BRPI0811198B1 - fosfatase alcalina direcionada a osso, kits e métodos de seu uso - Google Patents

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BRPI0811198-7A
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Philippe Crine
Guy Boileau
Thomas P. Loisel
Isabelle Lemire
Pierre Leonard
Robert Heft
Hal Landy
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Alexion Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

FOSFATASE ALCALINA DIRECIONADA A OSSO, KITS E MÉTODOS DE SEU USO. A presente invenção se refere a uma fosfatase alcalina direcionada a osso, compreendendo um polipeptídeo tendo uma estrutura: Z-sALP-Y-espaçador- X-Wn-V, em que sALP é o domínio extracelular da fosfatase alcalina; em que V é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; X é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácidos; Y é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; Z é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; e Wn é um poliaspartato ou poliglutamato, em que n = 10 a 16. Kits e métodos de seu uso.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados
Esse pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório Americano No. De Série 60/917.589, depositado no dia 11 de maio de 2007. Todos os documentos acima são aqui incorporados nas suas totalidades por referência.
Campo da Invenção
A presente invenção se refere à fosfatase alcalina direcionada a osso, kits e métodos de seu uso.
Antecedentes da invenção
Hipofosfatasia (HPP) é uma forma hereditária rara de raquitismo ou osteomalácia (Whyte, 2001) com uma incidência tão alta quanto 1 por 2.500 nascimentos nos menonitas canadenses (Greenberg, 1993) e de 1 por 100.000 nascimentos na população em geral para a forma mais severa da doença. Formas mais branda são mais prevalentes. Este "erro inato de metabolismo" é causado por mutações de perda de função no gene (ALPL) que codifica a isozima tecido-não-especifica da fosfatase alcalina (TNALP; a.k.a figado/osso/rim tipo ALP) (Weiss et al. 1988; Henthorn et al. 1992a; Henthorn et al. 1992b; Zurutuza et al. 1999; Millan 1995). A marca (hipofosfatasemia) , a qual leva a níveis de sangue e/ou urina elevados de três substratos de fosfocompostos: pirofosfato inorgânico (PPi), fosfoetanolamina (PEA) e piridoxal-5'-fosfato (PLP) (Whyte, 1994). HPP exibe uma faixa notável de severidade variando (mais severa para a mais branda) das formas perinatal, primeira-infância, infância, adulta e odontoipofosfatasia, classificadas historicamente de acordo com a idade no diagnóstico (Whyte, 2001) . Pode haver quase que a completa 10 ausência de mineralização óssea in útero com o parto de criança morta, ou fraturas espontâneas e doenças dentárias ocorrendo primeiramente na vida adulta. Hipofosfatasia perinatal (letal) é expressa in útero e pode causar o parto da criança morta. Alguns neonatos podem sobreviver por 15 vários dias, mas sofrem de comprometimento respiratório aumentado devido à doença hipoplástica e raquítica do peito. Em HPP de primeira-infância, diagnosticada antes de 6 meses de idade, o desenvolvimento pós-natal parece normal até o inicio da fraca alimentação, ganho de peso inadequado 20 e aparecimento de raquitismos. As características radiológicas são características e mostram mineralização do esqueleto prejudicada, algumas vezes com desmineralização do esqueleto progressiva levando às fraturas da costela e deformações do peito. A hipofosfatasia na infância também tem uma expressão clínica altamente variável. A perda prematura de dentes-de-leite resulta da aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário que conecta a raiz dentária com o ligamento periodontal. Raquitismos causam estatura baixa e as deformidades esqueléticas podem incluir pernas curvadas, aumento dos pulsos, joelhos e tornozelos como resultado da metáfise dilatada. HPP adulta geralmente se apresenta durante a idade mediana, embora frequentemente exista histórico de raquitismos e/ou perda precoce dos dentes seguido por boa saúde durante a adolescência e a vida adulta jovem. Fraturas por estresse metatársicas recorrentes são comuns e a deposição de pirofosfato de cálcio diidratado causa ataques de artrite e artropatia por pirofosfato. Odontoipofosfatasia é diagnosticada quanto a única anormalidade clínica é a doença dentária e estudos radiológicos e mesmo biópsias ósseas não revelam sinais de raquitismos ou osteomalacia.
As formas clínicas severas de hipofosfatasia são geralmente herdadas como características recessivas autossômicas com os pais de tais pacientes apresentando níveis subnormals de atividade AP no soro (White, 2001). Para as formas mais brandas de hipofosfatasia, isto é, adulta e odontoipofosfatasia, um padrão dominante autossômico de hereditariedade também foi documentado (Whyte, 2001).
No esqueleto saudável, TNALP é uma ectoenzima presente na superfície da membrana plasmática dos osteoblastos e condrócitos, incluindo nas membranas de suas vesículas da matriz projetada (MVs) (All et al. 1970; Bernard 1978) onde a enzima é particularmente enriquecida (Morris et al., 1992). A deposição da hidroxiapatita durante a mineralização óssea geralmente se inicia no lúmen dessas MVs (Anderson et al. 2005a). A microscopia eletrônica demonstrou que MVs deficientes de TNALP de pacientes HPP severamente afetados e camundongos Akp2 (um modelo de camundongo TNALP nulo, ver abaixo) contêm cristais de hidroxiapatita, mas que a propagação de cristais extravesiculares parece retardada (Anderson 1997; Anderson 2004). Este defeito é atribuído ao acúmulo extracelular de PPi, um potente inibidor da calcificação (Myer 1984) devido à deficiência da atividade TNALP (Hessle et al. 2002; Harmey et al. 2004; Harmey et al. 2006.).
Quando PPi está presente em concentrações próximas da fisiológica, na faixa de 0,01 a 0,1 mM, PPi tem a capacidade de estimular a mineralização em fêmures de galinhas órgão-cultivados (Anderson & Reynolds, 1973) e também por MVs de rato isolados (Anderson et al. 2005b), enquanto em concentrações acima de 1 mM, o PPi inibe a formação do mineral fosfato de cálcio pelo revestimento de cristais de hidroxiapatita, prevenindo dessa forma o crescimento de cristal mineral e de auto-nucleação proliferativa. Deste modo, PPi tem um duplo papel fisiológico; ele pode funcionar como um promotor da mineralização em baixas concentrações, mas também como um inibidor da mineralização em conentrações mais altas. Foi demonstrado que TNALP hidrolisa o inibidor da mineralização PPi para facilitar o crescimento e a precipitação mineral (Rezende et al. 1998). Estudos recentes usando os camundongos Akp2'/_ indicaram que o papel primário da TNALP in vivo é restringir o tamanho do pool de PPi extracelular para permitir uma adequada mineralização do esqueleto (Hessle et al. 2002/ Harmey et al. 2004).
A severidade da hipofosfatasia é variável e modulada pela natureza da mutação TNALP. Foi descoberto que todas as mutações com sentido errado na vizinhança do sitio ativo da enzima, interface do homodimero, dominio da coroa, braço aminoterminal e sítio de ligação ao cálcio afetam a atividade catalítica de TNALP (Zurutuza et al. 1999). Além disso, outras mutações com sentido errado, sem sentido, de mudança de estrutura e de união de sítio foram demonstradas como levando a proteínas mutantes aberrantes ou defeitos de tráfego intracelular que levam à atividade subnormal na superfície celular. A variedade de mutações e o fato de que a heterozigocidade do composto ser uma ocorrência comum em hipofosfatasia também explica a variável expressividade e a incompleta penetrância geralmente observada nessa doença (Whyt, 2001) .
O progresso na forma humana da doença se beneficia muito da existência dos camundongos nulos TNALP (Akp2"/_) como um modelo animal. Essas fenocópias de camundongos Akp2-/“ com HPP de bebê são notoriamente bons, uma vez que eles nascem com um esqueleto mineralizado normal, mas desenvolvem raquitismo aparente em radiografia por volta de 6 dias de idade, e morrem ente os dias 12 e 16, sofrendo de hipomineralização do esqueleto severa e episódios de apnéia e ataques epiléticos atribuíveis aos distúrbios no metabolismo de PP (vitamina Bg) (Waymire et al. 1995; Narisawa et al. 1997; Fedde et al. 1999; Narisawa et al. 2001) .
Foi demonstrado que algumas mutações nos sítios ativos de TNALP afetam a capacidade da enzima de metabolizar diferentemente PPi ou PLP (Di Mauro et al. 2002). Tanto PLP quanto PPi são substratos naturais confirmados de TNALP e anormalidades no metabolismo de PLP explicam os ataques epiléticos observados em camundongos Akp2-/* (Waymire et al. 1995; Narisawa et al. 2001),enquanto que anormalidades no metabolismo de PPi explicam o fenótipo esquelético nesse modelo de camundongo de hipofosfatasia (Hessle et al. 2002; Anderson et al. 2004; Harmey et al. 2004; Harmey et al. 2006; Anderson et al. 2005a). Não há terapia médica estabelecida para HPP.
Relatórios de casos de terapia de substituição enzimática (ERT) usando infusões intravenosas (i.v.) de plasma rico em TNALP de pacientes com doença óssea de Paget e ALP placentário purificado descreveram falhas para recuperar 10 crianças afetadas nos primeiros anos de vida (Whyte et al. 1982; Whyte et al. 1984). Em outro estudo similar, Weninger et al. (Weninger et al. 1989) experimentou ERT para um menino prematuro severamente afetado com hipofosfatasia por infusões de TNALP do figado humano purificada. 0 tratamento 15 (1,2 UI/Kg/min) iniciou na idade de três semanas e foi repetido em intervalos semanais até a idade de 10 semanas, quando a criança morreu. As amostras de TNALP foram diluidas com 10 mL de salina fisiológica e infundidas durante 30 min através de cateter arterial umbilical.
Nenhum efeito colateral alérgico ou tóxico foi observado. A atividade de TNALP do soro aumentou de 3 UI/L antes do tratamento até um nivel máximo de 195 OI/L com tempo de meia-vida entre 37 e 62 horas. Estudos radiográficos sequenciais não apresentaram melhorias de mineralização óssea (Weninger et al. 1989).
Parece que a atividade da ALP não deve ser aumentada na circulação, mas no próprio esqueleto. Essa hipótese é sustentada por respostas aparentemente benéficas de duas garotas com HPP na primeira infância após o transplante de células da medula onde células contendo TNALP foram introduzidas pelo esqueleto (Whyte et al. 2003). Deste modo, parece que há uma necessidade de fornecer TNALP ativo ao esqueleto desses pacientes. Relatórios recentes indicaram que sequências de poliaspartato conferem propriedades de retorno ósseo ao TNALP recombinante (WO 2005/103263 para Crine et al.; Nishioka et al. 2006).
Um relatório recente mostrou que a forma modificada de TNALP R450C (embora Nasu et al. se refiram a uma mutação R433C, sua numeração se aplica à proteina madura e não àquela compreendendo o peptideo de sinal) produz uma proteina com uma estrutura dimérica unida por uma ponte dissulfeto entre os residuos de cisteina na posição 450 de cada subunidade, a qual inibiu fortemente a sua atividade de fosfatase alcalina. Nasu et al. Concluiram que a perda de função resulta da ponte dissulfeto intercadeia e é a base molecular para a hipofosfatasia letal associada com R450C (Nasu et al. 2006).
A presente descrição se refere a uma variedade de documentos, o conteúdo dos quais sendo aqui incorporado por referência nas suas totalidades.
Sumário da Invenção
Dadas as Limitações atuais no gerenciamento clinico e tratamento de pacientes com HPP, um tratamento alternativo e eficiente foi necessário. Concordantemente, a presente invenção fornece uma terapia de substituição enzimática eficiente para o tratamento de HPP.
Para o conhecimento do depositante, e em oposição aos esforços tanto na terapia de substituição enzimática ou em camundongos nulo TNALP ou em crianças HPP nos quais TNALP ou outras isozimas de ALP foram intravenosamente distribuídas, a presente invenção marca a primeira vez onde uma resolução quase completa das alterações radiográficas e bioquímicas foi documentada para ocorrer somente com a substituição enzimática. Salp direcionada a osso
A composição direcionada a osso da presente invenção compreende uma proteína de fusão incluindo na ordem do lado amino para o lado carbóxi um sALP, um espaçador e um peptideo negativamente carregado direcionado a osso. ALPs Existem quatro isozimas conhecidas de ALP, a saber, a fosfatase alcalina não-específica descrita adicionalmente abaixo, fosfatase alcalina placentária (PALP) (por exemplo, [NP_112603], [NP_001623]) , a fosfatase alcalina de linhagem germinativa (GCALP) (por exemplo, [P10696]) e a fosfatase alcalina intestinal (por exemplo, [NP_001622]). Essas enzimas possuem uma estrutura tridimensional muito similar. Cada um dos seus sitios catalíticos contém quatro domínios de ligação de metais para os ions metálicos necessário para a atividade enzimática, incluindo dois Zn e um Mg. Essas enzimas catalisam a hidrólise dos monoésteres do ácido fosfórico e também catalisam uma reação de transfosforilação dos monoésteres do ácido fosfórico e também podem catalisar uma reação de transfosforilação na presença de altas concentrações de aceptores de fosfato. Foi particularmente demonstrado que PALP é fisiologicamente ativa para fosfoetanolamina (PEA), pirofosfato inorgânico (PPi) e piridoxal 5'-fosfato (PLP) , todos os três sendo substratos naturais conhecidos para TNALP (Whyte, 1995). Um alinhamento entre essas isozimas é apresentado na Figura 30. TNALP
Conforme indicado acima, TNALP é uma proteína ligada à membrana ancorada por um glicolipídeo ao seu C-terminal (Swiss-Prot, P05186). Essa âncora glicolipídica (GPI) é adicionada pós-traducionaimente depois da remoção de uma extremidade C-terminal hidrofóbica, a qual serve tanto como uma âncora de membrana temporária quanto como um sinal para a adição do GP1. Portanto, a TNALP solúvel humana usada em todos os exemplos abaixo é compreendida de uma TNALP, em que o primeiro aminoácido da sequência C-terminal hidrofóbica, a saber, alanina, é substituído por um códon de parada. A TNALP solúvel (aqui chamada de sTNALP) formada dessa forma continha todos os aminoácidos da forma ancorada natural de TNALP necessários para a formação do sitio catalítico, porém sem a âncora de membrana GPI. TNALP conhecida inclui TNALP humana [NP- 000469, AAI10910, AAH90861 , AAH66116, AAH21289, AAI26166]; TNALP de resus [XP-001109717] ; TNALP de rato [NP_037191]; TNALP de cachorro [AAF64516]; TNALP de porco [AAN64273], camundongo [NP_031457], boi [NP_789828, NPJ776412, AAM 8209, AAC33858] e gato [NP_001036028].
A composição direcionada para osso da presente invenção engloba sequências que satisfazem uma sequência de consenso derivada do domínio ALP extracelular das isozimas ALP humanas e de TNALPs funcionais conhecidos (humano, de camundongo, de rato, bovino, de gato e cachorro). Conforme aqui utilizada, a terminologia "domínio extracelular" é tencionada a se referir a qualquer porção extracelular funcional da proteína natural (isto é, sem o peptídeo sinal). Foi demonstrado que os aminoácidos originais que retém sTNALP recombinante 1 a 501 (18 a 501 quando secretados) (ver Oda et al., J. Biochem 126: 694-699, 1999), os aminoácidos 1 a 504 (18 a 504 quando secretados) (Patente Americana No. 6.905.689 de Bernd et al.) e os aminoácidos 1 a 505 (18 a 505 quando secretados) (US 2007/0081984 de Tomatsu et al) são enzimaticamente ativos. Exemplos aqui apresentados também mostram que aminoácidos 1 a 502 que retém sTNALP recombinante (18 a 502 quando secretados) (Figura 3) da TNALP original são enzimaticamente ativos. Isto indica que os residues de aminoácidos podem ser removidos da extremidade C-terminal da proteina natural sem afetar a sua atividade enzimática. Tabela 1 abaixo fornece uma lista de 194 mutações conhecidas por causar HPP. Em modalidades especificas dos polipeptídeos direcionados ao osso da presente invenção, a sequência ALP não inclui qualquer uma dessas mutações.
Portanto, em sALPs da presente invenção, usando a numeração de uma sequência de consenso derivada de um alinhamento de várias TNALPs e de isozimas ALP humanas, o aminoácido na posição 22 não é um residue de fenilalanina; o aminoácido na posição 33 (posição 11 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residue de cisteina; o peptideo de sinal) não é um resíduo de valina; o aminoácido na posição 42 (posição 20 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de prolina; o aminoácido na posição 45 (posição 23 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 56 (posição 34 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 67 (posição 45 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina, de isoleucina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 68 (posição 46 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 73 (posição 51 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 76 (posição 54 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de cisteína, serina, prolina ou histidina; o resíduo de aminoácido na posição 77 (posição 55 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 80 (posição 58 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 81 (posição 59 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de asparagina; o resíduo de aminoácido na posição 105 (posição 83 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 113 (posição 89 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 116 (posição 94 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 117 (posição 95 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 119 (posição 97 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 121 (posição 99 na sequência sem peptídeo de sinal) não é resíduo de serina ou de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 125 (posição 103 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 128 (posição 106 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 133 (posição 111 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 134 (posição 112 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 137 (posição 115 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 139 (posição 117 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de histidina ou de asparagina; o resíduo de aminoácido na posição 141 (posição 119 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residue de histidina; o residue de aminoácido na posição 153 (posição 131 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de alanina ou um residuo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 167 (posição 145 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de serina ou de valina; o residuo de aminoácido na posição 172 (posição 150 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o residuo de aminoácido na posição 175 (posição 153 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 176 (posição 154 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de tirosina ou de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 181 (posição 159 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 182 (posição 160 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 184 (posição 162 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 186 (posição 164 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 189 (posição 167 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de triptofano; o resíduo de aminoácido na posição 194 (posição 172 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 196 (posição 174 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina ou de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 197 (posição 175 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 198 (posição 176 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 206 (posição 184 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de tirosina; o resíduo de aminoácido na posição 208 (posição 186 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 207 (posição 190 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 216 (posição 194 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 217 (posição 195 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de fenilalanina; o resíduo de aminoácido na posição 223 (posição 201 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 225 (posição 203 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina ou de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 226 (posição 204 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 228 (posição 206 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de triptofano ou de glutamina; o resíduo de aminoácido na posição 229 (posição 207 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 231 (posição 209 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 240 (posição 218 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 251 (posição 229 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 254 (posição 232 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 269 (posição 247 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 277 (posição 255 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo e cisteína, de leucina ou de histidina; o resíduo de aminoácido na posição 280 (posição 258 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 295 (posição 273 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de fenilalanina; o resíduo de aminoácido na posição 297 (posição 275 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição (posição 276 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 300 (posição 278 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de tirosina ou de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 301 (posição 279 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina, de treonina ou de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 303 (posição 281 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 304 (posição 282 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 305 (posição 283 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 312 (posição 290 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 313 (posição 291 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina ou de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 317 (posição 295 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 332 (posição 310 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 333 (posição 311 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de cisteína, glicina ou de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 334 (posição leucina; o residue de aminoácido na posição 340 (posição 318 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 345 (posição 323 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina ou de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 354 (posição 332 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 360 (posição 338 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 361 (posição 339 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina ou de isoleucina; o resíduo de aminoácido na posição 377 (posição 355 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 380 (posição 358 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 383 (posição 361 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 384 (posição 362 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 387 (posição 365 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 388 (posição 366 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de 373 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residue de leucina; o residue de aminoácido na posição 397 (posição 375 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de cistina ou de histidina; o residuo de aminoácido na posição 398 (posição 376 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de alanina; o residuo de aminoácido na posição 401 (posição 379 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina; o residuo de aminoácido na posição 405 (posição 383 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de serina ou de valina; o residuo de aminoácido na posição 406 (posição 384 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 412 (posição 390 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de glicina; o residuo de aminoácido na posição 416 (posição 394 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 417 (posição 395 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de alanina; o residuo de aminoácido na posição 420 (posição 398 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de metionina; o residuo de aminoácido na posição 423 (posição 401 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de serina; o residuo de aminoácido na posição 426 (posição 404 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de serina; o residuo de aminoácido na posição 429 (posição 407 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 430 (posição 408 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 432 (posição 410 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de cisteína ou de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 434 (posição 412 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 435 (posição 413 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 442 (posição 420 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de histidina; o resíduo de aminoácido na posição 451 (posição 429 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 456 (posição 434 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de histidina ou de cisteína; o resíduo de aminoácido na posição 458 (posição 436 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 460 (posição 438 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 461 (posição 439 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina ou de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 462 (posição 440 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de triptofano ou de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 465 (posição 443 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de metionina ou de leucina; o residuo de aminoácido na posição 472 (posição 450 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 473 (posição 451 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 474 (posição 452 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 479 (posição 457 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o residuo de aminoácido na posição 482 (posição 460 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina ou de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 484 (posição 462 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 495 (posição 473 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 496 (posição 474 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de fenilalanina; e o resíduo de aminoácido na posição 497 (posição 475 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina.
Também mais especificamente, quando sTNALP é usado nas sALPs direcionadas para osso da presente invenção, usando a numeração da sequência TNALP humana, o aminoácido na posição 17 não é um residuo de fenilalanina; o aminoácido na posição 28 (posição 11 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de cisteína; o aminoácido na posição 33 (posição 16 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o aminoácido na posição 37 (posição 20 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de prolina; o aminoácido na posição 40 (posição 23 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 51 (posição 34 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de serina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 62 (posição 45 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina, isoleucina ou valina; o resíduo de aminoácido na posição 63 (posição 46 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 68 (posição 51 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 71 (posição 54 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de cisteína, serina, prolina ou histidina; o resíduo de aminoácido na posição 72 (posição 55 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 75 (posição 58 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 76 (posição 59 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de asparagina; o resíduo de aminoácido na posição 100 (posição 83 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 108 (posição 89 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 111 (posição 94 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 112 (posição 95 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 114 (posição 97 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 116 (posição 99 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resido de serina ou de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 120 (posição 103 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 123 (posição 106 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 128 (posição 111 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 129 (posição 112 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 132 (posição 115 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residue de treonina ou de valina; o residuo de aminoácido na posição 134 (posição 117 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de histidina ou de asparagina; o residuo de aminoácido na posição 136 (posição 119 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de histidina; o residuo de aminoácido na posição 148 (posição 131 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de alanina ou de isoleucina; o residuo de aminoácido na posição 162 (posição 145 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de serina ou de valina; o residuo de aminoácido na posição 167 (posição 150 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de metionina; o residuo de aminoácido na posição 170 (posição 153 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de aspartato; o residuo de aminoácido na posição 171 (posição 154 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de tirosina ou de arginina; o residuo de aminoácido na posição 176 (posição 159 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina; o residuo de aminoácido na posição 177 (posição 160 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina; o residuo de aminoácido na posição 179 (posição 162 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina; o residuo de aminoácido na posição 181 (posição 164 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residue de leucina; o residuo de aminoácido na posição 184 (posição 167 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de triptofano; o resíduo de aminoácido na posição 189 (posição 172 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 191 (posição 174 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina ou de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 192 (posição 175 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de treonina; o residuo de aminoácido na posição 193 (posição 176 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 201 (posição 184 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de tirosina; o resíduo de aminoácido na posição 203 (posição 186 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 207 (posição 190 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 211 (posição 194 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 212 (posição 195 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de fenilalanina; o resíduo de aminoácido na sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 220 (posição 203 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de valina ou de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 221 (posição 204 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 223 (posição 206 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de triptofano ou de glutamina; o resíduo de aminoácido na posição 224 (posição 207 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de glutamato; o resíduo de aminoácido na posição 226 (posição 209 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 235 (posição 218 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 246 (posição 229 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 249(posição 232 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 264 (posição 247 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 272 (posição 255 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de cisteína, leucina ou histidina; o resíduo de aminoácido na posição 275 (posição 258 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 289 (posição 272 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de fenilalanina; o resíduo de aminoácido na posição 291 (posição 274 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 292 (posição 27 5 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 294 (posição 277 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de tirosina ou de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 295 (posição 278 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de valina, treonina ou de isoleucina; o resíduo de aminoácido na posição 297 (posição 280 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 298 (posição 281 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 299 (posição 282 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 306 (posição 289 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de valina; o residuo de aminoácido na posição 307 (posição 290 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina ou de leucina; o residuo de aminoácido na posição 311 (posição 294 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 326 (posição 309 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de arginina; o residuo de aminoácido na posição 327 (posição 310 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de cisteina, glicina ou leucina; o residuo de aminoácido na posição 328 (posição 311 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 334 (posição 317 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de aspartato; o residuo de aminoácido na posição 339 (posição 322 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de arginina ou de glutamato; o residuo de aminoácido na posição 348 (posição 331 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina; o residuo de aminoácido na posição 354 (posição 337 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de aspartato; o residuo de aminoácido na posição 355 (posição 338 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de treonina ou de isoleucina; o residuo de aminoácido na posição 371 (posição 354 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de leucina; o residuo de aminoácido na posição 374 (posição 357 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de metionina; o residuo de aminoácido na posição 377 (posição 360 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de peptídeo de sinal) não é um resíduo de valina; o resíduo de aminoácido na posição 381 (posição 364 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 382 (posição 365 na sequência sem 5 peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 389 (posição 372 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 391 (posição 374 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de cisteína ou de 10 histidina; o resíduo de aminoácido na posição 392 (posição 375 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 395 (posição 378 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 399 (posição 15 382 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 400 (posição 383 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 406 (posição 389 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um 20 resíduo de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 410 (posição 393 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 411 (posição 394 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de alanina; o residuo de aminoácido na posição 414 (posição 397 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 417 (posição 400 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 420 (posição 403 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 423 (posição 406 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de alanina; o resíduo de aminoácido na posição 424 (posição 407 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de metionina; o resíduo de aminoácido na posição 426 (posição 409 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um cisteína ou de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 428 (posição 411 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 429 (posição 412 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 436 (posição 419 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de histidina; o resíduo de aminoácido na posição 445 (posição 428 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de prolina; o resíduo de aminoácido na posição 450 (posição 433 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de histidina ou de cisteína; o resíduo de aminoácido na posição 452 (posição 435 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de lisina; o resíduo de aminoácido na posição 454 (posição 437 na sequência sem peptideo de sinal) não é um residuo de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 455 (posição 438 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina ou de aspartato; o resíduo de aminoácido na posição 456 (posição 439 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de triptofano ou de arginina; o resíduo de aminoácido na posição 459 (posição 442 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de metionina ou de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 466 (posição 449 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 467 (posição 450 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 468 (posição 451 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de treonina; o resíduo de aminoácido na posição 473 (posição 456 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 476 (posição 459 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de lisina ou de glicina; o resíduo de aminoácido na posição 478 (posição 461 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de leucina; o resíduo de aminoácido na posição 489 (posição 472 na sequência sem peptideo de sinal) não é um resíduo de serina; o resíduo de aminoácido na posição 490 (posição 473 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um residuo de fenilalanina; e o residuo de aminoácido na posição 491 (posição 474 na sequência sem peptídeo de sinal) não é um resíduo de arginina. Em outras modalidades específicas, um ou mais Xs são definidos como sendo qualquer um dos aminoácidos encontrados naquela posição nas sequências de alinhamento ou um resíduo que constitui uma substituição conservada ou semi-conservada de qualquer um desses aminoácidos. Em outras modalidades específicas, Xs são definidos como sendo qualquer um dos aminoácidos encontrados naquela posição nas sequências do alinhamento. Por exemplo, o resíduo de aminoácido na posição 51 (posição 34 na sequência sem peptídeo de sinal) é um resíduo de alanina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 177 (posição 160 na sequência sem peptídeo de sinal) é um resíduo de alanina ou de serina; o resíduo de aminoácido na posição 212 (posição 195 na sequência sem peptídeo de sinal) é um resíduo de isoleucina ou de valina; o resíduo de aminoácido na posição 291 (posição 274 na sequência sem peptídeo de sinal) é um resíduo de ácido glutâmico ou de ácido aspártico; e o resíduo de aminoácido na posição 374 (posição 357 na sequência sem peptídeo de sinal) é um resíduo de valina ou de isoleucina.
Em modalidades específicas, o fragmento sALP na proteína de fusão direcionada ao osso da presente invenção consiste de qualquer um dos fragmentos de uma sequência de consenso derivada de um alinhamento das isozimas ALP humanas e TNALPs de várias espécies de mamiferos 5 correspondendo aos resíduos de aminoácidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501 , 18-502, 18-503, 18-504, ou 18 a 505 da TNALP humana. Esses fragmentos de consenso são os resíduos de aminoácidos 23 a 508, 23 a 509, 23 a 510, 23 a 511, 23 a 512, 23 a 513, 23 a 514 e 23 a 515 da SEQ ID NO: 15, respectivamente. Nesses fragmentos de consenso, X é qualquer aminoácido, exceto um aminoácido correspondendo a uma mutação patológica naquela posição da TNALP humana conforme reportado na Tabela 1. Em outras modalidades especificas esses fragmentos de consenso são resíduos de aminoácidos 23 a 508, 23 a 509, 23 a 510, 23 a 511, 23 a 512, 23 a 513, 23 a 514 e 23 a 515 da SEQ ID NO: 18, respectivamente. Nesses fragmentos de consenso, X é qualquer aminoácido encontrado naquela posição no ALP de qualquer uma das espécies e isozimas de ALP humana do alinhamento do qual o consenso é derivado, porém não é um aminoácido correspondendo a uma mutação patológica naquela posição da TNALP humana conforme reportado na Tabela 1 (ver Figura 30) .
Em outras modalidades específicas, o fragmento sALP na proteína de fusão direcionada ao osso da presente invenção consiste de qualquer um dos fragmentos de uma sequência de consenso derivada de um alinhamento de TNALPs a partir de várias espécies de mamíferos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501 , 18-502, 18503, 18-504 e 18 a 505 da TNALP humana. Esses fragmentos de consenso são resíduos de aminoácidos 18-498, 18-499, 18500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, e 18 a 505 da SEQ ID NO: 16, respectivamente. Nesses fragmentos de consenso, X é qualquer aminoácido, exceto um aminoácido correspondendo a uma mutação patológica naquela posição da TNALP humana conforme reportado na Tabela 1. Em outras modalidades específicas, esses fragmentos de consenso são resíduos de aminoácidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, e 18 a 505 da SEQ ID NO: 19, respectivamente. Nesses fragmentos de consenso, X é qualquer aminoácido encontrado naquela posição em TNALP de qualquer uma das espécies de alinhamento da qual o consenso é derivado, porém, não é um aminoácido correspondendo a uma mutação patológica naquela posição da TNALP humana conforme reportado na Tabela 1 (ver Figura 31). Tabela 1: Mutações patológicas em TNALP humana
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Espaçador
Sem se limitar a esta teoria, acredita-se que o fragmento Fc usado na proteína de fusão Salp direcionada ao osso apresentado nos Exemplos abaixo atue como um 5 espaçador, o qual permite que a proteina seja mais eficientemente dobrada, uma vez que a expressão de sTNALP- Fc-DlO foi maior do que aquela do sTNALP-DlO (ver o Exemplo 2 abaixo). Uma explicação possível é que a introdução do fragmento Fc alivia as forças repulsivas causadas pela 10 presença das cargas altamente negativas da sequência D10 adicionada ao C-terminal da sequência sALP testada.
Espaçadores úteis para a presente invenção incluem polipeptídeos compreendendo um Fc, e polipeptideos hidrofílicos e flexíveis capazes de aliviar as forças repulsivas causadas pela presença da sequência D10 altamente negativamente carregada no C-terminal da sequência sALP. Na modalidade especifica, o espaçador alivia o impedimento estéreo evitando que dois domínios sALP de dois monômeros sALP interajam entre si para constituir a entidade cataliticamente ativa minima. Fragmentos da região cristalizável do fragmento (Fc)
Fragmentos Fc úteis para a presente invenção incluem fragmentos FC da IgG que compreendem a dobradiça, e os domínios CH2 E CH3. Por exemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG- 4 podem ser usadas.
Peptideo carregado neqativamente
O peptideo carregado negativamente de acordo com a presente invenção pode ser um poliaspartato ou um poliglutamato selecionado do grupo consistindo de DIO a D16 ou E10 a E16.
Em modalidades especificas, as proteínas de fusão sALP direcionadas a osso da presente invenção são associadas de modo a formar dlmeros ou tetrâmeros.
Sem se limitar a esta teoria particular, nas modalidades especificas da invenção usando um polipeptideo compreendendo um Fc como um espaçador, os dimeros são presumivelmente constituídos de dois monômeros sALP direcionados ao osso ligados covalentemente pelas duas ligações dissulfeto localizadas nas regiões de dobradiça dos dois fragmentos Fc. Nesta configuração dimérica, o impedimento estéreo imposto pela formação das ligações dissulfeto intercadeia estão presumivelmente evitando a associação dos dominios sALP para se associar na entidade cataliticamente ativa minima dimérica presente em células normais.
Sem estar limitado a esta teoria particular, acredita- se que nesta estrutura tetramérica, a associação das proteinas de fusão poderia envolver um dominio sALP de um dimero e outro de outro dimero. 0 impedimento estéreo evitando presumivelmente que dois dominios Salp do mesmo dimero Fc-unido interajam entre si para constituir a entidade cataliticamente ativa minima poderia ser eventualmente aliviado pela inserção de um espaçador mais longo do que o Fc descrito nos Exemplos aqui apresentados entre o fragmento sALP e o fragmento de poliaspartato ou de poliglutamato.
O sALP direcionado ao osso pode ainda compreender opcionalmente um ou mais aminoácidos adicionais 1) à jusante do poliaspartato ou do poliglutamato; e/ou 2) entre o poliaspartato e o fragmento Fc; e/ou 3) entre o espaçador, tal como o fragmento Fc e o fragmento sALP. Este é o caso por exemplo, quando a estratégia de clonagem usada para produzir o conjugado de direcionado ao osso introduzindo aminoácidos exógenos nesses locais. Entretanto, os aminoácidos exógenos devem ser selecionados de modo a não fornecer um sinal de ancoramento GPI 5 adicional. A probabilidade de uma sequência projetada ser clivada pela transamidase da célula hospedeira pode ser previsto conforme descrito por Ikezawa (Ikezawa, 2002).
A presente invenção também engloba a proteína de fusão como pós-traducionalmente modificada, tal como pela 10 glicosilação incluindo aquelas expressamente mencionadas aqui, acetilação, amidação, bloqueio, formilação, hidroxilação do ácido gama-carboxiglutâmico, metilação, fosforilação, ácido pirrolidona carboxilico e sulfatação.
O termo "proteína recombinante" é aqui utilizado para se referir a uma proteína codificada por um ácido nucleico geneticamente manipulado inserido em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. 0 ácido nucleico é geralmente colocado em um vetor, tal como um plasmídeo ou vírus, conforme apropriado para a célula hospedeira. Embora 20 células de ovário do hâmster chinês (CHO) tenham sido usadas como hospedeiro para expressar os conjugados da presente invenção nos Exemplos aqui apresentados, uma pessoa normalmente versada na técnica irá entender que uma variedade de outros hospedeiros pode ser usada para produzir proteínas recombinantes de acordo com os métodos que são rotineiros na técnica. Métodos representativos são revelados em Maniatis, et al. Cold Springs Harbor Laboratory (1989). "Recombinant cleavable protein", conforme aqui utilizados tencionam a se referir a uma proteína recombinante que pode ser clivada por uma enzima do hospedeiro de modo a produzir uma proteína secretada/solúvel. Sem se limitar às células HEK293, PerCô, células de rim de hâmster bebê também podem ser usadas.
Conforme aqui utilizado, a terminologia "condições adequadas para efetuar a expressão do polipeptídeo" é tencionada a se referir a qualquer meio de cultura que irá permitir a produção da proteína de fusão da presente invenção. Sem ficar limitado dessa forma, ela inclui meio preparado com um tampão, bicarbonato e/ou HEPES, ions tipo cloreto, fosfato, cálcio, sódio potássio, magnésio, ferro, fontes de carbono tipo açúcar simples, aminoácidos, potencialmente lipídeos, nucleotídeos, vitaminas e fatores de crescimento tipo insulina; meios comercialmente disponíveis regulares como alfa-MEM, DMEM, Ham's-F12 e IMDM suplementado com L-glutamina 2-4 mM e soro bovino fetal 5%; meio sem proteína animal comercialmente disponível regular como Hyclone™ SFM4CHO, Sigma CHO DHFR-, Cambrex POWER™ CHO CD suplementado com L-glutamina 2 desejavelmente preparados sem timidina, hipoxantina e L- glicina para manter a pressão seletiva permitindo a expressão estável do produto de proteína estável.
Sem estar limitado, as células hospedeiras úteis para expressar a fusão da presente invenção incluem célula L, células C127, células 3T3, células CHO, células BHK. células COS-7 ou células do ovário do hâmster chinês (CHO). Células CHO particulares de interesse para expressar a proteína de fusão da presente invenção incluem CHO-DG44 e CHO/dhfr', também referido como CHO duk'. Essa última linhagem celular é disponível na American Type Culture Collection (ATCC número CRL-9096).
O termo "tecido ósseo" é aqui utilizado para se referir ao tecido sintetizado por osteoblastos composto de uma matriz orgânica contendo na maior parte colágeno e mineralizada pela deposição de cristais de hidroxiapatita.
AS proteínas de fusão compreendidas nos conjugados de distribuição óssea da presente invenção são úteis para o tratamento terapêutico de condições defeituosas ósseas através do fornecimento de uma quantidade eficaz da proteína de fusão ao osso. As proteínas de fusão são fornecidas na forma de composições farmacêuticas em quaisquer veículos farmaceuticamente aceitáveis padrões, e são administradas por qualquer procedimento padrão, por exemplo, por injeção intravenosa.
Conforme aqui utilizada, a terminologia "fenótipo HPP" é tencionada a se referir a qualquer um dos raquitismos (defeitos na cartilagem da placa de crescimento), 5 osteomalácia, niveis de pirofosfato inorgânico (PPi), fosfoetanolamina (PEA) ou piridoxal-5'-fosfato (PLP) no sangue e/ou urina elevados, ataques, dores ósseas, deposição de cristais diidratados de pirofosfato de cálcio (CPPD) nas juntas, levando a condrocalcinose e morte prematura. Sem estar limitado desta forma, um fenótipo HPP pode ser documentado pelo retardo no crescimento com um decréscimo do comprimento ósseo longo (tal como fêmur, tibia, úmero, radio, ulna), um decréscimo na densidade média óssea total e um decréscimo da mineralização óssea nos ossos tal como fêmur, tibia, costelas e metatarso, e falange, um decréscimo na mineralização dos dentes, perda prematura dos dentes-de-leite (por exemplo, aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário). Sem estar imitado dessa forma, a correção ou prevenção do defeito da mineralização óssea pode ser observada por um ou mais dentre os seguintes: um aumento no comprimento dos ossos longos, um aumento da mineralização nos ossos e/ou dentes, correção do arqueamento das pernas, redução da dor óssea e redução da deposição de cristais CPPD nas juntas.
Conforme aqui utilizada, a terminologia "corrigir" na expressão "corrigir um fenótipo de hipofosfatasia" é tencionada a se referir a qualquer redução parcial ou completa de um fenótipo de HPP pré-existente. Semelhantemente, a terminologia "prevenir" na expressão "prevenir um fenótipo de hipofosfatasia" é tencionada a se referir a qualquer retardo ou lentificação no desenvolvimento de um fenótipo HPP ou qualquer efeito parcial ou completa de evitar o desenvolvimento de um fenótipo HPP.
Conforme aqui utilizado, o termo "individuo" é tencionado a se referir a qualquer mamifero incluindo humano, camundongo, rato, cachorro, gato, porco, vaca, macaco, cavalo, etc. Em uma modalidade particular, ele se refere a um humano.
Conforme aqui utilizado, o termo "individuo necessitado do mesmo" em um método da administração de um composto da presente invenção é tencionado a se referir a um individuo que poderia se beneficiar de receber um composto da presente invenção. Em modalidades especificas, ele se refere a um individuo que já tem pelo menos um fenótipo HPP ou a um individuo propenso a desenvolver pelo menos um fenótipo HPP ou pelo menos um fenótipo HPP a mais.
Em outra modalidade, ele ainda se refere a um individuo que tem aplasia, hipoplasia ou displasia de cemento dentário ou a um indivíduo com probabilidade de desenvolver aplasia, hipoplasia ou displasia de cemento dentário.
Conforme aqui utilizado, "um indivíduo com probabilidade de desenvolver pelo menos um fenótipo HPP" é um indivíduo com pelo menos uma mutação de perda de função no gene (ALPL).
Conforme aqui utilizado, "um indivíduo com probabilidade de desenvolver aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário" é um indivíduo com HPP ou uma doença periodontal devido a uma infecção bacteriana. Doença periodontal devido a uma infecção bacteriana pode4 induzir alteração do cemento, o que pode levar à esfoliação dos dentes.
Rota de Administração sALPs direcionadas a osso da presente invenção podem ser administradas por vias tais como oralmente, nasalmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, sublingualmente, intratecalmente ou intradermicamente. A 20 via de administração pode depender de vários fatores, tais como do ambiente e dos objetivos terapêuticos. Conforme aqui utilizado, indivíduos se referem aos animais, tais como humanos nos quais a prevenção ou correção dos defeitos desmineralização óssea caracterizando HPP ou outros fenótipos associados com HPP ou prevenção ou correção de cemento defeituoso é desejável.
A titulo de exemplo, a composição farmacêutica da invenção pode estar na forma de um liquido, solução, suspensão, pilula, cápsula, comprimido, cápsula gelatinosa, pó, gel, unguento, creme, medicação liquida para nebulização, suspensão de gotas , vapor atomizado, aerossol ou fitossoma. Para administração oral, comprimidos ou cápsulas podem ser preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação, enchimentos, lubrificantes, desintegrantes ou agentes umidificantes. Os comprimidos podem ser revestidos por métodos conhecidos na técnica. Preparações liquidas para administração oral podem assumir a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensão, ou elas podem estar presentes como um produto seco para constituição com salina ou outro veiculo liquido adequado antes do uso. Suplementos da dieta da invenção podem conter aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes suspensores, agentes emulsificantes, veículos não-aquosos, conservantes, sais de tampão, flavorizantes, corantes e agentes adoçantes, conforme apropriado. Preparações para administração oral também podem ser adequadamente formuladas para fornecer a liberação controlada dos ingredientes ativos.
Revestimentos entéricos podem ser ainda usados em comprimidos da presente invenção para resistir ao contato prolongado com o fluido gástrico fortemente ácido, mas se dissolver no ambiente intestinal neutro ou levemente ácido. Sem estar limitado a isto, acetato ftalato de celulose, Eudragit™ e ftalato de hidroxipropilmetilcelulóse (HPMCP) podem ser usados nos revestimentos entéricos das composições farmacêuticas da presente invenção. Concentrações de acetato ftalato de celulose geralmente usadas são de 0,5 a 9,0% do peso do núcleo. A adição de plastificantes melhora a resistência à água desse material de revestimento, e formulações usando tais plastificantes são mais eficazes do que quando acetato ftalato de celulose é usado sozinho. Acetato ftalato de celulose é compatível com muitos plastificantes, incluindo monoglicerídeo acetilado; butilftalilbutil glicolato; tartarato de dibutila; ftlato de dietila; ftalato de dimetila; etilftaliletilglicolato; glicerina; propilenoglicol; triacetina; citrato de triacetina; e tripropionina. Ele também é usado em combinação com outros agentes de revestimento tais como etil celulose, em preparações de liberação controlada de fármacos. Dosagem
Qualquer quantidade de uma composição farmacêutica pode ser administrada a um individuo. As dosagens dependerão de muitos fatores incluindo o modo de administração e a idade do individuo. Tipicamente, a quantidade de ALP direcionada ao osso da invenção contida em uma dose única será uma quantidade que efetivamente previne, retarda ou corrige o defeito da mineralização óssea em HPP sem induzir a toxicidade significativa. Conforme aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é tencionado a se referir a uma quantidade eficaz para alcançar o efeito terapêutico desejado enquanto se evita os efeitos colaterais adversos. Tipicamente, sALPs direcionadas a osso de acordo com a presente invenção podem ser administradas a individuos em doses variando de 0,001 a 500 mg/Kg/dia e, em uma modalidade mais especifica, de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/Kg/dia, e em uma modalidade mais especifica, de cerca de 0,2 a cerca de 20 mg/Kg/dia. 0 método de acúmulo de cálcio alométrico de Mahmood et al. (Mahmood et al. 2003) pode ser usado para extrapolar a dose de camundongos para humanos. A dosagem será adaptada pelo • clinico de acordo com fatores convencionais tais como a extensão da doença e diferentes parâmetros do paciente. A quantidade terapeuticamente eficaz da sALP direcionada a osso pode também ser diretamente medida. A quantidade eficaz pode ser dada diariamente ou semanalmente ou suas frações. Tipicamente, uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada em uma quantidade de cerca de 0,001 mg até cerca de 500 mg por Kg de peso corporal por dia (por exemplo, 0,05, 0,01 , 0,1 , 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 0,8, Img, 2 mg, 3 mg, 4mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, ou 250 mg). As dosagens podem ser fornecidas em regimes ou de dosagem individual ou de dosagem múltipla. Por exemplo, em algumas modalidades, a quantidade eficaz é uma dose que varia de cerca de 0,1 até cerca de 100 mg/Kg/dia, de cerca de 0,2 mg até cerca de 20 mg do sALP direcionado a osso por dia, de cerca de 1 mg até cerca de 10 mg da sALP direcionada a osso por dia, de cerca de ,07 mg até cerca de 210 mg de sALP direcionada a osso por semana, de 1,4 mg a cerca de 140 mg da sALP direcionada a osso por semana, de cerca de 0,3 mg até cerca de 300 mg de sALP direcionada a osso a cada três dias, de cerca 0,4 mg a cerca de 40 mg da sALP direcionada a osso dia sim dia não, e de cerca de 2 mg até cerca de 20 mg da sALP direcionada a osso a cada dois dias.
Essas são diretrizes simples, uma vez que a dose efetiva deve ser cuidadosamente selecionada e titulada pelo clinico acompanhante baseando-se em fatores clínicos únicos para cada paciente ou por um nutricionista. A dose diária ótima será determinada por métodos conhecidos na técnica e será influenciada por fatores tais como idade do paciente, conforme indicado acima, e outros fatores clinicamente relevantes. Além disso, pacientes podem estar tomando medicações para outras doenças ou condições. As outras medicações podem ser continuadas durante o tempo em que uma sALP direcionada a osso é dada ao paciente, porém é particularmente recomendável em tais casos a começar com baixas doses para determinar se ocorrem efeitos colaterais adversos.
Carreadores/Veículos Preparações contendo uma sALP direcionada a osso podem ser fornecidas aos pacientes juntamente com solventes aquosos ou não-aquosos, suspensões ou emulsões estéreis farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de solventes não- aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal, óleo de peixe e ésteres orgânicos injetáveis. Veículos aquosos incluem água, soluções de água-álcool, emulsões ou suspensões, incluindo veículos parenterais médicos tamponado e salina incluindo solução de cloreto de sódio, solução de dextrose de Ringer, solução de dextrose mais cloreto de sódio solução de Ringer contendo lactose ou óleos fixo. Veículos intravenosos podem incluir repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer, e semelhantes.
Em ainda outra modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser distribuídas em um sistema de liberação controlado. Em uma modalidade, materiais poliméricos incluindo ácido polilático, poliortoésteres, copolimeros em bloco anfifático ligados de forma cruzada e hidrogéis, ácido poliidroxibutírico e poliidropiranos podem ser usados (ver também Smolen e Bali, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons; Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxicology series, 2003, 2a edição, CRRC Press), em outra modalidade, uma bomba pode ser usada (Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574).
As proteínas de fusão da presente invenção poderiam estar na forma de um pó liofilizado usando soluções excipientes apropriadas (por exemplo, sacarose) como diluentes.
Além disso, os segmentos de nucleotídeos ou proteínas de acordo com a presente invenção podem ser introduzidos em indivíduos de várias formas. Por exemplo, osteoblastos podem ser isolados do indivíduo afligido, transformado com um constructo de nucleotídeo de acordo com a invenção e reintroduzido no indivíduo afligido de várias formas, incluindo injeção intravenosa. Alternativamente, o constructo de nucleotídeo pode ser administrado diretamente ao indivíduo afligido, por exemplo, por injeção. O constructo de nucleotídeo pode também ser distribuído através de um veículo tal como lipossoma, o qual pode ser projetado para ser alvejado em um tipo celular específico, e projetado para ser administrado através de diferentes vias.
As proteínas de fusão da presente invenção também poderiam ser vantajosamente distribuídas através de terapia gênica. Métodos de terapia gênica úteis incluem aqueles descritos em WO06060641A2, US7179903 e WO0136620A2 para Genzyme usando, por exemplo, um vetor de adenovirus para a proteína terapêutica e alvejando os hepatócitos como células produtoras de proteína.
Um "veículo de distribuição gênica" é definido como qualquer molécula que possa carregar polinucleotídeos inseridos em uma célula hospedeira. Exemplos de veículos de distribuição de genes são lipossomas, polímeros biocompatíveis, incluindo polímeros naturais e polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos; envelopes virais artificiais; partículas metálicas; e bactérias, ou vírus, tais como baculovirus, adenovirus e retrovirus, bacteriófagos, cosmideos, plasmideos, vetores fúngicos e outros veiculo de recombinação tipicamente usados na técnica os quais tenham sido descritos para expressão em uma variedade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos, e podem ser usados para a terapia gênica assim como para a expressão de proteina simples. "Distribuição gênica", "transferência gênica" e semelhantes, conforme aqui utilizados, são termos que se referem à introdução de um polinucleotideo exógeno (algumas vezes referido como "transgene") em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a introdução. Tais métodos incluem uma variedade de técnicas bem conhecidas tais como transferência gênica mediada por vetor (por exemplo, infecção/transfecção virai, ou vários outros complexos de distribuição de gene à base de lipideo ou à base de proteina), assim como técnicas que facilitam a distribuição de polinucleotideos "nus" (tais como, eletroporação, distribuição por "arma gênica" e várias outras técnicas usadas para a introdução dos polinucleotideos). O polinucleotideo introduzido pode ser estavelmente ou temporariamente mantido na célula hospedeira. A manutenção estável tipicamente requer que o polinucleotideo introduzido ou contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se integre em um replicon da célula hospedeira, tal como um replicou extacromossomal (por exemplo, um plasmideo) ou um cromossomo mitocondrial ou nuclear. Uma variedade de vetores é conhecida como sendo capaz de mediar a transferência de genes para células de mamíferos, conforme é conhecido na técnica e aqui descrito.
Um "vetor virai" é definido como um vírus recombinantemente produzido ou partícula virai que compreende um polinucleotideo a ser distribuído em uma célula hospedeira seja in vivo, ex vivo ou in vitro. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores de adenovirus, vetores virais adenoassociados, tais como aqueles descritos em W06002203A2, vetores de alfavírus e semelhantes. Vetores de alfavírus, tais como vetores baseados no vírus Semliki Forest e vetores baseados no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso na terapia gènica e imunoterapia.
Em aspectos onde a transferência gênica é mediada por um vetor de DNA virai, tal como um adenovirus (Ad) ou vírus adenoassociado (MV), um constructo de vetor se refere ao polinucleotídeo compreendendo o genoma virai ou parte sua, e um transgene. Adenovirus (Ads) são um grupo homogêneo relativamente bem caracterizado de vírus incluindo mais de 50 sorotipos. Ver, por exemplo, o Pedido PCT Internacional WO 95/27071. Ads são fáceis de crescer e não requerem integração no genoma da célula hospedeira. Vetores derivados de Ad recombinante, particularmente aqueles que reduzem o potencial para a recombinação e geração do vírus tipo selvagem, também foram construídos, ver os Pedidos PT Internacionais Nos. WO 95/00655 e WO 95/11984. Vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio de clonagem nos quais um polinucleotídeo pode ser operativamente ligado são bem conhecidos na técnica. Tais vetores são capazes de transcrever RNA in vitro ou in vivo, e são comercialmente disponíveis de fontes tais como Stratagene (La Jolla, CA) e Promega Biotech (Madison, WI). Para otimizar a expressão e/ou a transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar porções 5' e/ou 3' dos clones para eliminar códons de início de tradução alternativos inapropriado potenciais extras ou outras sequências que podem interferir com ou reduzir a expressão, seja ao nível da transcrição ou da tradução.
O sALP direcionado ao osso da presente invenção pode também ser usado juntamente com pelo menos um outro ingrediente ativo para corrigir um defeito de mineralização óssea ou outro sintoma prejudicial de HPP. Poe também ser usado juntamente com pelo menos um outro ingrediente ativo para corrigir o defeito do cemento.
O termo "condições de alta estringência" é tencionado a se referir às condições que permitem sequências com uma alta homologia para se ligar. Sem ser limitado dessa forma, exemplos de tai condições sào listadas no manual "Molecular cloning, a laboratory manual, segunda edição de 1989 de Sambrook et al.: o reagente de Dnhardt 6XSSC ou 6XSSPE ou não, SDS 0,5% e a temperatura usada para obter condições de alta estringência é mais comum ao redor de 68 °C (ver páginas 9.47 a 9.55 de Sambrook) para um ácido nucleico de 300 a 1500 nucleotideos. Embora a temperatura ótima a ser usada para uma sonda de ácido nucleico especifica pode ser empiricamente calculada, e embora exista lugar para alternativas nas condições tampão selecionadas, dentro dessas faixas de condição muito bem conhecidas, o ácido nucleico capturado não irão variar significativamente. De fato, Sambrook claramente indica que a "escolha depende era larga extensão na preferência pessoal" (ver página 9.47). Sambrook especifica que a fórmula para calcular a temperatura ótima a qual varia de acordo com a fração de guanina e citosina na sonda de ácido nucleico e o comprimento da sonda (10 a 20 °C menos do que Tm, em que Tm = 81,5 °C + 16,6 (logio[Na+]) + 0,41 (fração G + C) - 0,63 (% de formamida - (600/1) (ver páginas 9.50 e 9.51 de Sambrook. Kits
A presente invenção também se refere a um kit para corrigir ou prevenir um fenótipo HPP ou um defeito de cemento compreendendo um ácido nucleico, uma proteína ou um ligante de acordo com a presente invenção. Por exemplo, ele pode compreender uma composição direcionada a osso da presente invenção ou um vetor que a codifique, e instruções para administrar a referida composição ou vetor a um indivíduo para corrigir ou prevenir um fenótipo HPP. Tais kits podem ainda compreender pelo menos um outro agente ativo capaz de prevenir o corrigir um fenótipo HPP. Quando o kit é usado para prevenir ou corrigir um fenótipo HPP em um indivíduo HPP, o kit pode ainda compreender pelo menos um outro agente ativo capaz de prevenir ou corrigir quaisquer outros sintomas prejudiciais do HPP. Além disso, um kit compartimentalizado de acordo com a presente invenção inclui qualquer kit no qual os reagentes estão contidos em recipientes separados. Tais recipientes incluem pequenos recipientes de vidro recipientes plásticos ou fitas de plástico ou papel. Tais recipientes permitem a transferência eficiente dos reagentes de um compartimento para outro compartimento, de modo que as amostras e reagentes não sejam contaminados de modo cruzado e os adicionados de modo quantitativo de um compartimento para o outro.
Mais especificamente, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecida uma fosfatase alcalina direcionada a osso compreendendo um polipeptideo com a estrutura: Z-sALP-Y-espaçador-X-Wn-V, em que sALP é o dominio extracelular da fosfatase alcalina; em que V é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; X é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; Y é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; Z é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de pelo menos um aminoácido; e Wn é um poliaspartato ou poliglutamato em que n = 10 a 16.
Em uma modalidade especifica, a sALP compreende residuos de aminoácidos 23 a 508 da SEQ ID NO: 15. Em outra modalidade especifica, a sALP consiste dos residuos de aminoácidos 23 a 512 da SEQ ID NO: 15. Em outra modalidade especifica, a sALP compreende residuos de aminoácidos 23 a 508 da SEQ ID NO: 18. Em outra modalidade especifica, a sALP consiste dos residuos de aminoácidos 23-512 da SEQ ID NO: 18. Em outra modalidade especifica, a sALP compreende os residuos de aminoácidos 18-498 da SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade especifica, a sALP consiste dos residuos de aminoácidos 18-502 da SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade especifica, a sALP compreende os residues de aminoácidos 18-498 da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade específica, a sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 18-502 da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade específica, a sALP compreende os resíduos de aminoácidos 18-498 da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade específica, a sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 18-502 da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade específica, a sALP compreende os resíduos de aminoácidos 18-498 da SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade especifica, a sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 18-502 da SEQ ID NO: 8.
Em outra modalidade específica, o espaçador compreende uma região cristalizável do fragmento (Fc). Em outra modalidade específica, o Fc compreende um domínio CH2, um domínio ch3 e uma região de dobradiça. Em outra modalidade específica, o Fc é um domínio constante de uma imunoglobulina selecionada do grupo consistindo de IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 e IgG-4. Em outra modalidade específica, o Fc é um domínio constante de uma imunoglobulina IgG-1. Em outra modalidade específica, o Fc é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade específica, Wn é um poliaspartato. Em outra modalidade específica, n = 10. Em outra modalidade específica, Z está ausente. Em outra modalidade específica, Y compreende dois resíduos de aminoácidos. Em outra modalidade específica, Y é leucina-lisina. Em outra modalidade específica, X sâo 2 resíduos de aminoácidos. Em outra modalidade específica, X é aspartato-isoleucina. Em outra modalidade específica, V é ausente. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 4.
Em outra modalidade específica, a fosfatase alcalina direcionada a osso compreende o polipeptídeo em uma forma compreendendo um dimero. Em outra modalidade específica, a fosfatase alcalina direcionada a osso compreende o polipeptídeo em uma forma de tetrâmero.
Em outra modalidade específica, a fosfatase alcalina direcionada a osso está em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade específica, o veículo farmaceuticamente aceitável é salina. Em outra modalidade específica, a fosfatase alcalina direcionada a osso está em uma forma liofilizada. Em outra modalidade específica, a fosfatase alcalina direcionada a osso está em uma dosagem diária de cerca de 0,2 a cerca de 20 mg/Kg. Em outra modalidade específica, a fosfatase alcalina direcionada a osso está em uma dosagem de cerca de 0,6 até cerca de 60 mg/Kg para administração a cada três dias. Em outra modalidade especifica, a fosfatase alcalina direcionada a osso está em uma dosagem semanal de cerca de 1,4 até cerca de 140 mg/Kg. Em outra modalidade especifica, a fosfatase alcalina direcionada a osso está em uma dosagem semanal de cerca de 0,5 mg/Kg.
Mais especificamente, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica o polipeptideo da presente invenção.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um ácido nucleico isolado consistindo de uma sequência que codifica o polipeptideo da presente invenção. Mais especificamente, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um ácido nucleico isolado consistindo de uma sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 17.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão recombinante compreendendo o ácido nucleico da presente invenção. Mais especificamente, De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de virus adenoassociado recombinante compreendendo o ácido nucleico da presente invenção. Mais especificamente, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula hospedeira recombinante isolada transformada ou transfectada com o vetor da presente invenção.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produção de fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção, compreendendo o cultivo da célula hospedeira da presente invenção, sob condições adequadas para efetuar a expressão da fosfatase alcalina direcionada a osso e recuperar a fosfatase alcalina direcionada a osso do meio de cultura.
Em uma modalidade especifica, a célula hospedeira é uma célula L, célula C127, célula 3T3, célula CHO, célula BHK, célula COS-7 ou uma célula de ovário de hâmster chinês (CHO). Em outra modalidade especifica, a célula hospedeira é uma célula de ovário de hâmster chinês. Em uma modalidade especifica, a célula hospedeira é uma célula CHO-DG44.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um kit compreendendo a fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção e instruções para administrar o polipeptídeo a um individuo para corrigir ou prevenir um fenótipo de hipofosfatasia (HPP).
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um kit compreendendo a fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção e instruções para administrar o polipeptideo a um individuo para corrigir ou prevenir aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de uso da fosfatase alcalina 5 direcionada a osso da presente invenção para corrigir ou prevenir pelo menos um fenótipo de hipofosfatasia (HPP), compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da fosfatase alcalina direcionada a osso a um indivíduo necessitado disso, por meio do que pelo 10 menos um fenótipo HPP é corrigido ou prevenido no indivíduo.
Em uma modalidade especifica, o indivíduo tem pelo menos um fenótipo HPP. Em outra modalidade especifica, o indivíduo é provável de desenvolver pelo menos um fenótipo 15 HPP. Em outra modalidade especifica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende ataque relacionado com HPP. Em outra modalidade especifica, o pelo menos um fenótipo de HPP compreende a perda prematura dos dentes-de-leite. Em outra modalidade especifica, o pelo menos um fenótipo de 20 HPP compreende a mineralização óssea incompleta. Em uma modalidade especifica, a mineralização óssea incompleta é a mineralização óssea femoral incompleta. Em outra modalidade especifica, a mineralização óssea incompleta é a modalidade especifica, a mineralização óssea incompleta é a mineralização óssea do metatarso incompleta. Em outra modalidade específica, a mineralização óssea incompleta é a mineralização óssea das costelas incompleta. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende níveis de pirofosfato inorgânico (PPi) no sangue e/ou na urina elevados. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende níveis de fosfoetanolamina (PPi) no sangue e/ou na urina elevados. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende níveis de piridoxal-5'-fosfato (PLP) no sangue e/ou na urina elevados. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende ganho de peso inadequado. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende raquitismos. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende dor óssea. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende deposição de cristais de pirofosfato de cálcio diidratado. Em outra modalidade específica, o pelo menos um fenótipo HPP compreende aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário. Em outra modalidade específica, o indivíduo necessitado disso tem HPP da primeira infância. Em outra modalidade o indivíduo necessitado disso tem HPP da infância propriamente dita até os 12 anos. Em outra modalidade específica, o indivíduo necessitado disso tem HPP perinatal. Em outra modalidade específica, o indivíduo necessitado disso tem HPP adulta. Em outra modalidade específica, o indivíduo necessitado disso tem HPP odontoipofosfatasia.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de uso da fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção, para corrigir ou prevenir aplasia, hipoplasia o displasia do cemento dentário, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da fosfatase alcalina direcionada a osso a um indivíduo necessitado disso, por meio do que a aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário é corrigida ou evitada no indivíduo.
Em uma modalidade específica, a administração compreende a transfecção de uma célula no indivíduo com um ácido nucleico codificando a fosfatase alcalina. Em outra modalidade específica, a transfecção da célula é efetuada in vitro, de modo que a fosfatase alcalina direcionada a osso é expressa e secretada em uma forma ativa e administrada ao indivíduo com a referida célula. Em outra modalidade específica, a administração compreende a administração subcutânea da fosfatase alcalina direcionada a osso ao indivíduo. Em outra modalidade especifica, a administração compreende administração intravenosa da fosfatase alcalina direcionada a osso ao indivíduo.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é 5 fornecida a fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção, para uso na correção ou prevenção de pelo menos um fenótipo de HPP.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida a fosfatase alcalina direcionada a osso da 10 presente invenção, para uso na correção ou prevenção de aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso da fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção, para fazer um medicamento.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso da fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção, para corrigir ou prevenir pelo menos um fenótipo HPP.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é 20 fornecido um uso da fosfatase alcalina direcionada a osso da presente invenção, para corrigir ou prevenir aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dentário.
Outros objetos, vantagens e características da presente invenção ficarão mais evidentes na leitura da seguinte descrição não-restritiva das suas modalidades especificas, dadas a titulo de exemplo somente com referência aos desenhos associados.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 apresenta o design e a estrutura esquemática da ALP direcionada ao osso da presente invenção exemplificada por hsTNALP-FcDIO. O painel A apresenta uma representação esquemática do produto de tradução primário completo do gene da fosfatase alcalina não-especifica de tecido humano (TNALP) incluindo o peptideo de sinal N- terminal e o sinal ancorado à membrana transiente para a adição de GPI. O painel B apresenta o produto de tradução primário da proteina de fusão. O painel C apresenta o produto de tradução primário sem o peptideo de sinal TNALP clivável; A Figura 2 apresenta a sequência de proteina para hTNALP-FcDIO ((SEQ ID NO: 1), incluindo o peptideo de sinal N-terminal - 17 primeiros aa) , em que a porção hTNALP (SEQ ID NO: 2) é escrita em itálico incluindo a porção do peptideo de sinal mostrado em itálico e sublinhado, e o fragmento Fc está sublinhado (SEQ ID NO: 3) ; A Figura 3 apresenta a sequência protéica para o hsTNALP-FcDIO usado nos Exemplos aqui apresentados (SEQ ID NO: 4) (sem o peptideo de sinal N-terminal), em que a porção hsTNALP (SEQ ID NO: 5) é escrita em itálico, e o fragmento Fc é sublinhado (SEQ ID NO: 3) . Os resíduos de asparagina duplamente sublinhados (N) correspondem aos sítios de N-glicosilação putativos e os resíduos de aminoácidos em negrito (LK & Dl) correspondem aos ligantes entre hsTNALP e Fc, e respectivamente os domínios Fc e D10. Esses ligantes são derivados dos sítios de restrição da endonuclease introduzidos durante a construção do DNAc; A Figura 4 representa graficamente a expressão comparativa das células STNALP-D10 e sTNALP-FcDIO em CHO- DG4 4; A Figura 5 apresenta a purificação de sTNALP-FcDIO na cromatografia de peneira molecular de Sepharose proteína-A em Sephacrtl™ 3-300, assim como a análise de SDS-PAGE da sTNALP-FcDIO purificada sob condições redutoras (DT+) e não-redutoras (DTT-). Ela também apresenta uma versão esquematizada de sTNALP- FcDIO. A proteína purificada por cromatografia por afinidade de proteína A-Sepharose foi analisada por SDS-PAGE e as bandas foram marcadas com Sypro™ Ruby. AS principais espécies de sTNALP-FcDIO migraram com uma massa molecular aparente de 90.000 Da sob condições redutoras e 200.000 Da sob condições não- redutoras; A Figura 6 apresenta a posição do sítio de clivagem da papaína em sTNALP-FcDIO; A Figura 7 apresenta uma análise de SEC-HPLC não- desnaturante de sTNALP-FcDIO na coluna TSK-Gel G3000WXL. Curva plana: amostra digerida por papaína. Curva -X-: amostra idêntica incubada nas mesmas condições sem papaína (controle); A Figura 8 apresenta uma análise SDS-PAGE de um sTNALP-FcDIO incubado com ou sem papaina mostrando qual fragmento é responsável para que banda do gel. A análise foi efetuada sob condições redutoras (+DTT) ou não- redutoras (-DTT); A Figura 9 apresenta um ensaio de ligação in vitro. sTNALP-FcDIO e a fosfatase alcalina não-específica de tecido do rim de bovino foram comparados no ensaio de ligação mineral reconstituído conforme descrito no Exemplo 2. A atividade total é a soma da atividade enzimática recuperada nas frações livre e ligada. A atividade total foi considerada como sendo de 84% e 96% da quantidade inicial da atividade enzimática introduzida em cada grupo de ensaios para as formas bovina e sTNALP-FcDIO da enzima, respectivamente. Os resultados são a média das duas ligações; A Figura 10 apresenta os perfis farmacocinéticos e de distribuição de sTNALP-FcDIO no soro, tibia e músculo de camundongos WT adultos. As concentrações de sTNALP-FcDIO no soro, tíbia e músculo é expressa em é expressa em μg/g de tecido (peso úmido) depois de uma única injeção intravenosa de massa de 5 mg/Kg em um camundongo WT adulto; A Figura 11 apresenta o perfil farmacocinético da concentração no soro de sTNALP-FcDIO em camundongos WT recém-nascidos. As concentrações no soro de sTNALP-FcDIO em função do tempo depois de uma única injeção i.p. (painel A) ou s.c. (painel B) de 3,7 mg/Kg em camundongos WT recém- nascidos (1 dia de idade); A Figura 12 apresenta o perfil farmacocinético previsto de sTNALP-FcDIO no soro. Níveis de estado fixo circulante máximo (Cmax) e mínimo (Cmin) de sTNALP-FcDIO depois de repetidas injeções subcutâneas (a cada 24 horas) de 10 mg/Kg em camundongos recém-nascidos; A Figura 13 apresenta o perfil farmacocinético experimentalmente testado de sTNALP-FcDIO no soro de camundongos recém-nascidos. Níveis de estado fixo circulante mínimos de sTNALP-FcDIO 24 h depois das últimas injeções subcutâneas de 10 mg/Kg foram medidos em camundongos recém-nascidos. Homo: homozigoto, hetero: heterozigoto; A Figura 14 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de baixa dose (1 mg/Kg) em termos de concentrações no soro de sTNALP-FcDlO em camundongos tratados com Akp2"/-. As concentrações de soro de sTNALP- FcDlO no dia 16 dos camundongos tratados por 15 dias com injeções s.c. diárias de 1 mg/Kg de STNALP-FcDlO; A Figura 15 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de baixa dose (1 mg/Kg) em termos de concentrações no soro de PPi em camundongos tratados com Akp2-/". Medição das concentrações de PPi no soro. Uma baixa de dose de 1 mg/Kg foi suficiente para normalizar os niveis de PPi em camundongos tratados com ERT; A Figura 16 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias) , e de baixa dose (1 mg/Kg) em termos da morfologia fiseal em camundongos Akp2"z' tratados. O manchamento de tricoma de Goldner das placas de crescimento de WT, camundongos Akp2'/" não-tratados e tratados. A placa de crescimento da tíbia próxima (fise) mostrou um alargamento excessivo da zona hipertrófica tanto em sTNALP- FcDlO quanto em veículo injetado em camundongos Akp2‘/-' o que é consistente com raquitismos precoces. Entretanto, a morfologia fiseal parecia menos perturbada nos animais tratados com sTNALP-FcDlO; A Figura 17 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de baixa dose (1 mg/Kg) em termos do tamanho da área hipertrófica fiseal de camundongos Akp2-/~ tratados. 0 tamanho da área hipertráfica da placa de crescimento é expresso como a porcentagem da área da placa de crescimento total. Verificar a normalização da área hipertrófica nos camundongos tratados; A Figura 18 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg) em termos do peso corporal em camundongos Akp2-/- tratados. O efeito de sTNALP-FcDIO no peso corporal; A Figura 19 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), resultados de eficácia em termos do comprimento ósseo longo em camundongos Akp2-/- tratados. 0 efeito de sTNALP-FcDIO no comprimento do fêmur e da tibia (medições feitas no dia 16) ; A Figura 20 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), resultados de eficácia em termos da concentração no soro de sTNALP- FcDlO em camundongos Akp2-/- tratados. As concentrações no soro de sTNALP-FcDIO no dia 16 de camundongos tratados por 15 dias com injeções s.c. diárias de 8,2 mg/Kg de sTNALP- FcDIO; A Figura 21 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), em termos de mineralização dos ossos em camundongos Akp2-/~ tratados. A análise de raio-X das patas, caixa torácica e membros posteriores dos camundongos Akp2'/_ (16 dias) e uma tabela de distribuição de imagem Faxitron™. As patas e as caixas torácicas foram classificadas como severa, moderadas ou saudáveis para levar em consideração a extensão dos defeitos de mineralização óssea. As pernas foram simplesmente classificadas como anormais (pelo menos um defeito) ou saudáveis (sem defeitos visíveis); A Figura 22 apresenta resultados de eficácia de curta duração (15 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), em termos de defeitos nos dentes em camundongos Akp2~/_ tratados. A análise histológica dos dentes dos camundongos Akp2-/~ injetados com veiculo ou sTNALP-FcDIO e camundongos tipo selvagem. Seções finas foram preparadas e marcadas conforme descrito em Millan et al. PDL = ligamento periodental; A Figura 23 apresenta resultados de eficácia de longa duração (52 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), os resultados de eficácia em termos de sobrevivência em camundongos Akp2-/' tratados. A sobrevivência de longo prazo de camundongos Akp2-/~ tratados com sTNALP-FcDIO em comparação com a morte prematura de Akp2"/" tratados somente com o veículo de controle; A Figura 24 apresenta resultados de eficácia de longa duração (52 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), os resultados de eficácia em termos de tamanho, mobilidade e aparência em camundongos Akp2‘/_ tratados. 0 tratamento normaliza o tamanho, mobilidade e aparência de camundongos Akp2-/’ tratados. Camundongos não-tratados da mesma liteira são mostrados para fins comparativos; A Figura 25 apresenta resultados de eficácia de longa duração (52 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg) , os resultados de eficácia em termos de mineralização e tamanho dos ossos em camundongos Akp2-/~ tratados. Imagens de raio-X do ossos do metatarso de camundongos Akp2^/“ tratados com 46 e 53 dias de idade em comparação com camundongos WT; A Figura 26 apresenta resultados de eficácia de longa duração (52 dias), e de alta dose (8,2 mg/Kg), os resultados de eficácia em termos da concentração no soro de sTNALP-FcDIO em camundongos Akp2'^' tratados. As concentrações no soro de sTNALP-FcDIO no dia 53 dos camundongos tratados por 52 dias com injeções s.c. diárias de 8,2 mg/Kg de sTNALP-FcDIO; A Figura 27 apresenta A) curvas de sobrevivência de camundongos Akp2-/“ recebendo sTNALP-FcDIO em doses de 4,3 mg/Kg diárias (Tx-1) ou de 15,2 mg/Kg a cada 3 dias (Tx-3) ou 15,2 mg/Kg a cada semana (Tx-7) e B) sobrevivência média para cada um daqueles regimes. A sobrevivência dos camundongos tratados foi comparada com a sobrevivência dos camundongos injetados com veículo; A Figura 28 apresenta A) curvas de sobrevivência de camundongos Akp2’/’ recebendo sTNALP-FcDIO em doses de 8,2 mg/Kg diárias (RTx) iniciando no dia 15 depois do nascimento e B) sobrevivência média para os camundongos injetados com veiculo e tratados. A sobrevivência dos camundongos tratados é comparável com a sobrevivência dos camundongos injetados com veiculo (Rveículo); A Figura 29 apresenta os efeitos do peso corporal de doses diárias de 8,2 mg/Kg de sTNALP-FcDIO injetada em camundongos Akp2“/" (RTx) iniciando no dia 15 depois do nascimento. Os pesos corporais diários são comparados com aqueles dos camundongos Apk2“/" injetados com veículo (Rveículo) dos companheiros de liteira (WT); A Figura 30 apresenta um alinhamento de vários ALPs estabelecidos por alinhamento de sequência múltipla CLUSTAL™ W (1,82), a saber, uma sequência TNALP bovina (SEQ ID NO: 6); uma sequência de gato TNALP (SEQ ID NO: 7), uma sequência TNALP humana (SEQ ID NO: 8), uma sequência TNALP de camundongo (SEQ ID NO: 9) , uma sequência TNALP de rato (SEQ ID NO: 10) e uma sequência TNALP de cachorro parcial (SEQ ID NO: 11), em que a natureza dos primeiros 22 resíduos de aminoácidos é desconhecida; uma IALP humana (SEQ ID NO: 12) (No. de acesso NP 001622), uma GCALP humana (SEQ ID NO: 13) (No. de Acesso P10696) e uma PLALP humana (SEQ ID NO: 14) (No. de Acesso NP_112603) . denota que os resíduos naquela coluna são idênticos em todas as sequências do alinhamento, ":"denota que substituições conservadas foram observadas, e denota que substituições semi-conservadas foram observadas. Uma sequência de consenso derivada deste alinhamento (SEQ ID NO: 15) também está presente, em que x é qualquer aminoácido; A Figura 31 apresenta um alinhamento de TNALPs de várias espécies estabelecido pelo alinhamento de sequências múltiplas CLUSTAL™ W (1.82), a saber a sequência bovina (SEQ ID NO: 6); a sequência do gato (SEQ ID NO: 7), a sequência humana (SEQ ID NO: 8), a sequência do camundongo (SEQ ID NO: 9) , a sequência de rato (SEQ ID NO: 10) e uma sequência de cachorro parcial (SEQ ID NO: 11), em que a natureza dos primeiros 22 resíduos de aminoácidos é desconhecida. denota que os resíduos naquela coluna são idênticos em todas as sequências do alinhamento, denota que substituições conservadas foram observadas, e denota que substituições semi-conservadas foram observadas. Uma sequência de consenso derivada deste alinhamento (SEQ ID NO: 16) também está presente, em que x é qualquer aminoácido; e A Figura 32 apresenta a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO; 17) codificando a sequência de polipeptideo descrita na Figura 1.
Descrição Detalhada das Modalidades Ilustrativas
Os exemplos fornecidos abaixo apresentam o primeiro tratamento bem sucedido de camundongos nocaute TNALP (Akp2‘ /_) usando injeções subcutâneas de uma forma recombinante de ALP. Camundongos Akp2‘/_ recapitulam a forma severa, geralmente letal da primeira infância de hipofosatasia.
O modelo de murino nulo homozigótico de TNSALP bem descrito o qual espelha muitas das anormalidades esqueléticas e bioquímicas associadas com a HPP da primeira infância foi usado. Os camundongos foram tratados com uma nova forma recombinante solúvel de TNSALP humana projetada em seu carbóxi terminal para conter tanto um espaçador na forma de região de fragmento cristalino (Fc) da IgGl-humana fundida a uma sequência direcionada a osso composta de dez resíduo de ácido aspártico sequenciais (D10). Foi demonstrado que em relação à TNSALP natural purificada do rim, a forma recombinante modificada da enzima se liga à hidroxiapatita de modo muito mais ávido, enquanto retém a sua atividade enzimática. 0 tratamento com a TNSALP recombinante da presente invenção normalizou surpreendentemente os níveis de PPi plasmáticos, e melhorou a mineralização das patas, tórax, patas posteriores e dentição de camundongos nulos homozigóticos em comparação com os camundongos os quais tenham recebido somente o veiculo. Também foi demonstrado que o tratamento prolonga a 5 sobrevivência, com a quase normalização radiográfica do fenótipo esquelético.
Além de seu efeito terapêutico in vivo, foi surpreendentemente descoberto que a forma ativa recombinante da enzima modificada a qual continha um espaçador é expressa em niveis mais altos do que sua correspondente recombinante sem tal espaçador. Além disso, foi demonstrado que a enzima funciona como um tetrâmero.
A presente invenção é ilustrada em outro detalhes pelos seguintes exemplos não-limitativos. EXEMPLO 1 Expressão e Purificação da sTNALP-FcDIO recombinante Para facilitar a expressão e purificação da TNALP recombinante, a sequência C-terminal hidrofóbica que especifica a ligação GPI-ãncora em TNALP foi eliminada para 20 torná-la uma enzima secretada solúvel (Di Mauro et al. 2002). A sequência codificadora do ectodominio TNALP também foi prolongada com a região Fc da IgG humana (yl de (IgGl), Swiss-Prot P01857). Isto permitiu a rápida purificação da enzima recombinante na cromatografia da proteina A e , surpreendentemente, sua expressão intensificada. Além disso, para alvejar TNALP recombinante ao tecido ósseo, uma sequência de deca-aspartato (D10) foi ligada ao C-terminal da região Fc. Essa forma quimérica de TNALP, designada sTNALP-FcDlO, retém a atividade enzimática total tanto quando ensaiado em pH 9,8 usando o substrato artificial p- nitrofenilfosfato e quando ensaiado em pH 7,4 usando o pirofosfato inorgânico(PPi), como o substrato fisiológico. Como na forma de ocorrência natural de TNALP, o peptideo de sinal N-terminal é removido por clivagem durante a translocáção co-tradução da proteina pelo reticulo endoplasmático irregular. Seu design e estrutura é esquematicamente ilustrado na Figura 1. A sequência de aminoácidos da proteina de fusão (incluindo o peptideo de sinal) é mostrada na Figura 2. A sequência de aminoácidos da proteina de fusão conforme secretada (isto é, sem o peptideo de sinal) é mostrada na Figura 3.
O método que foi usado para construir essa proteina de fusão é o seguinte. O DNAc codificando a proteina de fusão (ver Figura 32) foi inserido no vetor pIRES (Clontech™) no primeiro sitio de clonagem múltiplo localizado à montante de IRES usando os sitios de restrição da endonuclease Nhel e BamHI. O gene diidrofolato redutase (DHFR) foi inserido no segundo sitio de clonagem múltiplo localizado à jusante da IRES usando sítios de restrição da endonuclease Smal e Xbal. O vetor resultante foi transfectado em células de ovário de hamster chinês (CHO-DG44) sem ambos os alelos do gene DHFR (Urlaub et al. 1983, obtido de Dr Lawrence A. Chasin, Universidade de Columbia) usando o kit de transfecção de Lipofectamine™ (Invitrogen). Dois dias após a transfecção, o meio foi alterado e as células foram mantidas em um meio sem nucleotídeo (IMDM suplementado com FBS 5% dialisado) por 15 dias para isolar os transfectantes estáveis para clonagem em placa.
As células dos três melhores clones ou os cinco originalmente selecionados crescendo no meio sem nucleotídeo foram reunidas e adicionalmente cultivadas em meio (IMDM + FBS 5% dialisado) contendo concentração crescente de metotrexato (MTX). As culturas resistentes a MTX 50 nM foram ainda expandidas em Cellstacks™ (Coning) contendo meio IMDM suplementado com FBS 5%. Ao atingir a confluência, a camada celular foi rinsada com salina tamponada com fosfato (PBS) e as células foram incubadas por mais três dias com IMDM contendo butirato de sódio 3,5 mM para aumentar a expressão proteica. No final da cultura, a concentração de sTNALP-FcDIO no meio gasto foi de 3,5 mg/mL conforme avaliado pela medição da atividade enzimática de TNALP.
Os níveis de sALP-FcDlO no meio gasto foram quantificados usando um ensaio colorimétrico para a atividade ALP onde a absorvância do p-nitrofenol liberado é proporcional aos produtos reacionais. A reação ocorreu em 100 μL de tampão ALP (bis tris propano (HC1) 20 mM, pH 9, NaCl 50 mM, MgC12 0,5 mM e ZnCl2 50 μM) contendo 10 pL de meio gasto diluído e PNPP 1 mM. O último composto foi adicionado por último para iniciar a reação. A absorvância foi registrada a 405 nm a cada 45 segundos durante 20 minutos usando um leitor de placas espectrofotométrico. A atividade catalítica de sTNALP-FcDIO, expressa como uma taxa inicial, foi avaliada pelo ajuste da curva mais íngreme para 8 valores sequenciais. Os padrões foram preparados com concentrações variadas de sALP-FcD10, e a atividade ALP foi determinada como acima. A curva padrão foi gerada delineando log da taxa inicial em função do log das concentrações padrões. A concentração de sTNALP-FcDIO em diferentes amostras foi lida a partir da curva padrão usando suas respectivas absorvâncias ALP. Medições de atividade foram transformadas em concentrações de sALP- FcDlO pelo uso de uma curva de calibração obtida pela delineação da atividade de concentrações conhecidas da enzima recombinante purificada.
O sobrenadante da cultura foi a seguir concentrado e dialisado contra PBS usando a filtração em fluxo tangencial e carregado em coluna MbSelect SuRe™ (GE Health Care) equilibrada com NaCl 150 mM, PO4 de sódio 10 mM. AS proteínas ligadas foram eluidas com Tris pH 11 50 mM, tampão pH 11,0. As frações coletadas foram ajustadas para pH 8 - 9 com Tris-HCl 200 mM pH 5,5. As frações contendo a maior parte do material eluido foram dialisadas contra NaCl 150 mM, tampão PO4 de sódio 25 mM pH 7,4 contendo MgC12 0,1 mM, ZnCls 20 μM e filtradas em uma membrana 0,22 μm (Millipore, Millex-GP™) sob condições estéreis. 0 rendimento global do procedimento de purificação foi de 50% com uma pureza acima de 95% conforme avaliado por SDS-PAGE marcada com rubi Sypro™. A preparação de sTNALP-FcDIO purificada foi armazenada a 4 °C e permaneceu estável por vários meses.
A seguinte técnica de purificação também foi testada com sucesso. O sobrenadante da cultura foi concentrado e dialisado contra PBS usando a filtração em fluxo tangencial e carregado em coluna de proteina A-sepharose (Hi-Trap™ 5 mL, GE Health Care) equilibrada com PBS. As proteinas ligadas foram eluidas com tampão citrato 100 mM pH 4,0. As frações coletadas foram imediatamente ajustadas até pH 7,5 com Tris 1 M pH 9,0. AS frações contendo a maior parte do material eluido foram dialisadas contra NaCl 150 mM, tampão de PO4 de sódio 25 mM, pH 7,4 contendo MgClj 0,1 mM, ZnClz 20 μM e filtrada em uma membrana de 0,22 μm (Millipore, Millex-GP™) sob condições estéreis. O rendimento global do procedimento de purificação foi de 50% com uma pureza acima de 95% conforme avaliado por SDS-PAGE marcada com rubi Sypro™. A preparação de sTNALP-FcDIO purificada foi armazenada a 4 °C e permaneceu estável por vários meses.
A quantidade de cópias do gene sTNALP-FclO foi aumentada pelo cultivo das células CHO-DG44194 transfectadas na presença de concentrações crescentes de metotrexato. Os clones das células resistentes a metotrexato 100 nM foram isolados e avaliados em relação às suas capacidades de produzir sTNALP-FcDIO em um alto rendimento. Os melhores procedimentos foram adaptado para cultivo em suspensão em meio Hyclone™ SFM4CHO™ (Cat # SH30549) na ausência de soro bovino fetal. As culturas que mantiveram um alto rendimento de produção sob aquelas condições foram transferidas para bolsas biorreatoras Wave™ descartáveis. 0 meio (25 L de volume total) foi semeado em uma densidade de 0,4 x 106 células por mL. A temperatura da cultura foi mantida a 37 °C até a densidade da cultura atingir 2 x 10° células/mL. A temperatura foi a seguir reduzida até 30 °C e a cultura foi suplementada com 125 mL de alimentação genérica CHO (Sigma, C1615). Foi descoberto que essas condições lentificam a divisão celular e aumentam a secreção de produtos no meio de cultura. Essas condições foram mantidas por 6 dia antes de coletar o sobrenadante da cultura celular contendo sTNALP-FcDIO secretada. EXEMPLO 2
Expressão comparativa de sTNALP-DIO e sTNALP-FcDIO Os vetores de plasmideo codificando ou sTNALP-DIO e sTNALP-FcDIO foram transfectados em células CHO-DG44 usando Lipofectamine™ e cresceram em meio seletivo (isto é, sem nucleotídeos) projetado para promover a sobrevivência das células expressando o gene DHFR conforme descrito no Exemplo 1 acima. Os transfectantes estáveis foram isolados por clonagem em placa e classificados de acordo com os seus níveis de expressão de proteína usando o ensaio enzimático da fosfatase alcalina também descrito no Exemplo 1 acima. A varredura permitiu a identificação de somente um clone para sTNALP-DIO (0,120 pg/célula/dia) e de cinco clones para sTNALP-FcDIO (0,377, 0,258, 0,203, 0,099 e 0,088 pg/célula/dia). A amplificação do gene de metotrexato (MTX) foi efetuada conforme descrito no Exemplo 1 acima (MTX variando de 0 a 100 mM) e permitiu um aumento e expressão de 8 vezes para sTNALP-FcDIO enquanto que nenhuma amplificação foi observada com as culturas sTNALP-DIO (ver desenvolvimento da linhagem celular, foi descoberto inesperadamente que a proteina sTNALP-FcDIO foi mais fácil de expressar em comparação com sTNALP-D10 (ver Figura 4). EXEMPLO 3 Caracterização de sTNALP-FcDIO sTNALP-FcDIO foi primeiramente purificada em proteína- A Sepharose™ e foi analisada em SDS-PAGE usando condições redutoras e não-redutoras.
Sob as condições redutoras, ela migrou como uma banda larga com uma massa molecular aparente de ~ 90.000 Da (DTT+ na Figura 5). A digestão com a peptideo N-glicosidase F (PNGAse F) reduziu a massa molecular aparente da proteína até cerca de 80.000, o que aproximou muito a massa calculada de 80.500 Da para o monômero sTNALP-FcDIO não- glicosilado mostrado na Figura 1. TNALP solúvel em soro, como o TNALP presente como uma proteína ancorada a GPI da superfície externa dos osteoblastos, é uma proteína altamente glicósilada com carboidratos compreendendo 20% da massa total da enzima (Farley & Magnusson, 2005). Embora as estruturas de carboidrato específicas em TNALP não tenham sido identificadas, estudos de sequência indicam que a enzima possui cinco sítios putativos para a glicosilação N-ligada, e estudos bioquímicos demonstraram evidências para os carboidratos tanto N quanto O ligados (Nosjean et al. 1997). Em concordância com essas observações iniciais, a migração eletroforética de sTNALP-FcDlO e sua sensibilidade à PGNAase F sugere que ela também é uma proteina N-glicosilada. TNALP solúvel no soro, tipo TNALP presente como uma proteina ancorada a GPI na superfície externa dos osteoblastos, é uma proteína altamente glicosilada com carboidratos compreendendo S 20% da massa total da enzima (Farley & Magnusson, 2005).
Quando SDS-PAGE foi repetido sob condições não- redutoras, a massa molecular aparente de sTNALP-FclO foi calculada como sendo de 200.000 (DT- na Figura 5) consistente com aquela de um homodímero como na TNALP não- alterada natural (Millán 2006). Esse homodímero provavelmente resulta da formação de duas pontes dissulfeto entre as regiões Fc monoméricas (painel superior da direita, Figura 5).
A massa molecular de sTNALP-FcDlO purificada sob condições naturais foi posteriormente avaliada usando cromatografia FPLC por exclusão de tamanho em uma coluna Sephacryl™S-300 (GE Health Care) equilibrada em NaCl 150 mM, tampão Tris pH 7,5 20 mM. A coluna foi previamente calibrada com um kit de proteína padrão (kit de calibração HMW, GE Health Care) (painel da esquerda inferior, Figura 5) .
As frações de cromatografia coletadas foram avaliadas para a atividade da fosfatase alcalina enzimática e o material em cada pico. Surpreendentemente, 78% do material eluiu em uma posição correspondendo às proteínas de 370 KDa (painel da esquerda inferior, Figura 5) sugerindo uma forma tetramérica para a enzima recombinante sTNALP-FcDIO natural produzida nas células CHO. Quando as frações da coluna Sephacryl S-300 foram testadas em relação à atividade, toda a atividade enzimática foi associada com a fração de 370 KDa. O material remanescente foi de um peso molecular muito maior, indicando a formação de alguns agregados sTNALP- FcDlO. Tanto as formas tetraméricas, as quais não podem ser observadas em SDS-page por que esta destrói a ligação não- covalente mantendo os tetrâmeros unidos, quanto as formas agregadas foram separados como monômeros TNALP-FcDlO com um peso molecular aparente de 90.000 por SDS-PAGE usando condições redutoras (DTT+, painel da direita inferior na Figura 5) e como dímeros com um peso molecular aparente de 200.000 em condições não-redutoras (DTT-, painel da direita inferior na Figura 5) . sTNALP-FcDIO recombinante parece consistir principalmente dos homotetrâmeros enzimaticamente funcionais formados pela associação covalente de dois dímeros ligados a dissulfeto sTNALP-FcDIO. testada por digestão com papaína limitada (Figuras 6 - 8). Essa protease é conhecida por clivar as cadeias pesadas de IgG próximas da região de dobradiça e no lado N-terminal das ligações dissulfeto, gerando deste modo fragmentos Fab monoméricos inteiros e dimeros Fc ligados a dissulfeto diméricos. A digestão de sTNALP-FcDIO deveria então liberar dimeros sTNALP enzimaticamente ativos dos dominios Fc intactos (ver Figura 6).
Aliquotas contendo 400 μg de sTNALP-FcDIO foram digeridas com 208 m(Jde papaina-agarose (Sigma) em um tampão fosfato de 20 mM (pH 7,0) contendo 250 μM de ditiotreitol. A digestão foi efetuada a 37 °C por 1 h sob agitação branda. A reação foi interrompida pela remoção das pérolas de papaina-agarose por centrifugação. Naquelas condições, não houve perda significativa da atividade enzimática de sTNALP-FcDIO durante as primeiras 4 h de incubação. sTNALP- FcDlO incubada por uma hora na presença ou ausência de papaina-agarose foi depois analisada por SEC-HPLC em um TSK-Gel G3000WXL (Tosoh Bioscience) em condições não- desnaturantes. A Figura 7 mostra que o produto principal eluindo com uma Mr aparente de 370 KDa não foi mais observado depois de 1 h de digestão com papaina. Naquelas condições, a digestão com papaina gera dois fragmentos principais de 135 KDa e 62 KDa respectivamente. Um pico menor com Mr de 35 KDa também foi observado.
Sob condições SDS-PAGE redutoras (DTT+, Figura 8), o produto da amostra tratada sem papaína foi separado em uma banda principal (102 KDa) (DTT+, papaína-), a qual foi previamente demonstrada como correspondendo ao sTNALP-FcDIO monomérico. Em Western blots, esta banda pode de fato ser marcada com anticorpos tanto para TNALP e o domínio Fc da molécula IgGr (não-mostrado). Depois da digestão da papaína, esta banda é clivada em dois fragmentos principais: 1) a banda de 32 KDa, a qual se liga ao anti-Fc porém não ao anticorpo anti-TNALP e é proposta como correspondente ao fragmento FcDIO; e 2) a banda de proteína larga e difusa (66 - 90 KDa) a qual pode ser marcada com o anticorpo anti-ALP porém não com o anticorpo anti-Fc e é, deste modo, considerada como correspondendo aos monômeros do ectodomínio TNALP. A heterogeneidade deste material é presumivelmente devido à sua glicosilação, uma vez que pode ser reduzido por digestão com peptídeo-N-glicosidase F, a qual também reduz a sua massa molecular aparente até 52 KDa (resultados não mostrados).
Sob condições não-redutoras (DTT-, Figura 8), foi descoberto que sTNALP-FcDIO incubado sem papaína migra em SDS-Page como uma proteína de 216 KDa (DTT-, papaína-, Figura 8). Western blotting também demonstra que esta proteina contém epitopos para as porções TNALP e Fc (resultados não mostrados). Essa espécie molecular foi previamente proposta como consistindo de dimeros de sTNALP- FcDlO ligados por dissulfeto. Como sob condições redutoras, a clivagem da papaina sob condições nào-redutoras (DTT-, papaina+) gera dois fragmentos principais. Em Western blots, o fragmento de 55 KDa pode ser marcado com o anticorpo anti-Fc, porém não com o anti-TNALP. Esse fragmento é mais provavelmente idêntico com a espécie de 62 KDa observada em SEC-HPLC em condições naturais e é proposto para corresponder aos dimeros Fc ligados por dissulfeto. As outras espécies principais co-migram com a banda de proteína principal (66 - 90 KDa) observada durante condições redutoras. Isto é consistente com ela sendo composta de monômeros de ectodomínio de TNALP. Quando analisados por HPLC em condições não-desnaturantes, esses monômeros são não-covalentemente associados nos dimeros de TNALP enzimaticamente ativos eluindo da coluna SEC como as espécies de 135 KDa. EXEMPLO 4
Afinidade comparada para a hidroxiapatita da proteina sTNALP-FcDIO e sALP do rim bovino A afinidade da proteina sTNALP-FcDIO purificada para a hidroxiapatita também foi comparada com aquela da fosfatase alcalina solúvel do rim bovino (tecido nâo-especifico) (Calzyme) usando o seguinte procedimento. TNALP de rim bovino foi usada ao invés de TNALP do osso humano porque ela era comercialmente disponível. Pérolas de cerâmica de hidroxiapatita (Biorad) foram primeiramente solubilizadas em HC1 1 M e o mineral foi precipitado levando de volta a solução até pH 7,4 com NaOH 10 N. A ligação a este mineral reconstituído foi efetuada pela incubação de alíquotas da suspensão mineral contendo 750 μg de mineral com 5 μg de proteína em 100 μL de NaCl 150 mM, fosfato de sódio 80 mM pH 7,4, tampão. As amostras foram mantidas a 21 ± 2 °C por 30 minutos em uma roda giratória. O mineral foi decantado por centrifugação em baixa velocidade e a atividade enzimática total recuperada tanto no pélete mineral quanto o sobrenadante foi medida. A Figura 9 claramente mostra que sTNALP-FcDIO se liga mais eficientemente ao mineral hidroxiapatita reconstituído do que na TNALP do rim bovina. Além disso, a maior parte da proteína sTNALP-FcDIO recombinante introduzida no ensaio foi recuperada pela soma da atividade enzimática recuperada tanto nas frações do fundo quando na que não é do fundo. Isto indica que a ligação da proteína recombinante à fase mineral reconstituída não altera significativamente a sua atividade enzimática. EXEMPLO 5
Modelo de camundongo
Os camundongos Akp2''" foram criados pela inserção do cassete Neo no éxon VI do gene TNALP de camundongo (Akp2) através de recombinação homóloga (Narisawa et al. 1997; Fedde et al. 1999). Essa mutação causou a inativação funcional do gene Akp2 e nenhum RNAm ou proteina TNALP é detectada nesses camundongos nocaute (Narisawa et al. 1997). Fenotipicamente, os camundongos Akp2-/~ mimetizam a HPP da primeira infância severa. Esses camundongos não apresentam fenótipo de hipofosfatsia óbvio no nascimento, os defeitos esqueléticos geralmente aparecendo em ou por volta do dia 6, e piorando daí em diante. Eles retardaram o crescimento com raquitismo, desenvolveram ataques epiléticos e apnéia e reportou-se que morreram entre os dias pós-natal 12 - 16. Como os pacientes HPP, camundongos Akp2"/‘ apresentaram hipofosfatemia devido à deficiência global de atividade TNALP, acúmulo endógeno dos substratos ALP, PPi, PLP e PEA e sofreram de mineralização da matriz esquelética prejudicada levando a raquitismos ou osteomalácia (Feede et al. 1999).
Para entender como os defeitos na fosfatase alcalina podem levar a manifestações neurológicas da doença tanto em humanos quanto em camundongos, deve-se rever o papel e metabolismo da vitamina B6 no SNC. A vitamina B6 é um nutriente importante que serve como um co-fator para pelo menos 110 enzimas, incluindo aquelas envolvidas na biossíntese dos neurotransmissores ácido y-aminobutírico (GABA), dopamina e serotonina. A vitamina B6 pode ser encontrada em três formas livres (ou vitâmeros), isto é, piridoxal (PL), piridoxamina (PM) e piridoxina (PN), todos os quais podendo ser fosforilados aos derivados 5'- fosfatados correspondentes, PLP, PMP e PNP (Jansonius 1998) . A remoção do grupo fosfato é uma função da ALP, e primariamente a da isozima TNALP (Whyte 2001) . Uma vez que somente os vitâmeros desfosforilados podem ser transportados para as células, a atividade TNALP reduzida na hipofosfatasia resulta em aumentos acentuado no PLP plasmático (Whyte et al. 1985; Whyte, 2001) e a deficiência intracelular de PLP em tecidos periféricos e no sistema nervoso central, onde ela leva a níveis cerebrais reduzidos de GABA. Também foi levantada a hipótese de que os ataques epiléticos observados nesses camundongos resultam da disfunção da ácido glutâmico descarboxilase devido a deficiência de PLP (Waymire et al. 1995).
A suplementação de piridoxina suprime os ataques epiléticos dos camundongos Akp2'/-, mas prolonga o seu tempo de vida somente por alguns dias, até os dias pós natal 18 - 22 (Narisawa et al. 2001). Consequentemente, os animais nesse estudo (criadores, amamentadores, filhote de cachorros e animais recém-desmamados) receberam livre acesso a uma dieta de roedor de laboratório modificada 5001 com niveis aumentados (325 ppm) de piridoxina.
Os camundongos Ãkp2'/_ (C57BL/6 12,5% - fundo hibrido de 129J 87,5%) foram mantidos por criação heterozigótica. Os animais, pares de criação ou animais para amamentação com seus filhotes, foram alojados em uma gaiola plástica de fundo sólido ventilada equipada com um sistema de irrigação automático. Todos os animais tiveram acesso livre a uma dieta de roedor de laboratório modificada 5001 com 325 ppm de piridoxina (#48057, TestDiet™). As concentrações máximas permitidas dos contaminantes na dieta (por exemplo, metais pesados, aflatoxina, organofosfato, hidrocarbonetos clorados, PCBs) foram garantidas pelos produtores. Nenhum contaminante conhecido estava presente no material da dieta para influenciar na toxicidade do artigo de teste. EXEMPLO 6 Farmacocinética e distribuição tecidual de sTNALP-FcDIO injetada em camundongos WT Coleta de amostra de sangue
As amostras de sangue foram coletadas em tubos de heparina litio (VWR, #CBD365958), colocadas em gelo por no máximo 20 minutos antes da centrifugação a 2500 g por 10 min em temperatura ambiente. Pelo menos 15 pL de plasma foram transferidos em tubos de 0,5 mL (Sarstedt, #72.699), congelados em nitrogênio liquido e mantidos a -80 °C até serem ensaiados. Se disponível, outros de 50 pL de plasma foram transferidos em tubo de 0,5 mL, inativados a 65 °C por 10 minutos, congelados em nitrogênio liquido e mantidos a -80 °C até serem ensaiados. Qualquer plasma remanescente foi juntado com a aliquota de 15 pL, congelado em nitrogênio liquido e mantido a -80 °C até o ensaio. Determinação de sTNALP-FcDIO plasmática
A presença de sTNALP-FcDIO em amostras de plasma foi avaliada até o final do tratamento usando um ensaio enzimático colorimétrico. A atividade enzimática foi determinada usando um substrato cromogênico onde o aumento da absorvância é proporcional à conversão do substrato em produtos. A reação foi efetuada em 100 pL de tampão NaCl 50 mM, tampão Bis Tris propano 20 mM (HC1) pH 9 contendo MgCl2 0,5 mM e ZnCl2 50 pM ao qual foram adicionados 10 pL de amostra de plasma diluida. 0 p-nitrofenil do substrato ALP foi adicionado por último em uma concentração final de 1 mM para iniciar a reação. A absorvância foi registrada a 405 nm a cada 4 5 segundos por um periodo de vinte minutos usando um leitor de placa Spect ramaxTK190 (Molecular devices). A atividade enzimática de sTNALP-FcDIO expressa como uma taxa inicial da reação foi avaliada pelo ajuste da inclinação mais ingreme pelos 8 valores de leitura adjacentes. Padrões foram preparados com concentrações variadas do artigo de teste e a atividade enzimática foi determinada conforme descrito acima no Exemplo 1. A curva padrão foi gerada pela delineação do log da taxa de velocidade inicial em função do log das quantidades padrões. A concentração de sTNALP-FcDIO das diferentes amostras plasmáticas foi lida diretamente a partir da curva padrão usando suas respectivas atividades enzimáticas. Determinação do PPi plasmático
Os niveis circulantes de PPi foram medidos no soro obtido a partir da punctura cardíaca usando diferentes absorções em carvão vegetal ativado de UDP-D- [6-3H]glicose (Amersham Pharmacia) a partir do produto reacional de 6- fosfo[6-5H]gliconato, conforme anteriormente descrito (Johnson et al. 1999). Meia-vida e distribuição tecidual de sTNALP-FcDIO
Em camundongos WT adultos, a meia-vida e a distribuição tecidual de sTNALP-FcDIO injetado em camundongos foram determinadas. A Figura 10 resume sua farmacocinética e a distribuição tecidual depois de uma única injeção intravenosa de massa de 5 mg/Kg em camundongos WT adultos.
A meia-vida foi de 34 h no sangue com um acúmulo de sTNALP-FcDIO [125]-marcado em ossos de até 1 μg/g do osso (peso úmido). Essa meia-vida é comparável com aquela observada anteriormente em testes clínicos reportados como não sendo bem sucedidos. Os níveis de material direcionado a osso pareceram bem estáveis, uma vez que nenhum decréscimo significativo no sTNALP-FcDIO radiomarcado foi observado durante o experimento. Nenhum acúmulo de sTNALP- FcDlO foi observado no músculo, uma vez que a quantidade de enzima radiomarcada naquele tecido diminuiu juntamente com aquela da atividade sTNALP-FcDIO enzimática no sangue.
Em camundongos recém-nascidos. Uma vez que os camundongos Akp2~/_ morreram entre os dias 12 - 16 e a injeção i.v. não é praticável em tais camundongos jovens, a análise farmacocinética de sTNALP-FcDIO no soro foi repetida usando as vias i.p. e s.c. em camundongos recém- nascidos WT usando uma dose de 3,7 mg/Kg. A via i.p. foi considerada como sendo inadequada devido à alta pressão na cavidade abdominal levando a perdas imprevisíveis pelo sitio de injeção (Figura 11 A). A via s.c. foi mais reprodutível em camundongos recém-nascidos, conforme visto experimento PK da Figura 11 B. Os parâmetros farmacocinéticos de sTNALP-FcDIO em camundongos recém- nascidos e adultos são reportados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Parâmetros farmacocinéticos de sTNALP-FcDIO em camundongos WT recém-nascidos. Parâmetro Recém-nascidos
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Esses dados de PK, analisados pelo software WinNonlin™ PharsightCorporation, Mountain View, CA) foram usados para prever os níveis sanguíneos circulantes de sTNALP-FcDIO alcançados depois de injeções s.c. diariamente repetidas. sTNALP-FcDIO circulante atingiu concentrações no soro de estado constante oscilando entre os valores Cmin e Cmax de 26,4 e 36,6 pg/mL, respectivamente (Figura 12). O estado constante foi alcançado depois de 5 a 6 doses diárias de 10 mg/Kg. A validade da previsão foi testada experimentalmente depois de 5 injeções diárias de 10 mg/Kg de sTNALP-FcDIO.
No dia da injeção, o genótipo dos camundongos não pode ser distinguido. Ele foi depois determinado, o qual entre os camundongos testados estavam heterozigóticos ou homozigóticos. Não houve diferença comportamental de todos o genótipos diferentes. Quando a atividade ALP circulante foi medida 24 h depois da última injeção, a saber no dia 6 (Cmin), uma boa concordância foi observada entre as concentrações experimental e prevista (Figura 13). Nesses animais com 5 dias de idade não-tratados, os niveis de TNALP no soro foram de 0,58 ug/mL. Esses niveis diminuirão com a idade. Deste modo, foi calculado que o regime de injeção permitiu o acúmulo até as concentrações de soro no estado constante de sTNALP-FcDIO aproximadamente 50 vezes mais do que as concentrações de TNALP normais. EXEMPLO 7 Concentração de sTNALP-FcDIO em ossos de camundongos WT adultos depois da administração intravenosa da massa
Uma dose de sTNALP-FcDIO de 5 mg/Kg foi administrada i.v. em camundongos WT adulto 129J. A concentração sTNALP- FcDlO no osso em T = 25 horas foi a seguinte: 0,64 μg/g na calvária; 1,33 μg/g nas tibias; e 1,37 μg/g nos fêmures, para uma concentração média de 1,11 μg/g. Em ratos, os tecidos ósseos representam 16,3% da massa total. É esperado que essa porcentagem também seja encontrada nos camundongos. O peso corporal dos camundongos usado para esse experimento foi de 18,4 g. O peso tecidual ósseo calculado desses camundongos foi, deste modo, de cerca de 18,4 g x 0,163 = 3,00 g. A quantidade calculada de sTNALP- FcDlO nos tecidos ósseos foi de 3,33 μg. A porcentagem da dose injetada nos tecidos ósseos foi, deste modo, de (3,33 μg/(5 μg/g * 18,4 g))*100 = 4%.
A concentração de sTNALP-FcDlO nos ossos em T = 96 horas foi a seguinte: 0,83 μg/g na calvária; 1,33 μg/g nas tibias; e 1,63 μg/g nos fêmures, para uma concentração média de 11,26 μg/g. O peso corporal dos camundongos usados para esse experimento, deste modo, foi de cerca de 17,8 g x 0, 163 = 2,90 g. A quantidade de sTNALP-FcDlO nos tecidos ósseos dos camundongos foi, deste modo, de 3,66 μg. A porcentagem da dose injetada nos tecidos ósseos foi, deste modo, de (3,66 μg/(5 μg/g * 17,8 g))*100 = 4%. EXEMPLO 8 Concentração de sTNALP-FcDlO em ossos de camundongos WT recém-nascidos depois de 15 dias de injeção subcutânea de massa
Uma dose de sTNALP-FcDlO de 4,3 mg/Kg foi administrada subcutaneamente em camundongos WT recém-nascidos 129J todos os dias por 15 dias para uma quantidade administrada total de 65 mg/Kg. A concentração sTNALP-FcDlO nos ossos em T = 24 horas foi a seguinte: 6,45 μg/g na calvária; 3,05 μg/g nas tibias; e 3,71 μg/g nos fêmures, para uma concentração média de 4,40 μg/g. 0 peso corporal dos camundongos usados para esse experimento foi de cerca de 9,83 g. O peso de tecido ósseo calculado desses camundongos foi, deste modo, de cerca de 9,83 g x 0,163 = 1, 60 g. A quantidade de sTNALP-FcDIO em tecidos ósseos de camundongos naquele tempo foi, deste modo, de cerca de 7,04 μg. A porcentagem da dose injetada nos tecidos ósseos foi, deste modo, de (7,04 μg/(65 μg/g * 9,83 g))*100 = 1%.
A concentração de sTNALP-FcDIO nos ossos em T = 168 horas foi a seguinte: 5,33 μg/g na calvária; 1,37 μg/g nas tibias; e 1,88 μg/g nos fêmures, para uma concentração média de 2,86 μg/g. O peso corporal dos camundongos usados para esse experimento foi de 14,0 g. O peso de tecido ósseo calculado desses camundongos foi, deste modo, de cerca de 14,0 g x 0,163 = 2, 28 g. A quantidade de sTNALP-FcDIO em tecidos ósseos de camundongos naquele tempo foi, deste modo, de cerca de 6,52 μg. A porcentagem da dose injetada nos tecidos ósseos foi, deste modo, de (6,52 μg/(65 μg/g * 14 g))*100 = 0,7%. A Tabela 3 abaixo resume os resultados dos Exemplos 7 e 8. Tabela 3: Concentração média de sTNALP-FcDIO e a porcentagem da dose injetada nos ossos
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EXEMPLO 9
Eficácia a curto prazo (15 dias) das baixas doses (1 mg/Kg) de sTNALP-FcDIO para HPP em camundongos Akp2~z~ As injeções s.c. diária de STNALP-FCDIQ foram efetuadas por 15 dias em camundongos Akp2'z" usando 1 mg/Kg. Os grupos de tratamento forma constituídos a partir de 19 liteiras. Os camundongos Akp2“z' receberam veiculo (N = 13) ou sTNALP-FcDIO (N = 12) . Os controles consistiam de 15 camundongos WT (um por liteira) . Os controles não foram submetidos às injeções. Sangue foi coletado 24 horas antes da última injeção, conforme descrito no Exemplo 6. Figura 14 mostra que as atividades enzimátcas no soro no dia 16 foram levemente acima do nível de detecção.
Apesar dos baixos valores do soro para sTNALP-FcDIO, os níveis de PPi no soro foram corrigidos (Figura 15). Camundongos Akp2'/_ não-tratados tinham concentrações de PPi no soro de 1,90 + 064 μmol/mL, enquanto que camundongos Akp2-/" tratados tinham níveis de 1,41 ± 0,30 μmol/mL, comparáveis aos dos camundongos WT (1,52 ± 0,35 μmol/mL).
As placas de crescimento da tíbia proximais mostraram certo alargamento da região hipertrófica nos animais Akp2'/" em comparação com os animais WT (veículo comparável com tipo selvagem na Figura 16) . A mesma observação feita inicialmente nessa cepa de camundongos Akp2~/" (Hessle et al. 2002) é consistente com raquitismo. Uma tendência em direção à normalização da morfologia fiseal foi observada em animais tratados com sTNALP-FcDIO para 15 dias (Figura 17) em comparação com o veículo (não-tratado). EXEMPLO 10 Eficácia de curto prazo (15 dias) de altas doses (8,2 mg/Kg) de sTNALP-FcDIO para HPP em camundongos Akp2~z~ Para avaliar 15 dias de injeções s.c. diárias usando uma dose significativamente mais alta de sTNALP-FcDIO (8,2 mg/Kg) no crescimento e mineralização óssea, os camundongos de 20 liteiras (total de 141 camundongos) foram usados. Eles foram distribuídos em dois grupos: 1) foi dado aos camundongos Akp2-/~ veículo (N = 19) ; 2) camundongos Akp2-/" tratados com sTNALP-FcDIO (N = 20) ; adicionalmente, houve um camundongo WT por liteira não-tratado (N = 18).
Peso corporal Camundongos Akp2'/_ cresceram mais lentamente do que os camundongos WT. No dia 1, nenhuma diferença estatística nos pesos corporais foi observada entre os animais com veiculo, sTNALP-FcDIO e WT. Entretanto os pesos corporais médios diários divergiram no dia 6 (Figura 18). A diferença entre WT (4,2 ± 0,6 g) e o veiculo (3,7 ± 0,7 g) obteve significância estatística (p = 0,0217) no dia 6; porém a diferença entre os valores tratado de veículo (5,9 ± 1,0 g) e sTNALP-FcDIO (6,7 ± 1,0 g) alcançou significância estatística no dia 11 (p = 0,04), com o grupo tratado paradoxalmente mais pesado do que WT. No dia 16, o peso médio corporal dos animais tratados (8,2 ± 1,1 g) e WT (8,4 + 0,8 g) não foram estatisticamente diferentes. Os animais tratados com sTNALP-FcDIO tinham pesos corporais estatisticamente maiores (p = 0,026) do que aqueles tratados com veículo (6.6 ± 1,4 g) . Nenhuma diferença significativa entre os grupos ERT e WT foi observada para o peso corporal em qualquer ponto de tempo. Comprimento ósseo
No final desse experimento (dia 16) , o comprimento da tíbia fornecem uma medida adicional do benefício esquelético para os camundongos Akp2-/~. O comprimento da tíbia com ERT foi de 12,6 ± 0,7 mm e mais logo (p = 0,0135) em comparação com os animais os quais receberam veiculo (11,7 + 1,1 mm) (Figura 19). Uma diferença estatística (p = 00267) também foi obtida quando o comprimento do fêmur foi comparado entre os grupos sTNALP-FcDIO (9,2 ± 0,4 mm) e veiculo (8,6 ± 0,8 mm). Nenhuma diferença estatística foi verificada para o comprimento da tíbia ou do fêmur do ERT em comparação com os camundongos WT. Uma conservação parcial (isto é, prevenção parcial da redução no crescimento ósseo que se torna evidente por cerca de duas semanas de idade) do crescimento da tíbia e do fêmur foi observada através de medições do comprimento na necropsia (Figura 19).
Em todos os animais, exceto em 5, níveis detectáveis, porém altamente variáveis de sTNALP-FcDIO foram encontrados no plasma de camundongos Akp2~z~ tratados no dia 16 (Figura 20). As concentrações de TNALP circulantes em animais normais são dadas para fins de comparação. Mineralização óssea
As avaliações cegas de imagens Faxitron™ das patas e caixas torácicas distinguiram dois graus de severidade nos defeitos de mineralização nos camundongos Akp2'/" (Figura 21) . Camundongos severamente afetados (Severo) tinham uma ausência dos ossos digitais (falanges) e centro de ossificação secundários. Camundongos moderadamente afetados (Moderados) tinham centros de ossificação secundários anormais, porém todos os ossos digitais estavam presentes. Camundongos WT (Saudáveis) tinham todas as estruturas ósseas presentes com a arquitetura normal. Imagens radiográficas das patas posteriores foram semelhantemente classificadas como anormais se houvesse evidência de fraturas agudas ou crônicas, ou saudáveis na ausência de quaisquer descobertas anormais (Figura 21). Os defeitos de mineralização minimizados ERT nas patas documentados pela quantidade de camundongos Akp2'z' com vários defeitos, consistindo de 5 no grupo não tratado ainda 0 no grupo ERT (Tabela na Figura 21). Qui-quadrado foi significativo (p 0,05), indicando que ERT reduziu a gravidade dos defeitos ósseos adquiridos. Devido ao fato de que pacientes HPP na primeira infância severamente afetados geralmente morrem de costelas desmineralizadas e fraturadas incapazes de suportar a respiração, os tórax também foram detalhadamente examinados. ERT também reduziu a incidência de caixas torácicas severamente dismórficas (Tabela na Figura 21). A análise de qui-quadrado foi significativa em p 0,025. Semelhantemente, as patas posteriores aparentaram saudáveis em todos os animais tratados (Tabela na Figura 21) . A análise de qui-quadrado foi significativa em p 0,025.
As mandíbulas de camundongos com 16 dias de idade foram fixados por imersão de um dia para o outro em solução de aldeído tamponado com cacodilato de sódio e cortadas em segmentos contendo o primeiro molar, o incisivo subjacente 5 e o osso alveolar circundante. As amostras foram desidratadas através de uma serie de etanóis graduados e infiltradas ou com resina acrílica (LR White) ou de epóxi (Epon 812), seguido por polimerização dos blocos de resina contendo tecido a 55 °C por 2 dias. Seções finas (1 pm) 10 foram cortadas em um ultramicrótomo usando uma faca de diamante, e seções montadas em lâminas de vidro foram marcadas para mineral usando nitrato de prata 1% (marcação vos Kossa, negra) e contramarcadas com azul de toluidina 1%. As seções frontais pelas mandíbulas (no mesmo nível da 15 maior das raízes médias do primeiro molar) forneceu molar longitudinalmente seccionado e incisivo seccional de modo cruzado para análise histológica comparativa.
O exame histológico dos dentes de camundongos Akp2-/~ mostra o tecido da dentina fracamente mineralizado e muito 20 pouco cemento entre o ligamento periodontal e a dentina em comparação com animais tipo selvagem (Figura 22, comparar o veículo Akp2~z‘ e WT-normal) . A mineralização da dentina restaurada e a formação de cemento também são mostradas na Figura 22 (Akp2'/_ tratado vs. WT-normal). EXEMPLO 11 Eficácia de longo prazo (52 dias) de altas doses (8,2 mg/Kg) de sTNALP-FcDIO para HPP em camundongos Akp2~z~
Finalmente, para avaliar a sobrevivência de longo prazo e a mineralização óssea em camundongos Akp2”z“, ou sTNALP-FcDIO (8,2 mg/Kg) ou veiculo foram dados diariamente por 52 dias (injeções s.c.). Sobrevivência, atividade e aparência de camundongos
Camundongos tratados tinham uma sobrevivência média de 18,5 dias (Figura 23), enquanto que a sobrevivência foi dramaticamente aumentada com ERT e este tratamento também preservou a atividade normal e aparência saudável (Figura 24) dos camundongos tratados. Mineralização óssea
Radiografias das patas de camundongos Akp2-/~ de 16 dias de idade mostraram defeitos de ossificação secundários que são uma marca registrada da doença (ver Figura 25) . Esses defeitos foram evitados em todos os camundongos tratados por doses diárias de sTNALP-FcDIO por 46 ou 53 dias (Figura 25). Atividade ALP
Os níveis de atividade plasmática foram medidos em camundongos Akp2-/“ tratados depois de 53 dias. A Figura 26 mostra que a maior parte dos valores estava entre 1 e 4 μg/mL da atividade ALP. Entretanto, três animais tinham níveis ALP não-detectáveis.
Interessantemente, ao contrário dos camundongos onde uma concentração de soro de estado constante de sTNALP- FcDlO foi obtida, uma grande variabilidade nos níveis de soro de ALP foi medida nos camundongos Akp2"/_ tratados. EXEMPLO 12 Eficácia de longo prazo de diferentes intervalos de dosagem de sTALP-FcDlO em camundongos Akp2-/~
Camundongos Akp2-/‘ recém-nascidos foram injetados com 4,3 mg/Kg diariamente (Tx-1), 15,2 mg/Kg a cada 3 dias (Tx- 3) ou 15,2 mg/Kg a cada 7 dias (Tx-7) de sTNALP-FcDIO. O tratamento foi efetuado por 43 dias e os camundongos foram sacrificados no dia 44, a saber, 24 horas depois da última injeção. Eles foram monitorados para avaliar qualquer melhoria de suas sobrevivências e mineralização do esqueleto. Sobrevivência dos camundongos
A sobrevivência dos camundongos tratados foi aumentada em comparação com os camundongos que foram injetado com veículo (Figura 27). Esse aumento foi estatisticamente significativo (p< 0,0001). Não houve diferença estatisticamente significativa quando as curvas de sobrevivência dos grupos tratados foram comparadas entre 18 0 si. Mineralização óssea A) Para cada tratamento, as radiografias das patas foram analisadas e distribuídas ente normais e anormais. Os 5 números e porcentagens (entre parênteses) aparecem na Tabela 4 abaixo. Os defeitos de mineralização óssea foram avaliados no dia 23 e no final do estudo (Dias 23 - 45). Tabela 4: Distribuição das radiografias das patas
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No estudo médio, sTNALP-FcDIO administrado a 15,2 mg/Kg a cada 3 dias, os defeitos de mineralização óssea apareceram em 79% dos camundongos. Essa taxa da normalização atingiu significância estatística em comparação com a taxa de 50% de normalização avaliada nos camundongos tratados com 15,2 mg/Kg a cada 7 dias (Qui- quadrado; p = 0, 0596) . Nenhuma outra comparação entre tratamentos foram estatisticamente significativas ou se aproximaram da significância.
No final do estudo a porcentagem de normalização melhorou em todos os grupos tratados em comparação com a normalização porcentual avaliada no dia 23. 0 teste qui- quadrado comparando a distribuição entre todos os tratamentos sTNALP-FcDIO não foi significativo (p = 0,1844). A taxa de 100% de normalização observada nos camundongos tratados a cada três dias obteve significância estatística em comparação com a taxa nos camundongos tratados diariamente (83%, p = 0,0634) ou a cada 7 dias (85%, p = 0,0789).
Entretanto, em todos os grupos de tratamento, uma proporção significativa dos animais classificados como anormais no dia 23 melhoraram e se tornaram normais no final do estudo. No grupo de tratamento diário, 3 dos 6 animais ficaram normais; nos camundongos tratados a cada três dias 4 de 4 melhoraram, e finalmente no grupo de tratamento semanal, 7 de 10 ficaram normais. Embora os intervalos de dosagem fornecessem resultados satisfatório, os melhores resultados foram obtidos quando a quantidade diária resultante foi a mais alta. EXEMPLO 13
Eficácia a longo prazo de altas doses (8,2 mg/Kg) de sTNALP-FcDIO em camundongos Akp2-Z~ de 15 dias de idade Estudos de eficácia conforme descritos no Exemplo 11 foram efetuados em camundongos com 15 dias de idade os quais começaram a manifestar defeitos no esqueleto conforme observado em descrições de raio-X das patas (ver Exemplo 11, Figura 25). sTNALP-FcDIO foi administrado até o final do estudo. Os animais foram monitorados para avaliar qualquer melhoria de suas sobrevivências, peso corporal e mineralização do esqueleto. Sobrevivência dos camundongos
Injeções diárias, iniciando no dia 15, de 8,2 mg/Kg de sTNALP-FcDIO em camundongos Akp2"z- aumentaram as suas sobrevivências em comparação com os camundongos que foram injetados com veiculo (Figura 28). Este aumento foi estatisticamente significativo (p < 0,05). Peso corporal
No início do estudo, nenhuma diferença significativa no peso corporal foi verificada entre os grupos (Figura 29). No início do tratamento (dia 15), o peso corporal dos camundongos Akp2‘z‘ foi menor do que aquele dos animais selvagens. Embora o peso corporal dos animais injetados com veiculo continuou a diminuir, os camundongos Akp2-/“ tratados com sTNALP-FcDIO começaram a ganhar peso de 4 a 5 dias depois do inicio do tratamento e continuaram a ganhar peso até o final do estudo, sem entretanto atingir os valores dos animais tipo selvagem. Este ganho de peso sugere uma melhoria no bem estar dos animais tratados com sTNALP-FcDIO.
Mineralização óssea
Para cada tratamento, as radiografias das patas foram analisadas e distribuídas entre normais e anormais. Os números e porcentagens (entre parênteses) aparecem na Tabela 5. AS radiografias foram tiradas na necropsia.
O tratamento dos camundongos Akp2‘z~ com 8,2 mg/Kg de sTNALP-FcDIO diariamente, iniciando no dia 15 depois do nascimento, melhorou a mineralização conforme observado a partir da radiografia das patas tiradas na necropsia. O grupo tratado com sTNALP-FcDIO apresentou 41% de animais normais na necropsia em comparação com 12% no grupo injetado com veiculo dos camundongos Akp2-/'. Esta diferença quase que atingiu significãncia estatística (p = 00645 no teste qui-quadrado) . Tabela 5: Distribuição das radiografias das patas
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EXEMPLO 14 Eficácia a longo prazo de diferentes intervalos de dosagem de sTNALP-FcDlO no socorro dos camundongos Akp2-/~
Os camundongos foram iniciados no tratamento no dia 12 e injetados s.c. com veiculo (RV), 8,2 mg/Kg diariamente nos dias 4 6/47 (RTc-1) ou injetados com 8,2 mg/Kg diariamente por 7 dias seguido por 24,6 mg/Kg a cada 3 dias (RTx-3) ou seguido por 57,4 mg/Kg a cada 7 dias (RTx-7). A sobrevivência média foi de 19, 5 dias para os camundongos
RV, 21,0 dias para os camundongos RTx-7, 30,5 dias para os camundongos RTx-3 e 37,5 dias para os camundongos RTx-1. Em todos os casos, a sobrevivência foi estatisticamente aumentada em comparação com aquela do grupo tratado com controle. Existe um beneficio claro de ERT em camundongos Akp2-/- com hipofosfatasia bem estabelecida. A dosagem menos frequente do que a diária também parece aumentar estatisticamente a sobrevivência. EXEMPLO 15 Um Estudo da Toxicidade da Injeção Intravenosa da Dose 20 Tolerada Máxima em Ratos Sprague-Dawley Jovens
O objetivo do estudo foi determinar a doe máxima tolerada (MTD) e a toxicidade do artigo de teste, sTNALP- FcDlO, após a administração repetida em ratos Sprague- Dawley juvenis por injeção intravenosa. Nos Exemplos 15 a 5 18, o sALP-FcDIO usado é aquele especificamente descrito na Figura 3. sTNALP-FcDIO foi administrada a ratos Sprague-Dawley jovens (com idade no inicio entre 22 e 24 dias) uma vez por semana a cada quatro semanas por injeção intravenosa 10 conforme descrito na Tabela 6 abaixo: Tabela 6: Design de Estudo
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Por todo o estudo, os animais foram monitorados em relação à mortalidade, peso corporal e condição clinica. Avaliações de hematologia, coagulação e quimica clinica foram efetuadas em todos os animais. Terminalmente, os ratos foram eutanasiados e submetidos à necropsia. Para cada animal, as amostras dos tecidos selecionados foram retidas e foram submetidas ao processamento histológico e exame microscópico.
Não houve mortalidade nesse estudo e não houveram alterações relacionadas ao artigo de teste nos parâmetros 5 de coagulação ou pesos de órgãos. Os pesos corporais dos machos de Alta Dose, particularmente, foram 10% mais baixos do que os de Baixa Dose, sugerindo um efeito relacionado com o tratamento.
Nenhum sinal clínico foi observado nos animais dos 10 Grupos 1 e 2 a primeira ocasião da dosagem. Nos animais dos grupos 3 e 4, entretanto os animais aparentaram roais fracos imediatamente após a dosagem e alguns animais do grupo 4 apresentaram um decréscimo de leve a moderado na atividade. Um leve inchaço dos membros, parte externa do ouvido e 15 focinho com descoloração da pele (de aparência vermelha ou azul) nas extremidades também foram observados nos dois grupos. Outros sinais clínicos observados nos animais do Grupo 4 incluem arranhadura, poliereção e hiperpnéia excessiva. Sinais clínicos registrados para os animais dos Grupos 1 e 2 na ocasião da segunda dosagem (Dia 8) foram inchaço dos membros, parte externa do ouvido e focinho com descoloração da pele (de aparência vermelha ou azul) nas extremidades. Sinais clínicos semelhantes do inchaço da pele foram, também registrados na terceira e na quarta ocasião da dosagem (Dias 15 e 22) para os mesmos grupos de animais. Na quarta ocasião de dosagem (Dia 22) uma leve hiperatividade foi observada nas fêmeas do Grupo 1, ao passo que a hipoatividade foi observada nos machos do Grupo 2. Para os animais dos Grupos 3 e 4, os sinais clinicos da atividade motora, piloereção, hiperpnéia e inchaço dos membros, parte externa do ouvido e focinho reduzidos com a coloração da pele ficaram mais evidentes conforme a dosagem progrediu da primeira ocasião da dosagem para a quarta. É considerado que esses sinais clinicos foram relacionados ao tratamento. Nos dias 16 a 19 e no Dia 23, o leve inchaço e a coloração da pele da parte externa do ouvido (de aparência vermelha) foram observados em um animal (Grupo 1). Sinais clinicos semelhantes foram observados em outro animal (Grupo 2) no dia 23.
Os sinais clinicos foram agudos e a severidade aumentou conforme a dosagem progrediu, porém eles foram temporários. Todos o sinais clinicos apareceram dento de 50 minuto depois da administração do artigo de teste, sTNÃLP- FcDlO, com alguns animais recuperando dentro de aproximadamente trinta minutos a 2 horas. Par aos outros animais, a recuperação foi completa na manhã seguinte (o tempo de observação agendado seguinte).
Houve um decréscimo relacionado ao tratamento na contagem das plaquetas (PLT) para machos e fêmeas de todos os grupos de tratamento, medido depois da última dose, em comparação com os valores de fundo. Houve um aumento nos reticulócitos predominantemente na porcentagem, mas também absoluto que foi verificado geralmente era animais tratados nos três niveis de dose mais elevados.
Os niveis da fosfatase alcalina no soro foram mais altos do que poderiam ser quantificados pelo instrumento analítico mesmo após a diluição. Os resultados que estavam disponíveis para as fêmeas de Baixa Dose foram dramaticamente superiores do que a faixa de fundo. Isto era esperado, uma vez que o artigo de teste é uma ALP modificada ativa.
Macroscopicamente, o foco escuro/área e/ou área abaixada do estômago glandular foram observados em 3 dos 6 animais do Grupo 3 (2 machos/1 fêmea) e 4 de 6 dos animais do Grupo 4 (2 machos/2 fêmeas).
Microscopicamente, a erosão de mínima para branda/úlcera do estômago glandular, ocasionalmente associada com edema da submucosa foi verificada em 3 dos 6 animais do Grupo 3 (2 machos/1 fêmea) e 4 dos 6 animais do grupo 4 (2 machos/2 fêmeas),correlacionando com as descobertas principais.
Como conclusão, a injeção intravenosa de sTNALP-FcDIO em ratos Sprague-Dawley jovens uma vez por semana durante 4 semanas não causou a morte em qualquer um dos niveis de dose testados, porém causou sinais clínicos adversos, alterações hematológicas mínimas e erosão/ulceração do estômago glandular, ocasionalmente associada com edema da submucosa em níveis de dose de 90 e 180 mg/Kg.
Alterações relacionadas com a administração do artigo de teste nos dois níveis de dose mais baixos testados (10 e 30 mg/Kg) foram limitadas aos sinais clínico transientes aparentes somente no dia da dosagem. Os sinais clínicos foram mais severos no nível de 90 mg/Kg de dose, porém eles também foram transientes. Os sinais clínicos notados nos animais tratados com 180 mg/Kg foram muito severos de modo a evitar o uso desse nível de dose em estudos futuros. Consequentemente, o nível de dose recomendado mais alta para estudos a logo prazo subsequentes é de 90 mg/Kg. EXEMPLO 16
Um Estudo de Dose Tolerada Máxima de Injeção e Infusão Intravenosa em Macacos Cinomólogos Juvenis O propósito deste estudo foi determinar a dose máxima tolerada para sTNALP-FcDIO, quando administrada uma vez por injeção ou infusão intravenosa em macaco cinomólogos jovens. As formulações de dosagem do artigo de teste foram administradas uma vez de modo incremental, conforme indicado na Tabela 7 abaixo. Tabela 7: Design de Estudo
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Depois do último tratamento, os animais foram liberados do estudo. Parâmetros monitorados durante o estudo foram a mortalidade, observações clinicas,pesos corporais, suscetibilidade, toxicocinética, hematologia e 5 quimica clinica.
Nenhuma mortalidade, sinais clinicos adversos ou efeito nos pesos corporais foram observados durante o estudo. Um aumento proporcional da dose acentuado na fosfatase 10 alcalina foi observado em todos os animais durante o estudo. Uma vez que o artigo de teste foi uma fosfatase alcalina sintética, esse aumento foi principalmente devido à presença do fármaco na corrente sanguínea dos animais depois de cada dosagem.
Aumentos na alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase foram observados nos três animais durante o estudo, porém na ausência de uma necropsia, a significância toxicológica dessa descoberta é incerta.
A farmacocinética de sTNALP-FcDIO foi bem caracterizada após uma única administração IV de 5, 15, 45, 90 e 180 mg/Kg a macacos. Para as injeções IV, os valores AUC°° médios variaram de 797 a 2950 mg.h/L e os valores Cmax médios variaram de 65 a 396 mg/L durante o estudo da faixa de dose. Para as infusões, a AUC°° média variou de 9410 a 48400 mg.h/L e a Cmax variou de 1230 a 7720 mg/L na faixa de dose estudada.
Valores de tl/2 médios de sTNALP-FcDIO aparentaram diminuir com o aumento dos níveis de dose de sTNALP-FcDIO. Embora a depuração sistêmica de sTNALP-FcDIO tenha sido relativamente consistente pelos níveis de dose, o grupo de dose de 90 mg/Kg aparentou ser um desvio farmacocinético com uma depuração substancialmente mais baixa em comparação com os outros níveis de dose (aproximadamente de cinco vezes) . Nenhuma tendência relacionada ao gênero óbvia foi observada. Em resumo, embora certas alterações guímicas sanguíneas reversíveis foram observadas durante o estudo, a injeção/infusão intravenosa de sTNALP-FcDIO em até 180 mg/Kg foi bem tolerada em macacos cinomólogos juvenis. Consequentemente, sob as condições deste estudo, a Dose Máxima Tolerada foi considerada como sendo de pelo menos 180 mg/Kg. EXEMPLO 17
Um Estudo de Toxicidade de Injeção Intravenosa de 4 semanas (uma vez por semana) de sTNALP-FcDIO no Rato Albino Jovem seguido por um Período de Recuperação de 28 Dias
O objetivo deste estudo foi investigar a toxicidade potencial de sTNALP-FcDIO dada uma vez por semana por injeção intravenosa aos ratos jovens por um mínimo de 4 semanas consecutivas (total de 4 doses) seguindo por 28 dias de recuperação. Os animais foram dosados nos dias de 10 estudo 1, 8, 15 e 22 e o período de recuperação começou no dia de estudo 29. O design do estudo está detalhado na Tabela 8 abaixo. Tabela 8: Design do Estudo
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Os seguintes foram avaliados: sinais clínicos (duas vezes por dia), peso corporal (uma vez durante o período de aclimatação e semanalmente iniciando no dia 21 após o parto), consumo de ração (semanalmente), oftalmologia (fim 5 do tratamento e fim do período de recuperação), hematologia (na necropsia), química do soro (na necropsia), urinálise (dia 29 e no final do período de recuperação), marcadores bioquímicos da renovação óssea: osteocalcina )marcador de formação óssea) e C-telopeptídeo (marcador de reabsorção óssea) (a manhã anterior da necropsia agendada), avaliação de anticorpo (Dia 1 e na necropsia) , avaliação da concentração sanguinea do artigo de teste (Dia 16 e Dia 23), densiometria óssea (por DXA in vivo no dia 1 e 28, animais de estudo de recuperação e principal e Dia 14 e Dia 56 - animais de estudo e recuperação e pQCT ex vivo) , observações radiográficas e macroscópicas na necropsia, pesos de órgãos e histopatologia.
Um macho ao qual foram dados 90 mg/Kg/dose foi encontrado morto no dia de estudo 25. Uma vez que nenhuma observação histológica como consequência (hemorragias pulmonar e timica graduadas respectivamente como leve e minima) foram feitas para este rato, sua causa de morte foi indeterminada baseando-se nas investigações patológicas. No dia 23, este animal foi sangrado para o teste de avaliação da concentração sanguinea do artigo e este procedimento pode ter contribuído para esta morte, uma vez que não houve evidências de toxicidade no dia 22. Não houve mortalidade relacionada com Stnalp-fCdlO ou efeitos na oftalmologia, urinálise, marcador de formação óssea (osteocalcina), pesos de órgãos, patologia principal, radiologia ou exames de microscopia.
Sinais clínicos relacionados com sTNALP-FcDIO observados nos grupos de 3, 30 e/ou 90 mg/Kg/dose são considerado como sendo reação de infusão aguda. Esses incluíam olhos parcialmente fechados, tônus muscular reduzido, deitar de lado com uma postura curvada, frios ao toque, movimentos descoordenados, atividade reduzida, passo anormal e/o patas traseiras e/ou patas dianteiras azuis, vermelhas e/ou firmes durante observações de lado da gaiola em 5, 15, 30 e/ou 60 minutos após a dose. Essas observações foram temporárias e não ocorreram nos dias sem dosagem ou durante o período de recuperação.
Geralmente, uma tendência para o peso corporal levemente reduzido e o ganho de peso corporal foi verificada em machos nos grupos de 3, 30 e/ou 90 mg/Kg/dose durante o período de recuperação. O efeito no tamanho ósseo nos dois ossos do esqueleto apendicular (fêmur e na tíbia) foram correlacionados com os pesos corporais reduzidos. Reduções no consumo de alimentos foram geralmente consistentes com os pesos corporais reduzidos.
Os pesos corporais foram comparáveis com os controles para as fêmeas tratadas com sTNALP-FcDIO. sTNALP-FcDIO administrada na dose de 90 mg/Kg/dose foi geralmente associada com leves diferenças em neutrófilos,monócitos e/ou eosinófilos absolutos em comparação com o grupo de controle. Adicionalmente, leves aumentos nos linfócitos, plaquetas e reticulócitos absolutos foram observados em comparação com o grupo de controle. No final do período de recuperação, essas leves mudanças ainda eram aparentes nos animais tratados com 90 mg/Kg. sTNALP-FcDIO foi geralmente associado com aumentos relacionados com a dose estatisticamente significativos na fosfatase alcalina em todo os grupos tratados em comparação com os controles. Considerando a natureza do artigo de teste (fosfatase alcalina), a ausência de quaisquer alterações em outras enzimas hepáticas e ausência de correlates histopatológicos, esses aumentos são provavelmente atribuídos aos níveis circulantes de sTNALP- FcDlO. Leves aumentos estatisticamente significativos no fósforo foram observados em machos tratados com sTNALP- FcDlO em 90 mg/Kg/dose durante a Semana 4, associado com aumentos não-significativos no cálcio total no soro. No final da recuperação, essas alterações, incluindo aquelas estatisticamente significativas, retornaram para os valores de controle.
Não houve alterações no peso de órgão, radiológicas, macroscópicas ou microscópicas que estivessem relacionadas com sTNALP-FcDIO em ratos jovens tratados intravenosamente uma vez por semana em até 90 mg/Kg/dose por 4 semanas consecutivas. Não houve efeito retardado identificados em um subgrupo desses animais permitidos em uma recuperação de 28 dias depois do término do tratamento.
Valores CTx médios levemente menores foram observados para fêmeas tratadas em comparação com os controles(atingindo significância estatística em 90 mg/Kg/dose). Esses valores mais baixos não foram consistentes com a análise de densidade óssea e também com os resultados obtidos para os machos, consequentemente a natureza incidental para esses decréscimos não pode ser excluída.
Alta variabilidade nos parâmetros de densiometria óssea e geometria óssea verificados entre os grupos foram atribuídos à rápida fase de crescimento. No final da recuperação, a área e o BMC (avaliado por DXA e pQCT) foram de modo geral mais baixos para os machos tratados, sugerindo ossos menores para esses animais. O efeito no tamanho ósseo foi verificado em dois ossos de esqueleto apendicular (fêmur e na tíbia) por duas técnicas diferentes, entretanto nenhum efeito consistente foi verificado para o esqueleto axial (sugerindo nenhum efeito no comprimento da coroa para a anca) . Embora a área e BMC foram reduzidos, os valores BMD médios foram geralmente comparáveis com os controles, sugerindo que o efeito em BMC e na área foi secundário ao efeito no crescimento. Pesos corporais mais baixos e consumo de alimentos mais baixo para machos tratados em relação aos controles foram consistentes com esses dados. Entretanto, um tamanho de grupo pequeno na recuperação, falta de consistência em relação ao gênero assim como a variabilidade confundiram esses resultados, consequentemente uma natureza incidental para esses decréscimos não pode ser completamente excluída.
Na conclusão, a injeção intravenosa uma vez por semana ao rato jovem por um mínimo de 4 semanas consecutivas seguido pelo dia 28 da recuperação em doses de 3, 30 e 90 mg/Kg/dose resultou em sinais clínicos associados com efeitos relacionados com a injeção transiente incluindo atividade não-coordenada e reduzida e inchaço da pata observado em até 60 minutos após a dose. Machos tratados em 90 mg/Kg/dose apresentaram leves decréscimos no peso corporal e consumo de alimentos, o qual foi correlacionado com tíbias e fêmures levemente menores avaliados por técnicas de densiometria. Para as fêmeas, valores médios levemente mais baixos foram obtidos para os níveis de C- telopeptídeo em comparação com os controles. Os níveis de fósforo no soro foram levemente, embora significativamente maiores no grupo de 90 mg/Kg/dose. Níveis de fosfatase alcalina no soro elevados foram provavelmente atribuídos aos níveis circulantes de sTNALP-FcDIO. sTNALP-FcDIO não teve efeitos significativos ou consistentes na densiometria óssea e geometria óssea para fêmeas durante o período de tratamento e recuperação. Para machos, nenhum efeito biologicamente significativo foi notado na densiometria óssea ou geometria óssea durante o período de tratamento. Em geral, leves decréscimos na densiometria óssea (conteúdo mineral ósseo e/ou área avaliada por DXA e pQCT) e parâmetros de geometria óssea com um peso corporal médio correspondentemente menor foram verificados para os machos em relação aos controles no final do periodo de recuperação. Todas as descobertas esclarecidas depois do período sem tratamento de 28 dias com exceção dos efeitos no peso corporal e tamanho ósseo para machos de dose elevada, os quais persistiram. Não houve evidências de calcificação ectópica no final do tratamento ou no final do período de recuperação. Não houve descobertas radiológicas, macroscópicas ou microscópicas, assim como quaisquer alterações de peso órgão associadas com o tratamento com sTNALP-FcDIO em qualquer nível de dose. Devido ao fato da reação da injeção ser transiente e não resultar em qualquer feito sobre quaisquer parâmetros usados para avaliar a toxicidade nos grupo de 3 e 30 mg/Kg/dose, esta não foi considerada como sendo adversa. No grupo e 90 mg/Kg/dose, essa reação foi mais severa e acompanhada por decréscimos no ganho de peso corporal, consumo de alimentos reduzido e potencialmente decré3scimo no crescimento ósseo, e consequentemente os efeitos nesse grupo foram considerados como sendo adversos. Consequentemente, o nivel de efeito adverso não-observável (NOAEL) foi considerado como sendo de 30 mg/Kg/dose neste estudo. EXEMPLO 18
Um Estudo de Toxicidade de Injeção Intravenosa de 4 semanas em Macacos Cinomólogos Jovens Seguido por um Periodo de Recuperação de 28 Dias
O propósito deste estudo foi determinar a toxicidade e toxicocinética de sTNALP-FcDIO em macacos cinomólogo jovens, quando administrados uma vez por semana por injeção intravenosa de massa lenta por 4 semanas e para avaliar a reversibilidade de quaisquer alterações após um periodo de recuperação de 28 dias.
As formulações de dosagem do artigo de controle e de teste foram administradas aos macacos cinomólogos jovens por injeção de massa intravenosa lenta uma vez por semana durante 4 semanas, seguido por um periodo de recuperação de 28 dias,conforme indicado na Tabela 9 abaixo: Tabela 9: Design de Estudo
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Os animais do Grupo 1 receberam o artigo veículo/controie, fosfato de sódio 25 mN, pH 7,4, NaCl 150 mM.
Depois do último tratamento (Dia 22), os animais do Estudo Principal foram eutanasiados no Dia 29, enquanto que os animais de Recuperação foram observados por mais 28 dias, após o qual eles foram eutanasiados no Dia 57. Todos o animais Principais e de Recuperação foram submetidos a um exame de necropsia.
As avaliações efetuadas durante o estudo ou em sua conclusão incluíram mortalidade, condição clínica, peso corporal, suscetibilidade, medições corporais, avaliações radiográficas do desenvolvimento ósseo, oftalmologia, 5 eletrocardiografia, toxicocinética, imunogenicidade, hematologia, coagulação, química clínica, urinálise, biomarcadores da renovação óssea, pesos de órgãos, análise de densidade mineral óssea ex vivo e o global e histopatologia. Nenhuma mortalidade ou observações relacionadas ao tratamento adverso foram verificadas durante o estudo.
Baseando-se nas medições corporais registradas no término do tratamento e período de recuperação, não houve diferenças entre os grupos notáveis para os comprimentos da 15 circunferência cranial, oü úmero, antebraço, tíbia ou membro pélvico.
Não houve alterações de peso corporal ou consumo de ração relacionadas com o tratamento com o artigo e teste em qualquer nível de dose. Não houve descobertas oftalmológicas ou eletrocardiográficas relacionadas com o artigo de teste em qualquer nível de dose. Não houve alterações hematológicas, morfológicas de hemácias,de coagulação ou urinálise relacionadas com o tratamento com o artigo de teste em qualquer nível de dose. Não houve alterações toxicologicamente significativas entre os parâmetros bioquímicos clínicos durante os períodos de tratamento ou recuperação. Um aumento relacionado com a dose de leve a pronunciado na fosfatase alcalina foi observado em todos os animais tratados com o artigo de teste na maioria das ocasiões de avaliação por todo o período de tratamento. Os níveis de fosfatase alcalina foram geralmente mais comparáveis com os valores de controle pelo final do período de recuperação. Uma vez que o artigo de teste é uma fosfatase alcalina sintética, este aumento foi principalmente devido à presença de fármaco na corrente sanguínea dos animais depois de cada dose, e deste modo os aumentos foram considerados como não sendo adversos.
No final dos períodos de tratamento e de recuperação, não houve diferenças entre os grupos notórias nos pesos de órgãos relativo ou absoluto, nem houve quaisquer descobertas macroscópicas ou microscópicas relacionadas com o artigo de teste. As alterações histológicas observadas foram consideradas como sendo ou descobertas incidentais, descobertas de fundo comum nessa espécie, ou descobertas relacionadas com algum aspecto da manipulação experimental. Os órgãos reprodutores eram geralmente imaturos, porém considerados normais para este macaco idoso.
Como conclusão, a injeção intravenosa semanal de sTNALP-FcDIO para macacos cinomólogos machos e fêmeas por 4 semanas, em niveis de dose de 0, 5, 15 e 45 mg/Kg, e seguido por um periodo de recuperação de 4 semanas, foi sem evidências de toxicidade em qualquer nivel de dose. Consequentemente, o alto nivel de dose, de 45 mg/Kg, foi considerado como sendo o Nivel de Efeito Adverso Não- Observável (NOAEL) neste estudo. EXEMPLO 19
Determinação da Dose Inicial Recomendada Máxima para Humanos A dose inicial recomendada máxima para humanos (MRSD) é calculada estabelecendo-se o Nivel de Efeito Adverso Não- Observável (NOAEL, ver Guidance for Industry and Reviewers. Dezembro de 2002). Várias concentrações da formulação descrita acima foram testada em camundongos, ratos e macacos incluindo 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 8,2 mg/Kg diárias subcutâneas; 3 mg/Kg, 5 mg/Kg, 10 mg/Kg, 30 mg/Kg, 45 mg/Kg, 90 mg/Kg e 180 mg/Kg. O NOAEL para as espécies mais sensíveis, a saber ratos, foi de 30 mg/Kg. Esta dose foi aumentada até uma dose equivalente humana (HED) usando tabelas de conversão publicadas as quais fornecem um fator de conversão dos ratos para humanos de 6. Um NOAEL de 30 mg/Kg para aquela espécie é equivalente a 5 mg/Kg em humano.
Este valor (5 mg/Kg) foi dividido por um fator de segurança de dez. A MRSD calculada é, deste modo, de 0,5 mg/Kg. Para um ser humano médio pesando 60 Kg, uma dose semanal de 30 mg ou dose diária de 4,28 mg diárias poderiam ser então injetadas para iniciar os testes clinicos.
Embora a presente invenção tenha sido descrita aqui acima a titulo de duas modalidades específicas, ela pode ser modificada sem sair do espírito e natureza da referida invenção conforme definido nas reivindicações em anexo. Referências 1. Ali, S.Y., Sajdera, S.W. & Anderson, H.C. Isolation and characterization of calcifying matrix vesicles from epiphyseal cartilage. Proc Natl Acad Sci USA 67, 1513-20 (1970). 2. Anderson, HC, Hsu, H.H., Morris, D.C., Fedde, K.N. & Whyte, M.P. 1997 Matrix vesicles in osteomalacic hypophosphatasia bone contain apatite-like mineral crystals. Am J Pathol 151 1555-61. 3. Anderson HC, Garimella R & Tague SE 2005a The role of matrix vesicles in growth plate development and biomineralization. Frontiers in Bioscience 10 822-837. 4. 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Claims (25)

1. Fosfatase alcalina direcionada ao osso, caracterizada pelo fato de que ela compreende um polipeptídeo tendo a estrutura: Z-sALP-Y-espaçador-X-Wn-V em que sALP é o domínio extracelular da fosfatase alcalina compreendendo os resíduos selecionados dentre: a) o sALP compreende os resíduos de aminoácidos 23-508 da SEQ ID NO: 15, ou b) o sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 23-512 da SEQ ID NO: 15, ou c) o sALP compreende os resíduos de aminoácidos 23-508 da SEQ ID NO: 18, ou d) o sALP consiste os resíduos de aminoácidos 23-512 da SEQ ID NO: 18, ou e) o sALP compreende os resíduos de aminoácidos 18 - 498 da SEQ ID NO: 16, ou f) o sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 18 - 502 da SEQ ID NO: 16, ou g) o sALP compreende os resíduos de aminoácidos 18 - 498 da SEQ ID NO: 19, ou h) o sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 18 - 502 da SEQ ID NO: 19, ou i) o sALP compreende os resíduos de aminoácidos 18 - 498 da SEQ ID NO: 8, ou j) o sALP consiste dos resíduos de aminoácidos 18 - 502 da SEQ ID NO: 8; em que V é ausente ou é uma sequência de aminoácidos de um aminoácido; X é ausente ou é uma sequência de aminoácidos que possui até dois aminoácidos; Y é ausente ou é uma sequência de aminoácidos que possui até dois aminoácidos; Z ausente ou é uma sequência de aminoácidos de um aminoácido; e Wn é um poliaspartato ou um poliglutamato, em que n = 10 a 16; e o espaçador compreende uma região de fragmento cristalizável (Fc), que possui a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 3.
2. Fosfatase alcalina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que Wn é um poliaspartato, ou em que n = 10.
3. Fosfatase alcalina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que Z é ausente e/ou em que V é ausente.
4. Fosfatase alcalina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a) Y são dois resíduos de aminoácidos, e/ou b) X são dois resíduos de aminoácidos.
5. Fosfatase alcalina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que Y é leucina-lisina e/ou em que X é aspartato-isoleucina.
6. Fosfatase alcalina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a) o sALP é consiste nos resíduos de aminoácidos 18-502 da SEQ ID NO: 8; b) Wn é um poliaspartato, em que n = 10; c) Z e V são ausentes; d) Y é leucina-lisina; e e) X é aspartato-isoleucina.
7. Fosfatase alcalina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é conforme definido na SEQ ID NO: 4.
8. Fosfatase alcalina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo está em uma forma de um dímero.
9. Fosfatase alcalina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a dita fosfatase alcalina consiste do dito polipeptídeo.
10. Fosfatase alcalina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita fosfatase alcalina é glicosilada.
11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a fosfatase alcalina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é uma solução salina, ou em que a fosfatase alcalina está em uma forma liofilizada.
13. Molécula de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência que codifica o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
14. Vetor de expressão recombinante caracterizado pelo fato de que ele compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida pela reivindicação 13.
15. Vetor de vírus adenoassociado recombinante caracterizado pelo fato de que ele compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 13 ou 14.
16. Método de produção de uma fosfatase alcalina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que ele compreende o cultivo de uma célula hospedeira recombinante isolada transformada ou transfectada com o vetor, conforme definido pela reivindicação 14 ou 15, sob condições adequadas para efetuar a expressão da fosfatase alcalina, e a recuperação da fosfatase alcalina do meio de cultura.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula L, célula C127, célula 3T3, célula BHK, célula COS-7 ou célula de ovário de hamster chinês (CHO).
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula CHO-DG44.
19. Kit caracterizado pelo fato de que ele compreende a fosfatase alcalina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e a) instruções para uso em um método de correção ou prevenção de um fenótipo de hipofosfatasia (HPP), ou b) instruções para uso em um método de correção ou prevenção de aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dental.
20. Uso da fosfatase alcalina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo fato de que ele é para a fabricação de um medicamento para corrigir ou prevenir um fenótipo HPP.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a) o indivíduo tem um fenótipo HPP, ou b) o indivíduo é propenso a desenvolver um fenótipo HPP.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que i) o fenótipo HPP compreende um ataque relacionado ao HPP, ou ii) o fenótipo HPP compreende a perda prematura dos dentes decíduos, ou iii) o fenótipo HPP compreende a mineralização óssea incompleta, ou iv) o fenótipo HPP compreende níveis de sangue e/ou urina de pirofosfato inorgânico elevados (PPi), ou v) o fenótipo HPP compreende níveis de sangue e/ou urina elevados de fosfoetanolamina (PEA), ou vi) o fenótipo HPP compreende níveis de sangue e/ou urina elevados de piridoxal 5’-fosfato (PLP), ou vii) o fenótipo HPP compreende ganho de peso inadequado, ou viii) o fenótipo HPP compreende raquitismo, ou ix) o fenótipo HPP compreende dor óssea, ou x) o fenótipo HPP compreende deposição de cristal de pirofosfato de cálcio diidratado, ou xi) o fenótipo HPP compreende aplasia, hipoplasia ou displasia do cemento dental.
23. Uso, de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a mineralização óssea incompleta é a mineralização óssea do fêmur incompleta, a mineralização óssea da tíbia incompleta, a mineralização óssea do metatarso incompleta, ou a mineralização óssea da costela incompleta.
24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o indivíduo necessitado do mesmo tem a) HPP infantil; ou b) HPP na meninice; ou c) HPP perinatal; ou d) HPP adulto; ou e) HPP de odontoipofosfatasia.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para prevenir ou corrigir a aplasia, hipoplasia ou displasia de cemento dentário em um indivíduo necessitado disso.
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