BRPI0719672B1 - Isolated polyopeptide isolated, method for producing a polympeptide with resistance activity to herbicides, method for confering resistance to a herbicide in a plant, plant, method for enhancing vigor or yield of a plant, a method for confering glyphosate resistance to a plant - Google Patents

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA OBTER UMA CÉLULA VEGETAL TRANSFORMADA, MÉTODO PARA OBTER UMA PLANTA TRANSGÊNICA, POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE RESISTÊNCIA A HERBICIDAS, MÉTODO PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A UM HERBICIDA EM UMA PLANTA E MÉTODO PARA OBTER UMA PLANTA TRANSFORMADA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere a biologia molecular vegetal, particularmente a novos polipeptídeos da ΕΡΞΡ sintase que conferem uma melhor resistência ou tolerância ao glifosato herbicida.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A N-fosfonometilglicina, comumente denominada glifosato, é um importante agroquímico, 0 glifosato inibe a enzima que transforma o ácido fosfoenolpirúvico (PEP} e o ácido 3-fosfochiquímico (S3P) em ácido 5-enolpi ruvil-3- fosfochiquímico. A inibição dessa enzima (5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato sintase; denominada daqui em diante "EPSP sintase" ou "EPSPS") mata as células vegetais ao interromper a via do chiquimato, inibindo, portanto, a biosintese do aminoácido aromático.

Dado que os herbicidas de tipo glifosato inibem a biosintese do aminoácido aromático, eles não só matam as células vegetais, senão que também sào tóxicos para as células bacterianas, 0 glifosato inibe muitas EPS? sintases bacterianas e por isso é tóxico para essas bactérias. No entanto, certas EPSP sintases bacterianas possuem uma alta tolerância ao glifosato. É possível produzir células vegetais resistentes à toxidade do glifosato transformando as células vegetais para que expressem EPSP sintases bacterianas resistentes ao gi ifosato. Notoriamente, o gene bacteriano da cadeia CP4 do Agrobacterium tumefaciens foi utilizado para conferir resistência herbicida em células vegetais seguindo a expressão nos vegetais. Uma EPSP sintase mutante da cadeia CT7 do Salmonella typhimurium confere resistência ao glifosato em células bacterianas e confere resistência ao glifosato em células vegetais (Patente dos E.U.A. n°. 4.535.060, 4.769.061 e 5.094.945). A Patente dos E.U.A. N° 6.040.497 reporta que enzimas mutantes de EPSP sintase de milho apresentam substituição da treonina à isoleucina na posição 102 e da prolina à serina na posição 106 (a mutação "TIPS"). Tais alterações conferem ao glifosato uma resistência sobre a enzima de milho. Uma EPSP sintase mutante da cadeia CT7 do Salmonella typhimurium confere resistência ao glifosato em células bacterianas e confere resistência ao glifosato em células vegetais (Patente dos E.U.A. N°. 4.535.060, 4.769.061 e 5.094.945). He et al. ((2001) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6) desenvolveram uma EPSP sintase com maior tolerância ao glifosato mediante mutagênese e recombinação entre os genes de EPSP sintase do E. coli e do Salmonella typhimurium e sugere que as mutações na posição 42 (T42M) e na posição 230 (Q230K) sejam provavelmente responsáveis pela resistência observada. Trabalhos posteriores (He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67:1405-1409) mostram que a mutação T42M (treonina a metionina) é suficiente para melhorar a tolerância tanto da enzima E. coli como da Salmonella typhimurium. Devido às muitas vantagens que oferecem as plantas resistentes a herbicidas, os genes resistentes a herbicidas que melhoram a resistência ao glifosato são desejáveis.

Um método alternativo para a mutagênese é a "mutagênese permutacional", método descrito na Aplicação de Patentes dos E.U.A. N° 60/813.095, registrada em 13 de junho de 2006.

RESUMO DA INVENÇÃO São oferecidas as composições e métodos para conferir resistência ou tolerância. As composições incluem enzimas da EPSP sintase que são resistentes ao glifosato herbicida, bem como moléculas de ácido nucleico que codificam tais enzimas, vetores que contêm as moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que contêm os vetores. As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptideos resistentes a herbicidas, incluindo aqueles polipeptideos codificadores que contêm SEQ ID N°:9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ou 35, bem como sequências de polinucleotideos de SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34. As sequências de codificação podem ser utilizadas em construções de DNA ou em cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microorganismos e plantas. As composições também contêm bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformadas que são resistentes ao glifosato pela introdução das composições da invenção no genoma do organismo. Quando o organismo é uma planta, a introdução da sequência permite que os glifosatos que contêm herbicidas sejam aplicados a plantas para matar seletivamente as ervas daninhas ou outras plantas não transformadas, mas não o organismo transformado. As sequências podem ser também usadas para marcar a seleção de células vegetais que cresçam em condições de glifosato.

Também são oferecidos os métodos para identificar uma enzima EPSP sintase com atividade de resistência ao glifosato. Os métodos incluem identificar sequências adicionais de EPSP sintase que sejam resistentes ao glifosato baseando-se na presença do domínio da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 demonstra a atividade enzimática do GRG23(acel) ("M5"; SEQ ID N°:10) comparado com o tipo selvagem do GRG23 ("WTGRG23"; SEQ ID N°:2) a 37°C de 0 a 25 horas. A Figura 2 mostra a resistência do GRG23 e de diversas variantes ao glifosato, indicada como a constante de inibição OU Ki A Figura 3 mostra a meia vida do GRG23 e das variantes do GRG23 a 37°C.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As presentes invenções serão descritas daqui em diante de forma mais completa, referenciando as figuras anexas, nas quais são mostradas algumas, mas não todas, as configurações da invenção. Na verdade, estas invenções podem ser configuradas de várias maneiras diferentes e não deveriam ser interpretadas como limitadas às configurações aqui apresentadas; especificamente, as configurações são apresentadas com o objetivo de satisfazer os requerimentos legais vigentes. Números similares se referem a elementos similares em todos os casos.

Muitas modificações e outras configurações das invenções aqui apresentadas virão à mente dos mais experientes na especialidade à qual estas invenções pertencem, tendo o beneficio das lições apresentadas nas descrições precedentes e das figuras associadas. Portanto, deve-se entender que as invenções não estão limitadas às configurações especificas divulgadas e que pretende-se incluir modificações e outras configurações no alcance das afirmações anexas. Apesar de que aqui são utilizados termos específicos, eles são utilizados somente com sentido genérico e descritivo e não com o intuito de criar uma limitação. A presente invenção se interessa pelas composições e métodos para regular a resistência herbicida em organismos, particularmente em plantas ou células vegetais. Os métodos consistem em transformar organismos com sequências de nucleotideos codificando o gene de resistência ao glifosato da invenção. As sequências de nucleotideos da invenção são úteis para preparar plantas que mostrem uma tolerância maior ao glifosato herbicida. Portanto, entende-se por gene de "resistência ao glifosato" ou de "tolerância ao glifosato" da invenção a sequência de nucleotideos apresentada em SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34, bem como fragmentos e variantes da mesma, que codificam um polipeptideo de resistência ou tolerância ao glifosato. Da mesma forma, um polipeptideo de "resistência ao glifosato" ou de "tolerância ao glifosato" da invenção é um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°:9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ou 35, bem como fragmentos e variantes da mesma, que conferem a uma célula hospedeira resistência ou tolerância ao glifosato. A. Polinucleotídeos isolados e variantes e fragmentos dos mesmos Em algumas configurações, a presente invenção compreende polinucleotídeos isolados, recombinados ou purificados. Um polinucleotídeo ou polipeptideo "isolado" ou "purificado", ou uma porção biologicamente ativa do mesmo, é substancialmente livre de outros materiais celulares, ou meios de cultivo ao ser produzidos por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos ao ser sintetizado quimicamente. Entende-se por "biologicamente ativo" o fato de possuir a atividade biológica desejada do polipeptídeo nativo, isto é, de conservar a atividade de resistência a herbicidas. Um polinucleotídeo "isolado" pode ser livre de sequências (por exemplo, as sequências que codificam as proteínas) que naturalmente rodeiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nos extremos 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual deriva o polinucleotídeo. Para efeito da invenção, "isolado" quando se refira a polinucleotídeos exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias configurações, o polinucleotídeo isolado que codifica a resistência ao glifosato pode conter menos do que uns 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ou 0.1 kb de sequência de nucleotídeos que naturalmente rodeiam o polinucleotídeo no DNA genômico da célula da qual deriva o polinucleotídeo.

Os polinucleotídeos da invenção incluem aqueles que codificam polipeptídeos resistentes ao glifosato compreendendo a SEQ ID N°:9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ou 35, bem como as sequências de polinucleotídeo de SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34.

Por "glifosato" entende-se qualquer forma herbicida da N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal da mesma) e outras formas que resultem na produção do ânion glifosato in planta. Uma "proteína de resistência a herbicidas" ou uma proteína resultante da expressão de uma "molécula de ácido nucleico que codifica a resistência a herbicidas" representam proteínas que conferem a uma célula a habilidade de tolerar uma concentração mais alta de um herbicida do que as células que não expressam a proteína, ou de tolerar certa concentração de um herbicida por mais tempo do que as células que não expressam a proteína. Uma "proteína de resistência ao glifosato" representa uma proteína que confere a uma célula a habilidade de tolerar uma concentração mais alta de glifosato do que as células que não expressam a proteína, ou de tolerar certa concentração de glifosato por mais tempo do que as células que não expressam a proteína. Por "tolerar" ou "tolerância" entende-se sobreviver ou realizar funções celulares essenciais como síntese proteica e respiração de uma forma que não seja facilmente discernível de células não tratadas. A presente invenção também contempla variantes e fragmentos dos polinucleotídeos aqui descritos. Um "fragmento" de um polinucleotídeo pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo ou pode ser um fragmento a ser utilizado como sonda de hibridização ou primer de PCR, empregando métodos divulgados em outras partes deste documento. Os polinucleotídeos que são fragmentos de um polinucleotídeo compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 nucleotideos contíguos ou até o número de nucleotideos presentes em um polinucleotídeo de extensão completa aqui divulgado, dependendo do uso intencionado (por exemplo, um polinucleotídeo de EPSP sintase que compreenda a SEQ ID N°: 1). Por nucleotideos "contíguos" entendem-se os resíduos de nucleotideos que são imediatamente adjacentes uns aos outros.

Os fragmentos de polinucleotídeos da presente invenção geralmente codificam fragmentos de polipeptídeos que conservam a atividade biológica da proteína de resistência ao glifosato de extensão completa; isto é, a atividade de resistência a herbicidas. Por "conservar a atividade de resistência a herbicidas" entende-se que o fragmento terá pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, pelo menos 300% ou mais da atividade de resistência a herbicidas da proteína de resistência ao glifosato de extensão completa aqui divulgada como SEQ ID N°: 2, 3 ou 5. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicidas são bem conhecidos nesta especialidade. Vide, por exemplo, as Patentes dos E.U.A. n° 4.535.060 e 5.188.642, as quais se incorporam aqui em caráter íntegro como referência.

Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptideo da invenção codifica pelo menos 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptideo de extensão completa da invenção. A invenção também inclui variantes de polinucleotídeos. As "variantes" do polinucleotídeo se referem àquelas sequências que codificam os polipeptídeos aqui mostrados mas que diferem conservativamente por causa da degeneração do código genético, bem como àquelas que são suficientemente idênticas. 0 termo "suficientemente idênticas" se refere a uma sequência de polipeptideo ou de polinucleotídeo que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência comparado com a sequência de referência utilizando um dos programas de alinhamento que utilizam parâmetros padronizados. Alguém experiente na especialidade reconhecerá que esses valores podem ser ajustados de forma apropriada para determinar a identidade correspondente dos polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos, considerando aspectos como a degeneração do códon, a semelhança do aminoácido, o posicionamento do quadro de leitura, entre outros.

Os genes bacterianos normalmente possuem vários códons de iniciação à metionina na proximidade do começo do quadro de leitura aberta. Frequentemente, a iniciação da tradução em um ou mais desses códons de inicio levarão à geração de uma proteína funcional. Esses códons de início podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias como o Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon de início e proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, normalmente não se determina a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Portanto, entende-se que o uso de um dos códons de metionina alternativos podem levar à geração de variantes que conferem resistência herbicida. Essas proteínas de resistência a herbicidas estão incluídas na presente invenção e podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção.

Variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de reconhecidas técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, como se explica a seguir. As variantes de polinucleotídeos também incluem polinucleotídeos derivados sinteticamente que tenham sido gerados, por exemplo, utilizando estratégias dirigidas ou outras estratégias de mutagênese, mas que ainda codifiquem o polipeptídeo que possui a atividade biológica desejada.

Os especialistas também apreciarão o fato de que é possível introduzir modificações mediante mutações adicionais dos polinucleotídeos da invenção, levando, com isso, a modificações adicionais na sequência de aminoácidos dos polipeptideos codificados, sem alterar a atividade biológica dos polipeptideos. Portanto, variantes isoladas de polinucleotídeos podem ser criadas ao introduzir uma ou mais substituições, adições ou eliminações adicionais de nucleotídeos no correspondente polinucleotídeo que codifica o domínio da EPSP sintase aqui apresentado, de forma tal que uma ou mais substituições, adições ou eliminações de aminoácidos sejam introduzidas no polipeptídeo codificador. É possível introduzir mutações adicionais mediante técnicas padrão, como mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR, bem como técnicas de transposição genética. Tais variantes de polinucleotídeos também estão incluídas na presente invenção.

As variantes de polinucleotídeos podem ser criadas introduzindo mutações aleatórias ao longo de toda ou parte da sequência codificadora, por exemplo mediante mutagênese de saturação, sendo que os mutantes resultantes podem ser diferenciados pela capacidade de conferir atividade de resistência a herbicidas para identificar aqueles mutantes que conservam a atividade.

Transposição genética ou procedimentos sexuais de PCR (por exemplo, Smith (1994) Nature 370:324-325; Patente dos E.U.A. N° 5.837.458, 5.830.721, 5.811.238 e 5.733.731, as quais são aqui incorporadas como referência) podem ser utilizadas para modificar ou melhorar ainda mais polinucleotideos e polipeptideos que possuam o domínio da EPSP sintase da presente invenção (por exemplo, polipeptideos que confiram resistência ao qlifosato). A transposição genética implica a fragmentação aleatória de vários DNAs mutantes seguidos por sua montagem via PCR em moléculas de extensão completa. Exemplos de diversos procedimentos de transposição genética incluem, mas não se limitam a, montagem seguida por tratamento DNase, processo de extensão escalonado (STEP) e recombinação aleatória de primers in vitro. No método de mediado por DNase, segmentos de DNA isolados de um grupo de mutantes positivos são clivados em fragmentos aleatórios com Dnase I e sujeitos a múltiplas rondas de PCR sem primers agregados. A extensão dos fragmentos aleatórios se aproximam àquelas dos segmentos não clivados à medida que os ciclos de PCR procedem, resultando em que as mutações de diferentes clones se tornam mixtas e acumulam em algumas das sequências resultantes. Ciclos múltiplos de seleção e transposição levaram à melhoria funcional de várias enzimas (Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; e Crameri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-438). Tais procedimentos podem ser realizados, por exemplo, em polinucleotideos codificadores de polipeptideos que possuam o domínio da sequência da presente invenção para gerar polipeptideos que confiram resistência ao glifosato.

Utilizando métodos como PCR, hibridização, entre outros, as correspondentes sequências resistentes a herbicidas podem ser identificadas ao procurar por domínios da EPSP sintase da presente invenção. Vide, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). B. Proteínas isoladas e variantes e fragmentos das mesmas Os polipeptídeos de resistência a herbicidas estão incluídos na presente invenção. Um polipeptídeo de resistência a herbicidas que esteja substancialmente livre de material celular inclui preparações de polipeptídeos que possuam menos de cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (segundo peso seco) de polipeptídeo de não-resistência a herbicidas (também denominado aqui de "proteína contaminante"). Na presente invenção, entende-se por "proteína resistente a herbicidas" um polipeptídeo da EPSP sintase que possua um domínio de sequência da invenção. Fragmentos, porções biologicamente ativas e variantes dos mesmos também são oferecidas, e podem ser utilizadas para praticar os métodos da presente invenção.

Os "fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeos que compreendem uma porção de uma sequência de aminoácido que codifica uma proteína resistente a herbicidas e que conserva atividade de resistência a herbicidas. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína de resistência a herbicidas pode ser um polipeptídeo que representa, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de extensão. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas mediante técnicas de recombinação e avaliadas segundo a atividade de resistência a herbicidas.

Por "variantes" entendem-se as proteínas ou polipeptídeos que contêm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a um polipeptídeo da EPSP sintase que possua o domínio da EPSP sintase da presente invenção. Alguém experiente na especialidade reconhecerá que esses valores podem ser ajustados de forma apropriada para determinar a identidade correspondente dos polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos, considerando aspectos como a degeneração do códon, a semelhança do aminoácido, o posicionamento do quadro de leitura, entre outros.

Por exemplo, substituições de aminoácidos conservados podem ser realizadas em um ou mais resíduos não essenciais de aminoácidos. Um resíduo "não essencial" de aminoácido é um resíduo que pode ser alterado da sequência de tipo selvagem de um polipeptídeo sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" é requerido para atividade biológica. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possua uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares se encontram definidas na especialidade. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais de ramificações beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que conservem função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados ou para resíduos de aminoácidos que residam dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos sejam essenciais para a atividade do polipeptídeo. No entanto, alguém com conhecimento da especialidade entendería que as variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

Os anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção, ou para as variantes ou fragmentos dos mesmos, também estão incluídos. Os métodos para produzir anticorpos são reconhecidos na especialidade (vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis et al.) C. Construções de polinucleotídeos Os polinucleotídeos gue codificam os polipeptídeos da EPSP sintase da presente invenção podem ser modificados para obter ou melhorar a expressão em células vegetais. Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos aqui identificados podem ser oferecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. Um "cassete de expressão vegetal" inclui uma construção de DNA, incluindo uma construção de DNA recombinante, que é capaz de resultar na expressão de um polinucleotídeo em uma célula vegetal. 0 cassete pode incluir na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação transcricional (por exemplo, promotor, particularmente um promotor heterólogo) operacionalmente vinculados a um ou mais polinucleotídeos de interesse, e /ou uma região de terminação de tradução e transcrição (por exemplo, região de terminação) funcional em plantas. 0 cassette pode adicionalmente conter pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser introduzido no organismo, tal como um gene marcador selecionável. Alternativamente, os polinucleotídeo(s) adicionais podem ser oferecidos em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é oferecido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção do polinucleotídeo(s) que estarão sob a regulação transcripional das regiões regulatórias. "Heterólogo" geralmente se refere ao polinucleotídeo ou polipeptideo que não é endógeno à célula ou que não é endógeno ao local no genoma nativo onde está presente, e foi adicionadas à célula por infecção,transfecção, mocroinjeção, electroporação, microprojeção, entre outros. Por "operacionalmente vinculado" entende-se uma vinculação funcional entre dois polinucleotideos. Por exemplo, quando um promotor está operacionalmente vinculado a uma sequência de DNA, a sequência promotora inicia e media a transcrição da sequência de DNA. Reconhece-se que polinucleotideos operacionalmente vinculados podem ou não ser contíguos e, ao ser usado para referenciar a junção de duas regiões codificadoras de polipeptídeos, os polipeptídeos se expressam no mesmo quadro de leitura. 0 promotor pode ser qualquer polisequência de nucleotídeos que mostre atividade transcripcional nas células vegetais, em partes de plantas ou nas plantas escolhidas. 0 promotor pode ser nativo ou análogo, ou estrangeiro ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a sequência de DNA da invenção. Onde o promotor for "nativo" ou "análogo" para a planta hospedeira, procura-se que o promotor seja encontrado na planta nativa na qual é intduzido. Quando o promotor for "estrangeiro" ou "heterólogo" à sequência de DNA da invenção, procura-se que o promotor não seja o promotor nativo ou o promotor de ocorrência natural para a sequência de DNA operacionalmente vinculada da invenção. O promotor pode ser inducível ou constitutivo. Pode ser de ocorrência natural, pode estar composto por porções de vários promotores de ocorrência natual, ou podem ser parcialmente ou totalmente sintéticos. Um guia para o desenho de promotores é oferecido por estudos da estrutura de promotores, como o de Harley e Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. Também, o local do promotor relativo ao começo da transcrição pode ser otimizado. Veja, por exemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:760-764. Muitos promotores adequados para uso em plantas são reconhecidos na especialidade.

Por exemplo, promotores constitutivos adequados para serem utilizados nas plantas incluem: os promotores de virus vegetais, como o promotor do caulimovirus de surcos cloróticos do amendoim (PC1SV) (Patente dos E.U.A. n° 5.850.019); o promotor 35S do virus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotores dos virus de Chlorella genes metiltransferase (Patente dos E.U.A. n° 5.563.328) e o promotor transcrito de extensão completado virus do mosaico da ficária (FMV) (U.S. Pat. No. 5,378,619); os promotores de genes como o da actina do arroz (McElroy et al. (1990) Planta Célula 2:163-171); da ubiquitina (Christensen et al. (1989) Planta Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Planta Mol. Biol. 18:675-689); do pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); do MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); da histona H3 do milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 e Atanassova et al. (1992) Planta J. 2(3):291-300); do Brassica napus ALS3 (aplicação PCT WO 97/41228); e promotores de vários genes Agrobacterium (ver Patente dos E.U.A. n° 4.771.002, 5.102.796, 5.182.200 e 5.428.147).

Promotores induzíveis adequados para uso em plantas incluem: o promotor do sistema ACE1 que responde ao bronze (Mett et ai. (1993) PNAS 90:4567-4571); o promotor do gene In2 do milho que responde aos protetores herbicidas de benzenesulfonamida (Hershey et ai. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 e Gatz et ai. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); e o promotor do repressor Tet do TnlO (Gatz et ai. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Outro promotor induzivel para uso em plantas é um que responde a um agente induzivel ao qual as plantas não respondem normalmente. Um promotor induzivel exemplar desse tipo é o promotor induzivel de um gene de hormônio esteróide, a atividade transcripcional da qual é induzida pelo hormônio glucocorticosteróide (Schena et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421) ou a aplicação recente de um ativador chimérico de transcrição, XVE, para uso em um sistema de expressão vegetal baseado em receptores de ativado pelo estradiol (Zuo et ai. (2000) Planta J., 24:265-273). Outros promotores induzíveis para uso em plantas são descritos em EP 332104, PCT WO 93/21334 e PCT WO 97/06269, os quais são incorporados aqui de forma íntegra como referência. Também podem ser utilizados promotores compostos por porções de outros promotores, bem como promotores parcialmente ou totalmente sintéticos. Vide, por exemplo, Ni et al. (1995) Planta J. 7:661-676 e PCT WO 95/14098 descrevendo tais promotores para uso em plantas. O promotor pode incluir, ou pode ser modificado para incluir, um ou mais elementos de realce. Em algumas configurações, o promotor pode incluir uma pluralidade de elementos de realce. Os promotores que contêm elementos de realce permitem níveis mais altos de transcrição quando comparados com os promotores que não os incluem. Elementos de realce adequados para uso em plantas incluem o elemento de realce do PC1SV (Patente dos E.U.A. n° 5.85.019), o elemento de realce do CaMV 35S (Patente dos E.U.A. n° 5.106.739 e 5.164.316) e o elemento de realce do FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156). Vide também PCT WO 96/23898.

Frequentemente, tais construções podem conter regiões 5' e 3' não traduzidas. Tais construções podem conter uma "sequência sinalizadora" ou "sequência líder" para facilitar o transporte co-translacional ou pós-translacional do peptídeo de interesse para certas estructuras intracelulares como o cloroplasto (ou outro plastídeo), o retículo endoplasmático ou o aparelho de Golgi, ou para serem secretadas. Por exemplo, a construção pode ser projetada para conter um peptídeo sinalizador que facilite a transferência do peptídeo ao retículo endoplasmático. Por "sequência sinalizadora" entende-se a sequência que se sabe ou se suspeita que resulta em transporte de peptídeos co-translacional ou pós-translacional através da membrana da célula. Nas eucariotas, isto normalmente implica secreção dentro do aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Por "sequência líder" entende-se qualquer sequência que, ao ser traduzida, resulta em uma sequência de aminoácido suficiente para disparar um transporte co-translational da cadeia de peptídeos a uma organela sub-celular. Portanto, isto inclui sequências líderes que buscam transporte e/ou glicosilação pela passagem no retículo endoplasmático, passagem ao vacúolo, plástidos incluindo cloroplastos, mitocôndria, entre outros. Também pode ser preferível projetar que o cassete de expressão da planta contenha um íntron, de forma tal que o processamento mRNA do íntron seja requerido para a expressão.

Por "região 3' não traduzida" entende-se um polinucleotídeo localizado na cadeia inferior de uma sequência codificante. As sequências sinalizadoras de poliadenilação e outros sinais regulatórios que codificam sequências capazes de afetar a adição das vias de ácido poliadenílico ao extremo 3' do mRNA precursor são regiões 3' não traduzidas. Por "região 5' não traduzida" entende-se um polinucleotídeo localizado na cadeira superior de uma sequência codificante.

Outros elementos não traduzidos da cadeia superior ou inferior incluem os realçadores. Os realçadores são polinucleotídeos que agem para aumentar a expressão de uma região promotora. Os realçadores são bem conhecidos na especialidade e incluem, não estando limitados a, a região de realce SV40 e o elemento de realce 35S. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcripcional, pode ser nativa com a sequência da presente invenção ou pode ser derivada de outra origem. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do Ti-plásmido de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação octopina sintase e a nopalina sintase. Vide também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Planta Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Em um aspecto da invenção, sequências sintéticas de DNAs são criadas para um determinado polipeptídeo, tais como os polipeptídeos da invenção. A expressão do quadro de leitura aberta das sequências sintéticas de DNAs em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. As sequências sintéticas de DNAs podem ser úteis para remover facilmente locais não desejados de restrição à endonuclease, para facilitam as estratégias de clonagem de DNAs, para alterar ou remover qualquer sesgo potencial do códon, para alterar ou melhorar o conteúdo GC, para remover ou alterar quadros de leitura alternativas, e/ou alterar ou remover locais de renonhecimento de junção de íntron/exon, locais de poliadenilação, sequências Shine-Delgarno, elementos promotores não desejados, entre outros, que podem estar presentes em uma sequência de DNA nativa. Também é possível que as sequências sintéticas de DNAs possam ser utilizadas para introduzir outras melhorias a uma sequência de DNA, tais como a introdução de uma sequência de íntron, a criação de uma sequência de DNA que se expresse como uma fusão de proteínas a sequências que busquem organelas, tais como peptídeos de trânsito de cloroplastos, peptídeos que busquem apóplastos/vacúolos, ou sequências de peptídeos que resultem na retenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Genes sintéticos também podem ser sintetizados usando códons preferidos pelas células hospedeiras para melhorar a expressão, ou podem ser sintetizadas usando códons com a frequência de uso de códons preferida pela hospedeira. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Planta Physiol. 92:1-11; Patente dos E.U.A. n° 6.320.100, 6.075.185, 5.380.831 e 5.436.391, U.S. Published Application n° 20040005600 e 20010003849, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados como referência.

Em uma configuração, os polinucleotídeos de interesse são apontados ao cloroplasto para expressão. Dessa forma, quando o polinucleotídeo de interesse não é diretamente introduzido no cloroplasto, o cassete de expressão irá conter adicionalmente um polinucleotídeo que codificará um peptídeo de trânsito para direcionar o nucleotídeo de interesse aos cloroplastos. Tais peptideos de trânsito são conhecidos na especialidade. Vide, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Planta Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Blol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Planta Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem.

Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Os polinucleotídeos de interesse que serão direcionados ao cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para identificar diferenças no uso do códon entre o núcleo da planta e essa organela. Dessa forma, os polinucleotídeos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos pelos cloroplastos. Vide, por exemplo, Patente dos E.U.A. n° 5.380.831, aqui incorporada como referência.

Esse cassete de expressão vegetal pode ser inserido em um vetor de transformação vegetal. Por "vetor de transformação" entende-se uma molécula de DNA que possibilita a transformação de uma célula. Tal molécula pode consistir de um ou mais cassetes de expressão e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA vetor. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação vegetais que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções cis- e trans-atuantes necessárias para a transformação das células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Planta Science 5:446-451). "Vetor" se refere à policonstrução de nucleotídeo criada para a transferência entre diferentes células hospedeiras. "Vetor de expressão" se refere ao vetor que possui a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências de DNAs heterólogas ou fragmentos em uma célula estrangeira. O vetor de transformação vegetal compreende um ou mais vetores de DNA para obter a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na especialidade utilizar vetores de transformação vegetal que compreendem mais do que um segmento contíguo de DNA. Esses vetores são denominados comumente na especialidade como vetores binários. Os vetores binários, bem como os vetores com plasmídeos auxiliares, são normalmente utilizados para transformações mediadas pelo Agrobacterium, na qual o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar uma transformação eficiente é bastante grande, sendo vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetors binários contém normalmente um vetor plasmídeo que contém as sequências cis-atuantes requeridas para a transferência T-DNA (tais como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é projetado para ter capacidade de expressão em uma célula vegetal, e um "polinucleotídeo de interesse" (um polinucleotídeo projetado para ter capacidade de expressão em uma célula vegetal para a qual a geração de plantas transgênicas é desejável). Também estão presentes neste vetor plasmídeo sequências requeridas para a replicação bacteriana. As sequências cis-atuantes são ordenadas de maneira tal que permitam uma transferência eficiente a células vegetais e sua expressão. Por exemplo, a sequência do marcador selecionável e a sequência de interesse estão localizadas entre as bordas esquerda e direita. Normalmente, um segundo vetor plasmideo contém os fatores trans-atuantes que mediam a transferência T-DNA da Agrobacterium a células vegetais. Este plasmideo normalmente contém as funções virulentas (genes Vir) que permitem a infecção de células vegetais pela Agrobacterium e transferência do DNA mediante a divagem das sequências das bordas e a transferência de DNA mediada por vir, como é entendido na especialidade (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Planta Science, 5:446-451). Vários tipos de cepas da Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser utilizadas para transformação vegetal. O segundo vetor plasmideo não é necessário para introduzir os polinucleotideos nas plantas mediante outros métodos como a microprojeção, a microinjeção, a eletroporação, o glicol de polietileno, etc. D. Transformação da planta Os métodos da invenção consistem em introduzir a construção de nucleotideo em uma planta. Por "introduzir" entende-se apresentar à planta a construção de nucleotideo de forma tal que a construção obtenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem a utilização de um método particular para introduzir a construção de nucleotideo em uma planta, simplesmente requer que a construção de nucleotideo obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir uma construção de nucleotideos em plantas são conhecidos na especialidade, incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transientes e métodos mediados por virus.

Em geral, os métodos de transformação consistem em transferir DNA heterólogo às células vegetais alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, cultivos de suspensão, calos não diferenciados, protoplastos, etc.), seguidos pela aplicação de um nivel critico máximo da seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável e, neste caso, do "glifosato") para recuperar as células vegetais transformadas de um grupo de massa celular não transformada. Explantes são normalmente transferidos a uma fonte fresca do mesmo meio e cultivada de forma rotineira. Posteriormente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após serem colocadas em um meio de regeneração suplementado com um nivel critico máximo do agente selecionador (por exemplo, "glifosato"). Os brotos são posteriormente transferidos a um meio de enraizamento seletivo para recuperar as raizes dos brotos ou mudas. A muda transgênica logo cresce em uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Planta Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos a uma fonte fresa do mesmo meio e cultivada de forma rotineira. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas se encontra em Ayres e Park (1994) Criticai Reviews in Planta Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que o material transformado contém muitas células, tanto as células transformadas como as não transformadas estão presentes em qualquer pedaço do calo ou tecido ou grupo de células alvos sujeitos. A habilidade de matar células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resultados em cultivos vegetais transformados. Normalmente, a habilidade de remover células não transformadas é uma limitação para recuperar rapidamente as células vegetais transformadas e para a eficaz geração de plantas transgênicas. Métodos moleculares e bioquímcos podem ser usados para confirmar a presença dos genes heterólogos integrados de interesse no genoma da planta transgênica. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por algum dos diversos métodos existentes, incluindo, mas não se limitando a, introdução de DNA heterólogo pela Agrobacterium em células vegetais (transformação mediada pela Agrobacterium), bombardeio de células vegetais com DNA estrangeiro heterólogo aderido a partículas e vários outros other métodos não mediados diretamente por partículas (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Planta Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres e Park (1994) Criticai Reviews in Planta Science 13:219-239; Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferir DNA. Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na especialidade. Vide, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método se baseia na saida de arma de uma partícula de DNA contendo um marcador selecionável e que aponta do DNA ao genoma plastídico mediante recombinação homóloga. Além disso, a transformação plastídica pode ser alcançada pela transativação de um transgene silencioso relacionado ao plastídeo mediante a expressão preferida pelo tecido de um RNA polimerase codificado nuclearmente e dirigido ao plastídeo. Esse sistema foi descrito em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 91:7301-7305.

As células que foram transformadas podem crescer e virar plantas seguindo as formas convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al. (1986) Planta Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem portanto ser cultivadas e fecundadas com as mesmas cepas transformadas ou com cepas diferentes, possuindo o híbrido resultante expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão característica fenotípica desejada seja mantida de forma estável e herdada, colhendo as sementes para garantir que a expressão da característica fenotípica tenha sido alcançada. Dessa forma, a presente invenção oferece uma semente transformada (também denominada "semente transgênica") que possui uma construção de nucleotideo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado ao seu genoma. E. Avaliação da transformação da planta Após a introdução do DNA heterólogo estrangeiro em células vegetais, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabolites associadas com o gene integrado. A análise PCR é um método rápido para identificar em células, tecidos ou brotos transformados a presença do gene incorporado nos primeiros estágios, antes de que sejam transplantados no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). O PCR é realizado usando primers de oligonucleotídeo específicos ao gene de interesse ou fundo do vetor Agrobacterium, etc. A transformação da planta pode ser confirmada pela análise Southern Blot do DNA genômico (Sambrook e Russell (2001) supra) . Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com as enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido a uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. A membrana ou "mancha" pode então ser sondada com, por exemplo, fragmentos de DNA 32P alvo marcados com radioatividade para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta, de acordo com as técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra).

Na análise Northern, o RNA é isolado a partir de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose formaldeído e manchado em um filtro de nylon, de acordo com os procedimentos padrão usados rotineiramente na especialidade (Sambrook e Russell (2001) supra). A expressão de RNA codificada por sequências grg da invenção é então testada mediante a hibridização do filtro a uma sonda radioativa derivada de um GDC por métodos conhecidos na especialidade (Sambrook e Russell (2001) supra).

Experimentos Western Blot e bioquímicos, entre outros, podem ser realizados nas plantas transgênicas para determinar a presença de proteína codificada pelo gene de resistência a herbicidas mediante procedimentos padrão (Sambrook e Russell (2001) supra) usando anticorpos que se atam a um ou mais epítopes presentes na proteína de resistência a herbicidas.

Em um aspecto da invenção, os genes grg aqui descritos são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais. F. Plantas e partes das plantas Por "planta" entende-se a planta inteira, órgãos das plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e progênie dos mesmos. As células vegetais podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calos, células de cultura suspensa, protoplastos, células de folhas, células de raiz, células de floema, pólen). A presente invenção pode ser usada para a introdução de polinucleotideos em qualquer espécie vegetal, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledêonias e dicotiledêonias. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não se limitam a, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, cruciferas, pimenta, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza ou Brassica sp., alfalfa, centeio, painço, açafroa, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, verduras, plantas ornamentais e coníferas.

As verduras incluem, mas não se limitam a, tomates, alface, vagem, feijão-de-lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, melão amarelo e melão verde. As plantas ornamentais incluem, mas não se limitam a, azaléias, hortênsias, hibiscos, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, copos-de-leite e crisântemos. As plantas de cultivo também são de interesse, incluindo, por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, cruciferas, pimenta, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana de açúcar, tabaco, cevada, colza, etc.

Esta invenção é apropriada para qualquer membro da família das plantas monocotiledônias, incluindo, mas não se limitando a, milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana-de-açúcar, abacaxi, inhame, cebola, banana, coco e tâmaras. G. Métodos para aumentar o rendimento da planta Oferecem-se métodos para aumentar o rendimento da planta. Os métodos consistem em introduzir na planta ou célula vegetal um polinucleotídeo contendo uma sequência grg aqui indicada. Como aqui se define, o "rendimento" da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por "biomassa" entende-se qualquer produto medido da planta. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto medido da planta. Aumentar o rendimento da planta possibilita várias aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa da folha da planta pode aumentar o rendimento das verduras de folhas para consumo humano ou animal. Além disso, aumentar a biomassa da folha pode ser útil para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais de origem vegetal. Um aumento no rendimento pode ser entendido como qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 1% de aumento, pelo menos 3% de aumento, pelo menos 5% de aumento, pelo menos 10% de aumento, pelo menos 20% de aumento, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100% ou mais de aumento.

Em métodos específicos, a planta é tratada com uma concentração eficaz de um herbicida, sendo que a aplicação do herbicida resulta em um melhor rendimento da planta. Por "concentração eficaz" entende-se a concentração que permite um maior rendimento da planta. Tais concentrações eficazes para herbicidas de interesse são geralmente conhecidas na especialidade. 0 herbicida pode ser aplicado tanto em pré como em pós-emergência, de acordo com as técnicas habituais para a aplicação de herbicidas em campos cujos cultivos se tornaram resistentes a herbicidas pela expressão heteróloga de um gene grg da invenção.

Também são oferecidos métodos para conferir resistência a herbicidas em uma planta ou parte de uma planta. Em tais métodos, um polinucleotideo grg aqui revelado é inserido na planta, sendo que a expressão do polinucleotideo resulta em tolerância ou resistência ao glifosato. As plantas produzidas com este método podem ser tratadas com uma concentração eficaz de um herbicida e exibir maior tolerância ao herbicida. Uma "concentração eficaz" de um herbicida nesta aplicação é a quantidade suficiente para desacelerar ou parar o crescimento de plantas ou partes de plantas que não sejam naturalmente resistentes ou que não tenham se tornado resistentes ao herbicida. H. Métodos para controlar ervas daninhas em um campo Também são oferecidos métodos para o controle seletivo de ervas daninhas em um campo que contenha uma planta. Em uma configuração, as sementes da planta ou as plantas são resistentes ao glifosato como resultado de que um polinucleotídeo grg aqui revelado tenha sido inserido na semente da planta ou na planta. Em métodos específicos, a planta é tratada com uma concentração eficaz de um herbicida, sendo que a aplicação do herbicida resulta em um controle seletivo de ervas daninhas ou outras plantas não transformadas. Por "concentração eficaz" entende-se a concentração que controla o crescimento ou a disseminação de ervas daninhas ou outras plantas não transformadas sem afetar significativamente a semente da planta ou a planta resistente ao glifosato. Tais concentrações eficazes para herbicidas de interesse são geralmente conhecidas na especialidade. 0 herbicida pode ser aplicado tanto em pré como em pós-emergência, de acordo com as técnicas habituais para a aplicação de herbicidas em campos cujas plantas ou sementes de plantas se tornaram resistentes ao herbicida. I. Espectro de temperatura Foram realizados vários estudos sobre o metabolismo do glifosato nas plantas, os quais revelam que o glifosato não é metabolizado pelas plantas ou é metabolizado de forma muito lenta. 0 glifosato penetra na cutícula rapidamente e é translocado através das plantas por um período considerável (revisado em Kearney e Kaufman, Eds (1988) Herbicides; Chemistry, Degradation & Mode of Action Marcei Dekker , Inc., New York, 3:1-70 e Grossbard e Atkinson, Eds. (1985) The Herbicide Glyphosate Butterworths, London, p. 25-34). Portanto, é provável que a tolerância ao glifosato seja necessária por um período prolongado após a exposição ao glifosato em plantas importantes agronomicamente. Quando as temperaturas superam frequentemente 30°C durante a temporada de cultivo, seria conveniente utilizar uma EPSP sintase com tolerância ao glifosato para manter a atividade com temperaturas elevadas.

Em uma configuração da presente invenção, a EPSP sintase exibe estabilidade térmica a uma temperatura maior ou menor do que a temperatura ambiente. Por "estabilidade térmica" entende-se que a enzima permanece ativa a temperaturas mais altas ou mais baixas do que a temperatura ambiante por um período mais prolongado do que uma EPSP sintase que não exibe estabilidade térmica a essa temperatura. Por exemplo, uma EPSP sintase com estabilidade térmica exibe atividade enzimática por mais de cerca de 1 hora, por mais de cerca de 2 horas, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25 horas ou mais, a uma temperatura maior ou menor do que a temperatura ambiente. Para efeito da presente invenção, temperatura "ambiente" equivale a cerca de 30°C. Em algumas configurações, uma temperatura maior do que a temperatura ambiente é uma temperatura igual ou superior a cerca de 32°C, cerca de 34°C, cerca de 37°C, cerca de 40°C, cerca de 45°C, cerca de 50°C, cerca de 55°C, cerca de 60°C, cerca de 65 °C ou maior. Uma temperatua menor do que a temperatura ambiente é uma temperatura igual ou inferior a cerca de 28°C, cerca de 27°C, cerca de 26°C, cerca de 25°C, cerca de 23°C, cerca de 20°C, cerca de 18°C, cerca de 15°C, cerca de 10°C, igual ou inferior a cerca de 5°C, ou ao redor de 0°C. Métodos para realizar experimentos sobre a atividade da EPSP sintase são discutidos com maior detalhe em outras partes deste documento. Para efeitos da presente invenção, uma EPSP sintase com estabilidade térmica é considerada ativa quando funciona a cerca de 90% a 100%, cerca de 80% a 90%, cerca de 70% a 80%, cerca de 60% a 70% ou cerca de 50% a 60% do máximo nível de atividade observado na temperatura ótima para essa enzima.

Portanto, são oferecidos aqui métodos e composições para aumentar a tolerância ao glifosato a temperaturas maiores do que a temperatura ambiente. Em uma configuração, os métodos consistem em introduzir em uma planta uma sequência de nucleotídeos que codificam a enzima da EPSP sintase tolerante ao glifosato apresentada em SEQ ID N°: 8, 10, 14, 28, 30, 32 ou 34, e cultivar a planta a uma temperatura maior do que a temperatura ambiente. Em configurações específicas, a temperatura de cultivo é maior do que a temperatura ambiente, em média, pelo menos cerca de 2 horas por dia, pelo menos cerca de 3 horas por dia, pelo menos cerca de 4 horas por dia, pelo menos cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 14, cerca de 16, cerca de 18, cerca de 20, pelo menos cerca de 22 horas por dia ou até cerca de 24 horas por dia durante a temporada de cultivo da planta.

Em outra configuração, o método consiste em introduzir em uma planta uma sequência de nucleotideos que codificam a enzima da EPSP sintase tolerante ao glifosato apresentada em SEQ ID N°: 8, 10, 14, 28, 30, 32 ou 34, fazendo com que a planta entre em contato com uma concentração de glifosato herbicidamente eficaz, e cultivar a planta a uma temperatura que supere a temperatura ambiente por pelo menos 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4 ou mais horas por dia, por pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias após o glifosato ter sido aplicado na planta, sendo que os dias nos quais a temperatura supera a temperatura ambiente ocorrem durante a temporada de cultivo da planta.

Os seguintes exemplos são oferecidos a modo de ilustração e não a modo de limitação.

EXPERIMENTOS

Exemplo 1. Concepção e expressão do synqrq23 O GRG23 (SEQ ID N°: 2) é uma EPSP sintase que possui excelentes valores cinéticos para Km, Ki e Vmax (Aplicação de Patentes dos E.U.A. N° 60/ 741.166 registrada em 1 de dezembro de 2005) . Uma sequência genética inovadora que codifica a proteína GRG23 (Aplicação de Patentes dos E.U.A. No. 60/741.166, registrada em 1 de dezembro de 2005) foi concebida e sintetizada. A sequência resultante é aqui oferecida como SEQ ID N°: 6 e aqui denominada "syngrg23O quadro de leitura aberta foi clonado no vetor de expressão pRSFlb (Invitrogen) através de métodos conhecidos na especialidade. 0 gene syngrg23 que codifica o GRG23 foi clonado em um vetor pUC19 para criar o pAX748. Os primers PCR que flanquearam o syngrg23 nesse vetor foram usados para amplificar o syngrg23 a partir do pAX748, usando o sistema Mutazyme II (Stratagene) para introduzir mutações aleatórias na região codificadora do syngrg23. O modelo foi diluído em 1:50 na reação de PCR propensa a erros, tendo sido efetuada uma amplificação por 30 ciclos. O produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição BamH I e Sgs I, purificadas com gel e anexadas ao vetor pRSFlb para criar uma biblioteca de syngrg23 mutagenizada.

As bibliotecas de syngrg23 mutagenizadas foram transformadas em cepas de E. coli BL21*DE3 star (Invitrogen). Após a transformação, colônias individuais foram plaqueadas em meio lx M63 contendo glifosato 150 mM para selecionar clones que tivessem retido atividade enzimática e tolerância ao crescimento.

Exemplo 2. Identificando a resistência ao glifosato em placas Ligações de bibliotecas foram transformadas em células competentes de E. coli BL21*DE3 (Invitrogen). As transformações foram realizadas segundo as instruções do fabricante, com as seguintes modificações. Após a incubação por 1 hora a 37°C e meio SOC, as células foram sedimentadas por centrifugação (5 minutos, 1000 x g, 4°C). As células foram lavadas com 1 ml M63+ e centrifugadas novamente, obtendo a decantação do sobrenadante. As células foram lavadas pela segunda vez com 1 ml M63+ e foram resuspensas em 200 ul M63+.

Para a seleção das enzimas GRG23 mutantes que conferem resistência ao glifosato em E. coli, as células foram plaqueadas em meio ágar M63+ contendo 150 mM de glifosato, 0,05 mM de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosideo) e 50 □g/ml de canamicina. O meio M63+ contém 100 mM de KH2PO4, 15 mM de (NH4)2S04, 50 μΜ de CaCl2, 1 μΜ de FeS04, 50 μΜ de MgCl2, 55 mM de glicose, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de tiamina HC1, suficiente NaOH para ajustar o pH a 7,0 e 15 g/litro de ágar. As placas foram incubadas por 36 horas a 37 °C.

Colônias individuais foram selecionadas e dispostas em placas 384 poços. Duas placas de 384 poços foram criadas dessa forma. Uma terceira placa de 384 clones foi selecionada a partir de colônias que cresceram em placas sem glifosato.

Exemplo 3. Isolamento e análise de variantes GRG23 resistentes ao glifosato Células BL21*DE3 transformadas com syngrg23 mutagenizado e/ou variantes do grg23 foram identificadas pelo cultivo em placas de glifosato. Extratos de syngrg23 mutagenizado e variantes do grgr23 foram preparados e utilizados como experimentos para uma melhor atividade enzimática. As colônias identificadas nas placas de glifosato foram fixadas em blocos de 96 poços contendo meio LB e cultivadas a um O.D. de cerca de 0,6. Logo, foi acrescentado IPTG (0,5 mM) e os blocos foram incubados durante a noite a 20°C para induzir a expressão da proteína. Extratos de proteína foram preparados a partir de pellets celulares usando um reagente de cultivo POP (Novagen) e Lysonase (Novagen), e a atividade enzimática nos lisatos crus foi medida após aquecer os extratos por 30 min a 37°C. Os extratos com atividade superior a dois desvios padrão acima da média de um conjunto de extratos que contém a proteína de controle adequada (por exemplo, a GRG23) foram selecionados para maior análise.

Os clones que mostraram uma maior atividade após a incubação como extratos crus foram cultivados em LB 250 mL e a expressão da proteína foi induzida com IPTG. Após a indução, a proteína GRG23 mutante foi purificada a partir de cada cultivo por cromatografia de afinidade usando uma resina de cobalto (Novagen). As proteínas purificadas foram posteriormente testadas para detectar atividade enzimática com aquecimento por 0, 2, 4 e aproximadamente 16 horas a 37 °C.

Exemplo 4. Variantes melhoradas da GRG23 De uma biblioteca de DNA de syngrg23 mutagenizados, foram identificados vários clones com melhor atividade a 37eC. A sequência de DNAs dos clones correspondentes a esses extratos foi determinada. A Tabela 1 mostra as modificações de aminoácidos identificadas em seis variantes da GRG23 que conservaram a resistência ao glifosato: grg23(L3P1.B20) {SEQ ID N°: 20) que codifica a sequência de aminoácidos GRG23(L3P1.B20) (SEQ ID N°: 21), grg23(L3P1 ,B3) (SEQ ID N°: 22) que codifica a sequência de aminoácidos grg23(L3P1B3) (SEQ ID N°: 23); GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID N°: 24) que codifica a sequência de aminoácidos GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID Ne: 25); e grg23 {L3P1.023) (SEQ ID N0 : 26) que codifica a sequência de aminoácidos GRG23 (L3P1.023) (SEQ !ID N° : 27).

Tabela 1. Mutações identificadas em variantes da GRG23 resistentes ao glifosato Os clones foram cultivados em LB 250 mL e a expressão da proteína foi induzida de forma isolada, segundo o acima descrito. As proteínas purificadas foram então testadas para detectar atividade enzimática com aquecimento por 0, 2, A e aproximadamente 16 horas a 37 eC. Um dos clones, denominado "1*15", demonstrou conservar uma proporção maior de sua atividade enzimãtica após incubação prolongada a 37°c (Tabela 2). A sequência de DMA desse clone foi determinada, sendo que o gene é aqui denominado grg23(acel) (SEQ ID N°: 8}. A proteína expressada a partir do grg23(acel) é denominada GRG23(ACE1) (SEQ ID N°: 9).

Tabela 2. Meia-vida da GRG23(ACE1} versus GRG23 a temperatura elevada A GRG23(ACE1) contém 2 substituições de aminoácidos relativas à proteína GRG23 e tipo selvagem: A49^T e S276—T. 0 vetor pRSFlb que contém esse gene é denominado pAX3801. 0 Gráfico 1 mostra a estabilidade relativa da GRG23 (AGE1) versus a GRG23 a temperaturas elevadas.

Exemplo 5. Determinação de atividade EPSPS das variantes da GRG-23 Extratos contendo· proteínas variantes da GRG23 foram testados para detectar atividade da EPSP sintase, conforme descrito na Aplicação de Patentes dos E.U.A. N° 60/741.166 registrada em 1 de dezembro de 2005, aqui incorporadas como referência em forma íntegra. Os experimentos foram realizados em um volume final de 50 ul contendo 0,5 mM de chiquimato-3-fosfato, 200 uM de fosfoenolpiruvato (PEP), 1 U/ml de xantina oxidase, 2 U/ml de nucleosideo fosforilase, 2.25 mM de inosina, 1 U/ml de horseradish peroxidase, 2 mM de glifosato, 50 mM de HEPES/KOH pH 7,0, 100 mM de KC1 e AMPLEX® Red (Invitrogen), segundo as instruções do fabricante. Foram incubados extratos com todos os componentes do experimento, exceto o chiquimato-3-fosfato, por 5 minutos à temperatura do recinto, período após o qual os experimentos foram iniciados com a adição de chiquimato-3-fosfato. A atividade da EPSP sintase foi medida usando um espectômetro de fluorescência Spectramax Gemini XPS (Dinâmica molecular: excitação: 555 nm; emissão: 590 nm).

Uma determinação completa dos parâmetros cinéticos foi realizada em proteínas purificadas, conforme descrito previamente (Aplicação de Patentes dos E.U.A. N° 60/741.166 registrada em 1 de dezembro de 2005), ajustando a quantidade de proteína determinada pelo experimento Bradford, como é conhecido na especialidade. Para qualquer uma das concentrações de glifosato, a atividade de EPSP sintase foi medida em função de uma faixa ampla de concentrações PEP. Os dados foram introduzidos na equação Michaelis-Menten usando o software KALEIDAGRAPH® (Synergy Software), com o objetivo de determinar o Km (Km aparente) da EPSP sintase para aquela concentração de glifosato. Os valore de Km aparente foram determinados em não menos do que quatro concentrações de glifosato, e o Ki da EPSPS para glifosato foi calculado a partir do gráfico de Km aparente versus concentração de glifosato, usando a equação {ml*x/ (m2+x) ; ml = 1; m2 = 1), segundo ao conhecido na especialidade.

Tabela 3. Cinética da GRG23(ACE1) versus a GRG23 Exemplo 6. Identificação da grg23 (ace2), A GRG2 3( ace1) contém duas modificações de aminoácidos relacionadas com a GRG23. Para determinar se substituções adicionais nessas posições poderíam melhorar ainda mais a atividade, uma biblioteca de DNAs foi gerada, resultando em clones expressando proteínas que foram substancialmente mutadas nas posições 4 9 e 276 correspondentes à GRG23 (SEQ ID N°: 2), Os clones que conferiam resistência ao glifosato foram selecionados por cultivo em placas de glifosato, tendo sido cultivados e testados para detectar propriedades cinéticas, conforme o descrito.

Surpreendentemente, um clone, aqui denominado grg23{ãc&2) (SEQ ID N°: 10), codificador da proteína GRG23 (ACE2) {SEQ ID N° : II) foi identificado por exibir uma melhor termoestabilídade. A sequência de DNA da grg23(ace2) mostra que a GRG23(ACE2) contém apenas uma modificação de aminoácido (resíduo 276 da GRG23 para arginina).

Exemplo 7. Comparação entre GRG23 e GRG51 e mutaqênese de resíduos diferentes Duas bibliotecas foram geradas para avaliar as permutações de sequências de aminoácidos possíveis a partir da comparação de sequências de aminoácidos da GRG23 e da GRG51. A primeira biblioteca introduziu variação a partir da sequência de aminoácidos da GRG51 em uma região codificadora da grg23(ace2) . A segunda biblioteca introduziu a variação a partir da sequência de aminoácidos da GRG23(ACE2) em uma região codificadora da grg51.

Os clones das bibliotecas resultantes foram avaliados segundo: (1) a habilidade para conferir resistência ao glifosato resistance em uma célula, e (2) a atividade após incubação prolongada a 37°C. Um total de dez clones foram sequenciados e analizados com maior detalhe. Um clone em particular clone, aqui denominado grg51.4 (SEQ ID N°: 12), codificador da proteína GRG51.4 (SEQ ID N°: 13), contém várias modificações de aminoácidos relacionadas tanto com a GRG23(ACE2) como com a GRG51. As modificações de aminoácidos presentes na GRG51.4 relacionadas com a GRG23(ACE2) foram posteriormente introduzidas no gene grg23(ace2), para produzir a grg23(ace3) (SEQ ID N°: 14), codificadora da proteína GRG23(ACE3) (SEQ ID N°: 15). A GRG23(ACE3) exibe atividade e termoestabilidade superiores em comparação com a GRG23 e a GRG23(ACE2). A GRG23{acel) foi mutagenizada e os clones foram testados para identificar clones expressando variantes com melhor termoestabilidade e/ou atividade. Um clone, o grg23(L5P2. J2) {SEQ ID N°: 16), codificador da GRG23(L5P2.J2) (SEQ ID N°: 17), foi identificado em função de suas propriedades cinéticas melhoradas. A GRG23ÇL5P2.J2) contém três modificações de aminoácidos relacionadas com a GRG23 (ACE1), conforme se observa na tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Modificações de aminoácidos na GRG23(L5P2.J2) Foi usada uma mutagênese do oligonucleotídeo para modificar a região codificadora da grg23{ace3), para que contenha cada uma das modificações de aminoácidos identificadas em GRG23(L5P2.J2), Um clone com um gene contendo essas modificações foi identificado e viu-se que codificava uma proteína com propriedades cinéticas alteradas sobre a GRG23{ACE3). Esse gene foi denominado grg23face4) (SEQ ID N°: 18). A proteína codificada pelo grg23(ace4) e denominada GRG2 3 {ACE4) (SEQ ID N°: 19) contém uma única modificação de aminoácido relativa à GRG23(ACE3} ÍValine 101 a fenilalanina)* Baseando-se nesse resultado, uma mutagênese separada do oligonucleotídeo foi realizada para testar a cinética de cada possível substituição de aminoácidos na posição 101. Nenhuma dessas modificações de aminoácidos resultou em novas melhorias das propriedades cinéticas em compaação com a GRG23(ACE4). Vide Tabela 5.

Tabela 5. Cinética das variantes melhoradas Exemplo 8. Termoestabilidade melhorada das variantes da GRG23 A termoestabilidade da GRG23 e diversas variantes forma determinadas pela incubação de amostras de proteína a 37°c por uma faixa de tempos, determinando posteriormente a atividade EPSPS residual, conforme o aqui descrito, e comparando a atividade àquela de uma amostra de controle incubada a 4°C. A Tabela 6 mostra que as variantes da GRG2 3 GRG23(ACE1), GRG2 3{ACE2) e GRG23(ACE3) possuem termoestabilidade melhorada.

Tabela 6. Termoestabilidade das variantes da GRG23 e da GRG2 3 Exemplo 9. Variantes da grg23{ace3) R mutagênese do oligonucleotideo foi utilizada para gerar variantes da grg23 (ace3) que resultam na expressão de proteínas com modificações aos resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de 169 a 174 da SEQ ID N°: 15.

Reações de mutagênese foram realizadas usando o kit QuickChange© (Stratagene), conforme as instruções do fabricante. Os clones de plasraídeo foram, transformados em células de cepa E. coli BL2l*DE3 e a expressão de proteínas foi induzida pela IPTG, conforme conhecido na especialidade. As proteínas foram purificadas por afinidade, vinculando-as a uma coluna de níquel (TALON Metal Affinity Resin, Clontech). A proteína nativa da GRG23(ace3) também foi expressada e purificada para ser usada como controle. Após a purificação de cada enzima, a concentração de proteína foi medida pelo experimento Bradford, conforme conhecido na especialidade.

Exemplo 10. Análise cinética das variantes da GRG23(ace3) As variantes da GRG23(ace3) GRG23(ace3) R173K (SEQ ID N°: 29, codificadas pela SEQ ID N°: 28), GRG23(ace3) G169V/L170V (SEQ ID N°: 31, codificadas pela SEQ ID N°: 30), GRG23(ace3) R173Q (SEQ ID N°: 33, codificadas pela SEQ ID N°: 32), e GRG23(ace3) I174V (SEQ ID N°: 35, codificadas pela SEQ ID N°: 34) foram caracterizadas pelos experimentos enzimáticos conforme aqui descritos, e comparadas com a enzima nativa da GRG23(ace3) . Por cada enzima, o Km(app) foi determinado em cada uma das várias concentrações de glifosato, e um gráfico de Km(app) versus concentração de glifosato foi usado para calcular o Ki para cada enzima. A termoestabilidade para cada enzima foi avaliada mediante incubação da enzima a 37°C por 16 horas, quantificando, logo, a atividade enzimática remanente (como Vmax) versus a enzima de controle incubada a 4°C. A análise cinética revela que a GRG23(ace3)R173K, a GRG23(ace3)R173Q, a GRG23(ace3)I174V e a GRG23(ace3)G169V/L170V são praticamente indistintas das GRG23(ace3) nativas e mostram taxas catalíticas quase idênticas, extremamente alta resistência ao glifosato e ótima afinidade com o PEP. O Km observado para PEP de 19DM da G169V/L170V (versus os 15μΜ da GRG23(ace3) podem reprentar uma afinidade vinculante ligeiramente mais baixa para o PEP com relação ao GRG23(ace3). Cada uma das quatro variantes exibiu uma termoestabilidade superior a 95% após 16 horas a 37°C. Os valores cinéticos determinados para as variantes da GRG23 Íace3) GRG23{ace3) R173K, GRG23(ace3) R173Q e GRG23(ace3) I174V se observam na Tabela 7.

Tabela 7. Cinêtica das variantes da GRG23(ace3) Exemplo li. Clonagem das variantes syngrg23 e qrg23 no cassete de expressão de uma planta Para o syngrg23 e cada uma das variantes do grg23 aqui descritas (incluindo, por exemplo, grg23(acel), grg23(ace2), grg23 (ace3) , grg23(ace4}, grg23 (ace3) RI 73K, grg23 (ace3) RI 73Q, grg23 (ac&3)II74V, grg23(acé3)G169V/L17OV e grg23(L5P2.J2)}, o quadro de leitura aberta (ORF) é amplificado por POR a partir de um modelo de dna de extensão completa. Os locais de restrição Hind III são adicionados a cada extremo dos ORFs durante a PCR, Além disso, a sequência de nucleotídeos ACC é adicionada imediatamente 5' ao códon de inicio do gene para aumentar a eficiência translacional (Kozak (1987) Wucleic Acids Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653). O produto da PCR é clonado e sequenciado usando técnicas reconhecidas na especialidade para garantir que nenhuma mutação seja inroduzida durante o PCR. 0 plasmídeo que contém o produto do PCR é digerido com Hind III e o fragmento que contém o ORF intacto é isolado. Esse fragmento é clonado no local Hind III de um plasmídeo como o pAX200, um vetor de expressão vegetal contendo o promotor da actina do arroz (McElroy et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231:150-160) e o terminador Pinll (An et al. (1989) The Plant Cell 1:115-122). O fragmento promotor -gene - terminador desse plasmídeo intermediário é então subclonado em um plasmídeo pSBll (Japan Tobacco, Inc.) para formar um plasmídeo final baseado em pSBll. Em alguns casos, é preferível gerar uma construção alternativa na qual uma sequência de cloroplasto líder é codificada como uma fusão ao N-terminus das construções syngrg23, grg23(acel), grg23 (ace2) , grg23 (ace3) , grg23 (ace4) , grg23 (L5P2.J2) , grg23 (ace3) R173K, grg23 (ace3) R173Q, grg23 (ace3) I174V ou grg23(ace3)G169V/L170. Esses plasmídeos baseados em pSBll estão geralmente organizados de forma tal que o fragmento de DNA que contém a construção promotor - gene - terminador, ou a construção promotor-cloroplasto líder-gene-terminador, possa ser extirpado via dupla digestão por enzimas de restrição, como as Kpn 1 e Pme I, e usados para transformação em plantas mediante injeção em feixe de aerosol. A estrutura dos clones resultantes baseados em pSBll é verificada por digestão de restrição e eletroforese em gel, bem como por sequenciar ao londo de várias junções de clones. O plasmídeo é mobilizado em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404, que também abriga o plasmideo pSBl (Japan Tobacco, Inc.), usando procedimentos de emparelhamento triparentais reconhecidos na especialidade, e plaqueando em meios que contenham espectinomicina. 0 clone de plasmideo baseado em pSBll possui resistência à espectinomicina mas é um plasmideo hospedeiro de faixa estreita e não pode replicar em Agrobacterium. Colônias resistentes à espectinomicina surgem quando os plasmideos baseados em pSBll se integram no plasmideo hospedeiro de faixa larga mediante recombinação homóloga. 0 produto cointegrado de plasmideos baseados em pSBl e pSBll é verificado pela hibridização Southern. A cepa Agrobacterium que abriga o cointegrado é usada para transformar milho com métodos conhecidos na especialidade, como, por exemplo, o método Purelntro (Japan Tobacco).

Exemplo 12._______Transformação das células vegetais via transformação mediada por Agrobacterium As orelhas de milho são melhores coletadas 8-12 dias após a polinação. Os embriões são isolados das orelhas, e aqueles embriões de 0,8-1,5 mm de tamanho são preferidos para serem utilizados na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo para cima em um meio de incubação adequado, como o meio DN62A5S (3.98 g/L N6 Sais; 1 mL/L (de lOOOx Stock) N6 Vitaminas; 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Myo-inositol; 1.4 g/L L-Prolina; 100 mg/L ácidos casamino; 50 g/L sacarose; 1 mL/L (of 1 mg/ml stock) 2,4-D). No entanto, meios e sais que não sejam o DN62A5S são adequados e conhecidos na especialidade. Os embriões são incubados durante a noite a 25°C no escuro. Porém, não é necessário per se incubar os embriões de uma noite para a outra.

Os explantes resultantes são transferidos a quadrados de malha (30-40 por placa), transferidos a um meio osmótico por cerca de 30-45 minutos, e logo transferidos a uma placa de transmissão (vide, por exemplo, Publicação PCT N°. WO/0138514 e Patente dos E.U.A. N° 5.240.842).

Construções de DNA concebidas para expressar as proteínas GRG da presente invenção em células vegetais são aceleradas no tecido da planta usando um acelerador de transmissão em aerosol, sob as condições essencialmente descritas na Publicação PCT No. WO/0138514. Após serem transmitidos, os embriões são incubados por cerca de 30 min em meios osmóticos, para logo serem colocados em meios de incubação durante toda a noite a 25°C no escuro. Para evitar danificar desnecessariamente os explantes transmitidos, eles são incubados por pelo menos 24 horas antes de serem transferidos a meios de recuperação. Posteriormente, os embriões são espalhados em meios periódicos de recuperação, por cerca de 5 dias, a 25°C no escuro, para logo serem transferidos aos meios de seleção. Os explantes são incubados em recuperação por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, os calos resultantes são transferidos aos meios de maturação do embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são logo colocados sob uma luz tênue, dando começo ao processo de regeneração por métodos conhecidos na especialidade. Os brotos resultantes podem se enraizar em meios de raizes e as plantas resultantes podem ser transferidas a vasos de viveiros e propagadas como plantas transgênicas.

Materiais Meios DN62A5S

Ajustar o pH da solução a pH 5,8 com IN K0H/1N KC1, acrescentar Gelrite (Sigma) a 3g/L e autoclave. Após resfriar a 50°C, adicionar 2 ml/L de um estoque de 5 mg/ml de solução de Silver Nitrate (Phytotechnology Labs). A receira rende cerca de 20 placas.

Exemplo 13. Transformação das enzimas da EPSP em células vegetais de milho através da transformação mediada por Aqrobacterium As orelhas são melhor coletadas em 8-12 dias após a polinação. Os embriões são isolados das orelhas, sendo que aqueles embriões com 0,8-1,5 mm de tamanho são preferidos para serem usados na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo para cima em meios de incubação adequados e incubados durante a noite a 25°C no escuro.

Porém, não é necessário per se incubar os embriões de uma noite para a outra. Os embriões são postos em contato com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores apropriados que contêm uma enzima EPSP sintase da presente invenção para transferência de plasmídeos Ti mediadas por transferência por cerca de 5-10 min, e logo plaqueadas em meios de co-cultivo por cerca de 3 dias (a 25°C no escuro). Após a co-cultivo, os explantes são transferidos a meios periódicos de recuperação por cerca de cinco dias (a 25°C no escuro) . Os explantes são incubados em meios de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, os calos resultantes são transferidos aos meios de maturação do embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são logo colocados sob uma luz tênue, dando começo ao processo de regeneração por métodos conhecidos na especialidade. Os brotos resultantes podem se enraizar em meios de raizes e as plantas resultantes podem ser transferidas a vasos de viveiros e propagadas como plantas transgênicas.

Todas as publicações e aplicações da patente mencionadas na especificação são indicativas do nível de habilidade daqueles que dominam a especialidade à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e aplicações da patente são aqui incorporadas como referência da mesma forma, como se cada publicação ou aplicação da patente individual estivesse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada como referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita com algum detalhe mediante ilustrações e exemplos, para fins de claridade de entendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações possam ser praticadas dentro do escopo das afirmações anexas.

Afiil V .

Claims (24)

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de ser selecionada de um grupo consistindo em uma molécula de ácido nucleico que contenha a sequência de nucleotideos da SEQ ID N°: 28 ou suas degenerações que codificam o mesmo polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 29.

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da dita sequência de nucleotideo ser uma sequência sintética que tenha sido desenhada para a expressão em uma planta.

3. Vetor, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo heterólogo.

5. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de conter o vetor como definido na reivindicação 3, em que a referida célula não é uma célula vegetal, nem animal.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5 caracterizada pelo fato de ser uma célula hospedeira bacteriana.

7. Método para obter uma célula vegetal transformada, UCL.L CLU CLUU ptilü IdLU Utí ; a) transformar uma célula vegetal com o vetor como definido na reivindicação 3; b) cultivar a referida célula vegetal sob condições de crescimento de célula vegetal em cultura.

8. Método para obter uma planta transgênica caracterizado por compreender o método como definido na reivindicação 7 e a etapa adicional de: c) regenerar uma planta transgênica.

9. Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a dita planta ser selecionada de um grupo que consiste de milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, cruciferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza.

10. Polipeptideo recombinante caracterizado por ser selecionado de um grupo que consiste em um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 29.

11. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma sequência de aminoácidos heteróloga.

12. Método para produzir um polipeptideo com atividade de resistência a herbicidas caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira compreendendo o vetor como definido na reivindicação 3 sob condições nas quais é expressa uma molécula de ácido nucleico que codifica o poxxpeptxaeo, aenuu u itjLeiiuu po±ipepi.iueu Beieuiunciuu de um grupo consistindo em um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 29.

13. Método para conferir resistência a um herbicida em uma planta caracterizado pelo fato do dito método compreender transformar a dita planta com uma construção de DNA, onde a dita construção inclui um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal, operacionalmente ligado com uma sequência de nucleotideos selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID N°: 28 ou suas degenerações que codificam o mesmo polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 29, e regenerar uma planta transformada.

14. Método de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo fato do dito herbicida ser o glifosato.

15. Método para obter uma planta transformada, caracterizado por compreender as etapas de: a)transformar uma célula vegetal com uma construção de DNA compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína com atividade de resistência a herbicida, onde a dita sequência de nucleotideos é selecionada de um grupo que consiste em uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotideos de SEQ ID N°: 28 e suas degenerações que codificam o mesmo polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 29; unue and sequencid ue nucieuLiueus e upeidciundimeiiLe ligada a um promotor que dirige a expressão de uma sequência codificante em uma célula vegetal. b) cultivar a referida célula vegetal sob condições de crescimento de célula vegetal em cultura; e c) regenerar uma planta transformada.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato da dita planta ser uma planta de so j a.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato da dita planta ser uma planta de milho.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato da dita planta ser selecionada de um grupo que consiste de milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, cruciferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza.

19. Método para aumentar o vigor ou rendimento de uma planta caracterizado pelo fato de incluir: a) fornecer uma planta compreendendo a sequência de nucleotideos apresentada em SEQ ID N°: 28 ou degenerações da mesma que codificam o mesmo polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 29; b) colocar a dita planta em contato com uma concentração eficaz de glifosato; e, c; cuiLivdr a aitd pidntd soo cunaigoes oriae d. temperatura é maior do que a temperatura ambiente por pelo menos duas horas consecutivas por dia, por pelo menos quatro dias após o contato com o dito glifosato, em que os referidos dias após o contato estão dentro da temporada de cultivo da planta, onde o vigor ou rendimento da dita planta é maior do que o vigor ou rendimento de uma planta que expressa uma EPSP sintase de tolerância a glifosato, cuja temperatura ótima não é maior do que a temperatura ambiente.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de a temperatura da etapa (c) ser de cerca de 32°C a cerca de 60°C.

21. Método para conferir resistência ao glifosato em uma planta caracterizado por incluir: a) fornecer uma planta compreendendo a sequência de nucleotideos apresentada em SEQ ID N°: 28 ou degenerações da mesma que codificam o mesmo polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 29; b) colocar a dita planta em contato com uma concentração eficaz de glifosato; e, c) cultivar a dita planta sob condições onde a temperatura é maior do que a temperatura ambiente por pelo menos duas horas consecutivas por dia, por pelo menos quatro dias após o contato com o dito glifosato, em que os referidos dias após o contato estão dentro da temporada de cultivo da planta.

22. Método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato de a temperatura na etapa (c) ser de cerca de 32°C a cerca de 60°C.

23. Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado pelo fato de a temperatura na etapa (b) ser de cerca de 37°C.

24. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência nucleotidica estar operacionalmente ligada a um promotor capaz de conduzir a expressão de uma sequência codificante em uma célula vegetal.