BRPI0813681B1 - dispositivo e método para detectar a presença ou ausência de coproantígeno de nematelminto toxocara em uma amostra fecal de um mamífero, método para diagnosticar uma infecção intestinal por nematelminto toxocara em um mamífero, e kit para detecção de um ou mais coproantígenos de nematelmintos toxocara em uma amostra de um mamífero. - Google Patents

Description

(54) Título: DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE COPROANTÍGENO DE NEMATELMINTOTOXOCARA EM UMA AMOSTRA FECAL DE UM MAMÍFERO, MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA INFECÇÃO INTESTINAL POR NEMATELMINTO TOXOCARA EM UM MAMÍFERO, E KIT PARA DETECÇÃO DE UM OU MAIS COPROANTÍGENOS DE NEMATELMINTOS TOXOCARA EM UMA AMOSTRA DE UM MAMÍFERO.

(73) Titular: IDEXX LABORATORIES, INC., Sociedade Norte Americana. Endereço: One Idexx Drive - Westbrook, ME 04092, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: DAVID ALLEN ELSEMORE; LAURIE A. FLYNN.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 06/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 06/11/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para

DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE COPROANTÍGENO DE NEMATELMINTO TOXOCARA EM UMA AMOSTRA FECAL DE UM MAMÍFERO, MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA INFECÇÃO INTESTINAL POR NEMATELMINTO TOXOCARA EM UM MAMÍFERO, E KIT PARA DETECÇÃO DE UM OU MAIS COPROANTÍGENOS DE NEMATELMINTOS TOXOCARA EM UMA AMOSTRA DE UM MAMÍFERO.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a composições, a dispositivos, a kits e a métodos para a detecção de nematelminto em animais. Mais particularmente, a invenção refere-se a composições, a dispositivos, a kits e a métodos para detectar a presença ou ausência de nematelminto em uma amostra fecal. Ainda mais particularmente, a presente invenção se refere a composições de anticorpos, dispositivos, kits, e métodos para detectar a presença ou ausência de antígeno de nematelminto em uma amostra fecal que também pode incluir um ou mais de antígeno de ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris, e parasita do coração do cão.

2. Descrição da Técnica Anterior [002] Infecção intestinal por nematelminto é comum em animais e, caso deixada sem tratamento, pode causar doença grave e mesmo morte. Embora seja relativamente fácil de diagnosticar um animal infectado com nematelminto como tendo uma infecção por verme parasitário (helminto) de algum tipo, é significativamente mais difícil identificar o nematelminto, especificamente, como o verme causativo. Isto é um problema porque as infecções por nematelminto são

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2/36 melhores tratadas quando o tratador do animal infectado tem conhecimento de que o nematelminto é a fonte específica da infecção. Por exemplo, tal conhecimento permite que o tratador trate o animal com um fármaco que é otimamente potente contra nematelminto, e portanto evite o uso de um fármaco ou coquetel de fármacos que seja eficaz de modo geral contra infecções por vermes parasitários, mas não otimamente eficaz contra nematelminto.

[003] Os métodos atuais para diagnóstico de infecções por nematelminto essencialmente envolvem exame microscópico de amostras fecais, quer diretamente em esfregaços fecais ou depois de concentração de ovos e parasitas por flutuação em meios de densidade. Apesar da alta adoção deste procedimento, o método tem significativas desvantagens. Estes métodos microscópicos consomem tempo, requerem equipamento especializado e têm baixa especificidade. Além disso, a precisão dos resultados destes métodos é altamente dependente do conhecimento e da perícia do operador. [004] Distinções taxonômicas geralmente também podem ser feitas em um nível molecular determinando se um ou mais antígenos de um ou mais anticorpos para uma espécie de verme em particular ou para um grupo definido de espécies de vermes estão presentes em um animal. Por exemplo, Hill et al. {Veterinary Parasitology (1997), vol. 68, pp. 91-102) descrevem um teste de ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) para a detecção de anticorpos específicos para nematódeo do gênero Trichuris em soros de animais porcinos. Apesar do teste de Hill et al. não ter reação cruzada com soros de porcos infectados com nematelminto ou ancilóstomo, não foi determinado se o teste tem reação cruzada com soros de porcos infectados com parasita do coração do cão. De modo similar, Yamasaki et al. (J. CHn. Microbiology (2000), vol. 38, pp. 1409-1413) descrevem um teste ELISA utilizando um antígeno de nematelminto recombinante para a

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3/36 detecção de anticorpos específicos para nematelminto em soros humanos. Apesar de ter sido mostrado que o teste de Yamasaki et al. não é reativo cruzado com ancilóstomo ou parasita do coração do cão, não foi determinado se tem reação cruzada com nematódeo do gênero Trichuris. Bungiro e Cappello (A. J. Trop. Med. Hyg. (2005), vol. 73, pp. 915-920) descrevem um ELISA para detectar infecção pelo ancilóstomo Ancylostoma ceylanicum em um sistema modelo de hamster experimental, mas não foi determinado se seu teste também tem reação cruzada com um ou mais de nematelminto, nematódeo do gênero Trichuris e parasita do coração do cão.

[005] Os clínicos mostraram pouco interesse em usar estes testes para diagnosticar animais infectados com verme. Uma razão pela qual estes testes não foram adotados é que os pesquisadores não demonstraram que quaisquer dos mesmos são capazes de detectar especificamente um tipo particular de verme na exclusão de todos os outros tipos principais de vermes. Por exemplo, ninguém ainda desenvolveu um teste que detecte especificamente nematelminto, mas que também tenha sido mostrado que não tem reação cruzada com ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris e parasita do coração do cão. Esta incapacidade de precisar uma infecção de um animal para uma única fonte causaria incerteza no diagnóstico, e portanto provavelmente resultaria na administração de tratamento subótimo.

[006] Além disso, foi demostrado que alguns destes testes somente são úteis para detectar antígenos ou anticorpos em uma amostra de soro. Isto é limitante porque frequentemente é impraticável ou difícil de obter uma amostra de soro de um animal doente. Por exemplo, no caso de um animal não-cooperativo, pode ser difícil estabilizar o animal para o fim de colher sangue, e no caso de um animal muito doente, pode ser impraticável transportar o animal para

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4/36 um consultório veterinário para este mesmo fim. O teste para a presença ou ausência de um tipo de verme em particular portanto é melhor realizado usando um material animal que seja prontamente obtenível e que não requer transporte do animal, tal como fezes. Antígenos presentes em amostras fecais são refereidos como coproantígenos. No caso dos antígenos de vermes parasitários que são a matéria da presente invenção, coproantígenos são antígenos de vermes presentes em uma amostra fecal de um animal hospedeiro. [007] Outra limitação inerente a alguns destes testes é que eles envolvem a produção e purificação de um antígeno recombinante específico. Especificamente, isto é limitante porque as etapas requeridas para produzir e purificar um tal antígeno podem ser caras e consumir tempo.

[008] Portanto o que é necessário são composições, dispositivos, kits e métodos para detectar a presença ou ausência de nematelminto em uma amostra fecal. As composições, dispositivos, kits e métodos necessários adicionalmente devem ser capazes de detectar especificamente a presença ou ausência de nematelminto em uma amostra fecal que contém um ou mais de ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris, e parasita do coração do cão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] A presente invenção se baseia em parte na descoberta de uma propriedade inesperada de anticorpos policlonais. Especificamente, foi determinado que anticorpo policlonal cultivado contra tanto extrato de nematelminto inteiro, extrato do trato reprodutivo de nematelminto, ou extrato do trato intestinal de nematelminto, pode ser usado para capturar e detectar a presença ou ausência de coproantígenos de nematelmintos em um mamífero que está infestado por um ou mais de nematódeo do gênero Trichuris, parasita do coração do cão e ancilóstomo. Esta especificidade para

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5/36 nematelminto é surpreendente uma vez que nematelmintos, nematódeo do gênero Trichuriss, parasita do coração do cãos e ancilóstomos são todos nematódeo do gênero Trichuris relacionados, e se esperaria que um anticorpo policlonal cultivado contra um extrato total, extrato do trato reprodutivo de nematelminto, ou extrato do trato intestinal de nematelminto, de qualquer um destes vermes tivesse reação cruzada com uma ou mais dos outros vermes, antígenos do hospedeiro, ou outros componentes fecais. A invenção inclui condições de teste sob as quais os anticorpos da invenção podem ser usados para capturar e detectar especificamente a presença ou ausência de coproantígenos de nematelmintos em um mamífero que também pode estar infestado por um ou mais de nematódeo do gênero Trichuris, parasita do coração do cão e ancilóstomo.

[0010] A invenção, em em aspecto, é um dispositivo para detectar a presença ou ausência de nematelminto em uma amostra fecal em um mamífero, tal como um canino, felino, bovino, ou ser humano, por exemplo. A invenção adicionalmente proporciona um dispositivo para detectar a presença ou ausência de nematelminto em uma amostra fecal de um mamífero que também pode estar infectado com um ou mais de ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris, e parasita do coração do cão. Em um aspecto da invenção, o dispositivo inclui um suporte sólido, em que um ou mais anticorpos policlonais específicos para um ou mais antígenos de nematelmintos são imobilizados sobre o suporte sólido.

[0011] Em alguns aspectos da invenção, o dispositivo da invenção inclui um dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral. Em outros aspectos da invenção, o dispositivo da invenção inclui um dispositivo de ELISA.

[0012] A invenção também inclui anticorpos e composições de anticorpos. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos

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6/36 policlonais que são capazes de ligar especificamente coproantígeno de nematelmintos em um mamífero que também pode estar infectado com um ou mais de ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris ou parasita do coração do cão. Os anticorpos da invenção não ligam substancialmente antígeno de ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris ou parasita do coração do cão em uma amostra fecal. A presente invenção adicionalmente inclui métodos para produzir os anticorpos referidos.

[0013] A invenção também é um método para detectar a presença ou ausência de nematelminto em uma amostra fecal. O método inclui contactar uma amostra fecal com os anticorpos e capturar e detectar a presença ou ausência de coproantígenos de nematelmintos nesta amostra fecal. A etapa de detecção pode incluir a detecção de a presença ou ausência de um complexo de antígeno/anticorpo. O método pode envolver adicionalmente proporcionar um segundo anticorpo que liga ao antígeno do complexo de antígeno/anticorpo. [0014] A invenção adicionalmente inclui kits de teste para detectar coproantígeno de nematelmintos em uma amostra fecal obtida de um mamífero. Portanto um kit pode incluir uma ou mais composições e/ou dispositivos da presente invenção. Por exemplo, o kit pode incluir anticorpos antinematelmintos e meios para determinar ligação dos anticorpos a antígenos de nematelmintos na amostra. Em um exemplo particular, um kit semelhante inclui o dispositivo tendo um anticorpo anti-nematelminto imobilizado, um ou mais reagentes de captura de antígeno (por exemplo, um reagente de captura de antígeno marcado não-imobilizado e um reagente de captura de antígeno imobilizado) e reagente de lavagem, bem como reagente detector e reagentes controles positivo e negativo, caso desejado ou apropriado. Outros componentes tais como tampões, controles, e similares, podem ser incluídos em kits de teste semelhantes. Um kit pode incluir

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7/36 adicionalmente instruções para realizar um ou mais métodos da presente invenção, incluindo instruções para usar qualquer dispositivo da presente invenção que seja incluído com o kit.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0015] A figura IA mostra um dispositivo de lâmina de multipoço da presente invenção.

[0016] A figura IB mostra uma ampliação de um único poço da lâmina da figura IA com uma representação de exemplo de anticorpos imobilizados à mesma.

[0017] A figura 2 mostra um gráfico de valores da densidade ótica (OD) obtidos de amostras fecais caninas seguindo um método da presente invenção em um primeiro experimento.

[0018] A figura 3 mostra um gráfico de valores da densidade ótica obtidos de amostras fecais caninas seguindo o método da presente invenção em um segundo experimento.

[0019] A figura 4 mostra um gráfico de valores da densidade ótica obtidos de amostras fecais caninas seguindo o método da presente invenção em um terceiro experimento.

[0020] A figura 5 mostra um primeiro gráfico de valores da densidade ótica obtidos de amostras fecais felinas seguindo o método da presente invenção em um quarto experimento.

[0021] A figura 6 mostra um segundo gráfico de valores da densidade ótica obtidos de amostras fecais felinas seguindo o método da presente invenção no quarto experimento.

[0022] A figura 7 mostra um primeiro gráfico de valores da densidade ótica obtidos de amostras fecais caninas seguindo o método da presente invenção em um quinto experimento.

[0023] A figura 8 mostra um segundo gráfico de valores da densidade ótica obtidos de amostras fecais caninas seguindo o método da presente invenção no quinto experimento.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERENCIAL [0024] A presente invenção, em um aspecto, é um dispositivo para a detecção de infecção intestinal por nematelminto em um mamífero, tal como um canino, felino, bovino, ou ser humano, por exemplo. O dispositivo é disposto para auxliar na detecção de a presença ou ausência de coproantígeno de nematelmintos em uma amostra fecal de um mamífero que também pode estar infectado com um ou mais de ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris, e parasita do coração do cão. Em um aspecto da invenção, o dispositivo inclui um suporte sólido, em que um ou mais anticorpos policlonais, cultivados contra extrato de nematelminto inteiro, extrato do trato reprodutivo de nematelminto, e/ou extrato do trato intestinal de nematelminto, e específicos para um ou mais antígenos de nematelmintos, são imobilizados sobre o suporte sólido. O suporte sólido pode ser, por exemplo, uma lâmina ou um substrato em um dispositivo de fluxo lateral.

[0025] Conforme mostrado nas figuras IA e IB, o dispositivo da presente invenção é, por exemplo, uma lâmina de multipoço 10 incluindo uma pluralidade de poços 12. Cada poço 12 proporciona um suporte sólido 14 para imobilizar sobre o mesmo um anticorpo policlonal 16 específico para nematelminto. A lâmina 10 pode ser uma lâmina de 96 poços Immulon IB, mas não está limitada a esta. Alternativamente, o dispositivo pode ser um teste de fluxo lateral tal como o descrito na patente dos Estados Unidos N° 5.726.010.

[0026] O anticorpo policlonal 16, designado de modo geral antiToxocara pAB, que é imobilizado sobre o suporte sólido 14 é produzido administrando um extrato total de uma espécie de Toxocara ou um extrato de uma porção, tal como todo ou parte do trato reprodutivo ou todo ou parte do trato intestinal, de uma espécie de Toxocara a um animal, tal como um coelho, por exemplo, coletando

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9/36 soro do animal e purificando o arAi-Toxocara pAB. Anti-Toxocara pAB especificamente é imobilizado sobre o suporte sólido 14 do poço 12 da lâmina 10 por adsorção física. É realizada imobilização de antiToxocara pAB sobre o suporte sólido 14 de modo que arAi-Toxocara pAB não será retirado por lavagem por quaisquer procedimentos que podem ser realizados, e deste modo a ligação específica de antígenos em uma amostra fecal a anti-Toxocara pAB é desimpedida pelo suporte sólido 14 ou outra superfície do dispositivo enquanto o método da presente invenção está sendo realizado. O dispositivo 10 da presente invenção é adequado para detectar antígeno de nematelminto pelo método da presente invenção, o qual pode incluir realizar um ensaio ELISA.

[0027] O método da invenção pode ser usado para detectar um ou mais antígenos de nematelmintos em uma amostra. A amostra de teste usada no método da invenção é uma amostra fecal. O método da invenção pode ser usado para testar uma amostra fecal de qualquer mamífero, tal como um felino, um canino, bovino ou um ser humano, por exemplo.

[0028] O dispositivo 10 da presente invenção, o qual inclui antiToxocara pAB imobilizado sobre o suporte sólido 14, pode ser usado em combinação com um método da presente invenção para detectar nematelminto na amostra fecal. Especificamente, uma infecção ativa por nematelmintos de um animal pode ser diagnosticada detectando um ou mais coproantígenos de nematelmintos com anti-Toxocara pAB que é imobilizado sobre o suporte sólido 14 do dispositivo 10. Coproantígenos de nematelmintos são quaisquer componentes de nematelmintos presentes em uma amostra fecal que podem especificamente e estavelmente ligar a anti-Toxocara pAB. Coproantígenos de nematelmintos portanto podem ser nematelminto inteiro, ovos de nematelmintos, fragmentos de nematelmintos,

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10/36 produtos secretados, excretados ou espalhados por nematelmintos ou uma combinação dos mesmos.

[0029] Específico para ou liga estavelmente significa que antiToxocara pAB reconhece e liga aos coproantígenos de nematelmintos com maior afinidade do que a outros coproantígenos (por exemplo, um coproantígeno de um verme parasitário não-nematelminto). A especificidade da ligação pode ser testada usando metodologia de conhecimento geral na técnica, por exemplo, ELISA ou um radioimunoensaio (RIA). Em um método da presente invenção, antígeno de nematelminto é detectado por ELISA. Segue-se um exemplo específico do método ELISA da presente invenção. Embora a presente invenção seja descrita com respeito a um método ELISA específico, no entanto, deve ser entendido que aqueles com conhecimento regular na técnica reconhecerão que etapas de ELISA alternativas, adicionais ou substitutas podem ser usadas sem se afastar do objetivo básico.

[0030] Um método da presente invenção é especificamente descrito com referência a dois Exemplos, os quais juntos incluem cinco Experimentos; no entanto, não deve ser considerado como sendo limitada a estes.

EXEMPLO A [0031] Os seguintes materiais e métodos foram usados para gerar dados descritos nos Experimentos 1, 2, 3, e 4 descritos abaixo.

[0032] Preparação de anticorpos policlonais. O anticorpo policlonal anti- Toxocara pAB (IgG) foi cultivado em coelho contra extrato de nematelminto inteiro (Toxocara canis) (Antibody Systems Inc., Hurst, Texas) e purificado do soro usando métodos de rotina. Em resumo, um extrato de nematelmintos inteiros rompidos foi preparado colhendo nematelmintos de animais caninos infectados, lavando os mesmos, e ressuspendendo os mesmos em solução. Os vermes ressuspendidos

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11/36 foram então rompidos por homogenização de tecido, peletizados por centrifugação, e ressuspendidos em solução. Esta ressuspensão foi administrada a coelho e o soro dos coelhos imunizados foi coletado. Anti-Toxocara pAB foi purificado do plasma dos coelhos imunizados isolando anticorpo IgG por cromatografia por afinidade de proteína G. [0033] Infecção e tratamento anti-helmíntico de animais caninos e felinos. Para todos os quatro Experimentos, infecção parasitária por nematódeo do gênero Trichuris foi efetuada por via oral administrando cerca de 150 a 300 ovos larvados de quer nematelminto (Toxocara), ancilóstomo (Ancylostoma canium), ou nematódeo do gênero Trichuris (Trichuris vulpis) a um canino ou felino saudável. (Especificamente, Toxocara canis foi o nematelminto que foi administrado a canino e Toxocara cati foi o nematelminto que foi administrado a felino). Para o Experimento 2, amostras fecais foram coletadas de caninos que se sabia estarem naturalmente infectados com parasita do coração do cão (Dirofilaria immitis). Adicionalmente, para os Experimentos 3 e 4 somente, caninos foram tratados no dia 91 pós-infecção e felinos foram tratados no dia 56 pós-infecção com Interceptor®, o qual é um agente anti-helmíntico disponível comercial mente da Novartis Animal Health Inc. de Basel, Suíça, de acordo com o protocolo do fabricante. É de conhecimento geral daqueles versados na técnica que Interceptor® é eficaz para a remoção de nematelmintos, ancilóstomos, nematódeo do gênero Trichuriss e parasita do coração do cãos de animais caninos e felinos. A infecção foi confirmada por observação microscópica de ovos de vermes em amostras fecais obtidas destes animais caninos e felinos. Caninos e felinos produzindo amostras fecais que foi visto que estavam livres de ovos de vermes por exame microscópico foram considerados como estando não infectados.

[0034] Preparação de amostras fecais caninas e felinas. Animais caninos e felinos que se sabe livres de infecção por verme parasitário

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12/36 ou de estarem infectados com um de quer nematelminto, ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris ou parasita do coração do cão proporcionaram a fonte de amostras fecais. Amostras (aproximadamente 1 grama) de amostras fecais caninas ou felinas frescas, não preservadas foram suspendidas em 4 ml de solução diluente (solução diluente é base Tris a 0,05 M; EDTA a 1 mM; 0,45% de Kathon; 16 mg/ml de sulfato de gentamicina; 0,05% de Tween- 20; 40% de soro fetal bovino; 10% de soro de coelho; e 5% de soro de camundongo). A suspensão foi centrifugada a 4000 rpm por 20 minutos para produzir um primeiro sobrenadante. O primeiro sobrenadante foi centrifugado a 12000 rpm por 5 minutos para produzir um segundo sobrenadante, o qual é referido aqui, neste requerimento de patente, como extrato fecal.

[0035] Ensaios ELISA. Anti-Toxocara pAB purificado (5 pg/ml; 100 μΙ/poço) foi imobilizado por adsorção física sobre lâminas de 96 poços Immulon IB de um dia para o outro a 4Ό. As lâminas foram em seguida bloqueadas com 1% de BSA em Tris a 0,1 M pH 7,0 a 4Ό de um dia para o outro, seguido por secagem em temperatura ambiente. Aproximadamente 100 μΙ de extrato fecal foi adicionado a cada poço e deixado para incubar em temperatura ambiente por uma hora. Os poços foram lavados cinco vezes com uma solução de PBS-Tween-20 de acordo com métodos de rotina conhecidos por aqueles com conhecimento regular da técnica. Anti-Toxocara pAB livre foi marcado com peroxidase de raiz-forte (HRP) usando o reticulador 4- [Nmaleimidometil]ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (SMCC) para criar um conjugado, e 10 pg/ml deste conjugado foi adicionado a cada poço de lâmina de 96 poços. Depois de um período de incubação de 30' em temperatura ambiente, conjugado não-ligado foi lavado dos poços usando solução de PBS-Tween-20 de acordo com métodos de rotina conhecidos por aqueles de conhecimento regular da técnica. 50

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13/36 μΙ de substrato de peroxidase TMBLUE® (SeraCare Life Sciences, West Bridgewater, MA) foi em seguida adicionado a cada poço e as lâminas foram incubadas por 10' em temperatura ambiente. Depois de interromper cada reação enzimática com 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) depois do período de incubação de 10', o valor da densidade ótica (OD) de cada poço da lâmina de 96 poços foi medido a A650 por meio de técnicas espectrofotométricas de rotina usando uma leitora de lâmina ELISA. Neste arranjo, o valor da OD obtido para qualquer poço particular da lâmina de 96 poços foi diretamente proporcional à quantidade de antígeno ligado especificamente presente no poço.

EXPERIMENTO 1 [0036] Anti-Toxocara pAB liga especificamente nematelminto, mas não liga especificamente ancilóstomo ou nematódeo do gênero Trichuris, em amostras fecais caninas.

[0037] Foi um objetivo do Experimento 1 determinar se antiToxocara pAB liga especificamente coproantígeno de nematelminto, ancilóstomo, e/ou nematódeo do gênero Trichuris em caninos. Determinações da OD para 20 amostras fecais caninas obtidas no Experimento 1 são mostradas na figura 2. Especificamente, estas amostras fecais foram obtidas de cinco animais caninos que se sabia estarem livres de infecção por verme parasitário (negLCZõ d62, negRCZõ d87, negSBYõ d62, negSVYõ d62, e negTIYõ d62), cinco animais caninos que se sabia estarem infectados com nematelminto (round+KWZ5 d62, round+QKZ5 d62, round+RYZ d62, round+SPY5 d69, e round+WHY5 d62), cinco animais caninos que se sabia estarem infectados com ancilóstomo (hook+LEY5 d62, hook+OGY5 d62, hook+RKY5 d62, hook+SKZ5 d62, e hook+SXZ5 d62), e cinco animais caninos que se sabia estarem infectados com nematódeo do gênero Trichuris (whip+KXZ5 d87,

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14/36 whip+REY5 d85, whip+RQZ5 d85, whip+SEZ d85, e whip+TGZ d85). Amostras fecais foram obtidas ou no dia 62 (d62), dia 69 (d69), dia 85 (d85), ou dia 87 (d87) pós-infecção. O dia pósinfecção específico escolhido para cada animal canino em particular se baseou no dia em que a produção de ovos do verme estava em ou próximo de níveis de pico conforme determinado por inspeção microscópica.

[0038] A OD média medida das amostras não infectadas, infectadas por ancilóstomo, e infectadas por nematódeo do gênero Trichuris foram 0,091, 0,099, e 0,172, respectivamente (a OD medida de cada uma destas amostras foi < 0,25), indicando que arAi-Toxocara pAB não ligou especificamente antígeno em quaisquer destas amostras. AO invés, a OD média das amostras fecais de caninos infectados por nematelminto foi 1,40, a qual foi cerca de oito vezes maior do que a obtida para as amostras infectadas por nematódeo do gênero Trichuris, e cerca de 15 vezes maior do que a obtida para as amostras não infectadas e infectadas por ancilóstomo. Estes dados indicam que anti-Toxocara pAB liga especificamente um ou mais antígenos de nematelmintos, mas não liga especificamente qualquer coproantígeno de ancilóstomo ou nematódeo do gênero Trichuris. EXPERIMENTO 2 [0039] Anti-Toxocara pAB não liga especificamente parasita do coração do cão em amostras fecais caninas.

[0040] Foi um objetivo do Experimento 2 determinar se antiToxocara pAB liga especificamente coproantígeno de parasita do coração do cão. Determinações da OD para 25 amostras fecais caninas obtidas em um segundo experimento são mostradas na figura

3. Especificamente, a figura 3 mostra dados obtidos como o resultado de amostras fecais de teste de três animais caninos que se sabia estarem livres de infecção por verme parasitário (negILS 11, negILS

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12, e negILS 13), sete animais caninos que se sabia estarem naturalmente infectados com parasita do coração do cão (negTRS 403, negTRS 404, negTRS 405, negTRS 406, negTRS 583, negTRS 749, e negTRS 868), 11 animais caninos que se sabia estarem infectados com nematelminto (round+ILS 10, round+ILS 18, round+ILS 20, ^,,round+ILS 22, ^,,round+ILS 29, ^,,round+ILS 32, round+ILS 36, ^,,round+ILS 38, ^,,round+ILS 41, ^,,round+ILS 67, e round+ILS 51), dois animais caninos que se sabia estarem infectados com ancilóstomo (hook+ILS 9 e hook+ILS 23), e dois animais caninos que se sabia estarem infectados com nematódeo do gênero Trichuris (^,,whip+ILS 34 e ^,,whip+ILS 39).

[0041] A OD média das amostras não infectadas, infectadas por parasita do coração do cão, infectadas por ancilóstomo, e infectadas por nematódeo do gênero Trichuris foram 0,058, 0,061, 0,074, e 0,074, respectivamente (a OD medida de cada uma destas amostras foi 0,101 ou menos), indicando que anti-Toxocara pAB não ligou especificamente antígeno em quaiquer destas amostras. Ao invés, a OD média das amostras fecais de caninos infectados por nematelminto foi 0,599, a qual foi cerca de 10 vezes maior do que a OD média medida nas amostras não infectadas e infectadas por parasita do coração do cão, e cerca de oito vezes maior do que a OD média das amostras infectadas por nematódeo do gênero Trichuris e as amostras infectadas por ancilóstomo. Além de proporcionar confirmação adicional de que anti-Toxocara pAB liga especificamente um ou mais antígenos de nematelmintos, mas não liga especificamente qualquer coproantígeno de ancilóstomo ou nematódeo do gênero Trichuris, este segundo experimento demonstra que anti-Toxocara pAB não liga especificamente qualquer coproantígeno de parasita do coração do cão.

EXPERIMENTO 3

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16/36 [0042] Anti-Toxocara pAB detecta nematelminto em fezes de um animal canino somente quando o animal tem uma infecção ativa por nematelmintos.

[0043] Uma vez que foi determinado que arAi-Toxocara pAB liga especificamente nematelminto, mas não ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris ou parasita do coração do cão, o Experimento 3 foi realizado para determinar se anti- Toxocara pAB detecta nematelminto somente em momentos apropriados (isto é, somente quando o animal hospedeiro tem uma infecção ativa por nematelmintos). Com este objetivo, dados de ELISA foram obtidos de todos os caninos não infectados e os caninos infectados por nematelminto descritos nos Experimentos 1 e 2. Especificamente, dados foram gerados a partir de amostras fecais obtidas de todos ou alguns destes animais infectados com nematelminto um dia antes da infecção (-1), e nos dias 23, 31, 38, 44, 48, 52, 93, e 105 pós-infecção. Inspeção microscópica destas amostras fecais indicou que as amostras obtidas nos dias 38, 44, 48, 52, e 93, mas não nos dias -1, 23, 31, e 105, estavam substancialmente infectadas com ovos de nematelmintos. (A ausência de um número substancial de ovos de nematelmintos nos dias 23 e 31 é consistente com o ciclo de vida dos nematelmintos em caninos. Isto é, é de conhecimento geral na téccica que ovos de vermes administrados por via oral não se manifestam em material fecal canino em números substanciais até cerca de um mês depois da introdução. Adicionalmente, espera-se que a ausência de um número substancial de ovos de nematelmintos no dia 105 seja devida ao tratamento antihelmíntico administrado no dia 91.) [0044] Conforme mostrado na figura 4, nematelminto foi detectado pelo método da presente invenção somente em amostras fecais que foram determinadas microscopicamente estando substancialmente infectadas com ovos de nematelmintos (isto é, somente em amostras

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17/36 obtidas nos dias 38, 44, 48, 52, e 93). Especificamente, o valor da OD média gerado a partir de amostras fecais de caninos infectados por nematelmintos em cada um dos dias -1, 23, 31, e 105 (os quais foram determinados microscopicamente como estando substancialmente livres de ovos de nematelmintos), foi <0,180. O valor da OD média gerado a partir de amostras fecais de caninos infectados por nematelmintos em cada um dos dias 38, 44, 48, 52, e 93 foi 1,316, 1,842, 1,896, 2,295, 1,104, o qual representa uma faixa de cerca de um aumento de seis vezes a cerca de um aumento de 12 vezes na OD em relação às amostras livres de ovos.

[0045] O Experimento 3 portanto indica que arAi-Toxocara pAB liga especificamente coproantígeno de nematelmintos somemte quando um animal hospedeiro tem uma infecção ativa por nematelminto. EXPERIMENTO 4 [0046] Artii-Toxocara pAB liga especificamente coproantígeno de nematelminto em uma amostra fecal felina, e o faz somente quando o felino do qual a amostra fo iobtida tem uma infecção ativa por nematelminto.

[0047] Foi um objetivo do Experimento 4 determinar se antiToxocara pAB liga especificamente coproantígeno de nematelminto em felinos.

[0048] Valores da OD medidos para amostras fecais obtidas de felinos não infectados e felinos infectados por nematelmintos são mostrados nas figuras 5 e 6, respectivamente. Especificamente, a figura 5 mostra valores da OD média (e desvios-padrão) medidos usando amostras fecais de felinos não infectados durante o curso de 75 dias. (Cada valor de OD mostrado na figura 5 é a média de seis valores de OD obtidos da mesma amostra fecal em seis reações ELISA separadas.) Dados dos mesmos seis felinos não infectados, os quais são designados C081-N, C098-N, C118-N, C091-N, C097-N, e

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C106-N, são mostrados para os dias -1 (isto é, um dia antes da administração de infecção por ancilóstomo aos animais infectados por ancilóstomo) e 54, e para dias selecionados entre estes. Adicionalmente, dados de três destes seis felinos, C081-N, C098-N e Cl 18-N, também são mostrados para cada um dos dias 60, 68 e 74. [0049] A figura 6 mostra valores da OD média (e desvios-padrão) gerados usando amostras fecais tomadas de felinos infectados por ancilóstomo durante o curso de 78 dias. (Cada valor de OD mostrado na figura 6 é a média de seis valores de OD gerados a partir da mesma amostra fecal em seis reações ELISA separadas.) Dados dos mesmos seis animais felinos, os quais são designados C085-R, C087R, C104-R, C096-R, CIOO-R e C 107- R, são mostrados para os dias 1 (isto é, um dia antes da administração de infecção por nematelminto aos animais) e 54, e para dias selecionados entre estes. Adicionalmente, dados de três destes seis felinos, C085-R, C087-R e C104-R, são mostrados para os dias 60 e 77, e para dias selecionados entre estes.

[0050] Com referência à figura 5, a média dos valores da OD média medida para os felinos não infectados foi 0,059 ou menos para cada um dos dias -1 e 74 e os dias selecionados entre estes. Com referência à figura 6, a média dos valores da OD média medida para os felinos infectados por nematelmintos foi 0,053 ou menos para cada um dos dias -1 e 34 e os dias selecionados entre estes. No dia 40, a média dos valores da OD média medida para os felinos infectados por nematelmintos foi 0,312, a qual é cerca de 10 vezes maior do que a vista nos felinos não infectados para cada um dos dias -1 e 74 e os dias selecionados entre estes, e nos felinos infectados por nematelmintos nos dias -1 e 34 e os dias selecionados entre estes. Adicionalmente, vários valores da OD média medida para alguns dos felinos infectados por nematelmintos nos dias pós-infecção 42, 46, 48,

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19/36 e 54 foram várias vezes maiores do que os vistos nos felinos não infectados para cada um dos dias -1 e 74 e os dias selecionados entre estes, e nos felinos infectados por nematelmintos nos dias -1 e 34 e os dias selecionados entre estes.

[0051] Estes dados indicam que arAi-Toxocara pAB liga especificamente um ou mais coproantígeno de nematelminto. Estes dados adicionalmente indicam que arAi-Toxocara pAB pode ser usado determinar se um felino está ou não infectado com nematelminto.

[0052] Foi outro objetivo do Experimento 4 determinar se antiToxocara pAB detecta nematelminto somente quando um animal felino tem uma infecção ativa por nematelminto.

[0053] Observação microscópica das amostras fecais tomadas dos animais caninos infectados por nematelminto no dia 60 pós-infecção mostrou que as amostras estavam moderadamente livres de ovos de nematelminto, e observação microscópica das amostras fecais tomadas dos animais infectados por ancilóstomo nos dias 63, 68, 70, 74 e 77 pós-infecção mostrou que as amostras estavam substancialmente livres de ovos de nematelminto. Espera-se que a moderada redução em ovos no dia 60 pós-infecção e a substancial redução em ovos nos dias 63, 68, 70, 74 e 77 pós-infecção tenha sido devida ao tratamento anti-helmíntico administrado no dia 56 pósinfecção. Com referência à figura 6, a média dos valores da OD média medidos para os felinos infectados por nematelmintos foi consistente com a redução observada do número de ovos nas amostras fecais tomadas destes animais. Especificamente, a média dos valores da OD medida para estes caninos nos dias depois do tratamento antihelmíntico foi 0,063 (dia 60) ou menos.

[0054] Estes dados indicam que arAi-Toxocara pAB liga especificamente um ou mais coproantígeno de nematelminto. Estes dados adicionalmente indicam que arAi-Toxocara pAB pode ser usado

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20/36 determinar se um felino tem ou não uma infecção ativa por nematelminto.

EXEMPLO B [0055] Os materiais e métodos seguintes foram usados para gerar dados descritos no Experimento 5 descrito abaixo.

[0056] Preparação de anticorpos policlonais. Uma preparação de arAi-Toxocara pAB (IgG) foi cultivada em coelhos contra extratos de intestino de nematelminto (Γ. canis) e uma segunda preparação de arAi-Toxocara pAB (IgG) foi cultivada em coelhos contra extratos de órgãos reprodutivos de nematelminto (T canis), e ambas as preparações foram purificadas de soro usando métodos de rotina. (Para clareza, arA\-Toxocara pAB cultivado contra intestino é referido mais especificamente como sendo anti-TGUT pAB e anti-Toxocara pAB cultivado contra órgãos reprodutivos é referido mais especificamente como sendo anti-TOVA pAB). Em resumo, extratos de intestino de nematelminto fêmea ou órgãos reprodutivos masculino e feminino dissecados foram preparados colhendo nematelmintos de animais caninos infectados, lavando os mesmos, e dissecando os órgãos. Os órgãos foram triturados em nitrogênio líquido e suspendidos em solução salina balanceada de Hanks tendo inibidor de protease. Esta suspensão foi administrada aos coelhos e foi coletado soro dos coelhos imunizados. Anti-TGUT pAB e anti-TOVA pAB foram purificados do plasma dos coelhos imunizados isolando anticorpo IgG por cromatografia por afinidade de proteína G.

[0057] Infecção e tratamento anti-helmíntico de animais caninos. Para o Experimento 5, infecção parasitária por nematódeo do gênero Trichuris foi efetuada administrando por via oral cerca de 150 a 300 ovos larvados de quer nematelminto (Γ. canis), ancilóstomo, ou nematódeo do gênero Trichuris a um canino saudável. A infecção foi confirmada por observação microscópica de ovos de verme em

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21/36 amostras fecais obtidas destes animais caninos. Caninos produzindo amostras fecais que foram consideradas estando livres de ovos de vermes por exame microscópico foram considerado estando não infectados.

[0058] Ensaios ELISA. Anti-TGUT pAB ou anti-TOVA pAB purificado (3 a 9 pg/ml; 100 μΙ/ poço) foi imobilizado por adsorção física sobre lâminas de 96 poços Immulon IB de um dia para o outro a 4Ό. As lâminas foram em seguida bloqueadas com 1% de BSA em Tris a 0,1 M pH 7,0 a 40 de um dia para o outro, seguido por secag em em temperatura ambiente. Aproximadamente 100 pi de extrato fecal (preparado conforme descrito acima) foi adicionado a cada poço e deixado para incubar em temperatura ambiente por uma hora. Os poços foram lavados cinco vezes com uma solução de PBS-Tween-20 de acordo com métodos de rotina conhecidos por aqueles de conhecimento regular da técnica. Anti-TGUT pAB ou anti-TOVA pAB livre foi marcado com HRP usando SMCC para criar um conjugado, e 3 a 9 pg/ml deste conjugado foi adicionado a cada poço da lâmina de 96 poços. Depois de um período de incubação de 30' em temperatura ambiente, conjugado não-ligado foi lavado dos poços usando solução de PBS-Tween-20 de acordo com métodos de rotina conhecidos por aqueles de conhecimento regular da técnica. 50 μΙ de substrato de peroxidase TMBLUE® (SeraCare Life Sciences, West Bridgewater, MA) foi em seguida adicionado a cada poço e as lâminas foram incubadas por 10' em temperatura ambiente. Depois de interromper cada reação enzimática com 0,1% de SDS depois do período de incubação de 10', o valor da OD de cada poço da lâmina de 96 poços foi medido a A650 por meio de técnicas espectrofotométricas de rotina usando uma Leitora de lâmina ELISA. Neste arranjo, o valor da OD value obtido para qualquer poço particular da lâmina de 96 poços foi diretamente proporcional à quantidade de antígeno especificamente

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22/36 ligado presente no poço.

EXPERIMENTO 5 [0059] Cada de anti-TGUT pAB e anti-TOVA pAB liga especificamente nematelminto, mas não liga especificamente nem ancilóstomo ou nematódeo do gênero Trichuris, em amostras fecais caninas.

[0060] Foi um objetivo do Experimento 5 determinar se anticorpo cultivado contra trato intestinal de nematelminto, referido especificamente como anti-TGUT pAB, e/ou anticorpo cultivado contra trato reprodutivo de nematelminto, referido especificamente como anti-TOVA pAB, liga especificamente coproantígeno de nematelminto, ancilóstomo, e/ou nematódeo do gênero Trichuris. Determinações da OD para 16 amostras fecais caninas obtidas em Experimento 5 são mostrados em cada uma das figuras 7 e 8. (A figura 7 mostra valores da OD obtidos usando anti-TGUT pAB e a figura 8 mostra valores da OD obtidos usando anti-TOVA pAB.) Especificamente, estas amostras fecais foram obtidas de quatro animais caninos que se sabia estarem livres de infecção por verme parasitário (negTIY5 d62, negSVY5 d62, negSBY5 d62, e negLCZ5 d62), quatro animais caninos que se sabia estarem infectados com nematelminto (round+QKZ5 d62, round+SPY5 d62, round+RYZ d69, e round+WHY5 d69), quatro animais caninos que se sabia estarem infectados com ancilóstomo (hook+LEY5 d76, hook+OGY5 d76, hook+SXZ5 d84, e hook+SKZ5 d69), e quatro animais caninos que se sabia estarem infectados com nematódeo do gênero Trichuris (whip+SEZ d62, whip+KXZ5 d69, whip+RQZ5 d62, e whip+REY5 d62). As amostras fecais foram obtidas ou pós-infecção no dia 62 (d62), dia 69 (d69), dia 76 (d76), ou dia 84 (d84). O dia pós-infecção específico escolhido para cada animal canino em particular se baseou no dia que a produção de ovos de vermes estava

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23/36 em ou próximo de níveis de pico conforme determinado por inspeção microscópica.

[0061] Com referência especificamente à figura 7, para anti-TGUT pAB, a OD média medida das amostras não infectadas, infectadas por ancilóstomo, e infectadas por nematódeo do gênero Trichuris foram 0,075, 0,083, e 0,082, respectivamente (a OD medida de cada uma destas amostras foi < 0,096), indicando que anti-TGUT pAB não ligou especificamente antígeno em quaisquer destas amostras. Ao invés, a OD média das amostras fecais de caninos infectados por nematelmintos foi 0,385, a qual foi cerca de 4,5 a 5 vezes maior do que a obtida para as amostras não infectadas, infectadas por ancilóstomo e infectadas por nematódeo do gênero Trichuris. Estes dados indicam que anti-TGUT pAB liga especificamente um ou mais antígenos de neatelmintos, mas não liga especificamente qualquer coproantígeno de ancilóstomo ou nematódeo do gênero Trichuris. [0062] Com referência especificamente à figura 8, para anti-TOVA pAB, a OD média medida das amostras não infectadas, infectadas por ancilóstomo, e infectadas por nematódeo do gênero Trichuris foram 0,588, 0,820, e 0,590, respectivamente (a OD medida de cada uma destas amostras foi < 0,916). Ao invés, a OD média das amostras fecais de caninos infectados por nematelmintos foi 3,244, a qual foi cerca de 4 a 5,5 vezes maior do que a obtida para as amostras não infectadas, infectadas por ancilóstomo e infectadas por nematódeo do gênero Trichuris. Estes dados indicam que anti-TGUT pAB liga especificamente um ou mais antígenos de nematelmintos, mas não liga especificamente qualquer coproantígeno de ancilóstomo ou nematódeo do gênero Trichuris.

[0063] Apesar da composição, dispositivo e método da presente invenção terem sido descridos com respeito a uma modalidade específica e exemplos específicos, deve ser entendido que podem ser

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24/36 feitas variações ao dispositivo e/ou o método da presente invenção sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. Por exemplo, deve ser entendido que um anticorpo policlonal diferente de arAi-Toxocara pAB, ou anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, ou fragmentos de um anticorpo podem ser substituídos por arAi-Toxocara pAB. Outro anticorpo policlonal que é específico para nematelminto pode ser preparado, por exemplo, administrando um ou mais antígenos específicos para nematelminto a um animal. Além disso, apesar de anti-Toxocara pAB ter sido cultivado em coelho, anticorpo policlonal também pode ser cultivado em, por exemplo, um ser humano ou outro primata, camundongo, rato, porquinho-da-índia, cabra, porco, vaca, ovelha, asno, cachorro, gato, galinha, ou cavalo. Um anticorpo usado no dispositivo da invenção também pode ser qualquer classe de anticorpo, incluindo, por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Meios para preparar e caracterizar anticorpos são de conhecimento geral na técnica. Vide, por exemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al Crit. Rev. Immunol. 12:125-68(1992). [0064] Um anticorpo usado nos dispositivos, métodos e kits da invenção também pode ser um anticorpo de cadeia única (scFv), ou um fragmento de um anticorpo de ligação de antígeno. Fragmentos de anticorpos de ligação de antígeno são uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o sítio de ligação antigênica ou região variável de um anticorpo intacto, em que a porção é livre dos domínios de cadeia pesada constante da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 e Fv.

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25/36 [0065] Anticorpos usados no dispositivo da invenção podem ser imobilizados sobre o suporte sólido por qualquer metodologia conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, fixar de modo covalente ou de modo não-covalente, diretamente ou indiretamente, os anticorpos ao suporte sólido. Portanto, apesar do arAi-Toxocara pAB ser fixado ao suporte sólido por adsorção física (isto é, sem o uso de encadeadores químicos) na modalidade descrita, é contemplado que arAi-Toxocara pAB ou outros anticorpos podem ser imobilizados ao suporte sólido por qualquer método de ligação química (isto é, com o uso de encadeadores químicos) prontamente conhecido de uma pessoa versada na técnica.

[0066] O suporte sólido do dispositivo não está limitado a ser uma lâmina de 96 poços de poliestireno. O suporte sólido pode ser qualquer material adequado para a imobilização de anticorpos específicos para nematelminto. Por exemplo, o suporte sólido pode ser contas, partículas, tubos, poços, sondas, dipsticks, pontas de pipeta, lâminas, fibras, membranas, papéis, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, géis agaroses, vidro, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, plásticos, magnetita ou qualquer outro material adequado prontamente conhecido de uma pessoa versada na técnica.

[0067] O dispositivo da presente invenção também não está limitado a ser um dispositivo que é adequado para realizar um teste ELISA. Por exemplo, o dispositivo pode ser um dispositivo que é adequado para realizar um teste de fluxo lateral. Um dispositivo exemplar que é útil para realizar um teste de fluxo lateral que é útil na presente invenção é descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.726.010, a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. O dispositivo para realizar um teste de fluxo lateral portanto pode ser um dispositivo SNAP®, o

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26/36 qual está disponível comercial mente nos IDEXX Laboratories, Inc. de

Westbrook, ME.

[0068] O dispositivo pode incluir opcionalmente um ou mais reagentes de captura de antígeno marcados que podem ser misturados com uma amostra fecal antes da aplicação a um dispositivo da invenção. Quando o reagente antigênico marcado é incluído, o reagente de captura de antígeno marcado pode ser ou não depositado ou secado sobre a superfície sólida do dispositivo. Por captura de antígeno se indica qualquer composto que é específico para o antígeno de interesse. O reagente de captura de antígeno marcado, quer adicionado a uma amostra fecal ou pré-depositado sobre o dispositivo, pode ser, por exemplo, um anticorpo marcado específico para um antígeno de nematelminto. Por exemplo, um anticorpo específico para nematelminto conjugado com peroxidase de raiz-forte pode ser usado como um reagente de captura de antígeno marcado.

[0069] O dispositivo também pode incluir opcionalmente um reagente líquido que transporta, tal como quando o dispositivo inclui o dispositivo SNAP®, por exemplo, ou facilita remoção de, tal como quando o dispositivo inclui uma lâmina de 96 poços, por exemplo, material não-ligado (por exemplo, amostra fecal não reagida e reagente de captura de antígeno não-ligado) da zona de reação (fase sólida). O reagente líquido pode ser um reagente de lavagem e serve somente para remover material não-ligado da zona de reação, ou pode incluir um reagente detector e servir para tanto remover material nãoligado quanto facilitar detecção de antígeno. Por exemplo, no caso de um reagente de captura de antígeno conjugado a uma enzima, o reagente detector inclui um substrato que produz um sinal detectável na reação com o conjugado de enzima-anticorpo na zona de reação (fase sólida). Alternativamente, no caso de um reagente de captura de

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27/36 antígeno marcado conjugado a uma molécula radioativa, fluorescente, ou absorvedora de luz, o reagente detector age meramente como uma solução de lavagem facilitando a detecção de formação de complexo na zona reativa retirando por lavagem reagente marcado não-ligado. [0070] O reagente líquido pode incluir adicionalmente uma quantidade limitada de um inibidor, isto é, uma substância que bloqueia o desenvolvimento do produto final detectável. Uma quantidade limitada é definida como sendo uma quantidade de inibidor suficiente para bloquear o desenvolvimento de produto final até a maior parte ou todo o excesso, de material não-ligado ser transportado para longe da segunda região, ocasião na qual produto final detectável é produzido.

[0071] O dispositivo da presente invenção também pode incluir vários reagentes de ligação imobilizados em localizações distintas do um ou mais reagentes de captura de antígeno. Por exemplo, um imunorreagente (um anticorpo, antígeno ou peptídeo) que reconhece uma porção de anticorpo espécie-específica {por exemplo, específica para verme) de um anticorpo marcado ou reagente de captura de antígeno ou uma porção enzimática de um reagente marcado com enzima pode ser incluído como um controle positivo para avaliar a viabilidade dos reagentes dentro do dispositivo. Por exemplo, um controle positivo pode ser um anticorpo anti-peroxidase de raiz-forte que tenha sido cultivado, por exemplo, em uma cabra ou em um camundogno. Adicionalmente, um reagente, por exemplo, um anticorpo, isolado de um membro não-imune da espécie da qual a porção de anticorpo do complexo de antígeno-anticorpo foi derivado pode ser incluído como um controle negativo para avaliar a especificidade da formação de imunocomplexo (isto é, complexo de antígeno-anticorpo).

[0072] Além de ser designado para detectar nematelminto em uma

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28/36 amostra fecal, o dispositivo da invenção opcionalmente pode ser designado para permitir que um ou mais testes diagnósticos diferentes sejam realizados. Por exemplo, o suporte sólido também pode incluir reagentes para a detecção de um ou mais parasitas de verme nãonematelminto, um ou mais parasitas não- verme, um ou mais vírus, ou uma ou mais bactérias. Os reagentes para a detecção de um ou mais parasitas de verme não-nematelminto, um ou mais parasitas nãoverme, um ou mais vírus ou uma ou mais bactérias podem ser, por exemplo, um ou mais anticorpos ou um ou mais antígenos reconhecidos por anticorpos específicos para um ou mais parasitas de verme não-nematelminto, um ou mais parasitas não- verme, um ou mais vírus ou uma ou mais bactérias.

[0073] Nos métodos da presente invenção, a detecção de uma infecção por nematelminto é realizada detectando a presença ou ausência de um ou mais antígenos de nematelmintos em uma amostra fecal. A porção solúvel de uma amostra fecal a ser testada pode ser coletada por meio de qualquer protocolo conhecido na técnica. Por exemplo, além do protocolo específico descrito acima, as porções solúveis da amostra podem ser coletadas usando filtração, centrifugação, ou simples mistura seguida por sedimentação gravi métrica.

[0074] Os métodos incluem contactar a amostra fecal com um ou mais anticorpos específicos para um ou mais antígenos de nematelmintos sob condições que permitem que se forme um complexo de antígeno/anticorpo, isto é, um imunocomplexo. Isto é, um anticorpo liga especificamente a um antígeno de nematelminto presente na amostra fecal. Uma pessoa versada na técnica estaria familiarizada com testes e condições que são usados para detectar ligação de complexo de antígeno/anticorpo. Por exemplo, o complexo de antígeno/anticorpo pode ser detectado usando um anticorpo

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29/36 secundário que liga ao complexo de antígeno/anticorpo. A formação de um complexo entre antígeno de nematelminto e anticorpos antinematelmintos na amostra pode ser detectada usando qualquer método adequado conhecido na técnica. Além disso, a quantidade de complexos de anticorpo-antígeno pode ser determinada por meio de metodologia conhecida na técnica. Um nível que é maior do que o formado em uma amostra controle indica uma infecção por nematelminto.

[0075] Etapas alternativas do método da presente invenção podem incluir aplicar a amostra fecal a um dispositivo da invenção, o qual inclui um imobilizado anticorpo específico para antígeno de nematelminto, e detectar a presença ou ausência do antígeno de nematelminto na amostra fecal. Anticorpos específicoa para antígenos de nematelmintos podem ser fixados diretamente ou indiretamente a um suporte sólido ou um substrato tal como um poço de microtítulo, contas magnéticas, contas não-magnéticas, coluna, matriz, membrana, esteira fibrosa composta de fibras sintéticas ou naturais (por exemplo, vidro ou materiais à base de celulose ou polímeros termoplásticos, tais como, polietileno, polipropileno, ou poliéster), estrutura sinterizada composta de materiais particulados (por exemplo, vidro ou vários polímeros termoplásticos), ou filme de membrana de fundição composto de nitrocelulose, náilon, polissulfona ou similares (geralmente sintético na natureza). Todos estes materiais de substrato podem ser usados em formatos adequados, tais como filmes, folhas, ou lâminas, ou podem ser revestidos sobre ou ligados ou laminados a veículos inertes apropriados, tais como papel, vidro, filmes plásticos, ou tecidos. Métodos adequados para imobilizar peptídeos sobre fases sólidas incluem interações iônicas, hidrofóbicas, covalentes e similaress.

[0076] No entanto, o método da presente invenção não precisa

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30/36 incluir o uso de substratos ou fases sólidas. Por exemplo, os métodos podem incluir métodos de imunoprecipitação os quais não requerem o uso de substratos ou fases sólidas.

[0077] Em algumas modalidades da invenção, o complexo de antígeno/anticorpo é detectado quando um reagente indicador, tal como um conjugado de enzima, o qual é ligado ao anticorpo, catalisa uma reação detectável. Opcionalmente, um reagente indicador incluindo um composto gerador de sinal pode ser aplicado ao complexo de antígeno/anticorpo sob condições que permitem formação de um complexo de antígeno/anticorpo/indicador detectável. Opcionalmente o anticorpo pode ser marcado com um reagente indicador antes da formação de um complexo de antígeno/anticorpo. [0078] A formação de um complexo de antígeno/anticorpo ou um complexo de antígeno/anticorpo/indicador em alguns dos métodos da presente invenção especificamente pode ser detectada por métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, de separação de tamanho, ou de precipitação. Também pode ser obtida detecção de um complexo de antígeno/anticorpo pela adição de um anticorpo secundário que é acoplado a um reagente indicador incluindo um composto gerador de sinal. Reagentes indicadores incluindo compostos geradores de sinal (marcas) associados com um complexo de polipeptídeo/anticorpo podem ser detectados usando os métodos descritos acima e podem incluir agentes cromogênicos, catalisadores tais como conjugados de enzimas, compostos fluorescentes tais como fluoresceína e rodamina, compostos quimiluminescentes tais como dioxetanos, acridínios, fenantridínios, rutênio, e luminol, elementos radioativos, marcas visuais diretas, bem como cofatores, inibidores, partículas magnéticas, e semelhantes. Exemplos de conjugados enzimáticos incluem fosfatase alcalina, peroxidase de raiz-forte, betagalactosidase, e similares. A seleção de uma marca particular não é

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31/36 crucial, mas será capaz de produzir um sinal quer sozinho quer em combinação com uma ou mais substâncias adicionais.

[0079] Anticorpos, incluindo anticorpos secundários, podem ser marcados com qualquer tipo de marca conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, marcas fluorescentes, quimilumoinescentes, radioativas, de enzimas, de partículas coloidais, de radioisótopos e bioluminescentes. Em várias modalidades da invenção, o um ou mais dos anticorpos da invenção são marcados com uma enzima, uma partícula coloidal, um radionuclídeo ou um fluoróforo. A marca de particulado pode ser, por exemplo, uma partícula de látex colorida, sol de corante, ou ouro coloidal conjugado a um anticorpo específico para um antígeno de nematelminto.

[0080] Métodos da invenção incluem, mas não estão limitados àqueles baseados em provas do tipo de competição, de reação direta ou de sanduíche, incluindo, mas não limitados a ELISA, RIA, ensaios imunofluorescentes (IFA), hemaglutinação (HA), imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA), e ensaios de lâmina de microtítulo (qualquer prova feita em uma ou mais poços de uma lâmina de microtítulo). Uma prova da invenção inclui uma prova de ligação cromatográfica de fluxo reversível, a qual pode ser realizada, por exemplo, usando um dispositivo SNAP®. Vide a Patente dos Estados Unidos N° 5.726.010.

[0081] Métodos da invenção facilitam ensaios de ligação específicos de sanduíche ou do tipo de competição. Em um ensaio de sanduíche, reagentes de captura de antígeno são imobilizados em uma zona reativa. Estes reagentes de captura de antígeno podem ligar especificamente a antígenos na amostra fecal sendo testada. Especificamente, estes reagentes de captura de antígeno ligam especificamente a um antígeno de um nematelminto, caso presente na amostra fecal. Depois de ligação do antígeno da amostra, o complexo

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32/36 de reagente de captura de antígeno/ antígeno é detectado por qualquer método adequado. Por exemplo, o complexo pode ser reagido com reagentes de ligação específica marcados (por exemplo, um conjugado de enzima-anticorpo) e antígeno detectado (por exemplo, na reação com substrato).

[0082] Em outras modalidades da presente invenção, é realizada uma prova de competição. Em uma prova de competição, reagentes de captura de antígeno são imobilizados na zona reativa e são contactados simultaneamente com antígeno de uma amostra e antígeno marcado (por exemplo, um conjugado de antígeno-enzima). A quantidade de marca detectada na zona reativa é inversamente proporcional à quantidade de antígeno na amostra.

[0083] Em algumas modalidades da invenção, anticorpos específicos para um antígeno ou antígenos de nematelminto são anexados a uma fase sólida ou substrato. A amostra fecal incluindo potencialmente um antígeno de nematelminto é adicionada ao substrato. Anticorpos que ligam especificamente nematelminto são adicionados. Os anticorpos podem ser os mesmos anticorpos usados sobre a fase sólida ou podem ser de uma fonte ou espécie diferente. Adicionalmente, estes anticorpos podem ser encadeados a um reagente indicador, tal como um conjugado enzimático. Etapas de lavagem podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato de enzma pode ser adicionado e pode-se deixar desenvolver cor. A reação de cor pode ser interrompida e a cor pode ser quantificada usando, por exemplo, um espectrofotômetro.

[0084] Em outras modalidades da invenção, anticorpos específicos para um antígeno ou antígenos de nematelminto são anexados a uma fase sólida ou substrato. Uma amostra fecal incluindo potencialmente um antígeno de nematelminto é adicionada ao substrato. Segundos anticorpos anti-espécies que ligam especificamente antígenos de

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33/36 nematelmintos são adicionados. Estes segundos anticorpos são de uma espécie diferente dos anticorpos de fase sólida. Terceiros anticorpos antiespécies que ligam especificamente os segundos anticorpos e que não ligam especificamente os anticorpos de fase sólida são adicionados. Os terceiros anticorpos podem incluir um reagente indicador, tal como um conjugado enzimático. Etapas de lavagem podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato de enzma pode ser adicionado e pode-se deixar desenvolver cor. A reação de cor pode ser interrompida e a cor pode ser quantificada usando, por exemplo, um espectrofotômetro.

[0085] Em um exemplo específico, o método da presente invenção é realizado em combinação a um dispositivo que é um dispositivo de teste de fluxo lateral adicionando uma amostra fecal preparada a uma matriz de fluxo do dispositivo em uma primeira região (uma zona de aplicação de amostra). A amostra fecal preparada é carregada em um caminho de fluxo de fluidos por ação capilar para uma segunda região da matriz de fluxo onde uma marca de particulado capaz de ligação e formação de um primeiro complexo com um antígeno na amostra fecal. A marca de particulado pode ser, por exemplo, uma partícula de látex colorida, sol de corante, ou ouro coloidal conjugado a um anticorpo específico para um antígeno de nematelminto. O primeiro complexo é carregado para uma terceira região da matriz de fluxo onde um anticorpo que liga especificamente um antígeno de nematelminto é imobilizado em uma localização distinta. Forma-se um segundo complexo entre o anticorpo imobilizado e o primeiro complexo. A marca de particulado que é parte do segundo complexo pode ser diretamente vizualizada.

[0086] Anticorpo de nematelminto pode ser um reagente de captura de antígeno imobilizado em uma zona de reação (fase sólida). Um segundo reagente de captura de antígeno, isto é, um segundo

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34/36 anticorpo de nematelminto que tenha sido conjugado a uma marca, ou pode ser adicionado à amostra antes da amostra ser adicionada ao dispositivo, ou o segundo reagente de captura de antígeno pode ser incorporado no dispositivo. Por exemplo, o reagente de captura de antígeno marcado pode ser depositado e secaso sobre um caminho de fluxo de fluidos que proporciona comunição de fluidos entre uma zona de aplicação da amosrta e a fase sólida. Contato do reagente de captura de antígeno marcado com a amostra de teste pode resultar em dissolução do reagente de captura de antígeno marcado.

[0087] A invenção inclui adicionalmente kits de teste (por exemplo, artigos de fabricação) para detectar nematelminto em uma amostra fecal. Um kit portanto pode incluir um ou mais dispositivos da presente invenção. Por exemplo, o kit pode incluir anticorpos antinematelminto e meios para determinar ligação dos anticorpos a antígenos de nematelminto na amostra. Em um exemplo particular, um kit semelhante inclui o dispositivo tendo um anticorpo antinematelminto imobilizado, um ou mais reagentes de captura de antígeno (por exemplo, um reagente de captura de antígeno marcado não imobilizado e um reagente de captura de antígeno imobilizado), e reagente de lavagem, bem como reagente detector e reagentes controle positivo e negativo, caso desejado ou apropriado. Outros componentes tais como tampões, controles, e similares, de conhecimento daqueles versados na técnica, podem ser incluídos em semelhantes kits de teste. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas, para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibildade do ensaio. Partieularmente, os reagentes podem ser proporcionados como pós secos, geralmente liofilizados, os quais na dissolução proporcionarão uma solução de reagentes tendo as concentrações apropriadas para combinar a uma amostra. Os anticorpos, ensaios e

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35/36 kits da invenção são úteis, por exemplo, no diagnóstico de casos individuais de infecção por nematelminto em um paciente, bem como estudos epidemiológicos de surtos de nematelminto. O kit pode incluir adicionalmente instruções para realizar um ou mais métodos da presente invenção, incluindo instruções para usar qualquer dispositivo da presente invenção que é incluído com o kit.

[0088] Os métodos da invenção para detecção de infecção por nematelminto podem ser combinados a outros ensaios diagnósticos para detectar a presença de outros organismos ou condições. Por exemplo, ensaios da invenção podem ser combinados com reagentes que detectam um ou mais parasita fecal de verme não-nematelminto, um ou mais parasita não-verme fecal, um ou mais vírus, uma ou mais bactérias, um ou mais parasitas transportados pelo sangue ou sangue oculto ou uma combinação dos mesmos. Proporcionando dois ou mais sítios de ligação únicos em um dispositivo de ensaio único (tal como, por exemplo, dois pontos únicos sobre um dispositivo de ensaio SNAP®), a presente invenção possibilita detecção de dois ou mais organismos de uma amostra única. Em uma modalidade, há três pontos únicos para detecção de infecção passada ou presente de três organismos (os pontos sendo ou reagentes de ligação de anticorpo ou antígeno) de uma amostra única (isto é, a mesma amostra única é apresentada aos três reagentes de captura sobre um único dispositivo).

[0089] A invenção descrita de modo ilustrativo aqui, neste requerimento de patente, pode ser praticada convenientemente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são especificamente revelados aqui, neste requerimento de patente. Deste modo, por exemplo, em qualquer caso aqui, neste requerimento de patente, qualquer dos termos compreendendo, consistindo essencialmente em e consistindo em pode ser

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36/36 substituído com qualquer um dos outros dois termos, enquanto retendo seus significados ordinários. Os termos e expressões os quais foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de, no uso de semelhantes termos e expressões, excluir quaisquer equivalmentes das características mostradas e descritas ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção reivindicada. Deste modo, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente revelada por modalidades preferenciais, características opcionais, modificação e variação dos conceitos revelados aqui, neste requerimento de patente, podem ser reclassificados por aqueles versados na técnica, e que semelhantes modificações e variações são consideradas como estando dentro do âmbito desta invenção conforme definido pela descrição e pelas reivindicações anexadas.

[0090] Além disso, onde características ou aspectos da invenção são descritas em termos de grupos markush ou outro agrupamento de alternativas, os versados na técnica reconhecerão que a invenção também é dese modo descrita em termos de qualquer membro individual ou subbrupo de membros do grupo de Markush ou outro grupo.

[0091] Foi descrita uma série de exemplos para ajudar a ilustrar a invenção. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se agastar do espírito e do âmnbito da invenção. Por conseguinte, outras modalidades estão dentro do âmbito das reivindicações anexadas à mesma.

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Claims (28)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Dispositivo para detectar a presença ou ausência de coproantígeno de nematelminto Toxocara em uma amostra fecal de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte sólido, em que um ou mais anticorpos específicos para um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara são imobilizados sobre o suporte sólido.
2. 2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais anticorpos específicos para um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara não são específicos para qualquer coproantígeno derivado do grupo consistindo em ancilóstomo, nematódeo do gênero Trichuris, e parasita do coração do cão.
3. 3. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o um ou mais anticorpos são obtidos por imunização com um extrato de nematelminto Toxocara inteiro, um extrato de intestino de nematelminto Toxocara ou um extrato de órgão reprodutivo de nematelminto Toxocara.
4. 4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o nematelminto Toxocara do qual o extrato de nematelminto Toxocara inteiro, o extrato de intestino de nematelminto Toxocara e o extrato de órgão reprodutivo de nematelminto Toxocara são derivados é Toxocara canis.
5. 5. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos são policlonais.
6. 6. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um ou mais de um ou mais anticorpos são marcados.

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7. 7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um dispositivo de ensaio imunossorvente ligado a enzima.
8. 8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de ensaio imunossorvente ligado a enzima é um dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral.
9. 9. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um canino ou um felino.
10. 10. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o dispositivo adicionaimente inclui um ou mais reagentes para a detecção de um ou mais do grupo consistindo em: um ou mais parasitas de verme nãonematelminto, um ou mais parasitas não-verme, um ou mais vírus, e uma ou mais bactérias.
11. 11. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara são derivados de Toxocara canis ou Toxocara cati.
12. 12. Método para detectar a presença ou ausência de coproantígeno de nematelminto Toxocara em uma amostra fecal de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende:

    a. contactar a amostra fecal com um ou mais anticorpos específicos para um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara; e

    b. detectar a presença ou ausência do um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara ou detectar a presença ou ausência de um ou mais complexos de anticorpo/coproantígeno de nematelmintos Toxocara.
13. 13. Método para diagnosticar uma infecção intestinal por

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    3/5 nematelminto Toxocara em um mamífero, o método compreendendo as etapas de:

    a. obter uma amostra fecal do mamífero;

    b. contatar a amostra fecal com um ou mais anticorpos específicos para um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara',

    c. detectar a presença ou ausência de um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara ou detectar a presença ou ausência de um ou mais complexos de anticorpo/coproantígeno de nematelminto Toxocara', e

    d. diagnosticar o mamífero como tendo ou como não tendo a infecção por nematelminto Toxocara com base na detecção da presença ou ausência do um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara ou detecção da presença ou ausência de um ou mais complexos de anticorpo/coproantígenos de nematelminto Toxocara.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos são obtidos por imunização com um extrato de nematelminto Toxocara inteiro, um extrato de intestino de nematelminto Toxocara ou um extrato de órgão reprodutivo de nematelminto Toxocara.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o nematelminto Toxocara do qual o extrato de nematelminto Toxocara inteiro, o extrato de intestino de nematelminto Toxocara e o extrato de órgão reprodutivo de nematelminto Toxocara são derivados é Toxocara canis.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que um ou mais

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    4/5 anticorpos são policlonais.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um canino ou um felino.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência de um ou mais complexos de anticorpo/coproantígeno adicionalmente inclui a etapa de proporcionar um anticorpo secundário que liga ao um ou mais complexos de anticorpo/coproantígeno.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizado pelo fato de que um ou mais do um ou mais anticorpos são marcados.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo secundário é marcado.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais anticorpos são imobilizados sobre um suporte sólido.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido forma parte de um dispositivo de ensaio imunossorvente ligado a enzima.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de ensaio imunossorvente ligado a enzima é um dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 23, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreendendo a etapa de contatar a amostra fecal com um ou mais reagentes para detectar um ou mais do grupo consistindo em: um ou mais parasitas de verme não-nematelminto, um ou mais parasitas nãoverme, um ou mais vírus, e uma ou mais bactérias.

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25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os um ou mais reagentes são um ou mais anticorpos ou um ou mais antígenos reconhecidos por anticorpos específicos para o um ou mais parasitas de verme não-nematelminto, o um ou mais parasitas não-verme, o um ou mais vírus ou a uma ou mais bactérias.
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 25, caracterizado pelo fato de que um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara são derivados de Toxocara canis ou Toxocara cati.
27. 27. Kit para detecção de um ou mais coproantígenos de nematelmintos Toxocara em uma amostra de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende o dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um ou mais reagentes suficientes para a detecção do um ou mais antígenos.
28. 28. Kit de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais reagentes são selecionados entre o grupo consistindo em um ou mais reagentes indicadores, um ou mais compostos de marcação de anticorpo, um ou mais anticorpos, um ou mais reagentes de captura de antígeno, um ou mais inibidores, e um ou mais reagentes de lavagem.

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