BRPI1009232A2 - anticorpos totalmente humanos específicos para cadm1 - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS TOTALMENTE HUMANOS ESPECÍ- FICOS PARA CADM1. A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isola- dos, particularmente anticorpos monoclonais humanos, mais particularmente a anticorpos projetados resultando na ligação aumentada a receptores Fc e/ou potência aumentada para ADCC ou imunoconjugados, que se ligam especificamente a CADM1 com alta afinidade. As moléculas de ácido nuclei- co que codificam anticorpos de CADM1, vetores de expressão, células hos- pedeiras e métodos para expressão dos anticorpos de CADM1 são também providos. Moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas compreen- dendo os anticorpos de CADM1 são também providas. Métodos para detec- ção de CADM1, bem como métodos para tratamento de vários cânceres, incluindo câncer de pulmão e câncer pancreático, são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS TOTALMENTE HUMANOS ESPECÍFICOS PARA CADM1".

PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório dos Es- 5 tados Unidos Nº 61/209471, depositado em 5 de março de 2009, e pedido provisório dos Estados Unidos Nº 61/209390, depositado em 5 de março de 2009, ambos dos quais sendo incorporados por referência aqui em suas to- talidades.

CAMPO DA INVENÇÃO 10 A presente invenção refere-se geralmente aos campos de imu- nologia e biologia molecular. Mais especificamente, aqui providos são anti- corpos, particularmente anticorpos projetados resultando em ligação aumen- tada para receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC e imuno- conjugados, e outras proteínas terapêuticas direcionadas contra CADM1 de 15 molécula de adesão similar a imunoglobulina, ácidos nucleicos que codifi- cam tais anticorpos e proteínas terapêuticas, métodos para preparação dos anticorpos monoclonais da invenção, e outras proteínas terapêuticas, e mé- todos para o tratamento de doenças, tais como cânceres mediados por ex- pressão/atividade de CADM1 e/ou associados com expressão/atividade a- 20 normal de ligantes, portanto.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Moléculas de adesão de célula são geralmente identificadas co- mo caderins, integrins, selectins, ou como membros da superfamília Imuno- globulina (Ig). As moléculas da superfamília imunoglobulina incluem recepto- 25 res de antígeno de superfície de célula, coreceptores e moléculas coestimu- latórias do sistema imune, moléculas envolvidas na apresentação de antíge- no a linfócitos, moléculas de adesão de célula e alguns receptores de cito- quina. As moléculas de adesão de célula da superfamília Ig constituem mais de 100 moléculas em vertebrados, e incluem NCAMs (moléculas de adesão 30 de célula neuronais), família L1 CAMs, ICAMS (moléculas de adesão de cé- lula intracelulares), VCAMS (moléculas de adesão de célula vasculares), SIGLECs (lectins similares à ligação de ácido siálico de Ig, incluindo CD22 e

CD83), nectins, CD2, CD48. A molécula de superfamília de imunoglobulina CADM1 foi inici- almente caracterizada por grupos de pesquisa múltiplos; como um resultado a molécula é identificada por muitos nomes na literatura científica incluindo 5 molécula de adesão de célula 1, molécula de adesão de célula sináptica (synCAM), molécula de superfamília de imunoglobulina espermatogênica (sgIGSF), IGSF4, BL2, ST17, NECL2, RA175, e CADM1A.

Inicialmente re- portada para agir adicionalmente como um supressor de tumor, ela é tam- bém conhecida como TSLC1 (Murakami et al., Nature Genetics 27(4):427 10 (2001)). Diferente de caderins e integrins, que requerem cátions divalen- tes tais como Ca+2 ou Mg+2 para atividades adesivas, as moléculas de super- família de Ig são tipicamente Ca+2 ou Mg+2 independentes.

A estrutura de CADM1 é caracterizada como tendo um domínio extracelular com três moti- 15 vos similares à imunoglobulina, uma helicoidal que se estende na mem- brana hidrofóbica simples e um domínio intracelular que se liga às fibras ac- tin via DAL-1, e uma extremidade citoplásmica C-terminal curta contendo um motivo de ligação PDZ.

Duas isoformas CADM1 são conhecidas, NM_014333 e NM_001098517, a última tendo a 27 anulações de aminoáci- 20 dos.

A análise indica que as sequências de aminoácido correspondente ao domínio citoplásmico de CADM1 são idênticas em cinco mamíferos e alta- mente conservadas em vertebrados, sugerindo um papel importante de CADM1 em interação de célula-célula normal.

O ortólogo CADM1 de ca- mundongo (AAQ023810) mostra 97% de identidade a CADM1 humano. (Fu- 25 kami et al., Gene 295:7-12 (2002)). CADM1 é expresso em nervos e células tronco (Ito et al.

J Pharmacol Sci.;102(1):1-5 (2006)), células alveolares pulmonares (Ito et al.

Histol Histopathol. 18(4):1321-9 (2003)), células secretórias pancreáticas (Shingai et al.

J Biol Chem.; 278(37):35421-7 (2003)), (Wakayama et al., 30 Blood;101(7):2601-8 (2003)). Ele está também associado com carcinoma hepatocelular (HCC). O CADM1 parece ser expresso em células de duto de bile adulto cirrótico, mas está ausente de dutos de bile adulto livre de doença

(Ito et al., Hepatology;45(3):684-94 (2007)). Ele é adicionalmente reportado estar associado com glioblastomas e câncer de pulmão.

Dois mecanismos resultantes na inativação de CADM1 foram i- dentificados: através de metilação de promotor, e através de perda de hete- 5 rozigosidade no local do gene.

A metilação do promotor de CADM1 reporta- damente resulta em perda de expressão de CADM1 em tumores, incluindo câncer de pulmão, esofageal, pancreático, de seio, e cânceres de próstata, particularmente em tumores com comportamento agressivo. (Murakami et al., Mol Cancer. 4:28 (2005)). 10 RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a estas e outras necessidades re- lacionadas pela provisão de anticorpos, particularmente anticorpos projeta- dos resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência au- mentada para ADCC e imunoconjugados, direcionados contra CADM1, por- 15 tanto, ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos e proteínas terapêuti- cas, métodos para preparação de anticorpos monoclonais anti-CADM1 e outras proteínas terapêuticas, e métodos para o tratamento de doenças, tais como distúrbios mediados por CADM1, por exemplo, cânceres humanos, incluindo câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, 20 câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, do trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagono- 25 mas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

Desse modo, a presente invenção proporcionam anticorpos mo- noclonais isolados, em particular murino, quiméricos, humanizados, e anti- corpos monoclonais totalmente humanos, que se ligam a uma ou mais prote- 30 ínas morfogênicas de osso e receptores, portanto, e que exibem uma ou mais propriedades funcionais desejáveis.

Tais propriedades incluem, por exemplo, ligação específica de alta afinidade a CADM1 humano.

Também providos são métodos para tratamento de uma variedade de doenças medi- adas por CADM1 usando os anticorpos, proteínas, e composições da pre- sente invenção.

A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal iso- 5 lado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, um fragmento de anticor- po, ou um mimético de anticorpo que se liga a um epítope em CADM1 hu- mano reconhecido por um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 19, 20, ou 21 e uma região variável de cadeia leve compreen- 10 dendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 22, 23, ou 24. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo de compri- mento total de um isotipo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo total, um frag- 15 mento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia sim- ples, um imunoconjugado, um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, e um anticorpo biespecífico.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo da presen- te invenção é um imunoconjugado ou um anticorpo projetado resultando na 20 ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC.

O fragmento de anticorpo pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em: um UniCorpo, um anticorpo de domínio, e um Nanocorpo.

Em algumas modalidades, os imunoconjugados da invenção compreendem um agente terapêutico.

Em outro aspecto da invenção, o agente terapêutico 25 é uma citotoxina ou um isótopo radioativo.

Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em: um Afficorpo, um DARPin, um Anticalin, um Avímero, um Versacorpo, e um Duocalin.

Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo se liga a CADM1 30 humano com um EC50 de < 50 Nm, < 10 Nm, ou < 1 Nm.

Em modalidades alternativas, as composições da presente in- venção compreendem um anticorpo isolado ou porção de ligação de antíge-

no e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em outros aspectos, o anticorpo da presente invenção é uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, e um veículo farmaceuti- 5 camente aceitável.

Em algumas modalidades, a invenção compreende uma molécu- la de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou leve do anticor- po isolado, ou porção de ligação de antígeno que se liga a um epítope em CADM1 humano.

Outros aspectos da invenção compreendem vetores de 10 expressão compreendendo tais moléculas de ácido nucleico, e células hos- pedeiras compreendendo tais.

Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método para preparação de um anticorpo anti-CADM1, referido método compreendendo as etapas de: obtenção de uma célula hospedeira que con- 15 tém uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo da invenção; crescimento da célula hospedeira em uma cultura de célula hos- pedeira; provisão de condições de cultura de célula hospedeira no qual a uma ou mais moléculas de ácido nucleico são expressas; e recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira ou a partir da cultura de célula hos- 20 pedeira.

Em outras modalidades, a invenção é direcionada a métodos pa- ra tratamento ou prevenção de uma doença associada com células alvos que expressam CADM1, referido método compreendendo a etapa de admi- nistrar a um indivíduo um anticorpo anti-CADM1, ou porção de ligação de 25 antígeno deste, em uma quantidade efetiva para tratar ou prevenir a doença.

Em alguns aspectos, a doença tratada ou prevenida pelos anticorpos, ou porção de ligação de antígeno deste, da invenção, é selecionada a partir do grupo consistindo em: cânceres humanos.

Em algumas modalidades, a do- ença tratada ou prevenida pelos anticorpos da presente invenção é um cân- 30 cer selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célu- la pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma,

câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cân- ceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, do trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pân- creas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores 5 carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fí- gado, ou rim.

Em outras modalidades, a invenção é direcionada a um anticor- po anti-CADM1, ou porção de ligação de antígeno deste, para uso no trata- mento ou prevenção de uma doença associada com células alvos que ex- 10 pressam CADM1. Em alguns aspectos, a doença tratada ou prevenida pelo anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, da invenção, é câncer humano.

Em algumas modalidades, a doença tratada ou prevenida pelos anticorpos da presente invenção é um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T 15 adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas es- camosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, trato gastrintestinal, rim, fígado (inclu- indo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e gluca- 20 gonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pân- creas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

Em outras modalidades, a invenção é direcionada ao uso de um anticorpo anti-CADM1, ou porção de ligação de antígeno deste, para a pro- dução de um medicamento para uso no tratamento ou prevenção de uma 25 doença associada com células alvos que expressam CADM1. Em alguns aspectos, a doença tratada ou prevenida pelo medicamento da invenção, é câncer humano.

Em algumas modalidades, a doença tratada ou prevenida pelo medicamento da invenção é um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T 30 adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas es- camosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, trato gastrintestinal, rim, fígado (inclu- indo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e gluca- gonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pân- creas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim. 5 Em outras modalidades, a presente invenção é um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno deste, um frag- mento de anticorpo, ou um mimético de anticorpo que se liga a um epítope no CADM1 humano reconhecido por um anticorpo compreendendo uma re- gião variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve sele- 10 cionadas a partir do grupo consistindo na sequência de aminoácido da regi- ão variável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:19 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:22; a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:20 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia 15 leve colocada em SEQ ID NO:23; a sequência de aminoácido da região vari- ável de cadeia pesada em SEQ ID NO:21 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:24. Em aspectos adicionais, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um 20 anticorpo de cadeia simples, um imunoconjugado, um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumen- tada para ADCC, e um anticorpo biespecífico.

Em um aspecto preferido, o anticorpo é um imunoconjugado ou um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada para receptores de Fc e/ou potência aumentada para 25 ADCC.

Em aspectos adicionais da invenção, o fragmento de anticorpo é se- lecionado a partir do grupo consistindo em: um UniCorpo, um anticorpo de domínio, e um Nanocorpo.

Em algumas modalidades, o mimético de anticor- po é selecionado a partir do grupo consistindo em: um Afficorpo, um DAR- Pin, um Anticalin, um Avímero, um Versacorpo, e um Duocalin.

Em modali- 30 dades adicionais, a composição compreende o anticorpo isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em algumas modalidades, a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou leve do anticorpo isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, de anticorpo da invenção, e em aspectos adicionais, podem incluir um vetor de expressão compreen- dendo tais ácidos nucleicos, e células hospedeiras compreendendo tais ve- 5 tores de expressão.

Outra modalidade da presente invenção é um hibridoma que ex- pressa o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, de qualquer um de anticorpos da invenção.

Outros aspectos da invenção são dirigidos a métodos de produ- 10 ção dos anticorpos da invenção, compreendendo as tapas de: imunização de um animal transgênico compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recuperação de células B de referido animal transgênico; produção de hibridomas de referidas células B; seleção de hi- bridomas que expressam anticorpos que ligam CADM1; e recuperação de 15 referidos anticorpos que ligam CADM1 de referidos selecionados hibrido- mas.

Em outras modalidades, o método de produção de anticorpos anti-CADM1 compreende as etapas de: imunização de um animal transgêni- co compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de 20 CADM1; recuperação de mRNA a partir das células B de referido animal transgênico; conversão de referido mRNA em cDNA; expressão de referido cDNA em fagos tal que anticorpos anti-CADM1 codificados por referido cD- NA são apresentados na superfície de referidos fagos; seleção de fagos que apresentam anticorpos anti-CADM1; recuperação de moléculas de ácido 25 nucleico de referidos selecionados fagos que codificam referidas imunoglo- bulinas anti-CADM1; expressão de referidas recuperadas moléculas de áci- do nucleico em uma célula hospedeira; e recuperação de anticorpos de refe- rida célula hospedeira que liga CADM1. Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo monoclonal isola- 30 do, ou uma porção de ligação de antígeno deste, se ligam a um epítope no polipeptídeo de CADM1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 43 ou 44 reconhecido por um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido colo- cada em SEQ ID NOS: 19, 20, ou 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NOS: 22, 23, ou 24. 5 Outras características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos que não de- vem ser construídos como limitantes. Os conteúdos de todas as referências, entradas no Banco de Gene, patentes e pedidos de patente publicados cita- dos através de todo este pedido são expressamente aqui incorporados por 10 referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1A mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:25) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:19) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano PTA021_A1. As regiões 15 CDR1 (SEQ ID NO:1), CDR2 (SEQ ID NO:4) e CDR3 (SEQ ID NO:7) são delineadas, e as derivações de linhagem germinativa V, D e J são indicadas. A figura 1B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:28) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:22) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano PTA021_A1. As regiões CDR1 (SEQ 20 ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:13) e CDR3 (SEQ ID NO:16) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas. A figura 2A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:26) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:20) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano PTA021_A2. As regiões CDR1 25 (SEQ ID NO:2), CDR2 (SEQ ID NO:5) e CDR3 (SEQ ID NO:8) são delinea- das e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas. A figura 2B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:29) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:23) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano PTA021_A2. As regiões CDR1 (SEQ 30 ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:14) e CDR3 (SEQ ID NO:17) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas. A figura 3A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:27)

e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:21) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano PTA021_A3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:3), CDR2 (SEQ ID NO:6) e CDR3 (SEQ ID NO:9) são delinea- das e as derivações de linhagem germinativa V, D e J são indicadas. 5 A figura 3B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:30) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:24) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano PTA021_A3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:15) e CDR3 (SEQ ID NO:18) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas. 10 A figura 4 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A1 (SEQ ID NO:19) com a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana VH 2-05 (SEQ ID NO:31) e a sequência de aminoácido de linhagem germinativa JH JH5b (SEQ ID NO:37). 15 A figura 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A2 (SEQ ID NO:20) com as sequências de aminoácido de linhagem germinativa humana VH 2-05 (SEQ ID NO:32) e a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana JH 5b (SEQ ID NO:38). 20 A figura 6 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A3 (SEQ ID NO:21) com as sequências de aminoácido de linhagem germinativa humana VH 2-05 (SEQ ID NO:33) e a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana JH 5b (SEQ ID NO:39). 25 A figura 7 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A1 (SEQ ID NO:22) com a se- quência de aminoácido de linhagem germinativa humana VK L15 (SEQ ID NO:34) e a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana JK 4 (SEQ ID NO:40). 30 A figura 8 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A2 (SEQ ID NO:23) com a se- quência de aminoácido da linhagem germinativa humana Vk L15 (SEQ ID

NO:35) e a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana JK 4 (SEQ ID NO:41). A figura 9 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A3 (SEQ ID NO:24) com a se- 5 quência de aminoácido da linhagem germinativa humana Vk L15 (SEQ ID NO:36) e a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana JK 4 (SEQ ID NO:42). A figura 10 mostra os resultados de análise de FACS em PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3 em células de câncer de pulmão de 10 célula pequena NCI-H69. As figuras 11A e 11B mostram os resultados de análise FACS em PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3 em células de câncer de pulmão de célula pequena NCI-H69 e DMS79 respectivamente.

A figura 12 mostra os resultados de análise FACS em 15 PTA021_A3 em células de câncer ovariano SKOV3. A figura 13 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 em células de câncer de pulmão de célula não pequena A549. A figura 14 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 em células de carcinoma de célula renal 786-O e células de me- 20 lanoma SkMel28. A figura 15 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3 (nf) em células de câncer de pulmão de célula pequena NCI-H69 e DMS79. As figuras 16A e 16B mostram citotoxicidade celular dependente 25 de anticorpo (ADCC) mediada por PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 com as linhas de célula DMS79 e NC1-H69, respectivamente.

As figuras 17A e 17B mostram os resultados de ensaios Hum- ZAP em PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 em células DMS79 e NCI- H69, respectivamente. 30 A figura 18 apresenta um gráfico mostrando o efeito de trata- mento usando anticorpos PTA021_A3 fucosilatados ou não-fucosilatados em tamanho de tumor HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

A figura 19 apresenta um gráfico mostrando o efeito de trata- mento com um conjugado M PTA021_A3-Fórmula em tamanho de tumor HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

A figura 20A apresenta um gráfico mostrando o efeito de trata- 5 mento com dosagens de 0,3 umol/kg de um conjugado M de PTA021_A3- Fórmula em tamanho de tumor DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

A figura 20B apresenta um gráfico mostrando o efeito de tra- tamento com dosagens de 0,1 e 0,03 umol/kg de um conjugado M de PTA021_A3-Fórmula em tamanho de tumor de DMS79 em modelo de xeno- 10 enxerto de camundongo.

O estudo se completou no dia 60. As figuras 21, 22 e 23 apresentam gráficos mostrando atividade de ADCC de PTA021_A3 e PTA021_A3 não fucosilatado em HepG2, células de 786-O e DMS79, respectivamente.

A figura 24 apresenta um gráfico mostrando o efeito de trata- 15 mento com anticorpo PTA021_A3 sozinho ou em combinação com cisplatina no tamanho de tumor de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camun- dongo.

As figuras 25A e 25B mostram os dados de Peso de Corpo para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de cito- 20 toxicidade exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

As figuras 26A e 26B mostram os dados de Glicose para maca- cos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicolo- gia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de 25 PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

As figuras 27A e 27B mostram os dados de Alanina Transami- nase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um es- tudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e uma versão não fucosila- tada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus. 30 As figuras 28A e 28B mostram dados de Aspartato Transamina- se para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estu- do de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão nãofucosilatada de

PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

As figuras 29A e 29B mostram os dados de Fosfatase Alcalina para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de 5 PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

As figuras 30A e 30B mostram os dados de Lactato Desidroge- nase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um es- tudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus. 10 As figuras 31A e 31B mostram os dados de RBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

As figuras 32A e 32B mostram os dados de WBC para macacos 15 machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção se refere a anticorpos monoclonais isola- 20 dos, particularmente anticorpos monoclonais humanos, mais particularmente imunoconjugados e anticorpos projetados resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, que se liga especi- ficamente a CADM1 com alta afinidade.

Em certas modalidades, os anticor- pos da invenção são derivados de sequências de linhagem germinativa de 25 cadeia pesada e leve particulares e/ou compreendem características particu- lares tais como regiões CDR compreendendo sequências de aminoácidos particulares.

A invenção proporciona anticorpos isolados, anticorpos projeta- dos resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência au- mentada para ADCC, imunoconjugados, moléculas biespecíficas, affibodies, 30 anticorpos de domínio, nanocorpos, e unicorpos, métodos de produção de referidas moléculas, e composições farmacêuticas compreendendo referidas moléculas e um veículo farmacêutico.

A invenção também se refere a méto-

dos de uso das moléculas, tal como para detectar CADM1, bem como para tratar doenças associadas com expressão de CADM1, tal como CADM1 ex- presso em tumores, incluindo aqueles tumores de câncer de pulmão de célu- la pequena, e câncer pancreático neuroendócrino, carcinoides de pulmão, e 5 carcinoides gastrintestinal.

De modo que a presente invenção possa ser mais prontamente compreendida, certos termos são primeiro definidos.

Definições adicionais são colocadas através de toda a descrição detalhada.

Os termos "CADM1", "IGSF4", "superfamília de imunoglobulina, 10 membro 4D", "molécula de adesão de célula 1", "supressor de tumor em câncer de pulmão 1", "TSLC1", "BL2", "ST17", "molécula de adesão de célu- la sináptica", "syncam 1", "proteína 2 similar à nectin" e "NECL2", são per- mutavelmente usados, e incluem variantes, isoformas e espécies homólogas de CADM1 humano, incluindo isoforma 1 de CADM1 1 (Acesso no Banco de 15 Genes Nº NM_014333), e 2 (Acesso no Banco de Genes Nº NM_001098517). As duas isoformas foram também identificadas como OG- TA025a e OGTA025b no Pedido PCT (OBT Docket No.:OGL-P121PCT), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Os anticorpos humanos desta descrevedescrição podem, em certos casos, reagirem por cruzamento 20 com CADM1 de espécies outras do que humanas.

Em certas modalidades, os anticorpos podem ser completamente específicos para um ou mais CADM1 humano, e não podem exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada não humana.

A sequência de aminoácido completa de um CADM1 humano exemplar tem Acesso no Banco de Genes número NM_014333. 25 O termo "resposta imune" se refere à ação de, por exemplo, lin- fócitos, células de apresentação de antígeno, células fagocíticas, granulóci- tos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fíga- do (incluindo anticorpos, citoquinas, e complemento) que resultam em dano seletivo a, destruição de, ou eliminação a partir do corpo humano de patoge- 30 nias de invasão, células ou tecidos infectados com patogenias, células can- cerosas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células humanas normais ou tecidos.

Uma "trajetória de transdução de sinal" se refere ao relaciona- mento bioquímico entre várias de moléculas de transdução de sinal que de- sempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula.

Conforme aqui usado, a frase "re- 5 ceptor de superfície de célula" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receberem um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana de plasma de uma célula.

Um exemplo de um "recep- tor de superfície de célula" da presente invenção é o receptor CADM1. O termo "anticorpo" conforme aqui referido inclui anticorpos to- 10 tais e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, "porção de ligação de antígeno") ou cadeias simples destes.

Um "anticorpo" se refere a uma glicoproteína que pode compreender pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por pontes de dissulfeto, ou uma por- ção de ligação de antígeno destas.

Cada cadeia pesada é compreendida de 15 uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma regi- ão de cadeia pesada constante.

A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é com- preendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL ou VK) e uma região constante de cadeia leve.

A região constante de cadeia 20 leve é compreendida de um domínio, CL.

As regiões VH e VL/VK podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de de- terminação de complementaridade (CDR), interespersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL/VK é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de amino-terminal 25 para carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e cadeias leves con- têm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

As regiões cons- tantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por e- 30 xemplo, células efetuadoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), conforme aqui usado, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar a especificamente um antígeno (por exemplo, CADM1). Mostrou-se que a fun- ção de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmen- 5 tos de um anticorpo de comprimento total.

Exemplos de fragmentos de liga- ção envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anti- corpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL/VK, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab articulados por uma ponte de 10 dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fab’, que é essencial- mente um Fab com parte da região de articulação (vide, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento Fd consis- tindo nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo, (vi) a fragmento dAb (Ward et 15 al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; (vii) uma regiões de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um domínio va- riável simples e dois domínios constantes.

Além disso, embora os dois do- mínios do fragmento Fv, VL/VK e VH, são codificados por genes separados, 20 eles podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um ligante sintético que capacita que os mesmos sejam produzidos como cadeia de proteína simples em que o par de regiões VL/VK e VH forma moléculas mo- novalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc.

Natl. 25 Acad.

Sci.

USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples são tam- bém pretendidos para serem envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo.

Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando-se técnicas convencionais conhecidas àqueles técnicos no assunto, e os fragmentos são classificados para utilidade na mesma maneira como 30 são anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado," conforme aqui usado, é pretendido se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos ten-

do especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente CADM1 é substancialmente livre de anticorpos que liga especificamente antígenos outros do que CADM1). Um anticorpo isolado que liga especificamente CADM1 pode, contudo, ter reatividade cruzada a 5 outros antígenos, tais como moléculas de CADM1 de outras espécies.

Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme aqui usados, se referem a uma preparação de molé- 10 culas de anticorpo de composição molecular simples.

Uma composição de anticorpo monoclonal descreve uma especificidade de ligação simples e afi- nidade para um epítope particular.

O termo "anticorpo humano," conforme aqui usado, é pretendido para incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais ambas as regiões 15 de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de li- nhagem germinativa humana.

Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imuno- globulina de linhagem germinativa humana.

Os anticorpos humanos da in- venção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas se- 20 quências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de local in vitro ou por mutação somática in vivo). Contudo, o termo "anticorpo huma- no," conforme aqui usado, não é pretendido para incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas a partir da linhagem germinativa de outras 25 espécies mamíferas, tal como um camundongo, foram enxertadas nas se- quências de estrutura humanas.

O termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a anticorpos que descrevem uma especificidade de ligação simples que tem regiões vari- áveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de se- 30 quências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana.

Em uma mo- dalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibri- doma que inclui uma célula B obtida de um animal não transgênico humano,

por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreen- dendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", conforme aqui usa- 5 do, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, cri- ados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou trans- cromossomal para genes de imunoglobulina humana, ou um hibridoma pre- parado dos mesmos (descritos adicionalmente abaixo), (b) anticorpos isola- 10 dos de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo hu- mano, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma bi- blioteca de anticorpo humano combinatorial recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem união de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras 15 sequências de DNA.

Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequên- cias de imunoglobulina de linhagem germinativa humana.

Em certas modali- dades, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser indivi- dualizados para mutagênese in vitro (ou, quando um transgênico de animal 20 para sequência de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, desse modo, as sequências de aminoácido das regiões VH e VL/VK dos anti- corpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas de e rela- cionadas a sequências de linhagem germinativa humana VH e VL/VK, não podem existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa 25 humana de anticorpo in vivo.

Conforme aqui usado, "isotipo" se refere a uma classe de anti- corpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificado pelos genes de região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anti- 30 corpo específico para um antígeno" são usadas permutavelmente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno." O termo "derivados de anticorpo humano" se refere a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado do anti- corpo e outro agente ou anticorpo.

O termo "anticorpo humanizado" é pretendido para se referir a anticorpos em que sequências de CDR derivadas a partir da linhagem ger- 5 minativa de outras espécies mamíferas, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humanas.

Modificações de região de estrutura adicionais podem ser feitas dentro das sequências de estrutura humanas.

O termo "anticorpo quimérico" é pretendido para se referir a anti- 10 corpos em que as sequências de região variável são derivadas de uma es- pécie e as sequências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de região variável são deriva- das de um anticorpo de camundongo e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano. 15 Conforme aqui usado, um anticorpo que "especificamente se liga a CADM1 humano" é pretendido para se referir a um anticorpo que se liga a CADM1 humano com um EC50 de 50 Nm ou menos, 10 Nm ou menos, ou mais preferivelmente 1 Nm ou menos.

O termo "não se liga substancialmente" a uma proteína ou célu- 20 las, conforme aqui usado, significa não se liga a ou não se liga com uma alta afinidade à proteína ou células, isto é, se liga a proteína ou células com uma KD de 1 x 10-6 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-5 M ou mais, mais pre- ferivelmente 1 x 10-4 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-3 M ou mais, ainda mais preferivelmente 1 x 10-2 M ou mais. 25 O termo "EC50", conforme aqui usado, é pretendido para se refe- rir a potência de um composto por quantificação da concentração que con- duz a 50% de resposta máxima/efeito.

O termo "Kassoc" ou "Ka", conforme aqui usado, é pretendido para se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particu- 30 lar, pelo que o termo "Kdis" ou "Kd", conforme aqui usado, é pretendido para se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particu- lar.

O termo "KD", conforme aqui usado, é pretendido para se referir à cons-

tante dissociação, que é obtida a partir da proporção de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores KD para anticorpos podem ser determinados usando-se métodos bem estabelecidos na técnica.

Um método preferido para determinação da KD de um anticorpo é 5 pelo uso de ressonância de plasmon de superfície, preferivelmente usando- se um sistema de biosensor tal como um sistema Biacore®. Conforme aqui usado, o termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG se refere a um anticorpo tendo uma KD de 1 x 10-7 M ou menos, mais preferivelmente 5 x 10-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 1x10-8 M 10 ou menos, ainda mais preferivelmente 5 x 10-9 M ou menos, e ainda mais preferivelmente 1 x 10-9 M ou menos, para um antígeno alvo.

Contudo, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo.

Por exemplo, ligação de "alta afinidade" para um isotipo IgM se refere a um anti- corpo tendo uma KD de 10-6 M ou menos, mais preferivelmente 10-7 M ou 15 menos, ainda mais preferivelmente 10-8 M ou menos.

O termo "epítope" ou "determinante antigênico" se refere a um local em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se ligam es- pecificamente.

Os epítopes podem ser formados ambos de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por desdobramento 20 terciário de uma proteína.

Os epítopes formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes de desnaturação, pelo que os epítopes formados por desdobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação.

Um epítope tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma 25 conformação espacial única.

Métodos de determinação de conformação es- pacial de epítopes incluem técnicas na técnica e aqueles aqui descritos, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimen- sional (vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecu- lar Biology, Vol. 66, G.

E.

Morris, Ed. (1996)). 30 Consequentemente, também envolvidos pela presente invenção estão anticorpos que se ligam a (isto é, reconhecem) o mesmo epítope como os anticorpos descritos aqui (isto é, PTA021_A1, PTA021_A2 e

PTA021_A3). Os anticorpos que se ligam ao mesmo epítope podem ser i- dentificados por sua capacidade de competir cruzado com (isto é, competiti- vamente inibir ligação de) um anticorpo de referência a um antígeno alvo em uma maneira estatisticamente significante.

A inibição competitiva pode ocor- 5 rer, por exemplo, se os anticorpos se ligam a epítopes idênticos ou estrutu- ralmente similares (por exemplo, epítopes de sobreposição), ou epítopes espacialmente próximos que, quando ligados, causam impedimento estérico entre os anticorpos.

A inibição competitiva pode ser determinada usando-se ensaios 10 de rotina em que a imunoglobulina sob teste inibe ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum.

Numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio di- reto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indire- to de fase sólida (EIA), ensaio de competição intercalado (vide, Stahli et al., 15 Methods in Enzymology 9:242 (1983)); biotin-avidin EIA de fase direta sólido (vide, Kirkland et al., J.

Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio etiquetado de fase sólida, ensaio intercalado etiquetado direto de fase sólida (vide, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de etiqueta direto de fase sólida usando etiqueta I-125 (vide, Morel et 20 al., Mol.

Immunol. 25(1):7 (1988)); biotin-avidin EIA direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA etiquetado direto. (Molde- nhauer et al., Scand.

J.

Immunol. 32:77 (1990)). Tipicamente, tal ensaio en- volve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que suportam qualquer destes, uma imunoglobulina de teste não etiquetada 25 e uma imunoglobulina de referência etiquetada.

A inibição competitiva é me- dida por determinação da quantidade de etiqueta ligada a superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste.

Usualmente a imunoglo- bulina de teste está presente em excesso.

Usualmente, quando um anticor- po de competição está presente em excesso, ele inibirá ligação específica 30 de um anticorpo de referência a um antígeno comum por pelo menos 50- 55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75%, ou mais.

Outras técnicas incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítope, tal como análise de raios X de cristais de complexos antígeno: anticorpo, que proporcionam resolução atômica do epítope.

Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno onde perda de ligação devido a uma modificação de 5 um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é frequente- mente considerada uma indicação de um componente de epítope.

Em adi- ção, métodos combinatoriais computacionais para mapeamento de epítope podem também ser usados.

Estes métodos contam com a capacidade dos anticorpo de interesse em isolar peptídeos curtos específicos de afinidade de 10 bibliotecas de peptídeo de mostrador de fago combinatoriais.

Os peptídeos, são em seguida, relacionados como condutores para a definição do epítope correspondente ao anticorpo usado para classificar a biblioteca de peptídeo.

Para mapeamento do epítope, algoritmos computacionais foram também desenvolvidos que foram mostrados mapear epítopes descontínuos confor- 15 macionais.

Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano.

O termo "animal não humano" inclui todos os ver- tebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cães, gatos, cavalos, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc. 20 Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes adicio- nais nas seguintes subseções.

Anticorpos anti-CADM1 Os anticorpos da invenção são caracterizados por característi- cas funcionais particulares ou propriedades dos anticorpos.

Por exemplo, os 25 anticorpos se ligam especificamente a CADM1 humano.

Preferivelmente, um anticorpo da invenção se liga a CADM1 com alta afinidade, por exemplo, com uma KD de 8 x 10-7 M ou menos, ainda mais tipicamente 1 x 10-8 M ou menos.

Os anticorpos anti-CADM1 da invenção preferivelmente exibem uma ou mais das seguintes características: se liga a CADM1 humano com um 30 EC50 de 50 Nm ou menos, 10 Nm ou menos, ou, mais preferivelmente, 1 Nm ou menos; se ligam a células humanas que expressam CADM1. Em uma modalidade, os anticorpos preferivelmente se ligam a um epítope antigênico presente no CADM1, cujo epítope não está presente em outras proteínas.

Os anticorpos tipicamente se ligam a CADM1, mas não se ligam a outras proteínas, ou se ligam a proteínas com uma baixa afinida- de, tal como uma KD de 1 x 10-6 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-5 M 5 ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-4 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-3 M ou mais, ainda mais preferivelmente 1 x 10-2 M ou mais.

Preferivel- mente, os anticorpos não se ligam às proteínas relacionadas, por exemplo, os anticorpos não se ligam substancialmente a ICAMs, VCAMs, ou outras moléculas de adesão de célula.

Em uma modalidade, o anticorpo pode ser 10 internalizado em uma célula que expressa CADM1. Ensaios padrões para avaliar internalização de anticorpo são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, em ensaio de internalização HumZap.

Ensaios padrões para avaliar a capacidade de ligação dos anti- corpos para CADM1 são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, E- 15 LISAs, manchas de Western, RIAs, e análise de citometria de fluxo.

Ensaios adequados são descritos em detalhes nos Exemplos.

As cinéticas de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também podem ser avali- ados por ensaios padrões conhecidos na técnica, tal como por análise de sistema Biacore®. Para avaliar a ligação a células de tumor de célula B de 20 Raji ou Daudi, Raji (ATCC Depósito Nº CCL-86) ou Daudi (ATCC Depósito Nº CCL-213), as células podem ser obtidas de fontes publicamente disponí- veis, tais como a American Type Culture Collection, e usados em ensaios padrões, tais como análise citométrica de fluxo.

Anticorpos Monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 25 Anticorpos preferidos da invenção são os anticorpos monoclo- nais humanos PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3, isolados e estrutu- ralmente caracterizados conforme descrito nos Exemplos 1, 2, e 3. As se- quências de aminoácidos VH de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:19, 20, e 21, respectivamente.

As sequên- 30 cias de aminoácidos VK de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:22, 23, e 24, respectivamente.

Dado que cada um destes anticorpos podem se ligar a CADM1,

as sequências VH e VK podem ser "misturadas e combinadas" para criar ou- tras moléculas de ligação de anti-CADM1 da invenção.

A ligação de CADM1 de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). 5 Preferivelmente, quando as cadeias VH e VK são misturadas ecombinadas, uma sequência VH de um emparelhamento de VH/VK particular é substituída com uma sequência VH estruturalmente similar.

Do mesmo modo, preferi- velmente uma sequência VL de um emparelhamento VH/VK particular é subs- tituída com uma sequência VK estruturalmente similar. 10 Consequentemente, em um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste com- preendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:19, 20, e 21; e uma região variável de cadeia leve compreendendo 15 uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22, 23, e 24; no qual o anticorpo se liga especificamente a CADM1, preferivelmente CADM1 humano.

Combinações preferidas de cadeia pesada e leve incluem: uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoáci- 20 do de SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:22; ou uma região variável de ca- deia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO:23, ou uma região variável de cadeia pesada com- 25 preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:21; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:24. Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos que com- preendem a cadeia pesada e cadeia leve de CDR1s, CDR2s e CDR3s de 30 PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3, ou combinações destes.

As se- quências de aminoácido das VH CDR1s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 1, 2, e 3. As sequências de aminoácido das VH CDR2s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 4, 5, e 6. As sequências de aminoácido das VH CDR3s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:7, 8, e 9. As sequências de aminoácido das VK CDR1s de 5 PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:10, 11, e 12. As sequências de aminoácido das VK CDR2s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:13, 14, e 15. As sequências de aminoácidos das VK CDR3s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:16, 17, e 18. As regiões CDR 10 são delineadas usando-se o sistema Kabat (Kabat, E.

A., et al., (1991) Se- quences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242). Dado que cada um destes anticorpos pode se ligar a CADM1 e que especificidade de ligação de antígeno é provida principalmente pelas 15 regiões CDR1, CDR2, e CDR3, as sequências VH CDR1, CDR2, e CDR3 e sequências VK CDR1, CDR2, e CDR3 podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deve conter uma VH CDR1, CDR2, e CDR3 e uma VK CDR1, CDR2, e CDR3) para criar outras moléculas de ligação de anti- 20 CADM1 da invenção.

A ligação de CADM1 de tais anticorpos "misturados e equiparados" pode ser testado usando-se os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs, análise de Biacore®). Preferi- velmente, quando sequências VH CDR são misturadas e combinadas, a se- quência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de uma sequência VH 25 particular é substituída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente simi- lar.

Do mesmo modo, quando sequências VK CDR são misturadas e combi- nadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência Vk particu- lar preferivelmente é substituída com uma sequência(s) de CDR estrutural- mente similar.

Será prontamente aparente ao técnico no assunto que novas 30 sequências VH e VK podem ser criadas por substituição de uma ou mais se- quências de região CDR VH e/ou VL/VK com sequências estruturalmente si- milares a partir das sequências de CDR aqui descritas para anticorpos mo-

noclonais PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3. Consequentemente, em outros aspectos, a invenção proporcio- na um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste compreendendo: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreen- 5 dendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consis- tindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do gru- po consistindo em SEQ ID NOs:4, 5, e 6; uma região variável de cadeia pe- sada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a 10 partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:7, 8, e 9; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoáci- do selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:13, 14, e 15; e 15 uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:16, 17, e 18; no qual o anticorpo especificamente se liga a CADM1, pre- ferivelmente CADM1 humano.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: uma 20 região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO:1; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 13; e uma 25 região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade preferida, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 2; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 5; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma 30 região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 11; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 17.

Em outra modalidade preferida, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:6; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:9; uma 5 região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:12; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 15; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18. É bem conhecido na técnica que o domínio de CDR3, indepen- dentemente do(s) domínio(s) de CDR1 e/ou CDR2, sozinho pode determinar 10 a especificidade de ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que anticorpos múltiplos podem prognosticavelmente ser gerados tendo a mes- ma especificidade de ligação baseada em uma sequência de CDR3 comum.

Ver, por exemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (descrevendo a produção de um anticorpo anti-CD30 humanizado usando-se 15 somente o CDR3 de domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de mu- rino anti-CD30 Ki-4); Beiboer et al., J.

Mol.

Biol. 296:833-849 (2000) (descre- vendo anticorpos de glicoproteína-2 epitelial recombinante (EGP-2) usando- se somente a sequência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo MOC-31 anti-EGP-2 de murino parental); Rader et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 20 95:8910-8915 (1998) (descrevendo um painel de anticorpos humanizados anti-integrin v 3 usando-se um domínio de CDR3 variável de cadeia pesada e leve de um anticorpo de murino anti-integrin v 3 LM609 no qual cada anti- corpo membro compreende uma sequência distinta fora do domínio de C- DR3 e capaz de ligar o mesmo epítope como o anticorpo de murino de ori- 25 gem com afinidades tão alta ou mais alta do que o anticorpo de murino de origem); Barbas et al., J.

Am.

Chem.

Soc. 116:2161-2162 (1994) (descre- vendo que o domínio de CDR3 proporciona a contribuição mais significante para ligação de antígeno); Barbas et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (descrevendo o enxerto de sequência de CDR3 de ca- 30 deia pesada CDR3 de três Fabs (SI-1, SI-40, e SI-32) contra DNA placental humano na cadeia pesada de um Fab toxoide antitétano substituindo, desse modo, a CDR3 de cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio de CDR3 sozinho confere especificidade de ligação); e Ditzel et al., J.

Immu- nol. 157:739-749 (1996) (descrevendo estudos de enxerto no qual transfe- rência de somente a CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3 poliespecífi- co de origem a uma cadeia pesada de um Fab p313 de ligação toxoide de 5 tétano Ig monoespecífico foi suficiente para reter especificidade de ligação do Fab de origem). Cada uma estas referências é, desse modo, incorporada por referência em sua totalidade.

Consequentemente, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pe- 10 sada e/ou leve de um anticorpo derivado de um animal humano ou não hu- mano, no qual o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente ao CADM1. Dentro de certos aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano, tal como um anticor- 15 po de camundongo ou de rato, no qual o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente a CADM1. Dentro de algumas modalidades, tais anticorpos da invenção compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano (a) são capazes de competir a ligação com; (b) reter as características funcionais; (c) se ligar ao 20 mesmo epítope; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação similar como o anti- corpo não humano correspondente de origem.

Dentro de outros aspectos, a presente invenção proporciona an- ticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humano, tal como, por exemplo, 25 um anticorpo humano obtido de um animal não humano, no qual o anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente a CADM1. Dentro de outros aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compre- endendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano 30 obtido de um animal não humano, no qual o primeiro anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente a CADM1, e no qual o domínio de CDR3 a partir do primeiro anticorpo humano substitui um domínio de CDR3 em um anticorpo humano que está carecendo de especificidade de ligação para CADM1 para gerar um segundo anticorpo humano que é capaz de se ligar especificamente a CADM1. Dentro de algumas modalidades, tais anticorpos da invenção compreendem um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesa- 5 da e/ou leve a partir do primeiro anticorpo humano (a) são capazes de com- petirem ligação com; (b) reterem as características funcionais; (c) se ligarem ao mesmo epítope; e/ou (d) terem uma afinidade de ligação similar como o primeiro anticorpo humano de origem correspondente.

Em modalidades pre- feridas, o primeiro anticorpo humano é PTA021_A1, PTA021_A2 ou 10 PTA021_A3. Anticorpos Tendo Sequências de Linha de germe Particulares Em certas modalidades, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linhagem germinativa particular e/ou uma região variável 15 de cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linhagem germinativa particular.

Por exemplo, em uma modalidade preferida, a invenção propor- ciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antí- geno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o 20 produto de ou derivado de um gene humano VH 2-05, no qual o anticorpo especificamente se liga a CADM1. Em ainda outra modalidade preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene humano VK L15, no qual o 25 anticorpo se liga especificamente a CADM1. Em ainda outra modalidade pre- ferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, no qual o anticorpo: compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene hu- mano VH 2-05 (cujos genes codificam as sequências de aminoácido coloca- 30 das em SEQ ID NOs: 31, 32, ou 33, respectivamente); compreende uma re- gião variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene humano VK L15 (cujos genes codificam as sequências de aminoácido colo-

cadas em SEQ ID NOs: 34, 35, ou 36, respectivamente); e especificamente se ligam a CADM1, preferivelmente, CADM1 humano.

Exemplos de um anti- corpo tendo VH e VK de VH 2-05 e VK L15, respectivamente, são PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3. 5 Conforme aqui usado, um anticorpo humano compreende regi- ões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de linhagem germinativa particular se as regiões variá- veis do anticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobu- lina de linhagem germinativa humana.

Tais sistemas incluem imunização de 10 genes que transportam camundongo transgênico de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse, ou classificação de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana descrita no fago com o antígeno de interesse.

Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana, pode ser identificado co- 15 mo tal por comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano com as sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem germina- tiva humana e seleção da sequência de imunoglobulina de linhagem germi- nativa humana que é mais próxima da sequência (isto é, maior % de identi- dade) para a sequência do anticorpo humano.

Um anticorpo humano que é 20 "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linha- gem germinativa humana particular, pode conter diferenças de aminoácido conforme comparadas à sequência de linhagem germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas que ocorrem naturalmente, ou introdução in- tencional de mutação direcionada de local.

Contudo, um anticorpo humano 25 selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico nas sequências de ami- noácidos a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imu- noglobulina de linhagem germinativa humana, e contém resíduos de amino- ácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado às sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem 30 germinativa humana de outras espécies (por exemplo, sequências de linha- gem germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica na sequência de aminoácido para a sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

Tipicamente, um an- ticorpo humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa huma- na particular descreverá não mais do que 10 diferenças de aminoácido a 5 partir da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana.

Em tais casos, o anticorpo humano pode descrever não mais do que 5, ou ainda não mais do que 4, 3, 2, ou 1 dife- renças de aminoácido a partir da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. 10 Anticorpos Homólogos Em ainda outra modalidade, um anticorpo da invenção compre- ende cadeias variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácido que são homólogas às sequências de aminoácido dos anti- corpos preferidos descritos aqui, e no qual os anticorpos retêm as proprie- 15 dades funcionais desejadas dos anticorpos anti-CADM1 da invenção.

Por exemplo, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma regi- ão variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, no qual: a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoá- 20 cido que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência de aminoácido se- lecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:19, 20, e 21; a regi- ão variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22, 23, e 24; e o anticorpo se 25 liga a CADM1 humano com um EC50 de 10 Nm ou menos.

O anticorpo pode também se ligar à células CHO transfectadas com CADM1 humano.

Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. 30 Em outras modalidades, as sequências de aminoácido VH e/ou VK podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às se- quências colocadas acima.

Um anticorpo tendo regiões VH e VK tendo alta

(isto é, 80% ou maior) homologia às regiões VH e VK das sequências coloca- das acima, pode ser obtido por mutagênese (por exemplo, mutagênese dire- cionada de local ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam SEQ ID NOs:25, 26, 27, 28, 29, e 30, seguido pelo teste do anti- 5 corpo codificado alterado para função retida usando-se os ensaios funcio- nais aqui descritos.

Conforme aqui usado, a porcentagem de homologia entre duas sequências de aminoácido é equivalente a porcentagem de identidade entre as duas sequências.

A porcentagem de identidade entre as duas sequências 10 é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas se- quências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/total # de posi- ções x 100), levando-se em conta o número de folgas, e o comprimento de cada folga, que necessita ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências.

A comparação de sequências e determinação de porcentagem 15 de identidade entre duas sequências pode ser efetuada usando-se um algo- ritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitantes abaixo.

A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoá- cido pode ser determinada usando-se o algoritmo de E.

Meyers e W.

Miller (Comput.

Appl.

Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa A- 20 LIGN (versão 2.0), usando-se uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de folga de 12 e uma penalidade de folga de 4. Em adição, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoá- cido pode ser determinada usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.

Mol.

Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa FOLGA no 25 pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando-se ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de folga de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de proteína da presente invenção podem adicionalmente serem usadas como uma "se- 30 quência de indagação" para realizar uma pesquisa em bases de dados pú- blicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas.

Tais pesquisas podem ser realizadas usando-se o programa XBLAST (versão 2.0) de Alts-

chul, et al. (1990) J.

Mol.

Biol. 215:403-10. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas às molécu- las de anticorpo da invenção.

Para obter alinhamentos com folga para pro- 5 posta de comparação, BLAST com folga pode ser utilizado conforme descri- to em Altschul et al., (1997) Acids nucleics Res. 25(17):3389-3402. Quando se utiliza BLAST e programas BLAST Com Folga, os parâmetros de falta dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usa- dos.

Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 10 Anticorpos com Modificações Conservativas Em certas modalidades, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de C- DR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 sequências, no qual uma ou mais destas sequências 15 de CDR compreendem sequências especificadas de aminoácido baseadas nos anticorpos preferidos aqui descritos (por exemplo, PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3), ou modificações conservativas destes, e no qual os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticor- pos anti-CADM1 da invenção.

Consequentemente, a invenção proporciona 20 um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo se- quências de CDR1, CDR2, e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3, no qual: a sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência 25 de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:7, 8, e 9, e modificações conservativas destas; a sequência de CDR3 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em se- quência de aminoácido de SEQ ID NOs:16, 17, e 18, e modificações conser- 30 vativas destas; o anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 de 1 nM ou menos.

O anticorpo pode também se ligar a células CHO transfectadas com CADM1 humano.

Em uma modalidade preferida, a sequência de CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido sele- cionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ 5 ID NOs:4, 5, e 6, e modificações conservativas destas; e a sequência de CDR2 da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de a- minoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências de ami- noácidos de SEQ ID NOs:13, 14, e 15, e modificações conservativas destas.

Em outra modalidade preferida, a sequência de CDR1 da região variável de 10 cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:1, 2, e 3, e modificações conservativas destas; e a sequência de CDR1 da re- gião variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido se- lecionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de 15 SEQ ID NOs:10, 11, e 12, e modificações conservativas destas.

Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, anti- corpos humanos, anticorpos humanizados, ou anticorpo quiméricos.

Conforme aqui usado, o termo "modificações de sequência con- servativa" é pretendido para se referir a modificações de aminoácido que 20 não afetam significantemente ou alteram as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido.

Tais modificações conserva- tivas incluem substituições, adições e anulações de aminoácido.

Modifica- ções podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas pa- drões conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada de local e 25 mutagênese mediada por PCR.

Substituições de aminoácido conservativas são substituições em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.

Famílias de resí- duos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na téc- nica.

Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por 30 exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, ciste-

ína, triptofan), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais a- romáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Desse mo- 5 do, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR de um anti- corpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoá- cido a partir da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado para função retida usando-se os ensaios funcionais aqui descri- tos. 10 A sequência de CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO:1, 2, ou 3 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:10, 11, ou 12 pode compreender uma ou mais modificações de sequên- 15 cia conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substitui- ções, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR2 da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO:4, 5, ou 6 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a se- 20 quência de CDR2 da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO:13, 14, ou 15 pode compreendem uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR3 da cadeia pesada mostra- da em SEQ ID NO:7, 8, ou 9 pode compreender uma ou mais modificações 25 de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; e/ou a sequência de CDR3 da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO:16, 17, ou 18 pode compre- ender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de a- 30 minoácido.

Anticorpos que se ligam ao mesmo Epítope como Anticorpos anti-CADM1 da Invenção

Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epítope em CADM1 humano como qualquer dos anticorpos monoclonais CADM1 da invenção (isto é, anticorpos que têm a capacidade competir por cruzamento para ligação a CADM1 com quaisquer dos anticor- 5 pos monoclonais da invenção). Em modalidades preferidas, o anticorpo de referência para estudos na competição cruzada para ligação pode ser o anti- corpo monoclonal PTA021_A1 (tendo sequências de VH e VK conforme mos- trado em SEQ ID NOs:19 e 22, respectivamente), o anticorpo monoclonal PTA021_A2 (tendo sequências de VH e VK conforme mostrado em SEQ ID 10 NOs:20 e 23 respectivamente), ou o anticorpo monoclonal PTA021_A3 (ten- do sequências de VH e VK conforme mostrado em SEQ ID NOs:21 e 24 res- pectivamente). Tais anticorpos de competição cruzada podem ser identifica- dos baseados em sua capacidade de competir por cruzamento com PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 em ensaios de ligação padrões de 15 CADM1. Por exemplo, análise de BIAcore, ensaios de ELISA ou citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar competição cruzada para liga- ção com os anticorpos da presente invenção.

A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de, por exemplo, PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3, a CADM1 humano demonstra que o anticorpo de teste pode 20 competir com PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 para ligação a CADM1 humano e, desse modo, se liga ao mesmo epítope em CADM1 hu- mano como PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3. Em uma modalidade preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítope em CADM1 humano como PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 é um anticorpo monoclonal 25 humano.

Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.

Anticorpos Projetados e Modificados Um anticorpo da invenção adicionalmente pode ser preparado usando-se um anticorpo tendo uma mais das sequências de VH e/ou VL aqui 30 descritas pode ser usado como material de partida para projetar um anticor- po modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas conforme comparadas ao anticorpo de partida.

Um anticorpo pode ser proje-

tado por modificação de um ou mais aminoácidos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicional- mente ou alternativamente, um anticorpo pode ser projetado por modificação 5 de resíduos dentro de região (ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função (ões) efetuadora(s) do anticorpo. Em certas modalidades, o enxerto da CDR pode ser usado para projetar regiões variáveis de anticorpos. Os anticorpos interagem com antí- genos alvos predominantemente através de resíduos de aminoácido que 10 estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoá- cido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequência fora das CDRs. Devido às sequências de CDR serem responsá- veis por muitas das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anti- 15 corpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente por construção dos vetores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo específico que ocorre natu- ralmente enxertado nas sequências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al., (1998) 20 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Ver. U.S.A. 86:10029-10033; Patente dos Es- tados Unidos Nº 5.225.539 para Winter, e Patentes dos Estados Unidos Nos.

5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.). Consequentemente, outra modalidade da invenção pertence a 25 um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo se- quências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo uma sequência de ami- noácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3, SEQ ID NOs:4, 5, e 6, e SEQ ID NOs:7, 8, e 9, respectivamente, e uma regi- 30 ão variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12, SEQ ID NOs:13, 14, e

15, e SEQ ID NOs:16, 17, e 18, respectivamente.

Desse modo, tais anticor- pos contêm as sequências de CD de VH e VK de anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 ainda podem conter sequências de estrutura diferentes destes anticorpos. 5 Tais sequências de estrutura podem ser obtidas de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem sequências de gene de anticorpo de linhagem germinativa.

Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados de sequên- 10 cia de linhagem germinativa humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E.

A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Depart- ment of Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242; Tomlin- son, I.

M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences 15 Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Lo- ops" J.

Mol.

Biol. 227:776-798; e Cox, J.

P.

L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur.

J.

Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada um do qual são expressamente aqui incorporados por referência.

Como outro exemplo, as sequências de 20 DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados do Banco de Genes.

Por exemplo, as seguintes sequências de linhagem germinativa de cadeia pesada encontradas no camundongo HCo7 HuMAb são disponí- veis nos Acessos no Banco de Genes acompanhantes números: 1-69 25 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como outro exemplo, as seguintes se- quência de linhagem germinativa de cadeia pesada encontradas no camun- dongo HCo12 HuMAb são disponíveis no Acesso no Banco de Genes a- companhante números: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 30 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) e 3-23 (AJ406678). As sequências de proteína de anticorpo são comparadas com uma base de dados de sequência de proteína compilada usando-se um dos métodos de pesquisa de similaridade de sequência denominados o Gapped BLAST (Altschul et al., (1997) Nucleics Acids Research 25:3389-3402), que é bem conhecido àqueles técnicos no assunto.

BLAST é um algoritmo heu- 5 rístico em que um alinhamento estatisticamente significante entre a sequên- cia de anticorpo e a sequência de base de dados é do mesmo modo para conter pares de segmento de alto escore (HSP) de palavras alinhadas.

Os pares de segmento cujos escores não podem ser aperfeiçoados por exten- são ou arranjo são denominados um golpe.

Brevemente, as sequências de 10 nucleotídeo de origem VBASE (http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php) são transladadas e a região entre e incluin- do região de estrutura de FR1 a FR3 é retida.

As sequências de base de dados têm um comprimento médio de 98 resíduos.

As sequências duplicatas que são equiparações exatas sobre o comprimento total da proteína são re- 15 movidas.

Uma pesquisa de BLAST para proteínas usando-se o programa blastp com falta, parâmetros padrões, exceto o filtro de baixa complexidade, que é terminada, e a matriz de substituição de BLOSUM62, filtros para 5 golpes de topo produzindo equiparações de sequência.

As sequências de nucleotídeo são transladadas em todas as seis estruturas e a estrutura com 20 nenhum códon de parada no segmento de equiparação da sequência de base de dados é considerada o golpe potencial.

Isto é, por sua vez, confir- mado usando-se o programa BLAST tblastx, que translada a sequência de anticorpo em todas as seis estruturas e compara aquelas translações à se- quência de VBASE de nucleotídeos dinamicamente transladada em todas as 25 seis estruturas.

As identidades são combinações exatas de aminoácido entre a sequência de anticorpo e a base de dados de proteína sobre o comprimento total da sequência.

As (identidades + equiparação de substituição) positivas não são idênticas, mas substituições de aminoácido guiadas pela matriz de 30 substituição BLOSUM62. Se a sequência de anticorpo combina duas das sequências de base de dados com mesma identidade, o golpe com mais positivos seria decidido para ser o golpe de sequência de combinação.

As sequências de estrutura preferidas para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às sequências de estrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, similares às sequências de estrutura de VH 2-05 (SEQ ID NO:31) e/ou as 5 sequências de estrutura de VK L15 (SEQ ID NO:34) usadas por anticorpos monoclonais preferidos da invenção. As sequências de VH CDR1, CDR2, e CDR3, e as sequências de VK CDR1, CDR2, e CDR3 podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que têm a sequência idêntica conforme aquelas encontradas no gene de imunoglobulina de linhagem germinativa do qual a 10 sequência de estrutura deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxer- tadas em regiões de estrutura que contém uma ou mais mutações conforme comparadas às sequências de linhagem germinativa. Por exemplo, verificou- se que em certos exemplos é benéfico mudar os resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ou intensificar a capacidade de ligação de antígeno 15 do anticorpo (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos.

5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al). Outro tipo de modificação de região variável é mudar resíduos de aminoácido dentro das regiões de VH e/ou VK CDR1, CDR2 e/ou CDR3 para, desse modo, aperfeiçoar uma ou mais propriedades de ligação (por 20 exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese direcionada de local ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação (ões) e o efeito na ligação de anticorpo, ou outras propriedades funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo con- forme aqui descrito e provido nos Exemplos. Preferivelmente modificações 25 conservativas (conforme discutidas acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou anulações de aminoácidos, nas são preferivelmente substituições. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são altera- dos. 30 Consequentemente, em outra modalidade, a presente descrição proporciona anticorpo anti-CADM1 isolado monoclonais, ou porções de liga- ção de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pe-

sada compreendendo: (a) uma região de VH CDR1 compreendendo uma se- quência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, qua- tro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácido conforme 5 comparada a SEQ ID NOs:1, 2, e 3; (b) uma região de VH CDR2 compreen- dendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consis- tindo em SEQ ID NOs:4, 5, e 6, ou uma sequência de aminoácido tendo u- ma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de ami- noácido conforme comparado a SEQ ID NOs:4, 5, e 6; (c) uma região de VH 10 CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:7, 8, e 9, ou uma sequência de ami- noácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, anulações ou adições conforme comparada a SEQ ID NOs:7, 8, e 9; (d) uma região de VK CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecio- 15 nada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12, ou uma se- quência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácidos conforme comparada a SEQ ID NOs:10, 11, e 12; (e) uma região de VK CDR2 compreendendo uma sequên- cia de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID 20 NOs:13, 14, e 15, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácidos con- forme comparada a SEQ ID NOs:13, 14, e 15; e (f) uma região de VK CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do gru- po consistindo em SEQ ID NOs:16, 17, e 18, ou uma sequência de aminoá- 25 cido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anula- ções de aminoácidos conforme comparada a SEQ ID NOs:16, 17, e 18. Os anticorpos projetados da invenção incluem aqueles em que modificações foram feitas nos resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VK, por exemplo, para aperfeiçoar as propriedades do anticorpo.

Tipicamente 30 tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo.

Por exemplo, uma aproximação é "retromutada" um ou mais resí- duos de estrutura à sequência de linhagem germinativa correspondente.

Mais especificamente, um anticorpo que tem suportado mutação somática pode conter resíduos estruturais que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado.

Tais resíduos podem ser identifi- cados por comparação das sequências de anticorpo de estrutura às sequên- 5 cias de linhagem germinativa para qual o anticorpo é derivado.

Por exemplo, para PTA021_A1, usando-se o sistema de numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido #30 (dentro de FR3) de VH é uma asparagina (SEQ ID NO:19) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa corres- pondente VH 2-05 é uma serina (SEQ ID NO:31). Para retornar as sequên- 10 cias de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" à sequência de linhagem germinativa por, por exemplo, mutagênese direcionada de local ou mutagê- nese mediada por PCR (por exemplo, resíduo #30 do VH de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de asparagina para serina). 15 Como outro exemplo, para PTA021_A1, resíduo de aminoácido #54 de VH é um ácido aspártico (SEQ ID NO:19) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma aspara- gina (SEQ ID NO:31). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #54 20 do VH de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de ácido aspártico para aspa- ragina.

Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

Como outro exemplo, para PTA021_A1, resíduo de aminoácido #50 de VK é uma glicina (SEQ ID NO:22) pelo que este resíduo na sequência 25 de linhagem germinativa correspondente VK L15 é uma alanina (SEQ ID NO:34). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua confi- guração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #50 do VK de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de glicina para alanina.

Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela inven- 30 ção.

Como outro exemplo, para PTA021_A1, resíduo de aminoácido #77 de VK é uma asparagina (SEQ ID NO:22) pelo que este resíduo na se-

quência de linhagem germinativa correspondente VK L15 é uma serina (SEQ ID NO:34). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua con- figuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #77 do VK de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de asparagina para serina.

Tais anticor- 5 pos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

Como outro exemplo, para PTA021_A2, resíduo de aminoácido #54 de VH é um ácido aspártico (SEQ ID NO:20) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma aspara- 10 gina (SEQ ID NO:32). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #54 do VH de PTA021_A2 pode ser "retromutado" de ácido aspártico em aspara- gina.

Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção. 15 Como ainda outro exemplo, para PTA021_A2, resíduo de ami- noácido #89 de VH é uma isoleucina (SEQ ID NO:20) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma treo- nina (SEQ ID NO:32). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #89 20 dentro de FR1 do VH de PTA021_A2 pode ser "retromutado" de isoleucina para treonina.

Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

Como outro exemplo, para PTA021_A3, resíduo de aminoácido #54 de VH é um ácido aspártico (SEQ ID NO:21) pelo que este resíduo na 25 sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma aspara- gina (SEQ ID NO:33). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo # 54 do VH de PTA021_A3 pode ser "retromutado" de ácido aspártico para aspa- ragina.

Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem 30 envolvidos pela invenção.

Como outro exemplo, para PTA021_A3, resíduo de aminoácido #77 de VK é uma asparagina (SEQ ID NO:24) pelo que este resíduo na se-

quência de linhagem germinativa correspondente VK L15 é uma serina (SEQ ID NO:36). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua con- figuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #77 do VK de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de asparagina para serina.

Tais anticor- 5 pos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou ainda dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopes de célula T para, desse modo, 10 reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo.

Esta aproximação é tam- bém referida como "deimunização" e é descrita em detalhe adicional na Pu- blicação de Patente dos Estados Unidos Nº 20030153043 por Carr et al.

Em adição ou alternativa às modificações feitas dentro da estru- tura ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser projetados para 15 incluírem modificações dentro da região de Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia vida de soro, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, e/ou citotoxicidade celu- lar dependente de antígeno.

Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificada (por exemplo, uma ou mais porções químicas po- 20 dem ser fixadas ao anticorpo) ou serem modificadas para alterar sua glicosi- lação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anti- corpo.

Cada uma destas modalidades é descrita em detalhe adicional abai- xo.

A numeração de resíduos na região de Fc é aquela do índice dos Esta- dos Unidos de Kabat. 25 Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 é modifica- da tal que o número de resíduos de cisteína na região de articulação é alte- rado, por exemplo, aumentado ou diminuído.

Esta aproximação é descrita adicionalmente na Patente dos Estados Unidos Nº 5.677.425 por Bodmer et al.

O número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alte- 30 rado para, por exemplo, facilitar montagem das cadeias leves e pesadas ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

Em outra modalidade, a região de articulação de Fc de um anti-

corpo é passível a mutação para diminuir a meia vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzi- das na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de articula- ção-Fc tal que o anticorpo tenha prejudicado a ligação de proteína A Staph- 5 ylococcal (SpA) relativa a ligação de SpA de domínio de articulação-Fc. Esta aproximação é descrita em detalhe adicional na Patente dos Estados Unidos Nº 6.165.745 por Ward et al. Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia vida biológica. Várias aproximações são possíveis. Por exemplo, 10 uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos Nº

6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia vida biológi- ca, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítope de ligação de receptor de salvamento tomado a partir de dois circui- 15 tos fechados de um domínio de CH2 de uma região de Fc de uma IgG, con- forme descrito nas Patente dos Estados Unidos Nº 5.869.046 e Nº 6.121.022 por Presta et al. Em outra modalidade, o anticorpo é produzido como um Uni- body, conforme descrito no WO/2007/059782 que é aqui incorporado por 20 referência em sua totalidade. Em ainda outra modalidade, a região de Fc é alterada por substi- tuição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de amino- ácido diferente para alterar a(s) função (ões) efetuadora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 25 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem uma afinidade alte- rada para um ligante efetuador, mas retém a capacidade de ligação de antí- geno do anticorpo de origem. O ligante efetuador a qual afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 de comple- 30 mento. Esta aproximação é descrita em detalhe adicional nas Patentes dos Estados Unidos Nº 5.624.821 e Nº 5.648.260, ambas por Winter et al. Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de re-

síduos de aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resí- duo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento reduzida ou abolida (CDC). Esta aproximação é descrita em detalhe adicional na Patente dos Estados 5 Unidos Nº 6.194.551 por Idusogie et al.

Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das posições do aminoácido 231 e 239 são alteradas para, desse modo, al- terar a capacidade do anticorpo se fixar ao complemento.

Esta aproximação é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et 10 al.

Em ainda outro exemplo, a região de Fc é modificada para au- mentar a capacidade do anticorpo mediar citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo para um recep- tor Fc por modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 15 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta aproximação é descrita adicio- 20 nalmente na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta.

Além disso, os locais de ligação em IgG1 humana para Fc R1, Fc RII, Fc RIII e FcRn foram ma- peados e variantes com ligação aperfeiçoada descritos (vide, Shields, R.L. et al. (2001) J.

Biol.

Chem. 276:6591-6604). As mutações específicas nas posi- ções 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas para aperfeiçoar liga- 25 ção a Fc RIII.

Adicionalmente, os seguintes mutantes de combinação foram mostrados para aperfeiçoar ligação de Fc RIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada.

Por exemplo, um anticorpo aglicosilatado pode ser produzido 30 (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno.

Tais modificações de carboidrato podem ser acompanhadas por, por exemplo,

alteração de um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anti- corpo.

Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas que resulta em eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar glicosilação naquele 5 local.

Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antíge- no.

Tal aproximação é descrita em detalhe adicional nas Patentes dos Esta- dos Unidos Nº 5.714.350 e Nº 6.350.861 por Co et al.

Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser pro- duzido que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como anticorpo hipofu- 10 cosilatado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosil ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de bisecção aumentadas.

Tais modelos de glicosi- lação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos.

Tais modificações de carboidrato podem ser acompanhadas por, por exemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maqui- 15 naria de glicosilação alterada.

As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hos- pedeiras nas quais para expressar anticorpos recombinantes da invenção para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada.

Por e- xemplo, as linhas de célula Ms704, Ms705, e Ms709 carecem de gene fuco- 20 siltransferase, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferase), tal que os anticorpos ex- pressos nas linhas de células Ms704, Ms705, e Ms709 carecem de fucose em seus carboidratos.

As linhas de células Ms704, Ms705 e Ms709 FUT8-/- foram criadas pelo rompimento alvo do gene FUT8 em células CHO/DG44 usando-se dois vetores de substituição (vide Publicação de Patente dos Es- 25 tados Unidos Nº 20040110704 por Yamane et al., e Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como outro exemplo, EP 1.176.195 por Hanai et al., descreve uma linhagem de célula com um gene FUT8 fun- cionalmente rompido, que codifica um fucosil transferase, tal que os anticor- pos expressos em tal linhagem de célula exibem hipofucosilação por redu- 30 ção ou eliminação da enzima relacionada à ligação alfa 1,6. Hanai et al., também descreve linhas de células que têm uma baixa atividade de enzima para adição de fucose à N-acetilglucosamina que se liga a região de Fc do anticorpo, ou não tem atividade de enzima, por exemplo, a linhagem de célu- la de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem de célula variante CHO, célu- las Lec13, com capacidade reduzida de fixar fucose a carboidratos articula- 5 dos a Asn (297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos ex- pressos naquela célula hospedeira (vide também Shields, R.L. et al., (2002) J.

Biol.

Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO 99/54342 por U- mana et al., descreve linhas de células projetadas para expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por exemplo, beta (1,4)-N- 10 acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que os anticorpos expressos nas linhas de célula projetadas exibem estruturas GlcNac de bisecção aumenta- da que resultam na atividade aumentada de ADCC dos anticorpos (vide também Umana et al., (1999) Nat.

Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser clivados usando-se uma en- 15 zima fucosidase.

Por exemplo, a fucosidase alfa-L-fucosidase remove resí- duos fucosil de anticorpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516- 23). Outra modificação dos anticorpos aqui que é contemplada pela invenção é peguilação.

Um anticorpo pode ser peguilatado para, por exem- 20 plo, aumentar a meia vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo.

Para peguilatar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento deste, tipicamente é regi- do com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG tornam-se fixados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Preferivelmente, a peguila- 25 ção é efetuada via uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme aqui usado, o termo "polietileno glicol" é pretendido para envolver qualquer das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol 30 ou polietileno glicol-maleimida.

Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilatado é um anticorpo aglicosilatado.

Os métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção.

Ver, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al., e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

Propriedades Físicas do Anticorpo Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente 5 caracterizados pelas várias propriedades físicas dos anticorpos anti-CADM1. Vários ensaios podem ser usados para detectar e/ou diferenciar classes dife- rentes de anticorpos baseado nestas propriedades físicas.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem conter um ou mais locais de glicosilação em região variável ou de 10 cadeia leve ou de cadeia pesada.

A presença de um ou mais locais de glico- silação na região variável pode resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma alteração do pK do anticorpo devido a ligação de antígeno alterada (Marshall et al., (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 15 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). A glicosilação tem sido conhecida por ocorrer em motivos contendo uma se- quência N-X-S/T.

A glicosilação de região variável pode ser testada usando- se um ensaio de Glycoblot, que cliva o anticorpo para produzir um Fab, e, 20 em seguida, testes para glicosilação usando-se um ensaio que mede a oxi- dação de periodato e formação de base de Schiff.

Alternativamente, a glico- silação de região variável pode ser testada usando-se cromatografia leve de Dionex (Dionex-LC), que cliva sacarídeos de um Fab em monossacarídeos e analisa o teor de sacarídeo individual.

Em alguns exemplos, é preferido ter 25 um anticorpo anti-CADM1 que não contém glicosilação de região variável.

Isto pode ser alcançado ou por seleção de anticorpos que não contém o mo- tivo de glicosilação na região variável ou por mutação de resíduos dentro do motivo de glicosilação usando-se técnicas padrões bem conhecidas na téc- nica. 30 Como um exemplo de glicosilação, para PTA021_A1, usando-se o sistema de numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido #30 (dentro do FR3) de VH é uma asparagina (SEQ ID NO:19). Este é um local de glicosila-

ção potencial e este resíduo pode ser mutado para uma glutamina.

Em uma modalidade preferida, os anticorpos da presente inven- ção não contêm locais de isomerismo de asparagina.

Um efeito de deamida- ção ou ácido isoaspártico pode ocorrer nas sequências N-G ou D-G, respec- 5 tivamente.

O efeito de deamidação ou ácido isoaspártico resulta na criação de ácido isoaspártico que diminui a estabilidade de um anticorpo pela cria- ção de uma estrutura dobrada fora de uma carbóxi terminal de cadeia lateral preferivelmente do que a cadeia principal.

A criação de ácido isoaspártico pode ser medida usando-se um ensaio iso-quant, que usa uma HPLC de 10 fase reversa para testar ácido isoaspártico.

Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico único (pI), mas geral- mente os anticorpos cairão na faixa de pH de entre 6 e 9,5. O pI para um anticorpo de IgG1 tipicamente cai dentro da faixa de pH de 7-9,5 e o pI para um anticorpo de IgG4 tipicamente cai dentro da faixa de pH de 6-8. Os anti- 15 corpos podem ter um pI que está for a desta faixa.

Embora os efeitos sejam geralmente desconhecidos, existe especulação que os anticorpos com um pI fora da faixa normal podem ter algum desdobramento e instabilidade sob condições in vivo.

O ponto isoelétrico pode ser testado usando-se um ensaio de focalização isoelétrico capilar, que cria um gradiente de pH e pode utilizar 20 focalização de laser para precisão aumentada (Janini et al (2002) Electro- phoresis 23:1605-11; Ma et al., (2001) Chromatography 53:S75-89; Hunt et al., (1998) J Chromatogr A 800:355-67). Em alguns exemplos, é preferido ter um anticorpo anti-CADM1 que contém um valor de pI que cai na faixa nor- mal.

Isto pode ser alcançado ou por seleção de anticorpos com um pI na 25 faixa normal, ou por mutação de resíduos de superfície carregada usando-se técnicas padrões bem conhecidas na técnica.

Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão que é indicativa de estabilidade térmica (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Uma estabilidade térmica mais alta indica maior 30 estabilidade total de anticorpo in vivo.

O ponto de fusão de um anticorpo po- de ser medido usando-se técnicas tal como calorimetria de escaneamento diferencial (Chen et al., (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al.,

(1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1 indica a temperatura do desdobramento inicial do anticorpo.

TM2 indica a temperatura de desdobramento completo do anticorpo.

Geralmente, é preferido que a TM1 de um anticorpo da presente invenção seja maior do que 60ºC, preferivelmente maior do que 65ºC, ainda 5 mais preferivelmente maior do que 70ºC.

Alternativamente, a estabilidade térmica de um anticorpo pode ser medida usando-se dicroísmo circular (Mur- ray et al., (2002) J.

Chromatogr Sci 40:343-9). Em uma modalidade preferida, os anticorpos são selecionados que não degradam rapidamente.

A fragmentação de um anticorpo anti- 10 CADM1 pode ser medida usando-se eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS, conforme é bem compreendido na técnica (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32). Em outra modalidade preferida, os anticorpos são selecionados que têm efeitos de degradação mínimo.

A agregação pode conduzir a dispa- 15 ro de uma resposta imune onde desejada e/ou propriedades farmacocinéti- cas alteradas ou desfavoráveis.

Geralmente, os anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, preferivelmente 20% ou menos, ainda mais preferivelmente 15% ou menos, ainda mais preferivelmente 10% ou menos, e ainda mais preferivelmente 5% ou menos.

A agregação pode ser 20 medida por várias técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo cromato- grafia líquida de alto desempenho de coluna de exclusão de tamanho (SEC) (HPLC), e leve difusão para identificar monômeros, dímeros, trímeros ou multímeros.

Métodos de Projeção de Anticorpos 25 Conforme discutido acima, os anticorpos anti-CADM1 tendo se- quências de VH e VK aqui descritas podem ser usados para criar novos anti- corpos anti-CADM1 por modificação das sequências de VH e/ou VK, ou a(s) região (ões) constante(s) fixadas a estes.

Desse modo, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti-CADM1 da in- 30 venção, por exemplo, PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3, são usadas para criar anticorpos estruturalmente relacionados anti-CADM1 que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação a CADM1 humano.

Por exemplo, uma ou regiões de CDR de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3, ou mutações destas, pode ser combinadas recombinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-CADM1 recombinantemente projeta- 5 dos, adicionais, da invenção, conforme discutido acima.

Outros tipos de mo- dificações incluem aquelas descritas na seção anterior.

O material de partida para o método de projeção é um ou mais das sequências de VH e/ou VK aqui providas, ou uma ou mais regiões de CDR destas.

Para criar o anticorpo pro- jetado, não é necessário preparar de fato (isto é, expressar como uma prote- 10 ína) um anticorpo tendo um ou mais das sequências de VH e/ou VK aqui pro- vidas, ou uma ou mais regiões de CDR destas.

Preferivelmente, a informa- ção contida na(s) sequência(s) é usada como o material de partida para criar uma "segunda geração" de sequência(s) derivada da(s) sequência(s) original (is) e, em seguida, a "segunda geração" de sequência(s) é preparada e ex- 15 pressa como uma proteína.

Consequentemente, em outra modalidade, a invenção propor- ciona um método para preparação de um anticorpo anti-CADM1 compreen- dendo: provisão de: (i) uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDR1 selecionada a par- 20 tir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:4, 5, e 6, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:7, 8, e 9; e/ou (ii) uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir 25 do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:13, 14, e 15, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:16, 17, e 18; alteração de pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada e/ou a 30 sequência de anticorpo da região variável de cadeia leve para criar pelo me- nos uma sequência de anticorpo alterada; e expressão da sequência de an- ticorpo alterada como uma proteína.

Técnicas de biologia molecular padrões podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada.

Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alteradas é um que retém uma, algumas ou todas as propriedades 5 funcionais dos anticorpos anti-CADM1 aqui descritos, cujas propriedades funcionais incluem, mas não são limitadas a: ligação de um CADM1 humano com uma KD de 1x10-7 M ou menos; se liga a células CHO humanas trans- fectadas com CADM1. As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser 10 avaliadas usando-se ensaios padrões disponíveis na técnica e/ou aqui des- critas, tais como aqueles colocados nos Exemplos (por exemplo, citometria de fluxo, ensaios de ligação). Em certas modalidades dos métodos de projeção de anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ou seletiva- 15 mente ao longo de todo ou parte de uma sequência de codificação de anti- corpo anti-CADM1 e o anticorpo modificado anti-CADM1 resultante pode ser classificado para atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme aqui descritas.

Métodos mutacionais foram descritos na técnica.

Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos 20 para criação e classificação de mutações de anticorpo usando-se mutagêne- se de saturação, conjunto de ligação sintética, ou uma combinação destes.

Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 por Lazar et al., descre- ve métodos de uso de métodos de classificação computacional para otimizar as propriedades fisioquímicas dos anticorpos. 25 Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos da Invenção Outro aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucle- ico que codificam os anticorpos da invenção.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisato de célula, ou em uma for- ma parcialmente purificada ou substancialmente pura.

Um ácido nucleico é 30 "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado fora dos ou- tros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrões, incluindo tra-

tamento alcalino/SDS, bandagem de CsCl, cromatografia de coluna, eletrofo- rese de gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica.

Vide, F.

Ausub- el, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publi- shing and Wiley Interscience, New York.

Um ácido nucleico da invenção po- 5 de ser, por exemplo, DNA ou RNA, e pode ou não pode conter sequências intrônicas.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é uma sequência de cDNA.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando-se técnicas de biologia molecular padrões.

Para anticorpos expressos por hibri- 10 domas (por exemplo, hibridomas preparados de camundongos transgênicos transportando genes de imunoglobulina humana conforme descrito adicio- nalmente abaixo), cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anti- corpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA.

Para anticorpos obtidos de uma 15 biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando-se técnicas de descrição de fago), os ácidos nucleicos que codificam o anticorpo podem ser recuperados a partir da biblioteca.

As moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são a- quelas que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos monoclonais 20 PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3. As sequências de DNA que codi- ficam as sequências de VH de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 25, 26, e 27, respectivamente.

As sequências de DNA que codificam as sequências de VK de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 28, 29, e 30, respectivamente. 25 Outros ácidos nucleicos preferidos da invenção são ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência, com uma das sequências mostrada em SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, e 30, cujos ácidos nucleicos codificam 30 um anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno deste.

A porcentagem de identidade entre duas sequência de ácido nu- cleico é o número de posições na sequência em que o nucleotídeo é idênti-

co, levando-se em conta o número de folgas e o comprimento de cada folga, que necessita ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências.

A comparação de sequências e determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser acompanhadas usando-se um algoritmo 5 matemático, tal como o algoritmo de Meyers e Miller ou o programa XBLAST de Altschul descrito acima.

Ainda adicionalmente, os ácidos nucleicos preferidos da inven- ção compreendem uma ou mais porções que codificam CDR das sequências de ácido nucleico mostradas em SEQ ID NOs:25, 26, 27, 28, 29, e 30. Nesta 10 modalidade, o ácido nucleico pode codificar a sequência de cadeia pesada CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3, ou a sequência de cadeia leve CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3. Os ácidos nucleicos que têm pelo menos 80%, tais como pelo 15 menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência, com tal porção que codifica CDR de SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 (sequências de VH e VK) são tam- bém ácidos nucleicos preferidos da invenção.

Tais ácidos nucleicos podem diferir da porção correspondente de SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 20 em uma região de codificação de não CDR e/ou em uma região de codifica- ção de CDR.

Onde a diferença está em uma região de codificação de CDR, a região de CDR de ácido nucleico codificada pelo ácido nucleico tipicamen- te compreende uma ou mais modificação de sequência conservativa con- forme definido aqui comparada a sequência de CDR correspondente de 25 PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3. Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam segmentos de VH e VK são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de DNA recombinantes padrões, por exemplo, pa- ra converter os genes de região variável a genes de cadeia de anticorpo de 30 comprimento total, a genes de fragmento Fab ou a um gene scFv.

Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VK- ou VH é operativa- mente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um articulador flexível.

O termo "ope- rativamente ligado", conforme usado neste contexto, é pretendido significar que os dois fragmentos de DNA são unidos tal que as sequências de amino- ácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem dentro da es- 5 trutura.

O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido a um gene de cadeia pesada de comprimento total por ligação operativamente do DNA que codifica VH para outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes 10 humanos de região constante de cadeia pesada são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, E.

A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Im- munological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242) e os fragmentos de DNA envolvendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrões.

A região 15 constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas, mais preferivelmente é uma região constante de IgG1 ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifica somente a região constante CH1 de cadeia pesada. 20 O DNA isolado que codifica a região VL/VK pode ser convertido a um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de ca- deia leve Fab) por ligação operativamente de DNA que codifica VL para outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL.

As se- quências de genes humanos de região constante de cadeia leve são conhe- 25 cidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, E.

A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242) e os fragmentos de DNA envolvendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR pa- drão.

Em modalidades preferidas, a região constante de cadeia leve pode 30 ser uma região constante capa ou lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH- e VL/VK são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligador flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácido (Gly4 - Ser)3, tal que as sequências de VH e VL/VK podem ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões de VL/VK e VH unidas pelo ligador flexível (vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423- 5 426; Huston et al. (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85:5879-5883; McCaf- ferty et al., (1990) Nature 348:552-554). Produção de Anticorpos Monoclonais Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de an- 10 ticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora os procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para produção de anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. 15 O sistema de animal preferido para preparação de hibridomas é o sistema de murino.

A produção de hibridoma no camundongo é um proce- dimento muito bem estabelecido.

Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica.

Coparticipantes de fusão (por exemplo, células de mieloma de muri- 20 no) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados baseados na sequência de um anticorpo monoclonal não humano preparada conforme descrito acima.

O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido do hibridoma não 25 humano de interesse e projetado para conter sequências de imunoglobulina de não murino (por exemplo, humana) usando-se técnicas de biologia mole- cular padrões.

Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, regiões vari- áveis de murino podem ser articuladas às regiões constantes humanas u- sando-se métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente dos 30 Estados Unidos Nº 4.816.567 para Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, regiões de CDR de murino podem ser inseridas em uma estru- tura humana usando-se métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo,

Patente dos Estados Unidos Nº 5.225.539 para Winter, e Patentes dos Esta- dos Unidos Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.). Em uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção são 5 anticorpos monoclonais humanos.

Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra CADM1 podem ser gerados usando-se camundongos transgênicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imune humano preferivelmente do que o sistema do camundongo.

Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos 10 referidos aqui como camundongos das cepas HuMAb Mice® e KM Mice®, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como "camundongos Ig humanos". A cepa HuMAb Mice® (Medarex®, Inc.) contém gene de imuno- globulina humana miniloci que codifica sequências de imunoglobulina de 15 cadeia pesada e leve não rearranjadas ( e ) e , juntas com mutações al- vos que inativam a cadeia endógena e loci (vide, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camun- dongos exibem expressão reduzida de camundongo IgM ou , e em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos 20 suportam comutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGk humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), su- pra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern.

Rev.

Immunol. 13: 65- 93, e Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann.

N.Y.

Acad.

Sci. 764:536-546). 25 A preparação e uso do HuMAb Mice®, e as modificações genômicas trans- portadas por tais camundongos, é adicionalmente descrito em Taylor, L. et al. (1992) Acids nucleics Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) In- ternational Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, 30 J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J.

Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteú-

dos de todos os quais são especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Vide, adicionalmente, Patentes dos Estados Unidos Nos.

5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397;

5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; 5 Patente dos Estados Unidos Nº 5.545.807 para Surani et al.; Publicações PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT Nº WO 01/14424 para Korman et al. Em outra modalidade, os anticorpos humanos da invenção po- 10 dem ser produzidos usando-se um camundongo que transporta sequências de imunoglobulina humana nos transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Este camundongo é referido aqui como um camundongo da cepa "KM Mice®", e é descrito em detalhe na 15 Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al. Ainda adicionalmente, sistemas transgênicos de animal alterna- tivos que expressam genes de imunoglobulina humana são disponíveis na técnica e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-CADM1 da in- venção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o 20 Xenomice (Amgen, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.939.598; 6.075.181;

6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati et al. Além disso, sistemas de animal transcromossômicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana são disponíveis na técnica 25 e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-CADM1 da invenção. Por exemplo, camundongos que transportam ambos transcromossomos de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humanos, referidos como "TC camundongos" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722- 30 727. Além disso, vacas transportando transcromossomos de cadeia pesada e leve humanos foram descritos na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Bio- technology 20:889-894) e Pedido PCT Nº WO/2002/092812, e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-CADM1 da invenção. Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem tam- bém ser preparados usando-se métodos de descrição de fago para classifi- cação de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de 5 descrição de fago para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Vide, por exemplo: Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.223.409;

5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et al.; Patente dos Estados Unidos Nos.

5.427.908 e 5.580.717 para Dower et al.; Patentes dos Estados Unidos Nos.

5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; e Patentes dos Estados Uni- 10 dos Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths et al. Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem tam- bém ser preparados usando-se camundongos SCID nos quais células imu- nes humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpo huma- 15 no ser gerada após imunização. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson et al. Imunização de Camundongos de Ig Humanos Quando camundongos de Ig humanos são usados para produzir 20 os anticorpos humanos da invenção, tais camundongos podem ser imuniza- dos com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno de CADM1 e/ou CADM1 recombinante, ou células que expressam CADM1, ou uma pro- teína de fusão de CADM1, conforme descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 25 14: 845-851; e Publicações PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. Preferivel- mente, os camundongos terão 6-16 semanas de idade após a primeira infu- são. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50 µg) de antígeno de CADM1 pode ser usada para imunizar os camundongos de IgG humanos intraperitonealmente. 30 Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos a CADM1 são descritos no Exemplo 1 abaixo. A experi- ência cumulativa com vários antígenos tem mostrado que os camundongos transgênicos respondem quando inicialmente imunizados intraperitoneal- mente (IP) com antígeno em adjuvante completo de Freund, seguido por imunizações IP toda semana seguinte (até um total de 6) com antígeno em adjuvante incompleto de Freund.

Contudo, adjuvantes outros do que de Fre- 5 und são também verificados serem efetivos.

Em adição, células inteiras na ausência de adjuvante são verificadas serem altamente imunogênicas.

A resposta imune pode ser monitorada sobre o curso do protocolo de imuniza- ção com amostras de plasma sendo obtidas por sangrias retro-orbitais.

O plasma pode ser classificado por ELISA (conforme descrito abaixo), e ca- 10 mundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti- CADM1 podem ser usados para fusões.

Os camundongos podem ser agru- pados intravenosamente com antígeno 3 dias antes de sacrifício e remoção do baço.

É esperado que 2-3 fusões para cada imunização pode necessitar de ser realizada.

Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imunizados 15 para cada antígeno.

Em uma modalidade, cepas de camundongo suportan- do cepas transgenes de cadeia pesada humanas HCo7, HCo12 ou HCo17 podem usadas.

Alternativamente ou adicionalmente, as cepas KM Mice® podem ser usadas.

Em adição, duas ou mais destas cepas podem ser gera- das juntas em um camundongo simples tendo uma pluralidade de transge- 20 nes de cadeia pesada humanos diferentes.

Geração de Hibridomas de Produção de Anticorpos Monoclonais Humanos Para gerar hibridomas de produção de anticorpos monoclonais humanos da invenção, células de nodo de esplenócitos e/ou linfa de camun- dongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem de célula 25 imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula de mieloma de camundongo.

Os hibridomas resultantes podem ser classificados para a produção de anticorpos específicos de antígeno.

Por exemplo, suspensões de célula simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados po- dem ser fundidas a um sexto o número de células de mieloma de camun- 30 dongo não secretantes P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50% PEG.

Alternativamente, a suspensão de célula simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados pode ser fundida usando-se um campo elétrico baseado em método de eletrofusão, usando-se um eletroporador de fusão de célula de câmara grande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Bur- nie Maryland). As células são colocadas em aproximadamente 2 x 105 em placa de microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas 5 semanas em meio seletivo contendo 20% de soro de Clone fetal, 18% de meio condicionado "653", 5% de origem (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de genta- micina e 1X HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Após 10 aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio em que o HAT é substituído com HT.

As cavidades individuais podem, em seguida, serem classificadas por ELISA para IgM humana monoclonal e an- ticorpos de IgG.

Uma vez que crescimento extensivo do hibridoma ocorre, o meio pode ser observado usualmente após 10-14 dias.

Os hibridomas de 15 secreção de anticorpo podem ser recolocados, classificados novamente, e se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por limitação da diluição.

Os subclones estáveis podem, em seguida, serem cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização. 20 Para purificar anticorpos monoclonais humanos, hibridomas po- dem ser crescidos em frascos de centrifugação de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal.

Os sobrenadantes podem ser filtrados e concen- trados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Phar- macia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por gel eletrofore- 25 se e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza.

A solução tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser de- terminada por OD280 usando-se coeficiente de extinção 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80 ˚C.

Geração de Transfectomas de Produção de Anticorpos Monoclonais 30 Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando-se, por exemplo, uma combi- nação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene conforme é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo destes, os DNAs que codificam cadeias pesada e leve de compri- 5 mento parcial ou total, podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrões (por exemplo, amplificação de PCR ou clonagem de cDNA usando- se um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão tal que os genes são operativamente articulados às sequências de controle transcricional e translacional.

Neste 10 contexto, o termo "operativamente ligado" é pretendido para significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que sequências de controle transcricional e translacional dentro do vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e translação do gene de anticorpo.

O vetor de ex- pressão e sequência de controle de expressão são escolhidos para serem 15 compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada.

O gene de anti- corpo de cadeia leve e o gene de anticorpo de cadeia pesada podem ser inseridos no vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inse- ridos no mesmo vetor de expressão.

Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padrões (por exemplo, ligação de locais de 20 restrição complementar no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou liga- ção terminal enfraquecida se nenhum local de restrição está presente). A região variável de cadeia pesada e leve dos anticorpos aqui descritos pode ser usada para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo por inserção dos mesmos nos vetores de expressão já 25 que codifica cadeia pesada constante e região constante de cadeia leve do isotipo desejado tal que o segmento de VH é operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor e o segmento de VK é operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor.

Adicionalmente ou alternativa- mente, o vetor de expressão recombinante e pode codificar um peptídeo de 30 sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedei- ra.

O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptí- deo de sinal é ligado na estrutura interna ao amino-terminal do gene de ca-

deia de anticorpo.

O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de i- munoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína de não imunoglobulina). Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de ex- 5 pressão recombinantes da invenção transportam sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira.

O termo "sequência regulatória" é pretendido para incluir promo- tores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por e- xemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação 10 dos genes de cadeia de anticorpo.

Tais sequências regulatórias são descri- tas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology.

Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, in- cluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de fatores tais 15 como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expres- são de proteína desejado, etc.

Sequências regulatórias preferidas para ex- pressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que di- recionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), 20 Vírus de Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor posterior de adenovírus maior (AdMLP) e polioma.

Alternativamente, sequências regula- tórias não virais podem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitin ou promotor de β-globin.

Ainda adicionalmente, os elementos regulatórios com- postos de sequências de fontes diferentes, tal como o sistema promotor de 25 SR , que contém sequências a partir do promotor posterior SV40 e a repeti- ção de terminal longo de vírus de leucemia de célula T humana tipo 1 (Take- be, Y. et al. (1988) Mol.

Cell.

Biol. 8:466-472). Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e sequências regu- latórias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem trans- 30 portar sequências adicionais, tais como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e ge- nes marcadores selecionáveis.

O gene marcador selecionável facilita a sele-

ção de células hospedeiras em que o vetor tenha sido introduzido (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 e

5.179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou 5 metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzi- do. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene di- hidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418). Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor (es) de 10 expressão (ões) que codifica(m) as cadeias pesada e leve é/são transfecta- do(s) em uma célula hospedeira por técnicas padrões. As várias formas do termo "transfecção" são pretendidas para envolverem uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, 15 precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextran e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e, mais preferivelmente, células hospedeiras de mamífero, é as mais preferidas porque tais células eucarióticas, e, em parti- 20 cular, células de mamífero, são mais plausíveis do que células procarióticas para se reunirem e secretarem um anticorpo corretamente dobrado e imuno- logicamente ativo. Os genes de expressão de anticorpo procarióticos foram reportados serem inefetivos para produção de altos rendimentos de anticor- po ativo (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). 25 As célula hospedeiras de mamífero preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindo células dhfr- CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito 30 em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma de NSO, células de COS e células de SP2. Em particular, para uso com células de mieloma de NOS, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de gene de GS descrito em WO 87/04462 (para Wil- son), WO 89/01036 (para Bebbington) e EP 338.841 (para Bebbington). Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anti- corpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, os anticorpos 5 são produzidos por cultura das células hospedeiras por um período de tem- po suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recupera- dos a partir do meio de cultura usando-se métodos de purificação de proteí- 10 na padrões. Caracterização de Ligação de Anticorpo à Antígeno Os anticorpos da invenção podem ser testados para ligação a CADM1 por, por exemplo, ELISA padrão. Brevemente, as placas de microti- tulação são revestidas com CADM1 purificado a 0,25 g/ml em PBS, e, em 15 seguida, bloqueados com 5% de albumina de soro bovino em PBS. As dilui- ções de anticorpo (por exemplo, diluições de plasma de CADM1- camundongos imunizados) são adicionados a cada poço e incubados por 1- 2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e, em seguida, in- cubadas com reagente secundário (por exemplo, para anticorpos humanos, 20 um reagente policlonal específico de Fc de IgG de cabra-anti-humano) con- jugado a fosfatase alcalina por 1 hora a 37°C. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml), e analisadas a OD de 405-

650. Preferivelmente, os camundongos que desenvolvem as titulações mais altas serão usados para fusões. 25 Um ensaio de ELISA, conforme descrito acima, pode também ser usado para classificar hibridomas que mostram reatividade positiva com imunogênio de CADM1. Os hibridomas que se ligam com alta avidez a CADM1 são subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de ca- da hibridoma, que retém a reatividade das células de origem (por ELISA), 30 pode ser escolhido para produção de um banco de célula de 5-10 frascos armazenado a -140°C, e para purificação de anticorpo. Para purificar anticorpos anti-CADM1, os hibridomas seleciona-

dos podem ser cultivados em frascos de centrifugação de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal.

Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A- sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). A IgG eluída pode ser verificada por 5 gel eletroforese e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza.

A solução tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando-se coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais de anti-CADM1 10 selecionados se ligam a epítopes únicos, cada anticorpo pode ser biotinila- tado usando-se reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). Estudos para competição para ligação com os anticorpos da invenção usan- do-se anticorpos monoclonais não etiquetados e anticorpos monoclonais biotinilatados podem ser realizados usando-se placas de ELISA revestidas 15 com CADM1, conforme descrito acima.

A ligação de mAb biotinilatado pode ser detectada com uma sonda de strep-avidin-fosfatase alcalina.

Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ELISAs de isotipo podem ser realizados usando-se reagentes específicos para anticor- pos de um isotipo particular.

Por exemplo, para determinar o isotipo de um 20 anticorpo monoclonal humano, as cavidades das placas de microtitulação podem ser revestidas com 1 g/ml de imunoglobulina anti-humana durante a noite a 4°C.

Após bloqueio com 1% de BSA, as placas são reagidas com 1 g/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste, ou purificadas com controles de isotipo, à temperatura ambiente por uma a duas horas.

Os po- 25 ços podem ser, em seguida, reagidos com sondas conjugadas de ou IgG1 humana ou de fosfatase alcalina específica de IgM humano.

As placas são desenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.

Os IgGs humanos anti-CADM1 podem ser adicionalmente testa- dos para reatividade com antígeno de CADM1 por Western Blotting.

Breve- 30 mente, CADM1 pode ser preparado e submetido a gel de eletroforese de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida.

Após eletroforese, os antígenos se- parados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com

10% de soro de bezerro fetal, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados.

A ligação de IgG humana pode ser detectada usando-se fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem.

Co., St.

Louis, Mo.). 5 A especificidade de ligação de um anticorpo da invenção pode também ser determinada por monitoramento da ligação do anticorpo a célu- las que expressam CADM1, por exemplo, por citometria de fluxo.

Tipicamen- te, uma linhagem de célula, tal como uma linhagem de célula de CHO, pode ser transfectada com um vetor de expressão que codifica uma forma de 10 transmembrana de CADM1. Em algumas modalidades, uma molécula de CADM1 de comprimento total com uma etiqueta amino-terminal HA (SEQ ID NO:43) é expressa na superfície da célula da linhagem de célula de CHO.

A proteína transfectada pode compreender uma etiqueta, tal como um etique- ta-myc, preferivelmente no N-terminal, para detecção usando-se um anticor- 15 po para a etiqueta.

A ligação de um anticorpo da invenção a CADM1 pode ser determinada por incubação das células transfectadas com o anticorpo, e detecção de anticorpo ligado.

A ligação de um anticorpo à etiqueta na prote- ína transfectada pode ser usada como um controle positivo.

A especificidade de um anticorpo da invenção para CADM1 po- 20 de ser adicionalmente estudada por determinação se ou não o anticorpo se liga a outras proteínas, tais como TSLL2/CADM1C ou outros membros da superfamília de imunoglobulina usando-se os mesmos métodos pelos quais ligação á CADM1 é determinada.

Conjugados de Molécula de Anticorpo Parceiro 25 Em um aspecto preferido, é provido um conjugado compreen- dendo um anticorpo anti-CADM1 de acordo com esta invenção e uma molé- cula co-participante, o conjugado sendo representado pela fórmula (a) Z[(XZ) aC (XD) bD]m (a) onde 30 Z é um anticorpo de acordo com esta invenção; D é uma molé- cula coparticipante; e (XZ) aC (XD)b são coletivamente referidos como uma "porção ligadora " ou "ligadr" porque eles articulam os primeiros dois ele-

mentos.

Dentro do ligador, C é um grupo clivável designado para ser clivado no local de ação biológica pretendido da molécula coparticipante D; XZ e XD são referidos como porções espaçadoras (ou "espaçadores") porque eles espaçam à parte Z e C e C e D, respectivamente; subscritos de a e b são 5 independentemente 0 ou 1 (isto é, a presença de XZ e/ou XD é opcional); e subscrito m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 (preferivelmente 1, 2, 3, ou 4). Cada um dos termos precedentes é mais totalmente definido aqui abaixo.

O anticorpo Z serve como uma função alvo: por ligação a um te- cido ou célula alvo onde seu antígeno está localizado, ele dirige o conjugado 10 ali.

Preferivelmente, o tecido ou célula alvo é um tumor ou uma célula de câncer e o antígeno é um antígeno associado a tumor ou específico de tu- mor.

A clivagem do grupo C no tecido ou célula alvo libera a molécula par- ceira D para realizar sua função biológica pretendida.

Em alguns exemplos, o conjugado é internalizado em uma célula alvo por endocitose e clivagem 15 ocorre dentro da célula alvo.

Dessa maneira, distribuição precisa da molécu- la coparticipante D é alcançada no local de ação, reduzindo a dosagem ne- cessária.

Também, a molécula coparticipante D é normalmente biologica- mente inativa (ou significantemente menos ativa) em seu estado conjugado, reduzindo, desse modo, a toxicidade indesejada contra tecidos ou células de 20 não alvos.

Como fármacos anticâncer são frequentemente compostos alta- mente tóxicos com um baixo índice terapêutico, esta é uma consideração importante.

Conforme refletido pelo subscrito m, cada molécula de anticorpo Z pode conjugar com mais do que uma molécula parceira D, dependendo do 25 número de locais que o primeiro tem disponível para conjugação e as condi- ções experimentais empregadas.

Aqueles versados na técnica apreciarão que enquanto cada molécula de anticorpo Z é conjugada a um número intei- ro de moléculas parceiras D, uma preparação do conjugado pode analisar uma proporção não inteira de moléculas parceiras D para anticorpo Z, refle- 30 tindo uma média estatística.

Anticorpo Z Qualquer um de vários grupos reativos diferentes no anticorpo Z pode ser usado como um local de conjugação, incluindo grupos -amino em resíduos de lisina, porções de carboidrato pendentes, grupos de ácido car- boxílico, grupos de dissulfeto, e grupos tiol.

Cada tipo de grupo reativo re- presenta uma marca tendo algumas vantagens.

Mas algumas limitações. 5 Para revisões nos grupos reativos de anticorpo adequados para conjugação, vide, por exemplo, Garnett, Adv.

Fármaco Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 e Dubowchik e Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123, a descrição dos quais são aqui incorporados por referência.

Em uma modalidade, o anticorpo Z é conjugado via um grupo de 10 lisina -amino.

Mais anticorpos têm grupos de lisina -amino expostos múlti- plos, que podem ser conjugados via ligações de amida, ureia, tioureia, ou carbamato usando-se técnicas conhecidas na técnica, incluindo modificação com um agente heterobifuncional (conforme adicionalmente aqui descrito abaixo). Contudo, é difícil controlar qual e quantos grupos -amino reagem, 15 conduzindo a variabilidade potencial de batelada-a-batelada em preparações de conjugado.

Também, a conjugação pode causar neutralização de um grupo -amino protonado importante para manutenção da conformação nati- va do anticorpo, ou pode ocorrer em uma lisina perto do ou no local de liga- ção de antígeno, nem sendo uma ocorrência desejável. 20 Em outra modalidade, o anticorpo Z pode ser conjugado via uma cadeia lateral de carboidrato, visto que muitos anticorpos são glicosilatados.

A cadeia lateral de carboidrato pode ser oxidada com periodato para gerar grupos aldeído que, por sua vez, podem ser reagidos com aminas para for- mar um grupo imina, tais como em uma semicarbazona, oxima, ou hidrazo- 25 na.

Se desejado, o grupo imina pode ser reduzido com cianoboro-hidreto de sódio para produzir uma ligação mais estável.

Para descrições adicionais na conjugação, via cadeia lateral de carboidratos, vide, por exemplo, Rodwell et al., Proc.

Nat’l Acad.

Sci.

USA 83, 2632-2636 (1986); a descrição do qual é aqui incorporada por referência.

Como tal, com grupos de lisina -amino e- 30 xistem mais interesse com relação a localização do(s) local (is) de conjuga- ção e estequiometria.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo Z pode ser conjugado,

via um grupo de ácido carboxílico.

Em uma modalidade, um grupo de ácido carboxílico terminal é funcionalizado para gerar uma carbo-hidrazida, que é, em seguida, reagida com uma porção de conjugação de suporte de aldeído.

Vide, Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153. 5 Em ainda outra modalidade, o anticorpo Z pode ser conjugado, via um grupo de dissulfeto que liga em ponte o enxofre de um resíduo de cisteína no anticorpo Z e um enxofre na outra porção do conjugado.

Alguns anticorpos (tal como o isotipo de IgG) carecem de grupos tiol livres, mas têm grupos de dissulfeto, por exemplo, na região de articulação.

Em tal caso, 10 grupos tiol livres podem ser gerados por redução de grupos de dissulfeto nativos.

Os grupos tiol assim gerados podem, em seguida, ser usados para conjugação.

Vide, por exemplo, Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548- 3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); e Doronina et al., Natu- re Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003); as descrições dos quais são aqui in- 15 corporados por referência.

Novamente, existem interesses relacionados à localização da conjugação e estequiometria e o possível rompimento de con- formação nativa de anticorpo.

Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo Z é conjugado, via o produto de adição nucleofílico de um grupo tiol a uma porção aceitado- 20 ra.

Uma porção aceitadora preferida é um grupo de maleimida, cuja reação com um grupo tiol de anticorpo é ilustrada abaixo:

Um número de métodos foi desenvolvido para introduzir grupos tiol livres em anticorpos sem quebra de fontes de dissulfeto nativas, cujos métodos podem ser praticados com um anticorpo Z desta invenção.

Depen- 25 dendo do método empregado, pode ser possível introduzir um número prog- nosticável de sulfidris livres em localizações específicas.

Em uma aproxima- ção, anticorpos que sofreram mutação são preparados em que uma cisteína é substituída por outro aminoácido.

Vide, por exemplo, Eigenbrot et al., US 2007/0092940 A1; Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Ur-

novitz et al., US 4.698.420 (1987); Stimmel et al., J.

Biol.

Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7.311.902 B2 (2007); Kuan et al., J.

Bi- ol.

Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J.

Biol.

Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995). Em outra aproximação, uma cisteína extra é adicionada 5 ao C-terminal.

Vide, por exemplo, Cumber et al., J.

Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); e Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004). Um método preferido para introdução de cisteínas livres é aquele 10 ensinado por King, no Pedido Provisório dos Estados Unidos Nº de Série 60/957.271, depositado em 22 de agosto de 2007, em que uma sequência de aminoácido suportando cisteína é adicionada ao C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo.

Este método introduz um número conhecido de resíduos de cisteína (um por cadeia pesada) em uma localização conhecida 15 remota do local de ligação de antígeno.

As descrições dos documentos cita- dos neste parágrafo são todas aqui incorporadas por referência.

Em outra modalidade, os grupos de lisina -amino podem ser modificados com reagentes heterobifuncionais tal como 2-iminotiolana ou N- succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), convertendo um grupo - 20 amino em um grupo tiol ou dissulfeto - criando um substituto de cisteína.

Contudo, este método sofre das mesmas limitações de localização de conju- gação e estequiometria associadas com grupos -amino corretos.

Molécula Parceira D A molécula parceira D pode ser um agente terapêutico ou um 25 marcador.

Se o primeiro, pode ser, por exemplo, uma citotoxina, um fármaco não citotóxico (por exemplo, um imunosupressor), um agente radioativo, ou- tro anticorpo, ou uma enzima ou fragmento ativo desta, tais como abrin, ricin A, pseudomonas exotoxin, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor ou interferon-γ; ou, modificadores de resposta biológica 30 tais como, por exemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito ("GM-CSF"), fator de estimulação de colônia de granulócito ("G-

CSF"), ou outros fatores de crescimento.

Se o último, ele pode ser qualquer porção que gera um sinal detectável, tal como uma radioetiqueta, uma eti- queta fluorescente, ou uma enzima que catalisa uma modificação detectável a um substrato.

Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjuga- 5 dos a anticorpos para uso diagnosticamente ou terapeuticamente incluem, mas não são limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. O método para preparação de radioimunconjugados são estabelecidos na técnica.

Exem- plos de radioimunoconjugados são comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), e mé- 10 todos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados u- sando-se os anticorpos da invenção.

Uma citotoxina ou agente citotóxico incluem qualquer agente que é prejudicial a (por exemplo, mata) células.

Exemplos incluem taxol, co- tochalasin B, gramicidin D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposi- 15 de, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicin, daunorubicin, di-hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, 1-de-hidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes.

Onde molécula parceira D é um agente terapêutico, classes a- 20 dequadas de agentes terapêuticos incluem antimetabólitos, agentes de al- quilatação, ligantes de ranhura menor de DNA, intercaladores de DNA, reti- culadores de DNA, inibidores de histona deacetilase, inibidores de exporta- ção nuclear, inibidores de proteasome, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores de proteína de choque de calor, inibidores de tirosina quinase, an- 25 tibióticos, e agentes antimitóticos.

Exemplos de agentes terapêuticos ade- quados incluem actinomicina D, antraciclinas, antramicina (AMC), auristatin, bleomicina, busulfan, calicheamicina, camptotecina, carmustina, clorambucil, cis-diclorodiamina platina (II) (DDP), cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citochalasin B, dactinomicina, daunorubicin, decarbazina, 1-de- 30 hidrotestosterona, dibromomanitol, di-hidroxiantracindiona, doxorubicina, emetina, epotilona, brometo de etídio, etoposide, 5-fluorouracil, gemcitabina, glucocorticoides, gramicidin D, imatinib, irinotecan, -lapachona, lidocaína,

lomustina, maitansina, mecloretamina, melpalan, 6-mercaptopurina, metotre- xato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, paclitaxel, procaína, propra- nolol, puromicina, ricin, estreptozotocin, ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA), talisomicina, tenoposide, tetracaina, tioepa, 6-tioguanina, tubulisin, 5 vinblastina, vincristina, e análogos, homólogos ou derivados destes.

Preferivelmente, molécula parceira D é uma citotoxina selecio- nada a partir do grupo consistindo de auristatinas (especialmente MMAE e MMAF), antibióticos ienediona (especialmente calicheamicin e CalichDMH), doxorubicin, maitansinoides (especialmente DM1 e DM4), Pseudomonas 10 exotoxin A (especialmente sua forma truncada), alquiladores de ligação de ranhura menor de DNA (especialmente CC-1065 e análogos de duocarmici- na), e análogos ou derivados destes.

Um exemplo de um conjugado de anti- corpo de calicheamicina é comercialmente disponível (Mylotarg®; American Home Produtos). Aqueles versados na técnica apreciarão que as citotoxinas 15 precedentes são produtos muito mais naturais e que alguma modificação destes - isto é, derivatização - pode ser desejável ou necessário para torná- los prontos para conjugação.

Alquilador de ligação de ranhura menor de DNA preferido é um análogo ou um derivado de CC-1065 e as duocarmicinas estruturalmente relacionadas, exemplos adequados dos quais são revelados em Ng et al., US 7.087.600 B2 (2006); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., US 7.129.261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317 A1 (2006); Chen et al., US 2006/0004081 A1 (2006); Gangwar et al., US 2006/0247295 A1 (2006); Boyd et al., WO 2007/038658 A2 (2007); Gangwar et al., WO 2007/051081 A1 (2007); Gangwar et al., WO 2007/059404 A2 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); e Chen et al., Pedido PCT Nº PCT/US2008/054362, depositado em 20 de fevereiro de 2008; as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.

Tais moléculas parceiras D preferidas podem ser representadas pela fórmula (b):

(b)

no qual o sistema de anel A é um arila substituída ou não substituída, um heteroarila substituída ou não substituída, um grupo heterocicloalquila substituída ou não substituída, tal como fenila ou pirrol; 5 E G são independentemente H, alquila substituída ou não substi- tuída, heteroalquila substituída ou não substituída, um heteroátomo, ou uma ligação simples, ou E G são unidos para formar um sistema de anel selecio- nado de arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída e heterocicloalquila substituída ou não substituída; 10 X é O, S ou NR23, onde R23 é a H, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, ou acila; R3 é (=O) ou OH; R4, R4’, R5 e R5’ são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída 15 ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, halogê- nio, NO2, NR15R16, NC (O)R15, OC (=O)NR15R16, OC (=O)OR15, C(=O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, ou O (CH2) nN (CH3)2, onde n é um inteiro de 1 a 20, ou qualquer par adjacente de R4, R4’, R5 e R5’, junto com os átomos de car- bono aos quais eles são fixados, são unidos para formar uma cicloalquila 20 substituída ou não substituída ou sistema de anel de heterocicloalquila tendo de 4 a 6 membros; R15 e R16 são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituído, heteroarila substituída ou não substituída, heterocicloalquila 25 substituída ou não substituída, ou peptidila substituída ou não substituída, onde R15 e R16 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são fixados são opcionalmente unidos para formar um sistema de anel de heterocicloal- quila substituída ou não substituída tendo de 4 a 6 membros, opcionalmente contendo dois ou mais heteroátomos; R6 é uma ligação simples que está ou presente ou ausente; R7 é CH2-X1 ou -CH2-, com a condição que quando R6 está pre- sente, R6 e R7 são unidos para formar um anel ciclopropila; 5 E X1 é um grupo de saída tal como Cl, Br, F, mesolato, ou tosila- to.

Uma molécula parceira de fórmula (b) pode ser conjugada via um de R3, R4, R4’, R5, e R5’, preferivelmente via R3 (quando R3 é OH) ou R4, mais preferivelmente via R4. Também, R3 pode conduzir uma porção de pro- 10 fármaco, conforme discutido aqui abaixo.

Uma molécula parceira preferida de fórmula (b) é representada pela fórmula (c):

(c)

no qual R3, R4, R4’, R5, R5’, R6, e R7 são conforme definidos aqui acima; 15 Z é O, NH, ou N (alquila inferior); e R1, R1’, R2, e R2’ são inde- pendentemente H, alquila inferior substituída ou não substituída, ciano, alcó- xi, halogênio, C(=O)R8, ou CO2R8, no qual R8 é NR9R10 ou OR9, no qual R9 e R10 são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, ou he- teroalquila substituída ou não substituída. 20 Uma modalidade mais preferida é mostrada na fórmula (d):

(d)

no qual X1 é conforme anteriormente definido e X2 é

,

, , ou

. Um exemplo de uma molécula parceira D específica é represen- tado pela fórmula (e):

(e)

Onde a molécula parceira D é uma citotoxina, ela pode ser pro- vida de profármaco, isto é, ter fixado a mesma uma porção de profármaco 5 cuja remoção é requerida para ativá-la.

Preferivelmente, o grupo de profár- maco (1) é removido por um mecanismo de reação diferente daquela para clivagem da citotoxina a partir do conjugado, (2) não é removido ou é so- mente vagarosamente removido enquanto o conjugado está em circulação no plasma do sangue, mas (3) é eficientemente removido no tecido ou célula 10 alvo.

Consequentemente, se o conjugado é casualmente clivado antes de alcançar o tecido ou célula alvo, a citotoxina é liberada em sua forma de pro- fármaco ainda inativa, eliminando ou reduzindo citotoxicidade a tecidos ou células não alvos.

Isto é, o requerimento para uma segunda clivagem para ativar a citotoxina proporciona um fator seguro.

No exemplo de uma citotoxi- 15 na de acordo com as fórmulas (b), (c), (d) ou (e), um local preferido para fi- xação de um grupo de profármaco está na posição etiquetada com um "4". Para aumentar o fator de segurança onde a clivagem do grupo C e remoção da porção de profármaco são ambas mediadas por enzimas, é preferível que enzimas diferentes sejam envolvidas.

Exemplos não limitativos de grupos de profármacos incluem és- teres, carbamatos, fosfatos e glicosídeos.

Para ilustrar, a hidroxila de posi- ção 4 nas citotoxinas de fórmulas ((b)-(e) pode ser providacom profármaco 5 com as seguintes porções de profármaco:

ou seus sais

A molécula parceira D pode também ser um marcador.

O mar- cador pode ser qualquer etiqueta que gera um sinal detectável, tal como uma radioetiqueta, uma etiqueta fluorescente, ou uma enzima que catalisa uma modificação detectável um substrato.

Marcadores (também denomina- 10 dos grupos repórteres ou etiquetas detectáveis) são bem conhecidos na á- rea de imunoensaios, pesquisa biomédica, e diagnose médica, e podem ser detectados por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imuno- químicos, elétricos, óticos ou químicos.

O marcador é preferivelmente um isótopo radioativo, um agente fluorescente ou quimioluminescente ou pre- 15 cursor destes, um cromóforo, uma enzima, ou combinações destes.

Exem- plos de enzimas adequadas são peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase, e glicose oxidase.

Agentes fluorescentes incluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbelli- ferona, etc.

Compostos quimioluminescentes incluem luciferin e 2,3-di- 20 hidroftalazinadionas tal como luminol.

Ligador -(XZ)aC(XD)b- Conforme notado acima, a porção articuladora de um conjugado desta invenção compreende até três elementos: um grupo clivável C e espa- çadores opcionais XZ e XD. 25 O grupo clivável C é selecionado de forma tal que ele seja relati-

vamente estável, enquanto o conjugado está na circulação geral do plasma do sangue é prontamente clivado uma vez que o conjugado alcança seu lo- cal de ação pretendido.

Preferivelmente, o conjugado é internalizado por en- docitose por uma célula alvo sob ligação do anticorpo Z a um antígeno des- 5 crito na superfície da célula alvo.

Subsequentemente, a clivagem do grupo C ocorre em um corpo vesicular da célula alvo (um endossomo precoce, um endossomo posterior, ou, especialmente, uma lisosima). Em uma modalidade, o grupo C é um grupo sensível ao pH.

O pH no plasma sanguíneo está levemente acima de neutro, enquanto o pH 10 dentro do lisossomo é acídico, cerca de 5. Desse modo, um grupo C cuja clivagem é catalisada ácida clivará a uma taxa várias ordens de grandeza mais rápida dentro de um lisossomo do que na taxa do plasma sanguíneo.

Exemplos de grupos sensíveis a ácido adequados incluem cis-aconitila ami- das e hidrazonas, conforme descrito em Shen et al., US 4.631.190 (1986); 15 Shen et al., US 5.144.011 (1992); Shen et al., Biochem.

Biophys.

Res.

Commun. 102, 1048-1054 (1981) e Yang et al., Proc.

Natl Acad.

Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988); as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.

Em outra modalidade, o grupo C é um dissulfeto.

Os dissulfetos 20 podem ser clivados por um mecanismo de troca de tiol-dissulfeto, a uma ta- xa dependente da concentração de tiol ambiente.

A medida que a concen- tração intracelular de glutationa e outros tióis é mais alta do que suas con- centrações de soros, a taxa de clivagem de um dissulfeto será mais alta in- tracelularmente.

Adicionalmente, a taxa de troca de tiol-dissulfeto pode ser 25 modulada pelo ajuste das características estéricas e eletrônicas do dissulfeto (por exemplo, um alquil-aril dissulfeto versus um alquil-alquil dissulfeto; subs- tituição no anel arila, etc.), capacitando o desenho de articulações de dissul- feto que têm estabilidade intensificada de soro ou uma taxa de clivagem par- ticular.

Para descrições adicionais relacionadas a grupo dissulfeto cliváveis 30 em conjugados, vide, por exemplo, Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 2005/0287155 A1 (2005); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317

A1 (2006); e Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); as descrições das quais são aqui incorporadas por referência.

Um grupo C preferido compreende uma ligação de peptídeo que é clivada preferencialmente por uma protease no local de ação pretendido, 5 conforme oposto a por uma protease no soro.

Tipicamente, o grupo C com- preende de 1 a 20 aminoácidos, preferivelmente de 1 a 6 aminoácidos, mais preferivelmente de 1 a 3 aminoácidos.

O(s) aminoácido(s) pode(m) ser - aminoácidos naturais e/ou não naturais.

Os aminoácidos naturais são aque- les codificados pelo código genético, bem como aminoácidos derivados des- 10 tes, por exemplo, hidroxiprolina, -carboxiglutamato, citrulina, e O- fosfoserina.

O termo aminoácido também inclui análogos de aminoácido e miméticos.

Os análogos são compostos tendo a mesma estrutura geral H2N(R)CHCO2H de um aminoácido natural, exceto que o grupo R não é um encontrado entre os aminoácidos naturais.

Exemplos de análogos incluem 15 homoserina, norleucina, metionina-sulfóxido, e metionina metil sulfônio.

Um aminoácido mimético é um composto que tem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um -aminoácido, mas funciona em uma maneira similar a um.

O termo "aminoácido não natural" é pretendido representar a forma estereoquímica "D", os aminoácidos naturais sendo da forma "L". 20 Preferivelmente, o grupo C contém uma sequência de aminoáci- do que é uma sequência de reconhecimento de clivagem para uma protea- se.

Muitas sequências de reconhecimento de clivagem são conhecidas na técnica.

Vide, por exemplo, Matayoshi et al.

Science 247: 954 (1990); Dunn et al.

Meth.

Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al.

Meth.

Enzymol. 244: 175 25 (1994); Thornberry, Meth.

Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al.

Meth.

Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al.

Meth.

Enzymol. 244: 412 (1994); e Bouvier et al.

Meth.

Enzymol. 248: 614 (1995); as descrições das quais são aqui incorporadas por referência.

Para conjugados que não são pretendidos para serem internali- 30 zados por uma célula, um grupo C pode ser escolhido tal que ele é clivado por uma protease presente na matriz extracelular na vizinhança do tecido alvo, por exemplo, uma protease liberada por células de corante mais próxi-

mas ou uma protease associada a tumor.

Proteases associadas a tumor ex- tracelulares exemplares são timet oligopeptidase (TOP) e CD10. Para conjugados que são designados para ser internalizados por uma célula, o grupo C preferivelmente compreende uma sequência de ami- 5 noácido selecionada para clivagem por uma protease endossomal ou lisos- somal, especialmente a última.

Exemplos não limitativos de tais proteases incluem catepsinas B, C, D, H, L e S, especialmente catepsina B.

A catepsi- na B preferencialmente cliva peptídeos a uma sequência -AA2-AA1- onde AA1 é um aminoácido de ligação de hidrogênio fortemente ou básico (tal co- 10 mo lisina, arginina, ou citrulina) e AA2 é um aminoácido hidrofóbico (tal como fenilalanina, valina, alanina, leucina, ou isoleucina), por exemplo, Val-Cit (onde Cit denota citrulina), ou Val-Lys. (Aqui, sequências de aminoácido são escritas na direção N-para-C, como em H2N-AA2-AA1-CO2H, a menos que o contexto indique claramente de outro modo). Para informação adicional com 15 relação a grupo de catepsina clivável, vide, Dubowchik et al., Biorg.

Med.

Chem.

Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg.

Med.

Chem.

Lett., 8 3347-3352 (1998); e Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855- 869 (2002); as descrições dos quais são incorporadas por referência.

Em uma modalidade, o Grupo C é um peptídeo compreendendo 20 as duas sequências de aminoácido -AA2-AA1- no qual AA1 é lisina, arginina, ou citrulina, e AA2 é fenilalanina, valina, alanina, leucina ou isoleucina.

Em outra modalidade, C consiste de uma sequência de um a cinco aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO:45), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, 25 Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, e Glu.

A preparação e desenho dos grupos cliváveis C compreendendo um aminoácido simples é adicionalmente discutida em Chen et al., Pedido PCT Nº PCT/US2008/054362, depositado em 20 de fevereiro de 2008, a descrição dos quais é aqui incorporada por referência. 30 O grupo C pode também ser um grupo fotoclivável, por exemplo, um nitrobenzil éter que é clivado sob exposição à luz.

O grupo C pode ser ligado diretamente ao anticorpo Z ou molé-

cula parceira D; isto é, espaçadores XZ e XD, conforme o caso pode ser, po- de estar ausente.

Por exemplo, se o grupo C é um dissulfeto, um dos dois enxofres pode ser um resíduo de cisteína ou seu substituto no anticorpo Z.

Ou, o grupo C pode ser uma hidrazona ligada a um aldeído em uma cadeia 5 lateral de carboidrato.

Ou, o grupo C pode ser uma ligação de peptídeo for- mada com um grupo de lisina -amino do anticorpo Z.

Quando presente, o espaçador XZ proporciona separação espa- cial entre o grupo C e o anticorpo Z, a fim de que o primeiro não interfira es- tericamente com a ligação de antígeno pelo último, ou o último interfira este- 10 ricamente com a clivagem do primeiro.

Adicionalmente, o espaçador XZ pode ser usado para conferir solubilidade aumentada ou propriedades de agrega- ção diminuídas aos conjugados.

Um espaçador XZ pode compreender um ou mais segmentos modulares que podem ser unidos em qualquer número de combinações.

Exemplos de segmentos adequados para um espaçador XZ 15 são:

, , ,e

, onde o subscrito r é 1 a 24, preferivelmente 2 a 4. Estes segmentos podem ser combinados para produzir espaçadores XZ tais como:

ou

. O espaçador XD, se presente, proporciona separação espacial entre o grupo C e a molécula parceira D, a fim de que o último não interfira 20 estericamente ou eletronicamente com a clivagem do primeiro.

O espaçador XD também pode servir para introduzir massa molecular adicional e funciona- lidade química em um conjugado.

Geralmente, a massa adicional e funciona- lidade afetarão a meia vida do soro e outras propriedades do conjugado.

Desse modo, através de seleção judiciosa dos grupos de espaçadores, a 25 meia-vida do soro de um conjugado pode ser modulada.

O espaçador XD também pode ser unido dos segmentos modulares, conforme descrito acima no contexto do espaçador XZ.

Qualquer espaçador XZ ou XD, ou ambos, podem compreender uma porção de autoimolação.

Brevemente, uma porção de autoimolação é uma porção que (1) é ligada ao grupo C e ou ao anticorpo Z ou à molécula 5 parceira D, e (2) tem uma estrutura tal que a clivagem do grupo C inicia uma sequência de reação que resulta na porção de autoimolação para própria não ligação do anticorpo Z ou molécula parceira D, conforme o caso pode ser.

Em outras palavras, uma reação no local distal do anticorpo Z ou molé- cula parceira D (clivagem do grupo C) faz com que a ligação XZ-Z ou XD-D 10 se rompa também.

A presença de uma porção de autoimolação é desejável no caso do espaçador XD porque, se, após clivagem do conjugado, o espa- çador XD ou uma porção deste permanecem fixados à molécula parceira D, a atividade biológica da última pode ser prejudicada.

O uso de uma porção de autoimolação é especialmente preferido onde o grupo clivável C é um 15 olipeptídeo.

Porções de autoimolação (i)-(v) ligadas a um grupo hidroxila ou amino em uma molécula parceira D são mostradas abaixo:

Em cada exemplo, a porção de autoimolação é a estrutura entre linhas tracejadas a e b, com características estruturais adjacentes mostradas para proporcionar o contexto.

As porções de autoimolação (i) e (v) são liga- das a uma molécula parceira D-NH2 (isto é, molécula parceira D é conjugada via um grupo amino), enquanto porções de autoimolação (ii), (iii), e (iv) são ligadas a uma molécula parceira D-OH (isto é, molécula parceira D é conju- 5 gada via um grupo hidroxila). A clivagem da ligação amida na linha tracejada b (isto é, o grupo C é a peptídeo) libera o nitrogênio amida como um nitrogê- nio amina, iniciando uma sequência de reação que resulta na clivagem da ligação na linha tracejada a, e a consequente liberação da molécula parceira D-OH ou D-NH2, conforme o caso pode ser.

Para descrições adicionais com 10 relação a porções de autoimolação, vide, Carl et al., J.

Med.

Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharma- cology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6.214.345 B1 (2001); Toki et al., J.

Org.

Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Na- ture Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., WO 15 2005/112919 (2005); Boyd et al., WO 2007/038658 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); Feng, US 7.375.078 B2 (2008); e Senter et al., US 2003/0096743 A1 (2003); as descrições dos quais são incorporadas por re- ferência.

Exemplos de Conjugados 20 Exemplos de conjugados produzidos com um anticorpo Z(SH)m desta invenção (onde m é 1, 2, 3, 4, ou 5) são mostrados abaixo.

Os conju- gados A-1 a A-6 e A-8 a A-15 são conjugados em que o grupo clivável C compreende uma ligação de peptídeo.

Os conjugados A-7 e A-16 são conju- gados em que o grupo clivável C é uma hidrazona.

Os conjugados A-17 e 25 A-18 são conjugados em que o grupo clivável C é um dissulfeto.

Nos conju- gados A-1 a A-2, A-5 a A-9, A-11 a A-14, e A-16, a molécula parceira D é uma citotoxina tendo uma porção de profármaco fixada a esta.

Os conjuga- dos A-10, A-11, A-14, e A-15 são conjugados tendo uma porção de autoimo- lação (duas no caso de conjugado A-10). Os conjugados A-1 a A-8 e A-10 a 30 A-18 ilustram o uso de espaçadores tendo segmentos modulares.

Onde presente nas fórmulas precedentes, Hal é Cl ou Br e R30 é o grupo de profármaco de carboxiesterase-clivável carbamato mostrado a- baixo:

. Preparação de Conjugados 5 Os conjugados desta invenção preferivelmente são preparados primeiro por união de molécula parceira D e ligador (XZ) aC (XD)b para formar uma porção D-(XZ) aC (XD) b-R31, onde R31 é um grupo funcional para reação com um grupo funcional no anticorpo Z, para formar o conjugado.

Exemplos de grupos adequados R21 incluem:

, , , , , ,

, ,e , 10 onde

R32 é Cl, Br, F, mesilato, ou tosilato, e R33 é Cl, Br, I, F, OH, -O-N-succinimidil, -O-(4-nitrofenil), -O-pentafluorofenil, ou -O-tetrafluorofenil.

A preparação de porções adequadas D-(XZ) aC (XD) b-R31 é revelada em Ng et al., US 7.087.600 B2 (2006); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., 5 US 7.129.261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317 A1 (2006); Chen et al., US 2006/0004081 A1 (2006); Gang- war et al., US 2006/0247295 A1 (2006); Boyd et al., WO 2007/038658 A2 (2007); Gangwar et al., WO 2007/051081 A1 (2007); Gangwar et al., WO 2007/059404 A2 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); e Chen et 10 al., Pedido PCT Nº PCT/US2008/054362, depositado em 20 de fevereiro de 2008; as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.

Em uma modalidade preferida (fórmula M), R31 é um grupo ma- leimida e o grupo funcional no anticorpo Z é um grupo tiol conforme ilustrado em seguida, usando-se conjugado A-2 onde Hal é Cl e anticorpo Z(SH)m:

15 Fórmula M O seguinte é um procedimento ilustrativo, baseado na introdução de grupos tiol livres em um anticorpo pela reação de seus grupos de lisina - amino com 2-iminotiolano, seguido por reação com uma porção articulador-

fármaco D-(XZ) aC (XD) b-R31, onde R31 é maleimida.

Inicialmente o anticorpo é tampão trocado em 0,1 M de tampão de fosfato (pH 8,0) contendo 50 mM de NaCl e 2 mM de DTPA e concentrado a 5-10 mg/mL.

A tiolação é alcan- çada através da adição de 2-iminotiolano ao anticorpo.

A quantidade de 2- 5 iminotiolano a ser adicionada pode ser determinada por um experimento pre- liminar e varia de anticorpo para anticorpo.

No experimento preliminar, uma titulação de quantidades aumentadas de 2-iminotiolano é adicionada ao anti- corpo, e seguindo incubação com o anticorpo por 1 hora à temperatura am- biente, o anticorpo é desalgado em 50 mM de tampão de HEPES pH 6,0 10 HEPES usando-se uma coluna de Sephadex G-25 e o número de grupos tiol introduzidos determinado rapidamente por reação com ditiodipiridina (DTDP). A reação de grupos tiol com DTDP resulta na liberação de tiopiridi- na, que pode ser monitorada espectroscopicamente a 324 nm.

AS amostras a uma concentração de proteína de 0,5-1,0 mg/mL são tipicamente usadas. 15 A absorvência a 280 nm pode ser usada para determinar precisamente a concentração de proteína nas amostras, e, em seguida, uma alíquota de ca- da amostra (0,9 mL) é incubada com 0,1 mL de DTDP (5 mM de solução de estoque em etanol) por 10 minutos à temperatura ambiente.

Amostras vazias de tampão somente mais DTDP são também incubadas.

Após 10 minutos, a 20 absorvência a 324 nm é medida e o número de grupos tiol é quantificado usando-se um coeficiente de extinção para tiopiridina de 19.800 M-1. Tipicamente um nível de tiolação de três grupos tiol por anticor- po é desejado neste procedimento.

Por exemplo, com alguns anticorpos isto pode ser alcançado pela adição de um excesso 15 vezes de 2-iminotiolano, 25 seguido por incubação à temperatura ambiente por 1 hora.

O anticorpo é, em seguida, incubado com 2-iminotiolano na proporção molar desejado e, em seguida, desalgado em tampão de conjugação (50 mM pH 6,0 de tam- pão HEPES contendo 5 mM de glicina e 2 mM de DTPA). O material tiolata- do é mantido em gelo, enquanto o número de tióis introduzido é quantificado 30 conforme descrito acima.

Após verificação do número de tióis introduzidos, a porção de fármaco-articulador D-(XZ)aC(XD)b-R31 é adicionada a um excesso molar de 3 vezes por tiol. A reação de conjugação é permitida proceder em tampão de conjugação também contendo uma concentração final de 5% de dimetilsul- fóxido (DMSO), ou solvente alternativo similar. Comumente, a solução de estoque de fármaco-articulador é dissolvida em 100% de DMSO. A solução 5 de estoque é adicionada diretamente ao anticorpo tiolatado, que tem bastan- te DMSO adicionado para trazer a concentração final a 10%, ou pré-diluído em tampão de conjugação contendo uma concentração final de 10% de DMSO, seguido por adição a um volume igual de anticorpo tiolatado. A mistura de reação de conjugação é incubada à temperatura 10 ambiente por 2 horas com agitação. Em seguida à incubação, a mistura de reação de conjugação é centrifugada e filtrada através de filtro de 0,2 m. A purificação do conjugado pode ser alcançada através de cromatografia u- sando-se um número de métodos. Em um método, o conjugado é purificado usando-se cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna Sephacryl 15 S200 pré-equilibrada com 50 mM pH 7,2 de tampão HEPES contendo 5 mM de glicina e 50 mM de NaCl. A cromatografia é efetuada a uma taxa de fluxo linear de 28 cm/h. As frações contendo conjugado são coletadas, reunidas e concentradas. Em um método alternativo, purificação pode ser alcançada através de cromatografia de troca de íon. As condições variam de anticorpo 20 para anticorpo e devem ser otimizadas em cada caso. Por exemplo, a mistu- ra de reação de conjugado de anticorpo-fármaco é aplicada a uma coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em 50 mM pH 5,5 de HEPES contendo 5mM de glicina,. O anticorpo conjugado é eluído usando-se um gradiente de 0-1 M de NaCl em tampão de equilíbrio a pH 5,5. Frações relevantes contendo o 25 conjugado são reunidas e dialisadas contra tampão de formulação (50 mM pH 7,2 de tampão HEPES contendo 5 mM de glicina e 100 mM de NaCl). Aqueles versados na técnica compreenderão que as condições acima descritas e metodologia são exemplares e não limitativas e que outras aproximações para conjugação de anticorpos são conhecidas na técnica e 30 utilizáveis na presente invenção.

ADEPT Em outra modalidade, um anticorpo de acordo com esta inven-

ção é conjugado a uma enzima para uso em terapia de prófármaco de enzi- ma direcionada de anticorpo (ADEPT). Na ADEPT, uma enzima é guiada a um local de tumor pelo anticorpo ao qual ela é conjugada.

Aqui, a enzima age em um prófármaco subsequentemente administrado para liberar local- 5 mente o fármaco ativo correspondente.

Vide, por exemplo, Melton et al., J.

Natl Cancer Inst. 88(3/4), 153-165 (1996). Enzimas exemplares que podem ser conjugadas para uso em ADEPT incluem carboxipeptidase A e G2, fosfa- tase alcalina, -glucuronidase, -lactamase, -glucosidase, penicilina amida- se, aminopeptidase, citosina deaminase, e nitroreductase. 10 Devido a ADEPT não requerer a liberação da enzima a partir do anticorpo, a presença de um grupo clivável entre o anticorpo e a enzima não é mandatária.

Desse modo, um conjugado de ADEPT pode ser representado pela fórmula (f) Z-X-D (f) 15 onde Z é um anticorpo desta invenção; D é uma enzima, e X é um articulador que liga Z e D.

Imunoconjugados Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são refe- 20 ridas como "imunotoxinas". As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção usando-se tecnologia de articulador disponível na técnica.

Exemplos de tipos de articuladores que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anti- corpo incluem, mas não são limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, arti- 25 culadores contendo dissulfetos e peptídeo.

Um articulador pode ser escolhi- do, isto é, por exemplo, susceptível a clivagem por baixo pH dentro do com- partimento lisossomal ou susceptível a clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecido de tumor, tal como catep- sinas (por exemplo, catepsinas B, C, D). 30 Moléculas Biespecíficas Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-CADM1, ou um fragmento deste, da invenção.

Um anticorpo da invenção, ou porção de ligação de an- tígenos deste, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a 5 pelo menos dois locais de ligação diferentes ou moléculas alvos.

O anticorpo da invenção pode, de fato, ser derivatizado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais do que dois locais de ligação diferentes e/ou moléculas alvos; tais moléculas multiespecíficas são também pretendidas para serem envolvidas 10 pelo termo "molécula biespecífica" conforme aqui usado.

Para criar uma mo- lécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcio- nalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente, ou de outro modo) a uma ou mais outras molécu- las de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou 15 mimético de ligação, tal que uma molécula biespecífica resulta.

Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas bies- pecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de liga- ção para CADM1 e uma segunda especificidade de ligação para um segun- do epítope alvo.

Em uma modalidade particular da invenção, o segundo epí- 20 tope alvo é um receptor de Fc, por exemplo, FcγRI humano (CD64) ou um receptor de Fc humano (CD89). Portanto, a invenção inclui moléculas bies- pecíficas capazes de se ligarem a ambas FcγR ou Fc R que expressam cé- lulas efetuadoras (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polomor- fonucleares (PMNs)), e a células alvo que expressam CADM1. Estas molé- 25 culas biespecíficas alvo de CADM1 que expressam células a célula efetua- dora e disparam atividades de célula efetuadora mediada por receptor, tais como fagocitose de CADM1 que expressa células, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citoquina, ou gera- ção de ânion de superóxido. 30 Em uma modalidade da invenção em que a molécula biespecífi- ca é multiespecífica, a molécula pode adicionalmente incluir uma terceira especificidade de ligação, em adição a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CADM1. Em uma modalidade, a tercei- ra especificidade de ligação é uma porção de fator de anti-intensificação (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e, desse modo, aumenta a resposta imune 5 contra a célula alvo.

A "porção de fator de anti-intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou a ligante que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor, e, desse modo, resulta em uma intensificação do efeito dos determinantes de ligação para o receptor de Fc ou antígeno de célula alvo.

A "porção de fator de anti- 10 intensificação" pode se ligar a um receptor Fc ou a um antígeno de célula alvo.

Alternativamente, a porção de fator de anti-intensificação pode se ligar a uma entidade que seja diferente da entidade a qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam.

Por exemplo, a porção de fator de anti- intensificação pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, via CD2, 15 CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou a outra célula imune que resulta em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo). Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticor- po, ou um fragmento de anticorpo deste, incluindo, por exemplo, um Fab, 20 Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb ou um Fv de cadeia simples.

O anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo deste tal como um Fv ou um construto de cadeia simples conforme descrito na Patente dos Estados Unidos Nº 4.946.778 para Ladner et al., os conteúdos da qual é expressamente incorporado por referência. 25 Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um recep- tor de Fc é provida por um anticorpo monoclonal, a ligação da qual não é bloqueada por imunoglobulina humana G (IgG). Conforme aqui usado, o termo "receptor de IgG" se refere a qualquer dos oito genes de cadeia-γ lo- calizados no cromossomo 1. Estes genes codificam um total de doze isofor- 30 mas de transmembrana ou de receptor solúvel que são agrupados em três classes de receptor de Fcγ: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32), e FcγRIII (CD16). Em uma modalidade preferida, o receptor de Fc é um FcγRI de alta afinida-

de humana.

O FcγRI humano é uma molécula de 72 kDa, que mostra alta afinidade para IgG monomérica (108 - 109 M-1). A produção e caracterização de certos anti-Fc anticorpos mo- noclonais preferidos são descritas na Publicação PCT WO 88/00052 e na 5 Patente dos Estados Unidos Nº 4.954.617 para Fanger et al., os ensinamen- tos dos quais são totalmente incorporados por referência aqui.

Estes anti- corpos se ligam a um epítope de FcγRI, FcγRII ou FcγRIII em um local que é distinto do local de ligação de Fcγ do receptor e, desse modo, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG.

Anticorpos 10 anti-FcγRI específicos úteis nesta invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O mAb 32 de produção de hibridoma é disponível a par- tir de American Type Culture Collection, ATCC Nº de Acesso HB9469. Em outras modalidades, o anticorpo de receptor de anti-Fcγ é uma forma huma- nizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do 15 anticorpo H22 é descrita em Graziano, R.F. et al. (1995) J.

Immunol 155 (10): 4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332 para Tempest et al.

A li- nhagem de célula de produção de anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection sob a designação HA022CL1, e tem o nº de acesso CRL 11177. 20 Em ainda outras modalidades preferidas, a especificidade de li- gação para um receptor de Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, por exemplo, um receptor de Fc-alfa (FcαRI (CD89)), a ligação do qual não é preferivelmente bloqueada por imunoglobu- lina A humana (IgA). O termo "receptor de IgA" é pretendido para incluir o 25 produto de gene de um α-gene (FcαRI) localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido para codificar várias isoformas de transmembrana alterna- tivamente divididas de 55 a 110 kDa.

FcαRI (CD89) é constitutivamente ex- presso nos monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de célula não efetuadora.

FcαRI tem afinidade de 30 meio (≈ 5 × 107 M-1) para ambas IgA1 e IgA2, que é aumentada sob exposi- ção a citoquinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos de FcαRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcαRI fora do domínio de ligação de ligante de IgA, foram descritos (Mon- teiro, R.C. et al. (1992) J.

Immunol. 148:1764). FcαRI e FcγRI são receptores disparadores preferidos para uso 5 nas moléculas biespecíficas da invenção porque eles são (1) expressos principalmente em células efetuadoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em altos níveis (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocotose); e (4) apresentação de antígenos intensifi- 10 cados mediados, incluindo autoantígenos, alvejados para os mesmos.#p.78 Enquanto os anticorpos monoclonais humanos são preferidos, outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais de murino, quiméricos e humaniza- dos. 15 As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por conjugação das especifidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação de anti-FcR e anti-CADM1, usando- se métodos conhecidos na técnica.

Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, em se- 20 guida, conjugada a uma outra.

Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de reticulação pode ser usada para conjugação covalente.

Exemplos de agen- tes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil- tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o- 25 fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J.

Exp.

Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins.

Mitt.

Nº 30 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, e Glennie et al. (1987) J.

Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford,

IL). Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles po- dem ser conjugados via ligação de sulfidril das regiões de articulação C- terminais das duas cadeia pesadas. Em uma modalidade particularmente 5 preferida, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidril, preferivelmente um, antes da conjugação. Alternativamente, ambas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e unidas na mesma célula hospe- deira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é um 10 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x proteína de fusão de Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compre- 15 ender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para prepa- ração de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Números 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405;

5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858, todas das quais são expressamente aqui incorporadas por referência. 20 A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à en- zima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), Análise de FACS, bioensaio (por e- xemplo, inibição de crescimento), ou ensaio de Mancha de Western. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteí- 25 na-anticorpo de interesse particular pelo emprego de um reagente etiqueta- do (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usando-se, por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e especificamente se liga aos complexos de anticorpo-FcR. Alter- 30 nativamente, os complexos podem ser detectados usando-se qualquer de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente etiquetado e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide,

por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Tra- ining Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que é incorporado por referência aqui). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como o uso de um contador , ou um con- 5 tador de cintilação, ou por autoradiografia Fragmentos de Anticorpos e Miméticos de Anticorpo A presente invenção não é limitada a anticorpos tradicionais, e pode ser praticada através do uso de fragmentos de anticorpo e miméticos de anticorpo.

Conforme detalhado abaixo, uma ampla variedade de tecnolo- 10 gias de fragmento de anticorpo e mimético de anticorpo foi agora desenvol- vida, e são amplamente conhecidas na técnica.

Enquanto um número destas tecnologias, tais como anticorpos de domínio, Nanocorpos, e UniCorpos, faz uso de fragmentos de, ou outras modificações a, estruturas tradicionais de anticorpo, existem também tecnologias alternativas, tais como Afficorpos, 15 DARPins, Anticalins, Avímeros, e Versacorpos que empregam estruturas de ligação que, enquanto elas imitam a ligação de anticorpo tradicional, são geradas de e funcionam via mecanismos distintos.

Os Anticorpos de Domínio (dAbs) são as menores unidades de ligação funcional de anticorpos, correspondente às regiões variáveis de ou 20 as cadeias pesada (VH) ou leve (VL) de anticorpos humanos.

Os Anticorpos de Domínio têm um peso molecular de aproximadamente 13 kDa.

Domantis desenvolveu uma série de bibliotecas grandes e altamente funcionais de VH e VL dAbs humanos totais (mais do que dez bilhões de sequências diferen- tes em cada biblioteca), e usam estas bibliotecas para selecionar dAbs que 25 são específicos para alvos terapêuticos.

Em contraste a muitos anticorpos convencionais, Anticorpos de Domínio são bem expressos em sistemas de célula bacterial, de levedura, e de mamífero.

Detalhes adicionais de anticor- pos de domínio e métodos de produção destes podem ser obtidos por refe- rência às Patentes dos Estados Unidos 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 30 6.172.197; 6.696.245; Nº de Série dos Estados Unidos 2004/0110941; Pedi- do de patente europeu Nº 1433846 e Patentes Européias 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821,

WO04/003019 e WO03/002609, cada um do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Nanocorpos são proteínas terapêuticas derivadas de anticorpo que contêm as propriedades estruturais únicas e funcionais de anticorpos de 5 cadeia pesada que ocorrem naturalmente.

Estes anticorpos de cadeia pesa- da contêm um domínio variável simples (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Importantemente, o domínio de VHH clonado e isolado é um polipeptídeo perfeitamente estável que abriga a capacidade de ligação de antígeno total do anticorpo de cadeia pesada original.

Os nanocorpos têm 10 uma alta homologia com os domínios VH de anticorpos humanos, e podem ser adicionalmente humanizados sem qualquer perda de atividade.

Impor- tantemente, os Nanocorpos têm um baixo potencial imunogênico, que foi confirmado nos estudos primários com compostos de condução de Nano- corpo. 15 Os nanocorpos combinam as vantagens de anticorpos conven- cionais com características importantes de fármacos de molécula pequena.

Os nanocorpos mostram alta especificidade alvo, alta afinidade para seu alvo e baixa toxicidade inerente.

Contudo, similar a fármacos de molécula pequena eles podem inibir enzimas e prontamente acessar clivagens de re- 20 ceptor.

Além disso, os Nanocorpos são extremamente estáveis, podem ser administrados por meios outros do que injeção (vide, por exemplo, WO 04/041867, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade) e são fáceis de produzir.

Outras vantagens dos Nanocorpos incluem o reconheci- mento incomum ou oculto de epítopes como um resultado de seu pequeno 25 tamanho, ligação em cavidades ou locais ativos de alvos de proteína com alta afinidade e seletividade devido a sua flexibilidade de formato de fármaco única 3-dimensional, proporcionando meia vida e facilidade e velocidade de descoberta de fármaco.

Os Nanocorpos são codificados por genes simples e são eficien- 30 temente produzidos em quase todos os hospedeiros procarióticos e eucarió- ticos, por exemplo, E. coli (vide, por exemplo, US 6.765.087, que é aqui in- corporada por referência em sua totalidade), moldes (por exemplo, Aspergil-

lus ou Trichoderma) e levedura (por exemplo, Saccharomyces, Kluyveromy- ces, Hansenula ou Pichia) (vide, por exemplo, US 6.838.254, que é aqui in- corporada por referência em sua totalidade). O processo de produção é es- calável e quantidades de multi-kilograma de Nanocorpos foram produzidas. 5 Devido aos Nanocorpos exibirem uma estabilidade superior comparada com anticorpos convencionais, eles podem ser formulados como uma solução de armazenamento longo e pronta para uso.

O método de Nanoclone (vide, por exemplo, WO 06/079372, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade) é um método proprietá- 10 rio para geração de Nanocorpos contra um alvo desejado, baseado na sele- ção de alta produção automática de células-B, e pode ser usado no contexto da presente invenção.

UniCorpos são outras tecnologias de fragmento de anticorpo; contudo, esta tecnologia é baseada na remoção da região de articulação de 15 anticorpos de IgG4. A anulação da região de articulação resulta em uma mo- lécula que é essencialmente metade do tamanho de anticorpos de IgG4 tra- dicionais e tem uma região de ligação univalente preferivelmente do que a região de ligação bivalente de anticorpos de IgG4. É também bem conhecido que os anticorpos de IgG4 são inertes e, desse modo, não interagem com o 20 sistema imune, que pode ser vantajoso para o tratamento de doenças onde uma resposta imune não é desejada, e esta vantagem é passada nos Uni- Corpos.

Por exemplo, os UniCorpos pode funcionar para inibirem ou silenci- ar, mas não matar, as células as quais eles são ligados.

Adicionalmente, a ligação do UniCorpo às células de câncer não as estimulam a prolife- 25 rar.

Além disso, devido aos UniCorpos serem cerca de metade do tamanho dos anticorpos de IgG4 tradicionais, eles podem mostrar melhor distribuição sobre tumores sólidos maiores com eficácia potencialmente maior.

Os Uni- Corpos são retirados do corpo a uma taxa similar aos anticorpos de IgG4 inteiros, e são capazes de se ligarem com uma afinidade similar a seus antí- 30 genos como anticorpos totais.

Detalhes adicionais de UniCorpos podem ser obtidos por referência a patente WO2007/059782, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

As moléculas de Afficorpo representam uma nova classe de pro- teínas de afinidade baseadas em um domínio de proteína de 58 resíduos de aminoácido, derivado de um dos domínios de ligação de IgG de proteína A staphylococcal.

Estes três domínios de feixe de espiral foram usados como 5 um suporte para a construção de bibliotecas de fagemid combinatóriacombi- natórias, das quais variantes de Afficorpo que têm como alvo as moléculas desejadas podem ser selecionadas usando-se tecnologia de descrição de fago (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Proteínas de ligação selecionadas de bibliotecas combinatóriais de um do- 10 mínio de receptor bacterial de -espiral, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Imunoglobulina A humana (IgA)-ligantes específicos de projeto combinatórial de proteína A, Eur J Bio- chem 2002;269:2647-55.). A estrutura simples, robusta das moléculas de Afficorpo em combinação com seu baixo peso molecular (6 kDa), as tornam 15 adequadas para uma ampla variedade de aplicações, por exemplo, reagen- tes de detecção (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construção e ca- racterização de quimeras de afficorpo-Fc produzidas em Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) e para inibir interações de receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 20 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combi- natórial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Detalhes adicionais de Afficorpos e métodos de produção destes podem ser obtidos por referên- cia a Patente dos Estados Unidos 5831012 que é aqui incorporada por refe- rência em sua totalidade. 25 Afficorpos Etiquetados podem também serem úteis em aplica- ções de imagem para determinação de abundância de Isoformas.

DARPins (Proteínas de Repetição de Ankyrin Designadas) são um exemplo de uma tecnologia de mimético de anticorpo DRP (Proteína de Repetição Designada) que foi desenvolvida para explorar as capacidades de 30 ligação de polipeptídeos de não anticorpo.

As proteínas de repetição tais como ankyrin ou proteínas de repetição ricas em leucina, são moléculas de ligação ubíquas, que ocorrem, diferente de anticorpos, intra- e extracelular-

mente.

Duas unidades estruturais de repetição de arquitetura modular única (repetições), que empilham juntas para formar domínios de repetição alon- gados revelando superfícies de ligação alvo variáveis e modulares.

Baseado nesta modularidade, bibliotecas combinatóriais de polipeptídeos com especi- 5 ficidades de ligação altamente diversificadas podem ser geradas.

Esta estra- tégia inclui o desenho de consenso de repetições autocompatíveis revelando resíduos de superfície variável e sua montagem aleatória em domínios de repetição.

DARPins podem ser produzidos em sistemas de expressão bac- 10 terial em rendimentos muito altos e eles pertencem às proteínas mais está- veis conhecidas.

DARPins de alta afinidade, altamente específicos, a uma ampla faixa de proteínas alvos, incluindo receptores humanos, citoquinas, kinases, proteases humanas, vírus e proteínas de membrana, foram selecio- nados.

DARPins tendo afinidades na faixa de nanomolar de dígito simples a 15 picomolar podes ser obtidos.

DARPins foram usados em uma ampla faixa de aplicações, in- cluindo ELISA, ELISA de intercalação, análise citométrica de fluxo (FACS), imuno-histoquímica (IHC), aplicações de chip, purificação de afinidade ou manchamento de Western.

Os DARPins também se comprovam serem al- 20 tamente ativos no compartimento intracelular, por exemplo, como proteínas marcadoras intracelulares fundidas à proteína fluorescente verde (GFP). Os DARPins foram adicionalmente usados para inibir entrada viral com IC50 na faixa de pM.

Os DARPins não são somente ideais para bloquear interações de proteína-proteína, mas também para inibir enzimas.

As proteases, kina- 25 ses e veículos foram bem sucedidamente inibidos, mais frequentemente um modo de inibição alostérico.

Enriquecimentos muito rápidos e específicos no tumor e tumor muito favorável a proporções de sangue produzem DARPins bem adequados para diagnósticos in vivo ou aproximações terapêuticas.

Informação adicional com relação a DARPins e outras tecnologi- 30 as de DRP podem ser encontradas na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 2004/0132028, e Publicação de Pedido de Patente Inter- nacional Nº WO 02/20565, ambos dos quais são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade.

Anticalins são uma tecnologia de mimético de anticorpo adicio- nal; contudo neste caso a especificidade de ligação é derivada de lipocalins, uma família de proteínas de baixo peso molecular que são naturalmente e 5 abundantemente expressas em tecidos humanos e fluidos do corpo.

Os lipo- calins têm evoluído para realizar uma faixa de funções in vivo associadas com o transporte fisiológico e armazenagem de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis.

Os lipocalins têm uma estrutura intrínseca robusta compreendendo um ß-recipiente altamente conservado que suporta quatro 10 voltas em um terminal da proteína.

Estas voltas formam a entrada a uma bolsa de ligação e diferenças conformacionais nesta parte da contagem da molécula para a variação na especificidade de ligação entre lipocalins indivi- duais.

Enquanto a estrutura total de voltas hipervariáveis suportadas 15 por uma estrutura de ß-folha conservada é reminiscente das imunoglobuli- nas, os lipocalins diferem consideravelmente dos anticorpos em termos de tamanho, sendo compostos de uma cadeia de polipeptídeo simples de 160- 180 aminoácidos que é marginalmente maior do que um domínio de imuno- globulina simples. 20 Os lipocalins são clonados e seus circuitos fechados são subme- tidos a projeto de modo a criar Anticalins.

As bibliotecas de Anticalins estru- turalmente diversas foram geradas e a descrição de Anticalin permite a sele- ção e classificação de função de ligação, seguido pela expressão e produ- ção de proteína solúvel para análise adicional em sistemas procarióticos ou 25 eucarióticos.

Estudos têm demonstrado bem sucedidamente que Anticalins podem ser desenvolvidos, que são específicos para virtualmente qualquer proteína alvo humana poder ser isolada e afinidades de ligação na faixa na- nomolar ou mais alta podem ser obtidas.

Anticalins podem também serem formatados como proteínas al- 30 vos duplas, assim denominadas Duocalins.

A Duocalin liga dois alvos tera- pêuticos separados em uma proteína monomérica facilmente produzida u- sando-se processos de produção padrões, enquanto retém especificidade alvo e afinidade indiferente da orientação estrutural de seus dois domínios de ligação.

A modulação de alvos múltiplos através de uma molécula sim- ples é particularmente vantajosa em doenças conhecidas por envolver mais 5 do que um fator causativo simples.

Além disso, formatos de ligação bi- ou multivalentes tais como Duocalins têm potencial significante em ter como alvo moléculas de superfície de célula em doença, mediando efeitos agonís- ticos nas trajetórias de transdução de sinal ou induzindo efeitos de internali- zação intensificados, via ligação e agrupamento de receptores de superfície 10 de célula.

Além disso, a alta estabilidade intrínseca de Duocalins é compará- vel a Anticalins monoméricos, oferecendo formulação flexível e distribuição potencial para Duocalins.

Informação adicional com relação a Anticalins pode ser encon- trada na Patente dos Estados Unidos Nº 7.250.297 e Publicação de Pedido 15 de Patente Internacional Nº WO 99/16873, ambos dos quais são, desse mo- do, incorporados por referência em sua totalidade.

Outra tecnologia de mimético de anticorpo útil no contexto da presente invenção são Avímeros.

Os Avímeros são evoluídos de uma gran- de família de domínios de receptor extracelular humano por embaralhamento 20 de exon in vitro e descrição de fago, gerando proteínas de multidomínio com ligação e propriedades inibitórias.

A ligação múltipla independente de domí- nios de ligação foi mostrada criar a avidez e resulta na afinidade aperfeiçoa- da e especificidade comparada com proteínas de ligação de epítope simples convencionais.

Outras vantagens potenciais incluem produção simples e 25 eficiente de moléculas específicas multialvo em Escherichia coli, termoesta- bilidade aperfeiçoada e resistência a proteases.

Os Avímeros com afinidades subnanomolares foram obtidos contra uma variedade de alvos.

Informação adicional com relação a Avímeros pode ser encon- trada nas Publicações de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nos. 30 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, todos dos quais são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade.

Os Versacorpos são outra tecnologia de mimético de anticorpo que pode ser usada no contexto da presente invenção.

Os Versacorpos são pequenas proteínas de 3-5 kDa com >15% de cisteínas, que formam um 5 suporte de densidade de dissulfeto alto, substituindo o núcleo hidrofóbico que as proteínas típicas têm.

A substituição de um grande número de ami- noácidos hidrofóbicos compreendendo o núcleo hidrofóbico, com um peque- no número de dissulfetos resulta em uma proteína que é menor, mais hidrofí- lica (menos agregação e ligação não específica), mais resistente a proteases 10 e calor, e tem uma baixa densidade de epítopes de célula-T, porque os resí- duos que contribuem mais para a apresentação de MHC são hidrofóbicos.

Todas as quatro destas propriedades são bem conhecidas por afetarem a imunogenicidade, e juntas elas são esperadas causarem uma grande dimi- nuição na imunogenicidade. 15 A inspiração para Versacorpos vem dos biofarmacêuticos injetá- veis naturais produzidos por sanguessugas, serpentes, aranhas, escorpiões, lesmas e anêmonas, que são conhecidos por exibir imunogenicidade inespe- radamente baixa.

Partindo-se das famílias de proteína natural selecionada, por delineação e por classificação do tamanho, hidrofobicidade, processa- 20 mento de antígeno proteolítico, e densidade de epítope são minimizadas a níveis distante abaixo da média para proteínas injetáveis naturais.

Dada a estrutura de Versacorpos, estes miméticos de anticorpo oferecem um formato versátil que inclui multivalência, multiespecificidade, uma diversidade de mecanismos de meia vida, módulos de alvejamento de 25 tecido e a ausência da região Fc do anticorpo.

Além disso, Versacorpos são produzidos em E. coli em altos rendimentos, e devido a sua hidrofilicidade e pequeno tamanho, os Versacorpos são altamente solúveis e podem ser for- mulados a altas concentrações.

Os Versacorpos são excepcionalmente es- táveis ao calor (eles podem ser fervidos) e oferecem vida útil prolongada. 30 Informação adicional com relação a Versacorpos pode ser en- contrada ma Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 2007/0191272 que é, desse modo, incorporada por referência em sua totali-

dade. A descrição detalhada de tecnologias de fragmento de anticorpo e mimético de anticorpo provida acima não é pretendida para ser uma lista compreensiva de todas as tecnologias que podem ser usadas no contexto 5 do presente relatório descritivo. Por exemplo, e também não por meio de limitação, uma variedade de tecnologias adicionais incluindo tecnologias à base de polipeptídeo alternativas, tais como fusões de regiões de determi- nação complementares, conforme esboçadas em Qui et al., Nature Biotech- nology, 25(8) 921-929 (2007), que é, desse modo, incorporado por referên- 10 cia em sua totalidade, bem como tecnologias à base de ácido nucleico, tais como tecnologias de aptâmero de RNA descritas nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.789.157. 5.864.026. 5.712.375. 5.763.566. 6.013.443.

6.376.474. 6.613.526. 6.114.120. 6.261.774, e 6.387.620, todas das quais são, desse modo, incorporadas por referência, podem ser usadas no contex- 15 to da presente invenção. Composições Farmacêuticas Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma com- posição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porções de ligação de antíge- 20 no(s) dos mesmos, da presente invenção, formulados com um veículo far- maceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imuno- conjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação 25 de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epito- pos diferentes do antígeno alvo, ou que têm atividades complementares. As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo 30 anti-CADM1 da presente invenção combinado com pelo menos um outro agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêu- ticos que podem ser usados na terapia de combinação são descritos em maiores detalhes abaixo na seção de usos dos anticorpos da invenção.

Conforme aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" in- clui qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agen- tes antibacterial e antifungal, agentes de retardamento isotônico e de absor- 5 ção, e similares, que são fisiologicamente compatíveis.

Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutâ- nea, parenteral, espinhal ou epidermal (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um mate- 10 rial para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis.

Um "sal farmaceuticamente aceitá- vel" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do compos- 15 to de origem e não concede quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (vi- de, por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J.

Pharm.

Sci. 66:1-19). Exem- plos de tais sais incluem sais de adição ácidos e sais de adição básicos.

Os sais de adição ácidos incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hi- 20 droiódico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos di- e mono-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil- substituído, ácidos hidróxi alcanoico, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos, e similares.

Os sais de adição básicos incluem aque- les derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, mag- 25 nésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenzoletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína, e similares.

Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável.

Exemplos de antioxidantes 30 farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cisteína hidrocloreto, bissulfato de sódio, meta- bissulfito de sódio, sulfito de sódio, e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilatado (BHA), hidroxitolu- eno butilatado (BHT), lecitin, propol galato, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes de quelatação de metal, tais como ácido cítrico, etilenodiamina áci- do tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares. 5 Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção inclu- em água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila.

A fluidez corre- 10 ta pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitin, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de surfactantes.

Estas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes de umedecimento, agentes de emulsificação e agen- 15 tes de dispersão.

A prevenção de presença de micro-organismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, como pela inclusão de vários agentes antibacteriais e antifungais, por exemplo, parabeno, clorobu- tanol, fenol ácido sórbico, e similares.

Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares, nas 20 composições.

Em adição, a absorção prolongada da forma farmacêutica in- jetável pode ser considerada pela inclusão de agentes que retardam absor- ção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções a- quosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporâ- 25 nea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão.

O uso de tal meio e agen- tes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

Ex- ceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatí- vel com o composto ativo, o uso deste nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado.

Compostos ativos suplementares podem também 30 ser incorporados nas composições.

Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e es- táveis sob as condições de fabricação e armazenagem.

A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra estru- tura ordenada adequada à alta concentração de fármaco.

O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, po- liol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e simila- 5 res), e misturas adequadas destes.

A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitin, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfac- tantes.

Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por e- xemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio 10 na composição.

A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser considerada por incluir na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incor- poração do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apro- 15 priado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por microfiltração de esterilização.

Geralmente, dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veí- culo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredien- tes requeridos daqueles enumerados acima.

No caso de pós estéreis para a 20 preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de prepa- ração são secagem por vácuo e congelamento-secagem (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adi- cional de uma solução filtrada estéril previamente deste.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com 25 um material veículo para produzir uma forma de dosagem simples variará dependendo do indivíduo sendo tratado, e do modo particular de administra- ção.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um ma- terial veículo para produzir uma forma de dosagem simples geralmente será aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.

Geral- 30 mente, fora de dez porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 por- cento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, preferivel- mente de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, mais preferivelmen-

te de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a res- posta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, 5 uma massa simples pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas sobre o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente re- duzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação tera- pêutica.

É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária de administração e uniformidade de dosagem.

A 10 forma de dosagem unitária conforme aqui usada se refere a unidades fisi- camente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as- sociação com o veículo farmacêutico requerido.

A especificação para as 15 formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e diretamente de- pendentes de (a) as características únicas do composto ativo e o efeito tera- pêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos. 20 Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem variam de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e, mais usualmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corpóreo do hospedeiro.

Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corpóreo, 1 mg/kg de peso corpóreo, 3 mg/kg de peso corpó- reo, 5 mg/kg de peso corpóreo ou 10 mg/kg de peso corpóreo ou dentro da 25 faixa de 1-10 mg/kg.

Um regime de tratamento exemplar requer administra- ção uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cadaquatro semanas, uma vez em um mês, uma vez todos 3 meses, ou uma vez a cada três a 6 meses.

Regimes de dosa- gem preferidos para um anticorpo anti-CADM1 da invenção incluem 1 mg/kg 30 de peso corpóreo, ou 3 mg/kg de peso corpóreo, via administração intrave- nosa, com o anticorpo sendo dado usando-se uma das seguintes tabelas de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, em seguida a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corpóreo uma vez, seguido por 1 mg/kg de peso corpóreo todas três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, 5 em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrada cai dentro das fai- xas indicadas.

O anticorpo é usualmente administrado em ocasiões múlti- plas.

Intervalos entre dosagens simples podem ser, por exemplo, semanal- mente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente.

Os intervalos po- dem também ser irregulares conforme indicado por medição de níveis de 10 sangue de anticorpo ao antígeno alvo no paciente.

Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo de plas- ma de cerca de 1-1000 g /ml e, em alguns métodos, cerca de 25-300 g /ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma 15 formulação de liberação sustentada, em cujo caso administração menos fre- quente é requerida.

A dosagem e frequência varia dependendo da meia vida do anticorpo no paciente.

Em geral, os anticorpos humanos mostram a meia vida mais longa, seguido pelos anticorpos humanizados, anticorpo quiméri- cos, e anticorpos não humanos.

A dosagem e frequência de administração 20 pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico.

Em a- plicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes sobre um longo período de tempo.

Al- guns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas.

Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos 25 relativamente curtos é às vezes requerida até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferivelmente até que o paciente mostre me- lhora parcial ou completa dos sintomas da doença.

Em seguida, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas com- 30 posições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é efetiva para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente.

O nível de dosagem desejado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluin- do a atividade das composições particulares da presente invenção empre- gadas, ou o éster, sal ou amida destas, a rota de administração, o tempo de 5 administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, se- xo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas. 10 Uma "dosagem terapeuticamente efetiva" de um anticorpo anti- CADM1 da invenção preferivelmente resulta em uma diminuição na severi- dade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração de pe- ríodos livres do sintoma da doença, ou uma prevenção de dano ou incapaci- dade devido à aflição da doença.

Por exemplo, para o tratamento de tumo- 15 res de CADM1+, uma "dosagem terapeuticamente efetiva" preferivelmente inibe o crescimento da célula ou crescimento do tumor por pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 40%, ainda mais pre- ferivelmente por pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 80% relativo aos indivíduos não tratados.

A capacidade 20 de um composto inibir crescimento de tumor pode ser avaliada em um sis- tema de modelo de animal predisposto de eficácia em tumores humanos.

Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada pelo exame da capacidade do composto inibir crescimento da célula, tal ini- bição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos àqueles versados no 25 assunto.

Uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto tera- pêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou, de outro modo, melhorar os sintomas de um indivíduo.

Um versado no assunto será capaz de determinar tais quantidades baseado em tais fatores como o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particular ou rota de 30 administração selecionada.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada via uma ou mais rotas de administração usando-se uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será apreciado à- queles versados no assunto, a rota e/ou modo de administração variará de- pendendo dos resultados desejados. Rotas preferidas de administração para anticorpos da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradermal, in- 5 traperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras rotas parenterais de adminis- tração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parente- ral", conforme aqui usada, significa modos de administração outros do que administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limi- tação, intravenosa, injeção intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsu- 10 lar, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, sub- cutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinoide, intraspi- nhal, epidural e intrasternal, e infusão. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser adminis- trado via uma rota não parenteral, tal como um rota tópica, epidermal ou mu- 15 cosal de administração, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginal- mente, retalmente, sublingualmente ou topicamente. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como formulação de libe- ração controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais, e sistemas 20 de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatí- veis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoesteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente co- nhecidos àqueles versados no assunto. Vide, por exemplo, Sustained e Con- 25 trolled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. As composições terapêuticas podem ser administradas com dis- positivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada 30 com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os disposi- tivos descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.399.163; 5.383.851;

5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de im-

plantes bem conhecidos e módulos úteis na presente invenção incluem: Pa- tente dos Estados Unidos Nº 4.487.603, que revela uma bomba de micro- infusão implantável para dispersão de medicação a uma taxa controlada; Patente dos Estados Unidos Nº 4.486.194, que revela um dispositivo tera- 5 pêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente dos Esta- dos Unidos Nº 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente dos Estados Unidos Nº 4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantá- vel de fluxo variável para distribuição de fármaco contínua; Patente dos Es- 10 tados Unidos Nº 4.439.196, que revela um sistema de distribuição de fárma- co osmótico tendo compartimentos de multicâmara; e Patente dos Estados Unidos Nº 4.475.196, que revela um sistema de distribuição de fármaco os- mótico.

Estas patentes são aqui incorporadas por referência.

Muitos outros tais implantes, sistemas de distribuição, e módulos são conhecidos àqueles 15 versados no assunto.

Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição correta in vivo.

Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos al- tamente hidrofílicos.

Para assegurar que os compostos terapêuticos da in- 20 venção cruzem o BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exem- plo, em lipossomos.

Para métodos de produção de lipossomos, vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomos podem compreender uma ou mais porções que são seletiva- mente transportadas em células específicas ou órgãos, desse modo, intensi- 25 ficando a distribuição de fármaco alvo (vide, por exemplo, V.V.

Ranade (1989) J.

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Pharmacol. 29:685). Porções alvos exemplares incluem folato ou biotin (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.416.016 para Low et al.); mannosides (Umezawa et al., (1988) Biochem.

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Fidler (1994) Immunométodos 4:273. Usos e Métodos O anticorpos, particularmente os anticorpos humanos, composi- 5 ções de anticorpo e métodos da presente invenção têm numerosas utilida- des diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo a diagnose e tratamento de distúrbios mediados por CADM1. Por exemplo, estas molécu- las podem ser administradas às células na cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar 10 uma variedade de distúrbios.

Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" é pretendido para incluir animais humanos e não humanos.

Animais não hu- manos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamí- feros, tais como primatas não humanos, ovelha, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios, e répteis.

Indivíduos preferidos incluem pacientes huma- 15 nos tendo distúrbios mediados por atividade de CADM1. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio associado com expressão de CADM1 aberrante.

Quando anticor- pos para CADM1 são administrados juntos com outro agente, os dois podem ser administrados em ou em ordem ou simultaneamente. 20 Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção para CADM1, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar especi- ficamente expressão de CADM1 na superfície de células e, além disso, po- dem ser usados para purificar CADM1 via purificação de imunoafinidade.

Além disso, dada a expressão de CADM1 em várias células de 25 tumor, os anticorpos humanos, composições de anticorpo e métodos da pre- sente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de cé- lulas de tumor que expressam CADM1 incluindo, por exemplo, câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, cânceres neuroen- 30 dócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, de trato gastrintes- tinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluin-

do aqueles de pâncreas, pulmão, de trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas biespecíficas e composi- ções) da invenção podem ser usados para detectar os níveis de CADM1, ou 5 níveis de células que contêm CADM1 on sua superfície de membrana, cujos níveis podem, em seguida, serem articulados a certos sintomas de doença.

Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para inibir ou bloquear função de CADM1 que, por sua vez, pode ser articulado à prevenção ou me- lhora de certos sintomas de doença, implicando, desse modo, em CADM1 10 como um mediador da doença.

Isto pode ser alcançado pelo contato de uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-CADM1 sob condi- ções que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CADM1. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CADM1 são detectados e comparados na amostra e no controle. 15 Em outra modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e composições) da invenção podem ser inicialmente testados para atividade de ligação associada com uso tera- pêutico ou diagnóstico in vitro.

Por exemplo, as composições da invenção podem ser testadas usando-se os ensaios de citometria de fluxo descritos 20 nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas, imunoconjugados e composições) da inven- ção têm utilidade adicional na terapia e diagnose de doenças relacionadas a CADM1. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos, as moléculas 25 multiespecíficas ou biespecíficas e os imunoconjugados podem ser usados para induzir in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológi- cas: inibir o crescimento de e/ou matar uma célula que expressa CADM1; mediar fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa CADM1 na presen- ça de células efetuadoras humanas, ou bloquear ligação de ligante de 30 CADM1 a CADM1. Em uma modalidade particular, os anticorpos (por exemplo, anti- corpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições)

são usados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas a CADM1. Exemplos de doenças relacionadas a CADM1 incluem, entre outras, tecidos de câncer humano representando câncer de pulmão de célula pequena, câncer pancreático neuroendócrino, 5 câncer de fígado, carcinoides de pulmão, e carcinoides gastrintestinal.

Rotas adequadas de administração das composições de anti- corpo (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespe- cíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles versados 10 no assunto.

Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser adminis- tradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). Dosagens a- dequadas das moléculas usadas dependerão da idade e peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.

Conforme previamente descrito, os anticorpos humanos anti-CADM1 da invenção po- 15 dem ser coadministrados com um ou outros mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radio tóxico ou um agente imu- nossupressivo.

O anticorpo pode estar articulado ao agente (como um imu- nocomplexo), ou pode ser administrado separado do agente.

No último caso, (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes de, após 20 ou concorrentemente com o agente, ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, ra- diação.

Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti- neoplástico tais como doxorubicina (adriamicina), cisplatina bleomicin sulfa- to, carmustina, clorambucil, e ciclofosfamida hidroxiureia que, por si mes- 25 mas, são somente efetivos em níveis que são tóxicos ou subtóxicos a um paciente.

A cisplatina é intravenosamente administrada como uma dose de 100 mg/kg uma vez a cada quatro semanas e adriamicina é intravenosamen- te administrada como uma dose de 60-75 mg/ml uma vez a cada 21 dias.

A coadministração dos anticorpos humanos anti-CADM1, ou fragmentos de 30 ligação de antígenos destes, da presente invenção, com agentes quimiote- rapêuticos proporcionam dois agentes anticâncer que operam via mecanis- mos diferentes que produzem um efeito citotóxico a células de tumor huma-

no.

Tal coadministração pode solucionar problemas devido ao desenvolvi- mento de resistência a fármacos ou uma mudança na antigenecidade das células de tumor que tornariam as mesmas não reativas com o anticorpo.

As células efetuadoras específicas de alvo, por exemplo, células 5 efetuadoras articuladas às composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem também ser usadas como agentes terapêuticos.

As células efetuadoras para alvejamento podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monó- citos.

Outras células incluem eosinófilos, células matadoras originais e ou- 10 tras células que suportam IgG- ou receptor de IgA.

Se desejado, as células efetuadoras podem ser obtidas do indivíduo a ser tratado.

As células efetua- doras específicas de alvo podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável.

O número de células administradas pode ser na ordem de 108-109, mas variará dependendo da 15 proposta terapêutica.

Em geral, a quantidade será suficiente para obter loca- lização na célula alvo, por exemplo, uma célula de tumor que expressa CADM1, e para afetar morte de célula por, por exemplo, fagocitose.

As rotas de administração podem também variar.

A terapia com células efetuadoras específicas de alvo pode ser 20 realizada em conjunto com outras técnicas para remoção de células alvos.

Por exemplo, terapia antitumor usando-se as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da inven- ção e/ou células efetuadoras providas com estas composições pode ser u- sada em conjunto com quimioterapia.

Adicionalmente, imunoterapia de com- 25 binação pode ser usada para direcionar duas populações efetuadoras citotó- xicas distintas para rejeição de célula de tumor.

Por exemplo, anticorpos an- ti-CADM1 articulados a anti-Fc-gama RI ou anti-CD3 podem ser usados em conjunto com agentes de ligação específicos de receptor de IgG ou IgA.

Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção podem 30 também ser usadas para modular níveis de Fc R ou Fc R nas células efetu- adoras, tais como por capeamento e eliminação de receptores na superfície da célula.

As misturas de receptores anti-Fc podem também ser usadas para esta proposta.

As composições (por exemplo, anticorpos humanos, humaniza- dos, ou anticorpos quiméricos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção que têm locais de ligação de complemento, 5 tais como porções de IgG1, -2, ou -3 ou IgM que se ligam ao complemento, podem também ser usadas na presença de complemento.

Em uma modali- dade, tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo célu- las alvos com um agente de ligação da invenção e células efetuadoras apro- priadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou soro con- 10 tendo complemento.

A fagocitose de células alvos revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser aperfeiçoada por ligação de proteínas de complemento.

Em outra modalidade, as células alvos revestidas com as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem também ser lisadas pelo complemento. 15 Em ainda outra modalidade, as composições da invenção não ativam o complemento.

As composições (por exemplo, anticorpo humano, humanizado ou anticorpos quimérico, moléculas multiespecíficas e moléculas biespecífi- cas e imunoconjugados) da invenção podem também ser administradas jun- 20 to com complemento.

Em certas modalidades, a presente descrição propor- ciona composições compreendendo anticorpos humanos, moléculas multi- específicas ou biespecíficas e soro ou complemento.

Estas composições podem ser vantajosas quando o complemento está localizado em proximida- de aos anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas. 25 Alternativamente, os anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas da invenção e o complemento ou soro podem ser administra- dos separadamente.

Também dentro do escopo da presente invenção estão kits compreendendo as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, 30 anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas, ou imuno- conjugados) e instruções para uso.

O kit pode adicionalmente conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressivo, um agente citotóxico ou um agente radio tóxico, ou um ou mais anticorpos hu- manos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que se liga a um epitopo no antígeno de CADM1 distinto do primeiro anticorpo humano). 5 Consequentemente, pacientes tratados com as composições de anticorpo da invenção podem ser adicionalmente administrados (antes de, simultaneamente com, ou seguindo administração de um anticorpo humano da invenção) com outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos 10 humanos.

Em outras modalidades, o indivíduo pode ser adicionalmente tra- tado com um agente que modula, por exemplo, intensifica ou inibe a expres- são ou atividade de receptores Fc ou Fc por, por exemplo, tratamento do indivíduo com uma citoquina.

Citoquinas preferidas para administração du- 15 rante tratamento com as moléculas multiespecíficas incluem fator de estimu- lação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), interferon- (IFN- ), e fator de necrose de tumor (TNF). As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas 20 multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem também ser usadas em células alvos que expressam Fc R ou CADM1, por exemplo para etiqueta- ção de tais células.

Para tal uso, o agente de ligação pode ser articulado a uma molécula que pode ser detectada.

Desse modo, a invenção proporciona métodos para localização ex vivo ou in vitro de células que expressam re- 25 ceptores de Fc, tais como Fc R, ou CADM1. A etiqueta detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima.

Em uma modalidade particular, a invenção proporciona métodos para detecção da presença de antígeno de CADM1 em uma amostra, ou 30 medição da quantidade de antígeno de CADM1, compreendendo contactar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação de antígeno deste, que especificamente se liga a

CADM1, sob condições que permitem formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e CADM1. A formação de um complexo é, em seguida, detectada, no qual uma formação de complexo de diferença entre a amostra comparada à amostra de controle é indicativa da presença de antí- 5 geno de CADM1 na amostra.

Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos para tratamento de um distúrbio mediado por CADM1 em um indivíduo, por e- xemplo, cânceres humanos, incluindo câncer de pulmão de célula pequena, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, 10 de trato gastrintestinal, rim, fígado, pâncreas (incluindo insulinomas e gluca- gonomas), e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, de trato gastrintestinal, fígado ou rim.

Em ainda outra modalidade, imunoconjugados da invenção po- dem ser usados para compostos alvos (por exemplo, agentes terapêuticos, 15 etiquetas, citotoxinas, rádio toxinas imunossupressoras, etc.) para células que têm receptor de CADM1 de superfície de células por ligação de tais compostos ao anticorpo.

Por exemplo, um anticorpo anti-CADM1 pode ser conjugado a qualquer dos compostos de toxina descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6. 281. 354 e 6.548.530, Publicações de Patente dos 20 Estados Unidos Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852, e 20040087497, ou publicados em WO 03/022806. Desse modo, a invenção também proporciona métodos para localização ex vivo ou in vivo de células que expressam CADM1 (por exemplo, com uma etiqueta detectável, tal co- mo um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator 25 de enzima). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser usados para matar células que têm receptor de CADM1 de superfícies de célula por cito- toxinas alvos ou rádio toxinas a CADM1. A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como adicionalmente limitantes. 30 Os conteúdos de todas as figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados através de todo este pedido são expressa- mente aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de Anticorpos monoclonais humanos contra Antígeno de CADM1 Uma proteína de fusão recombinante composta do domínio ex- 5 tracelular do CADM1 (CADM1 ECD) articulado a um polipeptídeo de não CADM1 (proteína his) (SEQ ID NO:44) foi gerada por métodos recombinan- tes padrão e usada como antígeno para imunização (vide abaixo). Cepas de Transgênicas de HuMAb Mouse® e KM Mouse® Anticorpos monoclonais totalmente humanos a CADM1 foram 10 preparados usando-se cepas HCo7 e HCo27 do HuMAb Mouse® transgênico e a cepa KM de camundongos transgênicos transcromossômicos, cada um dos quais expressa genes de anticorpo humano.

Em cada uma destas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve de camundongo kappa endógeno foi como um homozigoto rompido conforme descrito em Chen et al. (1993) EM- 15 BO J. 12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi como um homozigoto rompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publica- ção PCT WO 01/09187. Cada uma destas cepas de camundongo conduz um transgene de cadeia leve kappa humana, KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. A cepa HCo7 con- 20 duz o transgene de cadeia pesada humano HCo7 conforme descrito nas Pa- tentes dos Estados Unidos Nos. 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. A cepa HCo27 conduz o transgene de cadeia pesada humana HCo27 conforme descrito na Publicação PCT WO 01/09187. A cepa de KM Mouse® contém o SC20 transcromossomo, conforme descrito na Publicação PCT WO 25 02/43478. Imunizações de HuMab e KM Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para CADM1, camundongos HuMab das cepas HCo7, HCo27 e camundongo KM foram imunizados com proteína purificada recombinante CADM1-ECD-his. 30 Esquemas gerais de imunização para estes camundongos são descritos em Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação PCT WO 98/24884. Os ca-

mundongos tinham 6-16 semanas de idade após a primeira infusão de antí- geno.

Uma preparação recombinante purificada (5-50 µg) de proteína CADM1-ECD-his foi usada para imunizar o HuMab e KM Mouse®. Os camundongos transgênicos foram imunizados com o antíge- 5 no em adjuvante Ribi ou intraperitonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) ou via salteador (FP) em intervalos de 3-21 dias (até um total de 9 imuniza- ções). A resposta imune foi monitorada por sangrias retroorbitais.

O plasma foi classificado por ELISA (conforme descrito abaixo), e os camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti-CADM1 foram 10 usados para fusões.

Os camundongos foram agrupados intravenosamente com antígeno 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço.

Tipicamente, 10-20 fusões para cada antígeno foram realizadas.

Várias dúzias de camun- dongos foram imunizadas para cada antígeno.

Seleção de um Animal de HuMab Mouse® ou KM Mouse® Produzindo Anti- 15 corpos anti-CADM1 Para selecionar um animal HuMab Mouse® ou KM Mouse® de produção de anticorpos que ligam CADM1, soro de camundongos imuniza- dos foi testado por ELISA conforme descrito por Fishwild, D. et al. (1996)(supra). Brevemente, placas de microtitulação foram revestidas com 20 CADM1 reconbinante purificado a 1-2 µg /ml em PBS, 50 µl/cavidades incu- badas a 4°C durante a noite, em seguida bloqueadas com 200 µl/cavidade de 5% de soro de galinha em PBS/Tween (0,05%). As diluições de plasma de camundongos imunizados de CADM1 foram adicionadas a cada cavidade e incubadas por 1-2 horas a temperatura ambiente.

As placas foram lavadas 25 com PBS/Tween e, em seguida, incubadas com um anticorpo policlonal ca- bra-anti-humano IgG Fc conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) por 1 hora à temperatura ambiente.

Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS (Moss Inc, produto: ABTS-1000) e anali- sadas por espectrofotômetro a OD 415-495. Os camundongos que desen- 30 volvem as titulações mais altas de anticorpos anti-CADM1 foram usados pa- ra fusões.

As fusões foram realizadas conforme descrito abaixo e sobrena- dantes de hibridoma foram testados para atividade anti-CADM1 por ELISA e

FACS.

Geração de Hibridomas de Produzindo Anticorpos monoclonais humanos para CADM1 Os esplenócitos de camundongo, isolados de um HuMab Mou- 5 se® e/ou um KM Mouse®, foram fundidos com uma linha de célula de mielo- ma de camundongo usando-se eletrofusão à base campo elétrico usando-se um eletroporador de fusão de refugo de câmara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Brevemente, suspensões de célula simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados foram fundidos 10 a número igual de Sp2/0 de células de mieloma de camundongo de não se- creção (ATCC, CRL 1581). As células foram colocadas a uma densidade de aproximadamente 2x104/cavidade em placas de microtitulação de fundo pla- no, que foram, em seguida, incubadas em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 10% de meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 15 3-5% de origem (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com alta glico- se, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM 2- mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído com HT.

Aproximadamente 10-14 dias após a colocação da célu- 20 la, os sobrenadantes de cavidades individuais foram classificados primeiro para se eles contêm anticorpos humanos g,k.

Os sobrenadantes que foram contados positivos para g,k humano foram, em seguida, subsequentemente classificados por ELISA e FACS (descritos acima) para anticorpos IgG mo- noclonais humanos anti-CADM1 para anticorpos de IgG.

O anticorpo que 25 secreta hibridomas foram transferidos para 24 placas de cavidade, classifi- cado novamente e, se ainda positivo para anticorpos de IgG humanos anti- CADM1 monoclonais, foram subclonados pelo menos duas vezes por limita- ção da diluição.

Os subclones estáveis foram, em seguida, cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido 30 para caracterização adicional.

Os clones de hibridoma PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 gerados de um KM Mouse® foram selecionados para análise adicional.

Exemplo 2: Caracterização Estrutural de Anticorpos monoclonais humanos PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3 As sequências de cDNA que codificam a região variável de ca- deia pesada e leve dos anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, e 5 PTA021_A3 foram obtidas dos hibridomas de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3, respectivamente, usando-se técnicas de PCR padrões e foram sequenciadas usando-se técnicas de sequenciamento de DNA padrões.

As sequências de anticorpo podem ser mutagenizadas para re- verter de volta para os resíduos de linhagem germinativa em um ou mais 10 resíduos.

Por exemplo, região variável de cadeia pesada PTA021_A1 pode ser mutagenizada para refletir a sequência de linhagem germinativa em lo- cais específicos (por exemplo, resíduo 30) para remover locais de glicosila- ção (por exemplo, uma mutação de N30Q). O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de 15 cadeia pesada de PTA021_A1 são mostrados na figura 1A e em SEQ ID NO:19 e 25, respectivamente.

O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A1 são mostrados na figura 1B e em SEQ ID NO:28 e 22, respectivamente. 20 A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesa- da de PTA021_A1 para as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas demonstrou que a cadeia pe- sada de PTA021_A1 utiliza um segmento VH de linhagem germinativa hu- mana VH 2-05, um segmento D da linhagem germinativa humana 6-6, e um 25 segmento JH de linhagem germinativa humana JH 5b.

O alinhamento da sequência de PTA021_A1 VH para a sequência de linhagem germinativa VH 2-05 é mostrada na figura 4. A análise adicional da sequência de PTA021_A1 VH usando-se o sistema Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia pesada de CDR1, CDR2 e 30 CD3 conforme mostrado nas figuras 1A e 4, e em SEQ ID NOs:1, 4 e 7, res- pectivamente.

A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de PTA021_A1 para as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve de PTA021_A1 utiliza um segmento de VK da linhagem germinativa humana de VK L15 e um segmento de JK de linhagem germinativa humana de JK 4. O 5 alinhamento da sequência de PTA021_A1 VK para a sequência de linhagem germinativa de VK L15 é mostrado na figura 7. Análise adicional da sequên- cia de PTA021_A1 VK usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrada nas figuras 1B e 7, e em SEQ ID NOs:10, 10 13 e 16, respectivamente.

O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A2 são mostrados na figura 2A e em SEQ ID NO:26 e 20, respectivamente.

O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de 15 cadeia leve de PTA021_A2 são mostrados na figura 2B e em SEQ ID NO:29 e 23, respectivamente.

A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesa- da do PTA021_A2 para as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas demonstrou que a cadeia pe- 20 sada de PTA021_A2 utiliza um segmento de VH de linhagem germinativa humana de VH 2-05, um segmento D da linhagem germinativa humana 6-6, e um segmento JH da linhagem germinativa humana de JH 5b.

O alinhamento da sequência de PTA021_A2 VH para a sequência de linhagem germinativa de VH 2-05 é mostrada na figura 5. A análise adicional da sequência de 25 PTA021_A2 VH usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia pesada de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrado nas figuras 2A e 5, e em SEQ ID NOs:2, 5 e 8, respectivamente.

A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve 30 de PTA021_A2 para as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linhagem germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de PTA021_A2 utiliza um segmento de VK da linhagem germinativa humana de

VK L15 e um segmento de JK da linhagem germinativa humana de JK 4. O alinhamento da sequência de PTA021_A2 VL para a sequência de linhagem germinativa de VK L15 é mostrada na figura 8. A análise adicional da se- quência de PTA021_A2 VK usando-se o sistema de Kabat de determinação 5 de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de C- DR1, CDR2 e CD3 regiões, conforme mostrado nas figuras 2B e 8, e em SEQ ID NOs:11, 14 e 17, respectivamente.

O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A3 são mostrados na figura 3A e em SEQ ID 10 NO:27and 21, respectivamente.

O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A3 são mostrados na figura 3B e em SEQ ID NO:30 e 24, respectivamente.

A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesa- 15 da de PTA021_A3 para as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de PTA021_A3 utiliza um segmento de VH da linhagem germinativa humana de VH 2-05 e um segmento de D da linhagem germinativa humana 6-6, e um segmento JH da linhagem germinativa humana JH JH5b.

O alinhamento da 20 sequência de PTA021_A3 VH para a sequência de linhagem germinativa de VH 2-05 é mostrada na figura 6. A análise adicional da sequência de PTA021_A3 VH usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrado nas figuras 3A e 6, e em SEQ ID NOs: 3, 6 e 9, 25 respectivamente.

A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de PTA021_A3 para as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linhagem germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de PTA021_A3 utiliza um segmento de VK da linhagem germinativa humana de 30 VK L15 e um segmento de JK da linhagem germinativa humana de JK 4. O alinhamento da sequência de PTA021_A3 VL para a sequência de linhagem germinativa de VK L15 é mostrada na figura 9. A análise adicional da se-

quência de PTA021_A3 VL usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de C- DR1, CDR2 e CD3, conforme mostrado nas figuras 3B e 9, e em SEQ ID NOs:12, 15, e 18, respectivamente. 5 Exemplo 3: Caracterização de Propriedades de Ligação de Anticorpos mo- noclonais de CADM1 Estudos de Citometria de Fluxo Neste exemplo, a ligação de mAbs PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3 (NF) para CADM1 10 de superfície de célula foi examinada por citometria de fluxo.

Para testar a capacidade dos anticorpos se ligarem a proteína de CADM1 de superfície de célula, os anticorpos foram incubados com célu- las diferentes que expressam CADM1: NCI-H69 (ATCC Designação HTB- 119™), uma linha de célula humana de câncer de pulmão de célula peque- 15 na; DMS79 (ATCC Designação CRL-2049™), uma linha de câncer de pul- mão de célula pequena humana; SKOV3 (ATCC Designação HTB-77™), uma linha de célula humana de câncer ovariano; A549 (ATCC Designação CCL-185™), uma linha de célula de câncer de pulmão de célula não peque- na; SkMel28 (ATCC Designação HTB-72™), uma linha de célula humana e 20 786-O (ATCC Designação CRL-1932™), uma linha de célula humana de carcinoma de célula renal.

Para os estudos de citometria de fluxo, os anti- corpos monoclonais de PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 e PTA021_A3 (NF) foram diluídos com 1x PBS frio + 0,1 % de BSA a 40 µg/ml.

Para a reação de ligação, 50 µl de solução de anticorpo diluída foi 25 adicionado a 50 µl de suspensão de célula contendo 4 x 105 células e a mis- tura foi incubada em gelo por 30-60 minutes.

As células foram, em seguida, lavadas três vezes com 1x PBS + 0,1 % de BSA.

Uma diluição 1:50 de frag- mento R-phycoerythrin-etiquetado cabra anti-humano IgG F F(ab)2 (Jack- son ImmunoResearch Labs, Cat. # 109-116-098) foi adicionada e a mistura 30 foi incubada em gelo por 1 hora, seguido por lavagem duas vezes com 1x PBS frio + 0,1 % de BSA.

Após a lavagem final, 200 µl de 1x PBS frio + 0,1% de BSA foi adicionado a cada solução e análise de ligação de anticor-

po foi efetuada por FACS.

A figura 10 e Tabela 1 abaixo mostram os resultados da análise de citometria de fluxo e o EC50 para ligação à linha de célula de NCI-H69. Os resultados demonstram que todos os três anticorpos monoclonais se ligam 5 efetivamente a CADM1 humano de superfície de célula.

Tabela 1: Ligação de Anticorpos anti-CADM1 a Células que Expressam CADM1 humano

Anticorpo NCI-H69 Células EC50 (nM) PTA021_A1 0,588 PTA021_A2 0,667 PTA021_A3 0,6742

As figuras 11A e 11B mostram os resultados da análise de cito- metria de fluxo em NCI-H69 e DMS79 de linhas de célula de câncer de pul- 10 mão de célula pequena.

A figura 12 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo em anticorpo PTA021_A3 no SKOV3 de linha de célula de câncer ovariano.

A figura 13 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo em anticorpo PTA021_A3 no A549 de linha de célula de câncer de pulmão 15 de célula não pequena.

A figura 14 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo em anticorpo PTA021_A3 em 786-O de linhas de células de carcinoma de célula renal e SkMel28 de célula de melanoma.

Os resultados das figuras 11 a 14 demonstram que PTA021_A3 20 se liga efetivamente a CADM1 humano de superfície de célula em células diferentes que expressam CADM1. A figura 15 mostra os resultados da análise citométrica de fluxo na versão não fucosilatada de PTA021_A3 (NF) em NCI-H69 e DMS79 de linhas de células de câncer de pulmão de célula pequena.

Estes resultados 25 demonstram que a não fucosilação não afeta a ligação de PTA021_A3 a CADM1 humano de superfície de célula.

Exemplo 4: Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo Mediada por Anti-CADM1 mAbs

Para determinar a capacidade do anti-CADM1 mAbs matar as células que expressam CADM1 na presença de células efetuadoras via cito- toxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC), duas linhas de célula, NCI-H69 e DMS79, foram usadas como as células alvos. 5 As células efetuadoras humanas foram preparadas de sangue total conforme segue.

As células mononucleares de sangue periférico huma- no foram purificadas de sangue total heparinizado por separação padrão Ficoll-paque.

As células foram resuspensas em meio RPMI1640 media con- tendo 10% de FBS (inativado por calor) e 200 U/ml de IL-2 humano e incu- 10 badas durante a noite a 37ºC.

No dia seguinte, as células foram coletadas e lavadas quatro vezes em meio de cultura e resuspensas a 1 x 107 células/ml.

As células alvos foram preparadas por incubação com reagente BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) a 2,5 µl de BATDA por 1 x 106 células al- vos/mL por 20 minutes a 37º C.

As células alvos foram lavadas quatro ve- 15 zes, centrifugadas e trazidas a um volume final de 1 x 105 células/ml.

As células alvo foram testadas para ADCC específico de anti- corpo aos anticorpos monoclonais humanos anti-CADM1 usando-se a análi- se de emissão de fluorescência Delfia conforme segue.

Células NCI-H69 ou DMS79 (100 µl de células alvos etiquetadas, 104 células/cavidade) foram 20 incubadas com 50 µl de células efetuadoras (106cells/cavidade) e 50 µl de anticorpo (10ug/ml de concentração final). Uma proporção de alvo para efe- tuadora de 1:25 foi usada através de todos os experimentos.

Em todos os estudos, um controle de isotipo IgG1 humano foi usado como um controle negativo.

As células foram centrifugadas a 2000 rpm e incubadas por uma 25 hora de incubação a 37º C.

Os sobrenadantes foram, em seguida, coletados, submetidos a centrifugação e 20 µl de sobrenadante foi transferido para uma placa de fundo plano, a qual 180 µl de solução Eu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foi adicionado e lido em uma leitora RubyStar (BMG Labtech). A % de lisis foi calculada conforme segue: (liberação de amostra - liberação espon- 30 tânea * 100)/(liberação máxima - liberação espontânea), onde a liberação espontânea é a fluorescência das cavidades que contêm células alvos mais células efetuadoras e liberação máxima é a fluorescência de cavidades con-

tendo células alvos e foram tratadas com 2% de Triton-X.

Os resultados são resumidos abaixo na Tabela 2 e figuras 16A e 16B, que demonstram que PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são ca- pazes de induzir especificamente ADCC nas linhas de célula de câncer que 5 expressam CADM1. Tabela 2: Citotoxicidade celular dependente do anticorpo Mediada por Anti- corpos PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3

% Específica de Lisis: % Específica de Lisis: Anticorpo NCI-H69 DMS79 PTA021_A1 24,6 ± 4,5 37,76 ± 7,8 PTA021_A2 15,9± 1,9 34,66 ± 3,1 PTA021_A3 29,8 ± 1,6 61,0 ± 1,5 Controle do Isotipo 3,3 ± 4,6 2,96 ± 1,9

Exemplo 5: Internalização de Anticorpo de CADM1 Os anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, e 10 PTA021_A3 foram mostrados serem internalizados por células NCI-H69 e DMS79 após ligação às células usando-se um ensaio Hum-Zap.

O ensaio Hum-ZAP mostrou internalização dos anticorpos monoclonais anti-CADM1 através da ligação de um anticorpo secundário anti-humano IgG conjugado a toxin saporin. (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100). Pri- 15 meiro, PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 foram ligados à superfície das células de NCI-H69 ou DMS79. Em seguida, os anticorpos Hum-ZAP foram ligados aos anticorpos primários.

Em seguida, o anticorpo primá- rio/complexo Hum-ZAP foi internalizado pelas células.

A entrada de Saporin nas células resultou em inibição da síntese de proteína e eventual morte da 20 célula.

O ensaio Hum-ZAP foi conduzido conforme segue.

Cada uma das células foi semeada a uma densidade de 3 x 103 células por cavidade.

Os anti-CADM1 anticorpos monoclonais ou um IgG humano de controle de isotipo foram serialmente diluídos, em seguida adicionados às células.

O 25 Hum-ZAP foi, em seguida, adicionado a uma concentração de 2 g/ml e as placas permitidas incubarem por 96 horas.

A viabilidade da célula nas placas foi detectada por kit de Ensaio De Viabilidade de Célula Luminescente Cell- Titer-Glo® (Promega, G7571) e as placas foram lidas a 490nM por um Lumi- nomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). O dado foi analisado por Prism (Gráficopad). A morte da célula foi proporcional à concentração de 5 PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 anticorpos monoclonais.

As figuras 17A e 17B mostram que os anti-CADM1 anticorpos monoclonais foram efici- entemente internalizados por células de DMS79 e NCI-H69 respectivamente conforme comparado ao anticorpo de controle de isotipo hIgG1. Exemplo 6: CADM1 é colocalizado com LAMP1 10 O anticorpo monoclonal PTA021_A3 foi mostrado colocalizar com LAMP1 e, desse modo, ser internalizado.

PTA021_A3 foi ligado às célu- las de NCI-H69, lavados e incubados a 37°C por 45 minutos.

O PTA021_A3 anticorpo foi rastreado via um anticorpo anti-humano etiquetado FITC.

Algumas células foram permeabilizadas e manchadas com anti- 15 humano LAMP1, detectado com TRITC secundário etiquetado.

Os resultados mostram que PTA021_A3 e LAMP1 são co- localizados nos endossomos.

Exemplo 7: Anticorpos anti-CADM1 se ligam a tecidos de câncer Anti-CADM1 anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, 20 e PTA021_A3 foram mostrados se ligarem a tecidos humanos de câncer incluindo tecidos representando câncer de pulmão de célula pequena, cân- cer pancreático neuroendócrino, câncer de fígado, carcinoides de pulmão, e carcinoides gastrointestinal.

As biópsias de pacientes com câncer foram ob- tidas e os anticorpos usados para manchamento de imuno-histoquímica (Cy- 25 tomyx, MA). 5 m de núcleos de tecido foram usados.

Após secagem por 30 minutos em lâminas, as seções de tecido foram fixadas com acetona à tem- peratura ambiente por 5 minutos.

As lâminas foram enxaguadas em PBS e, em seguida, bloqueadas com proteína livre de soro e bloqueador de peroxi- dase (Dako S2001, CO) e subsequentemente incubadas com complexo de 30 anticorpo primário a 5 g/ml por 45 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, as the lâminas foram lavadas e incubadas por 30 minutos com anti- corpo secundário conjugado a FITC (Jackson Immunoresearch Lab, 109-

097-003) e lavadas novamente com PBS e incubadas com polímero HRP conjugados (Dako, CO, K4063) por 20 minutos.

Cromogênio (Dako K3464) foi usado como um substrato, resultando em manchamento marrom.

As lâ- minas foram montadas em Faramount Aqueous Mounting Media (Dako, 5 S3025). PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3 foram mostrados se liga- rem especificamente a células de tumor dos tipos listados acima.

Quando manchados com estes anticorpos monoclonais, outros órgãos exibem man- chamento negativo ou não específico, que incluem útero, pulmão, fígado, rim, cólon, coluna cervical, seio, tutano de osso, cerebelo, cérebro, esôfago, 10 coração, próstata, placenta, pituitária, ovário, mesotélio, amígdala, pele, in- testino delgado, músculo esqueletal, estômago, baço, timo, e tireoide.

O da- do demonstra que o anti-CADMhuMabs PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 reconhece CADM1 expresso em tumores, incluindo aqueles tumores de câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célu- 15 la não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), cân- ceres neuroendócrinos (incluindo aqueles do pâncreas, pulmão e trato gas- trointestinal), câncer de fígado, carcinoides do pulmão, câncer de seio, cân- cer de cólon, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de rim, e carcinoi- des gastrointestinal. 20 A imuno-histoquímica no anticorpo PTA021_A3 em amostras de tecido de câncer de pulmão de célula pequena mostrou 75% de prevalência manchamento de membrana de alto nível (+++) de todas as células de tu- mor.

A imuno-histoquímica no anticorpo PTA021_A3 em amostras de tecido de câncer de fígado mostrou manchamento em 75%-95% de amostras com 25 45% de tumores mostrando manchamento de membrana de alto nível (+++) de todas as células de tumor.

Estudos adicionais em PTA021_A3 foram efe- tuados em conjuntos menores de amostra de câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de seio, câncer de próstata, câncer coloretal, câncer ovariano e carcinoma de célula renal.

A prevalência de manchamento positi- 30 vo em carcinoma de pulmão de célula não pequena, carcinoma de seio e carcinoma de célula clara renal foi ~66%; em carcinoma e prevalência de carcinoma ovariano foi 100% e adenocarcinoma coloretal mostrou mancha-

mento positivo em 17% de amostras.

Tumores neuroendócrinos do pulmão, pâncreas e trato gastrointestinal foram também testados com carcinoides de pulmão e amostras pancreáticas neuroendócrinas mostrando 75% de preva- lência e tumores neuroendócrinos de trato gastrointestinal mostrando man- 5 chamento positivo em 65% de amostras.

Exemplo 8: Efeito de anticorpos anti-CADM1 focusilatados e não focusilata- dos em crescimento de tumor de câncer de fígado em um modelo de xeno- enxerto de camundongo O efeito de PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de 10 PTA021_A3(NF) no crescimento de câncer de fígado derivado de células de HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado.

Nes- te modelo de xenoenxerto, SCID camundongos (CB17, de Charles River La- boratories, Hollister, CA) foram implantados com 2,5 x 106 de células de HepG2/camundongo e as células de HepG2 foram permitidas crescerem 15 para ca. 30 dias.

Os camundongos foram em seguida randomizados e trata- dos intraperitonealmente (i.p.) conforme segue na Tabela 3: Tabela 3: Protocolo de Imunização para Modelo de Xenoenxerto de Tumor de HEPG2

Dose (Ab mg/kg) Dia da Dose Veículo Dia 0 Isotipo IgG1 10 Dia 0, 4, 7, 11 Isotipo nf IgG1 10 Dia 0, 4, 7, 11 CADM1 PTA021_A3 parental IgG1 10, 3 Dia 0, 4, 7, 11 CADM1 PTA021_A3 nf IgG1 10, 3 Dia 0, 4, 7, 11 Nexavar Sorafenib 20 (Q1Dx3), 10 p.o.

Q1Dx8, Dia 0-7

Nexavar Sorafenib, um inibidor de quinase múltiplo à base de 20 química usado para tratar carcinoma de célula normal e câncer de fígado, foi usado como um controle para terapia alvo.

Conforme visto na figura 18, o tratamento com os PTA021_A3 e PTA021_A3 NF anticorpos reduziu significantemente a taxa de crescimento do tumor, com o PTA021_A3 NF anticorpo não fucosilatado sendo o mais 25 potente.

Exemplo 9: Anticorpo anti-CADM1-fármaco conjugado inibe crescimento de célula de HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo O efeito de um PTA021_A3 conjugado de acordo com a fórmula M (daqui por diante referido como "PTA021_A3-Fórmula A conjugado" ou 5 "PTA021_A3-Fórmula M") no crescimento de carcinoma hepatocelular deri- vado de células de HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado.

Neste modelo de xenoenxerto, SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 2,5 x 106 de células de HepG2/camundongo e as células de HepG2 foram permiti- 10 das crescerem para ca. 30 dias.

Os camundongos foram, em seguida, ran- domizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) com PTA021_A3-Fórmula M conjugado (0,1 umole/kg, ou 0,03umol/kg). DT, e anti difteria toxin anticorpo, foi usado como um controle de isotipo de não ligação.

Nexavar Sorafenib, um inibidor de kinase múltiplo à base de químico usado para tratar carcino- 15 ma de célula renal e câncer de fígado, foi usado como um controle para te- rapia alvo.

Conforme visto na figura 19, o tratamento com o PTA021_A3- Fórmula M conjugado inibiu significantemente a taxa de crescimento de tu- mor em um modo dependente da dose. 20 Exemplo 10: Anticorpo anti-CADM1-fármaco conjugado inibe crescimento de célula de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo O efeito de PTA021_A3-Fórmula M no crescimento de câncer de pulmão de célula pequena derivado de células de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado.

Neste modelo de xenoenxerto, 25 SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 5 x 106 de células de DMS79/camundongo e as célu- las de DMS79 foram permitidas crescer até que o volume de tumor médio foi ca. 200 mm3. Os camundongos foram em seguida randomizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) com PTA021_A3-Fórmula M conjugado em dois 30 estudos.

Conforme visto na figura 20A, o tratamento com o PTA021_A3- Fórmula M conjugado a 0,3 µmole/kg causou regressão completa do tumor em todos os camundongos através de todo o estudo (dia 88). Conforme visto na figura 20B, o tratamento com o PTA021_A3-Fórmula M conjugado cau- sou regressão do tumor na dose de 0,1umol/kg através do estudo que se completou no dia 60. A dose baixa de 0,03umol/kg causou retardo significan- 5 te no crescimento do tumor.

Exemplo 11: Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo Mediada por PTA021_A3 e não fucosilatado PTA021_A3 Um ensaio de citotoxicidade de fluorescência foi usado para de- terminar a capacidade do PTA021_A3 anti-CADM1 mAb não focusilatado 10 matar células que expressam CADM1 na presença de células efetuadoras via citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC com HepG2, 786- O e DMS79 células). As células efetuadoras humanas foram preparadas de sangue total conforme segue.

As células mononucleares de sangue periférico huma- 15 no foram purificadas de sangue total heparinizado por separação padrão Ficoll-paque.

As células foram resuspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS (inativado por calor) e 200 U/ml de IL-2 humano e incubadas durante a noite a 37ºC.

No dia seguinte, as células foram coletadas e lava- das quatro vezes em meio de cultura e resuspensas a 2 x 107 células/ml.

As 20 células alvos CHO-mesothelin foram preparadas por incubação com reagen- te BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) a 2,5 µl de BATDA por 1 x 106 célu- las alvos/mL por 20 minutos a 37º C.

As células alvos foram lavadas quatro vezes, centrifugadas e trazidas a um volume final de 1 x 105 células/ml.

As células HepG2, 786-O e DMS79 (100 µl de células alvos eti- 25 quetadas, 104 células/cavidade) foram incubadas com 50 µl de células efetu- adoras (106cells/cavidade) e 50 µl de anticorpo (10ug/ml de concentração final). Uma proporção de alvo para efetuadora de 1:25 foi usada através de todos os experimentos.

Em todos os estudos, um controle de isotipo IgG1 humano foi usado como um controle negativo.

As células foram centrifuga- 30 das a 2000 rpm e incubadas por uma hora de incubação a 37º C.

Os sobre- nadantes foram, em seguida, coletados, submetidos a centrifugação e 20 µl de sobrenadante foi transferido para uma placa de fundo plano, a qual 180 µl de solução Eu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foi adicionado e lido em uma leitora RubyStar (BMG Labtech). A % de lisis foi calculada conforme segue: (liberação de amostra - liberação espontânea * 100)/(liberação máxima - li- beração espontânea), onde a liberação espontânea é a fluorescência das 5 cavidades que contêm células alvos mais células efetuadoras e liberação máxima é a fluorescência de cavidades contendo células alvos e foram tra- tadas com 2% de Triton-X.

As figuras 21, 22 e 23 mostram que ambos PTA021_A3 e não fucosilatados PTA021_A3 são capazes de induzir ADCC em células de 10 HepG2, 786-O e DMS79, e que o PTA021_A3 não focusilatado é o anticorpo mais potente.

O mesmo efeito pode ser observado nas outras linhas de célu- la que expressam CADM1 tal como a linha SCLC NCI-H69. Exemplo 12: Anticorpo anti-CADM1/cisplatina inibe crescimento de célula de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo 15 O efeito de PTA021_A3 sozinho e em combinação com cisplati- na no crescimento de SCLC derivado de células de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado.

Neste modelo de xenoenxer- to, SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 5 x 106 de células de DMS79/camundongo e as célu- 20 las de DMS79 foram permitidas crescer até que os tumores alcancem uma média de 200 mm3. Os camundongos foram em seguida randomizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) conforme mostrado no gráfico de volume de tumor.

Conforme visto na figura 24, o tratamento com PTA021_A3 sozi- 25 nho retarda o crescimento do tumor, e em combinação com cisplatina mostra atividade antitumor significante e sinergística.

Exemplo 13: Avaliação da toxicidade de PTA021_A3NF, PTA021_A3, e PTA021_A3-Fórmula M.

O perfil de toxicidade de anti Anticorpos de CADM1, incluindo 30 anticorpos não focusilatados e anticorpo-fármaco conjugados, é avaliado em macacos cynomolgus usando-se, por exemplo, PTA021_A3 e seus deriva- dos.

Os resultados de ensaio de IHC têm mostrado que macacos cynomol-

gus e humanos mostram modelos similares de expressão de CADM1 quan- do submetidos a IHC usando-se PTA021_A3. Adicionalmente, a proteína de CADM1 mostra alta afinidade em cynos e humanos.

Doses Múltiplas IV en- tre, por exemplo, 0,1mg/kg e 100mg/kg são usadas para determinar a dose 5 máxima tolerada para uso para identificar doses apropriadas para ensaios clínicos em humanos.

Um estudo de toxicologia exploratória foi conduzido em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus. 8 macacos cynomolgus de quarto anos de idade não naïve 10 (naïve para biológicos, nas foram previamente tratados em um estudo de farmacocinética de molécula pequena) foram usados no estudo avaliado em dois grupos com dois machos e duas fêmeas em cada grupo.

Os animais no Grupo 1 foram tratados com o não fucosilatado PTA021_A3(NF) anticorpo em uma dose intravenosa única (IV) a 1 mg/kg.

Os animais no Grupo 2 fo- 15 ram tratados com o PTA021_A3 anticorpo em uma dose IV única a 1 mg/kg.

As observações clínicas e mortalidade/morbidez foram avaliadas duas vezes diariamente de manhã e à tarde.

O peso corpóreo, hematologia e química do sangue foram analisados nos dias 11, 0, 1, 3, 8, 15 e 22. As avaliações de hematologia incluem RBC, HGB, HCT, PLT, MCH, MCV, Reti- 20 culócitos, WBC e Contagem Diferencial.

As avaliações químicas do sangue incluem AST, ALT, ALP, CRE, BUN, GLU, CHO, TP, ALB, TBIL, LDH, TG, Ca, P, A/G, K, Na e Cl.

Não existem observações abertas significativas (por exemplo, comportamento de alimentação) durante o estudo.

Não existem efeitos ob- 25 serváveis mos tecidos neuroendócrinos (por exemplo, mudanças hormonais que conduziriam a mudanças comportamentais e sinais de sofrimento). Não existe também evidência de dor ou tremor notado.

As figuras 25 a 32 mos- tram que todas as análises conduzidas estavam dentro dos valores espera- dos normais. 30 As figuras 25A e 25B mostram os dados de peso corpóreo para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

As figuras 26A e 26B mostram is dados de Glicose para maca-

cos machos e macacos fêmeas respectivamente.

As figuras 27A e 27B mostram os dados de Alanina Transami- nase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

As figuras 28A e 28B mostram is dados de Aspartato Transami- 5 nase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

As figuras 29A e 29B mostram os dados de Fosfatase Alcalina para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

As figuras 30A e 30B mostram os dados de Lactato Dehidroge- nase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente. 10 As figuras 31A e 31B mostram os dados de RBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

As figuras 32A e 32B mostram os dados de WBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

Exemplo 14: Avaliação da eficácia de PTA021_A3NF, PTA021_A3, e 15 PTA021_A3-Fórmula M.

CADM1 mostrou-se ser expresso em muitos tipos de câncer por IHC usando-se o PTA021_A3 HuMAb.

Linhas de células representando mo- delos de tumor de câncer são usadas para demonstrar eficácia de Anticor- pos anti-CADM1 conjugados não confirmados e toxina para tratar vários 20 cânceres.

Por exemplo, PTA021_A3 e derivados deste são usados por si ou em combinação com padrões de cuidado em modelos de eficácia de câncer renal (786-O células), melanoma (SkMel28 células) e câncer de pulmão de célula pequena (DMS79 células) onde CADM1 é expresso.

PTA021_A3 e outros anticorpos anti-CADM1 podem ser usados com modelos de animal de 25 xenoenxerto usando-se linhas de células que expressam CADM1 represen- tando cânceres, tais como cânceres neuroendócrinos, câncer de cólon, cân- cer de seio, câncer ovariano, e câncer de próstata.

Todas as referências citadas neste relatório, incluindo sem limi- tação todos os artigos, publicações, patentes, pedidos de patente, apresen- 30 tações, textos, relatórios, manuscritos, brochuras, livros, internet, artigos de jornal, periódicos, folhas de fato de produto, e similares, podem, desse mo- do, ser incorporados por referência em seu relatório em suas totalidades.

A discussão das referências aqui é pretendida para meramente resumir as as- serções feitas por seus autores e nenhuma admissão é feita que qualquer referência constitui técnica anterior e reserve à Requerente o direito de de- safiar a precisão e pertinência das referências citadas. 5 Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para proposta de clareza de com- preensão, será prontamente aparente àqueles versados no assunto à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações po- dem ser feitas a esta sem fugir do espírito ou escopo das reivindicações em 10 anexo.

RESUMO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID SEQ ID

SEQUÊNCIA SEQUÊNCIA NO: NO: 1 VH CDR1 aminoácido 23 VK aminoácido PTA021_A1 PTA021_A2 2 VH CDR1 aminoácido 24 VK aminoácido PTA021_A2 PTA021_A3 3 VH CDR1 aminoácido 25 VH n.t. PTA021_A1 PTA021_A3 4 VH CDR2 aminoácido 26 VH n.t. PTA021_A2 PTA021_A1 5 VH CDR2 aminoácido 27 VH n.t. PTA021_A3 PTA021_A2 6 VH CDR2 aminoácido 28 VK n.t. PTA021_A1 PTA021_A3 7 VH CDR3 aminoácido 29 VK n.t. PTA021_A2 PTA021_A1 8 VH CDR3 aminoácido 30 VK n.t. PTA021_A3 PTA021_A2 9 VH CDR3 aminoácido 31 VH 2-05 linhagem germina- PTA021_A3 tiva aminoácido 10 VK CDR1 aminoácido 32 VH 2-05 linhagem germina- PTA021_A1 tiva aminoácido 11 VK CDR1 aminoácido 33 VH 2-05 linhagem germina- PTA021_A2 tiva aminoácido 12 VK CDR1 aminoácido 34 VK L15 linhagem germina- PTA021_A3 tiva aminoácido

SEQ ID SEQ ID

SEQUÊNCIA SEQUÊNCIA NO: NO: 13 VK CDR2 aminoácido 35 VK L15 linhagem germina- PTA021_A1 tiva aminoácido 14 VK CDR2 aminoácido 36 VK L15 linhagem germina- PTA021_A2 tiva aminoácido 15 VK CDR2 aminoácido 37 VH JH5b linhagem germi- PTA021_A3 nativa aminoácido 16 VK CDR3 aminoácido 38 VH JH5b linhagem germi- PTA021_A1 nativa aminoácido 17 VK CDR3 aminoácido 39 VH JH5b linhagem germi- PTA021_A2 nativa aminoácido 18 VK CDR3 aminoácido 40 JK4 linhagem germinativa PTA021_A3 aminoácido 19 VH aminoácido 41 JK4 linhagem germinativa PTA021_A1 aminoácido 20 VH aminoácido 42 JK4 linhagem germinativa PTA021_A2 aminoácido 21 VH aminoácido 43 CADM1 construct PTA021_A3 22 VK aminoácido 44 CADM1 ECD-6HIS PTA021_A1 45 Conjugado peptídeo

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, um fragmento de anticorpo, ou um mimético de anticor- po que se liga a um epitopo no CADM1 humano reconhecido por um anti- 5 corpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreenden- do a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 19, 20, ou 21, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido colocada em SEQ ID NO: 22, 23, ou 24.

2. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de 10 antígeno do mesmo, um fragmento de anticorpo, ou um mimético de anticor- po que se liga a um epitopo no CADM1 humano reconhecido por um anti- corpo compreendendo CDRs, conforme definido nas figuras 1-3, incluindo DNA e mudanças de aminoácido que mantêm 90% da ligação ao CADM1 humano das sequências originais indiferente da estrutura sob a qual estas 15 CDRs são colocadas.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual o referido anticorpo é um anticorpo de comprimento total de um isotipo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual o 20 referido anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anti- corpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anti- corpo humano, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo projetado re- sultando em ligação aumentada a receptores Fc e/ou potência aumentada para ADCC, e um anticorpo biespecífico. 25

5. Fragmento de anticorpo, como definido na reivindicação 1 ou 2, no qual o fragmento é selecionado a partir do grupo consistindo em: um UniBody, um anticorpo de domínio, e um Nanobody.

6. Mimético de anticorpo, como definido na reivindicação 1 ou 2, no qual o mimético é selecionado a partir do grupo consistindo em: um Affi- 30 body, um DARPin, um Anticalin, um Avímero, um Versabody, e um Duocalin.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que é conju- gado a um agente terapêutico.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, no qual o agente terapêutico é uma citotoxina ou um isótopo radioativo.

9. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual referido anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 na faixa de < 5 50 Nm.

10. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual referido anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 na faixa de < 10 Nm.

11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no 10 qual referido anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 na faixa de < 1 Nm.

12. Composição compreendendo o anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 15

13. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pe- sada ou leve do anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, co- mo definido na reivindicação 1 ou 2.

14. Vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 13. 20

15. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão, como definido na reivindicação 14.

16. Método para preparação de um anticorpo aniti-CADM1, o referido método compreendendo as etapas de: obtenção de uma célula hospedeira que contém uma ou mais moléculas de 25 ácido nucleico que codificam o anticorpo, como definido na reivindicação 1 ou 2; crescimento da célula hospedeira em uma cultura de célula hospedei- ra; provisão de condições de cultura de célula hospedeira nas quais uma ou mais moléculas de ácido nucleico são expressas; e recuperação do anticor- po a partir da célula hospedeira ou da cultura da célula hospedeira. 30 17. Método para tratamento ou prevenção de uma doença asso- ciada com as células alvo que expressam CADM1, o referido método com- preendendo a etapa de administrar a um indivíduo um anticorpo anti-

CADM1, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, em uma quantidade efetiva para tratar ou prevenir a doença.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, no qual referida doença é um câncer humano. 5

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, no qual o referido câncer humano é selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcino- mas), melanoma, câncer de seio, câncer coloretal, câncer ovariano, câncer 10 de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adre- nal, pituitário, do trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepa- tocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblasto- mas, e tumores carcinoides, incluindo aqueles do pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, e rim. 15

20. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, um fragmento de anticorpo, ou um mimético de anticor- po que se liga a um epitopo no CADM1 humano reconhecido por um anti- corpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo em: a se- 20 quência de aminoácido da região variável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:19 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:22; a sequência de aminoácido da região vari- ável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:20 e a sequência de amino- ácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:23; a se- 25 quência de aminoácido da região variável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:21 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:24.

21. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 20, no qual o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anti- 30 corpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anti- corpo humano, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo projetado re- sultando na ligação aumentada a receptores Fc e/ou potência aumentada para ADCC, e um anticorpo biespecífico.

22. Fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, no qual o fragmento é selecionado a partir do grupo consistindo em: um U- niBody, um anticorpo de domínio, e um Nanobody. 5

23. Mimético de anticorpo, como definido na reivindicação 20, no qual o mimético é selecionado a partir do grupo consistindo em: um Affibody, um DARPin, um Anticalin, um Avímero, um Versabody, e um Duocalin.

24. Composição compreendendo o anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 20, e um 10 veículo farmaceuticamente aceitável.

25. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pe- sada ou leve do anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 20.

26. Vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido 15 nucleico, como definida na reivindicação 25.

27. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão, como definido na reivindicação 26.

28. Hibridoma que expressa o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido nas reivindicações 1, 2 ou 20. 20

29. Método de produção do anticorpo, como definido nas reivin- dicações 1, 2 ou 20, compreendendo as etapas de: imunização de um ani- mal transgênico compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recuperação de células-B de referido animal transgêni- co; produção de hibridomas das referidas células-B; seleção dos hibridomas 25 que expressam anticorpos que se ligam a CADM1; e recuperação dos referi- dos anticorpos que se ligam a CADM1 dos referidos hibridomas seleciona- dos.

30. Método de produção de anticorpos anti-CADM1, compreen- dendo as etapas de: imunização de um animal transgênico compreendendo 30 genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recupera- ção de mRNA a partir das células B de referido animal transgênico; conver- são de referido mRNA a cDNA; expressão de referido cDNA em fagos tal que os anticorpos anti-CADM1 codificados por referido cDNA sejam apre- sentados na superfície dos referidos fagos; seleção dos fagos que apresen- tam anticorpos anti-CADM1; recuperação das moléculas de ácido nucleico a partir de selecionados fagos que codificam referidas imunoglobulinas anti- 5 CADM1; expressão das referidas moléculas de ácido nucleico recuperadas em uma célula hospedeira; e recuperação dos anticorpos de referida célula hospedeira que se liga a CADM1.

31. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que se liga a um epitopo no polipeptídeo tendo uma 10 sequência de aminoácido de SEQ ID NOS:43 ou 44 reconhecida por um an- ticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreen- dendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NOS:19, 20, ou 21, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácido colocada em SEQ ID NOS:22, 23, ou 24. 15

32. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que se liga a um epitopo no polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOS:43 ou 44 reconhecida por um an- ticorpo compreendendo CDRs, conforme definido nas figuras 1-3, incluindo DNA e mudanças de aminoácido que mantêm 90% da ligação a CADM1 20 humano das sequências originais independentemente da estrutura sob a qual estas CDRs são colocadas.