepot em 1996 (TAP Pharmaceutical Products Inc), micropartículas de 75:25 lactideo/glicolídeo contendo Leuprolide para o tratamento de câncer avançado de próstata . Administrado localmente, o LupronDepot forma um depósito e libera a droga gradualmente, podendo ser administrado em intervalos de até 4 meses, substituindo as injeções diárias de Leuprolide livre (KADA et al., 1994). Micropartículas de PLGA já estão sendo testadas, em humanos, como sistemas de liberação de vacina. Trata-se de teste clínico está em andamento no Brasil em pacientes com câncer avançado de colo e pescoço, desenvolvida por SILVA, C. L e colaboladores.The first FDA approved PLGA product was LupronDepot in 1996 (TAP Pharmaceutical Products Inc), 75:25 lactide / glycolide microparticles containing Leuprolide for the treatment of advanced prostate cancer. Administered locally, LupronDepot forms a deposit and releases the drug gradually and can be administered at intervals of up to 4 months, replacing the daily injections of free Leuprolide (KADA et al., 1994). PLGA microparticles are already being tested, in humans, as vaccine delivery systems. This is a clinical trial underway in Brazil in patients with advanced cancer of the neck and neck, developed by SILVA, C. L and collaborators.

Os primeiros registros do uso de partículas poliméricas para veiculação de antileishmaniais datam de 1987, quando micropartículas de poliacrilamida com diâmetro superior a 1pm foram utilizadas para complexação do antimonial pentavalente estibogluconato de sódio. Os trabalhos que se seguiram utilizaram primaquina e IFN-gama como ativos, também utilizando a via endovenosa em camundongos, e mostraram a sua potencialização e acúmulo principalmente no fígado (FORTINA, etal., 2005; ITO, et al., 2005).The first records of the use of polymeric particles for the delivery of antilishmanials date back to 1987, when polyacrylamide microparticles with a diameter greater than 1pm were used to complex the pentavalent antimonial sodium stibogluconate. The works that followed used primaquine and IFN-gamma as assets, also using the intravenous route in mice, and showed their potentiation and accumulation mainly in the liver (FORTINA, etal., 2005; ITO, et al., 2005).

O polímero de poli (lactídeo), ou PLA, é um dos mais estudados para o preparo de micropartículas para aplicação biológica, por sua alta bidegradabilidade e biocompatibilidade, já tendo inclusive uso clínico aprovado na constituição de fios de suturas biodegradáveis, assim como o PLGA, as nanoesferas de PLA já foram também testadas com certo sucesso como carreadoras de vários antileishmaniasis, como a primaquina, pentamidina, bacopasaponina e atovaquona, para o tratamento experimental da leishmaniose visceral por via endovenosa.The poly (lactide) polymer, or PLA, is one of the most studied for the preparation of microparticles for biological application, due to its high bi-compatibility and biocompatibility, and has even been approved for clinical use in the constitution of biodegradable suture threads, as well as PLGA , PLA nanospheres have also been tested with some success as carriers of various antileishmaniasis, such as primaquine, pentamidine, bacopasaponine and atovaquone, for the experimental treatment of visceral leishmaniasis intravenously.

Pinero J. e colaboradores 2006, mostraram que implantes de filmes de PLA e PLGA veiculando uma trans-chalcona foram testadas em camundongos BALB/c infectados com L amazonensis na pata. Nesta avaliação cada indivíduo recebeu um implante de 3 mm na orelha 5 semanas após a infecção. Os resultados mostraram que os camundongos implantados com a droga em PLA e PLGA induziram uma redução significativa no tamanho das lesões. Já os camundongos que receberam implantes de PLA vazias também apresentaram diminuição no tamanho da lesão devido aparentemente a uma atividade pro-inflamatória intrínseca do PLA que poderia estar ativando mecanismos antimicrobicidas dos macrófagos.Pinero J. et al. 2006 showed that PLA and PLGA film implants carrying a trans-chalcone were tested in BALB / c mice infected with L amazonensis in the paw. In this evaluation, each individual received a 3 mm implant in the ear 5 weeks after infection. The results showed that mice implanted with the drug in PLA and PLGA induced a significant reduction in the size of the lesions. Mice that received empty PLA implants also showed a decrease in lesion size, apparently due to an intrinsic pro-inflammatory activity of PLA that could be activating macrophage antimicrobial mechanisms.

Assim, tendo em vista a biocompatibilidade comprovada do polímero de PLGA, inclusive na forma de micropartículas para injeção subcutânea em preenchimento cosméticos, neste estudo propomos avaliar o potencial das micropartículas de PLGA para melhoramento da eficácia do tratamento da leishmaniose cutânea através da administração intralesional de compostos antimoniais, chalcona nitrada(CH8) e Anfotericina B. A terapêutica convencional baseada em séries de injeções intramusculares contribui de certa forma para o insucesso do tratamento, porque além da elevada toxicidade destes fármacos o regime terapêutico longo com múltiplas doses diminui a adesão de muitos pacientes. A administração intralesional de antimoniais vem sendo usada visando minimizar os efeitos colaterais sistêmicos e apresentam resultados satisfatórios, mas provoca dor no local de administração devido à necessidade de múltiplas injeções locais.Thus, in view of the proven biocompatibility of the PLGA polymer, including in the form of microparticles for subcutaneous injection in cosmetic fillers, in this study we propose to evaluate the potential of PLGA microparticles for improving the effectiveness of the treatment of cutaneous leishmaniasis through the intralesional administration of compounds antimonials, nitrated chalcone (CH8) and Amphotericin B. Conventional therapy based on series of intramuscular injections contributes in a way to treatment failure, because in addition to the high toxicity of these drugs, the long therapeutic regimen with multiple doses decreases the compliance of many patients . Intralesional administration of antimonials has been used to minimize systemic side effects and has satisfactory results, but it causes pain at the site of administration due to the need for multiple local injections.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

Para melhor esclarecimento desta invenção, as chalconhas nitrogenadas que aqui nos referimos tratam-se da 3-nitro-2-hidroxi-4,6-dimetoxichalcona, que para facilitar iremos denomina-la de CH8.For a better explanation of this invention, the nitrogenous chalches that we refer to here are 3-nitro-2-hydroxy-4,6-dimethoxyhalhal, which we will call CH8 to facilitate.

O primeiro objetivo desta invenção trata de composições farmacêuticas contendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de medicamentos ou fármacos antileishmaniais encapsulados em partículas de PLGA.The first objective of this invention concerns pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically effective amount of antilandishmanial drugs or drugs encapsulated in PLGA particles.

O segundo objeto desta invenção trata do uso das composições farmacêuticas contendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de Anfotericina B, chalcona nitrada (CH8) ou compostos antimoniais, encapsulados em partículas de PLGA voltada para a produção de um medicamento para o tratamento subcutâneo de doenças cutâneas inflamatórias e infecciosas da pele ou em regiões da pele (derme, epiderme e anexos), tais como, leishmaniose, micoses, hanseníase, psoríases, úlcera tropical, verrugas, hemangioma cavernoso em animais mamíferos.The second object of this invention deals with the use of pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically effective amount of Amphotericin B, nitrated chalcone (CH8) or antimonial compounds, encapsulated in PLGA particles aimed at the production of a medicine for the subcutaneous treatment of inflammatory skin diseases and infectious skin or skin regions (dermis, epidermis and appendages), such as leishmaniasis, mycoses, leprosy, psoriasis, tropical ulcer, warts, cavernous hemangioma in mammalian animals.

O terceiro objeto desta invenção é uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anfotericina B, chalcona nitrada (CH8) ou de compostos antimoniais encapsulados em partículas de PLGA, além de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.The third object of this invention is a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of Amphotericin B, nitrated chalcone (CH8) or antimonial compounds encapsulated in PLGA particles, in addition to pharmaceutically acceptable excipients.

O último objeto desta invenção trata de método de tratamento de parasitoses que compreende a aplicação subcutânea de uma quantidade terapeuticamente efetiva de Anfotericina B, chalcona nitrada (CH8) ou compostos antimoniais, encapsulados em micropartículas de PLGA a um animal mamífero portador da leishmaniose.The last object of this invention deals with a method of treating parasitosis that comprises the subcutaneous application of a therapeutically effective amount of Amphotericin B, nitrated chalcone (CH8) or antimonial compounds, encapsulated in PLGA microparticles to a mammalian animal with leishmaniasis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Esta invenção trata de composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de medicamentos ou fármacos antileishmaniais encapsulados em partículas de PLGA, tendo como exemplos de fármacos como a Anfotericina B, chalcona nitrada(CH8) e compostos antimoniais. O agente ativo pode constituir cerca de 5 a 85% do peso da formulação. Concentração variada de compostos ativos pode possibilitar uma liberação inicial mais rápida no tecido após a administração local. Em uma variação exemplificativa como será mostrado a seguir, utilizamos 10% de Anfotericina B em relação ao polímero (p/p).This invention deals with pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically effective amount of anti-leishmanial medications or drugs encapsulated in PLGA particles, having as examples of drugs such as Amphotericin B, nitrated chalcone (CH8) and antimonial compounds. The active agent can make up about 5 to 85% by weight of the formulation. Varied concentration of active compounds can enable faster initial release into tissue after local administration. In an exemplary variation as will be shown below, we use 10% Amphotericin B in relation to the polymer (w / w).

Exemplos de medicamentos ou fármacos utilizados são a Anfotericina B, chalcona nitrada(CHδ) e compostos antimoniais tais como, antimoniato de meglumina, estibogluconato de sódio e tartarato de potássio e antimonio (III) hidratado (Sblll), combinados ou não.Examples of medications or drugs used are Amphotericin B, nitrated chalcone (CHδ) and antimonial compounds such as, meglumine antimoniate, sodium stibogluconate and potassium tartrate and hydrated antimony (III) (Sblll), combined or not.

Um processo de encapsulamento desses fármacos, Anfotericina B, chalcona nitrada(CH8) ou compostos antimoniais em partículas de PLGA de tamanhos variando entre 0,5 e õOOpm. Em uma variação, copolímeros de ácido glicólico e lático são usados e o percentual de cada monômero de ácido poli (lático-co-glicólico) pode ser, cerca de 15-85%, cerca de 25-75%, cerca de 35- 65%, ou a proporção de 50-50% podem ser empregadas.An encapsulation process for these drugs, Amphotericin B, nitrated chalcone (CH8) or antimonial compounds in PLGA particles of sizes varying between 0.5 and OOOOpm. In one variation, glycolic and lactic acid copolymers are used and the percentage of each poly (lactic-co-glycolic) monomer can be about 15-85%, about 25-75%, about 35-65 %, or the 50-50% proportion can be used.

O segundo objeto desta invenção trata do uso das composições farmacêuticas contendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de Anfotericina B ou compostos antimoniais, preferencialmente, Glucantime e chalcona nitrada(CHδ) encapsulados em partículas de PLGA voltada para a produção de um medicamento para o tratamento subcutâneo de doenças cutâneas inflamatórias e infecciosas da pele ou em regiões da pele (derme, epiderme e anexos), tais como leishmaniose, micoses, hanseníase, psoríases, ulcera tropical, verrugas, hemangioma cavernoso em animais mamíferos.The second object of this invention deals with the use of pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically effective amount of Amphotericin B or antimonial compounds, preferably Glucantime and nitrated chalcone (CHδ) encapsulated in PLGA particles aimed at the production of a medicine for the subcutaneous treatment of diseases inflammatory and infectious cutaneous skin or skin regions (dermis, epidermis and appendages), such as leishmaniasis, mycoses, leprosy, psoriasis, tropical ulcer, warts, cavernous hemangioma in mammalian animals.

O terceiro objeto desta invenção é uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anfotericina B ou de compostos antimoniais como Glucantime e chalcona nitradas(CHδ) encapsulados em partículas de PLGA, além de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.The third object of this invention is a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of Amphotericin B or antimonial compounds such as Glucantime and nitrated chalcone (CHδ) encapsulated in PLGA particles, in addition to pharmaceutically acceptable excipients.

O último objeto desta invenção trata de método de tratamento de parasitoses que compreende a aplicação subcutânea de uma quantidade terapeuticamente efetiva de Anfotericina B ou compostos antimoniais como Glucantime e chalcona nitradas(CHδ) encapsulados em micropartículas de PLGA a um animal mamífero portador da leishmaniose.The last object of this invention deals with a method of treating parasitosis that comprises the subcutaneous application of a therapeutically effective amount of Amphotericin B or antimonial compounds such as Glucantime and nitrated chalcone (CHδ) encapsulated in PLGA microparticles to a mammalian animal with leishmaniasis.

PROCESSO DE ENCAPSULAMENTOENCAPSULATION PROCESS PRODUÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS DE PLGA:PRODUCTION OF PLGA MICROPARTICLES:

As partículas PLGA contendo a Anfotericina B e os compostos antimoniais serão produzidos pelo método de emulsificação múltipla (Ai / 0 / A2), seguida pelo método de evaporação de solvente. Inicialmente, 0 polímero (PLGA) será dissolvido em diclorometano (fase orgânica), a esta fase orgânica, será adicionado 1 ml de solução tampão pH 7,4 contendo os fármacos (10% em relação ao polímero (p/p)), e a mistura das fases será promovida sob ultra agitação de 7000rpm durante 30 segundos, para a formação de uma emulsão simples (Ai / 0). Essa emulsão simples será dispersa na fase contínua (A2) sob ultra-homogeneização de 7000rpm por 60 segundos, uma solução aquosa de 3% de ácido polivinílico (PVA) será adicionada ao sistema e a evaporação do solvente será sob agitação de 400 rpm durante 4horas. Na etapa final, a suspensão de micropartículas será centrifugada a 4000 rpm durante 5 minutos, lavada com água destilada 3 vezes e congelada em freezer -20°C para posterior liofilização por 16 horas. O agente ativo pode constituir cerca de 5 a 85% do peso da formulação.The PLGA particles containing Amphotericin B and antimonial compounds will be produced by the multiple emulsification method (Ai / 0 / A2), followed by the solvent evaporation method. Initially, the polymer (PLGA) will be dissolved in dichloromethane (organic phase), to this organic phase, 1 ml of pH 7.4 buffer solution containing the drugs (10% in relation to the polymer (w / w)) will be added, and the mixing of the phases will be carried out under ultra-agitation of 7000rpm for 30 seconds, for the formation of a simple emulsion (Ai / 0). This simple emulsion will be dispersed in the continuous phase (A2) under ultra-homogenization of 7000rpm for 60 seconds, an aqueous solution of 3% polyvinyl acid (PVA) will be added to the system and the evaporation of the solvent will be stirred at 400 rpm for 4 hours. . In the final step, the microparticle suspension will be centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes, washed with distilled water 3 times and frozen in a -20 ° C freezer for later lyophilization for 16 hours. The active agent can make up about 5 to 85% by weight of the formulation.

DETERMINAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DAS PARTÍCULASDETERMINATION OF CHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE PARTICLES A) TAXA DE INCORPORAÇÃO DOS FÁRMACOSA) RATE OF INCORPORATION OF DRUGS

A determinação do teor dos fármacos nas partículas é importante para a garantia da dose correta a ser utilizada nos ensaios. Os teores de Anfotericina B nas partículas de PLGA serão determinados por CLAE. Os teores de antimônio (Sb) serão determinados por absorção atômica.The determination of the content of drugs in the particles is important to ensure the correct dose to be used in the tests. The contents of Amphotericin B in the PLGA particles will be determined by HPLC. The levels of antimony (Sb) will be determined by atomic absorption.

B) TAXA DE LIBERAÇÃO DOS FÁRMACOSB) DRUG RELEASE RATE

As partículas de PLGA terão a velocidade de liberação dos fármacos determinada em tampão fisiológico pH 7,2 a 37°C. Para tal, 10 mg de partícula serão incubados em 1ml de PBS, acrescido de 0,1% de azida, sob agitação constante de 80rpm e temperatura de 37°C. A coleta das amostras será feita através de centrifugação, retirada de 500 pil em tempos variando de 1 hora a 270 dias. As amostras serão analisadas por UV-CLAE para determinar o teor da anfotericina B liberada, o teor de antimônio será analisado por absorção atômica. Será construída a curva: % de liberação x tempo.The PLGA particles will have the drug release rate determined in physiological buffer pH 7.2 at 37 ° C. For this purpose, 10 mg of particle will be incubated in 1 ml of PBS, plus 0.1% of azide, under constant agitation of 80 rpm and temperature of 37 ° C. The collection of the samples will be done through centrifugation, removal of 500 pil in times varying from 1 hour to 270 days. The samples will be analyzed by UV-HPLC to determine the content of amphotericin B released, the antimony content will be analyzed by atomic absorption. The curve will be constructed:% of release x time.

C) DEGRADAÇÃO POLIMÉRICA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURAC) POLYMERIC DEGRADATION BY SCAN ELECTRONIC MICROSCOPY

A degradação e morfologia das micropartículas de PLGA em tampão PBS por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As partículas de PLGA obtidas em tempos variados em b acima serão liofilizadas e tratadas para visualização por MEV.Degradation and morphology of PLGA microparticles in PBS buffer by scanning electron microscopy (SEM). The PLGA particles obtained at different times in b above will be lyophilized and treated for visualization by SEM.

D) ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO E DEGRADAÇÃO POLIMÉRICA DAS PARTÍCULASD) ANALYSIS OF THE DISTRIBUTION AND POLYMERIC DEGRADATION OF THE PARTICLES

A análise de tamanho e distribuição das partículas obtidas em b por centrifugação e liofilização será feita, usando o analisador de distribuição granulométrica Coulter LS230. Pequenas quantidades de partículas serão dispersas em etanol absoluto P.A. com auxílio de ultrassom até atingirem o índice de obscuração requisitado pelo aparelho. O tamanho médio de partícula será expresso com o diâmetro médio em volume (D4,3). O diâmetro das partículas será calculado em Do,9, Do,i e Do,5 , que significam o diâmetro de partícula correspondente a 90, 50 e 10 % da distribuição acumulada e a polidispersão será dada pelo índice span,o qual será calculado por (D0,9 - D0,1/D0,5). As partículas analisadas em C por MEV terão também seu tamanho médio avaliado pelo analisador Coulter LS230.The size and distribution analysis of the particles obtained in b by centrifugation and lyophilization will be done, using the Coulter LS230 particle size distribution analyzer. Small amounts of particles will be dispersed in P.A. absolute ethanol with the aid of ultrasound until they reach the obscuration index required by the device. The average particle size will be expressed with the average diameter in volume (D4,3). The particle diameter will be calculated in Do, 9, Do, ie Do, 5, which means the particle diameter corresponding to 90, 50 and 10% of the accumulated distribution and the polydispersity will be given by the span index, which will be calculated by ( D0.9 - D0.1 / D0.5). The particles analyzed in C by SEM will also have their average size evaluated by the Coulter LS230 analyzer.

E) ANÁLISE DE CARGA SUPERFICIAL (POTENCIAL ZETA)E) SURFACE LOAD ANALYSIS (ZETA POTENTIAL)

As partículas de PLGA serão dispersas em água com pH corrigido para 7,0 e as medidas de potencial zeta serão determinadas em um aparelho Zetamaster (Malvern Instruments). A dispersão das micropartículas para as medidas de potencial zeta será preparada em duplicata e cada amostra será medida 10 vezes.The PLGA particles will be dispersed in water with pH corrected to 7.0 and the zeta potential measurements will be determined in a Zetamaster device (Malvern Instruments). The dispersion of the microparticles for the zeta potential measurements will be prepared in duplicate and each sample will be measured 10 times.

ESTUDOS IN VITROIN VITRO STUDIES A) AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIAMASTIGOTA INTRACELULARA) EVALUATION OF INTRACELLULAR ANTIAMASTIGOTA ACTIVITY

Macrófagos serão isolados do peritôneo de camundongos BALB/c, por aderência em placas de cultura de 24 poços, infectados com promastigotas de L. amazonensis GFP e tratados com as formulações por 72h. Após 0 tempo de incubação, as células serão raspadas e a carga parasitária será avaliada por fluorimetria em fluorímetro de placa (excitação 485 nm, emissão 528 nm) (ROSSI-BERGMANN, et al., 1999) (FLxδOO, Bio- Tek Instruments, Inc) para L. amazonensis ou contagem em microscópica.Macrophages will be isolated from the peritoneum of BALB / c mice by adhering to 24-well culture plates, infected with L. amazonensis GFP promastigotes and treated with the formulations for 72 hours. After the incubation time, the cells will be scraped and the parasitic load will be assessed by fluorimetry in a plate fluorimeter (excitation 485 nm, emission 528 nm) (ROSSI-BERGMANN, et al., 1999) (FLxδOO, Bio-Tek Instruments, Inc) for L. amazonensis or microscopic counting.

B) EFEITO CITOTÓXICO OU ADJUVANTE SOBRE OS MACRÓFOGOSB) CITOToxic OR ADJUVANT EFFECT ON MACROPHOGS

Macrófagos serão isolados do peritôneo de camundongos BALB/c, por aderência em placas de cultura de 24 poços, partículas de PLGA vazias ou contendo os fármacos serão adicionadas e após 72 horas o sobrenadante das culturas será avaliado quanto à produção de NO (Oxido Nítrico) pela metodologia de Griss e para avaliação da atividade microbicida e a presença da enzima lactato desidrogenase (LDH), para avaliação de toxicidade por necrose, pela dosagem do lactato (Kit Dolles).Macrophages will be isolated from the peritoneum of BALB / c mice, by adhering to 24-well culture plates, empty PLGA particles or containing the drugs will be added and after 72 hours the culture supernatant will be evaluated for NO (Nitric Oxide) production by the Griss methodology and to evaluate the microbicidal activity and the presence of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH), to evaluate toxicity by necrosis, by the lactate dosage (Kit Dolles).

C) HISTOPATOLOGIA DA PELEC) SKIN HISTOPATHOLOGY

Para avaliar o efeito inflamatório intralesional provocado pelas formulações e ao mesmo tempo avaliar a degradação das partículas de PLGA in situ,os animais serão sacrificados em diferentes tempos após a administração. As orelhas serão fixadas e serão feitos cortes histológicos das patas infectadas e tratadas para análise histopatológica por microscopia ótica.To assess the intralesional inflammatory effect caused by the formulations and at the same time to evaluate the degradation of PLGA particles in situ, the animals will be sacrificed at different times after administration. The ears will be fixed and histological cuts will be made of the infected paws and treated for histopathological analysis by optical microscopy.

D) AVALIAÇÃO DE IMUNOTOXICIDADE CUTÂNEA DAS MICROFORMULAÇÔES DE EM CAMUNDONGOS HAIRLESSD) ASSESSMENT OF CUTANEOUS IMMUNOTOXICITY OF MICROFORMULATION IN HAIRLESS MICE

O teste de medida de edema de orelha (mouse ear swelling test - MEST). É recomendado pela OECD e ANVISA e será realizado para avaliação de imunotoxicidade cutânea (alergenicidade), - Teste de medida de edema de orelha (mouse ear swelling test - MEST)The ear ear swelling test (MEST) test. It is recommended by OECD and ANVISA and will be carried out to assess skin immunotoxicity (allergenicity), - Ear ear swelling test (MEST)

O MEST avalia o aumento da espessura da orelha como sinal de sensibilização cutânea. Os animais receberão 3 aplicações tópicas de 10Oul das formulações a cada 2 dias (dias 0, 2 e 4) na região dorsal (fase de indução). Após 5 dias, será feita a aplicação tópica de 10ul das substancias em uma orelha e na outra 10ul da formulação será aplicada intradermicamente (fase de desafio). Esse é o tempo necessário para que o organismo produza a resposta imunológica. As medidas do inchaço das orelhas serão avaliadas nos tempos 6, 18, 36, 48 e 72 horas depois do desafio. A sensibilização cutânea é positiva quando há um aumento da espessura da orelha acima de 10% em relação ao grupo controle. O oxazolone (0,3%) é a substância mais utilizada como controle positivo nestes testes de sensibilização cutânea e, segundo a literatura, promove um aumento de 30% da espessura da orelha em relação à medida antes do desafio. E) AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOSThe MEST assesses the increase in ear thickness as a sign of skin sensitization. The animals will receive 3 topical applications of 10Oul of the formulations every 2 days (days 0, 2 and 4) in the dorsal region (induction phase). After 5 days, 10ul of the substances will be applied topically in one ear and in the other 10ul of the formulation will be applied intradermally (challenge phase). This is the time needed for the body to produce the immune response. The measurements of ear swelling will be evaluated at times 6, 18, 36, 48 and 72 hours after the challenge. Skin sensitization is positive when there is an increase in the thickness of the ear above 10% in relation to the control group. Oxazolone (0.3%) is the substance most used as a positive control in these skin sensitization tests and, according to the literature, it promotes an increase of 30% in the thickness of the ear in relation to the measurement before the challenge. E) EVALUATION OF PHARMACOKINETIC PARAMETERS

Os animais serão tratados pela via intralesional, o sangue será coletado e o plasma obtido por centrifugação será pré-tratado seguindo a metodologia proposta por (WANG & MORRIS, 2005; PAGANGA & RICE- EVANS, 1997 e-MANACH et a/., 1996) baixando o pH para 4 utilizando H3PO4; acidificando com Acetonitrila e centrifugando. A acidificação das amostras é importante para quebrar possíveis ligações com proteínas plasmáticas. Após este procedimento as amostras de plasma serão analisadas utilizando UV- CLAE para a anfotericina B e absorção atômica para os antimoniais. Os parâmetros farmacocinéticos (Cmax; ASC0-~; t14β; Vd; e Cl) serão obtidos com auxilio de um software (ADAPT: Pharmacokinetic/pharmacodynamic systems analysis) produzido pela University of Southern California, disponível gratuitamente para download. Alternativamente, para determinação da quantidade de droga liberada localmente, as orelhas tratadas serão removidas após diferentes tempos, e maceradas em acetonitrila. As suspensões serão clarificadas por centrifugação e processadas como descrito para 0 plasma.The animals will be treated intralesionally, the blood will be collected and the plasma obtained by centrifugation will be pre-treated following the methodology proposed by (WANG & MORRIS, 2005; PAGANGA & RICE-EVANS, 1997 e-MANACH et a /., 1996 ) lowering the pH to 4 using H3PO4; acidifying with Acetonitrile and centrifuging. The acidification of the samples is important to break possible links with plasma proteins. After this procedure, the plasma samples will be analyzed using UV-HPLC for amphotericin B and atomic absorption for antimonials. The pharmacokinetic parameters (Cmax; ASC0- ~; t14β; Vd; and Cl) will be obtained with the aid of software (ADAPT: Pharmacokinetic / pharmacodynamic systems analysis) produced by the University of Southern California, available for free to download. Alternatively, to determine the amount of drug released locally, the treated ears will be removed after different times, and macerated in acetonitrile. The suspensions will be clarified by centrifugation and processed as described for the plasma.

DESCRIÇÃO DAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES

A Figura 1 mostra 0 resultado da análise de tamanho das partículas de PLGA contendo 0 Glucantime (antimoniato de meglumina) ou Anfotericina B, onde a figura 1A representa as micropartículas vazias, 1B as micropartículas contendo Glucantime e 1C as micropartículas contendo Anfotericina B.Figure 1 shows the result of the particle size analysis of PLGA containing 0 Glucantime (meglumine antimoniate) or Amphotericin B, where Figure 1A represents the empty microparticles, 1B the microparticles containing Glucantime and 1C the microparticles containing Amphotericin B.

A figura 2 mostra a análise da morfologia das partículas de PLGA avaliada por MEV e as imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das partículas de PLGA vazias (A), Glucantime (B), com Anfotericina B (C). Aumentos de 1500X, 3500X e 5000X, respectivamente.Figure 2 shows the analysis of the morphology of the PLGA particles evaluated by SEM and the images obtained by scanning electron microscopy (SEM) of the empty PLGA particles (A), Glucantime (B), with Amphotericin B (C). Increases of 1500X, 3500X and 5000X, respectively.

A figura 3A mostra 0 ensaio in vitroda incorporação de Anfotericina B em micropartículas de PLGA, onde as micropartículas de PLGA/Anfotericina B (1mg/ml) foram dissolvidas previamente em DMSO, em seguida, a amostra foi diluída em uma solução aquosa de Ácido Fosfórico (0,001%) e Acetonitrila (60/40) nas concentrações A=50ug/ml; B=100ug/ml e C=200ug/ml. A Incorporação teórica de Anfotericina B nas micropartículas é de 10% (p/p). As amostras foram feitas em triplicatas.Figure 3A shows the in vitro test of incorporation of Amphotericin B into PLGA microparticles, where the PLGA / Amphotericin B microparticles (1mg / ml) were previously dissolved in DMSO, then the sample was diluted in an aqueous solution of Phosphoric Acid (0.001%) and Acetonitrile (60/40) at concentrations A = 50ug / ml; B = 100ug / ml and C = 200ug / ml. Theoretical incorporation of Amphotericin B in the microparticles is 10% (w / w). The samples were made in triplicates.

A figura 3B mostra o ensaio in vitroda liberação de Anfotericina B, onde as micropartículas de PLGA/Anfotericina B, (6mg/ml contendo 535pg de Anfotericina B /ml), foram incubadas em solução de PBS 0,1% de Azida, pH=7.2 e mantido a 37°C em agitação constante de 80rpm. Em diferentes tempos as amostras foram centrifugadas a 1500rpm por 10 minutos e alíquotas foram retiradas do sobrenadante para dosagem em HPLC da Anfotericina B liberada. O teor de Anfotericina B nas partículas é de 8,92% (Gráfico 6.2.3).Figure 3B shows the Amphotericin B release test, where the PLGA / Amphotericin B microparticles, (6mg / ml containing 535pg of Amphotericin B / ml), were incubated in PBS 0.1% Azide solution, pH = 7.2 and maintained at 37 ° C with constant agitation of 80rpm. At different times, the samples were centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes and aliquots were removed from the supernatant for HPLC measurement of released Amphotericin B. The content of Amphotericin B in the particles is 8.92% (Graph 6.2.3).

A figura 4 mostra a análise da erosão das micropartículas de PLGA contendo anfotericina B, através das imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As imagens A e B no tempo zero, as imagens C e D com tempo igual a 30 dias em tampão PBS e, as imagens E e F com tempo igual a 120 dias em tampão PBS.Figure 4 shows the analysis of the erosion of PLGA microparticles containing amphotericin B, through the images obtained by scanning electron microscopy (SEM). Images A and B at time zero, images C and D with time equal to 30 days in PBS buffer, and images E and F with time equal to 120 days in PBS buffer.

A figura 5 mostra a eficácia do encapsulamento de Anfotericina B em micropartículas de PLGA administrado em dose única no tratamento de leishmaniose cutânea murina por via intralesional, onde camundongos BALB/c foram infectados com 2x106 promastigotas de L.amazonensis GFP na orelha. Após 10 dias de infecção, os animais foram aleatoriamente separados em grupos de 4. O grupo tratado com Anfotericina B livre, recebeu injeções intralesionais duas vezes por semana com doses de 50 ug do fármaco por 4 semanas (total de 8 doses). O grupo tratado com PLGA/Anfotericina B recebeu uma única dose da formulação intralesionalmente com dose 50 ug de Anfotericina B (1 dose). Os controles receberam uma única administração de PLGA de 500ug (1 doses), ou 10ul de PBS. (A) O crescimento lesão (espessura da orelha infectada menos espessura antes da infecção) foi acompanhado durante o experimento com o auxílio de paquímetro. (B) Carga parasitária medida por unidades de fluorescência específica, obtida 42 dias após a infecção. Fluorescência basal = 76728,5 ±1472. (C) Fotografia das orelhas infectadas, o halo vermelho indica o local de infecção. Média ±SD (n=4), ** p< 0,01 e *** p< 0,001.Figure 5 shows the efficacy of Amphotericin B encapsulation in PLGA microparticles administered in a single dose in the treatment of murine cutaneous leishmaniasis intralesionally, where BALB / c mice were infected with 2x106 L.mamazonensis GFP promastigotes in the ear. After 10 days of infection, the animals were randomly divided into groups of 4. The group treated with free Amphotericin B, received intralesional injections twice a week with doses of 50 µg of the drug for 4 weeks (total of 8 doses). The group treated with PLGA / Amphotericin B received a single dose of the formulation intralesionally with 50 µg dose of Amphotericin B (1 dose). Controls received a single administration of PLGA of 500ug (1 dose), or 10ul of PBS. (A) The lesion growth (thickness of the infected ear less thickness before infection) was monitored during the experiment with the aid of a caliper. (B) Parasitic load measured by specific fluorescence units, obtained 42 days after infection. Basal fluorescence = 76728.5 ± 1472. (C) Photograph of the infected ears, the red halo indicates the site of infection. Mean ± SD (n = 4), ** p <0.01 and *** p <0.001.

A figura 6 mostra o tratamento de leishmaniose cutânea murina por via intralesional, onde camundongos BALB/c foram infectados com 2x106 promastigotas de Lamazonensis GFP na orelha. Após 7 dias de infecção, os animais foram aleatoriamente separados em grupos de 4. No tratamento 1 o grupo tratado com PLGA/Anfotericina B recebeu uma dose da formulação intralesionalmente com dose 1,25 ug de Anfotericina B. O grupo tratado com Anfotericina B livre e Anfotericina B Lipossomal, recebeu uma dose 1,25 ug do fármaco. Os controles receberam uma única administração de PLGA de 12,5 ug ou 10ul de PBS. No tratamento 2 o grupo tratado com PLGA/Anfotericina B recebeu uma dose da formulação intralesionalmente com dose 50 ug de Anfotericina B. O grupo tratado com Anfotericina B livre e Anfotericina B Lipossomal, recebeu uma dose 50 ug do fármaco. Os controles receberam uma única administração de PLGA de 500ug ou 10ul de PBS. O crescimento lesão (espessura da orelha infectada menos espessura antes da infecção) foi acompanhado durante o experimento com o auxílio de paquímetro.Figure 6 shows the treatment of murine cutaneous leishmaniasis intralesionally, where BALB / c mice were infected with 2x106 Lamazonensis GFP promastigotes in the ear. After 7 days of infection, the animals were randomly separated into groups of 4. In treatment 1 the group treated with PLGA / Amphotericin B received a dose of the formulation intralesionally with a dose of 1.25 µg of Amphotericin B. The group treated with free Amphotericin B and Amphotericin B Liposomal, received a 1.25 µg dose of the drug. Controls received a single administration of PLGA of 12.5 µg or 10 µl of PBS. In treatment 2, the group treated with PLGA / Amphotericin B received a dose of the formulation intralesionally with 50 µg dose of Amphotericin B. The group treated with free Amphotericin B and Amphotericin B, received a 50 µg dose of the drug. Controls received a single administration of PLGA of 500ug or 10ul of PBS. The lesion growth (thickness of the infected ear less thickness before infection) was monitored during the experiment with the aid of a caliper.

A figura 07 mostra a avaliação da carga parasitária na lesão após o tratamento intralesional com as micropartículas de PLGA contendo Anfotericina B: O tratamento de leishmaniose cutânea murina por via intralesional com micropartículas de PLGA com Anfotericina B diminui a carga parasitária na lesão de animais infectados com L. amazonensis. As cargas de parasita no lisado da lesão foram medidas no dia 67 de infecção. O número de parasitas na lesão (A) e no linfonodo auricular (B) foi determinado pelo método de diluição limitante (LDA), a carga parasitária em (C) foi medida em unidades de fluorescência específica (FU). * p< 0,01 em relação ao grupo PBS. ▼ p<0,001 em relação ao grupo PLGA. • p< 0,05 em relação ao grupo PLGA. Média ± DP (n = 4).Figure 07 shows the evaluation of the parasitic load in the lesion after intralesional treatment with PLGA microparticles containing Amphotericin B: The treatment of murine cutaneous leishmaniasis intralesionally with PLGA microparticles with Amphotericin B decreases the parasitic load in the injury of animals infected with L. amazonensis. Parasite loads on the lesion lysate were measured on day 67 of infection. The number of parasites in the lesion (A) and in the auricular lymph node (B) was determined by the limiting dilution method (LDA), the parasitic load in (C) was measured in specific fluorescence units (FU). * p <0.01 in relation to the PBS group. ▼ p <0.001 in relation to the PLGA group. • p <0.05 in relation to the PLGA group. Mean ± SD (n = 4).

A figura 08 mostra a avaliação de toxidez cardíaca, hepática e renal. O sangue dos animais foi retirado 67 dias após a infecção para dosagens de: (a) níveis séricos de TGO; (b) níveis séricos de TGP; (c) níveis séricos de creatinina no soro. Controle negativo: PBS. Controle positivo: CCI4.Figure 08 shows the assessment of cardiac, hepatic and renal toxicity. The animals' blood was removed 67 days after infection for dosages of: (a) serum TGO levels; (b) serum levels of TGP; (c) serum serum creatinine levels. Negative control: PBS. Positive control: CCI4.

A figura 9 mostra a determinação da melhor proporção de droga na formulação. Foram preparadas micropartículas de PLGA contendo Anfotericina B adicionada em diferentes proporções em relação ao polímero (5%, 10% e 20%, como indicado). As partículas foram então lavadas e secadas. Para determinação do melhor rendimento do processo, as partículas secas foram totalmente dissolvidas em Acetonitrila após agitação por 24 horas a 100 rpm. As amostras foram então centrifugadas a 10.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi retirado para quantificação do teor da droga incorporada por CLAE.Figure 9 shows the determination of the best drug ratio in the formulation. PLGA microparticles were prepared containing Amphotericin B added in different proportions in relation to the polymer (5%, 10% and 20%, as indicated). The particles were then washed and dried. To determine the best performance of the process, the dried particles were completely dissolved in Acetonitrile after stirring for 24 hours at 100 rpm. The samples were then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes and the supernatant was removed to quantify the content of the drug incorporated by HPLC.

Tabela 1: O tamanho médio de partícula expresso como diâmetro médio em volume (D 4,3).

Tabela 2: A carga superficial das partículas foi avaliada pelo Potencial Zeta.

Table 1: The average particle size expressed as the average diameter in volume (D 4.3).

Table 2: The surface charge of the particles was evaluated by the Zeta Potential.

EXEMPLOSEXAMPLES EXEMPLO 1: CARACTERIZAÇÃO FÍSICA DAS PARTÍCULAS DE PLGA CONTENDO GLUCANTIME OU ANFOTERICINA BEXAMPLE 1: PHYSICAL CHARACTERIZATION OF PLGA PARTICLES CONTAINING GLUCANTIME OR AMPHOTERICIN B ANÁLISE DE TAMANHO E DISTRIBUIÇÃOSIZE ANALYSIS AND DISTRIBUTION

A análise da distribuição granulométrica (polidispersão) nas partículas vazias e nas partículas com Glucantime encapsulada, gerando as distribuições conforme figura 1B. O tamanho médio de partícula foi expresso com o diâmetro médio em volume (D 4,3). As diferentes % de distribuição acumulada estão indicadas na tabela 1. Ao analisarmos a distribuição granulométrica das partículas com Glucantime, podemos observar uma população mais heterogênea, com span de 1,69um para partículas de Glucantime em PLGA. A carga superficial das partículas foi caracterizada, avaliadas pelo Potencial Zeta. Os valores são mostrados na tabela 2.The analysis of the particle size distribution (polydispersion) in the empty particles and in the particles with encapsulated Glucantime, generating the distributions according to figure 1B. The average particle size was expressed with the average diameter in volume (D 4.3). The different% of cumulative distribution are shown in Table 1. When analyzing the particle size distribution with Glucantime, we can observe a more heterogeneous population, with a span of 1.69um for Glucantime particles in PLGA. The surface charge of the particles was characterized, evaluated by the Zeta Potential. The values are shown in table 2.

A análise da distribuição granulométrica (polidispersão) nas partículas vazias e nas partículas com Anfotericina B encapsulada, gerando as distribuições conforme figura 1C. O tamanho médio de partícula foi expresso com o diâmetro médio em volume (D 4,3). As diferentes % de distribuição acumulada estão indicadas na tabela 1. Ao analisarmos a distribuição granulométrica das partículas com Anfotericina B, podemos observar uma população mais heterogênea, com span de 1,75 um para partículas de Anfotericina B em PLGA. A carga superficial das partículas foi caracterizada, avaliadas pelo Potencial Zeta. Os valores são mostrados na tabela 2.The analysis of the granulometric distribution (polydispersion) in the empty particles and in the particles with Amphotericin B encapsulated, generating the distributions according to figure 1C. The average particle size was expressed with the average diameter in volume (D 4.3). The different% of accumulated distribution are shown in table 1. When analyzing the particle size distribution with Amphotericin B, we can observe a more heterogeneous population, with a span of 1.75 um for Amphotericin B particles in PLGA. The surface charge of the particles was characterized, evaluated by the Zeta Potential. The values are shown in table 2.

ANÁLISE MORFOLOGICA DAS PARTÍCULASMORPHOLOGICAL ANALYSIS OF PARTICLES

A morfologia das partículas também foi avaliada por MEV e as imagens estão representadas na Figura 2. Pela análise morfológica das partículas, podemos observar a formação de aglomerados que podem explicar a heterogeneicidade observada na distribuição de tamanho da população, quando o Glucantime ou a Anfotericina B estão encapsulados.The particle morphology was also evaluated by SEM and the images are represented in Figure 2. By the morphological analysis of the particles, we can observe the formation of clusters that can explain the heterogeneity observed in the population size distribution, when Glucantime or Amphotericin B are encapsulated.

EXEMPLO 2: AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE ENCAPSULACÃO, LIBERAÇÃO E DEGRADAÇÃO DAS PARTÍCULAS IN VITROEXAMPLE 2: EVALUATION OF ENCAPSULATION EFFECTIVENESS, RELEASE AND DEGRADATION OF PARTICLES IN VITRO

A Taxa de incorporação de Anfotericina B nas micropartículas de PLGA pode ser observada na figura 3A. Pela análise do teor de anfotericina B das partículas quando estas foram previamente dissolvidas em DMSO e analisada em HPLC. Podemos observar que a Média da taxa de incorporação foi de 89,2%, com esse rendimento o teor de anfotericina B na partícula é de 8,92% e não os 10% (p/p) de Anfotericina B em micropartículas de PLGA teórico.The rate of incorporation of Amphotericin B in the PLGA microparticles can be seen in figure 3A. By analyzing the amphotericin B content of the particles when they were previously dissolved in DMSO and analyzed by HPLC. We can observe that the Average incorporation rate was 89.2%, with this yield the content of amphotericin B in the particle is 8.92% and not the 10% (w / w) of Amphotericin B in theoretical PLGA microparticles .

No ensaio de liberação da anfotericina B das micropartículas de PLGA in vitro,as partículas foram incubadas em solução de PBS 0,1% de Azida, pH=7.2 e mantido a 37°C em agitação constante de 80rpm, em diferentes tempos as amostras foram centrifugadas e alíquotas foram retiradas do sobrenadante para dosagem da anfotericina B por cromatografia de alta eficiência (CLAE). Com esta análise podemos observar que aproximadamente 60% da anfotericina B que estava incorporada às micropartículas foi liberada para o sobrenadante nas condições analisadas, como podemos observar na Figura 3B. Análise da erosão das micropartículas.In the amphotericin B release test from the PLGA microparticles in vitro, the particles were incubated in a solution of PBS 0.1% Azide, pH = 7.2 and maintained at 37 ° C with constant agitation of 80 rpm, at different times the samples were centrifuges and aliquots were removed from the supernatant to measure amphotericin B by high performance chromatography (HPLC). With this analysis we can see that approximately 60% of amphotericin B that was incorporated into the microparticles was released into the supernatant under the conditions analyzed, as we can see in Figure 3B. Analysis of microparticle erosion.

A análise da degradação e morfologia das micropartículas de PLGA contendo anfotericina B em tampão PBS foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As microparticulas de PLGA foram obtidas em tempos variados, liofilizadas e tratadas para microscopia eletrônica. A incorporação da anfotericina B nas micropartículas de PLGA não promove mudanças significativas no tamanho, formato ou carga das partículas como observamos nos resultados anteriores (exemplo 1). No estudo da degradação as partículas vazias e contendo a anfotericina B não apresentaram diferenças morfológicas e nem mudanças na erosão da partícula (dados não mostrados). Como podemos observar na Figura 4 (A e B) as micropartículas contendo anfotericina B no tempo zero apresentavam um formato esférico de tamanhos bastante variados, na Figura 4 (C e D) observamos a morfologia no tempo de 30 dias em solução tampão, onde podemos observar a presença de estruturas quadriculadas em um número bastante significativo, na Figura 4 (E e F) observamos a morfologia no tempo igual a 120 dias em solução tampão, podemos observar uma predominância de estruturas quadriculadas oriundas da degradação das micropartículas de PLGA. Neste ponto, aproximadamente 60% da anfotericina B já foi liberada (exemplo 1).The degradation and morphology analysis of PLGA microparticles containing amphotericin B in PBS buffer was evaluated by scanning electron microscopy (SEM). The PLGA microparticles were obtained at different times, lyophilized and treated for electron microscopy. The incorporation of amphotericin B in the PLGA microparticles does not promote significant changes in the size, shape or charge of the particles as noted in the previous results (example 1). In the degradation study, empty particles containing amphotericin B did not show morphological differences or changes in particle erosion (data not shown). As we can see in Figure 4 (A and B) the microparticles containing amphotericin B at time zero had a spherical shape of quite varied sizes, in Figure 4 (C and D) we observed the morphology over 30 days in buffer solution, where we can observe the presence of checkered structures in a very significant number, in Figure 4 (E and F) we observe the morphology in the time equal to 120 days in buffer solution, we can observe a predominance of checkered structures arising from the degradation of the PLGA microparticles. At this point, approximately 60% of amphotericin B has already been released (example 1).

EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DAS COMPOSIÇÕES NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE CUTÂNEAEXAMPLE 3: EVALUATION OF THE EFFICACY OF COMPOSITIONS IN THE TREATMENT OF CUTANEOUS LEISHMANIOSIS

Na avaliação da atividade in vivo das micropartículas de PLGA contendo Anfotericina B. As micropartículas de PLGA com anfotericina B promoveram diminuição no crescimento da lesão na dose única de 50 pg/Kg como podemos observar na Figura 5 (A), o grupo tratado com Anfotericina B livre, recebeu injeções intralesionais duas vezes por semana com doses de 50 ug do fármaco por 4 semanas (total de 8 doses). Com a avaliação da carga parasitária (B) podemos concluir que a Anfotericina B/PLGA promoveu uma diminuição significativa da fluorescência comparando com o grupo tratado com placebo, apesar do tamanho da lesão ter diminuído não houve diferença estatística entre o grupo tratado com as micropartículas vazias e o grupo tratado com placebo quando comparamos a carga parasitária. Podemos observar em C, que as lesões das orelhas dos camundongos tratados estão diminuídas e menos inflamadas que as dos não tratados. A Anfotericina B encapsulada administrada em uma única dose promoveu uma diminuição do tamanho da lesão e na carga parasitária bastante significativa.In the evaluation of the in vivo activity of the PLGA microparticles containing Amphotericin B. The PLGA microparticles with amphotericin B promoted a decrease in lesion growth at a single dose of 50 pg / Kg as we can see in Figure 5 (A), the group treated with Amphotericin Free B, received intralesional injections twice a week with doses of 50 µg of the drug for 4 weeks (total of 8 doses). With the evaluation of the parasitic load (B) we can conclude that Amphotericin B / PLGA promoted a significant decrease in fluorescence compared to the group treated with placebo, although the size of the lesion decreased, there was no statistical difference between the group treated with empty microparticles and the placebo-treated group when comparing the parasitic burden. We can see in C, that the lesions in the ears of treated mice are reduced and less inflamed than those of untreated. Encapsulated Amphotericin B administered in a single dose promoted a significant reduction in the size of the lesion and in the parasitic burden.

Na avaliação de atividade in vivo com o tratamento pela via tópica, o tratamento tópico com os LCs contendo 6,6 pg CH8 apresentou a mesma atividade que o controle positivo intralesional, que recebeu 3,3 pg da CH8 livre (Figura 4). O mesmo efeito é obtido com a avaliação da carga parasitária ao final do experimento (Figura 5). Este resultado demonstra a capacidade da formulação em lipossomas convencionais (LCs) de penetrar a pele e veicular a chalcona nitrada(CH8) à região infectada, possibilitando assim, o tratamento por uma via não invasiva. O grupo tratado com a 5 formulação de CH8 em lipossomas convencionais apresentou maior eficácia que o grupo tratado com uma dose bem mais alta de 200 ug de CH8 livre em creme lanete. Os demais grupos que foram tratados com os veículos vazios (lipossomas convencionais LCs, lipossomas peguilados LPs e creme lanete) apresentaram perfil semelhante ao grupo não tratado, indicando atividade 10 específica da chalcona nitrada(CH8).In the assessment of in vivo activity with topical treatment, topical treatment with LCs containing 6.6 pg CH8 showed the same activity as the positive intralesional control, which received 3.3 pg of free CH8 (Figure 4). The same effect is obtained with the evaluation of the parasitic load at the end of the experiment (Figure 5). This result demonstrates the ability of the formulation in conventional liposomes (LCs) to penetrate the skin and transmit the nitrated chalcone (CH8) to the infected region, thus enabling treatment by a non-invasive route. The group treated with the CH8 formulation in conventional liposomes showed greater efficiency than the group treated with a much higher dose of 200 µg of free CH8 in lanete cream. The other groups that were treated with empty vehicles (conventional LC liposomes, LP pegylated liposomes and lanete cream) had a similar profile to the untreated group, indicating specific activity of nitrated chalcone (CH8).

O uso da formulação de chalcona nitrada(CH8) encapsulada em lipossomas convencionais é a mais vantajosa, pois apresenta o mesmo desempenho que os lipossomas peguilados, sem necessidade de incluir a etapa adicional de incorporação de PEG, na avaliação de retenção cutânea em 15 células de Franz. E sua eficácia foi maior que o peguilado no tratamento dô animal pela via tópica, apresentando o mesmo controle da infecção que o grupo tratado com chalcona nitrada(CH8) intralesional, com a vantagem de ser esta uma via não invasiva. Estes resultados podem ser verificados nas Figuras 3e4.The use of the nitrated chalcone (CH8) formulation encapsulated in conventional liposomes is the most advantageous, as it presents the same performance as pegylated liposomes, without the need to include the additional step of PEG incorporation, in the assessment of cutaneous retention in 15 cells of Franz. And its efficacy was greater than the pegylated one in topical treatment of animals, presenting the same infection control as the group treated with intralesional nitrated chalcone (CH8), with the advantage that this is a non-invasive route. These results can be seen in Figures 3 and 4.

Claims (6)

1. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadaspor serem os medicamentos ou fármacos a Anfotericina B, compostos antimoniais, tais como antimoniato de meglumina, chalcona nitrada (CH8), estibogluconato de sódio e tartarato de potássio e antimonio (lli) hidratado (Sblll), combinados ou não, encapsulados em partículas de PLGA, além de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.Pharmaceutical compositions according to claim 1, characterized in that the medicaments or drugs are Amphotericin B, antimonial compounds, such as meglumine antimoniate, nitrated chalcone (CH8), sodium stibogluconate and potassium tartrate and hydrated antimonium (lli) ( Sblll), combined or not, encapsulated in PLGA particles, in addition to pharmaceutically acceptable excipients. 2. Composições de acordo com as reivindicações 1, caracterizadas pelo fato da quantidade do medicamento ou fármaco constituir-se de cerca de 1 a 70% do peso da formulação.Compositions according to claims 1, characterized in that the amount of the drug or drug is about 1 to 70% of the weight of the formulation. 3. Composições de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fato da porcentagem ótima do encapsulamento do medicamento ou fármaco ser de 10% em relação ao polímero.3. Compositions according to claims 1 and 2, characterized by the fact that the optimum percentage of the drug or drug encapsulation is 10% in relation to the polymer. 4. Composições de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato das partículas de PLGA apresentarem tamanhos variando entre 0,5 e 500pm.4. Compositions according to claims 1 to 3, characterized in that the PLGA particles have sizes varying between 0.5 and 500pm. 5. Composições de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracterizadas por uma variação copolímeros de ácido glicólico e lático serem usados e o percentual de cada monômero de ácido poli (lático-co-glicólico) ser cerca de 15-85%, cerca de 25- 75%, cerca de 35-65%, ou a proporção de 50- 50%.Compositions according to claims 1 to 4, characterized in that a variation of copolymers of glycolic and lactic acid are used and the percentage of each poly (lactic-co-glycolic) monomer is about 15-85%, about 25-75%, about 35-65%, or the proportion of 50-50%. 6. Uso das composições farmacêuticas descritas nas reivindicações de 1 a 5, caracterizado por ser voltado para a produção de um medicamento de aplicação subcutânea para tratar doenças cutâneas inflamatórias e infecciosas da pele ou em regiões da pele (derme, epiderme e anexos), tais como, leishmaniose, micoses, hanseníase, psoríases, ulcera tropical, verrugas, hemangioma cavernoso em animais mamíferos.6. Use of the pharmaceutical compositions described in claims 1 to 5, characterized by being aimed at the production of a medicine for subcutaneous application to treat inflammatory and infectious cutaneous diseases of the skin or in regions of the skin (dermis, epidermis and appendages), such as such as leishmaniasis, mycoses, leprosy, psoriasis, tropical ulcer, warts, cavernous hemangioma in mammalian animals.

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