BRPI0720468B1 - NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND METHODS FOR ALTERING THE LENGTH OF THE FIBER OF THE PLANT AND / OR THE HEIGHT OF THE PLANT - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRU-TOS DE ÁCIDO NUCLEICO E MÉTODOS PARA ALTERAR O COMPRIMENTO DA FIBRA DA PLANTA E/OU A ALTURA DA PLANTA".Report of the Invention Patent for "NUCLEIC ACID BUILDINGS AND METHODS FOR CHANGING PLANT FIBER LENGTH AND / OR PLANT HEIGHT".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADOCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US 60/871.048, depositado em 20 de dezembro de 2006, cujo teor é aqui incorporado a título de referência, na íntegra.This application claims the priority of Provisional Application US 60 / 871,048, filed December 20, 2006, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

CAMPO DE INVENÇÃOFIELD OF INVENTION

A presente invenção refere-se aos campos de biologia molecular e alteração de expressão gênica em plantas transformadas. Mais especificamente, esta invenção refere-se à modificação do comprimento da fibra e/ou altura d planta de interesse industrial por regulação da expressão de genes que codificam cinases associadas à parede (WAKSs). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A demanda crescente por produtos de madeira e produtos derivados de madeira constitui um problema de proporção global. É estimado que a taxa sustentável máxima de colheita das florestas no mundo já tenha sido alcançada. Assim, há uma necessidade iminente por mais plantas lenhosas, bem com uma necessidade de desenvolver métodos para aumentar as propriedades agronômicas das plantas florestais, tais como altura da planta aumentada, produção da biomassa aumentada, comprimento de fibra do xilema mais longo. Por exemplo, a uniformidade e resistência da fibra são exigências comuns na maioria dos usos industriais. Na fabricação da polpa, as características de resistência são determinadas em parte pelo comprimento da fibra. Fibras longas são ideais para produção de papel forte, aumento do rendimento de polpa, e redução do consumo de álcali, devido as suas propriedades de resistência e ligantes.The present invention relates to the fields of molecular biology and alteration of gene expression in transformed plants. More specifically, this invention relates to modifying the fiber length and / or plant height of industrial interest by regulating the expression of wall-associated kinase-encoding genes (WAKSs). BACKGROUND OF THE INVENTION Growing demand for wood products and wood products is a global problem. It is estimated that the world's maximum sustainable harvest rate for forests has already been reached. Thus, there is an imminent need for more woody plants, as well as a need to develop methods to increase the agronomic properties of forest plants, such as increased plant height, increased biomass production, longer xylem fiber length. For example, fiber uniformity and strength are common requirements in most industrial uses. In pulp manufacture, strength characteristics are determined in part by fiber length. Long fibers are ideal for strong paper production, increased pulp yield, and reduced alkali consumption due to their strength and binder properties.

Como um exemplo da importância das plantas lenhosas, pode-se mencionar os eucaliptos que representam as maiores fontes de fibras usadas globalmente na indústria de papel (Bamber, 1985, Appita 38: 210-216). Há uma estimativa de dez a quinze milhões de hectares de terra plantados com eucalipto. Verhaegen e Plomion, 1996, Genome 39: 1051-1061. A maior vantagem do eucalipto é o seu crescimento rápido e capacidade de crescer em uma ampla faixa de condições, tanto tropicais como temperadas. As fibras de eucalipto têm, contudo, uma desvantagem em comparação com as fibras de outras fontes, como o pinheiro, que é seu comprimento signifi-cantemente mais curto. Assim, os papéis que são feitos de polpa de eucalipto são frequentemente fracos e requerem usualmente reforço com fibras mais longas de outras fontes, aumentando os custos de produção. O comprimento da fibra é controlado por regulação endógena do alongamento da célula, um processo que resulta da interação entre a pressão de turgescência interna e a resistência mecânica da parede celular, mas seu mecanismo e genes envolvidos não foram ainda totalmente compreendidos. Células de fibras de xilema se desenvolvem de iniciais fusifor-mes já bastantes alongadas localizadas dentro do câmbio vascular. Elas aumentam de diâmetro por extensão de suas paredes radiais, e, além disso, desenvolvem células de fibras que se alongam por crescimento da ponta intrusiva, o que resulta em até um aumento de várias vezes o comprimento da célula. Gray-Mitsumune etal., 2004, Plant Physiol. 135:1552-1564.As an example of the importance of woody plants, we can mention eucalyptus that represent the largest sources of fiber used globally in the paper industry (Bamber, 1985, Appita 38: 210-216). There are an estimated ten to fifteen million hectares of land planted with eucalyptus. Verhaegen and Plomion, 1996, Genome 39: 1051-1061. Eucalyptus's biggest advantage is its rapid growth and ability to grow in a wide range of conditions, both tropical and temperate. Eucalyptus fibers, however, have a disadvantage compared to fibers from other sources, such as pine, which is significantly shorter in length. Thus, papers that are made of eucalyptus pulp are often weak and usually require longer fiber reinforcement from other sources, increasing production costs. Fiber length is controlled by endogenous regulation of cell elongation, a process that results from the interaction between internal turgor pressure and mechanical resistance of the cell wall, but its mechanism and genes involved have not yet been fully understood. Xylem fiber cells develop from already rather elongated fusiforem initials located within the vascular cambium. They increase in diameter by extending their radial walls, and furthermore develop fiber cells that lengthen by growth of the intrusive tip, which results in up to several times the length of the cell. Gray-Mitsumune et al., 2004, Plant Physiol. 135: 1552-1564.

Em célula de crescimento de ponta, a expansão ocorre em uma área pequena da superfície da célula, que resultar em células tubulares, a-longadas. Por exemplo, as fibras do choupo se alongam intrusivamente na zona de expansão radial no xilema, alcançando 150% de seu comprimento celular inicial em média quando integralmente diferenciado, Hussey et al., 2006, Annu. Rev. Plant Biol. 57: 109-125; Mellerowicz et al., 2001, Plant Mol. Biol. 47: 239-274. A rápida expansão de células de fibra pode ser obtida por ação orquestrada da pressão contra a parede celular exercida por turgescência e afrouxamento da parede celular. Em fibras de algodão, a fase de alongamento celular segue uma elevação significante de turgescência, resultado do acúmulo observado de malato, açúcares, e K\ o principal osmótico, logo o influxo de água e a geração de alta turgescência nas células da fibra. Ruan et al., 2004, Plant Physiol. 136: 4104-4113.In cutting-edge growth cells, expansion occurs on a small area of the cell surface, which results in long, tubular cells. For example, poplar fibers lengthen intrusively in the radial expansion zone in the xylem, reaching 150% of their initial cell length on average when fully differentiated, Hussey et al., 2006, Annu. Rev. Plant Biol. 57: 109-125; Mellerowicz et al., 2001, Plant Mol. Biol. 47: 239-274. Rapid expansion of fiber cells can be achieved by the orchestrated action of pressure against the cell wall exerted by turgidity and loosening of the cell wall. In cotton fibers, the phase of cellular elongation follows a significant elevation of turgidity, as a result of the observed accumulation of malate, sugars, and the major osmotic, hence the influx of water and the generation of high turgidity in the fiber cells. Ruan et al., 2004, Plant Physiol. 136: 4104-4113.

Invertases vacuolares têm um papel importante na manutenção da turgescência e expansão da parede celular. Um trabalho recente na Ara-bidopsis thaliana mostrou que uma cinase associada à parede (WAK) pode regular uma invertase vacuolar estabelecendo assim uma ligação compor-tamental cruzada entre WAK e as invertase(s) vacuolar(es). Kohorn et al., 2006, Plant J. 46: 307-316.Vacuolar invertases play an important role in maintaining turgidity and cell wall expansion. Recent work in Ara-bidopsis thaliana has shown that a wall-associated kinase (WAK) can regulate a vacuolar invertase thereby establishing a cross-behavioral link between WAK and vacuolar invertase (s). Kohorn et al., 2006, Plant J. 46: 307-316.

As WAKs na Arabidopsis são codificadas por cinco genes firmemente ligados e altamente similares, e são expressos nas folhas, meris-temas, e nas células que passam por expansão. Wagner e Kohorn, 2001, Plant Ce//13: 303-318.WAKs in Arabidopsis are encoded by five tightly linked and highly similar genes, and are expressed in leaves, meris themes, and cells undergoing expansion. Wagner and Kohorn, 2001, Plant Ce 13: 303-318.

Semeaduras mutantes da Arabidopsis thaliana apresentando uma inserção de T-DNA no gene da WAK2 eram significantemente mais curta que as plantas do tipo selvagem, com as raízes mais afetadas que os hi-pocótílos. Kohorn etal., 2006, Plant J. 46: 307-316.Mutant seedings of Arabidopsis thaliana showing a T-DNA insert in the WAK2 gene were significantly shorter than wild type plants, with roots more affected than hypocotyls. Kohorn et al., 2006, Plant J. 46: 307-316.

Essas plantas mutantes mostraram uma atividade de invertase vacuolar reduzida em 62%, e os autores propuseram que a WAK 2 regula a transcrição da invertase vacuolar como um constituinte de um mecanismo regulador das concentrações do soluto e da regulação de turgescência, proporcionando, assim, um mecanismo possível para WAK para regular a expansão celular. A expressão de uma WAK2 antissentido induzível na Arabidopsis levou a uma redução de 50% nos níveis de proteína WAK, com perda subsequente de alongamento celular e logo a plantas anãs. Resultados similares reportados quando um gene WAK4 foi usado para reduzir os níveis totais de proteína WAK. Wagner e Kohorn, 2001, Plant Cell 13: 303-318; Lal-ly etal., 2001, Plant Cell 13: 1317-1331.These mutant plants showed a 62% reduced vacuolar invertase activity, and the authors proposed that WAK 2 regulates vacuolar invertase transcription as a constituent of a mechanism regulating solute concentrations and turgescence regulation, thus providing possible mechanism for WAK to regulate cell expansion. Expression of an inducible antisense WAK2 in Arabidopsis led to a 50% reduction in WAK protein levels, with subsequent loss of cell elongation and then to dwarf plants. Similar results reported when a WAK4 gene was used to reduce total WAK protein levels. Wagner and Kohorn, 2001, Plant Cell 13: 303-318; Lal-ly etal., 2001, Plant Cell 13: 1317-1331.

Sabe-se que as cinases associadas à parede contêm domínios extracelulares que podem estar ligadas às moléculas de pectina da parede celular, englobar a membrana plasmática e ter um domínio de cinase cito-plasmática de serina/treonina. He et al. 1999, Plant Mol. Biol. 39: 1189-1196.Wall-associated kinases are known to contain extracellular domains that may be attached to cell wall pectin molecules, encompass the plasma membrane, and have a serine / threonine cytoplasmic kinase domain. He et al. 1999, Plant Mol. Biol. 39: 1189-1196.

Quando as fibras são submetidas a alongamento significante em ambas as extremidades (crescimento de ponta intrusivo), as propriedades do limite de lamela média deste tipo de crescimento celular. Lamelas médias de células de madeira em desenvolvimento são ricas em pectinas, e o crescimento de ponta intrusivo requer a dissolução da lamela média. Vide Berthold et al., WO 2006/068603.When fibers are subjected to significant elongation at both ends (intrusive tip growth), the properties of the mean lamella boundary of this type of cell growth. Medium lamellae of developing wood cells are rich in pectins, and intrusive tip growth requires dissolution of the medium lamella. See Berthold et al., WO 2006/068603.

Por sua ligação de pectina, é possível que as WAKs possam detectar uma alteração no ambiente da parede celular, proporcionado assim um mecanismo molecular que ligar a parede celular detectando a regulação do metabolismo do soluto, que, por sua vez, sabe-se que está envolvido na manutenção da turgescência e da expansão celular nas células em crescimento. Tal informação pode ser inestimável para o ajuste da expansão celular ou turgescência. Huang et al., Funcional Plant Biology, 34: 499-507.By their pectin binding, it is possible that WAKs can detect a change in the cell wall environment, thus providing a molecular mechanism that binds the cell wall by detecting regulation of solute metabolism, which in turn is known to be involved in maintaining turgidity and cell expansion in growing cells. Such information can be invaluable for adjusting cell expansion or turgidity. Huang et al., Functional Plant Biology, 34: 499-507.

As características das fibras são controladas por um conjunto complexo de fatores genéticos e não são facilmente tratáveis por métodos de multiplicação clássica. Através da geração de árvores lenhosas tradicionais, é possível obter alguma modificação das características das fibras, Por exemplo, híbridos triplóides interespecíficos do choupo têm sido desenvolvidos com fibras mais longas que as espécies parentes. Aziz et al., 1996, Wo-od and pulp properties of aspen and its hybrids. TAPPÍ Proc. Pulping Confe-rence. p. 437-443. Ainda, considerando a desvantagem da multiplicação de árvores lenhosas tradicionais, tal como o progresso lento devido aos seus períodos longos de geração e a dificuldade de se produzir uma planta com uma característica desejável, os desenvolvimentos de tecnologia gênica podem reduzir de modo significante o tempo requerido para produzir uma nova variedade e possibilitar o alvejamento mais próximo das características consideradas desejáveis pelas indústrias florestais e de polpa em espécies de árvores específicas.Fiber characteristics are controlled by a complex set of genetic factors and are not easily treatable by classical multiplication methods. Through the generation of traditional woody trees, it is possible to obtain some modification of the fiber characteristics. For example, interspecific triploid poplar hybrids have been developed with longer fibers than parent species. Aziz et al., 1996, Wo-od and pulp properties of aspen and its hybrids. TAPPÍ Proc. Pulping Confe-rence. P. 437-443. Also, given the disadvantage of traditional woody tree multiplication, such as slow progress due to their long generation periods and the difficulty of producing a plant with a desirable trait, gene technology developments can significantly reduce the time required. to produce a new variety and enable targeting closer to the characteristics considered desirable by the forest and pulp industries in specific tree species.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

Em um aspecto, a invenção proporcionar um construto de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeos de WAK ligada operavelmente a um promotor de preferido de xilema que causa a super-expressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK. Em uma modalidade, a promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em promotor de gene TUB, promotor de gene SuSy, promotor de gene COMT e promotor de gene C4H. Em uma outra modalidade, uma planta transgênica compreende o construto de ácido nucleico e a planta tem um aumento do comprimento da fibra e/ou altura em comparação com uma planta não-transgênica da mesma espécie. Em outras modalidades, a planta é uma dicotiledônea, monocotiledônea, gimnoesperma, ou árvore de madeira de lei. A invenção contempla ainda a progênie da planta transgênica, bem como a polpa de madeira e a fibra de madeira produzidas da planta transgênica.In one aspect, the invention provides a nucleic acid construct comprising a WAK polynucleotide sequence operably linked to a preferred xylem promoter that causes overexpression of said WAK polynucleotide sequence. In one embodiment, the preferred xylem promoter is selected from the group consisting of TUB gene promoter, SuSy gene promoter, COMT gene promoter, and C4H gene promoter. In another embodiment, a transgenic plant comprises the nucleic acid construct and the plant has an increase in fiber length and / or height compared to a non-transgenic plant of the same species. In other embodiments, the plant is a dicot, monocot, gymnosperm, or hardwood tree. The invention further contemplates the progeny of the transgenic plant as well as the wood pulp and wood fiber produced from the transgenic plant.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para aumentar o comprimento da fibra e/ou a altura da planta, compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta um construto de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeos de WAK ligada operavel-mente a um promotor preferido de xilema que causa superexpressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK; (b) cultivar a dita célula da planta sob condições que promovem o crescimento de uma planta; e (c) selecionar uma planta transgênica que tem comprimento de fibra e/ou altura de planta, aumentados; e (c) selecionar uma planta transgênica em comparação com uma planta não-transgênica da mesma espécie.In another aspect, the invention provides a method for increasing fiber length and / or plant height, comprising: (a) introducing into a plant cell a nucleic acid construct comprising an operably linked WAK polynucleotide sequence to a preferred xylem promoter that causes overexpression of said WAK polynucleotide sequence; (b) cultivating said plant cell under conditions that promote the growth of a plant; and (c) selecting a transgenic plant that has increased fiber length and / or plant height; and (c) select a transgenic plant compared to a non-transgenic plant of the same species.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra esquematicamente o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção que compreende uma promotor preferido de câmbio/xilema que aciona a expressão de uma sequência de nucleotídeos de cinase associada à parede da invenção. A Figura 2 mostra o comprimento da fibra de várias linhagens transgênicas transformadas com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK e as respectivas plantas não-transgênicas. O asterisco denota os valores de comprimento médios de fibra mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). A Figura 3 mostra o comprimento de fibra de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linhagem 51B) transoformadas com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asteris- co denota os valores de comprimento médios de fibra mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). A Figura 4 mostra o comprimento de fibra de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linhagem 47B) transformada com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asterisco denota os valores de comprimento médios mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). A Figura 5 mostra a altura da planta dos três genótipos de uma linhagem transgênica T1 (linhagem 51B) transformada com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asterisco denota os valores de comprimento médios mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENCAÕ A presente invenção refere-se a processos para a manipulação genética de comprimento de fibra em plantas e/ou aumento da altura da planta. A parede celular da planta é uma rede fibrilar forte que da a cada célula sua conformação estável. Para aumentar, as células seletivamente se afrouxam da célula, permitindo que ela ceda às forças expansivas geradas pela pressão de turgescência da célula. Conforme a célula se expande, há uma necessidade aumentada de ajuste compensador da turgescência, que é dependente do metabolismo do soluto da célula.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 schematically illustrates the inventive pALELLYX-WAK plant expression plasmid vector comprising a preferred exchange / xylem promoter that triggers expression of a wall-associated kinase nucleotide sequence of the invention. Figure 2 shows the fiber length of various transgenic strains transformed with the pALELLYX-WAK plant expression plasmid vector and the respective non-transgenic plants. The asterisk denotes the highest statistically significant mean fiber length values (P <0.05, t-test). Figure 3 shows the fiber length of two genotypes of a transgenic T1 plant (strain 51B) transformed with the pALELLYX-WAK plant expression plasmid vector of the invention. The asterisk denotes the highest statistically significant mean fiber length values (P <0.05, t-test). Figure 4 shows the fiber length of two genotypes of a transgenic T1 plant (lineage 47B) transformed with the pALELLYX-WAK plant expression plasmid vector of the invention. The asterisk denotes the highest statistically significant mean length values (P <0.05, t-test). Figure 5 shows the plant height of the three genotypes of a transgenic T1 strain (51B strain) transformed with the pALELLYX-WAK plant expression plasmid vector of the invention. The asterisk denotes the highest statistically significant mean length values (P <0.05, t-test). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to methods for genetically manipulating fiber length in plants and / or increasing plant height. The plant cell wall is a strong fibrillar network that gives each cell its stable conformation. To increase, the cells selectively loosen from the cell, allowing it to give in to the expansive forces generated by the cell's turgor pressure. As the cell expands, there is an increased need for turgor compensatory adjustment, which is dependent on the cell's solute metabolism.

Uma cinase associada à parede (WAK) pode detectar a expansão da parede celular por sua ligação à pectina, proporcionando assim um mecanismo para transdução destes sinais aos sistemas que regulam as alterações no soluto, conforme descrição acima. Contudo, a trabalho anterior sobre WAKs não previu que a superexpressão de um gene de WAK na planta, em um modo específico de tecido, resulta em alterações significantes do comprimento da fibra, bem como alterações significantes da altura da planta. O resultado abre caminho para modificação das características do comprimento da fibra, bem como das alterações significativas da altura da planta. O resultado abre caminho para modificar características que são extremamen- te importantes para as indústrias de fibras vegetais, florestais, de polpa, e de papel.A wall-associated kinase (WAK) can detect cell wall expansion by binding to pectin, thereby providing a mechanism for transducing these signals to systems that regulate changes in solute, as described above. However, previous work on WAKs did not predict that overexpression of a plant WAK gene in a tissue-specific mode results in significant fiber length changes as well as significant plant height changes. The result paves the way for modifying fiber length characteristics as well as significant plant height changes. The result paves the way for modifying characteristics that are extremely important for the vegetable, forest, pulp, and paper industries.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para modificar o comprimento da fibra em tecidos de planta, tais como células de fibra do xilema de angiosperma lenhosa, células tra-queídes de xilema de gimnoesperma, e células de fibras de sementes algodão, por controle da atividade da cinase associada à parede. De acordo com esse aspecto da invenção, células de plantas ou plantas inteiras são geneticamente engenheiradas geneticamente com sequência de codificação da cinase associada à parede, que, quando expressa em células de fibras xila-res das angiospermas, traqueídes xilares de gimnospermas, ou células de fibras das sementes de algodão, provoca um aumento do comprimento da célula.According to one aspect of the present invention, there is provided a method for modifying fiber length in plant tissues such as woody angiosperm xylem fiber cells, gymnosperm xylem tracheid cells, and seed fiber cells cotton, by controlling the kinase activity associated with the wall. According to this aspect of the invention, plant cells or whole plants are genetically engineered with a wall-associated kinase coding sequence, which, when expressed in angiosperm xylar fiber cells, gymnosperm xilar tracheids, or cottonseed fibers causes an increase in cell length.

Todos os termos técnicos usados aqui são termos comumente usados em bioquímica, biologia molecular e agricultura, e podem ser entendidos por aquele com conhecimento ordinário na técnica ao qual esta invenção. Aqueles termos técnicos podem ser encontrados em: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience, Nova Iorque, 1988 (com atualizações periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5a ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. Metodologia envolvendo técnicas de biologia de plantas é descrita aqui e descrita em detalhes em tratados tais como METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Várias técnicas usando PCR são descritas por técnicas usando PCR são descritas, por exemplo, por Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 e por Dveksler, PCR PRIMER: A LABO RATO RY MANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y., 2003. Pares de primers em PCR podem ser derivados de sequências conhecidas por técnicas conhecidas, tal como usar programas pretendidos para este propósito, por exemplo, Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biome-dical Research, Cambridge, MA, Métodos para síntese química de ácidos nucleicos são discutidos, por exemplo, por Beaucage and Caruthers, 1981, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, e Matteucci e Caruthers, 1981, J Am. Chem. Soc. 103: 3185.All technical terms used herein are terms commonly used in biochemistry, molecular biology and agriculture, and may be understood by one of ordinary skill in the art to which this invention is based. Those technical terms can be found at: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook and Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience, New York, 1988 (with periodic updates); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5th ed., Vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. Methodology involving plant biology techniques is described herein and described in detail in treaties such as METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1995. Various techniques using PCR are described by techniques using PCR are described, for example, by Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS , Academic Press, San Diego, 1990 and by Dveksler, PCR PRIMER: A LABO MOUSE RY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003. PCR primer pairs may be derived from known sequences. by known techniques, such as using intended programs for this purpose, for example, Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA. Methods for chemical synthesis of nucleic acids are discussed, for example, by Beaucage. and Caruthers, 1981, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, and Matteucci and Caruthers, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185.

Digestões de enzima de restrição, fosforilações, ligações e transformações foram feitas por Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos e materiais usados para o crescimento e manutenção de células bac-terianas foram obtidos da Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), DIFCO Laboratories (Detroit, Ml), Invitrogen (Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que de outro modo especificado.Restriction enzyme digestions, phosphorylations, ligations and transformations were made by Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. All and materials used for bacterial cell growth and maintenance were obtained from Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, M1), Invitrogen (Gaithersburg, MD), or Sigma Chemical Company (St. Louis, MO ) unless otherwise specified.

Os termos "codificação" referem-se ao processo pelo qual um gene, através dos mecanismos de transcrição e de tradução, proporciona informação a uma célula do qual uma série de aminoácidos podem ser montada em um sequência de aminoácidos específica para produzir uma enzima ativa. Devido à degenerescência do código genético, são contempladas certas alterações de base em sequência de DNA não alteram a sequência de aminoácidos de uma proteína. Portanto, é entendido que modificações na sequência de DNA que codifica cinase associada à parede que não afetam substancialmente as propriedades funcionais da proteína.The terms "coding" refer to the process by which a gene, through transcription and translation mechanisms, provides information to a cell from which a series of amino acids can be assembled into a specific amino acid sequence to produce an active enzyme. Due to the degeneracy of the genetic code, certain base changes in DNA sequence are contemplated that do not alter the amino acid sequence of a protein. Therefore, it is understood that modifications to the wall-associated kinase-encoding DNA sequence that do not substantially affect the functional properties of the protein.

Nessa descrição, "expressão" denota a produção do produto de proteína codificado por um gene. Alternativamente ou adicionalmente, "expressão" denota a combinação dos processos intracelulares, incluindo transcrição e tradução, sofridos por uma molécula de DNA codificação tal como um gene estrutural produzir um polipeptídeo. "Superexpressão" refere-se à expressão de uma sequência de genes particular na qual a produção do mRNA ou polipeptídeo em um organismo transgênico excede os níveis de produção em organismo não-transgênico. O termo "ácido nucleico heterólogo" refere-se a um ácido nuclei-co, DNA ou RNA, que foi introduzido em uma célula (ou o antepassado da célula) através dos esforços dos humanos. Tal ácido nucleico exógeno pode ser uma cópia de uma sequência que é naturalmente encontrado na célula na qual foi ele foi introduzido, ou fragmentos destes.In this description, "expression" denotes the production of the protein product encoded by a gene. Alternatively or additionally, "expression" denotes the combination of intracellular processes, including transcription and translation, undergone by a coding DNA molecule such as a structural gene producing a polypeptide. "Overexpression" refers to the expression of a particular gene sequence in which mRNA or polypeptide production in a transgenic organism exceeds production levels in a non-transgenic organism. The term "heterologous nucleic acid" refers to a nucleic acid, DNA or RNA, which has been introduced into a cell (or cell ancestor) through the efforts of humans. Such exogenous nucleic acid may be a copy of a sequence that is naturally found in the cell into which it was introduced, or fragments thereof.

Em contraste, o termo "ácido nucleico endógeno" refere-se a um ácido nucleico, gene, polinucleotídeo, uma molécula de DNA, RNA, mRNA, ou cDNA que está presente em uma planta ou no organismo que é para ser geneticamente engenheirado. Uma sequência endógena é "nativa" para, isto é, indígena para, a planta ou o organismo que é para ser geneticamente engenheirado. O termo "sequências homólogas" refere-se a sequências de po-linucleotídeos ou de polipeptídeos que são similares devido à ancestralidade e conservação de sequências comuns. O termo "homólogo funcional" refere-se a sequências de polinucleotídeo ou de polipeptídeo que são similares devido à ancestralidade e conservação de sequências comuns e têm função idêntica ou similar nos níveis catalíticos, celulares, ou em organismos.In contrast, the term "endogenous nucleic acid" refers to a nucleic acid, gene, polynucleotide, a DNA, RNA, mRNA, or cDNA molecule that is present in a plant or organism that is to be genetically engineered. An endogenous sequence is "native" to, that is, indigenous to, the plant or organism that is to be genetically engineered. The term "homologous sequences" refers to polynucleotide or polypeptide sequences that are similar due to the ancestry and conservation of common sequences. The term "functional homologue" refers to polynucleotide or polypeptide sequences that are similar due to the ancestry and conservation of common sequences and have identical or similar function at catalytic, cellular, or organism levels.

Sequências de Cinase Associadas à Parede Nessa descrição, o termo "sequências de polinucleotídeos de cinase associada à parede" denota qualquer ácido nucleico, gene, molécula de DNA, RNA, mRNA, ou de cDNA que codifica um polipeptídeo de cinase associada à parede cuja superexpressão altera o comprimento da fibra e/ou a altura da planta. O DNA ou o RNA pode ser de fita dupla ou de fita simples. DNA de fita simples pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita sentido, o pode ser a fita de não codificação, também chamada de a fita antissentido. Ilustrativos desta categoria são moléculas de polinucleotídeos que compreendem SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7 e 9, identificadas da Arabidopsis thaliana e que podem ser empregadas para aumentar o comprimento da fibra e/ou a altura da planta. A sequência de polinucleotídeo de cinase associada à parede adequada para a presente invenção pode ser identificada de uma miríade de organismos caracterizados pela presença de um gene de WAK. Embora as sequências de nucleotídeos mencionadas acima estejam descritas aqui, elas não devem ser consideradas como limitações da presente invenção. Assim, uma sequência de WAK pode ser identificada e funcionalmente anotada por comparação de sequências. Aquele versado na técnica pode prontamente identificar uma sequência de WAK em uma base de dados adequada, tal como GenBank, usando programas e parâmetros de análise de sequências publicamente disponíveis. Alternativamente, a seleção de bibliotecas de cD-NA ou de bibliotecas genômicas empregado sondas de hibridização adequadas ou primers com base em DNA ou sequências de proteínas descritas aqui devem levar à identificação de sequências de WAK funcionalmente relacionadas (homólogo funcional). É também apreciado no campo que as sequências com níveis reduzidos de identidade podem ser também isoladas com o auxílio de oligonucleotídeos degenerados e metodologia baseada em PCR. Embora os polinucleotídeos da invenção sejam isolados da Arabidop-sis thaliana, os homólogos funcionais de outras plantas podem ser empregadas para produzir plantas com comprimento de fibra e/ou altura de planta aumentados. Exemplos de espécies de plantas cujos genes de WAK podem ser isolados incluem dicotiledôneas, tais como Cucurbitaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Papilionaceae tal como alfalfa e Vigna unguiculata, Malvace-ae, Asteraceae, Malpighiaceae 8 tal como Populus, Myrtaceae tal como Eucalipto, e monocotiledôenas tais como as gramíneas, incluindo arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada e milho.Wall-Associated Kinase Sequences In this description, the term "wall-associated kinase polynucleotide sequences" denotes any nucleic acid, gene, DNA, RNA, mRNA, or cDNA molecule that encodes a wall-associated kinase polypeptide whose overexpression alters fiber length and / or plant height. DNA or RNA can be double stranded or single stranded. Single stranded DNA can be the coding strand, also known as the sense strand, or the non-coding strand, also called the antisense strand. Illustrative of this category are polynucleotide molecules comprising SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7 and 9, identified from Arabidopsis thaliana and which may be employed to increase fiber length and / or plant height. The suitable wall-associated polynucleotide kinase sequence for the present invention can be identified from a myriad of organisms characterized by the presence of a WAK gene. Although the nucleotide sequences mentioned above are described herein, they should not be considered as limitations of the present invention. Thus, a WAK sequence can be identified and functionally annotated by sequence comparison. One of ordinary skill in the art can readily identify a WAK sequence in a suitable database, such as GenBank, using publicly available sequence analysis programs and parameters. Alternatively, selection of cD-NA libraries or genomic libraries employing suitable hybridization probes or DNA-based primers or protein sequences described herein should lead to the identification of functionally related (functional homologous) WAK sequences. It is also appreciated in the field that sequences with reduced levels of identity can also be isolated with the aid of degenerate oligonucleotides and PCR based methodology. Although the polynucleotides of the invention are isolated from Arabidop-sis thaliana, functional homologues of other plants may be employed to produce plants with increased fiber length and / or plant height. Examples of plant species whose WAK genes can be isolated include dicotyledons such as Cucurbitaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Papilionaceae such as Alfalfa and Vigna unguiculata, Malvace-ae, Asteraceae, Malpighiaceae 8 such as Populus, Myrtaceae such as Eucalyptus, and Monocotylede. such as grasses including rice, wheat, sugar cane, barley and corn.

Nessa descrição, os termos "sequência de polinucleotídeos de cinase associada à parede", "sequência de polinucleotídeos de WAK", e "sequência de DNA de WAK" referem-se também a qualquer molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos capazes de hibridízarem sob condições estringentes com qualquer uma das sequências descritas aqui, e de codificarem um polipeptídeo com atividade de WAK equivalente à proteínas tendo sequências de aminoácidos descritas aqui sob SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 ou 10. Os termos incluem também sequência que hibridizam de modo cruzado com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, tendo, preferivelmente, pelo menos 65% de homologia ou identidade com uma ou mais das SEQ ID Nos: 1,3, 5, 6 ou 9. As sequências de nudeotídeos da invenção podem codificar uma proteína que seja homóloga ao produto de gene predito descrito aqui sob qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, ou 10. Ainda, as sequências de nudeotídeos da invenção incluem aquelas sequências que codificam uma polipeptídeo de WAK tendo uma sequências de aminoácidos que tem pelo menos 55%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e de maior preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos descrita aqui sob qualquer uma de SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 e 10. A degenerescência do código genético permite maiores variações na sequência de nudeotídeos de um polinucleotídeo enquanto a sequência de aminoácidos da proteína codificada é mantida. A frase "condições estringentes" aqui diz respeito a parâmetros com os quais a técnica está familiarizada. Polinucleotídeos de fita simples hibridizam quando eles se associada com base em uma variedade de forças físico-químicas bem caracterizadas, tais como ligação de hidrogênio, exclusão com solvente, e empilhamento de base. A estringência de uma hibridi-zação reflete o grau de identidade da sequência dos ácidos nucleicos envolvidos, de modo que quando maior a estringência mais similares são as duas fitas de polinucleotídeo. A estringência é influenciada por uma variedade de fatores, incluindo temperatura, concentração e composição de sais, aditivos orgânicos e inorgânicos, solventes, etc. presentes tanto na hibridização e soluções de lavagem como nas incubações (e número). Aquele com conhecimento ordinário da técnica pode selecionar prontamente tais condições variando a temperatura durante a reação de hibridização e o processo da lavagem, a concentração de sal durante a reação de hibridização e o processo de lavagem, e assim por diante.In that description, the terms "wall-associated kinase polynucleotide sequence", "WAK polynucleotide sequence", and "WAK DNA sequence" also refer to any nucleic acid molecule having a nucleotide sequence capable of hybridizing. under stringent conditions with any of the sequences described herein, and of encoding a protein equivalent WAK activity polypeptide having amino acid sequences described herein under SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 or 10. The terms also include sequence which cross-hybridize to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9, preferably having at least 65% homology or identity to one or more more than SEQ ID Nos: 1,3, 5, 6 or 9. The inventive nudeotide sequences may encode a protein that is homologous to the predicted gene product described herein under any of SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, or 10. Still, the nud sequences The eotides of the invention include those sequences encoding a WAK polypeptide having an amino acid sequence that is at least 55%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 90%. and most preferably at least 95% sequence identity with an amino acid sequence described herein under any one of SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 and 10. The degeneracy of the genetic code allows for greater variations in the sequence of amino acids. a polynucleotide while the amino acid sequence of the encoded protein is maintained. The phrase "stringent conditions" here refers to parameters with which the technique is familiar. Single-stranded polynucleotides hybridize when they associate themselves based on a variety of well-characterized physicochemical forces, such as hydrogen bonding, solvent exclusion, and base stacking. The stringency of a hybridization reflects the degree of sequence identity of the nucleic acids involved, so that the higher the stringency most similar are the two polynucleotide strands. Stringency is influenced by a variety of factors including temperature, concentration and composition of salts, organic and inorganic additives, solvents, etc. present in both hybridization and washing solutions and incubations (and number). One of ordinary skill in the art can readily select such conditions by varying the temperature during the hybridization reaction and the washing process, the salt concentration during the hybridization reaction and the washing process, and so on.

Para hibridização de ácidos nucleicos complementares que têm mais que 100 resíduos complementares, em um filtro em Southern ou Northern blot, as condições de hibridização "estringentes" são exemplificadas por uma temperatura que é de cerca de 5°C a 20°C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica, em uma resistência iônica e pH definidos. Tm é a temperatura sob resistência iônica e pH definidos, onde 50% da sequência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente correspondente. Moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estringentes hibridizarão tipicamente para um sonda com base ou no cDNA inteiro ou em porções selecionadas. Mais preferivelmente, "condições estringentes" referem-se aqui aos parâmetros com os quais a técnica está familiarizada, tais como hibridização em 3,3 x SSC, 1 x solução de Denhardt, tampão de fosfato de sódio 25mM (pH 7,0), SDS a 0,5%, e EDTA 2mM, por 18 horas a 65°C, seguido por quatro lavagens do filtro, a 65°C, por 20 minutos, em 2 x SSC e SDS a 0,1%, e uma lavagem final por até 20 minutos em 0,5 x SSC e SDS a 0,1% ou 0,3 x SSC e SDS a 0,1% para maior estringência, e 0,1 x SSC e SDS a 0,1% para uma estringência maior. Outras condições podem ser substituídas desde que o grau de estringência seja igual ao fornecido aqui, usando-se uma lavagem fina com 0,5 x SSC. Para identificação de homólogos menos intimamente relacionados pode ser realizada em uma temperatura inferior, por exemplo, 50°c. Em geral, a estringência é aumentada por elevação da temperatura de lavagem e/ou decréscimo da concentração de SSC.For hybridization of complementary nucleic acids having more than 100 complementary residues on a Southern or Northern blot filter, "stringent" hybridization conditions are exemplified by a temperature which is about 5 ° C to 20 ° C below the point. melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature under defined ion resistance and pH, where 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. Nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions will typically hybridize to a probe based on either the entire cDNA or selected portions. More preferably, "stringent conditions" herein refers to the parameters with which the technique is familiar, such as 3.3 x SSC hybridization, 1 x Denhardt's solution, 25mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 0.5% SDS, and 2mM EDTA, for 18 hours at 65 ° C, followed by four filter washes at 65 ° C for 20 minutes in 2 x SSC and 0.1% SDS, and one wash up to 20 minutes in 0.5 x SSC and 0.1% SDS or 0.3 x SSC and 0.1% SDS for greater stringency, and 0.1 x SSC and 0.1% SDS for a greater stringency. Other conditions may be substituted as long as the degree of stringency is equal to that provided herein using a 0.5 x SSC fine wash. For identification of less closely related homologs can be performed at a lower temperature, for example 50 ° C. In general, stringency is increased by increasing the wash temperature and / or decreasing the SSC concentration.

Adicionalmente, a categoria de sequências de cinase associada à parede, adequadas, incluir uma molécula de ácido nucleico compreendida de uma variante de SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 7 ou 9 com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas ou adicionadas, cuja variante codifica um polipeptídeo quando superexpressado resulta na alteração do comprimento de fibra e/ou altura da planta. As "sequências de base com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas, ou adicionadas" referidas aqui são largamente conhecidas por aqueles versado na técnica para reter a atividade fisiológica mesmo quando a sequência de aminoácidos de uma proteína tendo geralmente esta atividade fisiológica tem um ou mais aminoácidos substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados. Por exemplo, a cauda de poly A ou as regiões de não-tradução das extremidades 5' ou 3' podem ser deletadas, e as base podem ser deletadas desde que os aminoácidos sejam deletados. As bases podem ser também substituídas desde que não resulte em deslocamento de estrutura. As bases podem ser também "adicionadas" desde que os aminoácidos sejam adicionados. Contudo, é essencial que qualquer de tal modificação não resulte na perda de atividade fisiológica. Um DNA modificado neste contexto pode ser obtido por modificação das sequências de base de DNA da invenção de modo que os aminoácidos em sítios específicos sejam substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados por mutagênese sítio-específica, por exemplo, Zoller & Smith, 1982, Nucleic Acid Res. 10: 6487-6500. Por conseguinte, o termo "variante" é uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos que desvia do padrão ou dada sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos de um gene ou proteína particular. A variante pode ter alterações "conservativas", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, reposição da leucina por isoleucina. Uma variante por ter alterações "não conservativas", por exemplo, reposição de uma glicina por um triptofano. Menores variações análogas podem incluir também deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. A orientação cujos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos da técnica tal como software Vector NTI Suíte (InforMax, MD). "Variante" pode também se referir a um gene "shuffled", conforme descrito, por exemplo, mas patentes US 6.506.603, US 6.132.970, US 6.165.793 e US 6.117.679.In addition, the suitable category of wall-associated kinase sequences will include a nucleic acid molecule comprised of a variant of SEQ ID Nos: 1 or 3 or 5 or 7 or 9 with one or more deleted, substituted, inserted or added bases. which variant encodes a polypeptide when overexpressed results in alteration of fiber length and / or plant height. The "base sequences with one or more deleted, substituted, inserted, or added bases" referred to herein are widely known to those skilled in the art for retaining physiological activity even when the amino acid sequence of a protein generally having this physiological activity has a or more substituted, deleted, inserted, or added amino acids. For example, the poly A tail or 5 'or 3' end non-translating regions may be deleted, and the bases may be deleted as long as the amino acids are deleted. The bases may also be substituted as long as it does not result in frame displacement. The bases may also be "added" as long as amino acids are added. However, it is essential that any such modification does not result in loss of physiological activity. A DNA modified in this context may be obtained by modifying the DNA base sequences of the invention such that amino acids at specific sites are replaced, deleted, inserted, or added by site-specific mutagenesis, for example, Zoller & Smith, 1982, Nucleic Acid Res. 10: 6487-6500. Accordingly, the term "variant" is a nucleotide or amino acid sequence that deviates from the standard or given nucleotide or amino acid sequence of a particular gene or protein. The variant may have "conservative" changes, wherein a substituted amino acid has similar structural or chemical properties, for example, leucine replacement by isoleucine. A variant for having "non-conservative" changes, for example replacement of a glycine by tryptophan. Minor analogous variations may also include amino acid deletions or insertions, or both. The orientation whose amino acid residues can be substituted, inserted or deleted can be found using computer programs well known in the art such as Vector NTI Suite software (InforMax, MD). "Variant" may also refer to a "shuffled" gene as described, for example, but US 6,506,603, US 6,132,970, US 6,165,793 and US 6,117,679.

Um outro modo de obter uma sequência de DNA de WAK é para sintetizá-la ab initio das bases apropriadas, por exemplo, pelo uso da sequência de cDNA apropriada como um molde.Another way to obtain a WAK DNA sequence is to synthesize it ab initio from the appropriate bases, for example, by using the appropriate cDNA sequence as a template.

Construtos de Ácido Nucleico A presente invenção inclui construtos recombinantes que compreendem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos aqui. os construtos compreendem tipicamente um vetor, tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus (por exemplo, um vírus de planta), um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), ou similares, nos quais uma sequência de ácidos nucleicos foi inserida, em uma orientação de avanço ou reversa. Números grandes de vetores adequados são conhecidos e estão comercialmente disponíveis e não precisam ser reiterados aqui.Nucleic Acid Constructs The present invention includes recombinant constructs that comprise one or more nucleic acid sequences herein. constructs typically comprise a vector, such as a plasmid, cosmid, phage, virus (e.g., plant virus), bacterial artificial chromosome (BAC), artificial yeast chromosome (YAC), or the like, in which a nucleic acid sequence has been inserted, in a forward or reverse orientation. Large numbers of suitable vectors are known and commercially available and need not be reiterated here.

Construtos de ácido nucleico recombinantes podem ser feitas usando-se técnicas padrão. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos para transcrição pode ser obtida por tratamento de um vetor contendo a dita sequência com enzimas de restrição para cortar o segmento apropriado. A sequência de nucleotídeos para transcrição pode ser também gerada por anelamento ou ligação de oligonucleotídeos sintéticos ou pelo uso de oligo-nucleotídeos sintéticos em uma reação em cadeia de polimerase (PCR) para dar sítios de restrição adequados em cada extremidade. A sequência de nucleotídeos é então clonada em vetor contendo elementos reguladores adequados, tais como sequências de promotores a montante e terminadores a jusante. Tipicamente, vetores de transformação de planta incluem uma ou mais sequências codificação de plantas clonadas (genômico ou cDNA) sob o controle transcricional de sequências reguladores 5' e 3' e um marcador se-lecionável. Tais vetores de transformação de plantas contêm também tipicamente um promotor, um sítio de partida de iniciação de transcrição, um sinal de processamento de RNA (tal como sequências de sinais de união), um sítio de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação. Inten-sificadores e sequências de alvejamento podem estar também presentes. A invenção proporciona moléculas de ácido nucleico que provavelmente causam comprimento de fibra e altura de planta alterados em uma planta transformada. Um aspecto importante da presente invenção é o uso de construtos de ácido nucleico, em que uma sequência de nucleotídeos de codificação de cinase associada à parede está operavelmente ligada a um ou mais promotores, que acionam a expressão da sequência de codificação de um modo constitutivo ou em certos tipos de células, órgãos, ou tecidos de modo a alterar o comprimento da fibra de uma planta transformada em com- paração com o comprimento da fibra de uma planta não-transgênica.Recombinant nucleic acid constructs may be made using standard techniques. For example, a nucleotide sequence for transcription may be obtained by treating a vector containing said sequence with restriction enzymes to cut off the appropriate segment. The nucleotide sequence for transcription may also be generated by annealing or ligating synthetic oligonucleotides or by using synthetic oligonucleotides in a polymerase chain reaction (PCR) to give suitable restriction sites at each end. The nucleotide sequence is then cloned into a vector containing suitable regulatory elements such as upstream promoter and downstream terminator sequences. Typically, plant transformation vectors include one or more cloned plant coding sequences (genomic or cDNA) under the transcriptional control of 5 'and 3' regulatory sequences and a selectable marker. Such plant transformation vectors also typically contain a promoter, a transcription initiation starting site, an RNA processing signal (such as splice signal sequences), a transcription termination site and / or a polyadenylation signal. . Intensifiers and targeting sequences may also be present. The invention provides nucleic acid molecules that are likely to cause altered fiber length and plant height in a transformed plant. An important aspect of the present invention is the use of nucleic acid constructs, wherein a wall-associated kinase coding nucleotide sequence is operably linked to one or more promoters, which drive expression of the coding sequence constitutively or in certain types of cells, organs, or tissues to alter the fiber length of a transformed plant as compared to the fiber length of a non-transgenic plant.

Promotores de plantas constitutivos adequados, que podem ser úteis para expressar as sequências de cinase associada à parede, adequadas, para a presente invenção, incluem, mas sem limitação, o promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV), o milho e os promotores de poli-ubiquitina da Populus, que conferem expressão constitutiva de alto nível na maioria dos tecidos de planta (vide, por exemplo, WO 2007/00611, Patente US 5.510.474; Odell et al., Nature, 1985, 313: 810-812); o promotor da sinta-se da nopalina (An et al. 1988, Plant Physiol. 88: 547-552); o promotor de FMV do vírus do mosaico da escrofulária (Patente US 5.378.619) e o promotor da sintase da octopina sintase (Fromm et al., Plant Ce//1: 977-984). O promotor pode ser também selecionado de modo que a expressão ocorre em um ponto de tempo determinado do desenvolvimento da planta, ou em um ponto de tempo determinado por influências externas, ou em um modo específico de tecido ou preferido de tecido. Por exemplo, pode ser assegura expressão específica e preferida em células de fibra (promotores específicos ou preferidos de fibra de algodão, de fibra de xilema, ou de fibra de xilaria).Suitable constitutive plant promoters which may be useful for expressing suitable wall-associated kinase sequences for the present invention include, but are not limited to, the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter, maize and Populus poly-ubiquitin promoters, which confer high level constitutive expression in most plant tissues (see, for example, WO 2007/00611, US Patent 5,510,474; Odell et al., Nature, 1985, 313 : 810-812); the nopaline feel promoter (An et al. 1988, Plant Physiol. 88: 547-552); the scrofular mosaic virus FMV promoter (US Patent 5,378,619); and the octopin synthase synthase promoter (Fromm et al., Plant Ce // 1: 977-984). The promoter may also be selected such that expression occurs at a determined time point of plant development, or at a time point determined by external influences, or in a tissue specific or preferred tissue mode. For example, specific and preferred expression can be ensured in fiber cells (specific or preferred promoters of cotton fiber, xylem fiber, or xylary fiber).

Promotores específicos ou preferidos de fibra de algodão exemplares incluem, por exemplo, o promotor de gene CFACT1 de algodão (Patente US 6.995.256); o promotor de gene E6 (Patente US 6.096.950, John et al., 1996, Plant Mol. Biol. 30: 297-306; John et al., 1996, Proc. Natl Acad. ScL 93: 12768-12773); promotor de gene H6 (John et al., 1995, Plant Physiol. 108: 669-676); promotor de gene GhTUBI (Li et al., 2002, Plant Physiol. 130: 666-674) e FbL2A (Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 112: 1331-1341 e John et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Set USA 93: 12768-12773).Exemplary specific or preferred cotton fiber promoters include, for example, the cotton CFACT1 gene promoter (US Patent 6,995,256); the E6 gene promoter (US Patent 6,096,950, John et al., 1996, Plant Mol. Biol. 30: 297-306; John et al., 1996, Proc. Natl Acad. ScL 93: 12768-12773); H6 gene promoter (John et al., 1995, Plant Physiol. 108: 669-676); GhTUBI (Li et al., 2002, Plant Physiol. 130: 666-674) and FbL2A gene promoter (Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 112: 1331-1341 and John et al., 1996, Proc. Natl Acad. Set USA 93: 12768-12773).

Promotores preferidos ou específicos do sistema vascular, tais como promotores específicos preferidos de xilema podem ser úteis para efetuar a expressão de moléculas de ácido nucleico da invenção, especificamente no tecido vascular, especialmente tecido de xilema. Assim, "preferido de xilema" significa que as moléculas de ácido nucleico da presente invenção são mais ativos no xilema que em qualquer outro tecido da planta. O promotor selecionado deve provocar a superexpressão da cinase associada à parede, de acordo com a presente invenção, de modo a modificar a comprimento do xilema da célula, para modificar a altura da planta hospedeira, ou ambos.Preferred or vascular system specific promoters, such as preferred xylem specific promoters may be useful for effecting expression of nucleic acid molecules of the invention, specifically in vascular tissue, especially xylem tissue. Thus, "preferred xylem" means that the nucleic acid molecules of the present invention are more active in the xylem than in any other plant tissue. The selected promoter should cause overexpression of the wall associated kinase according to the present invention in order to modify the length of the cell xylem, to modify the height of the host plant, or both.

Promotores adequados são ilustrados por, mas sem limitação, ao promotor do gene de tubulina (TUB) preferido do xilema, o promotor do gene do ácido cafeico 3-O-metiltransferase (COMT), o promotor do gene de sacarose sintase (SuSy), e o promotor de gene de cumarato-4-hidroxilase (C4H) preferido do xilema. Outros promotores preferidos do xilema adequados estão descritos no Pedido de Patente Internacional WO 2005/096805, que a aqui incorporado a título de referência.Suitable promoters are illustrated by, but are not limited to, the preferred xylem tubulin gene (TUB) gene promoter, the caffeic acid 3-methyltransferase (COMT) gene promoter, the sucrose synthase gene (SuSy) promoter, and the preferred xylem coumarate-4-hydroxylase (C4H) gene promoter. Other suitable preferred xylem promoters are described in International Patent Application WO 2005/096805, which is incorporated herein by reference.

Promotores específicos que incluem regiões de nucleotídeos específicos conferindo expressão específica de tecido, ou preferida de tecido, podem ser também usados, conforme exemplificados por identificação de elementos reguladores dentro dos promotores maiores conferindo expressão preferida de xilema. Seguín et al., 1997, Plant Mol. Biol. 35: 281-291; Torres-Schumann et al., 1996, Plant J. 9: 283-296; e Leyva et al., 1992, Plant Cell 4: 263-271.Specific promoters that include specific nucleotide regions conferring tissue-specific, or tissue-preferred, expression may also be used, as exemplified by identifying regulatory elements within the larger promoters conferring preferred expression of xylem. Seguín et al., 1997, Plant Mol. Biol. 35: 281-291; Torres-Schumann et al., 1996, Plant J. 9: 283-296; and Leyva et al., 1992, Plant Cell 4: 263-271.

Embora a taxa de expressão gênica seja prontamente modulada pelo promotor, o aperfeiçoamento na expressão pode ser também obtido pela identificação e o uso de sequências intensificadoras, tais côo porções intrônicas de genes, que elevam o nível de expressão dos genes localizados próximos em uma orientação de modo independente. Nas plantas, a inclusão de alguns introns nos construtos de gene em um posição entre o promotor e a sequência de codificação de gene leva a aumentos de acúmulo de mRNA e de proteína. Introns conhecidos por elevarem a expressão nas plantas foram identificados em genes de milho, por exemplo, hsp70, tubAI, Adhl, Shl, UbH (Brown e Santino, Patentes US 5.424.412 e US 5.859.347; Jeon et al., 2000, Plant Physiol. 123: 1005-1014; Callis et al., 1987, Genes Dev. 1 :1183-1200; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91 :1575-1579), e em genes de planta dicotiledônea tal como rbcS da petúnia (Dean et al., 1989, Plant Cell 1: 201-208); ST-LSI da batata (Leon et al., 1991, Plant Physiol. 95: 968-972) e UBQ3 (Norris et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 895-906) e PATI da Arabidopsís thaliana (Rose e Last, 1997, Plant J. 11: 455-464).Although the rate of gene expression is readily modulated by the promoter, enhancement in expression can also be achieved by identifying and using enhancer sequences, such as intronic portions of genes, which elevate the expression level of nearby genes in an orientation of. independent mode. In plants, the inclusion of some introns in the gene constructs at a position between the promoter and the gene coding sequence leads to increases in mRNA and protein accumulation. Introns known to increase plant expression have been identified in maize genes, for example, hsp70, tubAI, Adhl, Shl, UbH (Brown and Santino, US Patents 5,424,412 and US 5,859,347; Jeon et al., 2000, Plant Physiol 123: 1005-1014; Callis et al., 1987, Genes Dev. 1: 1183-1200; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91: 1575-1579), and in dicotyledonous plant genes such as Petunia rbcS (Dean et al., 1989, Plant Cell 1: 201-208); Potato ST-LSI (Leon et al., 1991, Plant Physiol. 95: 968-972) and UBQ3 (Norris et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 895-906) and Arabidopsis thaliana PATI (Rose and Last, 1997, Plant J. 11: 455-464).

De acordo com um aspecto da invenção, uma sequência de ci-nase associada à parede é incorporada em um construto de ácido nucleico que é adequada para transformação de planta. Por conseguinte, os constru-tos de ácido nucleico são proporcionadas compreendendo uma sequência de cinase associada à parede, sob o controle de uma região de iniciação transcricional operativa em uma planta, de modo que o construto pode gerar RNA em uma célula de planta hospedeira. Preferivelmente, a região de iniciação transcricional é parte de um promotor vascular ou preferido de xilema, tais como quais daqueles mencionados acima. Tal construto de ácido nucleico pode ser usada para modificar a expressão de gene de cinase associada à parede em plantas, conforme descrição acima.According to one aspect of the invention, a wall-associated kinase sequence is incorporated into a nucleic acid construct that is suitable for plant transformation. Accordingly, nucleic acid constructs are provided comprising a wall-associated kinase sequence under the control of an operative transcriptional initiation region in a plant, so that the construct can generate RNA in a host plant cell. Preferably, the transcriptional initiation region is part of a vascular or preferred xylem promoter, such as those mentioned above. Such a nucleic acid construct may be used to modify wall-associated kinase gene expression in plants as described above.

Vetores de expressão podem conter também um marcador de seleção por meio do qual as células transformadas podem ser identificadas na cultura. O marcador pode ser associado à molécula de ácido nucleico, isto é, o gene ligado operavelmente a um promotor. Como usado aqui, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica uma característica ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a triagem de, uma planta ou célula contendo o marcador. Nas plantas, por exemplo, o gene de marcador codificará resistência a antibiótico ou a herbicida. Isso permite a seleção de células transformadas dentre as células que não são transformadas ou transfec-tadas.Expression vectors may also contain a selection marker by which transformed cells can be identified in the culture. The marker may be associated with the nucleic acid molecule, that is, the gene operably linked to a promoter. As used herein, the term "marker" refers to a gene that encodes a trait or phenotype that allows selection of, or screening for, a plant or cell containing the marker. In plants, for example, the marker gene will encode antibiotic or herbicide resistance. This allows selection of transformed cells from cells that are not transformed or transfected.

Exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem a-denosina, desaminase, diidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase, timidina cinase, xantina-guanina fosforribosiltransferase, resistência ao glifo-sato e resistência ao glufosinato, e amino-glicosídeo 3'-0-fosfotranserase (resistência à canamicina, neomicina ou G418). Esses marcadores podem incluir resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina, e gentamici-na. o construto pode conter também o gene de marcador selecionável Bar, que confere resistência aos análogos de fosfinotricina como glufosinato de amônio. Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Outros marcadores selecionáveis adequados são também conhecidos.Examples of suitable selectable markers include α-denosine, deaminase, dihydrofolate reductase, hygromycin-B-phosphotransferase, thymidine kinase, xanthine guanine phosphoribosyltransferase, glyphosate resistance and resistance to glufosinate, and amino glycoside 3'-0-phosphotranserase ( kanamycin, neomycin or G418 resistance). Such markers may include resistance to G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin, and gentamicin. The construct may also contain the selectable marker gene Bar, which confers resistance to phosphinothricin analogs such as ammonium glufosinate. Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Other suitable selectable markers are also known.

Marcadores visíveis, tal como proteína fluorescente verde (GFP), podem ser usados. Métodos para identificar ou selecionar plantas transformadas com base no controle da divisão celular foram também descritas. Vide John e Van Mellaert, WO 2000/052168, e Fabijansk et al., WO 2001/059086.Visible markers such as green fluorescent protein (GFP) can be used. Methods to identify or select transformed plants based on cell division control have also been described. See John and Van Mellaert, WO 2000/052168, and Fabijansk et al., WO 2001/059086.

Sequências de replicação, de origem bacteriana ou viral, podem ser também incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hospedeiro bacteriano ou de fago. Preferivelmente, uma origem procariótica de faixa mais ampla de replicação é usada. Um marcador selecionável para bactéria pode ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas contendo o construto desejada. Marcadores selecionáveis procarióticos adequados incluem também resistência a antibióticos tal como canamicina ou tetraciclina.Replication sequences of bacterial or viral origin may also be included to allow the vector to be cloned into a bacterial or phage host. Preferably, a wider range prokaryotic origin of replication is used. A selectable bacterial marker may be included to allow selection of bacterial cells containing the desired construct. Suitable prokaryotic selectable markers also include resistance to antibiotics such as kanamycin or tetracycline.

Outras sequências de DNA que codificam funções adicionais podem estar também presentes no vetor, conforme conhecidas da técnica. Por exemplo, quando Agrobacterium é o hospedeiro, sequências de T-DNA podem ser incluídas para facilitar a transferência subsequente a e incorporação nos cromossomos da planta.Other DNA sequences encoding additional functions may also be present in the vector as known in the art. For example, when Agrobacterium is the host, T-DNA sequences may be included to facilitate subsequent transfer to and incorporation into plant chromosomes.

Plantas para Engenharia Genética A presente invenção compreende a manipulação genética das plantas, especialmente árvores de madeira de lei, para superexpressar uma cinase associada à parede em vários tecidos vasculares via introdução de um gene associado à parede, preferivelmente sob o controle de um promotor preferido de xilema ou específico de xilema. O resultado é o comprimento de fibra e a altura da planta aumentados.Plants for Genetic Engineering The present invention comprises the genetic manipulation of plants, especially hardwood trees, to overexpress a wall-associated kinase in various vascular tissues via introduction of a wall-associated gene, preferably under the control of a preferred promoter. xylem or xylem-specific. The result is increased fiber length and plant height.

Nessa descrição, o termo "planta" denota qualquer material de planta contendo fibra que possa ser geneticamente manipulado, incluindo, mas sem limitação, células de plantas diferenciadas ou não diferenciadas, protoplastos, plantas inteiras, tecidos de planta, ou órgãos de plantas, ou qualquer componente de uma planta tal como folha, caule, raiz, tubérculo, fruta, rizoma, ou similares.In this description, the term "plant" denotes any fiber-containing plant material that can be genetically engineered, including, but not limited to, differentiated or undifferentiated plant cells, protoplasts, whole plants, plant tissues, or plant organs, or any component of a plant such as leaf, stem, root, tuber, fruit, rhizome, or the like.

Plantas que podem ser engenheiradas de acordo com a invenção incluem, mas sem limitação, árvores, tal como espécies de Eucalipto (E alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladonien-sis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. hrevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E. croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. eryt-hrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globu-lus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis x urophylla, E. guilfoylei, E. gun-nii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtustflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petioiaris, E. piiuiaris, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. popul-nea, E. preissiana, E. pseudo globulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spa-thulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. te-tragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. faiciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), Populus spp. (P. alba, P. alba x P. grandidentata, P. alba x P. tremula, P. alba x P. tremula var. glan-dulosa, P. alba x P. tremuloides, P. balsamifera, P. balsamifera subsp. tri-chocarpa, P. balsamifera subsp. trichocarpa x P. deltoides, P. ciliata, P. del-toides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii x P. balsamifera subsp. trichocarpa, P. nigra, P. sieboldii x P. grandidentata, P. suaveolens, P. szechuani-ca, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula x P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis), Coníferas tal como pinheiro teda (Pinus taeda), pinheiro da Flórida (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta), e pinheiro Monterey (Pinus radiata)', Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta do Ocidente (Tsuga canadensis); espruce Sitka (Picea glauca)·, madeira vermelha (Sequoia sem-pervirens)·, abetos verdadeiros tais como abeto prata (Abies amabilis) e abeto de bálsamo (Abies balsamea)·, e cedros tais como cedro vermelho do Oeste (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparís nootkaten-sis).Engineable plants according to the invention include, but are not limited to, trees such as Eucalyptus species (E. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladonien-sis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. hrevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa. , E. crebra, E. croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E dunnii, E. elata, E. eryt-hrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. -lus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis x urophylla, E. guilfoylei, E. gun-nii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia , E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. margina E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtustflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petioiaris, E. piiuiaris, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. populanea, E. preissiana, E. pseudo globulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spa-thulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. te-tragone, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. faiciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), Populus spp. (P. alba, P. alba x P. grandidentata, P. alba x P. tremula, P. alba x P. tremula var. Glan-dulosa, P. alba x P. tremuloides, P. balsamifera, P. balsamifera subsp tri-chocarpa, P. balsamifera subsp.trichocarpa x P. deltoides, P. ciliata, P. del-toides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii x P. balsamifera subsp. Trichocarpa, P. nigra, P. sieboldii x P. grandidentata, P. suaveolens, P. szechuani-ca, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula x P. tremuloides, P tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis), conifers such as Teda pine (Pinus taeda), Florida pine (Pinus elliotii), ponderosa pine (Pinus ponderosa), lodgepole pine (Pinus contorta), and pine Monterey (Pinus radiata), Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); Western hemlock (Tsuga canadensis); spruce Sitka (Picea glauca) ·, red wood (Sequoia sem-pervirens) ·, true spruces such as silver spruce (Abies amabilis) and balsam spruce (Abies balsamea) ·, and cedars such as West red cedar (Thuja plicata) and Alaskan yellow cedar (Chamaecyparís nootkaten-sis).

Plantas produtoras de fibras estão também incluídas neste contexto. Colheitas ilustrativas algodão (Gossipium spp.), linho (Linum usitatis-simum), urtiga ferrão (Urtica dioica), lúpulo (Humulus lupulus), árvores de limeira (Tília cordata, T. x. europaea e T. platyphyllus), sorgo espanhol (Spartium junceum), rami (Boehmeria nivea), amoreira de papel (Brousso-netya papyrifera), linho da Nova Zelândia (Phormium tenax), apócino (A-pocynum cannabinum), espécie de Iris (/. douglasiana, I. macrosiphon e I. purdyi), asclépias (espécies de Asclépia), abacaxi, banana e outros. São também contempladas colheitas de forragem, tais como alfafa, lólio, festuca e trevo.Fiber producing plants are also included in this context. Illustrative harvests Cotton (Gossipium spp.), Flax (Linum usitatis-simum), Sting nettle (Urtica dioica), Hops (Humulus lupulus), Lime trees (Tilia cordata, T. x. Europaea and T. platyphyllus), Spanish sorghum (Spartium junceum), ramie (Boehmeria nivea), paper mulberry (Brousso-netya papyrifera), New Zealand flax (Phormium tenax), apocino (A-pocynum cannabinum), Iris species (/. Douglasiana, I. macrosiphon e I. purdyi), asclepias (species of Asclepia), pineapple, banana and others. Forage harvests such as alfalfa, lithium, fescue and clover are also contemplated.

Na presente descrição, "planta transgênica" refere-se a uma planta que foi incorporada uma sequência de ácidos nucleicos, incluindo, mas sem limitação, genes que não estão normalmente presentes em um genoma de planta hospedeira, sequências de ácidos nucleicos não normalmente transcritos em RNA ou traduzidos em uma proteína, ou quaisquer outros genes ou sequências de ácidos nucleicos que se deseja introduzir na planta tipo selvagem, tais como genes que normalmente podem estar presentes na planta do tipo selvagem, mas que se deseja ou engenheirar geneticamente ou ter a expressão alterada. A categoria de "planta transgênica" inclui tanto um transformador primário ou uma planta que inclui um transformador em sua linhagem, por exemplo, a título de introgressão padrão ou qualquer outro procedimento de multiplicação.In the present description, "transgenic plant" refers to a plant that has incorporated a nucleic acid sequence, including, but not limited to, genes not normally present in a host plant genome, nucleic acid sequences not normally transcribed in RNA or translated into a protein, or any other genes or nucleic acid sequences that are desired to be introduced into the wild-type plant, such as genes that may normally be present in the wild-type plant, but which are either genetically engineered or expression amended. The "transgenic plant" category includes either a primary transformer or a plant that includes a transformer in its lineage, for example as standard introgression or any other multiplication procedure.

Uma "planta híbrida" refere-se a uma planta ou parte desta resultante de um cruzamento entre duas plantas parentes, em que uma planta parente é uma planta geneticamente engenheirada da invenção. Tal cruzamento pode ocorrer naturalmente, por exemplo, por reprodução sexual, ou artificialmente, por exemplo, uma fusão nuclear in vitro. Os métodos para multiplicação de plantas são bem conhecidos e dentro do nível de um de conhecimento ordinário da técnica da biologia da planta.A "hybrid plant" refers to a plant or part thereof resulting from a cross between two parent plants, where a parent plant is a genetically engineered plant of the invention. Such crossover may occur naturally, for example, by sexual reproduction, or artificially, for example, an in vitro nuclear fusion. Methods for plant multiplication are well known and within the level of one's ordinary knowledge of the plant biology technique.

Em contraste, uma planta que não é geneticamente manipulada é uma planta de controle e é referida como uma planta "não-transgênica" ou de "controle". Planta não-transgênica pode ser uma planta cujo genoma não está modificado pela introdução de um construto compreendendo as sequências de polinucleotídeos nem fragmento destas da presente invenção. Pode ser também uma planta gerada a partir de células ou tecidos cultivados sem modificação anterior pela introdução de um construto que compreende as sequências de polinucleotídeos da invenção, ou pode compreender pro-gênie recessivo de homozigoto (isto é, não tem nenhuma cópia do transge-ne) resultante de autofertilização de uma planta transgênica. É contemplado que, em alguns casos, o genoma de uma planta transgênica inventiva será aumentado através da introdução estável de um transgene. Em outros casos, contudo, o gene introduzido substituirá uma sequência endógena. Um gene preferido com respeito à presente invenção, é uma sequência de DNA de cinase associada a uma parede, por exemplo, uma obtida de Arabidopsis thaliana. Métodos para Engenharia Genética Os construtos de acordo com a invenção podem ser introduzidos em qualquer célula da planta, usando uma técnica adequada. Tanto as células de planta da angiosperma ou da gimnosperma de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser geneticamente engenheiradas de vários modos conhecidos da técnica. Por exemplo, vide Klein et al., 1993, Biotechnology 4: 583-590; Bechtold et al., 1993, C. R. Acad. Sei. Paris 316:1194-1199; Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396; Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722; Sagi et al., 1994, Plant Cell Rep. 13: 262-266.In contrast, a plant that is not genetically engineered is a control plant and is referred to as a "non-transgenic" or "control" plant. Non-transgenic plant may be a plant whose genome is not modified by introducing a construct comprising the polynucleotide sequences or fragment thereof of the present invention. It may also be a plant generated from cells or tissues grown without prior modification by introducing a construct comprising the polynucleotide sequences of the invention, or it may comprise recessive homozygous progeny (i.e., has no copy of the transgene). ne) resulting from self-fertilization of a transgenic plant. It is contemplated that in some cases the genome of an inventive transgenic plant will be enhanced by the stable introduction of a transgene. In other cases, however, the introduced gene will replace an endogenous sequence. A preferred gene with respect to the present invention is a wall-associated kinase DNA sequence, for example one obtained from Arabidopsis thaliana. Methods for Genetic Engineering The constructs according to the invention may be introduced into any plant cell using a suitable technique. Both monocotyledon and dicotyledon plant angiosperm or gymnosperm plant cells can be genetically engineered in a variety of ways known in the art. For example, see Klein et al., 1993, Biotechnology 4: 583-590; Bechtold et al., 1993, C. R. Acad. Know. Paris 316: 1194-1199; Koncz and Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396; Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722; Sagi et al., 1994, Plant Cell Rep. 13: 262-266.

Espécies de Agrobacterium tais como A. tumefaciens e A. rhiso-genes podem ser usadas, por exemplo, de acordo com Nagel et al., 1990, Microbiol Lett 67: 325. Em resumo, a Agrobacterium podem ser usada com um vetor de expressão de planta, por exemplo, eletroporação, depois da qual a Agrobacterium é introduzida nas células da planta através, por exemplo, do método bem conhecido de discos foliares.Agrobacterium species such as A. tumefaciens and A. rhiso-genes may be used, for example, according to Nagel et al., 1990, Microbiol Lett 67: 325. In summary, Agrobacterium can be used with an expression vector. electroporation, after which Agrobacterium is introduced into plant cells by, for example, the well-known leaf disc method.

Os métodos adicionais para obtenção disto que incluem, mas sem limitação, a transformação por Rhizobium, Sinorhizobium ou Mesorhi-zobium (Broothaerts et al., 2005, Nature 433: 629-633), eletroporação, bombardeio com pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, e fusão de glicol, transferências nos grãos de pólen germinantes, transformação direta (Lorz et al., 1985, Mol. Genet. 199: 179-182), e outros métodos conhecidos da técnica. Se um marcador de seleção, tal como resistência à cana-micina, for empregado, torna-se mais fácil determinar que células sejam transformadas com êxito.Additional methods to achieve this include, but are not limited to, transformation by Rhizobium, Sinorhizobium or Mesorhi-zobium (Broothaerts et al., 2005, Nature 433: 629-633), electroporation, particle gun bombardment, phosphate precipitation. of calcium, and glycol fusion, transfers in germinating pollen grains, direct transformation (Lorz et al., 1985, Mol. Genet. 199: 179-182), and other methods known in the art. If a selection marker, such as cane mycin resistance, is employed, it is easier to determine which cells are transformed successfully.

Os métodos de transformação de Agrobacterium discutidos acima são conhecidos por serem úteis por dicotiledôneas transformadas. Adicionalmente, de La Pena et al., 1987, Nature 325: 274-276; Rhodes et al., 1988, Science 240: 204-207; e Shimamoto et al., 1989, Nature 328: 274-276, todos os quais são incorporados a título de referência, têm monocotiledô-neas cereais transformadas usando Agrobacterium. Vide Bechtold e Pelleti-er, 1998, Methods Mol. Biol. 82: 259-266, mostrando o uso de infiltração a vácuo para transformação mediada por Agrobacterium. A presença de uma proteína, polipeptídeo, ou molécula de ácido nucleico em uma célula particular pode ser medida para determinar se, por exemplo, uma célula foi transformada ou transfectada com sucesso. A capacidade de executar tal ensaio é bem conhecida e não precisa ser reiterada aqui.The Agrobacterium transformation methods discussed above are known to be useful for transformed dicotyledons. Additionally, de La Pena et al., 1987, Nature 325: 274-276; Rhodes et al., 1988, Science 240: 204-207; and Shimamoto et al., 1989, Nature 328: 274-276, all of which are incorporated by reference, have monocotyled cereals transformed using Agrobacterium. See Bechtold and Pelletier, 1998, Methods Mol. Biol. 82: 259-266, showing the use of vacuum infiltration for Agrobacterium-mediated transformation. The presence of a protein, polypeptide, or nucleic acid molecule in a particular cell can be measured to determine if, for example, a cell has been successfully transformed or transfected. The ability to perform such an assay is well known and need not be reiterated here.

Quantificação do Comprimento da Fibra ou Altura da Planta A palavra "fibra" é frequentemente usada para unificar um grupo diverso de tipos de células de planta que compartilham em comum as características de ter uma configuração alongada e celulose abundante nas paredes de células espessas, usualmente, mas nem sempre, descritas como paredes secundárias. Tais paredes podem ser ou não lignificadas e o proto- plasto de tais células pode permanecer vivo ou não na maturidade. Em algumas indústrias, o termo "fibra" inclui usualmente células condutoras de paredes espessas tais como vasos e traqueídes e agregados fibrilares de muitas células de fibras individuais. Para os propósitos da presente invenção, o termo "fibra" inclui: (a) células condutoras e não condutoras do xile-ma; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo aquelas de floema, raspas, tecido triturado, e epiderme: e (c) fibras de caules folhas, raízes, sementes, e flores ou inflorescências.Quantifying Fiber Length or Plant Height The word "fiber" is often used to unify a diverse group of plant cell types that share in common the characteristics of having an elongated configuration and abundant cellulose in the thick cell walls, usually. but not always described as secondary walls. Such walls may or may not be lignified and the protoplast of such cells may or may not remain alive at maturity. In some industries, the term "fiber" usually includes thick-walled conductive cells such as vessels and tracheids and fibrillar aggregates of many individual fiber cells. For purposes of the present invention, the term "fiber" includes: (a) xylem-conducting and non-conducting cells; (b) fibers of extraxillary origin, including those of phloem, zest, shredded tissue, and epidermis; and (c) fibers of stem leaves, roots, seeds, and flowers or inflorescences.

Plantas transgênicas da invenção são caracterizadas pelo comprimento maior das fibras e, preferivelmente, altura maior também. O comprimento aumentado das fibras na planta geneticamente modificada é preferivelmente realizado através da superexpressão de WAK nos tecidos da planta, onde a expansão celular ocorre. Na descrição de uma planta da invenção, "comprimento aumentado das fibras" refere-se ao aumento no comprimento das células de fibra da planta quando comparado ao comprimento das células de fibra em uma planta tipo selvagem. Um aumento quantitativo do comprimento das fibras pode ser medido por diversas técnicas tal qual digitalização, procedimento de Kajaani e o Analisador de Qualidade de Fibras. Han et al., 1999, em: Kenaf Properties, Processing and Products, Mis-sissipi State University, Ag & Bio Engineering, páginas 149 a 167. O comprimento das fibras na planta modificada da invenção é de pelo menos 5 a 15% mais longo, preferivelmente de pelo menos 10 a 30% mais longo e, mais preferivelmente, de pelo menos 20 a 50% mais longo que o comprimento das fibras de uma planta tipo selvagem.Transgenic plants of the invention are characterized by the longer fiber length and preferably higher height as well. The increased fiber length in the genetically modified plant is preferably accomplished by overexpression of WAK in plant tissues where cell expansion occurs. In describing a plant of the invention, "increased fiber length" refers to the increase in plant fiber cell length as compared to the fiber cell length in a wild type plant. A quantitative increase in fiber length can be measured by a variety of techniques such as scanning, Kajaani procedure and the Fiber Quality Analyzer. Han et al., 1999, in: Kenaf Properties, Processing and Products, Mississipi State University, Ag & Bio Engineering, pages 149 to 167. The fiber length in the modified plant of the invention is at least 5-15% longer. long, preferably at least 10 to 30% longer and more preferably at least 20 to 50% longer than the fiber length of a wild type plant.

Como o aumento do comprimento das fibras pode ser seguido por um aumento na altura da planta, as plantas transgênicas da invenção podem ter maiores comprimento das fibras e alturas. Nessa descrição, portanto, a frase "aumento da altura da planta" conota um aumento quantitativo na altura da planta, quando comparado à altura de uma planta tipo selvagem. A altura de uma planta modificada da invenção pode ter sua altura aumentada em cerca de 5% a cerca de 90%, preferivelmente cerca de 10% a cerca de 75% e, mais preferivelmente, cerca de 15% a cerca de 65% em relação à altura da planta tipo selvagem.As the increase in fiber length may be followed by an increase in plant height, the transgenic plants of the invention may have longer fiber lengths and heights. In this description, therefore, the phrase "plant height increase" connotes a quantitative increase in plant height when compared to the height of a wild type plant. The height of a modified plant of the invention may be increased from about 5% to about 90%, preferably about 10% to about 75%, and more preferably from about 15% to about 65%. at the height of the wild type plant.

Exemplos específicos de métodos para a obtenção de genes de cinase associada à parede são apresentados abaixo, assim como para a introdução do gene alvo, através de Agrobacterium, para produzir plantas transformadores. Eles devem ser considerados como exemplos e não como limitações à presente invenção.Specific examples of methods for obtaining wall-associated kinase genes are given below, as well as for introducing the target gene via Agrobacterium to produce transforming plants. They should be considered as examples and not as limitations to the present invention.

Exemplo 1 Isolamento de uma sequência de DNA de cinase associada à parede da A-rabidoosis thaliana (a) preparação de RNA do embrião da Arabidopsis thaliana e síntese de cD-NA.Example 1 Isolation of a wall-associated kinase DNA sequence from A-rabidoosis thaliana (a) RNA preparation from the Arabidopsis thaliana embryo and cD-NA synthesis.

Cortes do caule de plantas de Arabidopsis thaliana de três meses de idade foram cortados em pequenos pedaços, congelados em nitrogênio líquido e usados para extração de DNA através do método de extração por brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB). Aldrich e Cullis, 1993, PlantMol. Biol. Report, 11:128 - 141. Um conjunto de cDNA foi usado em experimentos RT-PCR em que o RNA isolado total foi usado como modelo, e a trans-criptase reversa Superscript II (Invitrogen) e o primeroligo (dT) foram usados para sintetizar a primeira fita de cDNA. cDNA de fita dupla foi obtido por reação de polimerase subsequente, utilizando-se primers específicos de gene, conforme descrito abaixo. (b) Projeto do primer Uma sequência de cDNA representativa de 4 mRNA da cinase associada à parede de Arabidopsis thaliana foi determinada e depositada no GenBank sob número de acesso NM101974. Baseado nessa sequência, oligômeros de DNA foram sintetizados como primers para PCR, incluindo ou a região em volta do primeiro códon ATG ou a envolta do códon terminal do ORF principal que codifica a cinase associada à parede 4.Stem sections of three-month-old Arabidopsis thaliana plants were cut into small pieces, frozen in liquid nitrogen and used for DNA extraction using the cetyl trimethyl ammonium bromide extraction method (CTAB). Aldrich and Cullis, 1993, PlantMol. Biol. Report, 11: 128 - 141. A set of cDNAs were used in RT-PCR experiments in which total isolated RNA was used as a template, and Superscript II reverse trans-cryptase (Invitrogen) and primeroligo (dT) were used to synthesize the first cDNA tape. Double-stranded cDNA was obtained by subsequent polymerase reaction using gene-specific primers as described below. (b) Primer Design A 4 mRNA representative cDNA sequence of the Arabidopsis thaliana wall-associated kinase was determined and deposited with GenBank under accession number NM101974. Based on this sequence, DNA oligomers were synthesized as PCR primers, including either the region around the first ATG codon or the main ORF terminal codon encoding the wall-associated kinase 4.

Primers foram projetados para amplificar a totalidade da região codificação da ORF 4 da cinase associada à parede, ou seja, de ATG até o códon de terminação de tradução. As sequências dos primers são dadas abaixo: WAK_NDE comprimento: 23SEQ ID NO: 11 CATATGAAAGTGCAGCGTCTGTT WAK_NDE comprimento: 23SEQ ID NO: 12 TCTAGATCAGCGGCCTGCTTCAAPrimers were designed to amplify the entire ORF 4 coding region of the wall-associated kinase, ie from ATG to the translation termination codon. Primer sequences are given below: WAK_NDE Length: 23SEQ ID NO: 11 CATATGAAAGTGCAGCGTCTGTT WAK_NDE Length: 23SEQ ID NO: 12 TCTAGATCAGCGGCCTGCTTCAA

(c) Amplificação de PCR A amostra de cDNA obtida em (a) foi usada como modelo, e os primers projetados em (b) foram usados para PCR. As etapas de PCR envolveram 40 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C e 2 minutos a 72°C, seguido por uma etapa extra de alongamento a 72°C por 7 minutos. Os produtos PCR foram isolados por eletroforese em gel em agarose a 1,0%, seguido por coloração com brometo de etídio do gel que sofreu eletroforese e detecção das bandas amplificadas em um transiluminador de UV. A banda amplificada detectada foi checada e cortada do gel de agarose com uma tesoura. Os pedaços do gel foram transferidos para microtubos de 1,5 mL, e os fragmentos de DNA foram isolados e purificados utilizando-se um kit de limpeza e purificação de banda em gel PCR GFX (Amersham). Os fragmentos de DNA recuperados foram subclonados para o vetor de clonagem pGEM-T (Promega), transformados em E. coli, e então usados para preparar plasmídeo de DNA da maneira habitual, que foi então sequenciado pelo método didesóxi (Messing, 1983, Methods in Enzymol. 101: 20-78), utilizando-se química BigDye (Applied Biosystems), para que rendesse a sequência de DNA revelada aqui por SEQ ID NO: 1, para uso em conformidade com a invenção.(c) PCR Amplification The cDNA sample obtained in (a) was used as a template, and the primers designed in (b) were used for PCR. The PCR steps involved 40 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 50 ° C and 2 minutes at 72 ° C, followed by an extra stretching step at 72 ° C for 7 minutes. PCR products were isolated by 1.0% agarose gel electrophoresis, followed by ethidium bromide staining of the electrophoresed gel and detection of the amplified bands in a UV transilluminator. The detected amplified band was checked and cut from the agarose gel with scissors. The gel pieces were transferred to 1.5 ml microtubes, and the DNA fragments were isolated and purified using a PCR GFX gel band cleaning and purification kit (Amersham). The recovered DNA fragments were subcloned into the E. coli transformed pGEM-T cloning vector (Promega) and then used to prepare DNA plasmid in the usual manner, which was then sequenced by the dideoxy method (Messing, 1983, Methods in Enzymol 101: 20-78) using BigDye chemistry (Applied Biosystems) to yield the DNA sequence disclosed herein by SEQ ID NO: 1 for use in accordance with the invention.

Exemplo 2 Preparação de plantas Nicotiana tabacum transaênicas O gene da cinase associada à parede obtido no Exemplo 1 acima foi introduzido em uma planta hospedeira para produzir plantas Nicotiana tabacum transgênicas. (a) Preparação de construtos e transformação da Agrobacterium Construtos de expressão foram preparados por divagem do gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 acima, com enzimas de restrição adequadas para incluir toda o quadro de leitura aberta e inserir o gene no vetor de transformação da planta pALELLYX-WAK (Figura 1) junto com um promotor apropriado. Por exemplo, o gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 foi clonado para vetor de expressão supramen-cionado a jusante para um promotor de gene tubulina preferido de xilema (TUB) da Populus deltoides, como revelado no Pedido Internacional WO 2005/096805. o construto de expressão resultante foi amplificada em E. coli, e então transformada por congelamento em Agrobacterium tumefaciens da cepa LBA4404. (b) Transformação da Nicotiana tabacum mediada por Agrobacterium A transformação da Nicotiana sp. Foi realizada utilizando-se o método de discos foliares de Horsch et ai., 1985, Science 227:1229, utilizando-se um construto de ácido nucleico que compreende o gene da cinase associada à parede obtido em (a) em uma ligação operável com o promotor TUB de um gene preferido de xilema. Os transformadores foram selecionados em meio Murashige e Skoog (Sigma, St. Louis, MO) contendo 100 mili-gramas/litro de canamicina e 500 mg/L de carbenicilina (Sigma). Permitiu-se que os brotos de tabaco transformados se enraizassem no meio Murashige e Skoog, e foram subsequentemente transferidos para o solo e cultivados em uma estufa. (c) Verificação de PCR de uma inserção de gene estranho no qenoma da planta hospedeira PCR pode ser usada para verificar a integração do construto de gene no genoma de plantas transgênicas. A mistura de reação de PCR continha 100 ng do DNA genômico da planta transformada, e 0,2 μΜ de cada primer descrito acima, 100 μΜ de cada desoxirribonucleotídeo trifosfato, 5 μΙ_ de tampão para PCR e 2,5 unidades de polimerase de DNA Amplitaq (Applied Biosystems) em um volume total de 50 μΙ_. Os parâmetros cíclicos foram os seguintes: 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto e 72°C por 3 minutos, por 40 ciclos, com uma extensão de 5 minutos a 72°C. Os produtos de PCR sofreram eletroforese em um gel de agarose a 1 %. (d) Determinação do nível de expressão transqênico em plantas transqêni-cas RT-PCR semiquantitativa foi usada para detectar a acumulação de transcritos de cinase associada à parede no tecido do caule das plantas transgênicas. O RNA total foi isolado de cortes de caule de plantas Nicotiana TO e T1 transgênicas de 3 meses de idade utilizando-se o método CTAB descrito em Aldrich e Culli, 1993, PlantMol. Biol. Report. 11:128-141. cDNA foi sintetizado a partir de 500 ng do RNA total utilizando-se Superscript II Rnase H- RT (Invitrogen, USA). Os primers descritos acima foram usados junto com primers para a codificação constitutiva do gene da desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) como um controle interno para normalizar a quantidade de RNA total utilizado em cada amostra. PCR foi feita com uma diluição de 12,5x do cDNA de primeira fita sob as seguintes condições: 94°C por 3 minutos e 27 ciclos de 94°C por 1 minuto, 52 a 60°C por 45 segundos, e 72°C por 1 minuto e 30 segundos.Example 2 Preparation of Transgenic Nicotiana Tabacum Plants The wall-associated kinase gene obtained in Example 1 above was introduced into a host plant to produce transgenic Nicotiana tabacum plants. (a) Agrobacterium Construct Preparation and Transformation Expression constructs were prepared by dividing the wall-associated kinase gene obtained in example 1 above, with appropriate restriction enzymes to include the entire open reading frame and insert the gene into the vector. transformation of the pALELLYX-WAK plant (Figure 1) together with an appropriate promoter. For example, the wall-associated kinase gene obtained in Example 1 was cloned for downstream supramenated expression vector to a Populus deltoides preferred xylem gene (TUB) gene promoter, as disclosed in International Application WO 2005/096805 . The resulting expression construct was amplified in E. coli, and then freeze-transformed into Agrobacterium tumefaciens of strain LBA4404. (b) Agrobacterium-mediated transformation of Nicotiana tabacum The transformation of Nicotiana sp. It was performed using the leaf disc method of Horsch et al., 1985, Science 227: 1229, using a nucleic acid construct comprising the wall-associated kinase gene obtained in (a) in an operable linkage with the TUB promoter of a preferred xylem gene. Transformers were selected in Murashige and Skoog medium (Sigma, St. Louis, MO) containing 100 milligrams / liter kanamycin and 500 mg / L carbenicillin (Sigma). The transformed tobacco sprouts were allowed to take root in the Murashige and Skoog medium, and were subsequently transferred to soil and grown in a greenhouse. (c) PCR verification of a foreign gene insert in the host plant qenoma PCR can be used to verify the integration of the gene construct into the genome of transgenic plants. The PCR reaction mixture contained 100 ng of the genomic DNA of the transformed plant, and 0.2 μΜ of each primer described above, 100 μΜ of each deoxyribonucleotide triphosphate, 5 μΙ_ of PCR buffer and 2.5 units of Amplitaq DNA polymerase. (Applied Biosystems) in a total volume of 50 μΙ_. The cyclic parameters were as follows: 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute and 72 ° C for 3 minutes for 40 cycles with a 5 minute extension at 72 ° C. PCR products were electrophoresed on a 1% agarose gel. (d) Determination of the level of transgenic expression in transgenic semiquantitative RT-PCR plants was used to detect the accumulation of wall-associated kinase transcripts in the stem tissue of transgenic plants. Total RNA was isolated from stem sections of 3-month-old transgenic Nicotiana TO and T1 plants using the CTAB method described in Aldrich and Culli, 1993, PlantMol. Biol. Report 11: 128-141. cDNA was synthesized from 500 ng of total RNA using Superscript II Rnase H-RT (Invitrogen, USA). The primers described above were used together with primers for constitutive coding of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene as an internal control to normalize the amount of total RNA used in each sample. PCR was performed with a 12.5x dilution of first strand cDNA under the following conditions: 94 ° C for 3 minutes and 27 cycles of 94 ° C for 1 minute, 52 at 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds.

Exemplo 3 Aumento do comprimento das fibras de plantas transgênicas de tabaco que superexpressam o gene da cinase associada à parede em tecidos vasculares Regiões de caule correspondentes a 50% da altura de plantas transgênicas e de controle de 5 meses de idade foram maceradas em uma solução de ácido acético-peróxido a 70°C por 48 horas ou até que células unitárias fossem obtidas. As células foram coloridas com safranina e examinadas sob um microscópio (Leica DMIL) com uma câmera (Sony) ligada a um computador pessoal. As células (cerca de 100 por linha) foram medidas diretamente na tela, usando o software "Image Tool".Example 3 Increased fiber length of transgenic tobacco plants that overexpress the wall-associated kinase gene in vascular tissues Stem regions corresponding to 50% of the height of 5-month-old transgenic and control plants were macerated in a solution of acetic acid-peroxide at 70 ° C for 48 hours or until unit cells were obtained. The cells were safranin-stained and examined under a microscope (Leica DMIL) with a camera (Sony) attached to a personal computer. The cells (about 100 per line) were measured directly on the screen using the "Image Tool" software.

Três dos eventos transgênicos, conhecidos por expressarem o transgene de acordo com o procedimento detalhado no exemplo 2, mostraram um aumento estatisticamente significativo do comprimento das fibras (Figura 2). O evento transgênico 43B exibiu um aumento de 21% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (P<0,05, teste t). O evento transgênico 47B exibiu um aumento de 19% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (Figura 2; P<0,05, teste t). Ademais, o evento transgênico 43B exibiu um aumento de 15% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (Figura 2 P<0,05, teste t). É importante mencionar que outra estratégia para aumentar o comprimento das fibras por superexpressão de um gene de pectina metil esterase (Berthold et ai, WO 2006/068603) logrou um aumento de somente 5% no comprimento das fibras de plantas transgênicas quando comparadas às plantas de controle.Three of the transgenic events known to express the transgene according to the procedure detailed in example 2 showed a statistically significant increase in fiber length (Figure 2). Transgenic event 43B exhibited a 21% increase in fiber length compared to control plants (P <0.05, t-test). Transgenic event 47B exhibited a 19% increase in fiber length compared to control plants (Figure 2; P <0.05, t-test). In addition, transgenic event 43B exhibited a 15% increase in fiber length compared to control plants (Figure 2 P <0.05, t-test). It is important to mention that another strategy for increasing fiber length by overexpression of a pectin methyl esterase gene (Berthold et al., WO 2006/068603) achieved only a 5% increase in the fiber length of transgenic plants when compared to transgenic plants. control.

Após o cultivo até a maturidade, deixou-se que os eventos TO gerassem linhas T1. Plantas que têm homozigoto dominante apresentam um aumento significativo de 10% no comprimento das fibras (P<0,05, teste t) quando comparadas à plantas que têm homozigoto recessivo. Esses resultados foram observados em duas linhas diferentes (Figura 3 e Figura 4). Exemplo 4 Aumento da altura da planta em plantas de tabaco transgênicas que super-expressam o gene da cinase relacionada à parede em tecidos vasculares A progênie T1 resultante da autofertilização das plantas transgênicas foi individualmente envasada após a semeadura. O crescimento foi medido periodicamente até que a primeira flor fosse formada (as plantas tinham cerca de 5 meses de idade) e foi registrado como a altura total.After cultivation to maturity, TO events were allowed to generate T1 lines. Plants that have dominant homozygote show a significant 10% increase in fiber length (P <0.05, t-test) when compared to plants that have recessive homozygote. These results were observed in two different lines (Figure 3 and Figure 4). Example 4 Increased plant height in transgenic tobacco plants that overexpress the wall-related kinase gene in vascular tissues The T1 progeny resulting from the self-fertilization of transgenic plants were individually potted after sowing. Growth was measured periodically until the first flower was formed (the plants were about 5 months old) and was recorded as the total height.

Os resultados apresentados são um exemplo do aumento da altura das plantas observadas nas plantas de homozigoto dominante de diferentes linhas. A altura da planta de três genótipos do evento 51B foi comparada. Plantas que têm homozigoto dominante são 12% mais altas que plantas que têm homozigoto recessivo. Plantas que são hemizigotos são 9% mais altas que as plantas que têm homozigoto recessivo (P<0,05, teste t) (Figura 5).The results presented are an example of the increase in plant height observed in dominant homozygote plants of different rows. Plant height of three genotypes of event 51B was compared. Plants that have dominant homozygotes are 12% higher than plants that have recessive homozygotes. Plants that are hemizygotes are 9% higher than plants that have recessive homozygotes (P <0.05, t-test) (Figure 5).

Exemplo 5 Preparação de plantas Pooulus transgênicas O gene obtido no exemplo 1 acima foi introduzido em uma planta hospedeira para produzir plantas Populus transgênicas. (a) Preparação de construtos e transformação da Aqrobacteríum Construtos de expressão foram preparados por divagem do gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 acima, com enzimas de restrição adequadas para incluir toda o quadro de leitura aberta e inserir o gene no vetor de transformação da planta pALELLYX-WAK (Figura 1) junto com um promotor apropriado. Por exemplo, o gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 foi clonado para vetor de expressão supramen-cionado a jusante para um promotor de gene tubulina preferido de xilema (TUB) da Populus deltoides, como revelado no Pedido Internacional WO 2005/096805. O construto de expressão resultante foi amplificado em e. coli, e então transformado por congelamento em Agrobacterium tumefaciens da cepa LBA4404. (b) Transformação da Populus mediada por Agrobacterium Faia tipo selvagem foi transformada com Agrobacterium tumefaciens carregando um construto que compreende um gene da cinase associada à parede de Arabidopsis thaliana obtido no exemplo 1 ligado operavel-mente a um promotor do gene preferido de xilema (TUB). Pecíolos e segmentos de caulse internodais de plantas micropropagadas in vitro foram u-sados como explantes. Brotos transformados foram selecionados em meio de regeneração contendo 1.000 mg/L de canamicina e permitiu-se que enraizassem no meio Murashige e Skoog. Plantas selecionadas foram subsequentemente transferidas para o solo e cultivadas em estufa.Example 5 Preparation of Transgenic Pooulus Plants The gene obtained in example 1 above was introduced into a host plant to produce transgenic Populus plants. (a) Preparation of Aqrobacterium Constructs and Transformation Expression constructs were prepared by dividing the wall-associated kinase gene obtained in example 1 above, with appropriate restriction enzymes to include the entire open reading frame and insert the gene into the vector. transformation of the pALELLYX-WAK plant (Figure 1) together with an appropriate promoter. For example, the wall-associated kinase gene obtained in Example 1 was cloned for downstream supramenated expression vector to a Populus deltoides preferred xylem gene (TUB) gene promoter, as disclosed in International Application WO 2005/096805 . The resulting expression construct was amplified in e.g. coli, and then freeze-transformed into Agrobacterium tumefaciens of strain LBA4404. (b) Transformation of Agrobacterium-mediated Populus Wild-type beech was transformed with Agrobacterium tumefaciens carrying a construct comprising an Arabidopsis thaliana wall-associated kinase gene obtained in example 1 operably linked to a preferred xylem gene promoter (TUB). ). Petioles and internodal caulse segments from in vitro micropropagated plants were used as explants. Transformed shoots were selected in regeneration medium containing 1,000 mg / L kanamycin and allowed to root in Murashige and Skoog medium. Selected plants were subsequently transferred to soil and grown in a greenhouse.

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Construção de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo WAK4, tal como definida pela SEQ ID N0:1 ligada operavelmente a um promotor heterólogo preferido de xilema, que causa superexpressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK4.Nucleic acid construct characterized in that it comprises a WAK4 polynucleotide sequence as defined by SEQ ID NO: 1 operably linked to a preferred heterologous xylem promoter which causes overexpression of said WAK4 polynucleotide sequence. 2. Construção de ácido nucleico, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.Nucleic acid construct according to claim 1, characterized in that said preferred xylem promoter is selected from the group consisting of a TUB gene promoter, SuSy gene promoter, COMT gene promoter and gene promoter. C4H. 3. Método para aumentar o comprimento das fibras e/ou da altura de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir uma construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos de WAK4, tal como definida pela SEQ ID NO: 1 ligada operavelmente a um promotor heterólogo preferido de xilema, que causa uma superexpressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK4; (b) cultivar a dita planta sob condições que promovam o crescimento· de uma planta; e (c) selecionar uma planta transgênica que possua comprimento da fibra e/ou altura da planta aumentados comparado a uma planta não-transgênica da mesma espécie.A method for increasing the length of fibers and / or height of a plant, comprising: (a) introducing a nucleic acid construct comprising a WAK4 polynucleotide sequence as defined by SEQ ID NO: 1 operably linked to a preferred heterologous xylem promoter, which causes overexpression of said WAK4 polynucleotide sequence; (b) cultivate said plant under conditions that promote the growth of a plant; and (c) selecting a transgenic plant that has increased fiber length and / or plant height compared to a non-transgenic plant of the same species. 4. Método, de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.Method according to claim 3, characterized in that said preferred xylem promoter is selected from the group consisting of a TUB gene promoter, SuSy gene promoter, COMT gene promoter and C4H gene promoter.