BRPI0921286B1 - Composição imunogênica com múltiplos componentes para a prevenção de doença por estreptococos beta-hemolíticos (bhs) - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA COM MÚLTIPLOS COMPONENTES PARA A PREVENÇÃO DE DOENÇA POR ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLÍTICOS (BHS). A presente invenção refere-se a vários polinucleotídeos e polipeptídeos estreptocócicos (Beta)-hemolíticos, particularmente polinucleotídeos da invenção podem ser formulados para uso como composições imunogênicas. Também são descritos métodos para imunização e redução da infecção causada pelos estreptococos (Beta)-hemolíticos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Essa invenção refere-se, de modo geral, a polipeptídeos e polinucleotídeos de estreptococos β-hemolitico (BHS), particularmente polipeptídeos e polinucleotídeos de Streptococcus pyogenes e seu uso em composições imunogênicas com múltiplos componentes para prevenir a doença BHS. Mais especificamente, a invenção refere-se à po- lipeptídeos de Streptococcus pyogenes, que estão localizados na superfície. A invenção refere-se também a composições imunogênicas e métodos de imunização contra e redução da infecção estreptocócica e-hemolítica, que compreendem a combinação de dois ou mais dos polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os critérios fenotípicos tradicionais para a classificação de estreptococos incluem ambas as reações hemolíticas e os grupos so- rológicos de Lancefield. Entretanto, com os avanços taxonômicos, é conhecido agora que espécies não relacionadas de estreptococos β- hemolíticos (BHS) (definida como a lise completa de eritrócitos de ovelha em placas de ágar) podem produzir antígenos de Lancefield idênticos e que cepas geneticamente relacionadas a nível de espécie podem ter antígenos de Lancefield heterogêneos. Apesar dessas exceções às regras tradicionais da taxonomia estreptocócica, as reações hemolíticas e os testes sorológicos de Lancefield podem ser usados ainda para dividir os estreptococos em grandes categorias como a primeira etapa na identificação de isolados clínicos. Ruoff, K.L., R.A. Whiley, and D. Beighton. 1999. Streptococcus. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (eds.), Manual of Clinical Microbiology. American Society of Microbiology Press, Washington D.C.

[0003] Isolados β-hemoliticos com antígeno de Lancefield do gru po A, C ou G podem ser subdivididos em dois grupos: formadores de colônia grande (>0,5 mm de diâmetro) e de colônia pequena (<0,5 mm de diâmetro). As cepas do grupo A (Streptococcus pyogenes), C e G que formam grandes colônias são estreptococos "piogênicos"repletos de uma variedade de mecanismos eficazes de virulência.

[0004] O Streptococcus agalactiae (grupo B) ainda é identificado confiavelmente por sua produção de antígeno do grupo B de Lancefield ou outras características fenotípicas.

[0005] As similaridades entre espécies de BHS incluem não ape nas fatores de virulência, mas também manifestações da doença. In-cluídasnas últimas estão a pneumonia, artrite, abscessos, rinofaringi- te, metrite, sepse puerperal, septicemia neonatal, infecções de lesões, meningite, peritonite, celulite, piodermite, fascite necrotizante, síndro- me do choque tóxico, septicemia, endocardite infecciosa, pericardite, glomerulonefrite e osteomielite.

[0006] O Streptococcus pyogenessão diplococos Gram-positivos que colonizam a faringe e a pele de seres humanos, locais que servem como o reservatório primário para esse organismo. Um parasita obrigatório,essa bactéria é transmitida tanto pelo contato direto de secreções respiratórias quanto pelo contato da mão com a boca. A maioria das infecções por Streptococcus pyogenessão doenças relativamente leves, tais como a faringite e o impetigo. Atualmente, existe algo entre vinte milhões a trinta e cinco milhões de casos de faringite apenas nos U.S., custando cerca de 2 bilhões de dólares em visitas médicas e outras despesas relacionadas. Adicionalmente, as sequelas não supura- tivas tais como a febre reumática, a escarlatina e a glomerulonefrite resultam de infecções por Streptococcus pyogenes. Globalmente, a febre reumática aguda (ARF) é a causa mais comum de doença cardí-acapediátrica (1997. Case definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. CDC).

[0007] Das portas de entrada iniciais, faringe e pele, o Streptococ cus pyogenes pode se disseminar para outras partes do corpo onde as bactérias não são geralmente encontradas, tais como o sangue, musculatura profunda e tecido gorduroso ou para os pulmões e pode causarinfecções invasivas. Duas das formas mais severas, mas menos comuns, de doença invasiva por Streptococcus pyogenessão a fascite necrotizante e a síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS). A fascite necrotizante (descrita como "bactéria devoradora de carne") é uma infecção destrutiva do músculo e do tecido gorduroso. STSS é uma infecção rapidamente progressiva que causa morte e dano aos órgãos internos, tais como rins, fígado e pulmões. A maior parte desse dano é mais devido à toxemia do que ao dano localizado devido ao crescimento bacteriano.

[0008] Em 1995, as infecções invasivas por Streptococcus pyoge nes e STSS tornaram-se doenças de notificação obrigatória. Em contraste com os milhões de indivíduos que adquirem a faringite e o impetigo, os relatos obrigatórios dos casos nos U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) indicaram que em 1997 houve entre 15.000 a 20.000 casos de doença invasiva por Streptococcus pyogenes nos Estados Unidos, resultando em cerca de 2000 mortes (1997. Case definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. CDC). Outros relatos estimam a doença invasiva sendo tão elevada quanto 10 a 20 casos por 100.000 indivíduos por ano (Stevens, D. L. 1995. Streptococcal toxic-shock syndrome: spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in treatment. Emerg Infect Dis. 1:6978). Mais especificamente, dos 15.000 a 20.000 casos de doença in- vasiva, 1100 a 1500 são casos de fascite necrotizante e 1000 a 1400 são casos de STSS, com 20% e 60% de taxa de mortalidade, respec-tivamente.Também incluídos em doenças invasivas graves estão os casos de miosite, que carrega uma taxa de fatalidade de 80% a 100%. Um adicional de 10% a 15% dos indivíduos morrem de outras formas de doença invasiva estreptocócica do grupo A. Esses números têm aumentado desde que a notificação obrigatória foi iniciada em 1995 e refletem uma tendência comum que tem ocorrido ao longo de uma ou duas décadas. Adicionalmente, é de comum acordo que a falta de rigor das definições dos casos resulta em números menores e, portanto, ilusórios, já que muitos casos são solucionados com sucesso devido ao diagnóstico e tratamento precoces antes que a definição tenha sido alcançada.

[0009] Embora o Streptococcus pyogenespermaneça sensível a penicilina e seus derivados, o tratamento não necessariamente erradica o organismo. Aproximadamente 5% a 20% da população humana são portadores dependendo da estação (Stevens, D. L. 1995. Streptococcal toxic-shock syndrome: spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in treatment. Emerg Infect Dis. 1:69-78), apesar da terapia com antibiótico. As razões para isso não estão totalmente claras e podem envolver uma variedade de mecanismos. Em casos de infecções invasivas graves, o tratamento geralmente requer uma intervenção cirúrgica agressiva. Para aqueles casos que envolvem STSS ou uma doença relacionada, a clindamicina (um inibidor da síntese de proteína) é o antibiótico preferido já que ela penetra bem nos tecidos e evita a produção de exotoxina. Existem relatos de alguma resistência à tetraciclina, sulfa e, mais recentemente, à eritromicina. Claramente, permanece a necessidade por composições para evitar e tratar a infecção β-hemolitica.

[00010] Numerosos fatores de virulência têm sido identificados no Streptococcus pyogenes, alguns secretados e alguns localizados na superfície. Embora ele seja encapsulado, a cápsula é composta de ácido hialurônico e não é adequado como candidato a antígeno para inclusão em composições imunogênicas, já que ele é comumente expresso por células de mamíferos e não é imunogênico (Dale, J. B., R. G. Washburn, M. B. Marques, and M. R. Wessels. 1996. Hyaluronate capsule and surface M protein in resistance to opsonization of group A streptococci. Infect Immun. 64:1495-501). O antígeno T e o Grupo de Carboidrato são outros candidatos, mas também desencadeiam anticorpos inter-reativos com o tecido cardíaco. O ácido lipoteicoico está presente na superfície do Streptococcus pyogenes, mas origina preocupações com a segurança similares a LPS.

[00011] As proteínas de superfície mais abundantes pertencem a uma família de proteínas referidas como proteínas M ou "semelhantes a M", devido a sua similaridade estrutural. Apesar dos membros dessa classe ter papéis biológicos similares na inibição da fagocitose, eles possuem, cada um, propriedades únicas de ligação ao substrato. A proteína melhor caracterizada dessa família é a proteína M helicoidal. Os anticorpos direcionados para cepas homólogas de M mostraram ser opsônicos e protetores (Dale, J. B., R. W. Baird, H. S. Courtney, D. L. Hasty, and M. S. Bronze. 1994. Passive protection of mice against group A streptococcal pharyngeal infection by lipoteichoic acid. J Infect Dis. 169:319-23, Dale, J. B., M. Simmons, E. C. Chiang, and E. Y. Chiang. 1996. Recombinant, Ellen, R. P., and R. J. Gibbons. 1972. M protein-associated adherence of Streptococcus pyogenes to epithelial surfaces: prerequisite for virulence. Infect Immun. 5:826-830). Complicando o uso da proteína M como candidata a antígeno está o fato de que existem aproximadamente 100 sorotipos diferentes de proteína M identificados com vários outros não tipificados. Tipicamente, os soroti- pos da Classe I M, exemplificados pelos sorotipos M1, M3, M6, M12 e M18, estão associados com a faringite, escarlatina e febre reumática e não expressam proteínas de ligação à imunoglobulina. Os sorotipos da classe II M, tais como M2 e M49, estão associados com a mais comum das infecções de pele localizadas e as sequelas de glomerulonefrite e expressam proteínas de ligação à imunoglobulina (Podbielski, A., A. Flosdorff, and J. Weber-Heynemann. 1995. The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genes. Infect Immun. 63:9-20). É importante notar que há pouca, se alguma, reatividade cruzada heteróloga de anticorpos para os sorotipos M. Igualmente importante é o papel que esses anticorpos desempenham na febre reumática. Regiões específicas da proteína M desencadeiam anticorpos que interagem com o tecido cardíaco do hospedeiro, causando ou pelo menos se correlacionando com o dano celular (Cunningham, M. W., and A. Quinn. 1997. Immunological crossreactivity be-tween the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Adv Exp Med Biol. 418:887-921, Quinn, A., K. Ward, V. A. Fischetti, M. Hemric, and M. W. Cunningham. 1998. Immunological relationship between the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Infect Immun. 66:4418-24).

[00012] As proteínas M e semelhante a M pertencem a uma grande família de proteínas localizadas na superfície que são definidas pelo motivo LPXTG atingido pela sortase (Mazmanian, S. K., G. Liu, H. Ton-That, and O. Schneewind. 1999. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science. 285:760-3, Ton-That, H., G. Liu, S. K. Mazmanian, K. F. Faull, and O. Schneewind. 1999. Purification and characterization of sortase, the transpeptidase that cleaves surface proteins of Staphylococcus aureus at the LPXTG motif. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:12424-12429). Esse motivo, localizado próximo da terminação carbóxi da proteína, é clivado primeiro pela sortase entre os resíduos de treonina e glicina do motivo LPXTG. Uma vez clivada, a proteína é covalentemente acoplada através da carboxila da treonina a um grupo amida livre da interligação no peptidoglicano, portanto acoplando permanentemente a proteína à superfície da célula bacteriana. Incluída nessa família de proteínas atingidas pela sortase, estão a C5a peptidase (Chen, C. C., and P. P. Cleary. 1989. Cloning and expression of the streptococcal C5a peptidase gene in Escherichia coli: linkage to the type 12 M protein gene. Infect. Immun. 57:1740-1745, Chmouryguina, I., A. Suvorov, P. Ferri- eri, and P. P. Cleary. 1996. Conservation of the C5a peptidase genes in group A and B streptococci. Infect. Immun. 64:2387-2390), adesinas para fibronectina (Courtney, H. S., Y. Li, J. B. Dale, and D. L. Hasty. 1994. Cloning, sequencing, and expression of a fibronectin/fibrinogen- binding protein from group A streptococci. Infect Immun. 62:3937-46, Fogg, G. C., and M. G. Caparon. 1997. Constitutive expression of fibronectin binding in Streptococcus pyogenes as a result of anaerobic activation of rofA. J Bacteriol. 179:6172-80, Hanski, E., and M. Capa- ron. 1992. Protein F, a fibronectin-binding protein, is an adhesion of the group A streptococcus Streptococcus pyogenes. Proc Natl Acad Sci., USA. 89:6172-76, Hanski, E., P. A. Horwitz, and M. G. Caparon. 1992. Expression of protein F, the fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes JRS4, in heterologous streptococcal and enterococcal strains promotes their adherence to respiratory epithelial cells. Infect Immun. 60:5119-5125), vitronectina e o colágeno tipo IV e outras proteínas semelhantes a M que se ligam ao plasminogênio, IgA, IgG, e albumina (Kihlberg, B. M., M. Collin, A. Olsen, and L. Bjorck. 1999. Protein H, an antiphagocytic surface protein in Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 67:1708-14).

[00013] Numerosas proteínas secretadas têm sido descritas, várias das quais são consideradas serem toxinas. A maioria dos Streptococcus pyogenes isolados de doença invasiva grave e da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS) produz exotoxinas piogênicas estreptocócicas (SPE) A e C (Cockerill, F. R., 3rd, R. L. Thompson, J. M. Musser, P. M. Schlievert, J. Talbot, K. E. Holley, W. S. Harmsen, D. M. Ilstrup, P. C. Kohner, M. H. Kim, B. Frankfort, J. M. Manahan, J. M. Steckelberg, F. Roberson, and W. R. Wilson. 1998. Molecular, serological, and clinical features of 16 consecutive cases of invasive streptococcal disease. Southeastern Minnesota Streptococcal Working Group. Clin Infect Dis. 26:1448-58). Outras exotoxinas piogênicas também têm sido identificadas na sequência genômica do Streptococcus pyogenes completada na Universidade de Oklahoma, submetida ao GenBank e designada com o número de acesso AE004092 e já caracterizada (Proft, T., S. Louise Moffatt, C. J. Berkahn, and J. D. Fraser. 1999. Identification and Characterization of Novel Superantigens from Streptococcus pyogenes. J Exp Med. 189:89-102). Outras toxinas tais como a toxina da Síndrome Semelhante ao Choque Tóxico, Superan- tígeno Estreptocócico (Reda, K. B., V. Kapur, D. Goela, J. G. Lamphe- ar, J. M. Musser, and R. R. Rich. 1996. Phylogenetic distribution of streptococcal superantigen SSA allelic variants provides evidence for horizontal transfer of ssa within Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 64:1161-5) e o Fator Mitogênico (Yutsudo, T., K. Okumura, M. Iwasaki, A. Hara, S. Kamitani, W. Minamide, H. Igarashi, and Y. Hinu- ma. 1994. The gene encoding a new mitogenic factor in a Streptococcus pyogenes strain is distributed only in group A streptococci. Infection and Immunity. 62:4000-4004) desempenham papéis menos definidos na doença. A Estreptolisina O também poderia ser considerada um possível candidato a antígeno, porque ela induz a liberação de IL- β. Adicionalmente, uma variedade de enzimas secretadas que têm sido identificadas inclui a Cisteína protease (Lukomski, S., C. A. Montgomery, J. Rurangirwa, R. S. Geske, J. P. Barrish, G. J. Adams, and J. M. Musser. 1999. Extracellular cysteine protease produced by Streptococcus pyogenes participates in the pathogenesis of invasive skin infection and dissemination in mice. Infect Immun. 67:1779-88, Matsu- ka, Y. V., S. Pillai, S. Gubba, J. M. Musser, and S. B. Olmsted. 1999. Fibrinogen cleavage by the Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease and generation of antibodies that inhibit enzyme proteolytic activity. Infect Immun. 67:4326-33), Estreptoquinase (Huang, T. T., H. Malke, and J. J. Ferretti. 1989. The streptokinase gene of group A streptococci: cloning, expression in Escherichia coli, and sequence analysis. Mol Microbiol. 3:197-205, Nordstrand, A., W. M. McShan, J. J. Ferretti, S. E. Holm, and M. Norgren. 2000. Allele substitution of the streptokinase gene reduces the nephritogenic capacity of group A streptococcal strain NZ131. Infect Immun. 68:1019-25), e a Hialuroni- dase (Hynes, W. L., A. R. Dixon, S. L. Walton, and L. J. Aridgides. 2000. The extracellular hyaluronidase gene (hylA) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiol Lett. 184:109-12, Hynes, W. L., L. Hancock, and J. J. Ferretti. 1995. Analysis of a second bacteriophage hyaluronidase gene from Streptococcus pyogenes: evidence for a third hyaluronidase involved in extracellular enzymatic activity. Infect Immun. 63:3015-20).

[00014] Dado ao grande número de fatores de virulência conhecidos produzidos pelo Streptococcus pyogenes, é claro que uma característica importante para uma composição imunogênica estreptocócica β-hemolitica bem sucedida deve ser sua habilidade de estimular uma resposta que possa evitar ou limitar a colonização precoce no processo de infecção. Essa resposta protetora tanto pode bloquear a aderência e/ou intensificar a depuração de células através da opsonofagoci- tose. Os anticorpos para a proteína M têm mostrado ser opsônicos e fornecem um mecanismo que supera as propriedades anti-fagocitose da proteína (Jones, K. F., and V. A. Fischetti. 1988. The importance of the location of antibody binding on the M6 protein for opsonization and phagocytosis of group A M6 streptococci. J Exp Med. 167:1114-23) em grande parte da mesma maneira que os anticorpos anti-sorotipo B capsular têm demonstrado proteção contra a doença causada pelo Haemophilus influenzae (B Madore, D. V. 1998. Characterization of immune response as an indicator of Haemophilus influenzae type b vaccine efficacy. Pediatr Infect Dis J. 17:S207-10). Adicionalmente, os anticorpos específicos para a Proteína F têm mostrado bloquear a aderência e a internalização em células de cultura de tecido (Molinari, G., S. R. Talay, P. Valentin-Weigand, M. Rohde, and G. S. Chhatwal. 1997. The fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes, SfbI, is involved in the internalization of group A streptococci by epithelial cells. Infect Immun. 65:1357-63).

[00015] Permanece a necessidade de desenvolver composições imunogênicas e métodos para evitar ou melhorar infecções causadas por estreptococos β-hemoliticos, incluindo os grupos A, B, C e G. Também permanece uma necessidade de fornecer composições imu- nogênicas que forneçam imunidade para uma ampla faixa de bactérias BHS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00016] Para atingir esses e outras necessidades e a vista de seus propósitos, a presente invenção fornece composições imunogênicas para a proteção de mamíferos suscetíveis contra a colonização ou infecção por estreptococos e-hemolíticos incluindo estreptococos do Grupo A, B, C e/ou D, incluindo aquelas de Streptococcus pyogenes. Essas composições imunogênicas compreendem uma mistura de dois ou mais polipeptídeos como descrita mais completamente abaixo. A invenção também fornece métodos para prevenir ou amenizar tal colonização, em um mamífero suscetível, pela administração de uma quantidade eficaz da composição imunogênica para gerar anticorpos para os polipeptídeos específicos contidos dentro da composição imu- nogênica. A invenção fornece, adicionalmente, polipeptídeos e polinu- cleotídeos de Streptococcus pyogenes, materiais recombinantes e métodos para sua produção. Outro aspecto da invenção refere-se a métodos para usar tais polipeptídeos e polinucleotídeos de Streptococcus pyogenes. Os polipeptídeos e polinucleotídeos também podem ser usados na fabricação de um medicamento para prevenir ou melhorar uma infecção causada pelos estreptococos β-hemoliticos.

[00017] Os polipeptídeos utilizados nas composições imunogênicas da invenção incluem polipeptídeos isolados que compreendem pelo menos uma sequência de aminoácidos da Figura 2, 4, 6, 8 ou 10. A invenção também inclui sequências de aminoácidos que possuem pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das sequências de ami- noácidos precedentes e seus polipeptídeos maduros. A invenção inclui ainda fragmentos imunogênicos e equivalentes biológicos desses poli- peptídeos. Também são fornecidos anticorpos que se liguem imuno- especificamente aos polipeptídeos da invenção.

[00018] Os polinucleotídeos da invenção incluem polinucleotídeos isolados que compreendem as sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo da invenção. Esses polinucleotídeos incluem po- linucleotídeos isolados que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma da Figura 1, 3, 5, 7 ou 9 e também incluem outras sequências de nucleotídeos que, como resultado da degeneração do código genético, também incluem um polipeptídeo da invenção. A invenção também inclui polinucleotídeos isolados que compreendem uma sequência de nucleotídeos que têm pelo menos 90% de identidade com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da invenção e polinucleotídeos isolados que compreendem uma sequência de nucleotídeos que têm pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das sequências de nucleotídeos precedentes. Adicionalmente, os polinucleotídeos isolados da invenção incluemsequências de nucleotídeos que hibridizam sob condições es- tringentes de hibridização com uma sequência de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo da invenção, sequências de nucleotídeos que hibridizam sob condições estringentes de hibridização com qualquer uma das sequências precedentes e sequências de nucleotídeos que são totalmente complementares a esses polinucleotídeos. Adicionalmente, a invenção inclui vetores de expressão e células hospedeiras que compreendem esses polinucleotídeos.

[00019] A invenção também fornece composições imunogênicas que compreendem uma quantidade imunogênica de pelo menos dois ou mais componentes selecionados entre SCP (Figura 2 (SEQ ID NO:2)) e os peptídeos codificados por ORF 554 (peptidilpropil isomerase (Figura 4 (SEQ ID NO:4)), ORF 1218 (proteína hipotética (Figura 6 (SEQ ID NO:6)), ORF 1358 (proteína de adesão putativa (Figura 8 (SEQ ID NO:8)) e ORF 2459 (lipoproteína de superfície (Figura 10 (SEQ ID NO:10)), cada um dos quais compreende um polipeptídeo da invenção em uma quantidade eficaz para prevenir ou amenizar a colonização ou a infecção estreptocócica β-hemolitica em um mamífero suscetível. Cada componente pode compreender o próprio polipeptí- deo ou pode compreender o polipeptídeo e qualquer outra substancia (por exemplo, um ou mais agentes químicos, proteínas, etc.) que podem auxiliar na prevenção ou amenização da colonização ou da infecção estreptocócica β-hemolitica. Essas composições imunogênicas podem compreender ainda pelo menos uma porção do polipeptídeo, opcionalmente conjugada ou ligada a um peptideo, polipeptideo ou proteina ou a um polissacarideo.

[00020] A invenção também inclui métodos de proteção de um mamífero suscetível contra a colonização ou a infecção estreptocócica β- hemolitica. Em uma modalidade, o método compreende administrar a um mamifero uma quantidade eficaz de duas ou mais composições imunogênicas que compreendam uma quantidade imunogênica de um polipeptídeo da invenção, cuja quantidade é eficaz para prevenir ou amenizar a colonização ou a infecção estreptocócica β-hemolitica no mamífero suscetível. Foi descoberto que tais combinações de componentes são eficazes para fornecer tal proteção para uma ampla faixa de grupos e, geralmente, fornecem uma resposta imune maior do que os componentes individuais administrados separadamente. As composições imunogênicas da invenção podem ser administradas por qualquer via convencional, por exemplo, por injeção subcutânea ou intramuscular, ingestão oral ou por via intranasal.

[00021] A invenção fornece ainda composições imunogênicas. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende pelo menos um polipeptídeo da invenção. Em outra modalidade, a composição imunogênica compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção.

[00022] Deve ficar compreendido que a descrição geral precedente e a descrição detalhada a seguir são exemplificadoras da invenção, mas não são restritivas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[00023] A figura 1 apresenta a sequência de ácido nucleico que codifica a C5a peptidase ("SCP"; SEQ ID NO:1). A figura 2 apresenta a sequência de aminoácidos de SCP (SEQ ID NO:2). A figura 3 apresenta a sequência de ácido nucleico da ORF 554 que codifica a peptidilpropil isomerase (SEQ ID NO:3). A figura 4 apresenta a sequência de aminoácidos da pepti- dilpropil isomerase (SEQ ID NO:4). A figura 5 apresenta a sequência de ácido nucleico da ORF 1218 que codifica a proteína hipotética (SEQ ID NO:5). A figura 6 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína hipotética (SEQ ID NO:6). A figura 7 apresenta a sequência de ácido nucleico da ORF 1358 que codifica a proteína de adesão putativa (SEQ ID NO:7). A figura 8 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína de adesão putativa (SEQ ID NO:8). A figura 9 apresenta a sequência de ácido nucleico da ORF 2459 que codifica a lipoproteína de superfície (SEQ ID NO:9). A figura 10 apresenta a sequência de aminoácidos da lipo- proteína de superfície (SEQ ID NO:10). A figura 11 apresenta graficamente o percentual de mortalidade comparado a média dos três componentes ("Trivax" = SCP, pep- tidilpropil isomerase (ORF 554) e proteína de adesão putativa (ORF 1358)) e um componente ("554" = peptidilpropil isomerase (ORF 554)) das composições imunogênicas examinadas no Exemplo 2. As figuras 12 a 16 demonstram graficamente os resultados da transferência de imunidade passiva do Exemplo 3. CFUs = unidades formadoras de colônia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00024] A presente invenção fornece composições imunogênicas para prevenir ou amenizar infecções causadas por estreptococos β- hemolítico, incluindo os grupos A, B, C e G. Dois ou mais dos polipep- tídeos enumerados aqui são combinados para fazer uma composição imunogênica.

[00025] Especificamente, em uma modalidade, uma composição imunogênica dessa invenção compreende uma mistura de dois ou mais polipeptídeos, cada polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico que possui pelo menos 90% de identidade com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: (a) C5a peptidase ("SCP") (Figura 1 (SEQ ID NO:1)); (b) fase de leitura aberta ("ORF") 554 (Figura 3 (SEQ ID NO:3)); (c) ORF 1218 (Figura 5 (SEQ ID NO:5)); (d) ORF 1358 (Figura 7 (SEQ ID NO:7)); e (e) ORF 2459 (Figura 9 (SEQ ID NO:9)).

[00026] Em outra modalidade, uma composição imunogênica dessa invenção compreende uma mistura de dois ou mais polipeptídeos, cadapolipeptídeo possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: (a) SCP (SEQ ID NO:2); (b) peptidilpropil isomerase (Figura 4 (SEQ ID NO:4)); (c) proteína hipotética (Figura 6 (SEQ ID NO:6)); (d) proteína de adesão putativa (Figura 8 (SEQ ID NO:8)); e (e) lipoproteína de superfície (Figura 10 (SEQ ID NO:10)).

[00027] Em outra modalidade, uma composição imunogênica dessa invenção compreende uma mistura de: (a) um polipeptídeo de SCP codificado por uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de ácido nucleico da Figura 1 (SEQ ID NO:1); (b) um polipeptídeo de peptidilpropil isomerase codificado por uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de ácido nucleico da Figura 3 (SEQ ID NO:3); e (c) pelo menos um outro polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico que possui pelo menos 90% de identidade com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de (i) Figura 5 (SEQ ID NO:5); (ii) Figura 7 (SEQ ID NO:7); e (iii) Figura 9 (SEQ ID NO:9).

[00028] Em outra modalidade, uma composição imunogênica dessa invenção compreende uma mistura de: (a) um polipeptídeo de SCP tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da Figura 2 (SEQ ID NO:2); (b) um polipeptídeo de peptidilpropil isomerase que tem pe- lo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da Figura 4 (SEQ ID NO:4); e (c) pelo menos um outro polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de (i) Figura 6 (SEQ ID NO:6); (ii) Figura 8 (SEQ ID NO:8); e (iii) Figura 10 (SEQ ID NO:10).

[00029] As expressões "polinucleotídeo", "ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico"são usadas aqui alternativamente. Essas expressões abrangem nucleotídeos conectados pelas ligações fosfodiés- ter. Um "polinucleotídeo"pode ser um polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou de ácido desoxirribonucleico (DNA) que possui fita simples ou dupla, que contém opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo na forma de um polímero de DNA pode compreender um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou suas misturas. As bases de nucleotídeos são indicadas aqui por um código de letra única: adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C), inosina (I) e uracil (U).

[00030] Os polinucleotídeos estreptocócicos aqui descritos podem ser obtidos usando técnicas de clonagem e rastreamento padronizadas. Esses polinucleotídeos podem ser obtidos, por exemplo, a partir do DNA genômico, de uma biblioteca de cDNA derivada de RNA, de uma biblioteca de DNA genômico ou podem ser sintetizados usando técnicas bem conhecidas e comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, PCR a partir de uma biblioteca de cDNA ou através de RT- PCR (transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase).

[00031] Existem vários métodos disponíveis e bem conhecidos por aqueles versados na técnica para se obter cDNAs de extensão completa ou para prolongar cDNAs curtos, tais como, por exemplo, aqueles baseados nos métodos de amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE). Veja Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988. Modificações recentes da técnica, exemplificadas pela tecnologia MARATHON® (Clontech Laboratories), por exemplo, simplificaram significativamente a pesquisa de cDNAs mais longos. Na tecnologia MARATHON®, os cDNAs tem sido preparados a partir de mRNA extraído de um tecido escolhido e um "adaptador" de sequência ligado em cada extremidade. A amplificação do ácido nucleico (PCR) é então realizada para amplificar a extremidade 5'"ausente" do cDNA usando uma combinação de iniciadores de oligonucleotídeo específico para o gene e específico para o adaptador. A reação de PCR é então repetida usando os iniciadores "nested", ou seja, os iniciadores designados para anelar dentro do produto amplificado (tipicamente um iniciadorespecífico para o adaptador que anela 3' adicional na sequência adaptadora e um iniciador específico para o gene que anela 51 adicional na sequência de gene conhecida). Os produtos dessa reação po-dementão ser analisados pelo sequenciamento de DNA e um cDNA de extensão completa construído tanto pela ligação do produto diretamente ao cDNA existente para fornecer uma sequência completa, quanto pela realização de uma PCR de extensão completa separada usando a nova informação de sequência para o planejamento do iniciador 5'.

[00032] A expressão "recombinante" significa, por exemplo, que um polinucleotídeo é feito por uma combinação artificial de dois ou mais segmentos de polinucleotídeos separados de outra maneira, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de polinucleotídeos isolados usando técnicas de manipulação genética. Um "construto de DNA recombinante" compreende qualquer um dos polinucleotídeos isolados da presente invenção operativamente ligado a pelo menos um elemento regulatório.

[00033] Ortólogos e variantes alélicas dos polinucleotídeos estrep- tocócicos podem ser rapidamente identificadas usando métodos bem conhecidos na técnica. As variantes alélicas e ortólogos dos polinucle- otídeos podem compreender uma sequência de nucleotídeos que é tipicamente pelo menos cerca de 90 a 95% ou mais idêntica a qualquer uma ou mais das sequências de nucleotídeos mostradas nas Figurasímpares 1 a 9 (SEQ ID ímpares Nos 1 a 9) ou seus fragmentos. As variantes alélicas e ortólogos desses polinucleotídeos podem codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a sequência de aminoácidos descrita em qualquer uma ou mais das Figuras pares 2 a 10 (SEQ ID pares Nos 2 a 10). Tais polinucleotídeos podem ser rapidamente identificados como sendo capazes de hibridizar sob condições estringentes a qualquer um ou mais dos polinucleotídeos que possuem uma sequência de nucleotídeos descrita nas Figuras 1 a 9 (SEQ ID ímpares Nos. 1 a 9) ou seus fragmentos.

[00034] É bem compreendido por aquele versado na técnica que vários níveis de identidade de sequência são úteis na identificação de sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos relacionados. Os alinhamentos de sequência e cálculos de percentual de identidade podem ser realizados usando o programa MEGALIGN® da suíte de computação de bioinformática LASERGENE™ (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Alinhamentos múltiplos de sequência podem ser realizados usando o método Clustal de alinhamento (Higgins and Sharp, Gene, 73(1):237-44, 1988) com os parâmetros padronizados de, por exemplo, PENALIDADE DE LACUNA = 10 e PENALIDADE DE EXTENSÃO DE LACUNA = 10. Os parâmetros padronizados para alinhamentos pareados usando o método Clustal podem ser, por exemplo, KTUPLE 1, PENALIDADE DE LACUNA = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SALVAS = 5.

[00035] Uma sequência de polipeptídeo da invenção pode ser idêntica a uma sequência citada, ou seja, 100% idêntica ou ela pode incluir até um certo número de alterações de aminoácido quando comparada com a sequência de referencia tal que o % de identidade seja menor do que 100%. Tais alterações incluem pelo menos uma deleção, substituição de aminoácidos, incluindo a substituição conservativa e não conservativa ou inserção. As alterações podem ocorrer nas posições amino ou carboxi terminais da sequência do polipeptídeo de referencia ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, interposta individualmente entre os aminoácidos na sequência de aminoácidos de referencia ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de aminoácidos de referência.

[00036] Portanto, a invenção também fornece polipeptídeos isolados que possuem identidade de sequência com as sequências de aminoácidos contidas nas sequências citadas aqui. Dependendo da sequência em particular, o grau de identidade de sequência é preferivelmente maior do que 90% (por exemplo, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais). Essas proteínas homólogas incluem mutantes e variantes aléli- cas.

[00037] "Identidade", como conhecida na técnica, é um relacionamento entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, como determinado pela comparação das sequências. Na técnica, "identidade"também significa o grau de relacionamento de sequência entre sequências de polipeptí- deo ou polinucleotídeos, dependendo do caso, como determinada pela combinação entre as fitas de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos que incluem, mas não se limitam aqueles descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a identidade são planejados para fornecer a maior combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos em programa de computador preferidos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem, mas não se limitam ao pacote de programas GCG (Devereux, J., et al. 1984), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F., et al., 1990. O programa BLASTX está disponível para o público através da NCBI e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., 1990.). O algoritmo de Smith Waterman, bem conhecido, também pode ser usado para determinar a identidade.

[00038] Por exemplo, o número de alterações de aminoácidos para um dado % de identidade pode ser determinado pela multiplicação do número total de aminoácidos em uma das Figuras pares numeradas de 2 a 10 (SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 10) pelo percentual numérico do respectivo percentual de identidade (divido por 100) e depois subtraindo aquele produto do dito número total de aminoácidos em uma das Figuras pares numeradas de 2 a 10 (SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 10) ou: na< xa - (xa . y),

[00039] em que na é o número de alterações de aminoácidos, xa é o número total de aminoácidos em uma das Figuras pares numeradas de 2 a 10 (SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 10) e y é, por exemplo, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, etc. e em que qualquer produto de xa e y que não seja um número inteiro é arredondado para baixo até o número inteiro mais próximo antes de subtrai-lo de xa.

[00040] A presente invenção também contempla polipeptídeos isolados que são substancialmente conservados através das cepas de estreptococos β-hemoliticos. Adicionalmente, os polipeptídeos que são substancialmente conservados através das cepas de estreptococos β- hemolíticos e que são eficazes na prevenção ou amenização da colonização ou infecção estreptocócica e-hemolítica em um indivíduo suscetível também são contemplados pela presente invenção. Como usado aqui, a expressão "conservado" refere-se, por exemplo, ao número de aminoácidos que não sofrem inserções, substituições e/ou dele- ções como um percentual do número total de aminoácidos em uma proteína. Por exemplo, se uma proteína é 90% conservada e tem, por exemplo, cerca de 263 aminoácidos, então ela tem 237 posições de aminoácidos na proteína nas quais os aminoácidos não sofreram substituição. Igualmente, se uma proteína é 95% conservada e tem, por exemplo, cerca de 280 aminoácidos, então existem 14 posições de aminoácidos nas quais os aminoácidos podem sofrer substituição e 266 (isto é, 280 menos 14) posições de aminoácidos que não sofrem substituição. De acordo com uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo isolado é preferivelmente pelo menos cerca de 90% conservado através das cepas de estreptococos e-hemolíticos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% conservado através das cepas, até mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% conservado através das cepas e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% conservado através das cepas, sem limitação.

[00041] Modificações e alterações podem ser feitas na estrutura dos polipeptídeos e ainda se obter polipeptídeos que tenham atividade estreptocócica e-hemolítica e/ou atividade de Streptococcus pyogenes e/ou antigenicidade. Como é a capacidade interativa e a natureza de um polipeptídeo que definem a atividade funcional biológica do poli- peptídeo, certas substituições na sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de polipeptídeo (ou, é claro, sua sequência codificadora de DNA subjacente) e ainda assim se obter um poli- peptídeo com propriedades semelhantes.

[00042] A invenção inclui qualquer polipeptídeo isolado que tem um equivalente biológico que fornece a reatividade desejada como aqui descrito. A expressão "reatividade desejada" refere-se à reatividade que pode ser reconhecida por uma pessoa versada na técnica como sendo um resultado útil para os propósitos da invenção. Exemplos de reatividade desejada estão aqui descritas, incluindo sem limitação, os níveis desejados de proteção, os títulos de anticorpo desejado, a atividade de opsonofagocitose desejada e/ou a reatividade cruzada desejada, tal como pode ser reconhecida por uma pessoa versada na técnica como sendo um resultado útil para os propósitos da invenção. A atividade de opsonofagocitose desejada é indicada por um percentual de morte da bactéria como medido pela diminuição das unidades formadoras de colônia (CFU) em OPA versus um controle negativo. Sem estar limitado a isso, a atividade de opsonofagocitose desejada é preferivelmente de pelo menos 15%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 20%, até mais preferivelmente pelo menos cerca de 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% e o mais preferivelmente pelo menos 60%.

[00043] A invenção inclui polipeptídeos que são variantes dos poli- peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos das Figuras pares numeradas de 2 a 10 (SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 e 10). "Variante" como a expressão usada aqui, inclui um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo de referencia, mas retém as propriedades essenciais. Geralmente, as diferenças são limitadas tal que as sequências do polipeptídeo de referencia e da variante são muito semelhantes globalmente e, em várias regiões, idênticas (isto é, biologicamente equivalentes). Um polipeptídeo variante e de referencia pode diferir na se- quência de aminoácidos por uma ou mais substituições, adições ou deleções em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substituído ou inserido pode ou não ser codificado pelo código genético. Uma variante de um polipeptídeo pode ser uma que ocorra naturalmente tal como uma variante alélica ou ela pode ser uma variante que não é conhecida como ocorrendo naturalmente. Variantes que não ocorrem naturalmente de polipeptídeos podem ser feitas por síntese direta ou por técnicas de mutagênese.

[00044] Ao fazer tais alterações, o índice hidropático dos aminoáci- dos pode ser considerado. A importância do índice hidropático de ami- noácido em conferir função biológica interativa em um polipeptídeo é comumente conhecida na técnica (Kyte & Doolittle, 1982). É sabido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoáci- dos que possuem índice ou escore hidropático similar e ainda resultar em um polipeptídeo com atividade biológica similar. Cada aminoácido tem um índice hidropático atribuído com base em sua hidrofobicidade e características de carga. Esses índices estão listados entre parênteses depois de cada aminoácido como se segue: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteina/cisteina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glu- tamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

[00045] Acredita-se que o caráter hidropático relativo do resíduo de aminoácido determina a estrutura secundária e terciária do polipeptí- deo resultante, o que por sua vez define a interação do polipeptídeo com outras moléculas, tais como enzimas, substratos, receptores, anticorpos,antígenos e semelhantes. É conhecido na técnica que um aminoácido pode ser substituído por outro aminoácido que possua um índice hidropático similar e ainda se obter um polipeptídeo funcional- mente equivalente. Em tais alterações, as substituições de aminoáci- dos cujos índices hidropáticos estejam dentro de +/-2 são preferidas, aquelas que estão dentro de +/-1 são particularmente preferidas e aquelas dentro de +/-0,5 são mais particularmente preferidas.

[00046] A substituição por aminoácidos semelhantes também pode ser feita com base na hidrofilicidade, particularmente onde o polipeptí- deo ou peptídeo equivalente funcional biológico é pretendido para uso em modalidades imunológicas. A Patente U.S. No 4.554.101, incorporada aqui por referencia, estabelece que a maior hidrofilicidade local média de um polipeptídeo, como governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com sua imunogenici- dade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica do poli- peptídeo.

[00047] Como detalhado na Patente U.S. No 4.554.101, incorporada aqui por referencia, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); as- partato (+3,0 ±1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ±1); treonina (-0,4); alanina (0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leu- cina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); e tripto- fano (-3,4). É entendido que um aminoácido possa ser substituído por outro que possua um valor de hidrofilicidade similar e ainda se obter um polipeptídeo biologicamente equivalente e, em particular, imunolo- gicamente equivalente. Em tais alterações, as substituições de amino- ácidos cujos valores de hidrofilicidade estejam dentro de ±2 são prefe-ridas, aquelas que estão dentro de ±1 são particularmente preferidas e aquelas dentro de ±0,5 são mais particularmente preferidas.

[00048] Como delineado acima, as substituições de aminoácidos são, portanto, geralmente baseadas na similaridade relativa das cadeias laterais dos aminoácidos substituintes, por exemplo, sua hidro- fobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e semelhantes. Substituições exemplificadoras que levam várias das características precedentes em consideração são bem conhecidas daqueles versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treoni- na; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina. Como mostrado na Tabela 1, as substituições de aminoácidos adequadas incluem as seguintes: TABELA 1:

[00049] Portanto, a invenção inclui equivalentes funcionais ou biológicos dos polipeptídeos das sequências nas Figuras pares numeradas de 2 a 10 (SEQ ID Nos.: 2, 4, 6, 8 e 10) que contenham uma ou mais substituições de aminoácidos.

[00050] Equivalentes biológicos ou funcionais de um polipeptídeo também podem ser preparados usando a mutagênese específica para o sítio. A mutagênese específica para o sítio é uma técnica útil na preparação de uma segunda geração de polipeptídeos ou polipeptídeos equivalentes biologicamente, funcionalmente, derivados de suas sequências, através da mutagênese específica do DNA subjacente. Como observado acima, tais alterações podem ser desejáveis onde substituições de aminoácidos são desejáveis. A técnica fornece ainda uma habilidade pronta para preparar e testar variantes de sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações precedentes, pela introdução de uma ou mais alterações da sequência de nucleotí- deos no DNA. A mutagênese específica ao sítio permite a produção de mutantes através do uso de sequências de oligonucleotídeo específicas que codificam a sequência de DNA da mutação desejada, assim como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, para fornecer uma sequência de iniciador de tamanho suficiente e complexidade de sequência suficientes para formar um dúplice estável em ambos os lados da junção da deleção a ser atravessada. Tipicamente, um iniciador de cerca de 17 a 15 nucleotídeos de extensão é preferido, com cerca de 5 a 10 resíduos em ambos os lados da junção da sequência a ser alterada.

[00051] Em geral, a técnica da mutagênese específica para o sítio é bem conhecida na técnica. Como será apreciado, a técnica tipicamente emprega um vetor de fago que pode existir em ambas as formas de fita simples e fita dupla. Tipicamente, a mutagênese direcionada ao sítio de acordo com isso é realizada primeiro pela obtenção de um vetor de fita simples que inclui dentro de sua sequência uma sequência de DNA que codifica toda ou uma porção da sequência selecionada de polipeptídeo de Streptococcus pyogenes. Um iniciador de oligonucleo- tídeo que abriga a sequência mutada desejada é preparado, por exemplo, por técnicas bem conhecidas (por exemplo, sinteticamente). Esse iniciador é anelado com o vetor de fita simples e prolongado pelo uso de enzimas , tal como o fragmento de Klenow da polimerase I de E. coli, a fim de completar a síntese da fita que abriga a mutação. Portanto,é formado um hetero-dúplice onde uma fita codifica a sequência original não mutada e a segunda fita abriga a mutação desejada. Esse vetor de heterodúplice é então usado para transformar células apropriadas, tais como células de E. coli e os clones que são selecionados incluem vetores recombinantes que abrigam a mutação. Kits comercialmentedisponíveis fornecem os reagentes necessários.

[00052] Os polipeptídeos e antígenos de polipeptídeo da invenção são compreendidos incluir qualquer polipeptídeo que compreende similaridade de sequência substancial, similaridade estrutural e/ou similaridade funcional com um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma Figuras pares numeradas de 2 a 10 (SEQ ID Nos.: 2, 4, 6, 8 e 10). Adicionalmente, um polipeptídeo ou antígeno de polipeptídeo da invenção não está limitado a uma fonte em particular. Portanto, a invenção fornece a detecção e o isolamento gerais dos polipeptídeos de uma variedade de fontes.

[00053] Os polipeptídeos da invenção podem estar na forma da proteína "madura" ou pode ser parte da sequência de aminoácidos que contém, por exemplo, sequências secretórias ou líder, pró-sequências, sequências que auxiliam na purificação tal como resíduos múltiplos de histidina ou uma sequência adicional para a estabilidade durante a produção recombinante.

[00054] A expressão "composição imunogênica"como usada aqui refere-se a qualquer tipo de agente biológico em uma forma adminis- trável capaz de estimular uma resposta imune em um indivíduo inoculado com a composição imunogênica. Uma resposta imune pode incluir a indução de anticorpos e/ou a indução de uma resposta de célula T. A expressão "proteção", quando usada em referencia a uma composição imunogênica, refere-se aqui a melhora (seja parcial ou completa) de qualquer um dos sintomas associados com a doença ou condição em questão. Portanto, a proteção de indivíduos contra infecção por espécies de Estreptococos tais como S. dysgalactiae (incluindo as subespéciesDysgalactiae e Equisimilis) pelas presentes composições imunogênicas, geralmente resulta em uma diminuição do crescimento bacteriano e/ou de um ou mais dos sintomas clínicos associados com a infecção estreptocócica, incluindo artrite, endocardite, meningite, po- liserosite, broncopeneumonia, meningite, perda permanente da audição e choque séptico.

[00055] Os métodos descritos aqui podem incluir a indução de uma resposta imune contra um ou mais patógenos que incluem uma espécie de Estreptococos (por exemplo, Streptococcus dysgalactiae, S. dysgalactiae sub. Equisimilis, S. dysgalactiae sub. Dysgalactiae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. anginosus, S. constellatus, S. equisimilis e S. intermedius). Por exemplo, os métodos podem incluir a indução da produção de anticorpo policlonal contra um ou mais patógenos estrep- tocócicos, tais S. dysgalactiae sub. Equisimilis.

[00056] Como discutido acima, as composições imunogênicas compreendem dois ou mais polipeptídeos da invenção, Para fazer isso, um ou mais polipeptídeos são ajustados para uma concentração apropriada e podem ser formulados com qualquer adjuvante adequado, diluente, veículo farmaceuticamente aceitável ou qualquer combinação desses. Como usada aqui, a frase "veículo farmaceuticamente aceitável" é pretendida incluir qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e que retardam a absorção, excipientes e semelhantes,compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Veículos fisiologicamente aceitáveis podem ser usados como transportadores e/ou diluentes. Um veículo farmaceuti- camente aceitável é compreendido designar um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica ou imunogênica que não causa efeitos colaterais e que torna possível, por exemplo, facilitar a administração do composto ativo, aumentar sua vida e/ou sua eficácia no corpo, aumentar sua solubilidade na solução ou alternativamente intensificar sua conservação. Esses veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados pelas pessoas versadas na técnica de acordo com a natureza e o modo de administração do composto ativo escolhido. Esses incluem, mas não são limitados à água, solução de Ringer, um meio isotônico apropriado, glicerol, etanol e outros solventes convencionais, salina tamponada com fosfato e semelhantes.

[00057] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Par- sippany, NJ) ou salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida à medida que exista facilidade de seringabilidade. Ela deve ser estável sob condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contenha, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e semelhantes) e misturas adequadas desses. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho da partícula requerido no caso de uma dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser obtida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol, ácido ascórbico e semelhantes. Em muitos casos, os agentes isotônicos são incluídos na composição, por exemplo, açúcares,poliálcoois tais como manitol, sorbitol e/ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00058] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação dos polipeptídeos na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguida pela esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são a secagem a vácuo e a liofilização que fornece um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.

[00059] As composições imunogênicas como aqui descritas também compreendem, em certas modalidades, um ou mais adjuvantes. Um adjuvante é uma substancia que intensifica a resposta imune quando administrada junto com um imunógeno ou antígeno. Várias citocinas ou linfocinas têm mostrado possuir atividade imune modula- dora e, portanto, são úteis como adjuvantes incluindo, mas não limitadasàs interleucinas 1-α, 1-β, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 10, 12 (veja, por exemplo, a Pat. U.S. No 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e suas formas mutantes), os interferons α, β e Y; o fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) (veja, por exemplo, a Pat. U.S. No. 5.078.996 e numero de acesso ATCC 39900); fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF); fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF); e os fatores α e β de necrose do tumor. Outros adjuvantes que são úteis com as composições imunogê- nicas aqui descritas incluem as quimiocinas, incluindo sem limitação, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, e RANTES; moléculas de adesão tais como uma selectina, por exemplo, L-selectina, P-selectina e E-selectina; moléculas semelhantes à mucina, por exemplo, CD34, GlyCAM-1 e Mad- CAM-1; um membro da família da integrina tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e p150.95; um membro da superfamília da imunoglobulina A, tal como PECAM, ICAMs, por exemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3; moléculas co-estimuladoras tais como CD40 e CD40L; fatores de crescimento incluindo o fator de crescimento vascular, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1, e fator de crescimento en- dotelial vascular; moléculas receptoras incluindo Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, e DR6; e Caspase (ICE).

[00060] Adjuvantes adequados usados para intensificar uma resposta imune incluem adicionalmente, sem limitação, MPL® (3-O- deacilatado monofosforil lipídeo A, Corixa, Hamilton, MT), que é descrito na Pat. U.S. No 4.912.094.Também são adequados para uso como adjuvantes os análogos sintéticos do lipídeo A ou compostos de fosfato de aminoalquil glicosamina (AGP), ou seus derivados ou análogos, que são disponibilizados por Corixa (Hamilton, MT), e que estão descritos na Pat. U.S. No 6.113.918. Um de tais AGP é 2-[(R)-3- Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Deoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)- 3-tetradecanoioxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil- amino]-b-D-glicopiranosídeo, que também é conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC529). Esse adjuvante 529 é formulado em forma aquosa (AF) ou como uma emulsão estável (SE).

[00061] Outros adjuvantes incluem os peptídeos de muramil, tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil- normuramil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)- etilamina (MTP-PE); emulsões de óleo em água, tais como MF59 (Pat. U.S. No 6.299.884) (contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo quantidades variáveis de MTP-PE) formuladas em partículas submicronicas usando um micro- fluidizador tal como o microfluidizador Model 110I (Microfluidics, Newton, MA)), e SAF (contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado com plurônico, e thr-MDP, tanto mi- crofluidizado em uma emulsão submicronica quanto centrifugado para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior); sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio; Amphigen; Avridine; L121/esqualeno; D-lactídeo- polilactídeo/glicosídeo; polióis pluronicos; Bordetella morta; saponinas, tais como Stimulon® QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrito na Pat. U.S. No 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descrito na Pat. U.S. No. 5.254.339 e complexos imunoestimulan- tes (ISCOMS); Micobacterium tuberculosis; lipopolissacarídeos bacte- rianos; polinucleotideos sintéticos tais como oligonucleotideos que contêm um motivo CpG (por exemplo, Pat. U.S. No 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), descrita nas Patentes Europeias Nos 1.296.713 e 1.326.634; toxina pertussis (PT) ou seu mutante, toxina da cólera ou seu mutante (por exemplo, Pat. U.S. Nos. 7.285.281, 7.332.174, 7.361.355 e 7.384.640); ou uma toxina termolábil de E. coli (LT) ou seu mutante, particularmente LT-K63, LT-R72 (por exemplo, Pat. U.S. Nos 6.149.919, 7.115.730 e 7.291.588).

[00062] O polipeptídeo pode incluir também pelo menos uma porção do polipeptídeo, opcionalmente conjugado ou ligado a um peptí- deo, polipeptídeo ou proteína ou a um polissacarídeo. Também é previsto que as composições imunogênicas podem conter outros compo- nentes, tais como polissacarídeos, isolados ou conjugados com proteínas que podem desencadear uma resposta imune.

[00063] Vários testes são usados para avaliar a imunogenicidade in vitro dos polipeptídeos que compreendem as composições imunogêni- cas da invenção. Por exemplo, um ensaio opsônico in vitro é realizado pela incubação de uma mistura de células de Streptococcus sp., soro inativado pelo calor contendo anticorpos específicos para o polipeptí- deo em questão e uma fonte de complemento exógena. A opsonofa- gocitose ocorre durante a incubação de células polimorfonucleares (PMN) isoladas frescas e a mistura de anticorpo/complemento/ células de Streptococcus sp. As células bacterianas que são revestidas pelo anticorpo e o complemento são mortas depois da opsonofagocitose. As unidades formadoras de colônia (cfu) das bactérias sobreviventes que escapam da opsonofagocitose são determinadas pelo plaquea- mento da mistura do ensaio. Os títulos são relatados como a recíproca da diluição mais alta que fornece > 50% de morte bacteriana, como determinado pela comparação dos controles do ensaio. Os espécimes que demonstram menos do que 50% de morte bacteriana na diluição de soro mais baixa testada (1:8) são relatados como possuindo um título de 4 de anticorpo de opsonofagocitose (OPA). O método descrito acima é uma modificação do método de Gray (Gray, Conjugate Vaccines Supplement, pp. 694-697, 1990).

[00064] Um controle de soro de teste, que contém o soro de teste mais as células bacterianas e complemento inativado pelo calor, é incluído para cada soro individual. Esse controle é usado para avaliar se a presença de antibióticos ou outros componentes séricos é capaz de matar a cepa bacteriana diretamente, isto é, na ausência de complemento ou PMNs). Um soro humano com um título opsônico conhecido é usado como soro de controle positivo humano. O título de anticorpo opsônico para cada soro desconhecido é calculado como a recíproca da diluição inicial do soro que fornece 50% de redução de cfu comparado com o controle sem soro.

[00065] Um ensaio ELISA de célula completa também pode ser usado para avaliar a imunogenicidade in vitro e a exposição na superfície do antígeno polipeptídico, em que a cepa bacteriana de interesse é revestida sobre uma placa, tal como uma placa de 96 poços, e os soros de teste de um animal imunizado são reagidos com as células bacterianas. Se qualquer anticorpo específico para o antígeno do poli- peptídeo de teste é reativo com um epítopo exposto na superfície do antígeno polipeptídico, ele pode ser detectado por métodos padronizados conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma abordagem similar é monitorizar o antígeno sobre a superfície da célula usando a Citometria de Fluxo e anticorpos específicos para o antígeno.

[00066] Qualquer polipeptídeo que demonstre a atividade desejada in vitro pode então ser testado em um modelo de inoculação em animal in vivo. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas são usadas na imunização de um animal (por exemplo, um camundongo) por métodos e vias de imunização conhecidas por aqueles versados na técnica (por exemplo, intranasal, parenteral, intramuscular, oral, retal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, etc.). Depois da imunização do animal com a composição imuno- gênica estreptocócica, o animal é inoculado com uma ou mais espécies de estreptococos e ensaiado quanto à resistência a infecção por Streptococcus spp.

[00067] A combinação de composições imunogênicas é fornecida pela inclusão de dois ou mais dos polipeptídeos da invenção, assim como pela combinação de um ou mais dos polipeptídeos da invenção com um ou mais polipeptídeos conhecidos de Streptococcus pyogenes, incluindo, mas não limitados a proteínas M, adesinas e semelhantes.

[00068] Uma vez formuladas, as composições imunogênicas da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo, liberadas para as células ex vivo derivadas do indivíduo ou in vitro para expressão de proteínas recombinantes. Para liberação direta para o indivíduo, a administração pode ser por qualquer forma convencional, tal como por via intranasal, parenteral, oral, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea ou tópica aplicada a qualquer superfície mucosa tal como a superfície intranasal, oral, do olho, do pulmão, vaginal ou retal, tal como um spray em aerossol.

[00069] É vantajoso formular as composições oral ou parenteral em uma forma de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária, como usada aqui, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagensunitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de dosagem unitária da invenção é ditada e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico em particular a ser alcançado e as limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento dos indivíduos.

[00070] As preparações injetáveis, por exemplo, suspensões injetá-veisestéreis aquosas ou oleosas, são preparadas de acordo com a técnica conhecida usando agentes de dispersão ou umectantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um dilu- ente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol.

[00071] Para a administração parenteral, as composições imunogê- nicas da invenção podem ser administradas como dosagens injetáveis em um diluente fisiologicamente aceitável que pode ser um líquido estéril tal como a água, óleos, salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, substancias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsifican- tes, tensoativos, substancias para o tamponamento do pH e semelhantes podem estar presentes nas composições. Outros componentes podem incluir aqueles de origem no petróleo, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, os glicóis tais como o propileno glicol ou polietileno glicol, são os veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis.

[00072] Tipicamente, as composições são preparadas como injetáveis, tanto como soluções quanto como suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção, também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas ou micro- partículas tais como de polilactídeo, poliglicolídeo ou copolímero para o efeito adjuvante intensificado como discutido acima (veja, Langer, Science 249: 1527 (1990) e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). As composições imunogênicas dessa invenção podem ser administradas na forma de uma injeção de depósito ou preparação em implante, que pode ser formulada de tal maneira a permitir uma liberação mantida ou pulsátil do ingrediente ativo.

[00073] Os indivíduos são geralmente humanos. Uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica em um número de doses apropriado é administrada ao indivíduo para desencadear uma resposta imune. Uma quantidade imunologicamente eficaz, como usada aqui, significa que a administração daquela quantidade a um hospedeiro mamífero (preferivelmente um ser humano), tanto em uma dose única quanto como parte de uma série de doses, suficiente para, pelo menos, induzir o sistema imune do indivíduo tratado a gerar uma resposta imune que reduza o impacto clínico da infecção bacteriana. A expressão "resposta imune" ou "resposta imunológica"inclui o desen-volvimento da resposta humoral (mediada por anticorpo) e/ou celular (mediada por células T específicas para o antígeno ou seus produtos de secreção). A proteção pode ser conferida por uma única dose da composição imunogênica ou pode necessitar da administração de várias doses, em adição a doses de reforço em períodos mais tardios para manter a proteção. Isso pode variar entre uma diminuição mínima da carga bacteriana à prevenção da infecção. Idealmente, o indivíduo tratado não exibirá as manifestações clínicas mais graves da infecção estreptocócica β-hemolitica. A quantidade da dosagem pode variar dependendo de condições específicas do indivíduo, tais como idade e peso. Essa quantidade pode ser determinada por testes de rotina por meios conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00074] Em aplicações profiláticas, as composições imunogênicas são administradas a um indivíduo suscetível ou em risco de outra maneira a uma infecção estreptocócica beta hemolítica em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a severidade ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença associados com a infecção, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Nas aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um indivíduo suspeito ou que já sofre de uma doença, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos suprimir parcialmente os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[00075] Foi observado que não há uma sequência peptídica única que forneça proteção para todas as cepas de BHS, incluindo os grupos A, B, C e G. Como mostrado na Tabela II (apresentada no Exemplo 1 abaixo), cada antígeno fornece uma resposta imune contra um subgrupo desses grupos.

[00076] Geralmente, qualquer combinação de dois ou mais antíge- nos expostos na superfície de BHS será esperada fornecer uma resposta imune intensificada descrita acima. Isso pode incluir os antíge- nos discutidos acima, antígenos capsulares de BHS, proteína M, transportador ABC ou qualquer outro antígeno de superfície exposto. Entretanto, foi encontrado que os seguintes antígenos exibem propriedades particularmente benéficas para a produção de composições imunogênicas: SCP (C5a peptidase) peptidilpropil isomerase (codificada pela ORF 554) proteína de adesão putativa (codificada pela ORF 1358) lipoproteína de superfície (codificada pela ORF 2459) proteína hipotética (codificada pela ORF 1218)

[00077] A combinação de dois ou mais desses antígenos em uma única composição imunogênica com múltiplos componentes fornece proteção intensificada contra um ou mais grupos de BHS e produz uma resposta imune intensificada a eles.

EXEMPLOS

[00078] Os exemplos a seguir são ilustrativos e a presente invenção não é pretendida ser limitada por eles.

EXEMPLO 1 - LIGAÇÃO AO ANTICORPO

[00079] A ligação de anticorpos a bactérias, um processo conhecido como opsonização, pode levar a absorção e morte das bactérias pelas células fagocitárias. O rastreamento de tais anticorpos é usado na determinação da eficácia dos anticorpos surgidos contra sorotipos particulares em matar as bactérias que expressam ou não expressam aquele sorotipo na superfície.

[00080] Para cada sorotipo rastreado, anticorpos foram gerados em camundongos contra os anticorpos codificados pela ORF citada. Os anticorpos foram rastreados contra várias cepas de BHS. O rastrea- mento dos anticorpos foi realizado pela classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Resumidamente, estreptococos mortos pelo calor foram incubados com um anticorpo citado sobre gelo por 45 minutos, seguido por duas lavagens. Os estreptococos foram incubados depois com um anticorpo anticamundongo de cabra Alexa-488 (mole-cular Probes, Eugene, OR) por 30 minutos sobre gelo, seguido por duas lavagens. As células assim tratadas foram corridas em uma máquina de FACS (por exemplo, veja DeMaster et al., Infect. Immun. 70(1):350-359, 2002). Os resultados estão resumidos na Tabela 2.

[00081] No decorrer do rastreamento daqueles antissoros anti- estreptococos beta hemolíticos e dos anticorpos monoclonais contra várias cepas de estreptococos beta hemolíticos (BHS), foi observado que alguns anti-soros e anticorpos eram inter-reativos contra várias cepas de BHS, incluindo membros do grupo de Streptococcus pyogenes (estreptococos do Grupo A), Streptococcus agalactiae (estrepto- cocos do Grupo B) e estreptococos do Grupo C e do Grupo G (que inclui as espécies estreptocócicas Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, Streptococcus dysga- lactiae sub. Equisimilis e Streptococcus dysgalactiae sub. Dysgalacti- ae). Essa reatividade cruzada também significa que os polipeptídeos citados ou codificados pela ORF relevante podem ser usados em uma composição imunogênica para induzir uma resposta imune eficaz para proteger contra a infecção por Estreptococos do Grupo A ou do Grupo B, assim como por Estreptococos do Grupo C ou do Grupo G.

[00082] Na Tabela 2, o símbolo "+" significa que o anticorpo reage com o antígeno pelo menos três vezes acima do fundo; o símbolo "+/-" significa que o anticorpo reage com o antígeno entre duas vezes e três vezes acima do fundo e o símbolo "-" significa que o sinal de detecção do anticorpo é igual ou abaixo do fundo.

EXEMPLO 2- USO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA COM TRÊS COMPONENTES PARA PRODUZIR SOROS IMUNES

[00083] Uma composição imunogênica trivalente consistindo em SCP, o polipeptídeo codificado pela ORF 554 e o polipeptídeo codificado pela ORF 1358 com o adjuvante fosfato de alumínio foi preparada e a composição imunogênica foi usada para preparar soro de coelho hiperimune por três inoculações subcutâneas separadas por 2 a 4 semanas, seguidas pela exsanguinação; uma composição imunogêni- ca monovalente constituída pelo polipeptídeo codificado pela ORF 554 com o mesmo adjuvante foi usada como controle. Os soros foram ras- treados quanto a atividade de opsonofagocitose (OPA) contra o S. pyogenes SF370 em várias diluições. Resumidamente, as bactérias foram incubadas com 10 ul dos soros por uma hora na presença de complemento (complemento de filhote de coelho) e depois diluídas 1:10 e plaqueadas sobre placas de ágar sangue. Os resultados são mostrados na Figura 11.

[00084] Como mostrado, pode ser visto que Trivax desencadeia uma atividade de opsonofagocitose maior do que a composição imu- nogênica 554, o que é indicativo de eliminação muito melhor das bactérias.

EXEMPLO 3 - TRANSFERÊNCIA DE IMUNIDADE PASSIVA

[00085] Os anticorpos foram gerados contra cada um dos seguintes antígenos como descrito acima: SCP e os polipeptídeos codificados pelas ORFs 554, 1358, 2459 e 1218. Esses anticorpos foram injetados em ratos jovens sem sistema imune completamente funcional. Os ratos tratados são subsequentemente inoculados com S. pyogenes e as bactérias recuperadas são contadas quatro horas depois da inoculação. O controle negativo era PBS e o controle humano positivo era o soro 385.

[00086] Os resultados são mostrados nas Figuras 12 a 16. Resumi- damente, os resultados demonstraram que os anticorpos gerados por cada um dos antígenos reduziram significativamente a bacteriemia nos ratos jovens.

[00087] Apesar de ilustrada e descrita acima com relação a modali-dadesespecíficas, a invenção não é pretendida estar limitada aos de-talhes mostrados. De preferência, várias modificações podem ser feitas nos detalhes dentro do escopo e da faixa de equivalentes das rei-vindicações e sem se afastar do espírito da invenção.

Claims (13)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de: (a) um polipeptídeo SCP consistindo na sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO:2; (b) um polipeptídeo peptidilpropil isomerase consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4; e (c) um polipeptídeo da proteína de adesão putativa consis-tindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um veículo fisiologicamente aceitável.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de um adjuvante.

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que cada polipep- tídeo em uma quantidade eficaz é capaz de evitar ou amenizar a colo-nização ou infecção por estreptococos β-hemoliticos em um mamífero suscetível.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os estreptococos β-hemoliticos são estreptococos do Grupo A, estreptococos do Grupo B, estreptococos do Grupo C ou estreptococos do Grupo G.

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o estreptococos β-hemolitico é o Streptococcus pyogenes.

7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso como medicamento.

8. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dito medicamento é uma vacina.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de proteção de um mamífero suscetível contra a colonização ou infecção por estreptococos β-hemoliticos.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica é adminis-trada por injeção subcutânea, por injeção intramuscular, pela ingestão oral, por via intranasal ou suas combinações.

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que os estreptococos β-hemoliticos são estreptococos do Grupo A, estreptococos do Grupo B. estreptococos do Grupo C ou estreptococos do Grupo G.

12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o estreptococos β-hemolitico é o Streptococcus pyogenes.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo fato de que o mamifero é um humano.

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