BRPI0721509A2 - mÉtodo e dispositivo para detecÇço de material genÉtico por reaÇço em cadeia da polimerase - Google Patents

Abstract

MÉTODO E DISPOSITIVO PARA A DETECCçO DE MATERIAL GENÉTICO POR REACçO EM CADEIA DE POLIMERASE. A presente invenção refere-se a um método e um dispositivo portátil para detectar material genético em uma amostra biológica usando a técnica conhecida como PCR (reação em cadeia da polimerase). O dispositivo compreende uma câmara de reação que incorpora meios de aquecimento dispostos para aquecer dita câmara. O método de detecção é caracterizado pelo fato de que as fases principais são realizadas na câmara de reação. O sistema miniaturizado tem o objetivo de aumentar a eficiência, simplicidade de uso e a portabilidade do PCR em comparação á análise em escala laboratorial.

Description

MÉTODO E DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

DESCRIÇÃO OBJETO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método e a um dispositivo portátil ou microdispositivo para detectar especificamente material genético em uma amostra biológica usando a técnica conhecida como PCR (reação em cadeia da polimerase).

O microdispositivo tem o objetivo de aumentar a eficiência, simplicidade de uso e a portabilidade da PCR em comparação com a análise em uma escala laboratorial. O microdispositivo torna possível diagnosticar rapidamente a presença de uma seqüência determinada de oligonucleotídeos (DNA e RNA), através da técnica de PCR em tempo real de um volume final, por exemplo, de 10 microUtros e em menos de 30 minutos,

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A técnica conhecida como PCR (reação em cadeia da polimerase) reproduz o sistema de replicação do DNA natural para um determinado fragmento de genoma, tornando possível produzir muitas cópias de uma seqüência de DNA determinada, desde que a seqüência alvo que se deseje amplificar seja encontrada em uma amostra biológica. Esses métodos compreendem, portanto, uma primeira fase de concentração na amostra da fração contendo a seqüência específica a ser identificada, seguida por uma segunda fase, se necessário, ou ruptura ou Iise para permitir a acessibilidade de tal seqüência para finalmente ser submetida à PCR, que permite sua identificação específica. O tratamento com PCR requer fases de aquecimento. A fase de detecção do produto amplificado é geralmente

realizada por meios ópticos.

A detecção de material genético baseia-se, portanto em sua ampíificação, uma vez que a amostra iniciai é encontrada em quantidades muito pequenas que não podem ser detectadas, enquanto que, através da reação PCRs o material genético começa sua amplificação até que possa ser detectado (se não estiver presente na amostra, obviamente a detecção não é feita).

Tipicamente, a reação PCR em um microdispositivo é realizada em uma microcâmara (dentro de um chip ou suporte plástico) que tem uma pequena entrada para a amostra e um segundo orifício para a saída. Geralmente, os dispositivos usados são muito complexos uma vez que compreendem várias câmaras onde a amostra é passada para realizar a concentração do analito alvo, a reação PCR e a detecção, o que deixa o processo mais lento. Os meios de aquecimento são tipicamente externos à câmara ou suporte plástico onde a reação PCR é produzida e não fornecem um aquecimento adequado e rápido em todas as partes da câmara onde a reação ocorre.

Da mesma forma, vários métodos são conhecidos que permitem atingir uma pré-concentração na amostra biológica da fração que contém a seqüência específica da reação PCR. Neste sentido, as partículas superparamagnéticas também são conhecidas, revestidas por um anticorpo específico que permite a concentração de amostra biológica. Essas partículas têm urna parte magnética e por isso podem ser detectadas ou separadas por um campo magnético. As partículas magnéticas são usadas, por exemplo, nas patentes US 881541, US 2004/108253, US 5.795.470, US

2005/208464 ou US 6.159.378.

Vários procedimentos de detecção óptica também são conhecidos, por exemplo, por fluorescência (EP 1 550 858, WO 2005/023427 ou US 6.814.934).

Os meios de aquecimento são muito diversos, mas sempre externos ao suporte plástico ou chip que incorpora a câmara onde a reação PCR é produzida.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção realiza a concentração da amostra por partículas superparamagnéticas, identificação específica por reação PCR em tempo real e detecção por fluorescência. Uma das principais características da invenção é que a concentração, a lise, quando necessário, o aquecimento, a reação PCR e a detecção por fluorescência são realizados na mesma microcâmara, ou seja, sem material genético saindo desta microcâmara.

Em particular, as partículas superparamagnéticas são misturadas com a amostra a ser analisada, o que permite o enriquecimento na fração que contém a seqüência alvo. A amostra é introduzida, com as partículas superparamagnéticas, dentro de uma microcâmara. Os imãs são aplicados nas superfícies opostas da microcâmara, a uma distância muito curta, de forma que o campo magnético gerado retenha as partículas superparamagnéticas (enquanto que o resto da amostra sai da microcâmara). Os reagentes são introduzidos na microcâmara que produzirá a reação PCR e os marcadores de fluorescência, os imãs são removidos, a entrada/saída é conectada e um perfil de aquecimento é, então, aplicado através de um dispositivo de aquecimento situado ao lado da câmara, produzindo a amplificação do material genético na mesma microcâmara.

Em seguida, o dispositivo é levado por meios ópticos que tornam possível captar a fluorescência e, dessa forma, detecta a presença do material genético desejado, sem que ele ou as partículas superparamagnéticas saiam da microcâmara.

SJm outro aspecto da invenção refere-se aos dispositivos onde o processo de detecção é realizado. O dispositivo, além de conter uma microcâmara onde a reação PCR é produzida, recebe o calor gerado por meio de aquecimento composto por uma série de eletrodos de titânio/platina, bem como os meios necessários para realizar todas as fases do processo de detecção na mesma microcâmara de reação.

Mais especificamente, um dos aspectos da invenção refere-se a um dispositivo para a detecção de material genético por reação em cadeia da polimerase, que compreende um substrato onde uma câmara de reação, bem como um microcondutor de entrada e um microcondutor de saída são formados, respectivamente, para a entrada e saída de uma amostra a ser analisada na dita câmara. O dispositivo incorpora meios de aquecimento adequadamente dispostos para aquecer uniformemente a dita câmara.

Para a introdução da amostra e dos reagentes PCR na microcâmara, o dito substrato (chip ou suporte de plástico) é retido em caráter desmontável em forma de cápsula, formada por uma base superior e uma base inferior posicionando a microcâmara entre as ditas bases superior e inferior. O meio de aquecimento pode ser integrado em uma dessas bases para aquecer a dita câmara ou ser integrado no próprio substrato onde a câmara de reação é formada.

A câmara é acessível através das bases superior e inferior pelas aberturas correspondentes existentes em ditas bases, com o objetivo de realizar várias fases do processo na câmara, por exemplo, a aplicação de um campo magnético por meio de imãs e detecção óptica.

O dispositivo pode ter um sensor de temperatura para medir a temperatura na câmara de reação, bem como contatos elétricos para fornecer eletrícamente os meios de aquecimento e fornecer uma conexão com o sensor de temperatura.

Dito meio de aquecimento compreende uma pluralidade de fios condutores conectados entre dois terminais.

O dispositivo tem meios que tornam possível produzir uma distribuição de corrente uniforme em ditos fios condutores, de forma que cada um dos ditos fios gerem uma quantidade de calor muito similar. Desta forma, e devido à distribuição uniforme dos fios sob toda a superfície da câmara de reação, um aquecimento uniforme é fornecido por toda a câmara de reação.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um aparelho para a detecção de material genético por uma reação em cadeia de polimerase, que incorpora o dispositivo mencionado acima e é complementado com meios eletrônicos externos ao dito dispositivo para controlar a temperatura produzida por meio de aquecimento da câmara de reação, bem como um sistema de medição de fluorescência.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um suporte plástico para a detecção específica de material genético por reação em cadeia da polimerase, que compreende uma face superior e uma face inferior e é caracterizado pelo fato que entre as ditas faces superior e inferior ele incorpora uma câmara de reação e um microcondutor de entrada e um microcondutor de saída conectados à dita câmara. A câmara de reação e os microcondutores de entrada e saída são acessíveis a partir de ao menos uma das ditas faces para poderem realizar o processo de detecção na câmara.

Um objetivo da invenção também é um método para a detecção específica de material genético por reação em cadeia da polimerase, que é caracterizado pelo fato de que as fases principais do método são realizadas na mesma câmara de reação. De maneira mais detalhada, o método compreende a introdução em uma câmara de reação de uma amostra a ser analisada que contém partículas magnéticas, de forma que um campo magnético seja subseqüentemente aplicado em dita câmara de reação para reter as partículas magnéticas dentro da dita câmara, sendo que o restante da amostra flui para fora da câmara, onde uma reação PCR é subseqüentemente produzida controlando-se a temperatura por meio de aquecimento associado à dita câmara. Finalmente, a amostra retida na câmara de reação é opticamente detectada.

O método pode ser aplicado, por exemplo, a amostras

microbiológicas, clínicas, de alimentos, etc.

A invenção fornece um dispositivo de detecção portátil e autônomo que permite a identificação específica de marcadores genéticos por meio de técnica PCR em tempo real, automaticamente, incluindo na câmara a concentração e preparação da amostra, a amplificação e a detecção óptica. O sistema miniaturizado aumenta a eficiência, simplicidade de uso e portabilidade da PCR em comparação com a análise em uma escala laboratorial. O microdispositivo torna possível diagnosticar rapidamente a presença de uma determinada seqüência de oligonucleotídeos (DNA ou RNA), através da técnica PCR em tempo real, em um volume final inferior a

microlitros e em menos de 30 minutos.

As temperaturas necessárias para realizar esta PCR em tempo real são atingidas por um sistema original de aquecimento integrado próximo à câmara de reação, que mantém a temperatura homogeneamente por todo o chip durante os diferentes ciclos dos quais a PCR é formada. Dita temperatura está de preferência na faixa da temperatura ambiente e 95° C.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Para complementar a descrição feita e para ajudar um entendimento melhor das características da invenção, de acordo com uma amostra de preferência de sua aplicação prática, um conjunto de desenhos está em anexo como parte integrante da dita descrição, onde, com caráter ilustrativo ou não ilustrativo, o seguinte é representado: Figurai mostra uma vista explodida dos elementos que formam o encapsulamento do dispositivo PCR.

Figura 2 a figura (a) é uma representação esquemática e secional do encapsulamento do microdispositivo de PCR e a figura (b) é uma representação similar à da figura (a), mas em uma fase anterior

ao encapsulamento.

Figura 3 mostra duas vistas em perspectiva do dispositivo PCR, onde é ilustrada a possibilidade de colocar e remover os imãs durante o processo. A figura (a) mostra o imã superior colocado nas aberturas da base superior, enquanto que a figura (b) mostra os

imãs fora do dispositivo.

Figura 4 a figura (a) é uma representação esquemática de uma vista plana da câmara vedada do chip PCR onde o meio de aquecimento, os contatos elétricos e o contorno rombóide da câmara são observados. A figura (b) é uma representação do eletrodo de

aquecimento e do sensor de temperatura.

Figura 5 é uma representação esquemática e secional da câmara vedada.

Figura 6 é um diagrama do sensor de resistência de 4 fios usado para medir a temperatura no centro da câmara. Figura 7 mostra um diagrama correspondente a um circuito microfluídico e

à microcâmara de PCR.

Figura 8 é uma representação esquemática de uma vista plana de um dos aquecedores na forma de placa alongada.

> Figura 9 representa uma simulação (ANSYS) da distribuição atual na

placa de aquecimento da figura 8. As formas irregulares nas

extremidades indicam a distribuição da corrente na superfície.

Figura 10 é uma representação em perspectiva do processo de injeção de uma amostra a ser analisada no microdispositivo de PCR.

Figura 11 é uma vista plana superior do dispositivo, onde as cápsulas das bases superior e inferior são observadas, o que é usado para

conectar o dispositivo de maneira fluídica e elétrica.

Figura 12 representa um diagrama do processo de fabricação dos microeletrodos Ti/Pt em um substrato de pyrex.

Figura 13 representa um diagrama do processo de fabricação da camada de semeadura do SU-8-5 no substrato de pyrex com eletrodos

Ti/Pt. Figura 14 representa um diagrama do processo de fabricação das cavidades das microcâmaras de PCR no substrato de pyrex com eletrodos Ti/Pi e a camada de semeadura/isolamento de SU-8-5.

Figura 15 representa um diagrama do processo de fabricação das coberturas das câmaras de PCR sobre um filme Kapton.

Figura 16 representa o processo de adesão de dois substratos.

Figura 17 mostra um gráfico dos resultados de uma amostra concentrada, que é iisada e passa por um termociclo dentro de um chip.

Figura 18 mostra a verificação através da execução da amostra tirada do chip em um gel de eletroforese.

Figura 19 mostra uma vista em perspectiva do dispositivo PCR.

Figura 20 mostra outra aplicação preferida da invenção onde o encapsutamento é uma caixa portátil e a câmara de reação é colocada em um suporte plástico, As figuras (a, b e c) são três vistas em perspectiva da caixa na posição aberta.

Figura 21 mostra uma vista explodida das folhas que formam o suporte plástico do chip PCR.

APLICAÇÃO PREFERIDA DA INVENÇÃO

O dispositivo objeto da invenção compreende uma câmara de reação (1) conectada a dois microcondutores. Um microcondutor de entrada (2) onde a amostra a ser analisada é introduzida e um microcondutor de saída (3), que permite que o fluxo vá para a parte externa.

Em uma aplicação preferida da invenção, esta câmara tem dimensões de 12 χ 3 mm como indicado na figura 7 e é alongada com uma porção central com plano retangular e porções terminais triangulares em correspondência com a entrada e saída para facilitar a injeção/extração da mistura de PCR. Os microcondutores (2,3) conectados à câmara (1) têm um comprimento de aproximadamente 2,5 mm e uma largura de 70 Mm e terminam em uma conexão para a parte externa que torna possível introduzir e evacuar o líquido dentro do circuito fluídico, como observado na figura 2.

O dispositivo incorpora, nesta aplicação preferida, elementos de aquecimento integrados, solidamente unidos à câmara de reação (1) dispostos de forma que possam aquecer dita câmara de maneira uniforme e controlada por meios externos.

O circuito microfluídico formado pela câmara de reação e os dois microcondutores é formado de preferência em um substrato de 4,5 pm de SU-8-5 que serve para isolar eletricamente os terminais (4) do suprimento elétrico do meio de aquecimento a partir do líquido. A altura dessas câmaras pode variar dependendo do volume da amostra que se deseja que passe pelo ciclo térmico (a partir de 120 pm a 400 μιτι), Este circuito microfluídico é produzido a partir de uma resina epóxi fotodefinívei chamada SU-8-50 que é depositado em um substrato de Pyrex (5), como mostrado na figura 5.

Alternativamente, o substrato pode ser produzido por outro substrato

polimérico (PMMA, SU-8, COC).

O meio de aquecimento compreende uma pluralidade dos fios condutores (6) conectados entre dois terminais (4) e, de preferência, eles são produzidos por uma folha de titânio (Ti) superimposto sobre uma folha de platina (Pt).

Os fios (6) são paralelos em todo o seu comprimento e eles são dispostos de maneira equidistante um ao outro.

Os fios de aquecimento (6) são formados em uma placa de aquecimento (7) de material condutor e com forma alongada, que tem uma superfície de conexão (8) em cada um e seus terminais e onde é conectado respectivamente o primeiro e o segundo terminal de conexão. Ditos fios condutores (6) são retos e são conectados entre as ditas superfícies de conexão (8), como mostrado na figura 8.

Ditas superfícies de conexão (8) têm cortes transversais (9) na forma de uma linha reta que definem os trajetos condutivos da corrente para produzir uma distribuição uniforme da corrente nos fios condutores (6),

como mostrado na simulação da figura 9.

Como observado em figura 8, ditos trajetos condutores são definidos por ao menos dois grupos paralelos de cortes alinhados (9). Esses cortes (9) fazem com que a distribuição da corrente seja uniforme independente da posição na qual os pontos elétricos flexíveis (17) são encontrados e com os quais cada terminal do meio de aquecimento é fornecido, como observado na figura 2(b).

A figura 9 mostra as simulações realizadas em ANSYS que demonstram que a variação máxima da corrente entre dois aquecedores deste tipo não exceda a 0,04 μ A. O projeto dos elementos de aquecimento incorpora duas estruturas de compensação com o mesmo propósito, mas para resolver problemas diferentes:

A compensação da geometria. A corrente elétrica sempre tenta ir através do trajeto da última resistência elétrica. Devido à geometria simétrica do aquecedor, todas as resistências, que estão localizadas em configuração paralela, têm a mesma resistência. Entretanto, embora a área do contato elétrico externa tenha sido feita muito grande para que não haja direção predominante, uma vez que é feita do mesmo material da resistência, tem uma certa resistência elétrica. Isto significa que há um trajeto preferido, o central (se o contato for centralizado). Devido ao nível requerido de uniformidade das temperaturas devido à aplicação, aquela pequena falta de uniformidade não é aceitável, sendo por essa razão que estruturas de corrente balanceadas devem ser projetadas e simuladas entre os diferentes ramais. Essas estruturas têm a função de equalizar o trajeto total de todas as resistências de forma que não haja uma mais favorável do que as outras. Essas estruturas têm a forma de Τ. A área central do T tem a intenção de cortar um curto trajeto e desviar a corrente através das laterais. Quatro níveis foram adicionados, sendo que este número depende do grau de uniformidade requerida. À medida que sobe um nível, o t!T" é de tamanho maior (25%), cobrindo uma superfície maior. Cada braço do T é equivalente

à distância entre este e o T anterior.

A compensação do contato. Se o contato elétrico com o aquecedor não for realizado de forma centralizada, há uma falta de uniformidade e favorece um trajeto mais confortável. Para minimizar este efeito, cortes laterais são introduzidos que obrigam a corrente a ir para a zona central do aquecedor. A abertura deve ser um terço da abertura que é vista na última linha do aT (o mais próximo do contato elétrico). A separação entre esta abertura e a linha mais próxima do "T™ devem ser de forma que o ângulo

aberto seja de 25°.

Em uma aplicação preferida, o dispositivo de PCR tem seis placas de aquecimento (7) colocadas em paralelo como mostrado na figura 4(b) e de preferência transversalmente à câmara de reação (1). Cada placa de aquecimento (7) tem 32 trilhas de fios (6) de Pt de 20 μπι de largura e 5 mm de comprimento, separadas em 50 pm uma da outra, que terminam em dois contatos elétricos (um em cada lado do chip), através dos quais são fornecidos 45 V por uma fonte de energia externa. Há fios condutores (6) sob toda a área da câmara de reação (1) como é observado na figura 4, de forma que todas as zonas da câmara sejam aquecidas de maneira uniforme.

Além desses seis aquecedores, o dispositivo de PCR contém um sensor de temperatura, em particular um sensor de resistência (10) de quatro fios, colocado no centro da câmara de reação (1) como mostrado na figura 4. Desta forma, a partir de 16 contatos elétricos que podem ser vistos na figura 4, os contatos (A1B1C1D) são aqueles que pertencem ao sensor de temperatura. Este sensor de resistência (10), mostrado na figura 6, baseia- se no princípio de que a resistência elétrica de platina depende da temperatura e varia linearmente com ela. Quando o sensor é fornecido com uma voltagem de 4,5 V através dos contatos (A) e (B) e a corrente é medida através dos contatos (C) e (D), é possível calcular a resistência e, portanto, a temperatura no centro da câmara de PCR.

Os fios de aquecimento (6) são mergulhados em uma das paredes que formam a câmara de reação (1). Os fios podem ficar sobre o pyrex ou sobre o SU-8. Em uma configuração preferida, os fios ficam sobre o pyrex e

são revestidos com uma camada de SU-8-5.

Para o uso do dispositivo é necessário preencher a câmara com uma mistura de PCR e, em seguida, fechar os microcondutores de entrada e saída (2,3) da câmara (1) pelo uso de um encapsulamento com os selos de silício que fecham os orifícios de entrada e saída.

Como representado esquematicamente na figura 2, o encapsulamento baseia-se em duas cápsulas ou bases prensadas juntas com parafusos (11), que deixam a câmara de reação (1) no meio.

A cápsula inferior (12) age como suporte da câmara de reação (1) formada no substrato (5), enquanto que a cápsula superior (13) atua como suporte para um PCB (placa de circuito impresso) (14) e contém um anel O (15) para cada entrada/saída da câmara (1), bem como dois orifícios (16) que colocam em contato a entrada/saída de micro tamanho do dispositivo com os conectores de tamanho maior onde podem ser unidos a um tubo ou

seringa, como mostrado na figura 10.

Além disso, a cápsula superior (13) coloca em contato, através de pontos elétricos retráteis (17) em seu interior, os contatos da PCB (14) com os eletrodos do dispositivo de PCR, de forma que através dos contatos elétricos (21) existentes na PCB (14) é possível fornecer os meios de aquecimento por uma fonte de energia externa.

Ao alinhar com a mão todas as peças e apertá-las usando parafusos, o (11), o chip do PCR é fiuídica e eletricamente capsulado sem a necessidade de adesivos, de forma que seja possívei substituir facilmente e conectar o dispositivo de PCR1 sendo possível usar facilmente o mesmo encapsulamento para chips diferentes. Por outro lado, a cápsula inferior e a cápsula superior respectivamente têm uma abertura superior (18) e uma abertura inferior (19), ambas do tamanho da câmara (1) para, por um lado, colocar imãs (20) na superfície do chip e, por outro lado, ter um acesso visual à parte interna da câmara (1) quando a fiuorescência é medida.

A figura 1 mostra o processo para encapsular o dispositivo, fiuídica e eletronicamente. Nesta figura, a cápsula superior ou base (13) e a cápsula inferior ou base (12) pode ser vista, feita de PMMA, com parafusos (11) e pinos para facilitar o alinhamento. A PCB (14) também é observada com vários componentes eletrônicos para suprir o meio de aquecimento e o conector elétrico na parte inferior.

Uma injeção de fluidos sem vazamentos é atingida através de anéis O (15), que passam através da cápsula ou base superior (13) para a câmara de reação (1) por condutores internos (28,29) da dita cápsula.

O encapsulamento do dispositivo é montado em um suporte (22) que tem uma abertura central (23), de forma que um ventilador (24) seja acoplado em sua parte inferior para poder resfriar mais rapidamente a câmara de reação. Pode ser observado que ambas as cápsulas têm ranhuras (25) que favorecem a passagem do ar direcionado pelo ventilador para facilitar o resfriamento por convenção forçada.

A cápsula ou base superior (13) tem um condutor de entrada (26) e um condutor de saída (27), que se conectam respectivamente com ditos microcondutores de entrada e saída (2,3) da câmara de reação (1), através dos condutores internos (28,29), como mostrado na figura 19.

Assim que o dispositivo for encapsulado e quando realizar o processo de detecção, a amostra é introduzida na câmara de reação (1), por exemplo, por uma seringa como representado na figura 10.

Na invenção, foi providenciado que o encapsulamento deve permitir a colocação dos imãs (20) muito próximos do chip, ou seja, da câmara de reação (1), além de não impedir seu resfriamento ou o feixe de luz. Para fazer isso, as aberturas (18) e (19) das cápsulas superior e inferior, tornam possível colocar os imãs (20) dentro delas, de forma que possam ser removidas posteriormente.

Para a preparação da amostra, um sistema de concentração universal é usado, que permite a captura e a concentração de amostras biológicas (microbiológicas, clínicas, de alimentos, ambientais, etc.). Este sistema pode usar partículas superparamagnéticas revestidas por anticorpos específicos ou partículas superparamagnéticas que especificamente atraem ácidos nucleicos. Ao colocar a amostra de teste em estado líquido com as partículas magnéticas, ela atinge uma pré- concentração da fração que contém a seqüência específica para a reação PCR.

Um volume de amostra que pode ser analisado (1-3 ml) passa através da microcâmara (1) enquanto aplica um campo magnético a ele. Em um exemplo de aplicação, o volume da amostra pode estar entre 1-10 ml.

Assim que a amostra é introduzida na câmara através da entrada, é deslocada pelo movimento do êmbolo da seringa por toda a câmara para a saída onde é eliminada para fora do encapsuiamento mantendo o campo magnético. A amostra sai da câmara (1) através do microcondutor (3) que se conecta com o condutor de saída (27) através do condutor interno (29). A vedação da gaxeta (15) evita qualquer vazamento na passagem do líquido entre o microcondutor (3) e o condutor interno (29).

O campo magnético é aplicado na colocação de dois imãs (20) na câmara de reação (1), um na parte superior e outro na parte inferior, como mostrado na figura 3. Para isto, o encapsuiamento torna possível colocar os imãs muito próximos da microcâmara. Neste caso, o imã superior está em contato com a cobertura da microcâmara, que tem uma espessura aproximada entre 70 pm e 100 pm, que torna possível realizar uma captura magnética extremamente eficiente devido à proximidade do imã. O imã inferior está em contato com o substrato de pyrex (5), que tem uma espessura entre 750 pm e 750 pm.

Em outras aplicações preferidas, é possível eliminar este substrato, usando o processo descrito na patente IS-2.263.400, que permitiriam uma proximidade inferior a 200 mícrons entre o imã e a câmara de reação.

Desta forma, como a amostra é feita para passar através da câmara (1), somente as partículas magnéticas e o complexo de partículas magnéticas-analito alvo, caso haja, são retidos nela. Assim que o alvo é capturado dentro da câmara (1) do chip e tendo assegurado a ausência total de fluido dentro da câmara (1), a mistura de PCR é, então, introduzida na mesma câmara de reação (1) e os imãs (20) são removidos para prosseguir com a reação de amplificação.

Para a preparação da amostra, os seguintes sistemas universais podem ser usados, que permitem a captura e a concentração de material genético: partículas superparamagnéticas (DYNAL©) que especificamente aprisionam os ácidos nucleicos e as partículas superparamagnéticas revestidas, por ligação covalente, por anticorpos específicos a um analito alvo. Ao colocar a amostra de teste em contato com as partículas magnéticas, essas especificamente ligam-se a seu alvo se este for encontrado na amostra, de forma que o complexo partículas magnéticas- anatito alvo seja formado. A amostra, com este complexo, é introduzida através da entrada do encapsulamento e é passada através da câmara de reação (1) onde, quando necessário, as biomoiéculas (DNA e RNA) e a reação PCR são realizadas e, ao mesmo tempo, um campo magnético é aplicado que retém as partículas magnéticas dentro da microcâmara. Desta forma, após a passagem da solução, somente o complexo partícula magnética-anatito alvo, que inclui seqüência específica e que serve como molde para a reação PCR1 é retido na câmara.

Assim que o analito alvo é capturado dentro da câmara do chip, a mistura PCR é introduzida neie. O chip, encapsulado e perfeitamente fechado é colocado sob um microscópio epifluorescente ou uma câmara CCD de um fotomultiplicador com os respectivos filtros ópticos que permitem a medição da fluorescência.

Quando o protocolo de amplificação é aplicado, no caso de concentração de partículas magnéticas com anticorpos ser usada, o tempo de pré-ativação necessário para a enzima polimerase é suficiente para provocar a Iise do analito alvo, contido na câmara na forma de complexo partícula magnética-anticorpo-analito e deixa acessível o ácido nucleico (DNA e RNA) para sua subsequente detecção por amplificação.

O programa de amplificação contém os ciclos de temperatura correspondentes à pré-ativação da enzima e à amplificação (desnaturação, hibridização e extensão), em uma faixa entre a temperatura ambiente e 95° C.

A formação do produto de amplificação por PCR em tempo real é observada no chip, através do revestimento transparente de SU-8 e é possível usar sondas moleculares específicas para o produto amplificado e rotulado na extremidade 5' com fluoróforo, por exemplo Cy5, na extremidade 3' com BHQ-2. (Cy5 é marca registrada da GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, Reino Unido. BHQ-2 é marca registrada da Biosearch Technologies, Inc., Novato, CV).

A fluorescência é medida durante a reação de amρHficação usando unidades de voltagem. Quando a amostra é positiva, um aumento exponencial na fluorescência é observado até atingirmos um máximo. O início deste aumento na fluorescência ocorre a partir de um certo ciclo de amplificação, que depende da quantidade inicial de ácido nucleico. O protocolo de amplificação completo dura não mais do que 30 minutos.

Através das aberturas (18) e (19) do encapsulamento, a câmara de reação PCR (1) permanece em contato com o ar, por três razões principais: (i) ser capaz de colocar os imãs em contato com o chip; (ii) de forma que o resfriamento seja mais rápido e (iii) ser capaz de realizar a detecção óptica.

Os imãs (20) são colocados uns sob os outros acima da câmara, manualmente, de forma que eles se adaptem através das aberturas (18) e (19) da cápsula para que seja muito fácil concentrar a amostra e o extrato do ácido nucleico e removê-los subseqüentemente para poder amplificar o ácido nucleico e ser capaz de realizar a detecção óptica.

Por outro lado, o aparelho eletrônico externo para o aquecimento do meio de aquecimento consiste de:

(i) uma fonte de voltagem que supre os fios de aquecimento (6)

(ii) uma fonte de voltagem que supre o ventilador (24)

(iii) um sistema de coleta de dados que mede a resistência do sensor

(10)

(iv) um software para controlar a temperatura.

O sistema de aquecimento funciona como segue: em primeiro lugar, o sensor do chip mede a resistência (e com isso a temperatura da câmara) e, de acordo com a temperatura necessária a qualquer tempo, é decidido se supre os aquecedores ou o ventilador. Se a temperatura medida for menor do que a necessária naquele momento, a fonte de voltagem que supre os aquecedores liga e aquece a câmara até atingir a temperatura desejada. Mas se, ao contrário, a temperatura medida pelo sensor for maior do que a necessária naquele momento, a fonte de voltagem que supre o ventilador liga para resfriar a câmara PCR. Tudo isso é controlado por software conectado ao sistema de coleta de dados.

O aparelho de coleta de dados baseia-se em um microscópio e contém:

(v) uma fonte de luz que é composta de uma lâmpada de mercúrio de 100W

(vi) um filtro de excitação que filtra todos os comprimentos de onda, exceto 640 mm (comprimento de onda que excita o fluorocromo Cy5)

(vii) um espelho dicroico que envia a luz emitida pela amostra em direção ao fütro de emissão

(viii) um filtro de emissão que filtra todos os comprimentos de onda, exceto 670 mm (comprimento de onda emitido pelo fluorocromo Cy5)

(ix) um fotomultiplicador ou uma câmara CCD que coleta a luz que passa através do filtro de emissão

A visualização do ácido nucleico amplificado é possível graças ao acúmulo de cada ciclo de amplificação do fluorocromo Cy5, que é excitado a 640 mm e emite a 670 mm.

A luz emitida pela lâmpada de mercúrio passa através do filtro de excitação. Este permite somente que a luz de 640 mm passe, atingindo a amostra. Em conseqüência, o fIurocromo é excitado e emite uma luz vermelha de 670 mm que é desviada em direção do filtro de emissão, graças ao espelho dicroico. Finalmente, esta luz de emissão atinge o fotomultiplicador, que está conectado a um sistema de coleta de dados.

Como explicado anteriormente, a cápsula ou base superior (13) tem um orifício (18) situado acima da câmara (1), de forma que permita este tipo de detecção óptica, uma vez que a cobertura da microcâmara é transparente, Além disso, é importante enfatizar que o SU-8, diferente de outros materiais poliméricos, tem uma autofluorescência muito baixa neste comprimento de onda, de forma que torna possível detectar o sinal de

fluorescência da amostra rotulada com Cy5.

Os imãs (20) usados para a preparação da amostra são Neodímio- ferro-boro (NdFeB) e têm o formato de um disco, como observado na figura 3b, com um diâmetro de10 mm e uma altura de 4 mm. A orientação da magnetização é axial com (B-H)max de 30 MGOe.

A figura 20 representa outra aplicação preferida da invenção, onde a base superior (13) e a base inferior (12) de encapsulamento, juntam-se por meio de pivô ou articulação em um de seus lados, formando um dispositivo portátil de pequenas dimensões. O chip PCR (30), que inclui a câmara de reação (1), os microcondutores (2,3) e o meio de aquecimento, é integrado a um suporte plástico (31) que tem janelas (32,32') respectivamente em suas faces superior e inferior, que dão acesso ao chip (30) como mostrado na figura 21.

Em uma das superfícies do suporte plástico (31) são dispostos dois orifícios (33) conectados dentro do suporte plástico com os microcondutores (2,3). O suporte plástico também tem orifícios (34) em uma de suas superfícies que dão acesso aos terminais elétricos (38) conectados ao meio de aquecimento e sensor de temperatura do chip (30).

O suporte plástico (31) é formado por várias folhas como observado na figura 21. Em particular, há uma folha superior (35) e uma folha inferior (36), entre as quais está disposto, em uma estrutura do tipo sanduíche, o chip (30).

Entre as bases superior e inferior (13) e (12) é definido um espaço adequado para receber o suporte plástico (31). Uma vez introduzido, o suporte plástico fecha as bases de encapsufamento, de forma que os condutores (26,27) dispostos em uma das bases sejam conectados a orifícios (33) do suporte plástico (31). Similarmente, os contatos elétricos (39) são colocados dentro de uma das bases para entrar em contato com os terminais (38) ao fechar o encapsulamento.

Para a colocação dos imãs, também há aberturas (19) e (18) nas

bases superior ou inferior (13) e (12).

Um ventilador pode ser posicionado em uma das bases, para direcionar o ar com o objetivo de reduzir a temperatura da câmara de reação quando necessário.

1.- Processo de fabricação do dispositivo

Em uma aplicação preferida da invenção, os dispositivos PCR são fabricados em substratos de pyrex. Entretanto, é possível fabricá-los em substratos poiíméricos tais como, por exemplo, PMMA, como descrito na patente IS-2,255,463 e sem qualquer substrato exceto SU-8 na patente IS- 2,263,400, de forma que seu custo de fabricação é consideravelmente reduzido.

Para fabricar os dispositivos PCR sobre substratos de pyrex, é necessário realizar três etapas fundamentais: (i) fabricação dos eletrodos nos substratos de pyrex; (ii) fabricação da camada de semeadura de SU-8-5 e (iii) fabricação das microcâmaras vedadas. Cada uma dessas etapas é explicada em mais detalhes nas seções a seguir. 1.1. Fabricação de eletrodos

Começamos com um substrato de pyrex sobre o qual é realizado um processo de fotolitografia com fotoresina positiva S1818, usando a máscara apropriada. Para fazer isto, um promotor de aderência é depositado primeiramente e, em seguida, a resina a 4000 rpm durante 30 segundos, o substrato é submetido a um tratamento térmico a 90° C durante 20 minutos, é exposto à luz UV com a dose de 300 mJ/cm2 e é removido.

Em seguida, 15 nm de titânio (3 minutos a 100 W) e 140 nm da platina (6 minutos a 190 W) são depositados usando o método de spray de cátodo em todo o substrato de pyrex. Finalmente, o substrato é introduzido em um banho de ultrassom de acetona para dissolver a fotoresina S1818; o metal permanece somente onde não havia resina, produzindo, assim, os microeletrodos.

Esta parte da fabricação é mostrada na figura 12 e é composta das seguintes fases:

a.- depósito do promotor de aderência de S1818 por centrifugação.

b.- depósito de S1818 por centrifugação

c.- polimerização de S1818 (20 minutos a 90°C)

d.- exposição de 300 mJ de luz UV para degradar o S1818

e.- remoção de S1818 degradado

f.- depósito de 15 nm de Ti e 140 nm de Pt por spray de cátodo

g.- dissolução de S1818 em acetona.

1.2. Fabricação das câmaras vedadas

Começamos com dois substratos diferentes: o substrato inferior é o mesmo substrato de pyrex onde os eletrodos foram fabricados previamente e o substrato superior, que é o filme Kapton aderido a um substrato de pyrex.

1.2.1. Fabricação do substrato inferior

Começamos com o substrato de pyrex com eletrodos de Ti/Pt produzidos de acordo com o processo descrito na seção 1.1. E Simpo cuidadosamente em banhos de ultrassom de acetona, metanol e água, respectivamente, para assegurar que toda a fotoresina S1818 seja retirada. Em seguida, a camada de semeadura de SU-8-5 é fabricada neste substrato com dois objetivos: (i) isolar eletricamente os eletrodos e (ii) melhorar a aderência entre o substrato de pyrex e as câmaras fabricadas em SU-8-50.

SU-8-5 e SU-8-50 são quimicamente similares, sendo a única diferença entre esses dois produtos comerciais a viscosidade, que depende da quantidade de solvente que possuem. A viscosidade do SU-8-5 (aproximadamente 290 cSt) é muito menor do que a do SU-8-50 (aproximadamente 2250 cSt). Portanto, a espessura da camada de SU-8-5 é muito menor após ser depositada por centrifugação sobre o substrato de pyrex. A aderência a esta fina camada é melhor do que a aderência a uma camada mais espessa do mesmo material. Aiém disso, é necessário ter em mente o grau de polimerização. Quanto maior o grau, melhor a aderência entre o substrato e sua camada de polímero. Portanto, quando fabricar a camada de semeadura, uma camada fina de SU-8-5 (4,5 pm de espessura) é depositada e consideravelmente se polimeriza.

Por isso, 2 ml da fotoresina são colocados sobre o substrato e é girado a 3000 rpm durante 30 segundos. A resina é espalhada em todo o substrato e uma camada continua de SU-8-5 de 4,5 Mm de espessura é produzida. Em seguida, o substrato é submetido a um tratamento térmico de 95° C durante 5 minutos para evaporar todo o solvente. Desta forma, somente o pré-polímero é lido para ser polimerizado. Para fazer isto, a etapa de fotolitografia é realizada pela irradiação de SU-8 com a luz UV usando a máscara apropriada, com uma dose de 160 mJZcnrf. Desta forma, os radicais livres são criados somente nas partes coincidentes com as áreas claras da máscara. É aqui onde a polimerização se inicia e é propagada durante o tratamento térmico seguinte, mantendo a camada de SU-8-5 a 95°

C durante 5 minutos.

Finalmente, o substrato é mergulhado em um banho de PGMEA com agitação durante 2 minutos e é enxaguado com IPA. Nesta última etapa, a fotoresina que não foi polimerizada é dissolvida e a camada de semeadura de SU-8-5 permanecesse no substrato de pyrex. Entretanto, a aderência é melhorada à medida que o grau de polimerização da fotoresina é aumentado. Portanto, o substrato é submetido a um último tratamento térmico (30 minutos a 170° C) onde este grau de polimerização

consideravelmente aumenta.

Esta parte da fabricação é mostrada na figura 13 e é composta das

seguintes fases: a.- depósito do SU-8-5 por centrifugação

b.- evaporação do solvente a 95° C durante 5 minutos

c.- exposição de 160 mJ da luz UV para iniciar a polimerização

d..- propagação da polimerização a 95 0C durante 5 min.

e.- desenvolvimento de SU-8-5 não polimerizado em PGMA

f.- alta polimerização a 170°C durante 30 minutos

Assim que esta camada de semeadura é polimerizada, as cavidades das câmaras de PCR podem ser fabricadas com seus microcanais nela, por um outro processo de fotolitografia. Mas desta vez uma camada mais espessa de SU-8-50 é usada, que pode variar entre 20 e 200 um de espessura, de acordo com a altura da câmara desejada. Embora alguns parâmetros de processo possam mudar, o procedimento a seguir é similar. Em primeiro lugar, 2 ml de resina são depositados e o substrato é girado durante alguns segundos para produzir uma camada uniforme. Em seguida, o solvente é evaporado com tratamento térmico a 90° C. Em seguida, a resina se polimeriza por exposição à luz UV e um tratamento térmico a 90° C. Finalmente, a resina não polimerizada é desenvolvida para produzir as estruturas desejadas. Neste caso, o grau de polimerização é relativamente baixo de forma que pode continuar polimerizando durante o processo de aderência subsequente, em contato com outra camada de SU-8.

Esta parte da fabricação é mostrada na figura 14 e é composta das

seguintes fases:

a.- depósito de SU-8-50 por centrifugação (20, 37 ou 80 pm em altura)

b.- evaporação do solvente a 90° C durante 8, 15 ou 30 minutos dependendo da altura

c.- depósito de 20 μπι de SU-8-50 por centrifugação

d.- evaporação do solvente a 90° C durante 8 minutos

e.- exposição a 190 mJ da luz UV para começar a polimerização

f.- propagação da polimerização a 90° C durante 4 minutos

g.- desenvolvimento de SU-8-50 não polimerizado em PGMEA

Como explicado no parágrafo anterior, é possível produzir espessuras de SU-8 entre 20 e 200 pm pela combinação de diferentes camadas de 20, 37 e 80 pm de altura. Para fazer isso, o depósito das camadas dessas três alturas diferentes foi otimizado de forma que as camadas são produzidas com uma uniformidade muito boa na espessura, que é um parâmetro crítico para uma boa aderência subsequente. No caso de 20 μιτι, 2 mi de resina são depositados e o substrato é gerado a 6000 rpm durante 60 segundos. Em seguida, o solvente é evaporado, submetendo o substrato ao tratamento térmico a 90° C durante 8 minutos,

No caso de 37 μηη, 2 mi de resina são depositados e o substrato é girado a 3000 rpm durante 60 segundos. Em seguida, o solvente é evaporado, submetendo o substrato a um tratamento térmico a 90° C durante 15 minutos.

Finalmente, no caso de 80 μηη, 2 ml de resina são depositados e o substrato é girado a 1500 rpm durante 60 segundos. Em seguida, o solvente é evaporado, submetendo o substrato a um tratamento térmico de 90° C

durante 3 minutos.

Combinações diferentes podem ser feitas entre essas três camadas para produzir a altura da câmara desejada. Por exemplo, para uma câmara de 100 pm de altura, 80 μηη são depositados, o solvente é evaporado a 90° C durante 30 min e 20 μηη são depositados novamente, evaporando o solvente a 90° C durante 8 minutos.

Entretanto, é importante que a última camada depositada no substrato tenha sempre 20 μηη de altura, uma vez que o processo de aderência subsequente é otimizado para essas camadas de SU-8. 1.2.2. Fabricação do substrato superior

Começamos a partir do substrato de pyrex onde é aderido 125 pm de filme kapton. Esses filmes são muito flexíveis e é impossível realizar uma fotolitografia correta sobre eles. É necessário aderi-los previamente a um substrato de pyrex rígido. Para fazer isto, 4 ml de resina S1818 são depositados sobre o pyrex e é girado a 3000 rpm durante 30 segundos. Em seguida, é colocado em contato com o filme kapton e é introduzido no bonder do substrato a vácuo (0,1 Pa). É aquecido a 90° C durante 20 minutos e o filme é aderido reversamente ao substrato de pyrex. Desta forma, o substrato kapton é produzido, sendo suficientemente rígido para

realizar a fotolitografia de SU-8.

A fotolitografia no kapton é realizada exatamente da mesma maneira que a fotolitografia das cavidades, mas com a máscara adequada.

Esta parte da fabricação é mostrada na figura 15 e é composta das seguintes fases:

a.- depósito de S1818 por centrifugação b.- aderência a Kapton a 0,1 Pa a 90°C durante 20 min

c.- depósito de 80 μη de SU-8-50 por centrifugação

d.- evaporação do solvente a 90°C durante 30 minutos

e.- depósito de 20 μηη do SU-8-50 por centrifugação

f.- evaporação do solvente a 90°C durante 8 minutos

g.- exposição de 140 mJ de iuz UV para iniciar a polimerização

h.- propagação da polimerização a 90°C durante 4 minutos

i.- desenvolvimento do SU-8-50 não polimerizado em PGMEA

Neste caso, uma camada de SU-8-50 de 100 Mm de espessura é fabricada de forma que a cobertura da câmara de PCR seja suficientemente rígida para apoiar a pressão gerada durante o ciclo térmico. Para fazer isto, como foi explicado na seção 1.2.1, uma camada de 80 pm é depositada primeiramente, seu solvente é evaporado a 90° C durante 8 minutos, Após submeter o substrato pyrex-kapton a 140 mJ de Iuz UV com a máscara apropriada, finalmente a camada é polimerizada a 90° C durante 4 minutos.

Todos os tratamentos térmicos realizados nesses processos de fotolitografia são realizados em rampas, uma vez que as alterações rápidas de temperatura fazem rachaduras aparecer no SU-8 devido ao estresse interno. Além disso, esses processos de fotolitografia foram otimizados pelas técnicas de Taguchi para produzir camadas uniformes de SU-8 e com boas propriedades adesivas. Ao fazer isso, é possível aderir essas camadas umas nas outras como explicado na seção 1.2.3. 1.2.3. Aderência de camadas estruturadas de SU-8

Começamos a partir de dois substratos fotolitografados nas seções 1.2.1 e 1.2.2. Como há cavidades no substrato inferior e coberturas no substrato superior, após a aderência das câmaras de PCR vedadas ser alcançada. Para fazer isso, é necessário alinhar as duas camadas estruturadas antes de aderi-las. O filme kapton usado neste trabalho é de 125 pm de espessura e permite realizar este alinhamento. Quanto mais espesso é este filme, menos transparente ele é e, por essa razão, os filmes de 125 μηη foram escolhidos,

A figura 16 mostra um diagrama deste processo de fabricação que é composto das seguintes áreas operacionais:

a.- alinhamento dos dois substratos

b.- aderência de dois substratos a 300 KPa e 100 0C

c.- liberação de pyrex-kapton Como explicado no diagrama da figura 16, após o alinhamento, os dois substratos são introduzidos na câmara de vácuo do bonder de substrato a 0,1 Pa e após colocá-los em contato, uma força de 300 Kpa é aplicada enquanto a temperatura é elevada a 100° C durante 20 minutos. As duas camadas de SU-8 são irreversiveimente aderidas.

A aderência entre o filme kapton e o SU-8 é muito fraca. Devido a isso, é possível liberar o substrato superior após o processo de aderência. Para fazer isso, os dois substratos são introduzidos aderidos em um banho de ultrassom IPA durante 10 minutos e o substrato de pyrex é removido com o auxilio de uma faca. 1.2.4. Corte

Após esta liberação do kapton, as duas camadas de SU-8 são produzidas aderidas junto com o substrato de pyrex formando as câmaras de PCR vedadas, com eletrodos de platina integrados. Em outras palavras, um substrato de pyrex é obtido que contém 16 dispositivos PCR. Portanto, cortar este substrato no cortador cria 16 dispositivos.

Claims (16)

1. Dispositivo para a detecção específica de material genético por reação em cadeia da polimerase em tempo real, que compreende uma câmara de reação adequada para produzir a dita reação em cadeia de polimerase conectada a um microcondutor de entrada e um microcondutor de saída, respectivamente para a entrada e saída de uma amostra a ser analisada da dita câmara, caracterizada pelo fato que compreende: um substrato onde é formada a dita câmara de reação, uma base superior e uma base inferior, de forma que dito substrato seja retido entre as ditas bases superior e inferior, meios de aquecimento dispostos para aquecer a dita câmara e configurado para produzir a ampiifícação do material genético na dita câmara de reação, uma primeira abertura na base superior que dá acesso a uma parte superior da câmara e uma segunda abertura na base inferior que dá acesso à parte inferior da câmara, um par de imãs para produzir a concentração do material genético na dita câmara de reação, sendo tais imãs adaptados em tamanho e formato para serem colocados com caráter removível, respectivamente, em ditas primeira e segunda aberturas, onde ditas primeira e segunda aberturas fornecem acesso visual para a parte interna da dita câmara de reação para permitir a detecção fluorescente do material genético dentro da dita câmara de reação, um sensor de temperatura disposto para medir a temperatura na dita câmara de reação, contatos elétricos localizados em ao menos uma das bases superior ou inferior, eletricamente conectados a dito meio de aquecimento e sensor de temperatura.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito substrato é retido em caráter desmontávei entre as ditas bases superior e inferior.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os meios de aquecimento são integrados ao substrato onde a câmara de reação é formada e onde tais meios de aquecimento são dispostos na base inferior.

4. Dispositivo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sensor de temperatura é integrado no substrato onde a câmara de reação é formada e onde o sensor de temperatura é disposto em uma das ditas bases,

5. Dispositivo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ao menos uma das paredes que formam a câmara de reação é transparente.

6. Dispositivo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma das bases tem um condutor de entrada e um condutor de saída, que são respectivamente conectados aos ditos microcondutores de entrada e saída da câmara de reação.

7. Dispositivo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato onde a câmara de reação é formada, os microcondutores de entrada e saída formam um suporte de plástico removível e pelo fato de que o dito suporte de plástico tem uma janela através da qual a câmara de reação é acessível e onde dito suporte de plástico tem duas perfurações em uma de suas superfícies conectadas aos microcondutores de entrada e saída da câmara de reação e onde o suporte plástico tem terminais elétricos acessíveis a partir de uma de suas superfícies, que são conectados aos meios de aquecimento mergulhados em dito substrato.

8. Dispositivo de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ditos meios de aquecimento compreendem uma pluralidade de fios condutores conectados entre dois terminais, estando ao menos uma parte de ditos fios disposta substancialmente em paralelo a uma outra, e onde os meios de aquecimento compreendem ao menos uma placa de condução alongada, que tem superfícies de conexão em cada uma de suas extremidades e onde é disposto, respectivamente, um primeiro e um segundo terminal de conexão e em que ditos fios condutores são retos e estão conectados entre as ditas superfícies de conexão e onde cada terminal de conexão está conectado aos fios condutores através dos trajetos condutores definidos em ditas superfícies de conexão, para produzir uma distribuição de corrente uniforme em ditos fios condutores, e onde as ditas superfícies de conexão são cortes transversais na forma de uma linha reta que define ditos trajetos condutores e onde o dispositivo tem ao menos dois grupos paralelos de cortes alinhados.

9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os fios condutores são dispostos sob toda a superfície da câmara.

10. Dispositivo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma das bases tem terminais elétricos que estão em contato com as ditas superfícies de conexão dos meios de aquecimento.

11. Método para a detecção de material genético por reação em cadeia da polimerase em tempo reai que compreende: introdução de uma amostra em uma câmara de reação a ser analisada e partículas magnéticas, aplicação de um campo magnético à dita câmara de reação para reter as partículas magnéticas dentro da dita câmara. extração do restante da amostra para fora da câmara, produção de uma reação PCR na câmara controlando a temperatura da câmara por meios de aquecimento dispostos para aquecer a dita câmara, remoção da aplicação do campo magnético, submeter a amostra a uma detecção óptica na dita câmara.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que antes da fase de produzir uma reação PCR1 uma Iise das células é feita por aquecimento e onde antes da fase de produção de uma reação PCR uma Iise química das células é realizada.

13. Método de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a detecção óptica na câmara é realizada por um microscópio epifluorescente ou sistema equivalente.

14. Método de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o controle de temperatura inclui um primeiro ciclo de temperatura adequado para produzir a pré-ativação da enzima de polimerase e para produzir a ampiificação da amostra, se necessário.

15. Método de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o método é implementado no dispositivo das reivindicações 1 a 10.

16. Método de acordo com as reivindicações 12 e 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro ciclo de temperatura da reação PCR produz a Iise da célula.