BRPI0719443A2

BRPI0719443A2 - Imunógeno neutralizador (nimiv) de rinovírus eseu uso para aplicações de vacina

Info

Publication number: BRPI0719443A2
Application number: BRPI0719443-9A2A
Authority: BR
Inventors: Kirill Kalnin; Yanhua Yan; Harold Kleanthous
Original assignee: Sanofi Pasteur Biologics Co
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2013-12-10
Also published as: CA2664628C; CN101678095A; WO2008057158A3; EP2066343A4; IL197755A; US9381237B2; AU2007318206A1; EP2066343B1; IL197755A0; AU2007318206A2; MX2009003301A; ZA200901993B; EP2548573A1; CN101678095B; WO2008057158A9; US20100297169A1; KR20090092764A; EP2066343A2; WO2008057158A2; CA2664628A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IMUNÓGENO NEUTRALIZADOR (NIMIV) DE RINOVÍRUS E SEU USO PARA APLICA- ÇÕES DE VACINA".

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A invenção refere-se a métodos e composições para a preven-

ção ou tratamento de infecções por rinovírus humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Rinovírus humanos (HRVs) representam os agentes etiológicos mais importantes do resfriado comum (Arruda et ai, J. Clin. Microbioi 35:2864-2868 (1997); Couch, "Rhinoviruses." em: Fields1 B.N., Knipe, D.M. (Eds.), Virology. Raven Press, New York, 607-629 (1990); Turner, Antivir. Res. 49(1): 1-14 (2001)). HRVs que causam cerca de um terço dos surtos de resfriados comuns são representados por cerca de 100 sorotipos, e os soros convalescentes de pacientes infectados com eles não têm uma neutraliza- ção cruzada completa. Embora a doença do trato respiratório superior indu- zida por HRV seja frequentemente leve a auto-limitada, o impacto socioeco- nômico causado por faltas ao trabalho ou à escola é enorme, e o grau de uso impróprio de antibióticos é significativo. Estima-se que a doença do trato respiratório superior represente pelo menos 25 milhões de faltas ao trabalho e 23 milhões de faltas à escola anualmente nos Estados Unidos (Anzueto et al., Chest 123(5): 1664-1672 (2003); Rotbart, Antivir. Res. 53:83-98 (2002)).

Há cada vez mais provas de uma relação entre infecção por HRV e complicações médicas mais graves. Por exemplo, resfriados induzi- dos por HRV são importantes fatores predisponentes à otite média aguda e 25 sinusite e são importantes fatores na indução de exacerbações da asma em adultos e crianças. Infecções por HRV também estão associadas a síndro- mes do trato respiratório inferior em indivíduos com fibrose cística, bronquite e outros transtornos respiratórios subjacentes (Gern, Pediatr. Infect. Dis. J. 23:S78-S86 (2004); Anzueto et ai, Chest 123(5): 1664-1672 (2003); Gern et 30 ai., Clin. Microbiol. Rev. 12(1):9-18 (1999); Pitkaranta et ai, J. Clin. Microbi- oi 35:1791-1793 (1997); Pitkaranta et al., Pediatrics 102:291-295 (1998); Rotbart, Antivir. Res. 53:83-98 (2002)). Até agora, nenhuma terapia antiviral eficaz foi aprovada para a prevenção ou tratamento de doenças causadas por infecção por HRV. As- sim, há uma necessidade médica não atendida significativa de se encontra- rem agentes que possam prevenir a infecção por HRV, encurtar a duração 5 da doença induzida por HRV, reduzir a gravidade dos sintomas, minimizar infecções bacterianas secundárias e exacerbações da doença subjacente e reduzir a transmissão de vírus. Uma vacina profilática contra HRV deve ser protetora contra uma ampla variedade de sorotipos para reduzir o número de infecções por HRV e seu impacto clínico.

Tentativas de preparar vacinas contra HRV baseadas em peptí-

dios sintéticos correspondentes a regiões conservadas apenas de proteínas estruturais (McCray et al., Nature 329:736-738 (1987)) ou como parte de fusões biológicas (Brown et al., Vaccine 9:595-601 (1991); Francis et al., Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A. 87:2545-2549 (1990)) tiveram sucesso limitado 15 devido à baixa imunogenicidade dos peptídios escolhidos, o que pode ser parcialmente explicado por sua baixa exposição na superfície do vírus (a- cesso limitado a anticorpos) ou restrições conformacionais.

A presente invenção supera essas limitações e apresenta uma vacina que gera uma resposta protetora de anticorpo neutralizador de rea- ção cruzada com sorotipo para prevenir e tratar infecções por HRV. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção apresenta peptídios imunogênicos neutralizadores IV (NimIV) de rinovírus. Esses peptídios pode ser de qualquer sorotipo de rino- vírus, como rinovírus humano (por exemplo, HRV14). Os peptídios podem 25 incluir, por exemplo, os aminoácidos 277 - 283 (por exemplo, os aminoáci- dos 275 - 285) da região terminal carboxila da proteína estrutural viral 1 (VP1) de um rinovírus humano. Seqüências exemplificativas incluem as se- guintes: PVIKKR1 PVIKKRK (HRV14), PVIKKRE (HRV6 e HRV72), PVIK- KRS (HRV92), PVIEKRT (HRV83), PKIIKKR (HRV86), PVIKRRE (HRV35), 30 PIIAKRE (HRV79), TIIKKRT (HRV3), NTEPVIKKRKGDIKSY (HRV14), e A- X1-X2-I-Xa-X4-R-Xs-B, em que X1 = P ou T; X2 = V, K, ou I; X3 = K, E, I, ou A; X4 = K ou R; X5 = S, E, D, T, R, T, ou K; A = 0 -10 aminoácidos adicionais; e

2 B = O-IO aminoácidos adicionais.

A invenção também inclui moléculas de ácidos nucléicos isola- das que codifiquem peptídios NimIV ou seus complementos. Além disso, a invenção inclui vetores (por exemplo, vetores HRV14) que incluem os peptí- dos e moléculas de ácidos nucléicos da invenção. Os vetores podem ser, por exemplo, vetores de rinovírus humano, por exemplo, vetores de rinovírus humano de um sorotipo diferente do rinovírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado. Em um exemplo, o peptídio NimIV ou molécula de ácido nucléico está presente no dito vetor de rinovírus humano no lugar de se- quências de NimIV originalmente presentes no dito vetor. Em outros exem- plos, o rinovírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado é o rinovírus humano 6 (HRV6) ou rinovírus humano 72 (HRV72). Esses últimos peptídios podem ser incluídos, por exemplo, em um vetor de rinovírus humano 14 (HRV14). Em outros exemplos, a protéina VP1 ou molécula de ácido nucléi- co do vetor é substituída pela proteína VP1 ou ácido nucléico do rinovírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado. Em exemplos adicionais, o vetor inclue um rinovírus humano inativado, ao qual o peptídio NimIV é reti- culado, ou uma seqüência de núcleo de hepatite B à qual se fusionam se- qüências de NimIV (veja, por exemplo, Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004; WO 2005/055957; US 2003/0138769 Al; US 2004/0146524A1; US 2007/0036826 A1).

A invenção também inclui composições farmacêuticas incluindo os peptídios, moléculas de ácidos nucléicos e vetores aqui descritos. Opcio- nalmente, as composições farmacêuticas também incluem um ou mais de 25 diluentes, excipientes, veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitá- veis. Adjuvantes exemplificativos incluem micropartículas de quitina e com- postos de alumínio. Além disso, as composições podem opcionalmente in- cluir um ou mais imunógenos neutralizadores de rinovírus humano adicio- nais.

Também estão incluídos na invenção métodos de indução de

uma resposta imune a um rinovírus em um sujeito. Esses métodos envolvem a administração ao sujeito de um peptídio de NimIV isolado ou molécula de

3 ácido nucléico. Em alguns exemplos, o sujeito não tem, mas apresenta risco de desenvolver, uma infecção por rinovírus. Em outros exemplos, o sujeito tem uma infecção por rinovírus.

Definições

"Administração" ou "administrar" significa um método de forne-

cer uma dosagem de uma composição da invenção a um mamífero (por e- xemplo, um ser humano), em que o método é, por exemplo, intranasal, tópi- co, sistêmico, por inalação, oral, intravenoso, subcutâneo, intravascular, in- tra-arterial, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, nasal, 10 retal, intraescleral, oftálmica, intraocular ou intramuscular. O método de ad- ministração preferido pode variar dependendo de vários fatores, por exem- plo, os componentes da composição farmacêutica, sítio de doença potencial ou real (por exemplo, a localização de um tumor ou condição vascular a ser tratada) e a gravidade da doença.

"Rinovírus humano" (HRV) significa qualquer membro da família

Picornaviridae gênero Rhinovirus. O HRV pode ser classificado por sorotipo, do qual se conhece a existência de aproximadamente 100. Por exemplo, HRV14, HRV6, HRV37 e HRV92 se referem a rinovírus humanos dos soroti- pos números 14, 6, 37 e 92, respectivamente.

"Veículo farmaceuticamente aceitável" signfica um veículo que

seja fisiologicamente aceitável para um mamífero tratado, mantendo, ao mesmo tempo, as propriedades profiláticas ou terapêuticas do composto com o qual é administrado. Um veículo farmaceuticamente aceitável exem- plificativo é a solução salina fisiológica. Outros veículos fisiologicamente a- 25 ceitáveis e suas formulações são conhecidos por aqueles versados na téc- nica, e seus exemplos são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharma- ceuticai Sciences, (18a edição), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, aqui incorporado por referência.

"Imunógeno neutralizador" (Nim) significa uma seqüência de rinovírus humano (HRV) que, por introdução em um ser humano, gera anti- corpos neutralizadores anti-HRV. No caso de vacinas contra HRV recombi- nante conforme aqui descritas, o sorotipo de NimIV é colocado no sobrescri-

4 to para descrever especificamente a fonte do Nim (por exemplo, NimlVHRV6 se refere a uma seqüência de NimIV derivada do sorotipo HRV6).

Um "peptídio imunogênico neutralizador IV" ou "peptídio NimIV" é um peptídio com uma seqüência da região terminal carboxila (por exem- 5 pio, aminoácidos 274 - 289, usando HRV14 (NTEPVIKKRKGDIKSY) como uma referência; veja a Figura 12B) de uma proteína estrutural viral 1 (VP1) de rinovírus. Peptídios NimIV podem incluir as seqüências especificadas, seqüências de flanco adicionais ou apenas uma seqüência de núcleo con- servada, conforme descrito abaixo. Além disso, os peptídios podem estar 10 não modificados e, portanto, ser idênticos às seqüências de NimIV de ocor- rência natural, ou podem incluir uma ou mais substituições, deleções, inser- ções ou outras modificações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 substituições, deleções ou inserções), contanto que a imunogenicidade do peptídio seja substanci- almente mantida. Além disso, os peptídios NimIV podem compreender ami- noácidos L ou D ou suas misturas.

Exemplos de seqüências de peptídios NimIV que podem ser u- sadas na invenção são relacionadas abaixo. Os peptídios podem ter, por exemplo, 5 - 30, 8 - 25, 10 - 20, 14 - 19, 15 - 18 ou 16 - 17 aminoácidos de 20 comprimento. Os peptídios podem incluir uma seqüência de NimIV de nú- cleo e, opcionalmente, ser flanqueados por seqüências de NimIV adicionais ou seqüências de Iigante (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 amino- ácidos nas extremidades terminais amino e/ou carboxila). Exemplos de se- qüências de NimIV de núcleo incluem PVIKKR, PVIKKRK (HRV14), PVIK- 25 KRE (HRV6 e HRV72), PVIKKRS (HRV92), PVIEKRT (HRV83), PKIIKKR (HRV86), PVIKRRE (HRV35), PIIAKRE (HRV79), TIIKKRT (HRV3), TIVK- KRT (HRV3), TAIVTRP (HRV2), VAIRPRT (HRV16), TAIVRRN (HRV1A), NTEPVIKKRKGDIKSY (HRV14), assim como outras seqüências de HRV que se alinhem com essas seqüências (veja, por exemplo, a Figura 11). A 30 seqüência de núcleo pode ser definida, por exemplo, pela fórmula A-X1-X2-I- X3-X4-R-X5-B, em que X1 = P ou T; X2 = V, K, ou I; X3 = K, E, I, ou A; X4 = K ou R; X5 = S, E, D, T, R, T, ou K; A = 0 - 10 aminoácidos adicionais; e B = 0

5 - 10 aminoácidos adicionais. As seqüências de A e/ou B podem ser seqüên- cias de NimlV/VP1 de ocorrência natural, seqüências artificiais (por exem- plo, seqüências de ligante) ou suas misturas.

Uma "molécula de ácido nucléico imunogênica neutralizadora IV" ou "molécula de ácido nucléico de NimIV" é uma molécula de ácido nu- cléico que codifica um peptídio NimIV conforme aqui definido ou seu com- plemento.

Um peptídio NimIV ou molécula de ácido nucléico é "isolado" se não incluir seqüências de flanco com as quais seja contínuo no vírus de o- 10 corrência natural. Esses peptídios ou moléculas de ácido nucléico podem estar limitados, por exemplo, pela seqüência de comprimento total de VP1, a metade terminal carboxila de VP1, o quarto terminal carboxila de VP1 ou os 15-30 aminoácidos terminais carboxila de VP1, ou regiões correspondentes das seqüências de ácidos nucléicos (veja, por exemplo, Laine et al., J. Gen. 15 Virol. 87:129-138, 2006).

Um peptídio NimIV "consiste essencialmente em" uma seqüên- cia especificada se incluir apenas essa seqüência, assim como, possivel- mente, uma quantidade mínima de seqüências de flanco (por exemplo, 1 -

10, 2 - 9, 3 - 8, 4 - 7 ou 5 - 6 aminoácidos), nas extremidades terminais ami- no e/ou carboxila, que podem ser seqüências de ocorrência natural, se- qüências artificiais (por exemplo, ligantes), ou suas combinações. Essas se- qüências podem estar presentes no contexto de seqüências maiores (por exemplo, vírus heterólogos ou outras seqüências de vetor).

Uma molécula de ácido nucléico de NimIV "consiste essencial- 25 mente em" uma seqüência especificada se incluir apenas essa seqüência, assim como, possivelmente, uma quantidade mínima de seqüências de flan- co (por exemplo, 3 - 30, 6 - 27, 9 - 24, 12 - 21 ou 15 - 18 nucleotídeos), nas extremidades 5’ e/ou 3’, que podem ser seqüências de ocorrência natural, seqüências artificiais (por exemplo, ligantes), ou suas combinações. Essas 30 seqüências podem estar presentes no contexto de seqüências maiores (por exemplo, vírus heterólogos ou outras seqüências de vetor).

Outras características e vantagens da invenção ficarão claras

6 com a Descrição Detalhada, Desenhos e Reivindicações a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama da região estrutural do genoma de CR6 (painel inferior) e alinhamento de aminoácidos de seqüências de NimIV 5 de HRV6 e HRV14 (painel superior).

As Figuras 2A e 2B são gráficos mostrando os resultados de ensaios de neutralização de redução de placas de CR6 (uma quimera inclu- indo seqüências de HRV14, com exceção das seqüências de NimIV1 que são seqüências de HRV6; aqui também chamadas de CR6; a barra à direita 10 de cada par (verde)) e HRV14 (a barra à esquerda de cada par (marrom)) com anticorpos policlonais de porquinho-da-índia anti-HRV14 (Figura 2A) e anti-HRV6 (Figura 2B). 20K, 40K, 60K, 80K correspondem aos títulos de anticorpos 2 x 104, 4 x 104, 6 χ 104 e 8 x 104, respectivamente. As linhas tra- cejadas superior (verde) e inferior (marrom) indicam uma redução de 50% 15 do número de placas para HRV14 e HRV6, respectivamente.

As Figuras 3A - 3D são modelos tridimensionais de HRV14 e CR6. As Figuras 3A e 3B são modelos 3D de uma partícula viral de HRV14 projetada com base na estrutura cristalina conhecida (Che et al., J. Viroi 72:4610-4622 (1998)) usando o software Chimera 20 (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/). VP1, Vp2 e VP2 são mostradas nas co- res azul escuro, magenta e cinza, respectivamente. A partícula de HRV14 é apresentada como um modelo de enchimento espacial, em que Nims são codificadas por cor em sua superfície de Van-der-Vaals. Superfícies com arestas verde, azul e magenta representam Nimlll, NimIV, e Nimll1 respecti- 25 vãmente. O contato de NimIV com Nimlll é mostrado indo até K287. Deve- se notar que Niml nesse modelo está coberto por Fab17 específico para Niml mostrado em verde escuro.

As Figuras 3C e 3D são modelos 3D preparados usando-se Ac- celrys Discovery Studio v1.5.1 (Accelrys Software, Inc.). Figura 3C - Modelo de enchimento de Niml1 Nimll1 Nimlll e NimIV da partícula HRV14. Os resí- duos de aminoácidos de Nims são representados por superfícies sólidas de Van Der Vaals. Superfícies positiva e negativamente carregadas são mos-

7 tradas em azul e vermelho, respectivamente. Figura 3D - Comparação de modelos de enchimento espacial de vírus HRV14 e CR6 (Nimlll e NimIV são apenas mostrados). A estrutura de CR6 foi prevista com base na estrutura cristalina conhecida (veja acima) e emm informações da seqüência de prote- 5 ínas de CR6 (veja a Figura 1). Nota: contato íntimo de K287 positivamente carregado de NimIV de HRV14 com resíduos negativos de Nimlll, ao passo que, em CR6, devido à substituição de K287T, essa conexão é suprimida.

A Figura 4 mostra os resultados de neutralização de CR6 com soros de camundongo anti-HRV37, anti-HRV92 e anti-HRV6. A Figura 4A é 10 um alinhamento de NimIV para HRV14, HRV37, HRV6, e HRV92. Os ami- noácidos são numerados (abaixo) de acordo com um molde de HRV14. Re- giões idênticas são mostradas nos retângulos (azuis). A Figura 4B é uma série de gráficos mostrando os resultados de estudos de teste de neutraliza- ção de redução de placas (PRNT) de HRV14 (a barra à esquerda de cada 15 par; marrom) e CR6 (a barra à direita de cada par; verde) com anticorpos de camundongo anti-HRV37, anti-HRV92 e anti-HRV6 gerados contra os vírus purificados correspondentes. Títulos de neutralização de 50% são mostra- dos por linhas tracejadas nos gráficos ou numericamente (50% de NUT) no painel em caixas da figura, abaixo dos gráficos correspondentes.

A Figura 5 mostra dados experimentais com base em peptídios

sintéticos específicos para NimlVHRV6 e NimlVHRV14. A Figura 5A é um Wes- tern blot de peptídios H6 ligados a KLH (NimlVHRV6) e H14 (NimlVHRV14) de- tectados por anticorpos policlonais de porquinho-da-índia anti-HRV14 (GP14) e anti-HRV6 (GP6). A Figura 5B é um Western blot de peptídios H6 25 e H14 livres detectados com os mesmos anticorpos; pista (1) - marcador de peso de proteína, pista (2) - H6-KLH (A) ou H6 (B), pista (3) - H14-KLH (A) ou H14 (B). A Figura 5C é um gráfico mostrando os resultados da análise ELISA de H6 e H14 com GP6 e GP14.

A Figura 6 é um gráfico mostrando os resultados de estudos de teste de neutralização de redução de placas (PRNT) de HRV14 e HRV6 com soro de camundongo anti-HRV14-NimlVHRV6. Esses dados mostram imuno- dominância de NimlVHRV6 no fundo de capsídio de HRV14.

8 A Figura 7 é um gráfico mostrando os resultados de estudos de teste de neutralização de redução de placas (PRNT) de HRV14 e CR6, que mostra que um anticorpo monoclonal contra Nimlll (Mab5) neutralizava CR6 cerca de dez vezes menos que HRV14.

A Figura 8 é um gráfico mostrando os resultados de estudos de

teste de neutralização de redução de placas (PRNT) de HRV14 e CR6, que mostra que um anticorpo monoclonal contra Nimll (Mab16) neutralizava CR6 cerca de cinco vezes mais que HRV14.

A Figura 9 é um gráfico mostrando os resultados de estudos de teste de neutralização de redução de placas (PRNT) de HRV14 e CR6, que mostra que um anticorpo monoclonal contra Niml (Mab17) neutralizava CR6 cerca de 1,5 vez menos que HRV14.

A Figura 10 é uma tabela mostrando que Nim IV afeta Niml, Ni- mll, e Nimlll (50% de título de neutralização).

A Figura 11 mostra um alinhamento de seqüências de Nimlll e

NimIV, assim como a posição dessas seqüências nas proteínas estruturais de HRV.

A Figura 12A é um alinhamento de seqüências de VP1 de qui- meras CR6 e CR72. A Figura 12B é uma representação esquemática do genoma de HRV, com alinhamento de NimIVs de HRV6, HRV72 e HRV14.

A Figura 13 é um par de gráficos mostrando que NimIV confere ao recombinante quimérico as características de neutralização do sorotipo doador. A Figura 13A mostra os títulos de neutralização de CR72 (barras abertas) e HRV14 (barras pretas) com anticorpos GP72. A Figura 13B mos- 25 tra os títulos de neutralização de CR6 (barras abertas) e HRV14 (barras pre- tas) com anticorpos GP6. Nota: GP6 e GP72 = anticorpos policlonais de porquinho-da-índia (ATCC) contra HRV6 e HRV72, respectivamente.

A Figura 14 é uma tabela mostrando o efeito da substituição de NimIV sobre outros Nims de uma estrutura principal de HRV14 (Mabs Niml, II, Ill contra HRV14, CR6 e CR72 (neutralização)).

A Figura 15 é uma tabela mostrando os títulos de neutralização de 50% de antissoros de camundongo anti-CR6 e anti-CR72 contra HRV14,

9 HRV6, HRV72, CR6 e CR72.

DESCRIÇÃO DETALHADA PA INVENÇÃO

Em geral, a invenção se refere a um novo Iocus imunogênico do rinovírus humano (HRV) e a seu uso em vacinas para prevenir ou tratar in- fecções por HRV. A invenção se baseia em nossa descoberta de um novo imunógeno neutralizador de HRV (Nim), NimIV, que pode ser usado como uma vacina, Essa vacina, conforme descrita abaixo, compreende várias mo- dalidades. Essas incluem HRVs recombinantes únicos ou múltiplos apresen- tando antígenos NimIV heterólogos, peptídios NimIV sintéticos isoladamente ou no contexto de um vírus, proteína ou veículos quimicamente ligados e misturas de fusões biológicas ou químicas de peptídios NimIV de diversos sorotipos no contexto de veículos biológicos. Essas vacinas para HRV, que geram respostas imunes específicas para NimIV a uma ampla faixa de soro- tipos de HRV, são úteis tanto para tratamento profilático, quanto terapêutico de infecção por HRV. O antígeno NimIV, composições de vacina incluindo NimIV e métodos de uso dessas composições são adicionalmente descritos a seguir.

Imunógeno Neutralizador IV (NimIV)

Três Imunógenos Neutralizadores de superfície maiores (Niml, Nimll e Nimlll) de rinovírus (HRVs) geram respostas imunes neutralizadoras altamente específicas. Anticorpos específicos para Nim bloqueiam a fixação do vírus ao receptor celular (ICAM-1). A presente invenção se baseia na descoberta de um novo Nim (NimIV), que engloba um trecho de cerca de 17

- 25 aminoácidos na extremidade C-terminal da proteína estrutural VP1 e foi 25 identificado por experimentos de evolução molecular. Demonstrou-se que NimIV é intercambiável entre diferentes sorotipos de HRV. Por exemplo, quando NimIV de um HRV de sorotipo doador (por exemplo, HRV6 ou HRV72) é introduzido em um vírus hospedeiro de outro sorotipo (por exem- plo, HRV14), confere ao recombinante quimérico resultante as característi- 30 cas de neutralização do sorotipo doador, alterando significativamente as ca- racterísticas neutralizadoras do vírus hospedeiro. A incorporação de NimIV em vacinas para HRV recombinante resultará em respostas imunes de rea-

10 ção cruzada entre os sorotipos dirigidas contra uma ampla faixa de sorotipos de HRV.

Vacina para HRV recombinante utilizando antíqenos NimIV auiméricos

Uma características de uma vacina ideal para HRV é a capaci- dade de proteger um ser humano com risco de infecção por HRV de uma ampla faixa de sorotipos de HRV. As vacinas da presente invenção apresen- tam a capacidade de gerar respostas imunes protetoras e terapêuticas con- tra um grande número de sorotipos de HRV (por exemplo, a maioria dos ou, mais idealmente, todos os sorotipos de HRV) que causam doença em seres humanos. Isso pode ser realizado com o uso de múltiplas seqüências de NimIV em uma vacina, o que pode envolver, por exemplo, a adição de antí- genos NimIV de sorotipos doadores em um pequeno grupo de HRVs de so- rotipo hospedeiro. Conforme foi demonstrado abaixo, o antígeno NimIV transferido provoca fortes respostas de anticorpos neutralizadores que são específicas para o sorotipo. No contexto de vacinas quiméricas ou recombi- nantes, a combinação de um antígeno NimIV de primeiro sorotipo em um HRV hospdeiro de segundo sorotipo gera anticorpos neutralizadores contra ambos os sorotipos de HRV, ampliando, dessa forma, o benefício protetor ou terapêutico com relação a uma vacina não quimérica no Iocus NimIV. Por exemplo, a substituição de NimlVHRV14 (isto é, o antígeno NimIV em HRV sorotipo 14) de HRV14 por NimlVHRV6 fornece a vacina para HRV CR6 (adi- cionalmente discutida abaixo). Essa vacina induz a geração de anticorpos neutralizadores dirigidos tanto contra o sorotipo HRV14, quanto o HRV6. Em outro exemplo, a substituição de NimlVHRV14 de HRV14 por NimlVHRV72 for- nece a vacina para HRV CR72 (adicionalmente discutida abaixo). Essa va- cina gera anticorpos neutralizadores dirigidos tanto contra o sorotipo HRV14, quanto o HRV72. Uma mistura de HRVs recombinantes assim construídos, que compreende um grande número de antígenos NimIV de sorotipo doador e um número limitado de combinações de HRV de sorotipo hospedeiro, re- presenta uma vacina ideal para a prevenção ou tratamento de infecções por HRV.

Peptídios NimIV

11 Uma segunda modalidade da invenção é o uso de peptídios Ni- mlV sintéticos ou derivados naturalmente que correspondem à seqüência de aminoácidos do Iocus genético de NimIV. Exemplos desses peptídios são aqui apresentados em outros lugares (veja, por exemplo, o Sumário da In- 5 venção e os Exemplos Experimentais). A administração de uma mistura de peptídios, reunidos de uma ampla faixa de sorotipos de HRV, gera uma res- posta de anticorpos neutralizadores amplamente protetores para a preven- ção ou tratamento de infecções por HRV. A administração de uma mistura de peptídios NimIV pode ocorrer isolamente ou em combinação com adju- 10 vantes farmaceuticamente aceitáveis ou estimulantes do sistema imune (ve- ja abaixo).

Moléculas de fusão com NimIV

Outro aspecto da invenção é a fusão química ou biológica de antígenos NimIV a um veículo biológico para ser usado como uma vacina 15 para HRV. Nesse contexto, peptídios NimIV, derivados de sorotipos únicos ou múltiplos, são ligados a um veículo biológico adequado (por exemplo, um antígeno de núcleo de hepatite B) para melhorar a meia-vida de degrada- ção, penetração em e especificidade para tecidos, detecção ou imunogeni- cidade de peptídios NimIV. Misturas dessas moléculas de fusão com NimIV, 20 retiradas de muitos sorotipos de HRV, são, então, usadas para vacinar um ser humano para prevenir ou tratar infecções por HRV. Em outros exemplos, peptídios NimIV (que podem ser de muitos sorotipos diferentes) são ligados de maneira cruzada a veículos de HRV.

Administração e Dosagem A presente invenção também apresenta composições que inclu-

em quantidades profilática ou terapeuticamente eficazes de uma ou mais vacinas para rinovírus humano, conforme aqui descrito. As misturas de vaci- nas para HRV podem estar presentes na mesma composição farmacêutica (uma forma de dosagem única) ou em composições farmacêuticas separa- 30 das (formas de dosagem separadas), que são administradas concomitante- mente ou em diferentes momentos. As composições podem ser formuladas para uso em vários sistemas de distribuição de fármacos. Um ou mais exci-

12 pientes ou veículos fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos nas composições para uma formulação apropriada. Os vírus podem estar em forma Iiofilizada ou dissolvidos em uma solução ou tampão fisiologica- mente compatível, como solução salina ou água. Podem-se usar métodos 5 padronizados de preparação e formulação conforme descrito, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a edição), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA.

As composições se destinam à administração intranasal, paren- teral, tópica, oral ou local para tratamento profilático e/ou terapêutico. Tipi- camente, as composições são administradas por via intranasal (por exem- plo, por inalação de aerossol ou gotas nasais), parenteral (por exemplo, por injeção intramuscular, subcutânea ou intravenosa), ou por ingestão oral, ou por aplicação tópica ou injeção intra-articular. Vias adicionais de administra- ção incluem a administração intravascular, intra-arterial, intratumoral, intra- peritoneal, intraventricular, intraepidural, assim como oftálmica, intraescleral, intraorbital, retal ou tópica. A administração de liberação prolongada tam- bém é especificamente incluída na invenção, por meios como injeções de depósito ou implantes ou componentes erodíveis. Assim, a invenção apre- senta composições para administração mucosa ou parenteral, que incluem os agentes acima mencionados dissolvidos ou em suspensão em um veícu- lo aceitável, de preferência um veículo aquoso, por exemplo, água, água tamponada, solução salina, PBS e outros. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme requerido para se aproximar das condições fisiológicas, como agentes de ajuste e tamponamento de pH, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectan- tes, detergentes e outros. A invenção também apresenta composições para distribuição oral, que podem conter ingredientes inertes, como aglutinantes ou cargas para a formulação de um comprimido, uma cápsula e outros. A- lém disso, essa invenção apresenta composições para administração local, que podem conter ingredientes inertes, como solventes ou emulsificadores para a formulação de um creme, um ungento e outros.

Essas composições podem ser esterilizadas por técnicas de es-

13 terilização convencionais ou podem ser filtradas estéreis. As soluções aquo- sas resultantes podem ser embaladas para uso como estão ou liofilizadas, a preparação Iiofilizada sendo combinada com um veículo aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações está tipicamente entre 3 e 11, por 5 exemplo, entre 5 e 9, 6 e 8, ou 7 e 8, como de 7 a 7,5. As composições re- sultantes em forma sólida podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do agente ou agentes acima mencionados, como em uma embalagem lacrada de comprimidos ou cápsulas. As composições também podem incluir o(s) ingrediente(s) ativo(s) 10 em forma liofilizada, que é reconstituído para administração.

As composições contendo uma quantidade eficaz de vacina po- dem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações profiláticas, as composições podem ser administradas a um su- jeito (por exemplo, um sujeito humano) com maior suscetibilidade a infec- 15 ções por HRV. As composições da invenção são administradas ao sujeito (por exemplo, um ser humano) em uma quantidade suficiente para retardar, reduzir ou prevenir o início de doença clínica ou subclínica. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente (por exem- plo, um ser humano) já sofrendo de uma infecção por HRV em uma quanti- 20 dade suficiente para curar ou pelo menos interromper parcialmente os sin- tomas da condição e suas complicações. Uma quantidade adequada para atingir essa finalidade é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". A determinação de uma quantidade e regime de dosagem apropriados pode ser prontamente determinada por aqueles versados na técnica. Quantidades 25 eficazes para esse uso podem depender da gravidade da doença ou condi- ção e do peso e estado geral do paciente, mas, em geral, variam de cerca de 0,5 mg a cerca de 3.000 mg do agente ou agentes por dose por paciente. As vacinas podem ser administradas apenas uma vez ou em regimes de primeira vacinação/reforço. Regimes adequados para administração inicial e 30 administrações de reforço são tipificadas por uma administração inicial se- guida por doses repetidas a intervalos horários, diários, semanais ou men- sais por uma administração subsequente. A quantidade eficaz total de um

14 agente presente nas composições da invenção pode ser administrada a um mamífero como uma dose única, como um bolo ou por infusão durante um período de tempo relativamente curto, ou pode ser administrada usando-se um protocolo de tratamento fracionado, em que múltiplas doses são admi- 5 nistradas durante um período de tempo mais prolongado (por exemplo, uma dose a cada 4 - 6, 8 - 12, 14 - 16 ou 18 - 24 horas, ou a cada 2-4 dias, 1-2 semanas, uma vez por mês).

A quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes presentes nas composições da invenção e usados nos métodos desta in- venção aplicados a mamíferos (por exemplo, seres humanos) pode ser de- terminada por aqueles versados na técnica considerando-se diferenças indi- viduais de idade, peso, integridade do sistema imune e condições do mamí- fero. Os agentes da invenção são administrados a um sujeito (por exemplo, um mamífero, como um ser humano, camundongo, gado (por exemplo, bo- vino, ovino ou suíno), animais de estimação (por exemplo, gatos ou cães)) em uma quantidade eficaz, que é uma quantidade que produza um resulta- do desejável em um sujeito tratado (por exemplo, a prevenção de infecções por HRV em um indivíduo suscetível ou a redução dos sintomas em um indi- víduo infectado). Essas quantidades terapeuticamente eficazes podem ser determinadas empiricamente por aqueles versados na técnica.

As vacinas da invenção podem ser usadas em combinação com outras abordagens de vacinação, assim como outras abordagens de trata- mento (por exemplo, abordagens baseadas em pequenas moléculas). Por exemplo, os vírus podem ser administrados em combinação com outras va- 25 cinas recombinantes, incluindo antígenos iguais ou diferentes. Os métodos de combinação da invenção podem incluir a co-administração de vacinas da invenção com outras formas do antígeno. Alternativamente, as vacinas da presente invenção podem ser usadas em combinação com outras aborda- gens (como abordagens de subunidade ou HBc (HBc-M2e; Fiers et al., Virus 30 Res. 103:173-176, 2004; WO 2005/055957; US 2003/0138769 Al; US 2004/0146524A1; US 2007/0036826 A1)) em uma estratégia de primeira vacinação-reforço, com as vacinas da invenção ou as outras abordagens

15 sendo usadas como a primeira vacinação, seguida pelo uso da outra abor- dagem como o reforço ou vice-versa. Além disso, a invenção inclui estraté- gias de primeira vacinação-reforço empregando a vacina da presente inven- ção tanto como agente de primeira vacinação, quanto de reforço.

5 As vacinas da invenção podem ser administradas a sujeitos,

como mamíferos (por exemplo, sujeitos humanos) usando-se métodos pa- dronizados. No caso da administração intranasal, os vetores podem ser ad- ministrados na forma de gotas nasais ou por inalação de uma formulação em aerossol ou nebulizada.

Os vetores da invenção podem ser administrados a sujeitos,

como seres humanos, como vacinas vivas ou mortas. As vacinas vivas po- dem ser administradas por via intranasal usando-se métodos conhecidos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Grünberg et al., Am. J. Respir. Crit. Car. Med. 156:609-616, 1997). Quantidades e regimes de do- 15 sagem apropriados podem ser prontamente determinados por aqueles ver- sados na técnica. Como um exemplo, a faixa de dosagem pode ser de, por exemplo, 103 a 108 ufp por dose. A vacina pode ser vantajosamente admi- nistrada em uma única dose; entretanto, também se pode realizar um refor- ço, caso seja determinado como necessário por aqueles versados na técni- 20 ca. Quanto a vacinas inativadas, o vírus pode ser morto com, por exemplo, formalina ou tratamento com UV e administrado por via intranasal a cerca de 108 ufp por dose, opcionalmente com um adjuvante apropriado (por exem- plo, quitina ou LT mutante; veja acima). Nessas abordagens, pode ser van- tajoso administrar mais de uma dose (por exemplo, 2 - 3).

O tamanho do peptídio ou proteína que é incluída em uma vaci-

na da invenção pode variar em comprimento de, por exemplo, 3 - 1.000 a- minoácidos, por exemplo, 5 - 500, 10 - 100, 20 - 55, 25 - 45 ou 35 - 40 ami- noácidos, como pode ser determinado como apropriado por aqueles versa- dos na técnica. Assim, pepetídios na faixa de 7 - 25, 12 - 22 e 15 - 20 ami- 30 noácidos de comprimento podem ser usados na invenção. Além disso, os peptídios aqui citados podem incluir seqüências adicionais ou podem ser de comprimento reduzido, também conforme determinado como apropriado por

16 aqueles versados na técnica. Os peptídios aqui relacionados podem estar presentes nos vetores da invenção, conforme aqui mostrado, ou podem ser modificados, por exemplo, por substituição ou deleção de um ou mais ami- noácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos). A- lém disso, os peptídios podem estar presentes na vacina no contexto de peptídios maiores. Opcionalmente, peptídios como aqueles acima descritos e em outros locais aqui incluem seqüências adicionais nas extremidades terminais amino e/ou carboxila, quer essas seqüências estejam naturalmen- te associadas às seqüências do peptídio (isto é, as seqüências com as quais os peptídios são contíguos no genoma do vírus da influenza) ou não (por exemplo, seqüências de Iigante sintéticas). Os peptídios podem, portanto, incluir, por exemplo, 1 - 25, 2 - 20, 3 - 15, 4 - 10 ou 4 - 8 seqüências de ami- noácidos em uma ou em ambas as extremidades. Como um exemplo espe- cífico, o peptídio pode incluir 1 - 3 seqüências de Iigante nas extremidades terminais amino e/ou carboxila.

Adiuvantes

Para aplicações de vacina, podem ser usados adjuvantes que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os adjuvantes são sele- cionados com base na via de administração. No caso de administração in- 20 tranasal, pode-se usados micropartículas de quitina (CMP) (Asahi-Ozaki et ai, Microbes and Infection 8:2706-2714, 2006; Ozdemir et ai, Clinicai and Experimental Allergy 36:960-968, 2006; Strong et al., Clinicai and Experi- mental Allergy 32:1794-1800, 2002). Outros adjuvantes adequados para uso na administração pela via mucosa (por exemplo, vias intranasal ou oral) in- 25 cluem a toxina termolábil de E. coli (LT) ou seus derivados mutantes. No caso de vírus inativado, podem ser usados adjuvantes parenterais, incluin- do, por exemplo, compostos de alumínio (por exemplo, um composto de hi- dróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou hidroxifosfato de alumínio), for- mulações lipossomais, adjuvantes sintéticos como, por exemplo, QS21, mu- 30 ramil dipeptídio, monofosforil lipídio A ou polifosfazina. Além disso, genes que codifiquem citocinas que tenham atividades adjuvantes podem ser inse- ridos nos vetores. Assim, genes que codifiquem citocinas, como GM-CSF,

17 IL-2, IL-12, IL-13 ou IL-5, podem ser inseridos juntamente com genes de antígenos estranhos para produzir uma vacina que resulte em respostas i- munes intensificadas ou para modular a imunidade dirigindo-a mais especi- ficamente para respostas celulares, humorais ou mucosas. Alternativamen- 5 te, as citocinas podem ser distribuídas, simultânea ou seqüencialmente, se- paradas de um vírus de vacina recombinante por meios bem-conhecidos (por exemplo, inoculação direta, DNA nu, em um vetor viral, e outros). Exemplos Experimentais Identificação de NimIV 10 Descobriu-se um imunógeno neutralizador, NimIV, que engloba

uma seqüência não conservada de 17 - 25 aminoácidos de comprimento da terminação C da proteína estrutural viral 1 (VP1). Esse epítopo pode ser tro- cado entre sorotipos de HRV. Caso substituído, NimIV confere suas caracte- rísticas de neutralização ao HRV heterólogo. Demonstrou-se que peptídios 15 sintéticos correspondendo a NimIV são reconhecidos por anticorpos especí- ficos para o vírus em experimentos de ELISA e Western blot.

Duas quimeras viáveis, HRV14-NimIVhrv6 (CR6) e HRV14-

HRV79

NimIV (CR72), foram isoladas durante um experimento de evolução molecular (combinações aleatórias do gene de VP1) realizado conforme descrito abaixo. Conforme mostrado no alinhamento apresentado na Figura 12A, seqüências de VP1 de CR6 e CR72 incluíam várias substituições de

HR\/1 Λ

aminoácidos individuais, assim como substituições de NimIV em Niml- Vhrv6 e NimlVHRV72 em CR6 e CR72, respectivamente. O alinhamento de NimIVs (Figura 12B) mostrou que todos os vírus NimIV contêm domínio cen- 25 trai conservativo (PVIKKRK/E), ao passo que as regiões de flanco eram va- riáveis. De maneira interessante, demonstrou-se que os aminoácidos nas posições 279 e 282 eram completamente conservados ou similares em to- dos os sorotipos de HRV (RM2506). Demonstrou-se que as quimeras CR6 e CR72 eram fortemente neutralizadas com os anticorpos policlonais de por- 30 quinho-da-índia GP6 e GP72 (ATCC), ao passo que nenhum desses anti- corpos neutralizava o vírus de estrutura principal (HRV14; Figura 13). Tam- bém se demonstrou que anticorpos policlonais de camundongo derivados

18 contra HRV6 e HRV72 neutralizam CR6 e CR72 a um título 10 vezes menor do que GP6 ou GP72, evidenciando que determinantes de NimIV em CR6 e CR72 estão expostos na superfície e em conformação favorável para neu- tralizar a ligação de anticorpos. A conformação desses epítopos em quime- 5 ras corresponde, mais possivelmente, àquela em vírus do tipo selvagem. Combinações aleatórias de DNA como um método de isolamento da substi- tuição de NimIV

A descoberta de NimIV foi possível após a geração da quimera de HRV CR6 portadora da substituição de 18 aminoácidos da parte C- terminal de VP1 pela região de 17 aminoácidos correspondente de HRV6 (veja a Figura 1). Essa seqüência foi obtida por combinação aleatória de DNA (para uma revisão do método, veja Patten et ai, "Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines," Curr Opin Biotechnol 8:724-733 (1997); exemplos de uso incluem Zhang et al., "Broadly cross-reactive mimo- tope of hypervariable region 1 of hepatitis C virus derived from DNA shuffling and screened by phage display library," J Med Virol 71:511-517 (2003), Cas- tle, et ai, "Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene," Science 304:1151-1154 (2004), Pekrun et ai, "Evolution of a human immu- nodeficiency virus type 1 variant with enhanced replication in pig-tailed ma- caque cells by DNA shuffling," J Virol 76:2924-2935 (2002), Toth et al., "Im- provement of the movement and host range properties of a plant virus vector through DNA shuffling," Plant J 30:593-600 (2002), Kaper et ai, "DNA family shuffling of hyperthermostable beta-gIycosidases," Biochem J 368:461-470 (2002). Wang et ai, "Directed evolution of substrate-optimized GroEL/S cha- peronins," Cell 111:1027-1039 (2002), e Hurt et ai, "Highly specific zinc fin- ger proteins obtained by directed domain shuffling and cell-based selection," Proe Natl Acad Sci U.S.A 100:12271-12276 (2003)), seguida por clonagem desse fragmento de volta ao clone infeccioso de HRV14. Aproximadamente 100 seqüências de VP1 foram incluídas no experimento de combinação ale- atória de DNA (Ledford et ai, "VP1 sequencing of ali human rhinovirus se- rotypes: insights into genus phylogeny and susceptibility to antiviral capsid- binding compounds," J Virol 78:3663-3674 (2004)).

19 CR6 é neutralizado tanto por GP6. quanto por GP14

Demonstrou-se que a especificidade de neutralização da quime- ra CR6 é diferente do vetor de origem HRV14 (clone infeccioso pWR3.26). Além da neutralização detectada com Abs policlonais de porquinho-da-índia 5 específicos para HRV14 (GP14; Figura 2A), verificou-se a neutralização de CR6 com anticorpos de porquinho-da-índia específicos para HRV6 (GP6; Figura 2B), ao passo que o HRV14 de origem não é neutralizado com GP6 (Figura 2). Isso indica que o domínio C-terminal de HRV6 é imunogênico e neutralizador.

CR6 é fortemente neutralizado por mAbs específicos para Niml- e Nimll-, mas não para Nimlll

A presença de NimlVHRV6 em um fundo de HRV14 (CR6) altera a NA de outros Nims (HRV14). PRNTs com mAbs específicos para NimHRV14 revelou que a neutralização específica para Nimlll de CR6 estava diminuída 15 (~10 vezes; Figura 7), ao passo que a NA específica para Nimll estava au- mentada (5 vezes; Figura 8); a neutralização específica para Niml só foi li- geiramente afetada (1,5 vez; Figuras 9 e 16). Esses achados estão resumi- dos na Figura 10.

upwft HRV7P

Efeito de NimIV e_sobre a potência neutralizadora da estrutura

principal de Nims

Para estudar o efeito de substituições de NimIV sobre as carac- terísticas de neutralização da estrutura principal de Nims, usou-se um painel de anticorpos monoclonais de camundongo específicos para Nim de HRV14 contra CR6 e CR72 (Figura 14). A capacidade de neutralização de Niml de 25 ambas as quimeras foi apenas ligeiramente afetada, se o foi, ao passo que Nimll e Nimlll de CR6 demonstraram taxas de neutralização 5 vezes maio- res e 10 vezes maiores, respectivamente. Em contraste, a neutralização de- pendente de Nimlll de CR72 não foi afetada. Infelizmente, a neutralização de CR72 com anticorpos específicos para Nimll não foi estudada, devido a 30 limites de suprimento de anticorpos. Esses dados evidenciaram uma forte interação entre os domínios NimIV e Nimlll, o que era consistente com a cristalografia e dados de mutagênese anteriormente obtidos.

20 Modelagem de interações de NimIV com outros Nims em CR6 e HRV14

Esses resultados demonstram a importância de NimIV HRV6 para a integridade conformacional de CR6. A modelagem 3D realizada com base na estrutura cristalina conhecida (Che et al., "Antibody-mediated neu- tralization of human rhinovirus 14 explored by means of cryoelectron micros- copy and X-ray crystallography of virus-Fab complexes," J Virol 72:4610- 4622 (1998) revelou um contato íntimo de Nimlll com NimIV em HRV14, mas não em partículas de CR6 (Figura 3 B, D). Esse contato em HRV14 es- tava associado com a carga positiva de K287 de VP1, através da qual inte- ragia com resíduos negativamente carregados de Nimlll (Figura 3B, D). Em CR6, uma mutação em T 287 suprime essa conexão (Figura 3D). Interes- santemente, o efeito negativo da mutação em K287 sobre a neutralização específica para Nimlll foi anteriormente documentada (Sherry et al., "Use of monoclonal antibodies to identify four neutralization immunogens on a com- mon cold picornavirus, human rhinovirus," J Virol 57:246-257 1986)), mas os autores alegaram que a região C-terminal de VP1 não era um imunógeno neutralizador (Nim) devido à ausência de mutantes de escape para a neutra- lização com anticorpos monoclonais específicos para essa região. NimlVHRV6 em CR6 afeta apenas ligeiramente a neutralização específica para Niml, o que poderia ser parcialmente explicado pela maior distância desse epítopo com relação a NimIV (Figura 3C).

Uma característica única de CR6 é sua sensibilidade 5 vezes maior à neutralização específica para Nimll (Figura 14). Esse aumento não

uDwc HRY/14

poderia ser explicado pelo contato físico direto de NimIV e Nimll . A 25 modelagem 3D revelou a localização distante desses Nims na partícula viral (Figuras 3A-C). Mais provavelmente, esse fenômeno poderia ser explicado por alterações conformacionais em VP2, o que possivelmente tornou mais favorável a exposição à ligação por anticorpo monoclonal de Nimll na super- fície da partícula viral.

Perfil de neutralização cruzada de CR6

O alinhamento de NiitiIVhrv6 com NimIV de todos os 100 soroti- pos identificou suas duas correspondências mais próximas: extremidades C-

21 terminais de HRV37 e HRV92 (veja a Figura 4A). A análise revelou a presen- ça de três regiões dentro de NimIV: região conservativa (núcleo), consistindo em AA (P-V-l-K-K-R), e duas regiões a montante e a jusante do núcleo. O nú- cleo também foi detectado em NimIVs de 7 vírus intimamente relacionados 5 (HRV14, HRV72, HRV83, HRV86, HRV35, HRV79 e HRV3; veja a Figura 11). Deve-se notar que R282 se mostrou conservativa em todos os 100 sorotipos de HRV. Conforme mostrado na Figura 4A, 6 AA de regiões a jusante de Ni- miVHRV6 e NimlVHRV37 são quase idênticos (D/E-N-l-T-T-Y), ao passo que a seqüência correspondente de HRV92 é muito diferente (S-L-I-T-N-Y) deles. 10 As regiões a montante de NiitiIVhrv6 e NimlVHRV92 têm dois aminoácidos idên- ticos, ao passo que a região correspondente de NimlVHRV37 não expõe ne- nhuma similaridade aparente com NimlVHRV6 Essa diferença entre NimIVs proporcionou uma oportunidade para avaliar que parte do epítopo é importan- te para a neutralização do vírus CR6. Para estudar isso, foram gerados soros 15 convalescentes de camundongo contra todos os três sorotipos e os mesmos foram testados quanto à neutralização de CR6 (Figura 4B). A despeito da ex- tensa homologia entre as regiões a jusante de NimlVHRV6 e NimlVHRV37 anti- HRV37, os soros não revelaram nenhuma neutralização, confirmando a insig- nificância da região a jusante para a neutralização. Inversamente, soros anti- 20 HRV92 demonstraram NA apenas ligeiramente diminuída com relação a anti- HRV6. Nenhuma dessas três amostras de soro foi capaz de neutralizar HRV14. Esses resultados representam uma dissecção funcional de NimIV, fornecendo provas de uma maior atividade de neutralização cruzada de regi- ões a montante versus de núcleo e a jusante. Para responder à pergunta de 25 se o reconhecimento diferencial desses vírus por anticorpos de camundongo reflete sua interação real com seqüências específicas para NimIV, foram sin- terizados peptídios específicos para NimlVHRV14 e NimlVHRV6 e realizados en- saios Western e ELISA com o mesmo conjunto de anticorpos.

A imunorreatividade dos peptídios específicos para NimIV GP14 e GP6 diferencia entre peptídios específicos para sorotipo

Gp6 e GP14 reconhecem peptídios específicos para NimIV es- pecificamente homólogos em ensaios de Western blot (Figura 5A-B) e ELI-

22 SA (Figura 5C). As Figuras 5A e 5B representam resultados de Western blot com materiais ligados a KLH e peptídios livres, respectivamente. Devido ao elevado peso molecular de KLH (~3 x 105 kDa), as bandas de proteínas na Figura 5A aparecem borradas. A imunorreatividade de peptídios dados é 5 muito específica, pois nenhum sinal foi detectado com combinações heteró- Iogas de peptídio/anticorpo (GP6/NimIVhrv14 ou GP14/NimlVHRV6). Vestígios de sinais em combinações heterólogas em material ligado a KLH foram atri- buídas às características do KLH. Esses resultados são evidências da linea- ridade e alta especificidade de epítopos de NimIV na superfície de HRV6 e 10 HRV14, cujas amostras purificadas foram usadas para gerar GP6 e GP14, respectivamente. Nenhuma reatividade cruzada aparente entre esses peptí- dios foi testemunhada quanto à baixa imunogenicidade da parte de núcleo desses Nims. Se essa declaração não fosse verdadeira, uma alta imunorre- atividade cruzada seria observada neste experimento.

A alta especificidade de reconhecimento desses peptídios com

GP6 e GP14 também é confirmada por ELISA (Figura 5C). Uma menor reati- vidade de H14 com GP14, então de H6 com GP6 poderia indicar uma diferen- ça na apresentação do epítopo NimIV nas superfícies de partículas virais. Es- ses resultados são recíprocos aos dados de PRNT descritos na Figura 2. Em 20 ambos os experimentos, não foi identificada nenhuma reatividade cruzada aparente entre HRV14 e HRV6 ou seus peptídios específicos para NimIV. Estudos in vivo: Soro anti-CR6 neutraliza HRV6

Camundongos Blb/c fêmea de 11 - 12 semanas de idade foram imunizados três vezes (nos dias 1, 14 e 28) por via intraperitoneal com sus- 25 pensões de vírus (105 ufp/mL) misturados com adjuvante (hidróxido de alu- mínio), ou em branco (diluente), em um volume de 100 μί. Os camundon- gos foram sangrados terminalmente no dia 49. Para testar os níveis séricos de anticorpos, os camundongos foram sangrados antes da inoculação (linha basal) e nos dias 30 - 40 após a imunização pela via retro-orbital, sob anes- 30 tesia por inalação de isofluorano, ou pela via mandibular sem anestesia (vo- lume de no máximo 7,7 μί/g de peso corporal). O ensaio PRNT demonstrou neutralização específica de HRV6 com o soro reunido de 2 camundongos

23 (Figura 6). Também mostrou neutralização diminuída do vírus HRV14, o que apresenta provas de que NimlVHRV6 em CR6 é o epítopo imunodominante. Métodos

Peptídios e conjugados 5 Os oligopeptídios NimlVHRV6, NimlVHRV72 e NimlVHRV14, corres-

pondendo às extremidades C-terminais de regiões estruturais de HRV6 (CKNIVPVIKKRENITTY), HRV14 (CNTEPVIKKRKGDIKSY) e HRV72 (CNPKPVIKKREGDIKTY), respectivamente, foram preparados por síntese em fase sólida padrão pela Biosynthesis, Inc (Lewisville, TX). Parte dos ma- 10 teriais peptídicos foi conjugada a uma hemocianina de Concholepas concho- Iepas (KLH) com o uso do reticulador succinimidil-4-(p-maleimidofenil)- butirato (sMBS) e o agente redutor TCEP-HCI Tris cloridrato de (2- carboxietil) fosfina (TCEP HCL).

Cultura celular, propagação viral e reagentes Estoques de HRV sorotipos 6, 14, 35, 37, 72, 83, 86, 92 (ATCC)

foram amplificados a alto título por infecção successiva de células H1 HeLa alvo. As células HeLa (ATCC) foram mantidas em Meio Essencial Mínimo (Invitrogen) com 5% de soro bovino fetal (JRH Biosciences, KS) para propa- gação de rotina. As células foram mantidas sob condições de crescimento 20 subconfluente durante a passagem. Após 48 horas a 34°C, os vírus foram liberados pelas células por três ciclos de congelamento-descongelamento a -80 e 37°C. Os detritos celulares foram descartadas, ao passo que o sobre- nadante contendo vírus amplificados foi dividido em alíquotas e congelado a -80°C. Antissoros de porquinho-da-índia para HRV sorotipos 6, 14, 72, 92 e 25 37 foram obtidos na ATCC.

Bibliotecas virais por combinação aleatória do gene de VP1

Fragmentos de DNA de VP1 são amplificados por RT-PCR a partir do RNA de HRV sorotipos 6, 14, 35, 37, 72, 79, 83, 86 e 92. Para fins de clonagem adicional, sítios Avrll internos apresentados em genes de VP1 30 de HRV sorotipos 83, 86, 92 são removidos em virtude de PCR recombinan- te. Todos os fragmentos de PCR são reunidos e combinados aleatoriamen- te, seguido por clonagem em cDNA de vetor pWR3.26 modificado de

24 HRV14 (ATCC). Resumidamente, dois microgramas de fragmentos de PCR reunidos são tratados com DNase I (Amersham Pharmacia Biotech, Inc), e uma fração de fragmentos de DNA de 50 - 100 pb é purificada em gel e submetida a 15 - 25 ciclos de PCR sem iniciadores a 94°C 30 s, 50°C 1 min, 5 72°C 1 min, seguidos por 25 ciclos de PCR com iniciadores de clonagem a 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 1 min. A biblioteca de seqüências de VP1 com- binadas aleatoriamente amplificadas é clonada no plasmídio pWR3.26 modi- ficado nos sítios Xhol e Avrll. Para essa finalidade, cDNA de HRV14 clone pWR3.26 é modificado por inserção do sítio Xhol no sítio 5’ da seqüência de 10 VP1 (Figura 12). Os sítios Xhol e Avrll são incorporados em iniciadores de clonagem direta e reversa de VP1, respectivamente.

A biblioteca de DNA de plasmídio de combinação aleatória de VP1 é Iinearizada por digestão com Mlul e transcrita in vitro pelo kit de transcrição T7 (Epicentere, Inc). O RNA é transfectado em células Hl-Hela 15 (ATCC) by Iipofectina (Invitrogen, Inc). As células são colhidas após incuba- ção a 34°C durante 2 - 4 dias. As amostras de células são submetidas a três ciclos de congelamento-descongelamento, e o sobrenadante é usado para infectar uma monocamada de células Hl-Hela. A biblioteca de vírus é arma- zenada a -80°C.

Isolamento de vírus recombinantes HRV14-NimlV

A quimera HRV14-NimIVhrv6 (CR6) é purificada em placa a par- tir da biblioteca de vírus acima descrita. Para isolar outros recombinantes de HRV14-NimlVMRVX, RNA total da biblioteca de vírus é usado como um molde para 8 reações de RT-PCR diferentes, realizadas com 8 iniciadores reversos 25 específicos para sorotipo que se anelam às extremidades 3’ do gene de VP1. O mesmo iniciador direto complementar à região conservativa a mon- tante do gene de VP1 foi usado em todas essas reações. Os fragmentos de PCR resultantes são clonados de volta no plasmídio pWR3.26 conforme acima descrito para combinações aleatórias de VP1. Após transcrição e 30 transfecção em células H1 Hela, os vírus individuais são purificados em pla- ca e sequenciados.

Protocolos com animais

25 Camundongos Balb/c fêmea de 8 semanas de idade (10 ca- mundongos por grupo) são inoculados no dia 0, então, reforçados nos dias

14 e 28 por administração intraperitoneal de meio de cultura celular filtrado contendo -1,0 x 106 ufp por dose de (1) HRV14-NimlVHRV6,(2) HRV14- NimlVHRV72, (3) HRV14 de origem, ou em branco (sobrenadante de cultura) como um controle negativo, misturados com 100 pg de adjuvante (hidróxido de alumínio), em um volume de 500 pL.

NimlVHRV6 e NimlVHRV6, acoplado (ou não) a peptídios KLH, são usados para imunização de camundongos Balb/c fêmea de 8 semanas de 10 idade. Os camundongos são inoculados no dia 0 com 100 pL de 15 pg de peptídio ligado a KLH em Titermax Gold (emulsão a 1:1) pela via subcutâ- nea e reforçados duas vezes (no dia 36 e dia 49) por administração intrape- ritoneal de 15 pg de peptídios "livres" dissolvidos em 100 pL de PBS.

Os títulos de anticorpos específicos para NimIV nos soros são determinados por um ELISA estabelecido, realizado em placas de microtitu- lação revestidas com peptídios NimIV sintéticos correspondentes.

Teste de Neutralização de Redução de Placas (PRNT)

Aproximadamente 50 ufp do HRV estudado (em MEM completo + 5% de meio de cultura FBS) são misturadas com várias diluições de soro 20 de amostra, em um volume total de 300 pL e incubadas durante uma noite a 4°C. Cem microlitros de cada mistura são usados para infectar uma cavida- de de células H1 Hela em uma placa de cultura de tecido de 12 cavidades (semeada a 6 x 105 células HI-HeLa por cavidade e incubada durante uma noite em um incubador a 37°C). Após 1 h de incubação a 34°C, as células 25 são superpostas com 1 mL de agarose a 0,4% em MEM, 10% de FBS com Pen/Strep e incubadas a 34°C durante aproximadamente 3 dias. As mono- camadas são, então, fixadas com formaldeído (concentração final de 3,7%) e tingidas com violeta cristal a 1% em metanol a 70%.

ELISA

Placas de 96 cavidades são revestidas com 5 pg/mL de peptí-

dios específicos para NimIV ou vírus HRV14 purificado durante uma noite a 4°C. As placas são incubadas com antissoro em diferentes diluições durante

26 1 h a 37°C, seguido por conjugado IgG-AP de cabra anticamundongo a 1:1.000 (Southern Biotech, Inc) durante 1 hora a 37°C. As placas são reve- ladas em substrato de fosfatase alcalina conforme descrito pelo vendedor (Sigma, Inc).

5 Western blot

20 Mg de peptídio são carregados em gel de tris-glicina a 10% (Novex, Invitrogen, Inc). Após um curto período de operação de eletroforese, o peptídio é transferido para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Inc). A ligação não específica à membrana é conseguida por encharcamento em 10 solução de bloqueio (5% de leite desnatado em PBS/0,05% de Tween) du- rante 1 h à temperatura ambiente. As membranas são incubadas com anti- corpos policlonais de porquinho-da-índia anti-HRV6 ou anti-HRV14 (ATCC) a 1:1.000 em solução de bloqueio durante uma noite a 4°C. Após três lava- gens de 15 minutos em PBS/0,05% de Tween, as membranas são incuba- 15 das com anticorpo conjugado IgG-AP de cabra anti-camundongo (Southern Biotech) em solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. A membrana foi revelada em substrato AP (Sigma SIGMA FAST™ BCIP/NBT) durante 10 minutos.

Outras Modalidades

Todas as publicações, pedidos de patente e patentes mencio-

nadas neste relatório são aqui incorporadas por referência.

Várias modificações e variações do método e sistema da inven- ção descritos ficarão claros para aqueles versados na técnica, sem sair do âmbito e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita com 25 relação a modalidades desejadas específicas, deve-se entender que a in- venção, conforme reivindicada, não deve ser excessivamente limitada a es- sas modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos de realização da invenção descritos que são óbvias para aqueles versados nos campos de medicina, farmacologia ou campos relacionados devem ser in- 30 cluídas dentro do âmbito da invenção. O uso de formas singulares aqui, co- mo "um" e "o", não exclui a indicação da correspondente forma plural, a me- nos que o contexto indique o contrário.

27 LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Acambis Inc. et al.

<120> IMUNÓGENO NEUTRALIZADOR (NIMIV) DE RINOVÍRUS E SEU USO PARA A- PLICAÇÕES DE VACINA

<130> O 6132/113W02

<140> PCT/USO7/21053

<141> 2007-10-01

<150> US 60/848,451

<151> 2006-09-29

<160> 43

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 1

Pro Val He Lys Lys Arg

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 2

Pro Val He Lys Lys Arg Lys

í 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 3

Pro Val He Lys Lys Arg Glu

1 5

28 <210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 4

Pro Val He Lys Lys Arg Ser I 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 5

Pro Val Ile Glu Lys Arg Thr I 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 6 Pro Lys Ile Ile Lys Lys Arg I 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 7

Pro Val Ile Lys Arg Arg Glu I 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

29 <4 00> 8

Pro Ile Ile Ala Lys Arg Glu

I 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 9

Thr Ile Ile Lys Lys Arg Thr

I 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 10

Asn Thr Glu Pro Val Ile Lys Lys Arg Lys Gly Asp Ile Lys Ser Tyr

10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 11

Thr Ile Val Lys Lys Arg Thr

I 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 12

Thr Ala Ile Val Thr Arg Pro

I 5

<210> 13

30 <211> 7 <212> PRT <213> Rinovírus (Rinovírus humano) <4 00> 13 Val Ala Ile Arg Pro Arg Thr 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Rinovírus (Rinovírus humano) <4 00> 14 Thr Ala Ile Val Arg Arg Asn 1 5 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Rinovírus (Rinovírus humano) <4 00> 15 Cys Lys Asn Ile Val Pro Val Ile Lys Lys 1 5 10 Tyr 15

<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Rinovírus (Rinovírus humano) <4 00> 16 Cys Asn Thr Glu Pro Val Ile Lys Lys Arg Lys Gly Asp Ile Lys 1 5 10 15 Tyr <210> 17

31 <211> 17

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 17

Cys Asn Pro Lys Pro Val Ile Lys Lys Arg Glu Gly Asp Ile Lys Thr

10 15

Tyr

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 18

Lys Asn Lys Ile Val Pro Val Ile Lys Lys Arg Glu Asn Ile Thr Thr

I 5 10 15

Tyr

<210> 19

<400> 19 000

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 20

Gln Ala Ile Val Pro Val Ile Lys Lys Arg Ser Leu Ile Thr Asn Tyr 15 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 21

32 Met Ile Thr Pro Val Ile Lys Lys Arg Asp Asn Ile Thr Thr Tyr

10 15

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 22

Thr Gln Gly Leu Lys Asn Ala

I 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 23 Thr Ala Asn Arg Gln Asn Asp I 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 24

Thr Ala Asn Lys Gln Asn Gly

I 5

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 25

Gln Pro Asn Arg Gln Gly Glu

I 5

<210> 26 <211> 7

33 <212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 26

Ile Gln Gly Gln Lys Asn Glu

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 27

Asn Val Asn Lys Gln Asn Glu 1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 28

Val Ala Asn Gln Gln Asn Glu 1 5

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 29

Thr Ala Asn Gln Gln Asn Thr 1 5

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 30

His Ala Asp Arg Gln Asn Glu

34 I 5

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 31 Asn Ala Asn Arg Gln Asn Glu I 5

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 32

Asn Pro Lys Pro Val Ile Lys Lys Arg Glu Gly Asp Ile Lys Thr Tyr

I 5 10 15

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 33

Gln Asn Ile Lys Pro Val Ile Glu Lys Arg Thr Ser Ile Lys Gln Tyr 15 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 34

Asn Pro Pro Lys Ile Ile Lys Lys Arg Asp Thr Ile Asn Thr Tyr 15 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

35 <213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 35

Ser Ala Lys Pro Val Ile Lys Arg Arg Glu Gln Ile Thr Lys Tyr 15 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 36

Asp Ala Lys Pro Ile Ile Ala Lys Arg Glu Asn Ile Met Lys Tyr 15 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 37

Asp Ser Lys Thr Ile Ile Lys Lys Arg Thr Asn Ile Lys Thr Tyr 15 10 15

<210> 38

<211> 289

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 38

Gly Leu Gly Asp Glu Leu Glu Glu Val Ile Val Glu Lys Thr Lys Gln

1 5 10 15

Thr Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Pro Lys His Thr Gln Lys Val Pro

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Asn Glu Thr Gly Ala Thr Met Pro Val Leu Pro Ser

40 45

Asp Ser Ile Glu Thr Arg Thr Thr Tyr Met His Phe Asn Gly Ser Glu

50 55 60

Thr Asp Val Glu Cys Phe Leu Gly Arg Ala Ala Cys Val His Val Thr

36 65 70 75

Glu Ile Gln Asn Lys Asp Ala Thr Gly Ile Asp Asn His 85 90

Lys Leu Phe Asn Asp Trp Lys Ile Asn Leu Ser Ser Leu

100 105

Arg Lys Lys Leu Glu Leu Phe Thr Tyr Val Arg Phe Asp

115 120 125

Thr Ile Leu Ala Thr Ala Ser Gln Pro Asp Ser Ala Asn

130 135 140

Asn Leu Val Val Gln Ala Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala 145 150 155

Lys Glu Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln Ser Ala Ser Asn

165 170

Phe Phe Lys Val Gly Asp Thr Ser Arg Phe Ser Val Pro

180 185

Leu Ala Ser Ala Tyr Asn Cys Phe Tyr Asp Gly Tyr Ser 195 200 205

Ala Glu Thr Gln Tyr Gly Ile Thr Val Leu Asn His Met 210 215 220

Ala Phe Arg Ile Val Asn Glu His Asp Glu His Lys Thr

225 230 235

Ile Arg Val Tyr His Arg Ala Lys His Val Glu Ala Trp 245 250

Ala Pro Arg Ala Leu Pro Tyr Thr Ser Ile Gly Arg Thr

260 265

Lys Asn Thr Glu Pro Val Ile Lys Lys Arg Lys Gly Asp 275 280 285

Tyr

<210> 39

<211> 289

<212> PRT

80

Arg Glu Ala

95

Val Gln Leu 110

Ser Glu Tyr

Tyr Ser Ser

Pro Asn Pro 160

Pro Ser Val 175

Tyr Val Gly 190

His Asp Asp

Gly Ser Met

Leu Val Lys 240

Ile Pro Arg 255 Asn Tyr Pro 270

Ile Lys Ser

37 <213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 39

Gly Leu Gly Asp Glu Leu Glu Glu Val Ile Val Glu Lys Thr Lys Gln 15 10 15

Thr Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Pro Lys His Thr Gln Lys Val Pro 20 25 30

Ile Leu Thr Ala Asn Glu Thr Gly Ala Thr Met Pro Val Leu Pro Ser 35 40 45

Asp Ser Ile Glu Thr Arg Thr Thr Tyr Met His Phe Asn Gly Ser Glu 50 55 60

Thr Asp Val Glu Cys Phe Leu Gly Arg Ala Ala Cys Val His Val Thr 65 70 75 80

Glu Ile Gln Asn Lys Asp Ala Thr Gly Ile Asp Asn His Arg Glu Ala 85 90 95

Lys Leu Phe Asn Asp Trp Lys Ile Asn Leu Ser Ser Leu Val Gln Leu 100 105 110

Arg Lys Lys Leu Glu Leu Phe Thr Tyr Val Arg Phe Asp Ser Glu Tyr 115 120 125

Thr Ile Leu Ala Thr Ala Ser Gln Pro Asp Ser Ala Asn Tyr Ser Ser 130 135 140

Asn Leu Val Val Gln Ala Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Asn Pro 145 150 155 160

Val Glu Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln Ser Ala Ser Asn Pro Ser Val 165 170 175

Phe Phe Lys Val Gly Asp Thr Ser Arg Phe Ser Val Pro Tyr Val Gly 180 185 190

Leu Ala Ser Ala Tyr Asn Cys Phe Tyr Asp Gly Tyr Ser His Asp Asp 195 200 205

Glu Asp Thr Pro Tyr Gly Ile Thr Val Leu Asn His Met Gly Ser Met

210 215 220

Ala Phe Arg Ile Val Asn Asp His Asp Ala His Arg Thr Leu Val Lys 225 230 235 240

38 Ile Arg Val Tyr His Arg Ala Lys His Ile Glu Ala Trp Val Pro Arg 245 250 255

Ala Pro Arg Ala Leu Pro Tyr Thr Ser Ile Gly Arg Thr Asn Tyr Pro 260 265 270

Lys Asn Pro Lys Pro Val Ile Lys Lys Arg Glu Gly Asp Ile Lys Thr 275 280 285

Tyr

<210> 40

<211> 290

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<4 00> 40

Gly Leu Gly Asp Glu Leu Glu Glu Val Ile Val Glu Lys Thr Lys Gln

I 5 10 15

Thr Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Pro Lys His Thr Gln Lys Val Pro 20 25 30

Ile Leu Thr Ala Asn Glu Thr Gly Ala Thr Met Pro Val Leu Pro Ser 35 40 45

Asp Ser Ile Glu Thr Arg Thr Thr Tyr Met His Phe Asn Gly Ser Glu

50 55 60

Thr Asp Val Glu Cys Phe Leu Gly Arg Ala Ala Cys Val His Val Thr 65 70 75 80

Glu Ile Gln Asn Lys Asp Ala Thr Gly Ile Asp Asn His Arg Glu Ala

85 90 95

Lys Leu Phe Asn Asp Trp Lys Ile Asn Leu Ser Ser Leu Val Gln Leu 100 105 110

Arg Lys Lys Leu Glu Leu Phe Thr Tyr Val Arg Phe Asp Ser Glu Tyr 115 120 125

Thr Ile Leu Ala Thr Ala Ser Gln Pro Asp Ser Ala Asn Tyr Ser Ser 130 135 140

Asn Leu Val Val Gln Ala Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Asn Pro

39 145 150 155 160

Val Glu Trp Asn Asp Tyr Thr Trp Gln Ser Ala Ser Asn Pro Ser Val 165 170 175

Phe Phe Lys Val Gly Asp Thr Ala Arg Phe Ser Val Pro Phe Val Gly 180 185 190

Leu Ala Ser Ala Tyr Asn Cys Phe Tyr Asp Gly Tyr Ser His Asp Asp 195 200 205

Ala Glu Thr Gln Tyr Gly Ile Thr Val Leu Asn His Met Gly Ser Met 210 215 220

Ala Phe Arg Ile Val Asn Glu His Asp Glu His Lys Thr Leu Val Lys 225 230 235 240

Ile Arg Val Tyr His Arg Ala Lys His Val Glu Ala Trp Ile Pro Arg 245 250 255

Ala Pro Arg Ala Leu Pro Tyr Thr Ser Ile Gly Arg Thr Asn Tyr Pro

260 265 270

Lys Lys Asn Lys Ile Val Pro Val Ile Lys Lys Arg Glu Asn Ile Thr 275 280 285

Thr Tyr 290

<21 ο>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

41

27

PRT

Rinovírus (Rinovírus humano)

CARACTERISTICA_MISC

(I)..(10)

Xaa = gualquer aminoácido ou está ausente

CARACTERíSTICA_MISC

(II)..(11)

Xaa = Pro ou Thr

40 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (12) . . (12)

<223> Xaa = Vai, Lys, ou Ile <220>

<221> CARACTERÍ STI CA__MI SC

<222> (14)..(14)

<223> Xaa = Lys, Glu, Ile, ou Ala <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (15) .. (15)

<223> Xaa = Lys ou Arg <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (17) . . (17)

<223> Xaa = Ser, Glu, Asp, Thr, Arg, ou Lys <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC

<222> (18) . . (27)

<223> Xaa = any amino acid ou is absent

<400> 41

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Arg 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25

<210> 42

<211> 6

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1) . . (1)

<223> Xaa = Asp ou Glu

41 <4 00> 42

Xaa Asn Ile Thr Thr Tyr

I 5

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> Rinovírus (Rinovírus humano)

<400> 43

Ser Leu Ile Thr Asn Tyr

I 5

42

Claims

1. Peptídio imunogênico neutralizador IV (NimIV) de rinovírus isolado.

2. Peptídio, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídio NimIV é um peptídio NimIV de rinovírus humano 14 (HRV14).

3. Peptídio, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídio NimIV compreende os aminoácidos 277 - 283 da região terminal carboxila da proteína estrutural viral 1 (VP1) de um rinovírus humano.

4. Peptídio, de acordo com a reivindicação 3, em que o peptídio compreende os aminoácidos 275 - 285 da região terminal carboxila de VP1 de um rinovírus humano.

5. Peptídio, de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên- cia do dito peptídio compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em: PVIKKR (SEQ ID NO:1), PVIKKRK (HRV14; SEQ ID NO:2), PVIKKRE (HRV6 e HRV72; SEQ ID NO:3), PVIKKRS (HRV92; SEQ ID NO:4), PVIEKRT (HRV83; SEQ ID NO:5), PKIIKKR (HRV86; SEQ ID NO:6), PVIKRRE (HRV35; SEQ ID NO:7), PIIAKRE (HRV79; SEQ ID NO:8), TIIK- KRT (HRV3; SEQ ID NO:9), NTEPVIKKRKGDIKSY (HRV14; SEQ ID N0:10), e A-Xi-X2-I-X3-X4-R-Xs-B, em que X1 = P ou T; X2 = V, K, ou I; X3 = K, E, I, ou A; X4= K ou R; X5 = S, E, D, T, R, T, ou K; A = 0 -10 aminoácidos adicionais; e B = 0 -10 aminoácidos adicionais (SEQ ID NO:41).

6. Molécula de ácido nucléico isolada que codifica um peptídio NimIV ou seu complemento.

7. Vetor compreendendo um peptídio NimIV ou molécula de áci- do nucléico isolada.

8. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, em que o vetor é um vetor de rinovírus humano.

9. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, em que o vetor de rinovírus humano é de um sorotipo diferente daquele do rinovírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado.

10. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, em que o peptídio NimIV ou molécula de ácido nucléico está presente no dito vetor de rinovírus humano em lugar das seqüências de NimIV originalmente presentes no dito vetor.

11. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, em que o vetor de rinovírus humano é um vetor de rinovírus humano 14 (HRV14).

12. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, em que o rinovírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado é rinovírus humano 6 (HRV6) ou rinovírus humano 72 (HRV72).

13. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, em que o vetor de rinovírus humano é um vetor de rinovírus humano 14 (HRV14), e o dito rino- vírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado é rinovírus humano 6 (HRV6) ou rinovírus humano 72 (HRV72).

14. Vetor, de acordo com a reivindicação 10, em que a proteína VP1 ou molécula de ácido nucléico do dito vetor é substituída por uma pro- teína VP1 ou ácido nucléico do rinovírus humano do qual o peptídio NimIV é derivado.

15. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, em que o vetor compreende um rinovírus humano inativado, ao qual o peptídio NimIV é reti- culado.

16. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, em que o vetor compreende uma seqüência de núcleo de hepatite B à qual se fusionam seqüências de NimIV.

17. Composição farmacêutica compreendendo um peptídio co- mo definido na reivindicação 1 ou a molécula de ácido nucléico como defini- do na reivindicação 6.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, em que o peptídio está compreendido dentro de um vetor.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, compreendendo adicionalmente um ou mais de um diluente, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, em que o adjuvante é selecionado do grupo que consiste em uma mi- cropartícula de quitina e um composto de alumínio.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, compreendendo adicionalmente um ou mais imunógenos neutralizado- res de rinovírus humano adicionais.

22. Método de indução de uma resposta imune a um rinovírus em um sujeito, o método compreendendo a administração ao sujeito de um peptídio NimIV ou molécula de ácido nucléico isolada.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o sujeito não tem, mas está com risco de desenvolver, uma infecção por rinovírus.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o sujeito tem uma infecção por rinovírus.