BRPI0913714A2 - polipeptídeo mutante que possui atividade de a5 dessaturase, molécula de ácido nucleico isolada, célula hospedeira microbiana e métodos de produção de ácido araquidônico e de ácido eicosapentaenoico - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO MUTANTE QUE POSSUI ATIVIDADE DE (Delta)5 DESSATURASE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ARAQUIDÔNICO E DE ÁCIDO EICOSAPENTAENOICO A presente invenção refere-se a (Delta)5 dessaturases mutantes, que possuem a capacidade de conversão de ácido di-homo-(Gama)-linolênico (DGLA; 20:3 (Ômega)-6) em ácido araquidônico (ARA; 20:4 (Ômega)-6) e/ou ácido eicosatetraenoico (ETA; 20:4 (Ômega)-3) em ácido eicosapentaenoico (EPA; 20:5 w-3) e que contêm 10 pelo menos uma mutação no motivo HPGG do domínio similar a citocromo b5. São descritos fragmentos de ácido nucleico isolados e construções recombinantes que compreendem esses fragmentos que codificam (Delta)5 dessaturases, junto com um método de elaboração de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa ("PUFAs") utilizando essas (Delta)5 dessaturases mutantes em levedura oleaginosa.

Description

j ' \- "POLIPEPTÍDEO MUTANTE QUE POSSUl ATJVIDADE DE A5 Q ,.\ DESSATURASE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CÉLULA

HOSPEDEIRA MICROBIANA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ARAQUIDÔNICO E DE ÁCIDO E(COSAPENTAENO1CO" 5 O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte- Americano n° 61/098.333, depositado em dezenove de setembro de 2008, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência.

Campo DA InvençÃo A presente invenção encontra-se no campo da biotecnologia, 10 Mais especificamente, a presente invenção refere-se à criação de fragmentos de ácidos nucleicos que codificam enzimas dessaturase de ácido graxo A5 mutantes (em que ocorre pelo menos uma mutação dentro do motivo HPGG do domínio similar a citocromo b5) e ao uso dessas dessaturases na elaboração de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa ("PUFAs").

15 Antecedentes DA InvençÃo Diversos hospedeiros diferentes, incluindo plantas, algas, fungos, estramenópilos e leveduras, estão sendo pesquisados como meios de produção de ácido graxo poli-insaturado comercial ("PUFA"). A engenharia genética demonstrou que as capacidades naturais de alguns hospedeiros 20 (mesmo os limitados de forma nativa a ácido linoleico (LA; 18:2 W-6) e ácido a- linolênico (ALA: 18:3 Cú-3)) podem ser substancialmente alteradas para que resultem em produção em alto nível de diversos PUFAS W-3/W-6 de cadeia longa. Seja este o resultado de capacidades naturais ou tecnologia recombinante, a produção de ácido araquidônico (ARA; 20:4 cú-6), ácido 25 eicosapentaenoico (EPA; 20:5 cú-3) e ácido docosa-hexaenoico (DHA; 22:6 (à)- 3) pode necessitar da expressão de uma A5 dessaturase.

A maior parte das enzimas L\5 dessaturase identificadas até aqui possui a capacidade primária de conversão de ácido di-homo-Y-|ino|ênico m

W (DGLA; 20:3 tú-6) em ARA, com atividade secundária na conversão de ácido - « eicosatetraenoico (ETA: 20:4 íú-3) em EPA. Foram descritas diversas A5 dessaturases na literatura aberta e na literatura de patentes. As características gerais de A5 dessaturases, com base na evolução da dessaturase, são bem 5 descritas por P. Sperling et al (Prostag/andins Leukot. Essent. Fatty Acids, 68: 73-95 (2003). Além das LJ6, A8 e A4 dessaturases, A5 dessaturases são conhecidas como dessaturases de "extremidade frontal" de PUFA de cadeia longa (em que a dessaturação ocorre entre uma ligação dupla previamente existente e o terminal carboxila do grupo acila do ácido graxo, ao contrário de 10 dessaturação dirigida a metila). Essas dessaturases são caracterizadas por três caixas de histidina (H(X)3-4H (SEQ ID N° 1 e 2), H(X)2-3HH (SEQ ID N° 3 e 4) e H/Q(X)2-3HH (SEQ ID N° 5 e 6)) e são membros da superfamília de fusão de citocromo b5, pois elas possuem um domlnio citocromo b5 fundido no seu terminal N que serve de doador de elétrons. O domínio citocromo b5 também 15 contem um motivo de ligação heme conservado (ou seja, uma sequência de histidina-prolina-glicina-glicina ou sequência "HPGG" (SEQ ID N" 180)), apesar da divergência das sequências de domínio citocromo b5 restantes. Essas sequências de motivos são o objeto da Patente Norte-Americana n° 5-972.664- Diversos estudos sugeriram que o motivo HPGG está relacionado 20 com a atividade enzimática. Stankova, O. et al (Plant Phisiol., 121: 641 (1999)) realizaram mutagênese dirigida a local para substituir o resíduo de histidina do motivo HPGG por um resíduo de alanina na A6 dessaturase de borragem. A enzima mutante foi expressa em Arabidopsis; nenhuma atividade enzimática pôde, entretanto, ser medida, o que sugere que o domínio citocromo b5 da 25 dessaturase foi importante para a função. Foi realizado um estudo similar em uma A6 dessaturase de rato, em que foi elaborada uma substituição de alanina por histidina no motivo HPGG. A proteína que sofreu mutação também não apresentou atividade (Guillou, H. et al, J. Lipid Res., 45: 32-40 (2004)). Mais recentemente, Hongsthong, A. et al (Appl. Microbiol. Biotechnol., 72: 1192-1201

P " (2006)) relataram a substituição do resíduo de histidina do motivo HPGG por um resíduo de alanina na A6 dessaturase de Spirulina. Como ocorre com os relatos anteriores, a mutação tornou a enzima mutante incapaz de produzir 5 GLA em E. co/i, o que sugere que o domínio de citocromo b5 foi importante para a atividade e que alterações nesse motivo resultarão em redução da atividade enzimática. Embora as enzimas A5 dessaturase sejam relativamente comuns e bem caracterizadas, permanece a necessidade de enzimas que sejam expressas eficientemente em altos níveis em células hospedeiras de 10 produção capazes de elaborar PUFAS. O problema a ser solucionado é, portanto, descobrir novas enzimas A5 dessaturase que possuam alta atividade e sejam apropriadas para integração em processos biossintéticos de PUFA em células hospedeiras comercialmente úteis. Os depositantes solucionaram o problema indicado por 15 meio da verificação inesperada de que alterações no motivo HPGG do domínio citocromo b5 de várias A5 dessaturases resultaram em aumento de até 38% da atividade enzimática, com base na conversão de DGLA em ARA. DescriçÃo Resumida da Invenção A presente invenção refere-se a novas construções genéticas que 20 codificam polipeptídeos que possuem atividade A5 dessaturase e seu uso em bactérias, leveduras, algas, euglenoides, estramenópilos, oomicetes e fungos para a produção de PUFAs. É consequentemente fornecido no presente um polipeptídeo mutante que possui atividade A5 dessaturase que compreende um motivo de 25 aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 183 (His-Gly-Gly-Gly ou HGGG), SEQ ID N° 184 (His-His-Gly-Gly ou HHGG), SEQ ID N° 186 (His-Cys-Gly-Gly ou HCGG), SEQ ID N° 187 (His-Trp-Gly-Gly ou HWGG) e SEQ ID N° 185 (His-Pro-Gly-Ser ou HPGS). Polipeptídeos A5

W

B dessaturase mutantes preferidos são aqueles que demonstram eficiência de a " conversão de ácido di-homo Y-|ino|ênico em ácido araquidônico que é maior que a eficiência de conversão de ácido di-homo-Y-|ino|ênico do polipeptídeo original do qual foi derivado o mutante.

5 Em uma segunda realização fornecida no presente, encontra-se uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica substancialmente o polipeptldeo de acordo com a presente invenção. Em uma terceira realização fornecida no presente, encontra-se uma célula hospedeira microbiana que expressa o polipeptídeo de acordo com 10 a presente invenção- Em uma quarta realização fornecida no presente, encontra- se um método de produção de ácido araquidônico que compreende o cultivo de uma célula hospedeira microbiana que expressa o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 na presença de ácido di- 15 homo-Y-]ino|ênico, em que o ácido di-homo-yHnolênico é convertido em ácido araquidônico, Em uma quinta realização, é fornecido no presente um método de produção de ácido eicosapentaenoico que compreende o cultivo de uma célula hospedeira microbiana que expressa o 20 polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 na presença de ácido eicosatetraenoico, em que o ácido eicosatetraenoico é convertido em ácido eicosapentaenoico. Breve DescriçÃo das Figuras e Listagens de SequÊncias A Fig. 1A e a Fig. 1B ilustram o processo biossintético de ácido 25 graxo w-3/tú-6 e deverão ser observadas em conjunto ao considerar-se a descrição deste processo abaixo. A Fig. 2 fornece mapas de plasmídeos para os seguintes: (A) pDM\N369; e (B) pZUF17.

W

A presente invenção pode ser compreendida mais completamente * wt a partir da descrição detalhada a seguir e das descrições de sequências anexas que fazem parte do presente pedido.

As sequências a seguir atendem a 37 C.

F.

R. §1.821-1.825

5 (Requirements for Patent Applications Containing Nuc/eotide Sequences and'br Amino Acid Sequence Disc/osures - the Sequence Ru/es) e são consistentes com o Padrão ST.25 (1998) da Organização Mundial da Propriedade lntelectual (OMPI) e as exigências de listagens de sequências do EPO e PCT (Regras 5.2 e 49.5 (a-bis) e Capítulo 208 e Anexo C das lnstruções Administrativas). Os

10 sÍmbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C.

F.

R. §1.822. SEQ ID N° 7-19, 58, 97-100, 139, 140 e 179-195 são ORFs que codificam genes ou proteínas (ou suas partes) ou plasmídeos, conforme identificado na Tabela 1. 15 Tabela 1

Resumo DE NÚmeros DE SEQ ID DE ÁCIDOS NUCLEICOS E PROTEÍNAS

Descrição Ácido nucleico Proteína SEQIDN° SEQID N° Motivo rico em His: H(X)3H m 1 Motivo rico em His: H(X)4H — 2 Motivo rico em His: H(X)2HH -- 3

Motivo rico em His: H(X)3HH — 4 Motivo rico em His: (H/Q)(X)2HH me 5

Motivo rico em His: (H/Q)(X)3HH — 6 A5 dessaturase de Eug/ena graci/is ("EgD5") 7 (1350 bp) 8 (449 AA) A5 dessaturase sintética, derivada de Euglena graci/is, 9 (1350 bp) 10 (449 AA) otimizada por códons para expressão em Yarrowia //Polytica ("EgD5S") A5 dessaturase de Eug/ena anabaena ("EaD5") 11(1362 bp) 12 (454 AA) L!t5 dessaturase sintética, derivada de Eug/ena anabaena, 13 (1 362 bp) 14 (454 AA) otimizada por códons para expressão em Yarrowia /ipo/ytica ("EaD5S") A5 dessaturase de Peridinium sp CCMP626 ("RD5") 15(1392 bp) 16 (463 AA)

T ! Descrição Ácido nucleico Proteina dr

H SEQID N° SEQID N° I LJ5 dessaturase sintética, derivada de Peridinium sp 17(1392 bp) 18 (463 AA) I CCMP626, otimizada por códons para expressão em I Yarrowia /ipo/ytica ("RD5S") I Plasmldeo pDMW369 19 (8438 bp) — ! A5 dessaturase mutante EgD5S-HXGG (ou seja, que 58 (449 AA) -- ! compreende um motivo HGGG ou HHGG) I A5 dessaturase mutante EgD5S-HPGS (ou seja, que 97 (449 AA) I compreende um motivo HPGS) I Plasmldeo pZUFmEaD5S 98 (8357 bp) I Plasmídeo pZUF17 99 (8165 bp) I Plasmldeo pEaD5S 100 ~~ (3983 bp) LJ5 dessaturase mutante EaD5S-HPGS (ou seja, que -- 139 compreende um motivo HCGG) (454 AA) PIasmldeo pZURD5S 140 (8480 bp) A5 dessaturase mutante RD5S-HXGG (ou seja, que -- 179 compreende um motivo HCGG ou HWGG) (463 AA) Motivo HPGG 180 Motivo HXGG — 181 Motivo H PGX -- 182 Motivo HGGG e 183 Motivo HHGG — 184 Motivo HPGS 185 Motivo HCGG ~ 186 Motivo HWGG 187 Motivo HAGG W— 188 Motivo HPGA — 189 â5 dessaturase mutante EgD5S-HGGG 190 W— (1350 b L\5 dessaturase mutante EgD5S-HHGG 191 (1350 b L\5 dessaturase mutante EgD5S-HPGS 192 (1350 b â5 dessaturase mutante EaD5S-HCGG 193 (1365 b A5 dessaturase mutante RD5S-HCGG 194 (1392 b L\5 dessaturase mutante RD5S-HWGG 194 (1392 b

# SEQ ID N° 20-57 correspondem a primers de oligonucleotÍdeos

W utilizados para realizar mutação individual do resíduo de prolina do motivo HPGG de EgD5S por meio de mutagênese dirigida a local. SEQ ID N° 59-96 correspondem a pn'mers de ohgonucleotídeos 5 utilizados para realizar mutação individual do segundo resíduo de glicina do motivo HPGG de EgO5S por meio de mutagênese dirigida a Iocal. SEQ ID N° 101-138 correspondem a primers de oligonucleotÍdeos utilizados para realizar mutação individual do resíduo de prolina do motivo HPGG de Ea05S por meio de mutagênese dirigida a local.

10 SEQ ID N° 141-178 correspondem a primers de oligonucleotÍdeos utilizados para realizar mutação individual do resíduo de prolina do motivo HPGG de RD5S por meio de mutagênese dirigida à local. Descrição Detalhada DA InvençÃo Novas enzimas L\5 dessaturase mutantes e genes que as 15 codificam que podem ser utilizados para manipulação dos processos bioquímicos para a produção de PUFAs saudáveis são descritos no presente. Essas A5 dessaturases mutantes contêm pelo menos uma mutação dentro do motivo HPGG (SEQ ID N° 10) do domínio citocromo b5. PUFAs ou seus derivados são utilizados como substitutos ou 20 suplementos alimentares, particularmente fórmulas para bebês, para pacientes que sofrem alimentação intravenosa ou para evitar ou tratar de má nutrição. Alternativamente, os PUFAs purificados (ou seus derivados) podem ser incorporados em óleos de cozinha, gorduras ou margarinas formuladas de tal forma que, durante o uso normal, o paciente receberia a quantidade desejada 25 de suplementação alimentar. Os PUFAS podem também ser incorporados a fórmulas para bebês, suplementos nutricionais ou outros produtos alimentícios e podem encontrar uso como agentes redutores do colesterol ou anti- inflamatórios. Opcionalmente, as composições podem ser empregadas para

W uso farmacêutico, seja humano ou veterinário.

KG Toda a literatura de patente e não de patente mencionada no presente é incorporada ao presente como referência. No presente relatório descritivo, são utilizados diversos termos e 5 abreviações. São fornecidas as definições a seguir. "Estrutura de leitura aberta" é abreviada "ORF".

"Reação em cadeia de polimerase" é abreviada "PCR". "Coleção Norte-Americana de Cultivo de Tipos" é abreviada "ATCC".

10 "Ácido(s) graxo(s) poli-insaturado(s)" é(são) abreviado(s) "PUFA(S)".

"Triacilgliceróis" são abreviados "TAGS". "Ácidos graxos totais" são abreviados "TFAs".

A expressão "invenção" ou "presente invenção", da forma utilizada 15 no presente, não se destina a limitar-se a nenhuma realização especlfica da presente invenção, mas aplica-se, de forma geral, a toda e qualquer realização da presente invenção conforme descrito nas reivindicações e no relatório descritivo. A expressão "ácidos graxos" designa ácidos alifáticos de cadeia 20 longa (ácidos alcanoicos) com comprimentos de cadeia variáveis de cerca de C12 a C22, embora sejam conhecidos ácidos com comprimento de cadeia mais longo e mais curto. Os comprimentos de cadeia predominantes são de C16 a C22. A estrutura de um ácido graxo é representada por um sistema de notação simples de "X:Y", em que X é o número total de átomos de carbono ("C") no 25 ácido graxo específico e Y é o número de ligações duplas. Detalhes adicionais referentes à diferenciação entre "ácidos graxos saturados" e "ácidos graxos insaturados", "ácidos graxos monoinsaturados" e "ácidos graxos poli- insaturados" ("PUFAS") e "ácidos graxos ômega 6" ('U-6" ou "n-6") contra

"ácidos graxos ômega 3" ("W-3") ou ("n-3") são fornecidos na Patente Norte- . " Americana n° 7.238.482, que é incorporada ao presente como referência.

A nomenclatura utilizada para descrever PUFAS no presente é exibida abaixo na Tabela 2. Na coluna intitulada "Notação Abreviada", o 5 sistema de referência ômega é utilizado para indicar o número de carbonos, o número de ligações duplas e a posição da ligação dupla mais próxima do carbono ômega, a partir do carbono ômega (que recebe o número 1 com este propósito). O restante da Tabela resume os nomes comuns de ácidos graxos cú-3 e W-6 e seus precursores, as abreviações que serão utilizadas ao longo de 10 todo o re|atório descritivo e o nome químico de cada composto.

Tabela 2 Nomenclatura de Ácidos Graxos Políjnsaturados e PRECURSORES Notação Nome comum I Abreviação I Nome químico abreviada Mirístico Tetradecanoico 14:0 -— Palmítico Palmitato Hexadecanoico 16:0 Palmitole ico -- 9-hexadecenoico 16:1 Esteárico -- Octadecanoico 18:0 Oleico -- Cis-9-octadecenoico 18:1 Linoleico I LA I Cis-9,12-octadecadienoico l 18:2 W-6 Cis-6,9,12- Y-Lino|ênico I GLA I I 18:3 cü-6 octadecatrienoico Eicosadienoico I EDA I Cis-11,14-eicosadienoico I 20:2 úú-6 Di-horrio-Y- DGLA ! Cis-8,11,14-eicosatrienoico I 20:3 uú-6 linolênico C/s-5,8,11,14- Araquidônico ARA 20:4 tú-6 eicosatetraenoico

-~ 10

P Cis-9,12,15- 18:3 u>3 0 0 a-Linolênico ALA octadecatrienoico Cis-6,9,12,15- ) 3e 00 0 STA 18:4 W-3 octadecatetraenoico Cis-11,14,17-eicosatrienoico i 20:3 üü-3 Eicosatrienoico ETrA Cis-5,11,14-eicosatrienoico I 20:3b Vü-6 Sciadônico SCl Cis-5,11,14,17- Juniperônico JUP 20:4b uú-3 eicosatetraenoico Cis-8,11,14,17- Eicosatetraenoico ETA 20:4 úü-3 eicosatetraenoico Cis-5,8,11,14,17- Eicosapentaenoico EPA 20:5 úü-3 eicosapentaenoico Cis-7,10,13,16- Docosatetraenoico DTA 22:4 W-6 docosatetraenoico Cis-4,7,10,13,16- Docosapentaenoico I OPAn-6 22:5 üú-6 docosapentaenoico Cis-7,10,13,16,19- Docosapentaenoico DPA 22:5 W-3 docosapentaenoico Cis-4,7,10,13,16,19-docosa- Docosa-hexaenoico DHA 22:6 úú-3 hexaenoico Embora os PUFAs W-3/W-6 relacionados na Tabela 2 sejam os mais propensos a acúmulo nas frações de óleo de hospedeiros microbianos utilizando os métodos descritos no presente, a lista não deverá ser considerada limitadora nem completa.

5 O termo "óleo" designa uma substância de lipídio que é liquida a 25 °C e normalmente poli-insaturada. Em organismos oleaginosos, óleo constitui uma parte importante do total de lipidios. "Óleo" é composto

W principalmente de triacilgliceróis ("TAGS"), mas pode também conter " outros lipídios neutros, fosfohpldios e ácidos graxos livres. A composição de ácidos graxos no óleo e a composição de ácidos graxos do total de lipídio são geralmente similares; desta forma, um aumento ou 5 redução da concentração de PUFAs no total de lipidio corresponderá a um aumento ou redução da concentração de PUFAS no óleo e vice- versa. "Lipídios neutros" designam os lipídios comumente encontrados em células em corpos de lipídios na forma de gorduras de armazenagem e recebem esse 10 nome porque, sob pH celular, os lipidios não contêm grupos carregados. Geralmente, eles são completamente não polares sem afinidade para água.

Lipldios neutros geralmente designam mono, di e/ou triésteres de glicerol com ácidos graxos, também denominados monoacilglicerol, diaci|g[icero| ou triacilglicerol, respectivamente, ou, coletivamente, acilgliceróis. É necessário 15 que ocorra uma reação de hidrólise para liberar ácidos graxos livres de acilgliceróis.

O termo "triacilgliceróis" ("TAGS") designa lipíd ios neutros compostos de três resíduos acila graxos esterificados para uma molécula de glicerol. TAGS podem conter PUFAs de cadeia longa e ácidos graxos 20 saturados, bem como ácidos graxos saturados e insaturados de cadeía mais curta.

A expressão "total de ácidos graxos" ("TFAs") designa no presente a soma de todos os ácidos graxos celulares que podem ser derivados em metil ésteres de ácido graxo ("FAMEs") por meio do método de 25 transesterificação de bases (conforme conhecido na técnica) em uma dada amostra, que pode ser, por exemplo, biomassa ou óleo. Desta forma, o total de ácidos graxos inclui ácidos graxos e frações de lipídios neutros (incluindo diacilgliceróis, monoacilgliceróis e TAGs) e de frações de lipídios polares

(incluindo as frações de fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina), mas não ácidos graxos livres.

A expressão "teor total de lipídio" de células é uma medida de TFAS na forma de percentual do peso de células secas ("DCW"), embora o teor total de lipídios possa ser aproximado como medida de FAMEs na forma de percentual do DCW ("°/0 DCW FAMEs"). Desta forma, o teor total de lipídios ("°/0 DCW TFAS") é equivalente, por exemplo, a miligramas do total de ácidos graxos por cem miligramas de DCW.

A concentração de um ácido graxo no total de lipídios é expressa no presente na forma de percentual em peso de TFAS ("°/0 TFAS"), tal como miligramas do dado ácido graxo por cem miligramas de TFAs.

A menos que indicado especificamente em contrário no presente relatório descritivo, a referência ao percentual de um dado ácido graxo com relação ao totai de lipidios é equivalente à concentração do ácido graxo na forma de °/) TFAs e °/)

EPA do total de lipídios, por exemplo, é equivalente a °/0 EPA TFAs.

As expressões "perfil de lipidios" e "composição de lipídios" são intercambiáveis e designam a quantidade de ácidos graxos individuais contidos em uma fração de lipldio especifica, tal como no lipídio total ou no óleo, em que a quantidade é expressa na forma de percentual em peso de TFAS.

A soma de cada ácido graxo individual presente na mistura deverá ser de 100. A expressão "processo biossintético de PUFA" designa um processo metabólico que converte ácido oleico em ácidos graxos üú-6 tais como LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, DTA e OPAn-6 e ácidos graxos íú-3 tais como ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA e DHA, Este processo é bem descrito na literatura.

Vide, por exemplo, o Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2006/0115881-A1. Resumidamente, este processo envolve o alongamento da cadeia de carbono por meio da adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula por meio da adição de ligações duplas, por uma

¶ 0 série de enzimas de dessaturação e alongamento especiais denominadas 0 "enzimas do processo biossintético de PUFA" que estão presentes na membrana do retículo endoplasmático. Mais especificamente, "enzimas do processo biossintético de PUFA" designam qualquer uma das enzimas a seguir 5 (e genes que codificam as mencionadas enzimas) associadas à biossíntese de um PUFA, incluindo: A4 dessaturase, A5 dessaturase, A6 dessaturase, A12 dessaturase, A1 5 dessaturase, A17 dessaturase, A9 dessaturase, A8 dessaturase, A9 elongase, elongase C4/16, elongase C16/18, elongase C18/20 e/ou elongase C20/22.

10 O termo "dessaturase" designa um poIipeptídeo que pode ser dessaturado, ou seja, introduzir uma ligação dupla, em um ou mais ácidos graxos para produzir um ácido graxo ou precursor de interesse. Apesar do uso do sistema de referência ômega ao longo de todo o presente relatório descritivo para designar ácidos graxos específicos, é mais conveniente indicar a atividade 15 de uma dessaturase por meio de contagem a partir da extremidade carboxila do substrato utilizando o sistema delta. São de interesse específico no presente A5 dessaturases que realizam dessaturação de um ácido graxo entre o quinto e c) sexto átomo de carbono numerados a partir da extremidade carboxil- terminal da molécula e podem, por exemplo, catalisar a conversão de DGLA 20 em ARA e/ou ETA em EPA. Outras dessaturases de ácidos graxos incluem, por exemplo: A8 dessaturases, A6 dessaturases, A4 dessaturases, A12 dessaturases, A15 dessaturases, A17 dessaturases e A9 dessaturases. Na técnica, A15 e A17 dessaturases também são ocasionalmente denominadas "ômega-3 dessaturases", "w-3 dessaturases" e/ou "tü-3 dessaturases", com 25 base na sua capacidade de conversão de ácidos graxos uü-6 nos seus correspondentes üú-3 (tal como conversão de LA em ALA e ARA em EPA, respectivamente). Pode ser desejável determinar empiricamente a especificidade de uma dessaturase de ácido graxo específica por meio da transformação de um hospedeiro apropriado com o gene da dessaturase de ácido graxo e determinar o seu efeito sobre o perfil de ácido graxo do hospedeiro. O termo "EgD5" designa uma enzima A5 dessaturase (SEQ ID N° 8) isolada de Euglena graci/is, codificada por SEQ ID N° 7 no presente. De forma similar, o termo "EgD5S" designa uma A5 dessaturase sintética derivada de E. graci/is que é otimizada por códons para expressão em Yarrowia lipo/ytica (ou seja, SEQ ID N° 9 e 10). Detalhes adicionais referentes a EgO5 e EgD5S são descritos no Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2007/1 36671. O termo "Ea05" designa uma enzima LJ5 dessaturase (SEQ ID N° 12) isolada de Eug/ena anabaena, codificada por SEQ ID N° 11 no presente, De forma similar, o termo "EaD5S" designa uma L\5 dessaturase sintética derivada de E. anabaena que é otimizada por códons para expressão em Yarrowla /ipo/ytica (ou seja, seq id n° 13 e 14). Detalhes adicionais referentes a EaD5 e EaD5S são descritos no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0274521-A1. O termo "RD5" designa uma enzima A5 dessaturase (SEQ ID N° 16) isolada de Peridinium sp CCMP626, codificada por SEQ ID N° 15 no presente. De forma similar, o termo "RD5S" designa uma LJ5 dessaturase sintética derivada de Peridinium sp CCMP626 que é otimizada por códons para expressão em Yarrowia lipo/ytica (ou seja, SEQ ID N° 17 e 18). Detalhes adicionais referentes a RD5 e RD5S são descritos no Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2007/136646.

A expressão "domínio conservado" ou "motivo" indica um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma sequência alinhada de proteínas com evolução relacionada. Embora os aminoácidos em outras posições possam variar entre proteínas homólogas,

aminoácidos que são altamente conservados em posições especificas e

1 indicam aminoácidos que são essenciais na estrutura, estabilidade ou atividade de uma proteína.

Como eles são identificados pelo seu alto grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos

5 de proteína, eles põem ser utilizados como identificadores, ou "assinaturas", para determinar se uma proteína com sequência recém determinada pertence a uma família de proteinas identificada anteriormente.

Motivos que são encontrados universalmente em enzimas A5 dessaturase de animais, plantas e fungos incluem três caixas de

10 histidina (ou seja, H(X)3-4H (SEQ ID N° 1 e 2), H(X)2-3HH (SEQ ID N° 3 e 4) e H/Q(X)2-3HH (SEQ ID N° 5 e 6) e um motivo de ligação heme (ou seja, His-Pro-Gly-Gly ou HPGG (SEQ ID N° 180)) com o domínio citocromo b5 fundido no terminal N.

A expressão "L\5 dessaturase mutante" designa uma LJ,5

15 dessaturase conforme descrito no presente que contém pelo menos uma mutação no motivo HPGG (SEQ ID N° 180) do domínio citocromo b5, em que a mencionada mutação resulta em uma substituição de aminoácidos, seja ela conservadora ou não conservadora). Embora a(s) mutação (ões) possa(m)

incluir qualquer substituição de aminoácido, a L\5 dessaturase mutante

20 compreende preferencialmente um motivo mutante selecionado a partir do grupo que consiste em His-Xaa-Gly-Gly ou "HXGG" (SEQ ID N° 181) e His-Pro- Gly-Xaa ou "HPGX" (SEQ ID N° 182) e a atividade de LJ5 dessaturase da L\5 dessaturase mutante é pelo menos aproximadamente equivalente funcionalmente à atividade de A5 dessaturase da A5 dessaturase do tipo

25 selvagem.

De maior preferência, o motivo mutante é selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 183 (His-Gly-Gly-Gly ou "HGGG"), SEQ ID N° 184 (His-His-Gly-Gly ou "HHGG"), SEQ ID N° 186 (His-Cys-Gly-Gly ou "HCGG"), SEQ ID N° 187 (His-Trp-Gly-Gly ou "HWGG") e SEQ ID N° 185 (His-

« ¥ Pro-Gly-Ser ou "HPGS"). Vide, por exemplo, as A5 dessaturases descritas # ' como SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 97, SEQ ID N°139 e SEQ ID N° 179. Cada "A5 dessaturase mutante" contém uma "LJ,5 dessaturase do tipo selvagem correspondente". Especificamente, a A5 dessaturase mutante e 5 a A5 dessaturase do tipo selvagem correspondente compartilham sequências de aminoácidos idênticas, com exceção de que o tipo selvagem compreenderá um motivo HPGG (SEQ ID N° 180) dentro do domínio citocromo b5, enquanto o mutante compreenderá pelo menos uma mutação dentro desse motivo (conforme descrito acima).

10 Uma A5 dessaturase mutante é "pelo menos aproximadamente equivalente funcionalmente" à A5 dessaturase do tipo selvagem correspondente quando a atividade enzimática e a seletividade específica da sequência A5 mutante forem comparáveis com à da LJ5 dessaturase do tipo selvagem correspondente. Desta forma, uma A5 dessaturase mutante 15 funcionalmente equivalente possuirá atividade A5 dessaturase que não é substancialmente reduzida com relação à da A5 dessaturase do tipo selvagem correspondente quando a "eficiência de conversão" de cada enzima for comparada (ou seja, uma A5 dessaturase mutante possuirá pelo menos cerca de 50 a 75°/o, preferencialmente pelo menos cerca de 75 a 85%, de maior 20 preferência pelo menos cerca de 85 a 95% e, de preferência superior, pelo menos cerca de 95% da atividade enzimática da A5 dessaturase do tipo selvagem). A atividade de A5 dessaturase dos dois polipeptídeos pode ser substancialmente idêntica. Preferencialmente, a t!j5 dessaturase mutante possuirá atividade enzimática e seletividade especlfica mais altas em 25 comparação com as da A5 dessaturase do tipo selvagem correspondente, ou seja, pelo menos cerca de 101 a 105%, de maior preferência pelo menos cerca de 106 a 115% e, de preferência superior, pelo menos cerca de 116 a 125% da atividade enzimática da A5 dessaturase do tipo selvagem.

€ e

6 As expressões "eficiência de conversão" e "percentual de

° conversão de substrato" designam a eficiência com que uma enzima específica (tal como uma dessaturase) pode converter substrato em produto.

A eficiência de conversão é medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato

5 + produto]) * 100 Desta forma, "eficiência de conversão de DGLA em ARA" designa a eficiência de conversão com que o substrato, DGLA, é convertido no produto, ARA.

O termo "elongase" designa um polipeptideo que pode alongar uma cadeia de carbono de ácido graxo para produzir um ácido com mais dois

10 carbonos que o substrato de ácido graxo sobre o qual age a elongase.

Este processo de alongamento ocorre em um mecanismo com múltiplas etapas em associação com sintase de ácido graxo, conforme descrito no Pedido de

Patente Norte-Americano publicado n° 2005/0132442. Exemplos de reações catalisadas por sistemas de elongase são a conversão de GLA em DGLA, STA

15 em ETA e EPA em DPA.

Geralmente, a seletividade de substratos de elongases é um tanto ampla, mas segregada pelo comprimento de cadeia e pelo grau e tipo de insaturação.

Uma elongase C14/16, por exemplo, utilizará um substrato C14 (tal como ácido miristico), uma elongase C16l18 utilizará um substrato C16 (tal como

20 palmitato), uma elongase C18/20 utilizará um substrato C18 (tal como GLA, STA, LA, ALA) e uma elongase C20/22 (também denominada A5 elongase) utilizará um substrato C2q (tal como ARA, EPA). Para os propósitos do presente, podem ser definidos dois tipos distintos de elongases C18/20: uma A6 elongase catalisará a conversão de GLA e STA em DGLA e ETA, respectivamente,

25 enquanto uma A9 elongase é capaz de catalisar a conversão de LA e ALA em EDA e ETrA, respectivamente.

É importante observar que algumas elongases possuem ampla especificidade e, portanto, uma única enzima pode ser capaz de catalisar

W

V diversas reações de elongase, por exemplo, de forma a agir como uma

W " elongase C16-18 e uma elongase C18-20. Pode ser desejável determinar empiricamente a especificidade de urna elongase de ácido graxo por meio da transformação de um hospedeiro apropriado com o gene de elongase de ácido 5 graxo e determinar o seu efeito sobre o perfil de ácido graxo do hospedeiro. O termo "oleaginoso" designa os organismos que tendem a armazenar a sua fonte de energia na forma de óleo (Weete, em: Fungal Lipid Biochemistry, segunda edição, Plenum, 1980). Geralmente, o teor de óleo celular de micro-organismos oleaginosos segue uma curva sigmoide, em que a 10 concentração de lipídios aumenta até atingir o máximo da fase de crescimento logarítmico posterior ou estacionário inicial e cai gradualmente em seguida durante as últimas fases estacionária e de morte (Yongmanitchai e Ward, Appl. Environ. Microbiol., 57: 419-25 (1991)). É comum que micro-organismos oleaginosos acumulem-se em mais de cerca de 25% do seu peso de células 15 secas na forma de óleo. A expressão "levedura oleaginosa" designa os micro-organismos classificados como leveduras que podem produzir óleo. Exemplos de levedura oleaginosa incluem, mas sem nenhuma limitação, os gêneros a seguir: Yarrowia, Candida, Rhodotoru/a, Rhodosporidium, Ctyptococcus, Trichosporon 20 e Lipomyces. Alternativamente, os organismos classificados como leveduras que são elaborados para fabricar mais de 25% do seu peso de células secas na forma de óleo são também "oleaginosos".

O termo "aminoácido" designará a unidade estrutural química básica de uma proteína ou polipeptídeo. Os aminoácidos são identificados pelo código de 25 uma letra ou pelo código de três letras para aminoácidos, em conformidade com os padrões IUPACJYUB descritos em Nuc/eic Acids Reseamh, 13: 3021-3030 (1985) e no Biochemicaljoumal, 219 (2): 345-373 (1984).

A expressão "substituição de aminoácidos conservadores"

'Ü designa a substituição de um resíduo de aminoácido em uma dada proteína por e um outro aminoácido, sem alterar a natureza química ou funcional daquela proteína. Sabe-se bem na técnica, por exemplo, que alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um 5 dado local (mas não afetam as propriedades estruturais e funcionais da protelna dobrada codificada) são comuns. Para os propósitos do presente, "substituições de aminoácidos conseNadores" são definidas como trocas dentro de um dos cinco grupos a seguir:

1. resíduos alifáticos, não polares ou levemente polares 10 pequenos: Ala [A], Ser [S], Thr [T] (Pro [p], Gly [g]);

2. resíduos polares com carga negativa e suas amidas: Asp [D], Asn [N], Glu [E], Gln [Q];

3. residuos polares com carga positiva: His [H], Arg [R], Lys [K]: 15 4. residuos não polares alifáticos grandes: Met [M], Leu [L], lle [I], Val [V] (Cys [C]); e

5. resíduos aromáticos grandes: Phe [F], Tyr [y], Trp NYJ. Desta forma, Ala, um aminoácido levemente hidrofóbico, pode ser substituldo por um outro residuo menos hidrofõbico (tal como GIy). De forma 20 similar, pode-se também esperar que alterações que resultem na substituição de um resíduo com carga negativa por outro (tal como Asp por Glu) ou um resíduo com carga positiva por outro (tal como Lys por Arg) gerem um produto funcionalmente equivalente. Desta forma, as substituições de aminoácidos conservadores geralmente mantêm: a estrutura da cadeia principal de 25 poIipeptídeo na área da substituição; a carga ou hidrofobicidade da molécula no Iocal alvo; ou o volume da cadeia Iateral. Além disso, em muitos casos, também não se esperaria que alterações das partes N-terminais e C-terminais da molécula de proteína alterassem a atividade da proteína.

A expressão "substituição de aminoácidos não conservadora" * " designa uma substituição de aminoácidos que geralmente se espera que produza a maior alteração das propriedades de proteína.

Desta forma, por exemplo, uma substituição de aminoácidos não conservadora seria aquela por

5 meio da qual: 1) um resíduo hidrofÍIico é substituído por um residuo hidrofóbico (tal como Ser ou Thr por Leu, lle, Val); 2) um Cys ou Pro é substituído por qualquer outro resíduo; 3) um resíduo que possui uma cadeia lateral eletropositiva é substituído por um residuo eletronegativo (tal como Lys, Arg ou His por Asp ou GIu); ou 4) um resíduo que contém uma cadeia lateral volumosa

10 é substituído por um que não possui uma cadeia lateral (tal como Phe por Gly). Às vezes, substituições de aminoácidos não conservadoras entre dois dos cinco grupos não afetarão a atividade da proteína codificada.

As expressões "polinucleotideo", "sequência de polinucleotídeos", "sequência de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico" e "fragmento de

15 ácido nucleico isolado" são utilizadas de forma intercambiável no presente.

Essas expressões englobam sequências de nucleotídeos e similares.

Um pohnucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que possua fita simples ou dupla, que contenha opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas.

Um polinucleotídeo na forma de polímero de DNA pode

20 ser compreendido por um ou mais segmentos de CDNA, DNA genômico, DNA sintético ou suas misturas.

Nucleotideos (normalmente encontrados na sua forma de 5'-monofosfato) são indicados pela sua designação de letra única conforme segue: "A" para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato ou

25 desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A, C ou T, "I"

para inosina e "N" para qualquer nucleotídeo.

Um fragmento de ácido nucleico é "hibridizável" em outro fragmento de ácido nucleico, tal como CDNA, DNA genômico ou molécula de y

" RNA, quando uma forma de fita única do fragmento de ácido nucleico puder combinar-se com o outro fragmento de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e resistência iônica de solução.

As condições de f

5 hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E.

F. e Maniatis, T., Mo/ecu/ar C/oning.' A Laboratory Manual,

segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor NY

(1989), que é incorporado ao presente como referência, particularmente o Capítulo 11 e a Tabela 11,1. As condições de temperatura e resistência iônica

10 determinam a "estringência" da hibridização.

As condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares (tais como sequências homólogas de organismos com relação distante) até fragmentos altamente similares (tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos com relação próxima). Lavagens pós-hibridização

15 determ inam as condições de estringência.

Um con junto de condições preferidas utiliza uma série de Iavagens a partir de 6X SSC, 0,5% SDS à temperatura ambiente por quinze minutos, repetida em seguida com 2X SSC,

0,5% SDS a 45 °C por trinta minutos e repetida em seguida por duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 50 °C por trinta minutos.

Um conjunto de

20 condições estringentes de maior preferência utiliza temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idênticas às acima, exceto pela temperatura das duas lavagens finais de trinta minutos em 0,2X SSC, 0,5% SDS, que aumentou para 60 °C.

Um outro conjunto preferido de condições altamente estringentes utiliza duas lavagens finais em O,1X SSC, 0,1% SDS a 65 °C.

Um conjunto adicional

25 de condições estringentes inclui hibridização a O,1X SSC, 0,1% SDS, 65 °C e lavagens com 2X SSC, 0,1% SDS seguidas, por exemplo, por O,1X SSC, 0,1%

SDS.

A hibridização necessita que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares e, embora dependentes da estringência da hibrid ização, são possíveis faltas de coincidência entre as bases. A estringência apropriada para a hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeos, maior o valor do ponto de fusão térmica ("Tm") para híbridos de ácidos nucleicos que contenham essas sequências. A estabilidade relativa, correspondente a Tm mais alta, de hibridizações de ácidos nucleicos cai na ordem a seguir: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de cem nucleotídeos de comprimento, foram derivadas equações para cálculo da Tm (vide Sambrook et al, acima,

9.50-9.51). Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, ou seja, oligonucleotídeos, a posição de falta de coincidência torna-se mais importante e o comprimento do oligonucleotÍdeo determina a sua especificidade (vide Sambrook et al, acima, 11.7-11.8). Em uma realização, o comprimento de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de dez nucleotídeos.

Preferencialmente, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de quinze nucleotídeos; de maior preferência, pelo menos cerca de vinte nucleotídeos; e, de preferência superior, o comprimento é de pelo menos cerca de trinta nucleotídeos. Além disso, os técnicos no assunto reconhecerão que a temperatura e a concentração de sa! da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário, de acordo com fatores tais como o comprimento da sonda. Uma "parte substancial" de uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos é a parte que compreende sequência de aminoácidos suficiente de um polipeptídeo ou a sequência de nucleotídeos de um gene para supostamente identificar aquele polipeptídeo ou gene, seja por meio de avaliação manual da sequência pelos técnicos no assunto ou por comparação

' e

B e identificação computadorizada de sequências utilizando algoritmos tais como ¥ " Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico ("BLAST") (Altschul, S F. et al, J. Mol. B/o/., 215: 403-410 (1993)). Geralmente, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos é necessária para 5 identificar supostamente uma sequência de ácidos nucleicos ou polipeptídeos como homóloga a uma proteína ou gene conhecido. Além disso, com relação a sequências de nucleotídeos, sondas de oligonucleotídeos específicas de genes que compreendem de vinte a trinta nucleotídeos contíguos podem ser utilizadas em métodos dependentes de sequência de identificação (tal como 10 hibridização Southern) e isolamento (tal como hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas de bacteriófagos) de genes. Além disso, oHgonucleotídeos curtos com doze a quinze bases podem ser utilizados como pn'mers de amplificação em PCR a fim de obter um fragmento de ácido nucleico específico que compreende os primers. Consequentemente, uma 15 "parte substancial" de uma sequência de nucleotídeos compreende sequência suficiente para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento de ácido nucleico que compreende a sequência. O presente relatório descritivo ensina a sequência de nucleotídeos e aminoácidos completa que codifica proteinas microbianas específicas. Os técnicos no assunto, conhecendo o benefício das 20 sequências relatadas no presente, podem agora utilizar as sequências descritas, no todo ou em uma parte substancial, para os propósitos conhecidos dos técnicos no assunto. Consequentemente, as sequências completas conforme relatado na Listagem de Sequências anexa, bem como partes substanciais dessas sequências conforme definido acima, são englobadas no 25 presente relatório descritivo. O termo "complementar" é utilizado para descrever o relacionamento entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar-se entre si. Com relação ao DNA, por exemplo, adenosina é complementar a timina e citosina é complementar a guanina.

Consequentemente, fragmentos 0

" de ácido nucleico isolados que são complementares às sequências completas relatadas na Listagem de Sequências anexa, bem como as sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares, são englobados pelo presente

5 relatório descritivo.

Os termos "homologia" e "homólogo" são utilizados de forma intercambiável.

Eles se referem a fragmentos de ácidos nucleicos em que as alterações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucleico de mediar a expressão genética ou produzir um

10 certo fenótipo.

Esses termos também designam modificações dos fragmentos de ácido nucleico tais como a exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante com relação ao fragmento inicial não modificado.

Compreende-se, portanto, como apreciarão os técnicos no

15 assunto, que a presente invenção engloba mais que os exemplos de sequências específicos.

Além disso, os técnicos no assunto reconhecem que sequências de ácidos nucleicos homólogas também são definidas pela sua capacidade de hibridização, sob condições moderadamente estringentes, tais como 0,5X SSC,

20 0,1% SDS, 60 °C, com as sequências exemplificadas no presente ou em qualquer parte das sequências de nucleotídeos descritas no presente e que são funcionalmente equivalentes.

As condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos com relação distante, até fragmentos

25 altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos com relação próxima.

A expressão "hibridiza-se seletivamente" inclui referência à hibridização, sob condições de hibridização estringente, de uma sequência de

L__

e g ácido nucleico em uma sequência alvo de ácido nucleico especificada até um * " grau detectavelmente maior (tal como pelo menos duas vezes sobre o fundo) que a sua hibridização em sequências de ácido nucleico não alvo e a exclusão substancial de ácidos nucleicos não alvo. Sequências de hibridização seletiva 5 possuem tipicamente pelo menos cerca de 80% de identidade de sequências, 90% de identidade de sequências ou até 100% de identidade de sequências, inclusive (ou seja, totalmente complementares) entre si. A expressão "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringente" inclui referência a condições nas quais uma sonda se 10 hibridizará seletivamente na sua sequência alvo. Condições estringentes são dependentes de sequências e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ao controlar a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, podem ser identificadas sequências alvo que são 1OO°/o complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência 15 podem ser ajustadas para permitir alguma falta de coincidência nas sequências, de tal forma que sejam detectados alguns graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda contém menos de cerca de mil nucleotídeos de comprimento, opcionalmente menos de quinhentos nucleotídeos de comprimento.

20 Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sais é de menos de cerca de 1,5 M de Íons de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de Íons (ou outros sais) sob pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (tais como dez a cinquenta nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas 25 longas (tais como mais de cinquenta nucleotídeos). Podem também ser atingidas condições estringentes com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida. Exemplos de condições de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCl,

1°/, dodecil sulfato de sódio ("SDS") a 37 °C e lavagem em lX a 2X SSC (20X ' SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrato trissódico) a 50-55 °C. Exemplos de condições de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% formamida, 1 M NaCl, i°/o SDS a 37 °C e Iavagem em 0,5X a lX SSC a 55 até 60 °C. Exemplos 5 de condições de alta estringência incluem hibridização em 50% formamida, 1 M NaCl, i°/o SDS a 37 °C e Iavagem em O,1X SSC a 60 até 65 °C. Um conjunto adicional de condições estringentes inclui, por exemplo, hibridização a O,1X SSC, 0,1% SDS, 65 °C e lavagens com 2X SSC, 0,1°/o SDS seguidas por O,1X SSC, 0,1% SDS.

10 A especificidade é tipicamente função de lavagens pós- hibridização, em que os fatores importantes são a resistência iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser calculada de forma aproximada por meio da equação de Meinkoth et al, Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984): T,,, = 81,5 °C + 16,6 (log M) " 0,41 15 (°/oGC) - 0,61 (°/0 form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes; °/oGC é o percentual de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, °/0 form é o percentual de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob pH e resistência iônica definidos) em que 5O°/j de uma sequência alvo complementar 20 hibridizam-se em uma sonda perfeitamente coincidente. A Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada i°/o de falta de coincidência; desta forma, Tm, condições de hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridização em sequências com a identidade desejada. Caso sejam procuradas sequências com z 90°6 de identidade, a Tm pode ser reduzida em 10 °C. Geralmente, são 25 selecionadas condições estringentes cerca de 5 °C mais baixas que a Tm para a sequência específica e seu complemento sob pH e resistência iônica definidos. Condições severamente estringentes podem utilizar, entretanto, hibridização e/ou lavagern a 1, 2, 3 ou 4 °C menos que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar hibridização e/ou Iavagem a 6, 7,

W " 8, 9 ou 10 °C menos que a Tn e condições de baixa estringência podem utilizar hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menos que a Tm. Utilizando a equação, composições de lavagem e hibridização e Tm 5 desejadas, os técnicos comuns no assunto compreenderão que são inerentemente descritas variações na estringência de soluções de lavagem e/ou hibridização. Caso o grau desejado de falta de emparelhamento resulte em Tm de menos de 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é ideal aumentar a concentração de SSC de forma que possa ser utilizada 10 temperatura mais alta. Um extenso guia da hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistiy and Molecular Bio/ogy - Hybrid/zation with Nuc/eic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Overview of Princip/es of Hybridization and the Strategy of Nuc/eic Acid Probe Assays, Elsevier, Nova Iorque (1993); e Current Protoco/s in Mo/ecular Bio/ogy, Capítulo 15 2, Ausubel et al, Eds., Greene Publishing e Wiley-lnterscience, Nova lorque (1995). As condições de hibridização e/ou lavagem podem ser aplicadas por pelo menos dez, trinta, sessenta, noventa, 120 ou 240 minutos. "Identidade de sequências" ou "identidade", no contexto de sequências de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, designa os residuos de 20 aminoácidos ou bases de ácidos nucleicos em duas sequências que são idênticas quando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Desta forma, "percentual de identidade de sequências" ou "percentual de identidade" indica o valor determinado por meio da comparação 25 de duas sequências alinhadas idealmente ao longo de uma janela de comparação, em que a parte da sequência de polinucleotídeos ou polipeptideos na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (ou seja, intervalos) em comparação com a sequência de referência

* V (que não compreende adições nem exclusões) para alinhamento ideal das 0 ' duas sequências. O percentual é calculado por meio de determinação da quantidade de posições em que o residuo de aminoácidos ou base de ácido nucleico idêntico ocorre nas duas sequências para gerar o número de posições 5 coincidentes, dividindo o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por cem para gerar o percentual de identidade de sequências. Métodos de determinação do "percentual de identidade" e "percentual de similaridade" são codificados em programas de computador 10 disponíveis ao público. O percentual de identidade e o percentual de similaridade podem ser facilmente calculados por meio de métodos conhecidos, incluindo, mas sem limitações, os descritos em: 1) Computational Mo/ecu/ar Bio/ogy (Lesk, A. M., ed.), Universidade de Oxford: Nova lorque (1988); 2) Biocomputing: lnformatics and Genome projects (Smith, D. W., ed.

15 Academic: Nova lorque (1993); 3) Computer Ana/ysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., Eds.), Humania: NJ (1994): 4) Sequence Analysis in Mo/ecu/ar Bio/ogy (von Heinje, G., Ed.), Academic (1987); e 5) Sequence Ana/ysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.), Stockton: Nova lorque (1991).

20 Cálculos de percentual de identidade ou simiiaridade e alinhamentos de sequências podem ser determinados utilizando uma série de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas, que incluem, mas sem limitações, o programa MegAlign® da suite de computação bioinformática LASERGENE (DNASTAR® lnc., Madison Wl). O alinhamento 25 múltiplo das sequências é realizado utilizando o "método Clustal de ' alinhamento" que engloba diversas variedades do algoritmo, incluindo o "método Clustal V de alinhamento" e o "método Clustal W de alinhamento" (descritos por Higgins e Sharp, CAB/OS, 5: 151-153 (1989); Higgins, D. G. et

U al, Comput. Appl. Biosci., 8: 189-191 (1992)) e encontrados no programa " MegAlign® (versão 8.0.2) (acima). Após alinhamento das sequências utilizando qualquer programa CIustal, é possÍvel obter um "percentual de identidade" observando a tabela "distâncias de sequências" no programa.

5 Para diversos alinhamentos utilizando o método Clusta! V de alinhamento, os valores padrão correspondem a PENALIDADE DO INTERVALO = 10 e PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 10. Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando o método Clustal V são 10 COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2, PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM 15 DIAGONAIS = 4. Os parâmetros padrão de alinhamento múltiplo utilizando o método Clustal W de alinhamento correspondem a PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 0,2, Sequências Divergentes de Atraso (°/0) = 30, Peso de Transição de DNA = 0,5, 20 Matriz em Peso de Proteína = Série Gonnet, Matriz em Peso de DNA = IUB. O "método BLASTN de alinhamento" é um algoritmo fornecido pelo Centro Nacional de Informações Biotecnológicas ("NCBI") para comparar sequências de nucleotídeos utilizando parâmetros padrão, enquanto o "método BLASTP de alinhamento" é um algoritmo fornecido pelo NCBI para comparar 25 sequências de proteína utilizando parâmetros padrão. Os técnicos no assunto compreendem que muitos níveis de identidade de sequências são úteis na identificação de polipeptideos de outras substâncias, em que esses polipeptídeos possuem função ou atividade idêntica

V

Q ou similar. Fragmentos de ácidos nucleicos apropriados, ou seja, ° pohnucleotídeos isolados de acordo com o presente relatório descritivo, codificam polipeptideos que são pelo menos cerca de 70 a 85°6 idênticos, enquanto fragmentos de ácidos nucleicos de maior preferência codificam 5 sequências de aminoácidos que são pelo menos cerca de 85 a 95% idênticas às sequências de aminoácidos relatadas no presente. Embora sejam descritas acima faixas preferidas, exemplos úteis de percentuais de identidade incluem qualquer percentual inteiro de 50% a 100%, tais como 51°/o, 52°/o, 53°6, 54°/o, 55%, 56%, 57°'6, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65°/o, 66%, 67%, 10 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 8O°/,, 81%, 82%, 83%, 84%, 85°/o, 86%, 87%, 88°/o, 89%, 9Ó°/o, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Também é de interesse qualquer complemento parcial ou de comprimento total desse fragmento de nucleotídeo isolado.

15 Os fragmentos de ácidos nucleicos apropriados não apenas possuem as homologias acima, mas tipicamente codificam um polipeptideo que contém pelo menos cinquenta aminoácidos, preferencialmente pelo menos cem aminoácidos, de maior preferência pelo menos 150 aminoácidos, de preferência ainda maior pelo menos duzentos aminoácidos e, de preferência 20 superior, pelo menos 250 aminoácidos. "Degeneração de códons" designa a natureza do código genético que permite a variação da sequência de nucleotídeos sem afetar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Consequentemente, é descrito no presente qualquer fragmento de ácido nucleico que codifica, no todo ou em 25 parte substancial, a sequência de aminoácidos que codifica os polipeptídeos do presente conforme descrito em SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 97, SEQ ID N° 139 e SEQ ID N° 179. Os técnicos no assunto conhecem bem a "orientação de códon" exibida por uma célula hospedeira específica no uso de códons de

V nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Ao sintetizar um gene para " aumento da expressão em uma célula hospedeira, portanto, é desejável projetar o gene de tal forma que a sua frequência de uso de códons aproxime- se da frequência de uso de códons preferida da célula hospedeira.

5 "Genes sintéticos" podem ser reunidos a partir de blocos de construção de oligonucleotÍdeos que são sintetizados quimicamente utilizando procedimentos conhecidos dos técnicos no assunto. Esses blocos de construção de oligonucleotÍdeos são combinados e ligados em seguida para formar segmentos de genes que são montados enzimaticamente em seguida 10 para construir todo o gene. Consequentemente, os genes podem ser elaborados para expressão genética ideai com base na otimização de sequências de nucleotídeos para refletir a orientação de códons da célula hospedeira. Os técnlcos no assunto apreciam a probabilidade de expressão genética bem sucedida caso o uso do códon seja orientado para os códons 15 favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode ser baseada em uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira, na qual as informações de sequências são disponíveis. O perfil de uso de códons para Yarrowia lipo/ytica é fornecido, por exemplo, na Patente Norte-Americana n°

7.125.672.

20 "Gene" indica um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteina específica e que pode designar a região de codificação isoladamente ou pode incluir sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5') e posteriores (sequências não codificadoras 3') à sequência de codificação. "Gene nativo" designa um gene conforme encontrado na 25 natureza com as suas próprias sequências reguladoras. "Gene quimérico" indica qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender

W

0 sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de e

' fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma forma diferente da encontrada na natureza. "Gene endógeno" indica um gene nativo no seu local

5 natural no genoma de um organismo.

Gene "exógeno" indica um gene que é introduzido no organismo hospedeiro por meio de transferência genética.

Genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, genes nativos introduzidos em um novo local no hospedeiro nativo ou genes quiméricos. "Transgene" é um gene que foi

, 10 introduzido no genoma por meio de um procedimento de transformação. "Gene otimizado por códons" é um gene que possui a sua frequência de uso de códons projetada para imitar a frequência de uso de códons preferida da célula hospedeira. "Sequência de codificação" designa uma sequência de DNA que

15 codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras" designam sequências de nucleotideos localizadas acima no fluxo (sequências não codificadoras 5'), no interior ou abaixo no fluxo (sequências não codificadoras 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência

20 de codificação associada.

As sequências reguladoras podem incluir, mas sem limitações: promotores, amplificadores, silenciadores, sequências líderes não traduzidas 5' (tais como entre o local de início de transcrição e o códon de início de tradução), introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, locais de processamento de RNA, locais de ligação de efetores e estruturas de

25 circuito e haste- "Promotor" designa uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional.

Geralmente, uma sequência de codificação está localizada a 3' de uma sequência

V

D promotora. Promotores podem ser completamente derivados de um gene 0 " nativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem que diferentes 5 promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Promotores que causam a expressão de um gene na maior parte dos tipos de células na maior parte das vezes são comumente denominados "promotores constitutivos". Reconhece-se 10 ainda que, como na maior parte dos casos as fronteiras exatas de sequências reguladoras (especialmente na sua extremidade 5') não foram completamente definidas, fragmentos de DNA com alguma variação podem possuir atividade promotora idêntica. As expressões "sequências não codificadoras 3'", "terminal de 15 transcrição" e "sequências de término" designam sequências de DNA Iocalizadas abaixo no fluxo de uma sequência de codificação. lsso inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificadoras de sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão genética. O sinal de poliadenilação normalmente é 20 caracterizado por afetar a adição de características de ácido poliadenhico à extremidade 3' do precursor de mRNA. A região 3' pode influenciar a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou a tradução da sequência de codificação associada. "Transcrito de RNA" designa o produto resultante da transcrição 25 catalisada por RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA for uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, ele é denominado transcrito primário. Um transcrito de RNA é denominado RNA maduro quando for uma sequência de RNA derivada do processamento pós-

W

T tradução do transcrito primário. "RNA mensageiro" ou "mRNA" designa o RNA y » que não contém introns e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "cDNA" designa um DNA que é complementar a um modelo de mRNA que utiliza a enzima transcriptase reversa e é sintetizado a partir dele. O CDNA 5 pode possuir fita única ou ser convertido na forma de fita dupla utilizando o fragmento Klenow de DNA polimerase I. RNA "com sentido" designa o transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. "RNA sem sentido" indica um transcrito de RNA que é complementar a um transcrito primário alvo ou mRNA, no todo ou em parte, e 10 que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente Norte-Americana n°

5.107.065). A expressão "ligado operativamente" designa a associação de sequências de ácidos nucleicos sobre um único fragmento de ácido nucleico, de tal forma que. a função de um seja afetada pelo outro. Um promotor é ligado 15 operativamente a uma sequência de codificação, por exemplo, quando for capaz de afetar a expressão daquela sequência de codificação, ou seja, aquela sequência de codificação encontra-se sob o controle transcricional do promotor. Sequências de codificação podem ser ligadas operativamente a sequências reguladoras em orientação com ou sem sentido.

20 O termo "recombinante" designa uma combinação artificial de dois segmentos de sequências separados de outra forma, tal como por meio de sÍntese química ou da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de métodos de engenharia genética. O termo "expressão", da forma utilizada no presente, indica a 25 transcrição e acúmulo estável de RNA com (mRNA) ou sem sentido. Expressão pode também designar a tradução de mRNA em uma proteina (seja ela precursora ou madura). "Transformação" designa a transferência de uma molécula de

Ü g ácido nucleico para um organismo hospedeiro, o que resulta em herança d

P

U geneticamente estável. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmideo que se reproduz de forma autônoma, por exemplo, ou pode integrar-se ao genoma do organismo hospedeiro. Os organismos hospedeiros que contêm os 5 fragmentos de ácidos nucleicos transformados são denominados organismos "transgênicos", "recombinantes", "transformados" ou "transformadores". Os termos "pIasmídeo" e "vetor" designam um elemento cromossômico adicional que frequentemente conduz genes que não são parte do metabolismo central da célula e, normalmente, encontram-se na forma de 10 moléculas de DNA de fita dupla circulares. Esses elementos podem ser sequências reprodutoras autônomas, sequências integrantes de genomas, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um RNA ou DNA com fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que uma série de sequências de nucleotídeos uniu-se ou recombinou-se em uma única 15 construção que é capaz de introduzir um ou mais conjuntos de expressão em uma célula. A expressão "conjunto de expressão" designa um fragmento de DNA que contém um gene exógeno e possui elementos além do gene exógeno que permitem expressão aprimorada daquele gene em um hospedeiro 20 exógeno. Geralmente, um conjunto de expressão compreenderá a sequência de codificação de um gene selecionado e sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5') e seguintes (sequências não codificadoras 3) que são necessárias para a expressão do produto genético selecionado. Desta forma, um conjunto de expressão é tipicamente composto de: 1) uma 25 sequência promotora; 2) uma sequência de codificação ("ORF"); e 3) uma região não traduzida 3' (ou seja, um terminal) que, em eucariotes, normalmente contém um local de poliadenilação. O(s) conjunto(s) de expressão normalmente é(São) inc1uído(s) em um vetor para facilitar a clonagem e transformação. Diferentes conjuntos de expressão podem ser transformados

P m em diferentes organismos que incluem bactérias, leveduras, pIantas e células de mamíferos, desde que as sequências reguladoras corretas sejam utilizadas para cada hospedeiro.

5 As expressões "construção recombinante", "construção de expressão", "construção quimérica", "construção" e "construção de DNA recombinante" são utilizadas de forma intercambiável no presente. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácidos nucleicos, tais como sequências reguladoras e de codificação que 10 não são encontradas juntas na natureza. Uma construção de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma forma diferente da encontrada na natureza. Essa 15 construção pode ser utilizada isoladamente ou pode ser empregada em conjunto com um vetor. Caso seja utilizado um vetor, a seleção do vetor depende do método que será empregado para transformar células hospedeiras como é bem conhecido dos técnicos no assunto. Pode ser utilizado, por exemplo, um vetor de plasmídeo.

20 Os técnicos no assunto conhecem bem os elementos genéticos que devem estar presentes sobre o vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras que compreendem qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolados descritos no presente. Os técnicos no assunto também reconhecerão que diferentes eventos de transformação 25 independente resultarão em níveis e padrões de expressão diferentes (Jones et al, EMBO J., 4: 2411-2418 (1985); De Almeida et al, Mol. Gen. Genetics, 218: 78-86 (1989)), de tal forma que diversos eventos devem ser selecionados a fim de obter linhagens que exibem o nivel e padrão de expressão desejados. Essa

I 37

W e . B seleção pode ser realizada por meio de análise Southern de DNA, análise " Northern da expressão de mRNA, análise Western da expressão de proteínas ou análise fenotípica, entre outras. A expressão "software de análise de sequências" designa 5 qualquer algoritmo de computador ou programa de software que seja útil para análise de sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos. "Software de análise de sequências" pode ser disponível comercialmente ou desenvolvido independentemente. Software de análise de sequências típico incluirá, mas sem limitações: 1) a suite GCG de programas (Pacote Wisconsin Versão 9.0, 10 Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl): 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al, j. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)); 3) DNASTAR (DNASTAR, lnc. Madison Wl); 4) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor Ml); e 5) o programa FASTA que incorpora o algoritmo de Smith- Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., (Proc. lnt. Symp.) 15 (1994), data da reunião 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor, Plenum: Nova lorque, NY). Dentro dessa descrição, sempre que for utilizado soMare de análise de sequências para análise, os resultados analíticos são baseados nos "valores padrão" do programa indicado, a menos que especificado em contrário. Da forma utilizada no presente, "valores padrão" ind icarão qualquer 20 conjunto de valores ou parâmetros que são originalmente carregados com o software quando inicializado em primeiro lugar. Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Mo/ecu/ar 25 Cloning.' A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989); Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova lorque (1984); e Ausubel, F. M. et al, Current Protoco/s in

Mo/ecu/ar Bio/ogy, publicado pela Greene Publishing Assoc. e Wiley- . " lnterscience, Hoboken NJ (1987). Geralmente, o acúmulo de lipídios em micro-organismos oleaginosos é acionado em resposta à relação geral entre carbono e nitrogênio

5 no meio de crescimento.

Este processo, que gera a sÍntese original de palmitato livre (16:0) em micro-organismos oleaginosos, é descrito em detalhes na Patente Norte-Americana n° 7.238.482. Palmitato é o precursor de derivados de ácidos graxos saturados e insaturados de cadeia mais longa.

O processo metabólico em que o ácido oleico é convertido em

10 ácidos graxos cú-3kú-6 envolve o alongamento da cadeia de carbono por meio da adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula por meio da adição de ligações duplas. lsso necessita de uma série de enzimas de alongamento e dessaturação especiais presentes na membrana do retículo endoplasmático.

Conforme observado, entretanto, na Fig. 1 e conforme

15 descrito abaixo, existem diversos processos alternativos de produção de um ácido graxo W-3/w-6 específico.

Especificamente, a Fig. 1 ilustra os processos descritos abaixo.

Todos os processos necessitam da conversão inicial de ácido oleico em ácido linoleico ("LA"), o primeiro dos ácidos graxos Cú-6, por uma LJ12 dessaturase.

Em seguida,

20 utilizando o "processo de A9 elongaseh58 dessaturase" e LA como substrato, são formados ácidos graxos Cü-6 de cadeia longa conforme segue: 1) LA é convertido em ácido eicosadienoico ("EDA") por uma LJ9 elongase; 2) EDA é convertido em ácido di-homo-Y-lino|ênico ("DGLA") por uma A8 dessaturase; 3) DGLA é convertido em ácido araquidônico ("ARA") por uma A5 dessaturase; 4) ARA é convertido em

25 ácido docosatetraenoico ("DTA") por uma elongase C20-22; e 5) DTA é convertido em ácido docosapentaenoico ("DPAn-6") por uma A4 dessaturase.

O "processo de A9 elongase/A8 dessaturase" pode também utilizar ácido a-linolênico ("ALA") como substrato para produzir ácidos graxos vú-3 de cadeia Ionga conforme segue: 1) LA é convertido em ALA, o primeiro

P " dos ácidos graxos W-3, por uma A15 dessaturase; 2) ALA é convertido em ácido eicosatrienoico ("ETrA") por uma A9 elongase; 3) ETrA é convertido em ácido eicosatetraenoico ("ETA") por uma A8 dessaturase; 4) ETA é convertido 5 em ácido eicosapentaenoico ("EPA") por uma A5 dessaturase; 5) EPA é convertido em ácido docosapentaenoico ("DPA") por uma elongase C20-22: e 6) DPA é convertido em ácido docosa-hexaenoico ("DHA") por uma A4 dessaturase. Opcionalmente, ácidos graxos W-6 podem ser convertidos em ácidos graxos óú-3. ETA e EPA são produzidos, por exemplo, a partir de DGLA 10 e ARA, respectivamente, por meio da atividade de L\17 dessaturase. Processos alternados de biossíntese de ácidos graxos w-3/w-6 utilizam uma A6 dessaturase e elongase C18-20, ou seja, o "processo de lj6 dessaturase/A6 elongase". Mais especificamente, LA e ALA podem ser convertidos em GLA e ácido estearidônico ("STA"), respectivamente, por uma 15 A6 dessaturase; em seguida, uma elongase C18-20 converte GLA em DGLA e/ou STA em ETA. PUFAS abaixo no fluxo são formados em seguida conforme descrito acima. Contempla-se que as funcionalidades especificas que necessitam ser introduzidas em um organismo hospedeiro específico para a produção de 20 ácidos graxos tú-3/W-6 dependerão da célula hospedeira (e seu perfil de dessaturase/elongase e/ou perfil de PUFA nativo), disponibilidade do substrato e produto(s) final(is) desejado(s). Pode-se preferir, por exemplo, a expressão do processo de A9 elongasel/!t8 dessaturase em algumas realizações, ao contrário da expressão do processo de A6 dessaturase/Lj6 elongase, pois 25 PUFAs produzidos por meio do processo anterior são isentos de GLA e/ou STA. Os técnicos no assunto serão capazes de identificar diversos genes possÍveis que codificam cada uma das enzimas desejadas para a biossíntese de ácidos graxos tú-3kú-6. Sequências de elongase e dessaturase 0 ' úteis podem ser derivadas de qualquer fonte, tal como isoladas de uma fonte natural (de bactérias, algas, fungos, plantas, animais etc.), produzidas por meio de um processo semissintético ou completamente sintetizadas. Embora a fonte 5 específica dos genes dessaturase e elongase introduzidos no hospedeiro não seja crítica, considerações para escolha de um polipeptídeo específico que possui atividade de dessaturase ou elongase incluem: 1) a especificidade de substrato do polipeptideo; 2) se o polipeptídeo ou um de seus componentes é uma enzima limitadora da velocidade; 3) se a dessaturase ou elongase é 10 essencial para a sÍntese de um PUFA desejado; 4) cofatores exigidos pelo polipeptídeo; e/ou 5) se o polipeptídeo foi modificado após a sua produção (tal como por uma quinase ou preniltransferase). O polipeptideo expresso possui preferencialmente parâmetros compativeis com o ambiente bioquímico da sua localização na célula hospedeira (vide a Patente Norte-Americana n° 7.238.482 15 para detalhes adicionais). Também será útil considerar a eficiência de conversão de cada dessaturase e/ou elongase específica. Mais especificamente, como cada enzima raramente funciona com 100% de eficiência para converter substrato em produto, o perfil final de lipídios de óleos não purificados produzidos em 20 uma célula hospedeira será tipicamente uma mistura de diversos PUFAS que consistem no ácido graxo w-3/tú-6 desejado, bem como diversos PUFAS intermediários acima no fluxo. Desta forma, a eficiência de conversão de cada enzima também é uma variável a ser considerada ao otimizar-se a biossíntese de um ácido graxo desejado.

25 Com cada uma das considerações acima em mente, possiveis genes que possuem as atividades de dessaturase e elongase apropriadas (tais como A6 dessaturases, elongases C18-20, A5 dessaturases, A17 dessaturases, A15 dessaturases, A9 dessaturases, 812 dessaturases, elongases C14-16,

elongases C16-18, A9 elongases, A8 dessaturases, A4 dessaturases e 0 " elongases C20-22) podem ser identificados de acordo com a Iiteratura disponível ao público (tal como Gen8ank), a literatura de patentes e análise experimental de organismos que possuem a capacidade de produzir PUFAS. Esses genes 5 serão apropriados para introdução em um organismo hospedeiro específico, para permitir ou aumentar a síntese de PUFAS pelo organismo. Quando ácidos graxos forem sintetizados em um organismo (incluindo ácidos graxos saturados e insaturados e ácidos graxos de cadeia curta e cadeia longa), eles podem ser incorporados a triacilglicérides ("TAGS").

10 TAGS, a unidade de armazenagem primária para ácidos graxos, são formados por uma série de reações que envolvem: 1) a esterificação de uma molécula de acil-CoA em 3-fosfato de glicerol por meio de uma aciltransferase para produzir ácido lisofosfatídico; 2) a esterificação de uma segunda molécula de acil-CoA por meio de uma aciltransferase para gerar fosfato de 1,2-diaci|g|icero| 15 (comumente identificado como ácido fosfatídico); 3) remoção de um fosfato por fosfatase de ácido fosfatídico para gerar 1,2-diaci|g|icero|: e 4) adição de um terceiro ácido graxo por meio da ação de uma aciltransferase para formar TAG.

Embora A5 dessaturases contenham diversas sequências conservadas (ou seja, as três caixas de histidina (H(X)3-4H (SEQ ID N° 1 e 2), 20 H(X)2-3HH(SEQ|DN°3e4)eH/Q(X)2-3HH(SEQ|DN°5e6))eodomínio citocromo bs), apenas o motivo de ligação heme (ou seja, His-Pro-Gly-Gly ou HPGG (SEQ ID N° 180)) não possui variação na sequência. Foi este motivo que foi selecionado em primeiro lugar como alvo de mutagênese. A literatura sugere que o resíduo de histidina no motivo HPGG é importante para função 25 (Sayanova, O. et al, P/ant Physiol., 121: 641 (1999); Guillou, H. et al, J. Lipid Res., 45: 32-40 (2004); Hongsthong, A. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 72: 1192-1201 (2006)). Consequentemente, evitam-se substituições para o resíduo de histidina em favor de substituições para os resíduos de prolina e glicina.

Mutagênese dirigida à local foi realizada independentemente ;p

" sobre a prolina e a segunda glicina no motivo HPGG de diversas A5 dessaturases, seguida pela expressão dos polipeptídeos mutantes resultantes e determinação das suas atividades com relação à da enzima do tipo

5 selvagem.

Surpreendentemente, foram criadas diversas A5 dessaturases mutantes que compreendem motivos mutantes de aminoácidos que incluem

HXGG (SEQ ID N" 181) e HPGX (SEQ ID N° 182), em que a atividade de A5 dessaturase da A5 dessaturase mutante foi funcionalmente equivalente à atividade de L\5 dessaturase da LJ5 dessaturase do tipo selvagem

10 correspondente.

Utilizou-se mutagênese dirigida à local mediada por oligonucleotídeos para criar mutações pontuais específicas no motivo HPGG de diversas LJ5 dessaturases alvo, Existem diversos protocolos de mutagênese dirigida a local (tais como lshii, T.

M. et al, Methods Enzymol., 293: 53-71

15 (1998); Ling, M.

M. e B.

H.

Robinson, Anal.

Biochem., 254: 157-178 (1997): Braman, J. (Ed.), ln Vitro Mutagenesis Protoco/s, segunda edição, Humania:

Totowa, NJ (2002); Kunkel, T.

A. et al, Methods Enzymol., 154: 367-382

(1987): Sawano, A. e Miyawaki, A., Nuc/eic Acids Res., 28: e78 (2000)); foi selecionado para uso, entretanto, o kit de mutagênese dirigida a local

20 QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) com base na sua fácil implementação e alta eficiência.

O procedimento básico utiliza um vetor de DNA de fita dupla superbobinado com um inserto de interesse e dois primers de oligonucleotÍdeos sintéticos que contêm a mutação desejada.

Os primers de oligonucleotideos, cada qual complementar a fitas opostas do vetor, são

25 estendidos durante a ciclização da temperatura por uma DNA polimerase.

A incorporação dos primers de oligonucleotídeos gera um pIasmídeo que sofreu mutação e contém incisões oscilantes.

Após a ciclização da temperatura, o produto é tratado com Dpn 1 endonuclease (específica para DNA metilado e semimetilado) como meio de digestão do modelo de DNA parental e seleção de

W " DNA mutante recém-sintetizado. O DNA de vetor incrustado que contém as mutações desejadas é transformado em seguida e propagado em um hospedeiro Escherichia co/i.

5 Utilizando os métodos descritos acima, todas as substituições de aminoácidos possÍveis foram introduzidas por meio de mutagênese dirigida a local em uma LJ,5 dessaturase sintética, otimizada por códons para expressão em Yarrowia lipolytica e derivada de Eug/ena graci/is (ou seja, EgD5S; SEQ ID N° 10; Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2007-0277266-A1) 10 dentro de uma construção de plasmídeo que compreende um gene FBAIN::EgD5S::Pex20 quimérico. Os mutantes foram transformados em E. co/i, sequenciados e transformados em seguida em uma linhagem apropriada de Y. /ipo/ytica elaborada anteriormente para produzir cerca de 18% de DGLA. lsso permitiu a seleção de atividade de A5 dessaturase com base em análises GC e 15 a produção de ARA, Foram identificadas muitas mutações que resultaram em uma A5 dessaturase mutante completamente não funcional (ou seja, que não possui atividade de A5 dessaturase detectável) ou uma A5 dessaturase mutante que possui atividade de A5 dessaturase substancialmente reduzida com relação à 20 enzima do tipo selvagem não mutante. Surpreendentemente, entretanto, a seleção preliminar identificou três resíduos de aminoácidos que poderão ser substituidos pela prolina no motivo HPGG e que resultaram em atividade de A5 dessaturase aproximadamente equivalente ou mais alta no mutante, em comparação com a atividade de A5 dessaturase na enzima do tipo selvagem 25 correspondente (ou seja, EgD5S). Desta forma, essa experimentação preliminar sugeriu que o resíduo de prolina no motivo de HPGG poderá ser substituído com diversos aminoácidos sem afetar significativamente a atividade de A5 dessaturase de EgD5S,

a Realizou-se experimentação similar utilizando EgD5S como

" modelo em reações de mutagênese dirigida a local, em que o segundo resíduo de glicina do motivo HPGG sofreu mutação.

Conforme descrito acima, análises das enzimas mutantes determinaram que dois residuos de aminoácidos foram

5 suficientes para substituir o aminoácido do tipo selvagem (ou seja, glicina) e resultaram em uma enzima EgD5S mutante que possui atividade de A5 dessaturase equivalente ou aprimorada.

Após o término das análises preliminares de substituições de aminoácidos no motivo HPGG de EgD5S conforme descrito acima, foi

10 conduzida uma análise quantitativa dos mutantes que apresentaram desempenho igual ou superior à taxa de conversão de EgD5S do tipo selvagem por meio de retransformação de cada plasmídeo que contém EgD5S mutante na linhagem hospedeira de Yarrowia lipolytica.

Análise de GC dos metil ésteres de ácidos graxos ("FAMEs") produzidos confirmou que a atividade de L\5

15 dessaturase de três dos cinco mutantes iniciais apresentou aumento da atividade em comparação com o EgD5S do tipo selvagem controle correspondente.

O protocolo experimental acima foi repetido utilizando uma A5 dessaturase sintética, otimizado por códons para expressão em Yarrowia

20 /ipo/ytica e derivado de Eug/ena anabaena (ou seja, EaD5S; SEQ ID N° 14: Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008-0274521-A1) e uma A5 dessaturase sintética, otimizada por códons para expressão em Y. hjpolytica e derivada de Peiidinium sp CCMP626 (ou seja, RD5S: SEQ ID N° 18: Pedido de

Patente Norte-Americano publicado n° 2007-0271632-A1). Os resultados de

25 toda a mutagênese dirigida a local que causaram atividade de A5 dessaturase equivalente ou mais alta no mutante em comparação com a enzima do tipo selvagem correspondente (ou seja, EgD5S, EaO5S ou RD5S) encontram-se resumidos abaixo na Tabela 3 (vide Exemplos para detalhes adicionais). Os mutantes são designados utilizando a nomenclatura em detalhes a seguir: 1)

" enzima do tipo selvagem; 2) hífen (-); 3) motivo HPGG mutante.

Desta forma, por exemplo, a enzima mutante criada com o EgD5S otimizado por códons sintético (ou seja, SEQ id N° 10) que contém uma substituição de histidina por

5 prolina no aminoácido 2 (ou seja, uma substituição de P2 por H) do motivo HPGG é identificada como EgD5S-HHGG.

Tabela 3 Mutantes COM Motivo HPGG QUE Resultam EM Aumento DA Atividade DE A5

Dessaturase

SEQ ID N° de A5 Dessaturase I : Atividade de A5 A5 Dessaturase Mutante I I Dessaturase Mutante

EgD5S-HGGG I SEQ ID N° 58 I 104,6%

EgD5S-HHGG SEQ ID N° 58 103,6°6

EgD5S-HPGS SEQ ID N° 97 106,9%

EaD5S-HCGG SEQ ID N° 139 107,9%

RD5S-HCGG SEQ ID N° 179 138,6% *

RD5S-HWGG | SEQ ID N° 179 113,5% *

10 * O percentual de aumento da atividade de A5 dessaturase da enzima mutante com relação à enzima não mutante do tipo selvagem correspondente é relatado com base em resultados de teste iniciais e não em análise quantitativa.

Os dados acima não sugerem um consenso com relação a qual

15 substituição de aminoácido específica é suficiente para produzir um polipeptídeo mutante que possua atividade de A5 dessaturase mais alta.

Ao a 0 contrário dos relatórios mencionados acima na técnica, entretanto, os dados

W " são surpreendentes ao demonstrarem que substituições para os residuos de prolina ou glicina podem resultar em uma enzima que possui atividade de LJ5 dessaturase mais alta que o seu pai do tipo selvagem. Consequentemente, 5 encontra-se dentro do escopo da presente invenção fornecer um polipeptídeo mutante que possui atividade LJ5 dessaturase que compreende um motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 183 (HGGG), SEQ ID N" 184 (HHGG), SEQ ID N° 186 (HCGG), SEQ ID N° 187 (HWGG) e SEQ ID N° 185 (HPGS). Preferencialmente, o polipeptídeo contém a 10 sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 58 (EgD5S-HGGG e EgD5S-HHGG), SEQ ID N° 97 (EgD5S-HPGS), SEQ ID N° 139 (EaD5S-HCGG) e SEQ ID N° 179 (RD5S-HCGG e RD5S- HWGG). De maior preferência, a LJ5 dessaturase mutante: 1) compreende um motivo de aminoácido mutante selecionado a partir do grupo que consiste em: 15 SEQ ID N" 183 (HGGG), SEQ ID N" 184 (HHGG), SEQ ID N° 186 (HCGG), SEQ ID N° 187 (HWGG) e SEQ ID N° 185 (HPGS); e 2) a atividade de A5 dessaturase mutante é maior com relação à A5 dessaturase do tipo selvagem correspondente que contém um motivo de aminoácido HPGG (SEQ ID N° 180).

Os técnicos no assunto apreciarão que LJ5 dessaturases mutantes 20 úteis não se limitam às mutações descritas acima. Na verdade, os resultados sugerem que poderá ser realizada experimentação similar utilizando qualquer enzima A5 dessaturase do tipo selvagem que contenha um motivo HPGG (SEQ ID N° 180) no domínio de citocromo b5, de forma a elaborar uma A5 dessaturase mutante que possui atividade de A5 dessaturase mais alta, em 25 que a mutação resultaria em um motivo HXGG mutante (SEQ ID N° 181) ou um motivo HPGX (SEQ ID N° 182). Uma enzima mutante que possui atividade de L\5 dessaturase mais alta pode ser útil para permitir aumento da produção de ácidos graxos üü-3/W-6.

Seleção e mutagênese in vitro ou PCR à prova de erros (Leung à " et al, Techniques, 1: 11-15 (1989): Zhou et al, Nucleic Acids Res., 19: 6052-6052 (1991); Spee et al, Nuc/eic Acids Res., 21: 777-778 (1993): Melnikov et al, Nuc/eic Acids Res., 27 (4): 1056-1062 (quinze de fevereiro de 5 1999)), por exemplo, poderão também ser empregadas como meio de obtenção de mutações de genes L\5 dessaturase de ocorrência natural, tais como EgO5S, EaD5S ou RD5S, em que as mutações podem incluir exclusões, inserções e mutações pontuais ou suas combinações. A principal vantagem de PCR à prova de erros é que todas as mutações introduzidas por meio desse 10 método estarão dentro do gene dessaturase desejado e qualquer alteração pode ser facilmente controlada por meio de alteração das condições de PCR. Alternativamente, pode-se empregar mutagênese in vivo utilizando materiais disponiveis comercialmente tais como a linhagem XLl-Vermelha de E. CO/i e linhagem de mutação XLl-Vermelha de Epicurian co/i da Stratagene (La Jolla 15 CA, Greener e Callahn, Strategies, 7: 32-34 (1994)). Esta linhagem apresenta deficiência em três dos processos de reparo de DNA primários (mutS, mutD e mut7), resultando em velocidade de mutação 5000 vezes mais alta que a do tipo selvagem. A mutagênese in vivo não depende da eficiência de ligação (como ocorre com PCR à prova de erros); pode ocorrer, entretanto, mutação 20 em qualquer região do vetor e as velocidades de mutação geralmente são muito mais baixas. Também se contempla que uma enzima A5 dessaturase mutante com atividade de A5 dessaturase alterada ou amplificada pode ser construída utilizando o método de "comutação genética" (Patente Norte-Americana n° 25 5,605,793; Patente Norte-Americana n° 5.811.238; Patente Norte-Americana n°

5.830.721; Patente Norte-Americana n° 5.837.458). O método de comutação genética é particularmente atraente devido à sua fácil implementação e alta velocidade de mutagênese. O processo de comutação genética envolve a restrição de um gene de interesse em fragmentos com tamanho específico na d presença de populações adicionais de regiões de DNA com similaridade (ou diferença) com o gene de interesse. Este conjunto de fragmentos desnaturar- se-á e recombinar-se-á em seguida para criar um gene que sofreu mutação. O 5 gene que sofreu mutação é selecionado em seguida para determinar alteração da atividade. Qualquer desses métodos pode ser utilizado para criar enzimas mutantes A5 dessaturase que contêm os motivos substituídos HXGG (SEQ ID N° 181) e HPGX (SEQ ID N° 182), que podem ser selecionados em seguida para aumento da atividade utilizando os métodos descritos no presente.

10 Espera-se que a introdução de genes quiméricos que codifiquem as A5 dessaturases mutantes descritas no presente (ou seja, em que a mencionada LJ5 dessaturase mutante compreende pelo menos uma mutação em uma região que codifica um motivo de aminoácido HPGG e em que a mencionada A5 dessaturase mutante aumentou a atividade de A5 dessaturase com relação à 15 da A5 dessaturase do tipo selvagem correspondente) sob o controle dos promotores apropriados resulte em aumento da produção de ARA e/ou EPA no organismo hospedeiro transformado, respectivamente. Desta forma, são descritos no presente métodos de produção direta de PUFAS que compreendem a exposição de um substrato ácido graxo (ou seja, DGLA e/ou 20 ETA) a uma enzima dessaturase mutante descrita no presente (tal como SEQ ID N" 58 (EgD5S-HGGG e EgD5S-HHGG), SEQ ID N° 97 (EgD5S-HPGS), SEQ ID N° 139 (EaD5S-HCGG), SEQ ID N° 179 (RD5S-HCGG e RD5S- HWGG)), de tal forma que o substrato seja convertido no produto ácido graxo desejado (ou seja, ARA e/ou EPA, respectivamente).

25 Mais especificamente, é descrito no presente um método de produção de ARA em uma célula hospedeira microbiana (tal como bactéria, levedura, algas, euglenoides, estramenópilos, oomicetes e fungos), em que a célula hospedeira microbiana compreende:

e a. urn polipeptídeo que possui atividade de A5 dessaturase " que compreende um motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 183 (HGGG), SEQ ID N° 184 (HHGG), SEQ ID N° 186 (HCGG), SEQ ID N° 187 (HWGG) e SEQ ID N° 185 (HPGS); e

5 b. uma fonte de DGLA; em que a célula hospedeira é cultivada sob condições tais que a A5 dessaturase mutante é expressa e o DGLA é convertido em ARA, em que o

ARA é opcionalmente recuperado.

Em outro método descrito no presente, a L\5 dessaturase mutante

10 pode ser utilizada para conversão de ETA em EPA.

Consequentemente é descrito um método de produção de EPA, em que a célula hospedeira compreende:

a. um polipeptídeo que possui atividade de A5 dessaturase que compreende um motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo que

15 consiste em: SEQ ID N° 183 (HGGG), SEQ ID N° 184 (HHGG), SEQ ID N° 186 (HCGG), SEQ ID N° 187 (HWGG) e SEQ ID N° 185 (HPGS): e b. uma fonte de ETA; em que a célula hospedeira é cultivada sob condições tais que a A5 dessaturase mutante é expressa .e o ETA é convertido em EPA, em que o

20 EPA é opcionalmente recuperado.

Alternativamente, cada gene A5 dessaturase mutante e seu produto de enzima correspondente descrito no presente podem ser utilizados indiretamente para a produção de diversos PUFAS üü-6 e üú-3 (vide a Fig. 1;

Patente Norte-Americana n° 7.238.482; Pedido de Patente lnternacional

25 publicado n° WO 2007/136671 e Pedido de Patente lnternacional publicado n" WO 2007/136646). Ocorre a produção indireta de PUFAs tú-3/W-6, em que o substrato de ácido graxo é convertido indiretamente no produto ácido graxo desejado, por meio de uma ou mais etapas intermediárias ou intermediário(s)

de processo. Desta forma, contempla-se que as A5 dessaturases mutantes

V " descritas no presente possam ser expressas em conjunto com genes adicionais que codificam enzimas do processo biossintético de PUFA (tais como LJ6 dessaturases, elongases C18/20, A17 dessaturases, L\8 5 dessaturases, A1 5 dessaturases, LJ9 dessaturases, A1 2 dessaturases, elongases C14/16, elongases C16/18, A9 elongases, A5 dessaturases, A4 dessaturases, elongases C20/22) para resultar em níveis mais altos de produção de ácidos graxos w-3/w-6 de cadeia mais longa, tais como ARA, EPA, DTA, OPAn-6, DPA e/ou DHA.

10 Preferencialmente, as A5 dessaturases descritas no presente serão expressas minimamente em conjunto com uma LJ,9 elongase e uma A8 dessaturase. As A5 dessaturases poderão também ser expressas minimamente em conjunto com uma A6 dessaturase e uma A6 elongase. Os genes específicos incluídos em um conjunto de expressão específico 15 dependerão, entretanto, da célula hospedeira (e seu perfil de PUFA e/ou perfil de dessaturase/elongase), da disponibilidade de substrato e do(s) produto(s) final(is) desejado(s).

É necessário criar e introduzir uma construção recombinante que compreende um ORF que codifica uma A5 dessaturase mutante (ou seja, em 20 que o mencionado mutante compreende um motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 183 (HGGG), SEQ ID N° 184 (HHGG), SEQ ID N" 186 (HCGG), SEQ ID N° 187 (HWGG) e SEQ ID N° 185 (HPGS)) em uma célula hospedeira apropriada. Os técnicos no assunto conhecem materiais de recurso padrão que descrevem: 1) condições e 25 procedimentos específicos de construção, manipulação e isolamento de macromoléculas, tais como moléculas de DNA, plasmídeos etc.; 2) geração de fragmentos de DNA recombinantes e construções de expressão recombinantes; e 3) seleção e isolamento de clones. Vide Sambrook, J.,

V » Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecu/ar C/oning.' A Laboratoty Manual, segunda

W " edição, CoId Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova lorque (1989) (a seguir, "Maniatis"); Silhavy, T. j., Bennan, M. L. e Enquist, L. W., Exper/ments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring 5 Harbor, Nova lorque (1984); e Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Mo/ecu/ar Bio/ogy, publicado pela Greene Publishing Assoc. e Wiley- lnterscience, Hoboken NJ (1987). Geralmente, a seleção de sequências incluídas na construção depende dos produtos de expressão desejados, da natureza da célula 10 hospedeira e dos meios propostos de separação de células transformadas contra células não transformadas. Os técnicos no assunto conhecem os elementos genéticos que necessitam estarem presentes sobre o vetor de plasmídeo para transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras que contêm o gene quimérico. Tipicamente, entretanto, o vetor ou 15 conjunto contém sequências que dirigem a transcrição e a tradução do(s) gene(s) relevante(s), um marcador selecionável e sequências que permitem a reprodução autônoma ou integração cromossômica. Vetores apropriados compreendem uma região 5' do gene que controla o início de transcrição, ou seja, um promotor, a sequência codificadora de genes e uma região 3' do 20 fragmento de DNA que controla o término de transcrição, ou seja, um terminal. É de preferência superior quando as duas regiões de controle são derivadas de genes da célula hospedeira transformada, embora elas não necessitem ser derivadas dos genes nativos para o hospedeiro de produção. Regiões de controle de início de transcrição (também promotores 25 ou regiões de controle de inicio) úteis para dirigir a expressão dos ORFS de A5 dessaturase do presente na céluia hospedeira microbiana desejada são bem conhecidas. Essas regiões de controle podem compreender um promotor, amplificador, silenciador, sequências de intron, regiões 3' UTR e/ou 5' UTR e elementos de estabilização de RNA e/ou proteína. Esses elementos podem

W ' variar de resistência e especificidade. Virtualmente qualquer promotor, ou seja, nativo, sintético ou quimérico, capaz de dirigir a expressão desses genes na célula hospedeira selecionada é apropriado, embora as regiões de transcrição 5 e tradução da espécie hospedeira sejam particularmente úteis. A expressão em uma célula hospedeira pode ser realizada de forma induzida ou constitutiva. A expressão induzida ocorre por meio de indução da atividade de um promotor regulável ligado operativamente ao gene de interesse, enquanto a expressão constitutiva ocorre por meio do uso de um promotor constitutivo.

10 Quando a célula hospedeira for Ievedura, são fornecidas regiões de transcrição e tradução funcionais em células de levedura, particularmente da espécie hospedeira. Vide, por exemplo, o Pedido de Patente Norte- Americano publicado n° 2006-0115881-A1, correspondente ao Pedido lntemacional publicado n° WO 2006/052870 para regiões reguladoras de início 15 de transcrição preferidas para uso em Yarrow/a /ipo/ytica. Pode ser utilizada qualquer uma dentre uma série de sequências reguladoras, dependendo se é desejada transcrição constitutiva ou induzida, da eficiência do promotor na expressão do ORF de interesse, da facilidade de construção e similares.

Descobriu-se que sequências de nucleotídeos que envolvem o 20 códon de início de tradução "ATG" afetam a expressão em células de leveduras. Caso o polipeptídeo desejado seja mal expresso em levedura, as sequências de nucleotídeos de genes exógenos podern ser modificadas para que incluam uma sequência de início de tradução de levedura eficiente para obter expressão genética ideal. Para expressão em levedura, isso pode ser 25 realizado por meio de mutagênese dirigida a local de um gene expresso ineficientemente por meio da sua fusão em quadro a um gene de levedura endógeno, preferencialmente um gene de alta expressão. Alternativamente, pode-se determinar a sequência de início de tradução de consenso no hospedeiro e elaborar essa sequência na forma de genes heterólogos para sua

W expressão ideal no hospedeiro de interesse. Podem ser fornecidas sequências não codificadoras 3' que codificam regiões de término de transcrição em uma construção recombinante 5 ou elas podem ser da região 3' do gene do qual foi obtida a região de início ou de um gene diferente. Um grande número de regiões de término é conhecido e funciona satisfatoriamente em uma série de hospedeiros, quando utilizadas em gêneros e espécies idênticos e diferentes dos quais foram derivadas. As regiões de término podem também ser derivadas de diversos genes nativos 10 dos hospedeiros preferidos. A região de término normalmente é selecionada mais por questão de conveniência que devido a qualquer propriedade específica. A região 3' pode também ser sintética, pois os técnicos no assunto podem utilizar as informações disponiveis para projetar e sintetizar uma sequência de região 3' que funcione como um término de transcrição. Um local 15 de término pode ser desnecessário, mas é altamente preferido. A mera inserção de um gene em um vetor de clonagem não garante a sua expressão na velocidade, concentração, quantidade desejada etc. Em resposta à necessidade de alta velocidade de expressão, muitos vetores de expressão especializados foram criados por meio de ajuste de 20 certas propriedades que regem a transcrição, estabilidade de RNA, tradução, estabilidade de proteina e localização, limitaçáo de oxigênio e secreção da célula hospedeira microbiana. Estas propriedades incluem: a natureza das sequências promotora e de término de transcrição relevantes; o número de cópias do gene cIonado (no qual cópias adicionais podem ser clonadas em 25 uma única construção de expressão e/ou cópias adicionais podem ser introduzidas na célula hospedeira por meio de aumento do número de cópias de plasmldeo ou de integração múltipla do gene clonado no genoma); se o gene é baseado em plasmídeo ou integrado ao genoma da célula hospedeira;

r 54

P 0 o local celular final da proteína exógena sintetizada; a eficiência de tradução e

W " a dobra correta da proteína no organismo hospedeiro; a estabilidade intrínseca do mRNA e proteina do gene clonado na célula hospedeira; e o uso de códons no gene clonado, de tal forma que a sua frequência aproxime-se da frequência 5 de uso de códons preferido da célula hospedeira. Cada um destes pode ser utilizado nos métodos e células hospedeiras descritas no presente, para otimizar ainda mais a expressão das LJ5 dessaturases mutantes. Após a criação de uma construção recombinante que compreende pelo menos um gene quimérico que compreende um promotor, um ORF de L\5 10 dessaturase e um terminal, ela é colocada em um vetor de pIasmideo capaz de reprodução autônoma em uma célula hospedeira ou é integrado diretamente ao genoma da célula hospedeira. A integração de conjuntos de expressão pode ocorrer aleatoriamente no interior do genoma hospedeiro ou pode ser dirigida utilizando construções que contêm regiões de homologia com o genoma 15 hospedeiro suficientes para dirigir a recombinação no interior do local hospedeiro. Quando as construções forem dirigidas para um local endógeno, as regiões reguladoras da transcrição e tradução podem ser fornecidas, no todo ou em parte, pelo local endógeno. Quando dois ou mais genes forem expressos a partir de vetores 20 de reprodução separados, é desejável que cada vetor possua um meio diferente de seleção e não possua homologia com a(s) outra(s) construção(ões) para manter expressão estável e evitar a redisposição de elementos entre as construções. A seleção criteriosa de regiões reguladoras, meios de seleção e método de propagação da(s) construção(ões) 25 introduzida(s) pode ser determinada experimentalmente de forma que todos os genes introduzidos sejam expressos nos niveis necessários para fomecer a sÍntese dos produtos desejados.

As construções que compreendem O(S) gene(s) de interesse

Z 0 » podem ser introduzidas em uma célula hospedeira microbiana por meio de « " qualquer método padrão. Estes métodos incluem a transformação, tal como transformação de acetato de lítio (Methods in Enzymo/ogy, 194: 186-187 (1991)), impacto bolístico, eletroporação, microinjeção ou qualquer outro 5 método que introduza o(S) gene(s) de interesse na célula hospedeira. Por conveniência, uma célula hospedeira que foi manipulada por meio de qualquer método para absorver uma sequência de DNA, tal como em um conjunto de expressão, é denominada no presente "transformada", "transformante" ou "recombinante". O hospedeiro transformado conterá pelo 10 menos uma cópia da construção de expressão e pode conter duas ou mais, dependendo se o conjunto de expressão é integrado ao genoma, amplificado ou está presente sobre um elemento extracromossômico que contém diversos números de cópias. A célula hospedeira transformada pode ser identificada por meio de seleção em busca de um marcador contido sobre a construção 15 introduzida. Alternativamente, uma construção de marcador separado pode ser cotransformada com a construção desejada, pois diversos métodos de transformação introduzem muitas moléculas de DNA em células hospedeiras.

Tipicamente, os hospedeiros transformados são selecionados pela sua capacidade de crescimento sobre meios seletivos, que podem 20 incorporar um antibiótico ou não conter um fator necessário para o crescimento do hospedeiro não transformado, tal como um nutriente ou fator de crescimento. Um gene marcador introduzido pode conferir resistência a antibióticos ou codificar uma enzima ou fator de crescimento essencial, de forma a permitir o crescimento sobre meios seletivos quando expresso no 25 hospedeiro transformado. A seleção de um hospedeiro transformado pode também ocorrer quando a proteína marcadora expressa puder ser detectada, seja direta ou indiretamente. Métodos de seleção adicionais são descritos na Patente Norte-Americana n° 7.238.482, Patente Norte-Americana n° 7.259.255 r_ 56 0 0 e Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2006/052870. 0

D Após a transformação, os substratos apropriados para as A5 dessaturases mutantes do presente (e, opcionalmente, outras enzimas de PUFA que são coexpressas no interior da célula hospedeira) podem ser 5 produzidos pelo hospedeiro de forma natural ou transgênica ou podem ser fornecidos de forma exógena.

Diversos organismos eucarióticos são apropriados como hospedeiros, de forma a gerar um transformante que compreende A5 dessaturases mutantes conforme descrito no presente, incluindo bactérias, 10 leveduras, algas, estramenópilos, oomicetes, euglenoides e/ou fungos. lsso é contemplado porque o aparelho biossintético de proteínas, transcrição e tradução é altamente conservado. Desta forma, os hospedeiros apropriados podem incluir aqueles que crescem sobre uma série de estoques de alimentação, incluindo carboidratos simples ou complexos, ácidos graxos, 15 ácidos orgânicos, óIeos, gliceróis e alcoóis e/ou hidrocarbonetos ao longo de uma ampla variedade de valores de pH e temperatura.

Os hospedeiros microbianos preferidos são organismos oleaginosos. Esses organismos oleaginosos são naturalmente capazes de sÍntese e acúmulo de óleos, em que o teor total de óleo pode compreender 20 mais de cerca de 25% do peso de células secas, de maior preferência mais de cerca de 30% do peso de células secas e, de preferência superior, mais de cerca de 4Ó°/o do peso de células secas. Diversas bactérias, algas, euglenoides, musgos, fungos, leveduras e estramenópilos são naturalmente classificados como oleaginosos. Em realizações alternativas, um organismo 25 não oleaginoso pode ser geneticamente modificado para tornar-se oIeaginoso, tal como uma levedura como Saccharomyces cerevisiae.

Em realizações de maior preferência, as células de hospedeiro microbiano são de Ievedura oleaginosa. Os gêneros tipicamente identificados

* como Ievedura oleaginosa incluem, mas sem limitações: Yarrowia, Candida,

W ' Rhodotoru/a, Rhodosporidium, C/yptococcus, Trichosporon e Lipomyces. Mais especificamente, ilustrações de leveduras de sÍntese de óleo incluem: Rhodosporidium toru/oides, Lipomyces starkeyii, L. lipoferus, Candida revkaufi, 5 C. pu/cherrima, C. tropica//s, C. uti/is, Trichosporon pu//ans, T. cutaneum, Rhodotoru/a g/utinus, R. graminis, and Yarrowia l/po/ytica (anteriormente classificada como Candida lipo/ytica). Alternativamente, a biossíntese de óleo pode ser geneticamente elaborada de tal forma que a célula hospedeira microbiana (tal como uma levedura) possa produzir mais de 25% do peso seco 10 celular em óleo e, portanto, ser considerada oleaginosa. É de preferência superior a Ievedura oleaginosa Yarrowia /ipo/ytica. Em uma realização adicional, são de preferência superior as linhagens de Y. l/po/ytica denominadas ATCC n° 20362, ATCC n° 8862, ATCC n° 18944, ATCC n° 76982 e/ou LGAM S(7) 1 (Papanikolaou, S. e Aggelis, G., 15 Bioresour. Technol., 82 (1): 43-9 (2002)). Ensinamentos especificos aplicáveis para transformação de leveduras oleaginosas (ou seja, Yarrowia //po/ytica) incluem a Patente Norte- Americana n° 4.880.741, Patente Norte-Americana n° 5.071.764 e Chen, D. C.

et al, AppI. Microbiol. Biotechnol., 48 (2): 232-235 (1997). Ensinamentos 20 específicos aplicáveis à elaboração da produção de ARA, EPA e DHA em Y. /ipo/ytica são fornecidos no Pedido de Patente Norte-Americano n° 11/264784 (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2006/055322), Pedido de Patente Norte-Americano n° 11/265761 (Pedido de Patente lnternacional publicado n° 2006/266.641) e Pedido de Patente Norte-Americano n° 25 11/264737 (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2006/052871), respectivamente. O método preferido de expressão de genes nessa levedura é a integração de DNA linear ao genoma do hospedeiro. lntegração em diversos e

O Iocais no interior do genoma pode ser particularmente útil ao desejar-se

P " expressão de genes em alto nível, tal como no local Ura3 (Acesso Gen8ank n° AJ306421), o local genético Leu2 (acesso Genbank n° AF260230), o local genético Lys5 (acesso Genbank n° M34929), o local genético ACo2 (acesso 5 Genbank n° AJO01300), o local genético POX3 (POX3: acesso Genbank n° XP _503244; ou ACO3: acesso Genbank n° AJO01301), o Iocal de gene A12 dessaturase (Patente Norte-Americana n° 7.214.491), o local genético Lipl l (acesso Genbank n° Z50020), o local genético Lip2 (acesso Genbank n° AJO12632), o local genético SCP2 (acesso Genbank n° AJ431362), o local 10 genético Pex3 (acesso Genbank n° CAG78565), o local genético Pex16 (acesso Genbank n° CAG79622) e/ou o local genético PexlO (acesso Genbank n° CAG81606).

Métodos de seleção preferidos para uso em Yarrowia //po/ytica são a resistência a canamicina, higromicina e o amino glicosideo G418, bem 15 como a capacidade de crescimento sobre meios sem uracil, leucina, lisina, triptofano ou histidina. Ácido 5-fluoro-orótico (mono-hidrato de ácido 5- fluorouracik6-carboxÍlico; "5-FOA") pode também ser especialmente útil para a seleção de levedura de mutantes de Ura" de levedura (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2009-0093543-A1) ou uma sintase aceto- 20 hidroxiácida nativa (ou acetolactato sintase; E. C. 4.1.3.18) que confere resistência ao herbicida sulfonil ureia (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2006/052870) é utilizada para a seleção de transformantes.

Um método exclusivo de "reciclagem" de um par de marcadores de seleção preferidos para seu uso em diversas transformações sequenciais, utilizando 25 sistemas de recombinase específicos de local, também é ensinado no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2009-0093543-A1.

Com base no acima, é descrito no presente um método de produção de ARA ou EPA, respectivamente, que compreende:

F

D (a) fornecimento de uma levedura oleaginosa (tal como 0 6 Yarrowia /ipo/ytica) que compreende: (i) uma primeira molécula de nucleotideo recombinante que codifica um polipeptídeo A5 dessaturase mutante, ligada operativamente a pelo 5 menos uma sequência reguladora; e (ii) uma fonte de substrato de dessaturase que consiste em DGLA e/ou ETA, respectivamente; e (b) cultivo da levedura da etapa (a) na presença de uma fonte de carbono fermentável apropriada em que o gene que codifica o polipeptídeo 10 A5 dessaturase mutante é expresso e DGLA é convertido em ARA e/ou ETA é convertido em EPA, respectivamente; e (C) recuperação opcional do ARÁ e/ou EPA, respectivamente, da etapa (b). Pode ser necessário alimentação do substrato, Em realizações 15 preferidas, o polipeptideo A5 dessaturase mutante é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 97, SEQ ID N° 139 e SEQ ID N° 179. Desta forma, por exemplo, a sequência de nucleotídeos do gene que codifica o polipeptídeo A5 dessaturase mutante pode ser selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 191, SEQ ID N° 192, 20 SEQID N°193,SEQIDN°194eSEQID N°195. Como PUFAS produzidos naturalmente em levedura oleaginosa são limitados a ácidos graxos 18:2 (ou seja, LA) e, menos comumente, ácidos graxos 18:3 (ou seja, ALA), a levedura oleaginosa pode ser geneticamente elaborada para expressar diversas enzimas necessárias para a biossíntese de 25 PUFAs de cadeia longa (de forma a permitir a produção, por exemplo, de OPAn-6, DPA e DHA), além das A5 dessaturases mutantes descritas no presente. Especificamente, é contemplada no presente uma levedura oleaginosa, em que a mencionada levedura compreende:

W a) uma primeira construção de DNA recombinante que e compreende um polinucleotideo isolado que codifica um polipeptídeo L\5 dessaturase mutante, ligado operativamente a pelo menos uma sequência 5 reguladora; e b) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional que compreende um polinucleotÍdeo isolado, ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: L\4 dessaturase, L!i6 10 dessaturase, A9 dessaturase, A12 dessaturase, A1 5 dessaturase, A17 dessaturase, A8 dessaturase, A9 dessaturase, elongase C14-16, elongase C16-18, elongase C1820 e elongase C20-22. Outros hospedeiros microbianos apropriados incluem bactérias oleaginosas, algas, euglenoides, estremenópilos, oomicetes e fungos. Dentro 15 desse amplo grupo de hospedeiros microbianos, são de interesse específico micro-organismos que sintetizam ácidos graxos W-3/W-6 ou aqueles que podem ser geneticamente elaborados com esse propósito (tais como outras leveduras, como Saccharomyces cerevisiae). Desta forma, por exemplo, a transformação de Mortiere//a a/pina (que é utilizada comercialmente para a 20 produção de ARA) com qualquer dos genes L\5 dessaturase do presente sob o controle de promotores indutíveis ou regulados poderá gerar um organismo transformador capaz de sÍntese de quantidades mais altas de ARA. O método de transformação de M. a/pina é descrito por Mackenzie et al (Appl. Environ. Mlcrobiol., 66: 4655 (2000)). De forma similar, métodos de transformação de 25 micro-organismos Thraustochytriales (tais como Thraustochytrium e Schizochytíium) são descritos na Patente Norte-Americana n° 7.001.772.

lndependentemente do hospedeiro selecionado para expressão das A5 dessaturases mutantes descritas no presente, diversos transformadores devem ser selecionados a fim de obter uma linhagem que exibe o nivel e o e ' padrão de expressão desejados. JL|retzek et al (Yeast, 18: 97-113 (2001), por exemplo, obseNam que a estabilidade de um fragmento de DNA integrado em Yarrowia /ipo/ytica depende dos transformadores individuais, da linhagem 5 receptora e da plataforma de direcionamento utilizada. Essa seleção pode ser realizada por meio de análise Southern Blot de DNA (Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975)), análise Northern da expressão de mRNA (Kroczek, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 618 (1-2): 133-145 (1993)), análises Western e/ou Elisa da expressão de proteínas, análise fenotípica ou análise GC dos produtos 10 de PUFA. O conhecimento das sequências das lj5 dessaturases mutantes do presente será útil para manipular a biossíntese de ácidos graxos cú-3 e/ou úú-6 em diversas células hospedeiras. Métodos de manipulação de processos bioquímicos são bem conhecidos dos técnicos no assunto e espera-se que 15 sejam possÍveis diversas manipulações para maximizar a biossíntese de ácidos graxos tú-3 e/ou íú-6 em leveduras oleaginosas e, particularmente, em Yarrowia /ipo/ytica. Esta manipulação pode necessitar de engenharia metabólica diretamente com o processo biossintético de PUFA ou manipulação adicional de processos que agregam carbono ao processo biossintético de 20 PUFA. Os métodos úteis para a regulagem para cima dos processos bioquimicos desejáveis e regulagem para baixo dos processos bioquímicos indesejáveis são bem conhecidos dos técnicos no assunto.

Processos bioquimicos que concorrem com os processos biossintéticos de ácidos graxos tú-3 e/ou W-6 para energia ou carbono ou 25 enzimas do processo biossintético de PUFA nativo que interferem com a geração de um produto final de PUFA específico, por exemplo, podem ser eliminados por meio de rompimento genético ou regulados para baixo por outros meios, tais como mRNA com sentido contrário.

Discussão detalhada de manipulações no processo biossintético e ' de PUFA como meio de aumento de ARA, EPA ou DHA e seus métodos associados são apresentados no Pedido de Patente Internacional publicado n° WO 2006/055322 (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2006- 5 0094092-A1), Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2006/052870 (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2006-0115881-A1) e Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2006/052871 (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2006-0110806-A1), respectivamente, e também são desejáveis manipuiações do processo biossintético de TAG e do processo 10 de degradação de TAG (e seus métodos associados). Pode ser útil modular a expressão do processo biossintético de ácido graxo por meio de qualquer uma das estratégias descritas acima. São fornecidos no presente, por exemplo, métodos por meio dos quais genes que codificam enzimas fundamentais no processo biossintético de 89 elongase/lj8 15 dessaturase e processo biossintético de A6 dessaturase/l\6 elongase são introduzidos em leveduras oleaginosas para a produção de ácidos graxos tú-3 e/ou üú-6. Será particularmente útil expressar os genes A5 dessaturase mutantes do presente em leveduras oleaginosas que naturalmente não possuem processos biossintéticos de ácido graxo íü-3 e/ou óú-6 e coordenam a 20 expressão desses genes, para maximizar a geração de produtos de PUFA preferidos utilizando diversos meios de engenharia metabólica do organismo hospedeiro.

A célula hospedeira microbiana transformada é cultivada sob condições que otimizam a expressão de genes quiméricos (tais como 25 dessaturase e elongase) e produzem o rendimento maior e mais econômico de PUFAs desejados. Geralmente, condições de meios que podem ser otimizadas incluem o tipo e a quantidade de fonte de carbono, tipo e quantidade de fonte de nitrogênio, razão entre carbono e nitrogênio, quantidade de diferentes íons minerais, nível de oxigênio, temperatura de crescimento, pH, duração da fase e ' de produção de biomassa, duração da fase de acúmulo de óleo e tempo e método de colheita celular. Os micro-organismos de interesse, tais como levedura oleaginosa (por exemplo, Yarrowia lipolytica), são geralmente 5 cultivados em um meio complexo tal como caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose ("YPD") ou um meio minimo definido que não contém um componente necessário para o crescimento e, desta forma, força a seleção dos conjuntos de expressão desejados (tais como Base de Nitrogênio de Levedura (DIFCO Laboratories, Detroit Ml)).

10 Os meios de fermentação para os métodos e células hospedeiras descritos no presente devem conter uma fonte de carbono apropriada conforme ensinado na Patente Norte-Americana n° 7.238.482. Embora se contemple que a fonte de carbono utilizada nos métodos do presente pode englobar uma ampla variedade de fontes que contêm carbono, as fontes de carbono 15 preferidas são açúcares (tais como glicose), gliceróis e/ou ácidos graxos. Nitrogênio pode ser fornecido a partir de uma fonte inorgânica (tal como (NH4)2SO4) ou orgânica(tal como ureia ou glutamato). Além das fontes de carbono e nitrogênio apropriadas, o meio de fermentação deve conter também minerais apropriados, sais, cofatores, tampões, vitaminas e outros 20 componentes conhecidos dos técnicos no assunto, apropriados para o crescimento do hospedeiro oleaginoso e promoção dos processos enzimáticos necessários para a produção de PUFA. Dedica-se atenção especifica a diversos Íons metálicos, tais como Fe"2, Cu"2, Mn"2, Co"2, Zn"2 e Mg"2, que promovem a sÍntese de lipidios e PUFAS (Nakahara, T. et al, lnd. Appl. Sing/e 25 Ce// Oi/s, D. J. Kyle e R. Colin, Eds., págs. 61-97 (1992)). Meios de crescimento preferidos para os métodos e células hospedeiras descritas no presente são meios comuns preparados comercialmente, tais como Base de N itrogênio de Levedura (DIFCO

Laboratories, Detroit Ml). Outros meios de crescimento sintéticos ou definidos

W " podem também ser utilizados e o meio apropriado de crescimento das células hospedeiras transformantes será conhecido dos técnicos no assunto de microbiologia ou ciências da fermentação. Uma faixa de pH apropriada para a 5 fermentação é tipicamente de cerca de pH 4,0 a pH 8,0, em que pH 5,5 a pH 7,5 é preferido como faixa para as condições de crescimento inicial. A fermentação pode ser conduzida sob condições aeróbicas ou anaeróbicas, sendo preferidas condições microaeróbicas.

Tipicamente, o acúmulo de altos níveis de PUFAS em células de 10 Ieveduras oleaginosas requer um processo em duas etapas, pois o estado metabólico deve ser "equilibrado" entre o crescimento e a sÍntese/armazenagem de gorduras. Desta forma, de maior preferência, um processo de fermentação em duas etapas é necessário para a produção de PUFAs em levedura oleaginosa (tal como Yarrowia /ipo/ytica). Esta abordagem 15 é descrita na Patente Norte-Americana n" 7.238.482, bem como diversos projetos de processo de fermentação apropriados (ou seja, bateladas, bateladas alimentadas e contínua) e considerações durante crescimento.

PUFAs podem ser encontrados nos micro-organismos hospedeiros na forma de ácidos graxos livres ou em formas esterificadas, tais 20 como acilgliceróis, fosfolipídios, sulfolipÍdios ou glicolipÍdios, e podem ser extraídos das células hospedeiras por uma série de meios bem conhecidos na técnica. Uma análise de métodos de extração, análise de quantidade e padrões de aceitabilidade para lipídios de levedura é a de Z. Jacobs (Critical Reviews in Biotechno/ogy, 12 (5/6): 463-491 (1992))- Uma breve análise do processamento 25 abaixo no fluxo também é disponível por meio de A. Singh e O. Ward (Adv. Appl. Microbiol., 45: 271-312 (1997)).

Geralmente, os meios de purificação de PUFAS podem incluir extração (tal como na Patente Norte-Americana n° 6.797.303 e na Patente

B e Norte-Americana n° 5.648.564) com solventes orgânicos, sonicação, extração

W ' de fluidos supercrítica (utilizando, por exemplo, dióxido de carbono), saponificação e meios flsicos tais como prensas ou suas combinações. Vide a Patente Norte-Americana n° 7.238.482 para detalhes adicionais.

5 Existe uma série de alimentos e produtos alimentícios que incorporam ácidos graxos íü-3 e/ou tú-6, particularmente, por exemplo, ALA, GLA, ARA, EPA, DPA e DHA. Contempla-se que a biomassa microbiana que compreende PUFAs de cadeia longa, biomassa microbiana parcialmente purificada que compreende PUFAS, óIeo microbiano purificado que 10 compreende PUFAs e/ou PUFAs purificados funcionará em alimentos e produtos alimentícios para proporcionar os benefícios à saúde das formulações atuais. Mais especificamente, óleos que contêm ácidos graxos W-3 e/ou cú-6 serão apropriados para uso em uma série de alimentos e produtos alimentícios, incluindo, mas sem limitações: análogos de alimentos, produtos de carne, 15 produtos de cereal, alimentos cozidos, salgadinhos e derivados do leite (vide o Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2006-0094092 para detalhes).

As composições do presente podem ser utilizadas em formulações para fornecer beneficios à saúde em alimentos médicos, incluindo nutricionais médicos, suplementos alimentares, fórmulas para bebês e produtos 20 farmacêuticos. Os técnicos no assunto de processamento e formulação de alimentos compreenderão como a quantidade e a composição dos óleos do presente podem ser adicionados ao alimento ou produto alimentício. Essa quantidade será indicada no presente como quantidade "eficaz" e dependerá do alimento ou produto alimentício, da dieta que o produto destina-se a 25 suplementar ou da condição médica que o alimento médico ou nutricional médico destina-se a corrigir ou tratar.

h Exemplos A presente invenção é adicionalmente descrita nos Exemplos a seguir, que ilustram reduções para a prática da presente invenção, mas não d ' definem completamente todas as suas variações possÍveis. MÉtodos Gerais Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão 5 utilizados nos Exemplos são bem conhecidos na técnica e descritos por: 1) Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Mo/ecu/ar C/oning: A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova lorque (1989) (Maniatis); 2) T. J. Silhavy, M. L. Bennan e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova 10 Iorque (1984); e 3) Ausubel, F. M. et al, Current Protoco/s in Mo/ecu/ar B/o/ogy, publicado pela Greene Publishing Assoc. e Wiley-lnterscience, Hoboken NJ (1987). Os materiais e métodos apropriados para a manutenção e crescimento de cultivos microbianos são bem conhecidos na técnica. Os 15 métodos apropriados para uso nos exemplos a seguir podem ser encontrados conforme descrito em Manual of Methods for General Bacterio/ogy (Phillipp Gerhardt. R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A.

Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, Eds), Sociedade Norte-Americana de Microbiologia: Washington DC (1994)); ou por Thomas D. Brock em 20 Biotechno/ogy." A Textbook of /ndustria/ Microbio/ogy, segunda edição, Sinauer Associates: Sunderland, MA (1989)- Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiais utilizados para o crescimento e manutenção de células microbianas foram obtidos por meio da Aldrich Chemicals (Milwaukee Wl), DIFCO Laboratories (Detroit Ml), GIBCO/BRL (Gaithersburg MD) ou Sigma Chemical 25 company (St. Louis MO), a menos que especificado em contrário. Linhagens de E. co/iforam tipicamente cultivadas a 37 °C sobre placas Luria Bertani ("LB").

Clonagem molecular geral foi realizada de acordo com métodos padrão (Sambrook et al, acima). A sequência de DNA foi gerada em um sequenciador automático ABI utilizando tecnologia de término de tintura

V " (Patente Norte-Americana n° 5.366.860; EP 272.007) utilizando uma combinação de vetor e primers especificos de inserto. A edição de sequências foi realizada em Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor Ml). Todas 5 as sequências representam cobertura de pelo menos duas vezes nas duas direções. Foram realizadas comparações de sequências genéticas utilizando software DNASTAR (DNASTAR lnc., Madison WI). O significado das abreviações é o seguinte: "seg" indica segundo(s), "min" indica minuto(s), "h" indica hora(s), "d" indica dia(s), "µ1" 10 indica microlitro(s), "ml" indica mililitro(s), "I" ind ica litro(s), "µM" indica micromolar, "mM" indica milimolar, "M" indica molar, "mmol" indica milimol(es), "µmol" indica micromol(es), "g" indica grama(s), "µg" indica micrograma(s), "ng" indica nanograma(s), "U" indica unidade(s), "bp" indica par(es) de bases e "KB" indica quilobase(s).

15 Nomenclatura de Conjuntos de ExpressÃo A estrutura de um conjunto de expressão será representada por um sistema de notação simples "X::Y::Z", em que X descreve o fragmento promotor, Y descreve o fragmento de gene e Z descreve o fragmento terminal, que são todos ligados operativamente entre si.

20 TransformaçÃo e cultivo de Yarrowia lipolytica Linhagens de Yarrow/a /ipo/ytica com Acesso ATCC n° 20362, 76982 e 90812 foram adquiridas da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos (Rockville MD). Linhagens de Y. /ipo/ytica foram tipicamente cultivadas a 28-30 °C em diversos meios, de acordo com as receitas exibidas abaixo.

25 Foram preparadas placas Agar conforme o necessário por meio da adição de 20 g/l de Ágar para cada meio Iíquido, de acordo com a metodologia padrão. Meio Ágar YPD (por litro): 10 g de extrato de Ievedura (Difco), 20 g de bactopeptona (Difco); e 20 g de glicose.

¥

H Meio Mínimo Básico (MM) (por litro): 20 g de glicose; 1,7 g de

W " base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos; 1,0 g de prolina; e pH 6,1 (não ajustado). Meios minimos + leucina (MM + leucina ou MMLeu) (por litro): 5 Preparar meios MM conforme acima e adicionar 0,1 g de leucina. Meio de Alta Glicose (HGM) (por litro) 80 g de glicose, 2,58 g de KH2PO4 e 5,36 g de K2HPO4, pH 7,5 (não necessita de ajuste). A transformação de Y. lipolytica foi realizada conforme descrito no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2009-0093543-A1, 10 incorporado ao presente como referência. AnÁlise de Ácidos graxos de Yarrowia lipolytica Para análise de ácidos graxos, células foram recolhidas por meio de centrifugação e lipídios foram extraídos conforme descrito em Bligh, E. G. e Dyer, W. j. (Can. j. Blochem. Physiol, 37: 911-917 (1959)).

15 Metil ésteres de ácido graxo ("FAMES") foram preparados por meio de transesterificação do extrato de lipídios com metóxido de sódio (Roughan, G. e N ishida, I., Arch. Biochem. Biophys., 276 (1): 38-46 (1990)) e analisados em seguida com um Hewlett-Packard 6890 GC equipado com uma coluna HP-INNOWAX (Hewlett-Packard) de 30 m x 0,25 mm (diâmetro 20 interno). A temperatura do forno foi de 170 °C (25 minutos de manutenção) a185 °C a 3,5°C/min. Para transesterificação de bases direta, cultivo de Yarrowia (3 ml) foi colhido, lavado uma vez em água destilada e seco a vácuo em Speed-Vac por cinco a dez minutos. Adicionou-se metóxido de sódio (100 µ1 de 1%) à 25 amostra e a amostra foi turbilhonada em seguida e agitada por vinte minutos. Após adição de três gotas de 1 M de NaCl e 400 µ1 de hexano, a amostra foi turbilhonada e centrifugada. A camada superior foi removida e analisada por meio de GC conforme descrito acima.

Construção DE LJNHAGEM Y4036U de YARROWIA LIPOLYTjCA d

V Linhagem Y4036U de Y. /ipo/ytica (Leu-, Ura-) descrita no Pedido de Patente Internacional publicado n° WO 2008/073367 foi utilizada como hospedeiro nos Exemplos 2 a 4, 6 a 7 e 9 abaixo.

5 O desenvolvimento da linhagem Y4036U necessitou da construção de linhagem Y2224 (mutante resistente a FOA de uma mutação autônoma do gene Ura3 de linhagem ATCC n° 20362 de Yarrowia do tipo selvagem), linhagem Y4001 (que produz 17% de EDA com um fenótipo de Leu), linhagem Y4001U1 (que produz 17% de EDA com um fenótipo de Leu e 10 Ura) e linhagem Y4036 (que produz 18°/) de DGLA com um fenótipo de Leu). O genótipo final da linhagem Y4036U com relação a Yarrowia /lpo/ytica ATCC n° 20362 do tipo selvagem foi o seguinte: GPO::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::Oct, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20 (em que 15 FmD12 é um gene L\12 dessaturase de Fusarium moniliforme (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2005/047485); ME3S é um gene elongase C16-18 otimizado por códons, derivado de Mortiere//a a/pina (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2007/046817); EgD9e é um gene A9 elongase de Eug/ena gracilis (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 20 2007/061742); EgD9eS é um gene A 9 elongase otirnizado por códons, derivado de Euglena grac///s (Pedido de Patente lnternacional publicado n" WO 2007/061742); e EgD8M é uma A8 dessaturase mutante sintética (Pedido de Patente lnternacional publicado n° WO 2008/073271), derivada de Eug/ena graci/is (Patente Norte-Americana n° 7.256.033)).

25 Exemplo 1 Construção PDMW369 que compreende EGD5S O presente Exemplo descreve o plasmídeo pDMW369, que compreende um gene FBAIN::EgD5S::Pex20 quimérico (a construção de plasmídeo é descrita no Pedido de Patente Internacional publicado n° WO 2007/136671). O plasmídeo pDMW369 (Fig. 2A; SEQ ID N° 19) continha os componentes a seguir: Tabela 7

Componentes do PlasmÍdeo PDMW369 (SEQ ID N° 19) Locais RE e nucleotídeos em Descrição de fragmento e componentes de gene quimérico SEQ ID N° 19

FBAÍN::EgD5S::Pex20, que compreende:

· FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia /ipo/ytica (Patente Norte-Americanan° 7.202.356) ECOR //BsiW/ · EgD5S: A5 dessaturase otimizada por códons (SEQ (6063-318) ID N° 9), derivada de Eug/ena graci/is

· Pex20: sequência terminal de gene Pex20 de Yarrowia (acesso Gen8ank n" AF054613)

1354-474 I origem de reprodução de plasmídeo COIEI i gene de resistência a ampicilina (AmpR) para seleção em 2284-1424 E. co/i l Sequência de reprodução autônoma de Yarrowia (ARS18; 3183-4476 Acesso GenBank n° A17608)

6020-4533 Gene Ura 3 de Yarrowia (Acesso Gen8ank n° AJ306421)

Exemplo 2

|DENTlFlCAçÃO de mutações HXGG que resultam em aumento da atividade de

A5 dessaturase em EGD5S

As mutações de aminoácidos isoladas foram conduzidas utilizando pDMW369 (Exemplo 1) como modelo e dezenove pares de oligonucleotideos (SEQ ID N° 20-57; Tabela 8) como primers para mutação ¥

" individual do resíduo de prolina do motivo HPGG de EgD5S (SEQ ID N° 10) por meio de mutagênese dirigida a local (Kit QuickChange, Stratagene CA), de forma a gerar todas as substituições de aminoácidos possÍveis (ou seja,

5 mutantes His-Xaa-Gly-Gly (HXGG), em que Xaa pode ser qualquer aminoácido). Os pIasmídeos que compreendem cada mutação foram transformados em células XL2 Azul de E. co/i (Stratagene). Quatro colônias de cada uma das dezenove transformações foram tomadas e cultivadas individualmente em meios líquidos a 37 °C por uma noite.

Plasmídeos (ou seja,

10 total de 76) foram isolados desses cultivos e sequenciados individualmente para confirmar as mutações.

O plasmídeo pDM\N369 do tipo selvagem e os plasmídeos mutantes isolados foram transformados na linhagem Y4036U individualmente, conforme descrito nos Métodos Gerais.

Os transformantes foram selecionados

15 sobre placas MMLeu.

Após dois dias de crescimento a 30 °C, dois transformantes de cada reação de transformação foram riscados sobre placas de MMLeu novas e incubados por dois dias adicionais a 30 °C.

As colônias foram utilizadas em seguida para inocular 3 ml de MMLeu em um bloco Qiagen com 24 cavidades.

Os blocos foram incubados em um incubador a 30 °C em

20 agitação a 200 rpm.

Após a incubação dos cultivos por dois dias, os blocos foram centrifugados, o sobrenadante foi removido e foram adicionados 3 ml de HGM.

Os blocos foram colocados de volta em um incubador a 30 °C em agitação a 200 rpm por cinco dias adicionais.

As células foram recolhidas por meio de centrifugação, os lipídios foram extraídos, FAMES foram preparados

25 por meio de transesterificação e analisados em seguida com GC Hewlett- Packard 6890. A atividade de A5 dessaturase atribuída a cada mutação no motivo HPGG é resumida abaixo na Tabela 8. Os mutantes EgD5S são designados de acordo com a sequência do motivo HXGG mutante (ou seja, o

P " motivo HPGG no mutante EgD5S-HAGG continha uma substituição de P2 para A, de forma a gerar um motivo His-Ala-Gly-Gly (HAGG), enquanto EgD5S- HRGG possuía uma substituição de P2 para R etc.). A eficiência de conversão 5 foi medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato + produto]) * 100 Os resultados são comparados com os de EgD5S do tipo selvagem (SEQ ID N° 10) no plasmídeo pDM\N369, em que a análise de GC determinou a produção de 8,8% de DGLA e 4,5% de ARA do total de lipídios pelos transformantes (ou seja, a eficiência média de conversão foi de 33,8%).

10 Tabela 8 Atividade de A5 Dessaturase em Mutantes de Motivo EGD5S e HXGG Eficiência média I Percentual j I Primers utilizados para I Transformante ) de conversão de I de atividade | I construção de motivos Y4036U * I DGLA em ARA i com relação I mutantes (°/0) l a EgD5S EgD5S I -- 33,8 100 I EgD5S-HAGG I SEQ ID N° 20 e 21 31,4 92,9 i EgD5S-HRGG | SEQ ID N° 22 e 23 29,7 87,9 EgD5S-HNGG SEQIDN"24e25 30,6 88,8 EgD5S-HDGG SEQIDN°26e27 ND** -- EgD5S-HCGG SEQIDN"28e29 ND** — EgD5S-HQGG SEQIDN°30e31 31,2 92,3 EgD5S-HEGG SEQIDN°32e33 ND** -- EgD5S-HGGG SEQIDN°34e35 33,6 99,4 EgD5S-HHGG SEQIDN°36e37 32,8 97,0 EgD5S-HIGG SEQIDN°38e39 28,0 82,8 EgD5S-HLGG SEQIDN°40e41 27,4 81,1

U e Eficiência média Percentual

W Primers utilizados para 4 Transformante de conversão de de atividade construção de motivos Y4036U * DGLA em ARA com relação mutantes (O/j) a EgD5S EgD5S-HKGG SEQIDN°42e43 32,4 95,9 EgD5S-HMGG SEQIDN°44e45 30,1 89,1 EgD5S-HFGG SEQIDN°46e47 ND** ~~ EgD5S-HSGG SEQIDN°48e49 28,4 84,0 EgD5S-HTGG SEQIDN"50e51 29,7 87,9 EgD5S-H\NGG i SEQIDN°52e53 i ND** -- EgD5S-HYGG l SEQ ID N" 54 e 55 l 34,6 I 102 EgD5S-HVGG l SEQ ID N° 56 e 57 I 31,2 I 92,3 * Cada gene EgD5S (mutante ou do tipo selvagem) foi expresso em pDMW369.

** ND: não obteve mutante neste experimento.

Com base no acima, fica claro que o resíduo de prolina no motivo 5 HPGG pode ser substituído por diversos aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade de A5 dessaturase de EgD5S. As substituições de prolina preferidas, em que a atividade de A5 dessaturase foi maior ou igual a EgO5S, estavam presentes em EgD5S-HGGG (conversão de 33,6%) e EgD5S- HYGG (conversão de 34,6%). EgD5S-HHGG (conversão de 32,8%) funcionou 10 com 97% da atividade de A5 dessaturase de EgD5S.

Exemplo 3 |DENTlFjcAçÃo de mutações HPGX que resultam em aumento da atividade de A5 dessaturase em EGD5S As mutações de aminoácidos isoladas foram conduzidas 15 utilizando pDMW369 (Exemplo 1) como modelo e dezenove pares de e oligonucleotideos (SEQ ID N° 59 a 96; Tabela 9) como primers para ¥ mutação individual do segundo resíduo de glicina do motivo HPGG de EgD5S (SEQ ID N° 10) por meio de mutagênese dirigida a local (Kit QuickChange, Stratagene CA), de forma a gerar todas as substituições de 5 aminoácidos possÍveis (ou seja, mutantes His-Pro-Gly-Xaa (HPGX)). Após a mutagênese, os plasmídeos foram transformados em Y4036U, transformantes foram selecionados e cultivados em MMLeu e HGM e FAMES foram preparados e analisados por meio de GC, conforme descrito no Exemplo 2. 10 A atividade de LJ5 dessaturase atribulda a cada mutação no motivo HPGG é resumida abaixo na Tabela 9. Os mutantes EgD5S são designados de acordo com a sequência do motivo HPGX mutante (ou seja, o motivo HPGG no mutante EgD5S-HPGA continha uma substituição de G4 para A, de forma a gerar um motivo His-Pro-Gly-Ala (HPGA), enquanto EgD5S- 15 HPGR possuía uma substituição de G4 para R etc.). A eficiência de conversão foi medida de acordo com a fórmula descrita no Exemplo 2. Os resultados são comparados com os de EgD5S do tipo selvagem (SEQ ID N" 10) no plasmideo pDMW369, em que a análise de GC determinou a produção de 8,8% de DGLA e 4,5% de ARA do total de lipídios pelos transformantes (ou seja, a eficiência

20 média de conversão foi de 33,8%). Tabela 9

Atividade DE A5 Dessaturase EM Mutantes DE Motivo EGD5S E HPGX

| Eficiência média I Percentuai de

Primers utilizados para Transformante I I de conversão de I atividade com construção de motivos Y4036U * I I DGLA em ARA i relação a mutantes (°/0) I EgD5S

EgD5S ! m I 33,8 I 100

EgD5S-HPGA I SEQIDN°59e60 I 31,3 I 92,6

Eficiência média Percentual de Primers utilizados para Transformante de conversão de atividade com construção de motivos Y4036U * DGLA em ARA relação a mutantes (O/j) EgD5S EgD5S-HPGR SEQIDN°61e62 26,9 79,6 EgD5S-HPGN SEQIDN°63e64 31,5 93,2 . EgD5S-HPGD SEQIDN°65e66 ND** EgD5S- HPGC SEQIDN°67e68 ND** EgD5S- HPGQ SEQIDN°69e70 ND** EgD5S- HPGE SEQIDN°71e72 ND** EgD5S- HPGH SEQIDN°73e74 ND** Eg05S- HPGl SEQIDN°75e76 ND** EgO5S- HPGL sjEQIDN°77e78 ND** EgD5S- HPGK SEQIDN°79e80 32,0 94,7 EgO5S- HPGM SEQIDN°81e82 ND** EgD5S- HPGF SEQIDN°83e84 ND** Eg05S- HPGP SEQIDN°85e86 ND** EgD5S- HPGS SEQIDN°87e88 37,3 110,4 EgD5S- HPGT SEQIDN°89e90 35,5 105,0 EgD5S- HPGW SEQIDN°91e92 ND** EgD5S- HPGY SEQIDN°93e94 ND** EgD5S- HPGV SEQIDN°95e96 ND** I ~ m * Cada gene EgD5S (mutante ou do tipo selvagem) foi expresso em pDMW369.

** ND: não obteve mutante neste experimento.

Os resultados demonstraram que o segundo resíduo de glicina no motivo HPGG pode ser substituído por diversos aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade de A5 dessaturase de EgD5S. As substituições de glicina preferidas, em que a atividade de A5 dessaturase foi maior ou igual a Eg05S, estavam presentes em EgD5S-HPGS (conversão de 37,3%) e EgO5S- HPGT (conversão de 35,5%).

Exemplo 4 AnÁlise quantjtativa de mutantes EGD5 com desempenho maior ou igual ao NÍVEL de EGD5S do tipo selvagem Ao término das análises preliminares das substituições de aminoácidos (Exemplos 2 e 3), realizou-se análise quantitativa das mutações que apresentaram desempenho aproximadamente equivalente ou acima da taxa de conversão de EgD5S (ou seja, EgD5S-HGGG, EgD5S-HHGG, EgD5S- HYGG, EgD5S-HPGS e EgD5S-HPGT). Os plasmldeos que contêm as mutações acima foram denominados HGGG pDM\N369, HHGG pDM\N369, HYGG pDMW369, HPGS pDM\N369 e HPGT pDMW369, respectivamente.

Esses plasmídeos, junto com pDMW369, foram novamente transformados em Y4036U (Métodos Gerais) e colocados em placas sobre MMLeu. As placas foram incubadas a 30 °C por cerca de quatro dias. Doze transformantes de cada placa foram novamente riscados sobre placas MMLeu novas e incubadas a 30 °C. Os transformantes foram inoculados em 3 ml de MMLeu em um formato de blocos com 24 cavidades. Os blocos foram incubados a 30 °C a 200 rpm por dois dias. Após dois dias de crescimento, os blocos foram centrifugados, o sobrenadante foi decantado e as pelotas, novamente suspensas em HGM. Os blocos foram incubados a 30 °C por cinco dias adicionais. As células foram recolhidas por meio de centrifugação, os lipÍdios foram extraídos, FAMEs foram preparados por meio de transesterificação e analisados em seguida com GC Hewlett-Packard 6890. A taxa de conversão média de DGLA em ARA de doze amostras é resumida abaixo na Tabela 10.

Tabela 10 Atividade DE A5 Dessaturase EM Mutantes DE Motivo HXGX EGD5S Eficiência média de Transformante I I Percentual de atividade com I conversão de DGLA em I Y4036U * I / ! relação a EgD5S ARA (°0) EgD5S I 30,4 i 100 EgO5S- HGGG I 31,8 I 104,6 EgD5S- HHGG ! 31,5 I 103,6 EgD5S- HYGG I 26,0 I 85,5 EgD5S- HPGS l 32,5 l 106,9 EgD5S- HPGT ! 30,1 ; 99,0 * Cada gene EgD5S (mutante ou do tipo selvagem) foi expresso em pDMW369.

Este experimento confirmou que as atividades de dessaturase L\5 de mutantes EgD5S-HGGG e EgD5S-HHGG (SEQ ID N° 58) e EgD5S-HPGS (SEQ ID N° 97) aumentaram com relação ao controle EgD5S do tipo selvagem. Uma sequência de nucleotídeos apropriada que codifica EgD5S-HGGG é descrita como SEQ ID N° 190, uma sequência apropriada que codifica EgD5S-HHGG é descrita como SEQ ID N° 191 e uma sequência de nucleotídeos apropriada que codifica EgD5S-HPGS é descrita como SEQ ID N° 192.

Exemplo 5 GeraçÃo DE CONSTRUÇÃO PZUFMEAD5S QUE COMPREENDE EAD5S O presente Exemplo descreve a construção do plasmideo pZUFmEaD5S que compreende um gene FBAINm::EaD5S::Pex20 quimérico. O plasmídeo pZUFmEa05S (SEQ ID N° 98) foi construído por r_ 78

W meio de substituição do fragmento Nco 1/NOt I de pZUF17 (Fig. 2B, SEQ ID 4 " N° 99) com o fragmento EaD5S de Nco 1/NOt I de pEa05S (SEQ ID N° 100) (em que o plasmideo pEaO5S (SEQ ID N° 100) foi criado quando o gene EaD5S (SEQ ID N° 13) foi clonado em pUC57 (Acesso GenBank n° 5 Y14837)). O produto dessa ligação foi pZUFmEaD5S, que continha, portanto, os componentes a seguir: Tabela 11 Componentes DO PlasmÍdeo PZUFMEAD5S (SEQ ID N° 98) Locais RE e nucleotídeos em Descrição de fragmento e componentes de gene quimérico SEQ ID N° 98 FBAIN::EaD5S::Pex20, que compreende.

FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (Patente Norte- Americana n° 7.202.356) Swa //BsiWl EaD5S: A5 dessaturase otimizada por códons (SEQ ID N° 13), (7435-1686) derivada de Eug/ena anabaena Pex20: sequência terminal de gene Pex20 de Yarrowia (acesso Gen8ank n° AF054613) 2722-1842 origem de reprodução de plasmideo COIEI 3652-2792 gene de resistência a ampicilina (AmpR) para seleção em E. CO/i Sequência de reprodução autônoma de Yarrowia (ARS18; Acesso 4554-5855 Gen8ank n° A17608) 7399-5898 Gene Ura 3 de Yamwia (Acesso Gen8ank n" AJ306421) Exemplo 6 10 Identificação DE MUTAÇÕES HXGG QUE RESULTAM EM AUMENTO DA ATIVIDADE DE A5 DESSATURASE EM EAD5S As mutações de aminoácidos isoladas foram conduzidas utilizando pZUFmEaD5S (Exemplo 5) como modelo e dezenove pares de oligonucleotÍdeos (SEQ ID N° 101 a 138; Tabeta 12) como primers para

W " mutação individual do reslduo de prolina do motivo HPGG de EaD5S (SEQ ID N° 14) por meio de mutagênese dirigida a local (Kit QuickChange, Stratagene CA), de forma a gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis (ou 5 seja, mutantes His-Xaa-Gly-Gly (HXGG))- Os plasmídeos de cada mutação foram transformados em células XL2 Azul de E. co/i. Quatro colônias de cada uma das dezenove transformações foram tomadas e cultivadas individualmente em meios liquidos a 37 "C por uma noite. Plasmideos (ou seja, total de 76) foram isolados desses cultivos e sequenciados individualmente para confirmar 10 as mutações. O pIasmídeo pZUFmEaO5S do tipo selvagem e os plasmídeos mutantes isolados foram transformados na linhagem Y4036U individualmente, conforme descrito nos Métodos Gerais. Os transformantes foram selecionados sobre placas MMLeu e cultivados em seguida em meio 15 HGM e MMLeu Iíquido, conforme descrito no Exemplo 2 (exceto pelo aumento da velocidade do incubador de 200 para 250 rpm). As células foram recolhidas por meio de centrifugação, os lipidios foram extraídos, FAMES foram preparados por meio de transesterificação e analisados em seguida com GC Hewlett-Packard 6890.

20 As atividades de LJ5 dessaturase atribuídas a cada mutação no motivo HPGG encontram-se resumidas abaixo na Tabela 12. Os mutantes Ea05S são designados de acordo com a sequência do motivo HXGG mutante (ou seja, o motivo HPGG no mutante EaD5S-HAGG continha uma substituição de P2 para A, de forma a gerar um motivo His-Ala-Gly-Gly (HAGG), enquanto 25 EaD5S-HRGG possuía uma substituição de P2 para R etc.). A eficiência de conversão foi medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato + produto]) * 100 Os resultados são comparados com os de EaD5S do tipo selvagem (SEQ ID N° 14) no plasmídeo pZUFmEaD5S, em que análise de GC determinou que a eficiência média de conversão de DGLA em ARA de dois « " transformantes foi de 25%, Tabela 12 Atividade DE A5 Dessaturase EM Mutantes DE Motjvo EAD5S E HXGG I Eficiência I I média de I Percentual de Primers utilizados para I Transformante I I conversão I atividade com construção de motivos Y4036U * I I deDGLA I relação a mutantes em ARA I EaD5S (Q/O) EaD5S l -- I 25,0 I 100 ) EaD5S-HAGG SEQIDN°1O1e102 I 26,4 I 105,6 I EaD5S-HRGG SEQIDN°103e104 I 24,9 I 99,0 I EaD5S-HNGG SEQIDN°105e106 I 23,2 I 92,8 I EaD5S-HDGG SEQ ID N°107e108 I 8,3 I 33,2 I EaD5S-HCGG SEQIDN°109e11O I 26,2 I 104,8 | EaD5S-HQGG SEQIDN°111e112 I 20,7 I 82,8 I EaD5S-HEGG SEQIDN°113e114 l 8,8 I 35,2

I EaD5S-HGGG SEQIDN"115e116 18,9 75,6 EaD5S-HHGG SEQIDN°117e118 20,4 81,6 EaD5S-HIGG SEQIDN°119e120 ND** ~ EaD5S-HLGG SEQ ID N°121e122 21,1 84,4 EaD5S-HKGG SEQ ID N° 123e124 25,2 100,8 EaD5S-HMGG SEQID N°125e126 23,6 94,4 EaD5S-HFGG I SEQ ID N°127e128 21,2 84,8 EaD5S-HSGG | SEQID N°129e130 23,0 95,6

F » Eficiência m

U média de Percentual de Primers utilizados para Transformante conversão atividade com construção de motivos Y4036U * de DGLA relação a mutantes em ARA EaD5S (O/j) EaD5S-HTGG I SEQID N° 131 e132 25,8 103,2 I EaD5S-HWGG I SEQID N°133e134 I 14,0 l 56,0 I EaD5S-HYGG i SEQIDN°135e136 I 19,9 I 79,6 I EaD5S-HVGG I SEQID N°137e138 I ND** ~~ * Cada gene EaD5S (mutante ou do tipo selvagem) foi expresso em pZuFmEa05S.

** ND: não obteve mutante neste experimento. Com base no acima, fica claro que o resíduo de prolina no 5 motivo HPGG pode ser substituído por diversos aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade de A5 dessaturase de EaO5S. As substituições de prolina preferidas, em que a atividade de LJ5 dessaturase foi maior com relação a EaD5S, estavam presentes em EaD5S-HAGG (conversão de 26,3%), EaD5S-HCGG (conversão de 26,2%), Ea05S- 1o HKGG (conversão de 25,2%) e EaD5S-HTGG (conversão de 25,8°/o). AnÁlise quantitativa de mutantes EAD5 com desempenho maior ou igual ao NÍVEL de EAD5S do tipo selvagem Foi realizada uma análise mais quantitativa dessas mutações que apresentaram atividade aproximadamente equivalente ou maior com relação à 15 taxa de conversão de EaD5 do tipo selvagem (ou seja, EaD5S-HAGG, EaD5S-

B

*

, q HRGG, EaD5S-HNGG, EaD5S-HCGG, EaD5S-HHGG, EaD5S-HLGG, · EaD5S-HKGG, EaD5S-HMGG, EaD5S-HFGG, EaD5S-HSGG e Ea05S- HTGG). Os plasmídeos que contêm as mutações acima foram denominados pZuFmEaD5S-HAGG, pZuFmEaD5S-HRGG, pZuFmEaD5S-

5 HNGG, pZuFmEaD5S-HCGG, pZuFmEaD5S-HHGG pZuFmEaD5S-HLGG, pZuFmEaD5S-HKGG, pZuFmEaD5S-HMGG, pZuFmEaD5S-HFGG, pZuFmEaD5S-HSGG e pZuFmEaD5S-HTGG, respectivamente.

Esses plasmídeos, junto com pZuFmEaD5S, foram novamente transformados em Y4036U (Métodos Gerais) e colocados em placas sobre MMLeu.

As placas

, 10 são incubadas a 30 °C por cerca de quatro dias.

Seis transformantes de cada placa foram novamente riscados sobre placas MMLeu novas e incubadas a 30 °C.

Os transformantes foram inoculados em 3 ml de MMLeu em um formato de blocos com 24 cavidades.

Os blocos foram incubados a 30 °C a 200 rpm por dois dias.

Após dois dias de crescimento, os blocos

15 foram centrifugados, os sobrenadantes foram decantados e as pelotas foram novamente suspensas em HGM.

Os blocos foram incubados a 30 °C por cinco dias adicionais.

As células foram recolhidas por meio de centrifugação, os Iipídios foram extraídos, FAMES foram preparados por meio de transesterificação e analisados em seguida com GC Hewlett-

20 Packard 6890. A taxa de conversão média de DGLA em ARA de seis amostras é resumida abaixo na Tabela 13. Tabela 13

Atividade De A5 Dessaturase Em Mutantes De Motivo HXGG EAD5S I Eficiência média de I Percentual de Transformante I conversão de DGLA I atividade com relação Y4036U * em ARA (°/0) ! a EaD5S

EaD5S i 24,0 100

EaD5S-HAGG 23,8 99,2 EaD5S-HRGG 23,0 95,8 EaD5S-HNGG 20,7 86,2 EaD5S-HCGG 25,9 107,9 EaD5S-HHGG 20,4 85,0 EaD5S-HLGG 16,7 69,6 EaD5S-HKGG 20,7 86,3 EaD5S-HMGG 23,4 97,5 EaD5S-HFGG 21,2 88,3 EaD5S-HSGG 23,8 99,2 EaD5S-HTGG I 21,4 l 89,2 * Cada gene EaD5S (mutante ou do tipo selvagem) foi expresso em pZuFmEaD5S.

Este experimento confirmou que a atividade de dessaturase L\5 de mutante EaD5S-HCGG (SEQ ID N° 139) aumentou com relação ao controle EaD5S do tipo selvagem. Uma sequência de nucleotídeos apropriada que codifica EaD5S-HCGG é descrita como SEQ ID N° 193.

Exemplo 7 GeraçÃo de CONSTRUçÃO PZUFMRD5S que compreende RD5S O presente Exemplo descreve o plasmídeo pZURD5S, que compreende um gene FBAIN::RD5S::Pex20 quimérico (a construção de plasmídeo é descrita no Pedido de Patente Internacional publicado n° WO 2007/136646). O plasmídeo pZURD5S (SEQ ID N° 140) possui construção idêntica a pDMW369 (Exemplo 1, SEQ ID N° 19), com exceção da substituição de RD5S (SEQ ID N° 17) no lugar de EgD5S (SEQ ID N° 9).

e

O Exemplo 8 e © IdentificaçÃo de mutações HXGG que resultam em aumento da atjvidade de A5 dessaturase EM RD5S As mutações de aminoácidos isoladas foram conduzidas 5 utilizando pZURD5S (Exemplo 7) como modelo e dezenove pares de oligonucleotÍdeos (SEQ ID N° 141 a 178; Tabela 14) como primers para mutação individual do resíduo de prolina do motivo HPGG de RD5S (SEQ ID N° 17) por meio de mutagênese dirigida a local (Kit QuickChange, Stratagene CA), de forma a gerar todas as substituições de aminoácidos possÍveis (ou 10 seja, mutantes His-Xaa-Gly-Gly (HXGG)). Os plasmídeos de cada mutação foram transformados em células XL2 Azul de E. CO//. Quatro colônias de cada uma das dezenove transformações foram tomadas e cultivadas individualmente em meios líquidos a 37 °C por uma noite. PIasmideos (ou seja, total de 76) foram isolados desses cultivos e sequenciados individualmente para confirmar 15 as mutações.

O plasmídeo pZURD5S do tipo selvagem e os plasmídeos mutantes isolados foram transformados na linhagem Y4036U individualmente, conforme descrito nos Métodos Gerais. Os transformantes foram selecionados sobre placas MMLeu e cultivados em seguida em meio 20 HGM e MMLeu líquido, conforme descrito no Exemplo 2 (exceto pelo aumento da velocidade do incubador de 200 para 250 rpm). As células foram recolhidas por meio de centrifugação, os lipídios foram extraidos, FAMES foram preparados por meio de transesterificação e analisados em seguida com GC Hewlett-Packard 6890.

25 As atividades de A5 dessaturase atribuídas a cada mutação no motivo HPGG são resumidas abaixo na Tabela 14. Os mutantes RD5S são designados de acordo com a sequência do motivo HXGG mutante (ou seja, o motivo HPGG no mutante RD5S-HAGG continha uma substituição de P2 para

A, de forma a gerar um motivo His-Ala-Gly-Gly (HAGG), enquanto RD5S- , " HRGG possuía uma substituição de P2 para R etc.). A eficiência de conversão foi medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato + produto]) * 100 Os resultados são comparados com os de RD5S do tipo selvagem (SEQ 5 ID N° 18) no plasmídeo pZURD5S, em que análise de GC determinou que a eficiência média de conversão de DGLA em ARA de dois transformantes foi de 25,1%.

Tabela 14 Atívidade de A5 Dessaturase em Mutantes de Motivo RD5S e HXGG I Eficiência média I I Primers utilizados para I I Percentual de I Transformante I I de conversão de I : construção de motivos I I atividade com Y4036U * I i DGLAemARA I mutantes | (°/,) I relação a RD5S RD5S I -- I 25,1 i 100 I RD5S-HAGG I SEQ ID N° 141 e 142 i 23,2 I 92,4 ) RD5S-HRGG I SEQ ID N° 143 e 144 I ND** ~ I RD5S-HNGG ! SEQ ID N° 145 e 146 I ND** e RD5S-HDGG SEQ ID N° 147 e148 13,1 52,2 RD5S-HCGG SEQIDN°149e150 34,8 138,6 RD5S-HQGG SEQIDN°151e152 20,2 80,5 RD5S-HEGG SEQID N°153e154 18,6 74,1 RD5S-HGGG SEQIDN°155e156 18,7 74,1 RD5S-HHGG SEQID N°157e158 ND** -- RD5S-HIGG SEQ ID N° 159e160 ND** -- RD5S-HLGG SEQID N°161e162 ND** RD5S-HKGG SEQID N°163e164 22,2 88,4 RD5S-HMGG SEQID N°165e166 21,2 84,1

Eficiência média Primers utilizados para Percentual de Transformante de conversão de construção de motivos atividade com Y4036U * DGLA em ARA mutantes relação a RD5S (O/j) RD5S-HFGG SEQID N°167e168 ND** RD5S-HSGG SEQID N° 169e170 ND** -- RD5S-HTGG SEQID N°171e172 22,6 90,0 RD5S-HWGG SEQID N° 173e174 28,5 113,5 RD5S-HYGG SEQIDN°175e176 ND** RD5S-HVGG SEQIDN°177e178 20,6 82,0 * Cada gene RD5S (mutante ou do tipo selvagem) foi expresso em pZURD5S. ** ND: não obteve mutante neste experimento. Com base no acima, fica claro que o resíduo de prolina no motivo HPGG pode ser substituldo por diversos aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade de A5 dessaturase de RD5S. As substituições de prolina preferidas, em que a atividade de A5 dessaturase foi maior ou igual a RD5S, estavam presentes em RD5S- HCGG (conversão de 34,8%) e RD5S-HWGG (conversão de 28,5%).

Será conduzida uma análise quantitativa das mutações que apresentaram desempenho maior ou igual à taxa de conversão de RD5S do tipo selvagem (ou seja, RD5S-HCGG e RD5S-HWGG (SEQ ID n° 179)), conforme descrito anteriormente para mutantes Eg05S e EaD5S. Uma sequência de nucleotídeos apropriada que codifica RD5S-HCGG é descrita como SEQ ID N° 194 e uma sequência apropriada que codifica RD5S- H\NGG é descrita como SEQ ID N° 195.

Claims (12)

1. Reivindicações b · 1. POLIPEPTÍDEO MUTANTE QUE POSSUI ATIVIDADE DE A5 DESSATURASE, caracterizado pelo fato de que compreende um motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 183 5 (HGGG), SEQ ÍD N° 184 (HHGG), SEQ ID N° 186 (HCGG), SEQ ID N° 187 (HWGG) e SEQ ID N° 185 (HPGS).
2. 2. POIJPEPTÍDEO MUTANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N° 10 58 (EgD5S-HGGG e EgD5S-HHGG), SEQ ID N° 97 (EgD5S-HPGS), SEQ ID N° 139 (EaD5S-HCGG) e SEQ ID N° 179 (RD5S-HCGG e RD5S- HWGG).
3. 3. POLIPEPTÍDEO MUTANTE de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo mutante possui 15 uma eficiência de conversão de ácido di-homo-Y-|ino|ênico em ácido araquidônico que é maior que a eficiência conversão de ácido di-homo-Y- linolênico em ácido araquidônico do polipeptídeo original.
4. 4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, caracterizada pelo fato de que codifica substancialmente o polipeptídeo 20 conforme definido na reivindicação 1.
5. 5. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 190, SEQ ID N° 191, SEQ ID N° 192, SEQ ID N° 193,SEQID N° 194eSEQID N° 195.
6. 25 6. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, caracterizada pelo fato de que expressa o polipeptideo conforme definido na reivindicação 1,
7. 7. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em: bactérias, leveduras, algas, euglenoides, estramenópilos,

   K " oomicetes e fungos.
8. 8. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira microbiana é 5 uma levedura oleaginosa.
9. 9. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a Ievedura oleaginosa é selecionada a partir do grupo que consiste em: Yarrowia, Candida, Rhodotoru/a, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.
10. 10 10. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de em que a célula hospedeira produz um ácido graxo poli-insaturado selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos graxos üü-6 e ácidos graxos cú-3.
11. 11. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ARAQUIDÔNICO, 15 caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira microbiana que expressa o polipeptideo conforme definido na reivindicação 1 na presença de ácido di-homo-Y-|ino|ênico, em que o ácido di-homo-y-linolênico é convertido em ácido araquidônico.
12. 12. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 20 EICOSAPENTAENOICO, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira microbiana que expressa o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1 na presença de ácido eicosatetraenoico, em que o ácido eicosatetraenoico é convertido em ácido eicosapentaenoico.