BRPI0718978A2

BRPI0718978A2 - Composição de combustível, métodos para preparar a composição de combustível e para acionar um motor, e, veículo

Info

Publication number: BRPI0718978A2
Application number: BRPI0718978-8A
Authority: BR
Inventors: Neil Stephen Renninger; Jason A Ryder; Karl J Fisher
Original assignee: Amyris Biotechnologies Inc
Priority date: 2006-11-21
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2014-02-04
Also published as: US20100281845A1; US7942940B2; WO2008140492A3; CA2670307A1; EP2099883A4; AU2007353411A1; CA2670307C; EP2099883A2; WO2008140492A2; AU2007353411B2

Description

“COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL, MÉTODOS PARA PREPARAR A COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL E PARA ACIONAR UM MOTOR, E, VEÍCULO”

RELATÓRIO DESCRITIVO PEDIDOS RELACIONADOS ANTERIORES Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) de Pedidos de Patente Provisórios U.S. de Nos. 60/860.853, depositado aos 21 de Novembro de 2006, e 60/951,235, depositado aos 23 de Julho de 2007, todos os quais são aqui incorporados como referências em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO São aqui proporcionados, dentre outras coisas, composições de combustível de jato e métodos de preparação e uso das mesmas. Em algumas modalidades, as composições de combustível compreendem pelo menos um componente combustível pronta e eficientemente produzido, pelo menos em parte, de um microorganismo. Em certas modalidades, as composições de combustível aqui proporcionadas compreendem a componente combustível bioengenheirado. Em outras modalidades, as composições de combustível aqui proporcionadas compreendem carano, pinano, sabinano ou uma combinação dos mesmos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Biocombustível é geralmente um combustível derivado de biomassa, i.e., recentemente organismos vivos ou seus subprodutos metabólicos, tal como esterco de animais. Biocombustível é desejável porque é de uma fonte de energia renovável, diferentemente de outras fontes naturais tais como combustíveis de petróleo, de carvão e nuclear. Um biocombustível que é adequado para uso como combustível de jato ainda tem que ser introduzido. Portanto, há uma necessidade de biocombustíveis para motores a jato. A presente invenção proporciona tais biocombustíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO São aqui proporcionados, dentre outras coisas, composições de combustível compreendendo isoprenóides bicíclicos Ci0 de preparação e uso das mesmas. Estes compostos podem exibir um equilíbrio bom de propriedades físicas para preparar excelentes combustíveis de jato ou de míssil. Em certas modalidades, isoprenóides bicíclicos C10 são pronta e eficientemente produzidos, pelo menos em parte, de um microorganismo.

Em um aspecto, são aqui proporcionadas composições de combustível compreendendo (a) um isoprenóide bicíclico Ci0 em uma quantidade que é pelo menos 2% em volume, baseada no volume total da composição; e (b) um combustível baseado em petróleo em uma quantidade que é pelo menos 5% em volume, baseada no volume total da composição. Em algumas modalidades, a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de

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cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m .

Em outro aspecto, são aqui proporcionadas composições de combustível compreendendo (a) um isoprenóide bicíclico Ci0 em uma quantidade que é pelo menos 10% em volume, baseada no volume total da composição; e (b) querosene em uma quantidade que é pelo menos 40% em volume, baseada no volume total da composição. Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 840 kg/m . Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de congelamento menor do que -40°C.

Em outro aspecto, são aqui proporcionadas métodos de preparação de composições de combustível compreendendo as etapas de (a) contactar um material de partida isoprenóide C10 com hidrogênio na presença de um catalisador para formar um isoprenóide bicíclico Ci0; e (b) misturar o isoprenóide bicíclico Cj0 com um componente combustível para preparar a composição de combustível. Em certas modalidades, o material de partida isoprenóide Ci0 is careno, a-pineno, β-pineno, sabineno ou uma combinação dos mesmos.

Em outro aspecto, são aqui proporcionadas métodos de

preparação de composições de combustível de a açúcar simples compreendendo as etapas de (a) contactar uma célula capaz de preparar um material de partida isoprenóide Cio com o açúcar simples sob condições adequadas para preparar o material de partida isoprenóide Ci0; (b) converter o 10 material de partida isoprenóide C1O to um isoprenóide bicíclico C]0; e (c) misturar o isoprenóide bicíclico Cio com um componente combustível para preparar a composição de combustível. Em certas modalidades, o material de partida isoprenóide Cio is careno, α-pineno, P-pineno, sabineno ou uma combinação dos mesmos.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados veículos

compreendendo um motor de combustão interna; um tanque de combustível conectado no motor de combustão interna; e uma composição de combustível aqui mostrada no tanque de combustível, sendo que a composição de combustível é usada para acionar o motor de combustão interna. Em algumas modalidades, o motor de combustão interna é um motor a jato.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de acionar um motor compreendendo as etapas de comburir uma ou mais das composições de combustível aqui mostradas. Em certas modalidades, o motor é um motor a jato.

Em algumas modalidades, o isoprenóide bicíclico Ci0 nas

composições de combustível aqui mostradas é ou compreende carano, pinano, sabinano ou uma combinação dos mesmos.

Em certas modalidades, o combustível baseado em petróleo nas composições de combustível aqui mostradas é querosene, Jato A, Jato A- I, Jato B, ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, as composições de combustível aqui mostradas atendem à especificação ASTM D 1655 para Jato A, Jato A-I ou Jato B.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 é uma representação esquemática da via de

mevalonato ("MEV") para a produção de difosfato de isopentila ("IPP").

Figura 2 é uma representação esquemática de a via DXP para a produção de IPP e pirofosfato de dimetil-alila ("DMAPP"). Dxs é 1-desóxi-D- xiluíose-5-fosfato; Dxr é l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato-redutoisomerase 10 (também conhecida como IspC); IspD é 4-difosfo-citidil-2-C-metil-D- eritritol-sintase; IspE é 4-difosfo-citidil-2-C-metil-D-eritritol-sintase; IspF é 2C-metil-D-eritritol-2,4-ciclo-difosfato-sintase; IspG é l-hidróxi-2-metil-2- (E)-butenil-4-difosfato-sintase (IspG); e ispH é isopentil/dimetil-alil- difosfato-sintase.

Figura 3 é uma representação esquemática da conversão de

uma molécula de IPP e uma molécula de DMAPP em geranil-difosfato ("GPP"). Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, geranil-difosfato-sintase.

Figuras 4A-B mostra mapas de plasmídeos de expressão pAM408, pAM409, e pAM424.

Figuras 5A-E mostram mapas dos insertos de vetores pAM489, pAM491, pAM493, pAM495, e pAM497.

Figura 6 mostra mapas de plasmídeos de expressão pTrc99A- APS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-CS, e pTrc99A-SS.

Figura 7 mostra mapas de plasmídeos de expressão pRS425-

leu2d-APS, pRS425-leu2d-BPS, pRS425-leu2d-CS, e pRS425-Ieu2d-SS.

|0020] Figura 8 mostra os dados de teste ASTM D 1655 para certas modalidades das composições de combustível aqui mostradas.

Figura 9 mostra as curvas de destilação para um Jato A e certas misturas de jato A e AMJ-400.

DEFINIÇÕES

As especificações ASTM D 1655, publicadas por ASTM International, definem certas exigências de aceitação mínima para Jato A, Jato A-l,eJatoB.

"Composto bioengenheirado" refere-se a um composto preparado por uma célula hospedeira, incluindo qualquer microorganismo ou células archae, bacterianas, ou eucarióticas.

"Biocombustível" refere-se a qualquer combustível que é derivado de uma biomassa, i. e., recentemente organismos vivos ou seus subprodutos metabólicos, tal como esterco de vacas. Ié uma fonte renovável de energia, diferentemente de outras fontes naturais tais como combustíveis de petróleo, de carvão e nuclear.

"Carano" refere-se ao seguinte composto

"isoprenóide bicíclico Cio" refere-se a um composto

isoprenóide totalmente saturado consistindo de 10 átomos de carbono e que inclui dois grupos cíclicos. Em certas modalidades, o isoprenóide bicíclico Cio é selecionado do grupo consistindo de carano (i.e., 3,7,7-trimetil- biciclo[4.1.0]heptano; CAS No. 554-59-6), pinano (i.e., 2,6,6-trimetil- 20 biciclo[3.1.1]heptano; CAS No. 473-55-2), e sabinano (i.e., 4-metil-l-(l- metil-etil)-biciclo[3.1.0]hexano; CAS No. 471-12-5) e suas combinações.

"material de partida isoprenóide Cjo" refere-se a pirofosfato de geranila ("GPP") ou um composto que é capaz de ser derivado de GPP.

"Densidade" refere-se a uma medida de massa por volume em uma temperatura particular. O método geralmente aceito para medir a densidade de um combustível é ASTM Standard D 4052, que é aqui incorporado como referência.

"Teste Doutor" é para a detecção de mercaptanos em combustíveis baseados em petróleo tais como querosene e combustível de jato. Este teste também pode proporcionar informação sobre sulfeto de 5 hidrogênio e enxofre elementar que podem estar presentes nos combustíveis. O método geralmente aceito para medir o ponto de congelamento de um combustível é ASTM Standard D 4952, que é aqui incorporado como referência.

"Ponto de vaporização instantânea" refere-se à temperatura mais baixa na qual os vapores acima de um líquido inflamável ignizar-se-ão no ar sob aplicação de uma fonte de ignição. Geralmente, cada líquido inflamável tem uma pressão de vapor, que é uma função da temperatura do líquido. A medida que a temperatura aumenta, aumenta a pressão de vapor do líquido. A medida que a pressão de vapor aumenta, a concentração do líquido evaporado no ar aumenta. Na temperatura do ponto de vaporização instantânea, quantidade exatamente suficiente do líquido tem vaporizado para trazer o espaço de vapor-ar acima do líquido além do limite inferior de inflamabilidade. Por exemplo, o ponto de vaporização instantânea da gasolina é cerca de -43°C que é o porquê a gasolina é tão elevadamente inflamável. Por razões de segurança, é desejável ter pontos de vaporização instantânea muito mais altos para combustível que é contemplado para uso em motores a jato. Os métodos geralmente aceitos para medir o ponto de vaporização instantânea de um combustível são ASTM Standard D 56, ASTM Standard D 93, ASTM Standard D 3828-98, todos os quais são aqui incorporados como referências.

"Ponto de congelamento" refere-se à temperatura na qual o último cristal de parafina se funde, quando se aquece um combustível que tem sido previamente esfriado até formar cristais parafínicos. O método geralmente aceito para medir o ponto de congelamento de um combustível é ASTM Standard D 2386, que é aqui incorporado como referência.

"Combustível" refere-se a um ou mais hidrocarbonetos, um ou mais alcoóis, um ou mais ésteres graxos ou uma sua mistura. Preferivelmente, hidrocarbonetos líquidos são usados. Combustível pode ser usado para 5 acionar motores de combustão interna tais como motores recíprocos (e.g motores a gasolina e motores a diesel), motores de Wankel, motores a jato, alguns motores de foguete, motores de míssil e motores de turbina a gás. Em algumas modalidades, combustível tipicamente compreende uma mistura de hidrocarbonetos tais como alcanos, ciclo-alcanos e hidrocarbonetos 10 aromáticos. Em outras modalidades, o combustível compreende um isoprenóide bicíclico Ci0. Em ainda outras modalidades, combustível compreende carano, pinano, e sabinano quer individualmente quer como suas misturas.

"Aditivo de combustível" refere-se a um componente combustível tal como um componente químico adicionado em combustíveis para alterar as propriedades do combustível, e.g., para melhorar o desempenho do motor, manuseio de combustível, estabilidade de combustível, ou para controle de contaminante. Tipos de aditivos incluem, mas não são limitados a, antioxidantes, aperfeiçoadores de estabilidade térmica, aperfeiçoadores de cetano, estabilizadores, aperfeiçoadores de fluxo a frio, aperfeiçoadores de combustão, antiespumantes, aditivos de anti-névoa, inibidores de corrosão, aperfeiçoadores de lubricidade, inibidores de formação de gelo, aditivos de limpeza de injetor, supressores de fumaça, aditivos redutores de arrasto, desativadores de metal, dispersantes, detergentes, desemulsificadores, corantes, marcadores, dissipadores estáticos, biocidas e suas combinações. O termo "aditivos convencionais" refere-se aos aditivos de combustível conhecidos pelo técnico experiente, tais como aqueles descritos acima, e não incluem um isoprenóide bicíclico Ci0.

"Componente combustível" refere-se a qualquer composto ou uma mistura de compostos que são usados para formular a composição de combustível. Há "componentes combustíveis maiores" e "componentes combustíveis menores". Um componente combustível maior está presente na composição combustível em pelo menos 50% em volume; e um componente 5 combustível menor está presente na composição combustível em menor do que 50%. Aditivos de combustível são componentes combustíveis menores. Um isoprenóide bicíclico Ci0 pode ser um componente maior ou um componente menor, ou em uma mistura com outros componentes combustíveis.

"Composição de combustível" refere-se a um combustível que

compreende pelo menos dois componentes combustíveis.

"Isoprenóide" e "composto isoprenóide" são usados aqui intercambiavelmente e se referem a um composto derivável de difosfato de isopentila ("IPP").

"Combustível de jato" refere-se a um combustível adequado

para uso em um motor a jato.

"Querosene"refere-se a um destilado de fração específica de petróleo (também conhecido como "óleo cru"), geralmente entre cerca de 150°C e cerca de 2750C na pressão atmosférica. Óleos crus são compostos

primariamente de hidrocarbonetos das classes parafínica, naftênica, e aromática.

"Combustível de míssil" refere-se a um combustível adequado para uso em um motor de míssil.

"p-Cimeno" refere-se ao seguinte composto

)“0_

"Pinano" refere-se ao seguinte composto "Combustível baseado em petróleo" refere-se a um combustível que inclui um destilado de fração de petróleo.

"Sabinano" refere-se ao seguinte composto

"Ponto de fumaça" refere-se ao ponto no qual um combustível 5 ou uma composição de combustível é aquecido até ele se decompor e fumegar. O método geralmente aceito para medir o ponto de fumaça de um combustível é ASTM Standard D 1322, que é aqui incorporado como referência.

"Viscosidade" refere-se a uma medição da resistência de um combustível ou uma composição de combustível à deformação sob tensão cisalhante. O método geralmente aceito para medir o viscosidade de um combustível é ASTM Standard D 445, que é aqui incorporado como referência.

Como aqui usado, uma composição que é um composto "substancialmente puro" está substancialmente livre de um ou mais outros compostos, i.e., a composição contém mais do que 80% em volume, mais do que 90% em volume, mais do que 95% em volume, mais do que 96% em volume, mais do que 97% em volume, mais do que 98% em volume, mais do que 99% em volume, mais do que 99,5% em volume, mais do que 99,6% em volume, mais do que 99,7% em volume, mais do que 99,8% em volume, ou mais do que 99,9% em volume do composto; ou menos do que 20% em volume, menos do que 10% em volume, menos do que 5% em volume, menos do que 3% em volume, menos do que 1% em volume, menos do que 0,5% em volume, menos do que 0,1% em volume, ou menos do que 0,01% em volume de um ou mais outros compostos, baseado no volume total da composição. Como aqui usado, uma composição que está "substancialmente livre" de um composto significa que a composição contém menos do que menos do que 20% em volume, menos do que 10% em volume, menos do que 5% em volume, menos do que 4% em volume, menos do que 3% em volume, 5 menos do que 2% em volume, menos do que 1% em volume, menos do que

0,5% em volume, menos do que 0,1% em volume, ou menos do que 0,01% em volume do composto, baseado no volume total da composição.

Como aqui usado, o termo "estereoquimicamente pura" significa uma composição que compreende um estereoisômero de um composto e está substancialmente livre de outros estereoisômeros daquele composto. Por exemplo, uma composição estereomericamente pura de um composto tendo um centro quiral estará substancialmente livre do enantiômero oposto do composto. Uma composição estereomericamente pura de um composto tendo dois centros quirais estará substancialmente livre dos outros diastereômeros oposto do composto. Um composto estereomericamente puro típico compreende maior do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero do composto e menor do que cerca de 20% em peso de outros estereoisômeros do composto, mais preferivelmente maior do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero do composto e menor do que cerca de 10% em peso dos outros estereoisômeros do composto, ainda mais preferivelmente maior do que cerca de 95% em peso de um estereoisômero do composto e menor do que cerca de 5% em peso dos outros estereoisômeros do composto, e muito mais preferivelmente maior do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero do composto e menor do que cerca de 3% em peso dos outros estereoisômeros do composto.

Como aqui usado, o termo "enantiomericamente pura" significa uma composição estereomericamente pura de um composto tendo um centro quiral.

Como aqui usado, o termo "racêmico" ou "racemato" significa cerca de 50% de um enantiômero e cerca de 50% do enantiômero correspondente em relação a todos os centros quirais na molécula. A invenção inclui todas as misturas enantiomericamente puras, enantiomericamente enriquecidas, diastereomericamente puras, diastereomericamente enriquecidas, e racêmicas do compostos da invenção.

Em adição às definições acima, certos compostos aqui descritos têm uma ou mais ligações duplas que podem existir como o isômero quer Z quer E. Em certas modalidades, compostos aqui descritos estão presentes como isômeros individuais substancialmente livres de outros 10 isômeros e alternativamente, como misturas de vários isômeros, e.g., misturas racêmicas de estereoisômeros.

Na descrição seguinte, todos os números aqui mostrados são valores aproximados, a não ser que a expressão "cerca de" ou "aproximado" seja usada em conexão com os mesmos. Podem variar em 1 por cento, 2 por 15 cento, 5 por cento, ou, algumas vezes, 10 a 20 por cento. Sempre que uma faixa numérica com um limite inferior, RL e um limite superior, RU, é mostrada, qualquer número caindo dentro da faixa é especificamente mostrado. Em particular, os seguintes números dentro da faixa são especificamente mostrados: R=RL+k* (RU-RL), sendo que k é uma variável 20 variando de 1 por cento a 100 por cento com um incremento de 1 por cento,

i.e., k é 1 por cento, 2 por cento, 3 por cento, 4 por cento, 5 por cento.....50

por cento, 51 por cento, 52 por cento,..., 95 por cento, 96 por cento, 97 por cento, 98 por cento, 99 por cento, ou 100 por cento. Além disso, qualquer faixa numérica definida por dois números R como definida acima também é especificamente mostrada.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção proporciona uma composição combustível compreendendo:

(a) um isoprenóide bicíclico Ci0 em uma quantidade que é pelo menos 2% em volume, baseada no volume total da composição; e

(b) um combustível baseado em petróleo em uma quantidade que é pelo menos 5% em volume, baseada no volume total da composição,

sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C e a composição de

Λ

combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m3.

Em algumas modalidades, o isoprenóide bicíclico Cjo é carano. Em outras modalidades, o isoprenóide bicíclico Ci0 é pinano. Em ainda outras modalidades, o isoprenóide bicíclico Ci0 é sabinano. Em certas modalidades, o isoprenóide bicíclico Ci0 é uma mistura compreendendo dois ou mais de carano, pinano, e sabinano.

Em certas modalidades onde o isoprenóide bicíclico Cj0 é pinano, a composição de combustível compreende de cerca de 0% a cerca de 15 10% de um material contendo nafltaleno hidrogenado. Em certas outras modalidades, a composição de combustível não compreende um material contendo naftaleno hidrogenado material. Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de ebulição final que é menor do que ou igual a 300°C.

Cada um dos compostos isoprenóides nas composições de

combustível pode funcionar como um componente combustível que pode liberar energia quando quimicamente reage com um oxidante tal como oxigênio; ou um aditivo de combustível que pode alterar o desempenho ou as propriedades do componente combustível. Em algumas modalidades, o 25 composto isoprenóide está presente em uma quantidade de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em outras modalidades, the composto isoprenóide está presente em uma quantidade de no máximo cerca de 5%, no máximo cerca de 10%, no máximo cerca de 15%), no máximo cerca de 20%, no máximo cerca de 25%, no máximo cerca de 5 30%, no máximo cerca de 35%, no máximo cerca de 40%, no máximo cerca de 45%, no máximo cerca de 50%, no máximo cerca de 60%, no máximo cerca de 70%, no máximo cerca de 80%, ou no máximo cerca de 90%, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em outras modalidades, the composto isoprenóide está presente em uma quantidade de 10 cerca de 2% a cerca de 99%, de cerca de 2.5% a cerca de 95%, de cerca de 5% a cerca de 90%, de cerca de 7,5% a cerca de 85%, de cerca de 10% a cerca de 80%, de cerca de 15% a cerca de 80%, de cerca de 20% a cerca de 75%, ou de cerca de 25% a cerca de 75%, baseada no peso ou volume total da composição de combustível.

Em algumas modalidades, o composto isoprenóide Ci0 é

derivado de um material de partida isoprenóide Cio bioengenheirado. Em certas modalidades, o material de partida isoprenóide Ci0 bioengenheirado é preparado por células hospedeiras pela conversão de uma fonte de carbono no material de partida isoprenóide C]0.

Em outras modalidades, a fonte de carbono é um açúcar tal

como um monossacarídeo (açúcar simples), um dissacarídeo, ou uma ou mais suas combinações. Em certas modalidades, o açúcar é um açúcar simples capaz de suportar o crescimento de uma ou mais células aqui proporcionadas. O açúcar simples pode ser qualquer açúcar conhecido por aquelas pessoas 25 experientes na arte. Alguns exemplos não-limitantes de açúcares simples ou monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, ribose, e suas combinações. Alguns exemplos não-limitantes de dissacarídeos adequados incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose, e suas combinações. Em outras modalidades, a fonte de carbono é um polissacarídeo. Alguns exemplos não-limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogênio, celulose, quitina, e suas combinações.

Em ainda outras modalidades, a fonte de carbono é uma fonte de carbono não-fermentável. Alguns exemplos não-limitantes de fonte de carbono não-fermentável adequada incluem acetato e glicerol.

Em outras modalidades, a quantidade de o combustível baseado em petróleo nas composições de combustível aqui mostradas é pelo menos cerca de 20% e a quantidade de composto isoprenóide é de cerca de 5% a cerca de 75%, baseada no volume total da composição. Em certas modalidades, a quantidade de combustível baseado em petróleo é pelo menos 30% e a quantidade do composto isoprenóide é de cerca de 5% a cerca de 65%, baseada no volume total da composição. Em certas outras modalidades, a quantidade de combustível baseado em petróleo é pelo menos 40% e a quantidade de isoprenóide é de cerca de 5% a cerca de 50%, baseada no volume total da composição. Em certas outras modalidades, a quantidade de combustível baseado em petróleo é pelo menos 50% e a quantidade de isoprenóide é de cerca de 5% a cerca de 45%, baseada no volume total da composição.

Em algumas modalidades, o combustível baseado em petróleo é querosene. Querosene convencional geralmente é uma mistura de hidrocarbonetos, tendo um ponto de ebulição de cerca de 285°F a cerca de 610°F (i. e., de cerca de 140°C a cerca de 320°C).

Em outras modalidades, o combustível baseado em petróleo é um combustível de jato. Qualquer combustível de jato conhecido pelos técnicos experientes pode ser aqui usado. O American Society for Testing and Materials ("ASTM") e o United Kingdom Ministry of Defense ("MOD") têm desempenhado os papéis líder em definição e manutenção de especificação para combustível de turbina para aviação civil ou combustível de jato. As especificações respectivas publicadas por estas duas organizações são muito similares mas não são idênticas. Muitos outros países publicam suas próprias especificações nacionais para combustível de jato mas estão muito próximas ou são completamente idênticas à especificação quer de ASTM quer de MOD.

ASTM D 1655 é a Especificação Padrão para Combustíveis de Turbina de Aviação e inclui especificações para Combustíveis Jato A, Jato A-Ie Jato B. Defense Standard 91-91 é a especificação MOD para Jato A-1.

Jato A-I é o combustível de jato mais comum e é produzido para um grupo internacionalmente padronizado de especificações. Apenas nos 10 Estados Unidos, uma versão de jato A-I conhecida como Jato A também é usada. Outro combustível de jato que é comumente usado em aviação civil é chamado Jato B. Jato B é um combustível mais leve na região de nafta- querosene que é usado por causa de seu desempenho melhorado em clima frio. Jato A, Jato A-Ie Jato B são especificados em ASTM Specification 15 D1655.

Alternativamente, combustíveis de jato são classificados por militares em todo o mundo com um sistema diferente de números JP. Alguns são quase idênticos às suas contra-partes civis e diferem apenas pelas quantidades de uns poucos aditivos. Por exemplo, Jato A-I é similar a JP-8 e Jato B é similar a JP-4.

Em algumas modalidades, as composições de combustível aqui proporcionadas adicionalmente compreendem um composto aromático tal como p-cimeno, m-cimeno ou o-cimeno. Em outras modalidades, o composto aromático é ou compreende p-cimeno. Em certas modalidades, a 25 quantidade de p-cimeno é de cerca de 0,1% a cerca de 50% em volume, de cerca de 0,1% a cerca de 45% em volume, de cerca de 0,1%) a cerca de 40% em volume, ou de cerca de 0,1% a cerca de 35% em volume, baseada no volume total da composição. Em outras modalidades, a quantidade de p- cimeno é de cerca de 0,5% a cerca de 35% em volume, baseada no volume total da composição. Em ainda outras modalidades, a quantidade de p-cimeno é de cerca de 1% a cerca de 25%, de cerca de 5% a cerca de 25%, de cerca de 5%> a cerca de 20%, ou 10% a cerca de 20% em volume, baseada no volume total da composição.

5 Em algumas modalidades, a quantidade total de compostos

aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 1% a cerca de 50% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 15% a cerca de 35%) em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível. Em outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 15% a cerca de 25% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível. Em outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 5% a cerca de 10% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível. Em ainda outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é menor do que cerca de 25% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível.

Em algumas modalidades, a composição de combustível adicionalmente compreende um aditivo de combustível. Em certas modalidades, o aditivo de combustível é de cerca de 0,1% a cerca de 50% em peso ou volume, baseado no peso ou volume total da composição de 25 combustível. Em outras modalidades, o aditivo de combustível é selecionado do grupo consistindo de oxigenados, antioxidantes, aperfeiçoadores de estabilidade térmica, estabilizadores, aperfeiçoadores de fluxo a frio, aperfeiçoadores de combustão, antiespumantes, aditivos de anti-névoa, inibidores de corrosão, aperfeiçoadores de lubricidade, inibidores de formação de gelo, aditivos de limpeza de injetor, supressores de fumaça, aditivos redutores de arrasto, desativadores de metal, dispersantes, detergentes, desemulsificadores, corantes, marcadores, dissipadores estáticos, biocidas e suas combinações.

5 A quantidade de um aditivo de combustível na composição de

combustível aqui mostrada pode ser de cerca de 0,1% a menor do que cerca de 50%, de cerca de 0,2% a cerca de 40%, de cerca de 0,3% a cerca de 30%, de cerca de 0,4% a cerca de 20%, de cerca de 0,5% a cerca de 15% ou de cerca de 0,5% a cerca de 10%, baseada na quantidade total da composição de combustível. Em certas modalidades, a quantidade de um aditivo de combustível é menor do que cerca de 50%, menor do que cerca de 45%, menor do que cerca de 40%, menor do que cerca de 35%, menor do que cerca de 30%, menor do que cerca de 25%, menor do que cerca de 20%, menor do que cerca de 15%, menor do que cerca de 10%, menor do que cerca de 5%, menor do que cerca de 4%, menor do que cerca de 3%, menor do que cerca de 2%, menor do que cerca de 1% ou menor do que cerca de 0,5%, baseada na quantidade total da composição de combustível. Em algumas modalidades, a quantidade está em % em peso baseada no peso total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade está em % em volume baseada no volume total da composição.

Exemplos ilustrativos de aditivos de combustível são descritos com mais detalhe abaixo. Aperfeiçoadores de lubricidade são um exemplo. Em certos aditivos, a concentração do aperfeiçoador de lubricidade no combustível cai dentro da faixa de cerca de 1 ppm a cerca de 50.000 ppm, 25 preferivelmente de cerca de 10 ppm a cerca de 20.000 ppm, e mais preferivelmente de cerca de 25 ppm a cerca de 10.000 ppm. Alguns exemplos não-limitantes de aperfeiçoador de lubricidade incluem ésteres de ácido graxo.

Estabilizadores melhoram a estabilidade de armazenagem da composição de combustível. Alguns exemplos não-limitantes de estabilizadores incluem terciário-alquil-aminas primárias. O estabilizador pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 2% em peso, baseada no peso total da 5 composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Aperfeiçoadores de combustão aumentam a velocidade de queima de massa da composição de combustível. Alguns exemplos não- limitantes de aperfeiçoadores de combustão incluem ferroceno(diciclo- 10 pendadienil-ferro), aperfeiçoadores de combustão baseados em ferro (e.g., TURBOTECT™ ER-18 de Turbotect (USA) Inc., Tomball, Texas), aperfeiçoadores de combustão baseados em bário, aperfeiçoadores de combustão baseados em cério, e aperfeiçoadores de combustão baseados em ferro e magnésio (e.g., TURBOTECT™ 703 de Turbotect (USA) Inc., 15 Tomball, Texas). O aperfeiçoador de combustão pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 1% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Antioxidantes que evitam a formação de depósitos de goma

sobre componentes de sistema de combustível causada por oxidação de combustíveis em armazenagem e/ou inibem a formação de compostos de peróxido em certas composições de combustível podem ser aqui usados. O antioxidante pode estar presente na composição de combustível em uma 25 concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Dissipadores estáticos reduzem os efeitos de eletricidade estática gerada pelo movimento de combustível através de sistemas de transferência de combustível de velocidade alta. O dissipador estático pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em 5 peso a cerca de 1% em peso.

Inibidores de corrosão protegem metais ferrosos no manuseio de sistemas de combustível tais como tubulações, e tanques de armazenagem de combustível, da corrosão. Em circunstâncias onde lubricidade adicional é desejada, inibidores de corrosão que também melhoram as propriedades de 10 lubrificação da composição podem ser usados. O inibidor de corrosão pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1 % em peso.

Inibidores de formação de gelo de sistema de combustível

(também chamado de aditivo de anti-formação de gelo) reduzem o ponto de congelamento da água precipitada dos combustíveis de jato devido ao esfriamento em altitudes elevadas e previnem a formação de cristais de gelo que restringem o fluxo de combustível para o motor. Certos inibidores de 20 formação de gelo de sistema de combustível também podem atuar como um biocida. O inibidor de formação de gele de sistema de combustível pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01%) em peso a cerca de 25 1% em peso.

Biocidas são usados para combater crescimento microbiano na composição de combustível. O biocida pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Desativadores de metal suprimem o efeito catalítico que alguns metais, particularmente cobre, têm sobre a oxidação de combustível. O desativador de metal pode estar presente na composição de combustível em 5 uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Aperfeiçoadores de estabilidade térmica são usados para inibir a formação de depósito nas áreas de temperatura alta do sistema de 10 combustível de aeronave. O aperfeiçoador de estabilidade térmica pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001%) em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem

um ponto de vaporização instantânea maior do que cerca de 32°C, maior do que cerca de 33 °C, maior do que cerca de 34°C, maior do que cerca de 3 5°C, maior do que cerca de 36°C, maior do que cerca de 37°C, maior do que cerca de 38°C, maior do que cerca de 39°C, maior do que cerca de 40°C, maior do 20 que cerca de 41°C, maior do que cerca de 42°C, maior do que cerca de 43°C, ou maior do que cerca de 44°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea maior do que 38°C. Em certas modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 56. 25 Em outras modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 93. Em outras modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 3828- 98. Em ainda outras modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com qualquer método convencional conhecido por um técnico experiente para medir o ponto de vaporização instantânea de combustíveis.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3, de cerca de 750 kg/m a cerca de 845 kg/m , de cerca de 750 kg/m a cerca de 840 kg/m3, de cerca de 760 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3, de cerca de 770 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3, de cerca de 770 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3, de cerca de

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775 kg/m a cerca de 850 kg/m , ou de cerca de 775 kg/m a cerca de 845 kg/m . Em outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 780 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 775 kg/m3 a cerca de 840 kg/m3. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 805 kg/m3. Em certas modalidades, a densidade da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 4052. Em outras modalidades, a densidade da composição de combustível aqui mostrada é medida de acordo com qualquer método convencional conhecido por um técnico experiente para medir densidade de combustíveis.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem um ponto de congelamento que é menor do que -30°C, menor do que -40°C, menor do que -50°C, menor do que -60°C, menor do que -70°C, ou menor do que -80°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de congelamento de cerca de -80°C a cerca de -30°C, de cerca de -75°C a cerca de -35°C, de cerca de -70°C a cerca de -40°C, ou de cerca de -65 "C a cerca de -45°C. Em certas modalidades, o ponto de congelamento da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 2386. Em outras modalidades, o ponto de congelamento da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com qualquer método convencional conhecido por um técnico experiente para medir ponto de congelamento de combustíveis.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem

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uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m , e um 5 ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C. Em certas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15 0C de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m , um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C, e um ponto de congelamento menor do que -40°C. Em certas modalidades, a composição de combustível

3 3

tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 840 kg/m , um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C, e um ponto de congelamento menor do que -40°C.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem um ponto de ebulição inicial que é de cerca de 140°C a cerca de 170°C. Em 15 outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de ebulição final que é de cerca de 180°C a cerca de 300°C. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem uma ebulição inicial de cerca de 140°C a cerca de 170°C, e a ponto de ebulição final de cerca de 180°C a cerca de 300°C. Em certas modalidades, a composição de combustível atende 20 à especificação de destilação de ASTM D 86.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma temperatura de Testador de Oxidação Térmica de Combustível de jato (JFTOT) que é igual a ou maior do que 245°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem uma temperatura de JFTOT que é igual a ou 25 maior do que 250°C, igual a ou maior do que 255°C, igual a ou maior do que 260°C, ou igual a ou maior do que 265°C.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem

uma viscosidade a -20°C que é menor do que 6 mm2/s, menor do que 7

2 2 2 mm /s, menor do que 8 mm /s, menor do que 9 mm /s, ou menor do que 10 mm /s. Em certas modalidades, a viscosidade da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 445.

Em algumas modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para Jato A-1. Em outras modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para Jato A. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para Jato B.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição combustível compreendendo:

(a) um isoprenóide bicíclico C10 em uma quantidade que é pelo menos 10% em volume, baseada no volume total da composição; e

(b) querosene em uma quantidade que é pelo menos 40% em volume, baseada no volume total da composição,

sendo que a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m3a cerca de 850 kg/m3, um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C; e um ponto de congelamento menor do que -40°C.

Em algumas modalidades, a quantidade de o isoprenóide bicíclico Cio é pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%», pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, ou pelo menos cerca de 50% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em certas modalidades, a quantidade está em % em peso baseada no peso total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade está em % em volume baseada no volume total da composição.

Em algumas modalidades, o isoprenóide bicíclico Cio é carano. Em outras modalidades, o isoprenóide bicíclico Cjo é pinano. Em ainda outras modalidades, o isoprenóide bicíclico Cio é sabinano. Em certas modalidades, o isoprenóide bicíclico Ci0 é uma mistura compreendendo dois ou mais de carano, pinano, e sabinano.

Em certas modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para Jato A.

Em outro aspecto, um sistema de combustível é proporcionado compreendendo um tanque de combustível contendo a composição de combustível aqui mostrada. Opcionalmente, o sistema de combustível pode adicionalmente compreender um sistema de esfriamento de motor tendo um agente de refrigeração de motor circulando, uma linha de combustível conectando o tanque de combustível com o motor de combustão interna, e/ou um filtro de combustível posicionado na linha de combustível. Alguns exemplos não-limitantes de motores de combustão interna incluem motores recíprocos (e.g., motores a gasolina e motores a diesel), motores de Wankel, motores a jato, alguns motores de foguete, e motores de turbina a gás.

Em algumas modalidades, o tanque de combustível está posicionado com dito sistema de combustível de modo a permitir transferência de calor do agente de refrigeração de motor recirculando para a composição de combustível contida no tanque de combustível. Em outras modalidades, o sistema de combustível adicionalmente compreende um segundo tanque de combustível contendo um segundo combustível para um motor a jato e uma segunda linha de combustível conectando o segundo tanque de combustível com o motor. Opcionalmente, as primeira e segunda linhas de combustível podem estar munidas com válvulas eletromagneticamente operadas que podem ser abertas ou fechadas independentemente umas das outras ou simultaneamente. Em outras modalidades, o segundo combustível é um Jato A.

Em outro aspecto, um arranjo de motor é proporcionado compreendendo um motor de combustão interna, um tanque de combustível contendo a composição de combustível aqui mostrada, uma linha de combustível conectando o tanque de combustível com o motor de combustão interna. Opcionalmente, o arranjo de motor pode adicionalmente compreender um filtro de combustível e/ou um sistema de esfriamento de motor compreendendo um agente de refrigeração de motor circulando. Em algumas modalidades, o motor de combustão interna é um motor a diesel. Em outras modalidades, o motor de combustão interna é um motor a jato.

Quando se usa a composição de combustível aqui mostrada, é desejável remover matéria particulada originária da composição de combustível antes de injetá-la no motor. Portanto, é desejável selecionar um filtro de combustível adequado para uso em um sistema de combustível aqui mostrado. Água em combustíveis usados em um motor de combustão interna, ainda em quantidades pequenas, pode ser muito nociva para o motor. Portanto, é desejável que alguma água presente na composição de combustível seja removida antes da injeção no motor. Em algumas modalidades, água e matéria particulada podem ser removidas pelo uso de um filtro de combustível utilizando uma centrífuga de turbina, na qual água e matéria particulada são separadas da composição de combustível em uma extensão que permite a injeção da composição de combustível filtrada no motor, sem risco de danificar o motor. Outros tipos de filtros de combustível que podem remover água e/ou matéria particulada também podem ser usados. Em outro aspecto, é proporcionado um veículo

compreendendo um motor de combustão interna, um tanque de combustível contendo a composição de combustível aqui mostrada, e uma linha de combustível conectando o tanque de combustível com o motor de combustão interna. Opcionalmente, o veículo pode adicionalmente compreender um filtro de combustível e/ou um sistema de esfriamento de motor compreendendo um agente de refrigeração de motor circulando. Alguns exemplos não-limitantes de veículos incluem carros, motocicletas, trens, navios, e aeronave.

Métodos de Preparação de Composições de Combustível Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de preparação de uma composição de combustível compreendendo as etapas de:

(a) contactar um material de partida isoprenóide Cio com hidrogênio na presença de um catalisador para formar um isoprenóide bicíclico Ci0; e

(b) misturar o isoprenóide bicíclico Cio com um componente combustível para preparar a composição de combustível.

Em uma modalidade, o material de partida isoprenóide Cio é careno e o isoprenóide bicíclico Cj0 é carano. Em outra modalidade, o material de partida isoprenóide Ci0 é α-pineno e o isoprenóide bicíclico Ci0 é pinano. Em outra modalidade, o material de partida isoprenóide C)0 é p- pineno e o isoprenóide bicíclico Ci0 é pinano. Em ainda outras modalidades, o material de partida isoprenóide Cio é uma mistura de α-pineno e β-pineno e o isoprenóide bicíclico C]0 é pinano. Em outras modalidades, o material de partida isoprenóide Ci0 é sabineno e o isoprenóide bicíclico Cio é sabinano.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de preparação de uma composição de combustível a partir de um açúcar simples compreendendo as etapas de:

(a) contactar uma célula capaz de preparar um material de partida isoprenóide Ci0 com o açúcar simples sob condições adequadas para preparar o material de partida isoprenóide Cio;

(b) converter o material de partida isoprenóide Ci0 to um isoprenóide bicíclico Cto; e

(c) misturar o isoprenóide bicíclico Cio com um componente combustível para preparar a composição de combustível.

Em algumas modalidades, o material de partida isoprenóide Cio é convertido em um isoprenóide bicíclico Cjo pelo contato do material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador.

Em outro aspecto, é proporcionada uma instalação para manufatura de um combustível, componente biocombustível bioengenheirado, ou aditivo de combustível bioengenheirado da invenção. Em certas modalidades, a instalação é capaz de biologicamente manufaturar dos materiais de partida Ci0. Em certas modalidades, a instalação é adicionalmente capaz de preparar um aditivo de combustível isoprenóide ou componente combustível a partir do material de partida.

A instalação pode compreender qualquer estrutura útil para preparar o material de partida Ci0 usando um microorganismo. Em algumas modalidades, a instalação biológica compreende uma ou mais das células aqui mostradas. Em algumas modalidades, a instalação biológica compreende uma cultura de células compreendendo pelo menos a C]0 material de partida em uma quantidade de pelo menos cerca de 1% em peso, pelo menos cerca de 5% em peso, pelo menos cerca de 10% em peso, pelo menos cerca de 20% em peso, ou pelo menos cerca de 30% em peso, baseada no peso total da cultura de células. Em outras modalidades, a instalação biológica compreende um fermentador compreendendo uma ou mais das células aqui descritas.

Qualquer fermentador que pode proporcionar às células ou bactérias um ambiente estável e ótimo no qual elas podem crescer ou se reproduzir pode ser aqui usado. Em algumas modalidades, o fermentador compreende uma cultura compreendendo uma ou mais das células aqui mostradas. Em outras modalidades, o fermentador compreende uma cultura de células capaz de biologicamente manufaturar pirofosfato de geranila (GPP). Em outras modalidades, o fermentador compreende uma cultura de células capaz de biologicamente manufaturar difosfato de isopentila (IPP). Em certas modalidades, o fermentador compreende uma cultura de células compreendendo pelo menos a Ci0 material de partida em uma quantidade de pelo menos cerca de 1% em peso, pelo menos cerca de 5% em peso, pelo menos cerca de 10% em peso, pelo menos cerca de 20% em peso, ou pelo menos cerca de 30% em peso, baseada no peso total da cultura de células.

A instalação pode adicionalmente compreender qualquer estrutura capaz de manufaturar o componente combustível ou aditivo de combustível do material de partida Cio- A estrutura pode compreender um hidrogenador para a hidrogenação dos materiais de partida Ci0. Qualquer hidrogenador que pode ser usado para reduzir ligações duplas C=C em ligações simples C-C sob condições conhecidas pelos técnicos experientes pode ser aqui usado. O hidrogenador pode compreender um catalisador de hidrogenação aqui mostrado. Em algumas modalidades, a estrutura adicionalmente compreende um misturador, um recipiente, e uma mistura dos produtos de hidrogenação da etapa de hidrogenação e um aditivo de combustível convencional no recipiente.

O açúcar simples pode ser qualquer açúcar conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Alguns exemplos não-limitantes de açúcares simples ou monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, ribose e suas combinações. Alguns exemplos não-limitantes de dissacarídeos adequados incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose e suas combinações. Em certas modalidades, o componente biocombustível bioengenheirado pode ser obtido a partir de um polissacarídeo. Alguns exemplos não-limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogênio, celulose, quitina e suas combinações. Os monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos

adequados para preparar o tetrametil-ciclo-hexano bioengenheirado podem ser encontrados em uma ampla variedade de colheitas ou fontes. Alguns exemplos não-limitantes de colheitas ou fontes adequadas incluem cana-de- açúcar, bagaço, miscanthus, beterraba, sorgo, sorgo granífero, switchgrass (Panicum virgatum), cevada, cânhamo, kenaf {Hibiscus cannabinus), batatas, batatas doces, mandioca, girassol, fruta, melaço, soro de leite ou leite desnatado, milho, forragem, grão, trigo, madeira, papel, palha, algodão, muitos tipos de resíduo de celulose, e outra biomassa. Em certas modalidades, as colheitas ou fontes adequadas incluem cana-de-açúcar, beterraba e milho. Métodos para Preparar Compostos

Os compostos da presente invenção podem ser preparados usando qualquer método conhecido na arte incluindo método biológico, síntese química total (sem o uso de materiais biologicamente derivados), e um método híbrido onde meios biológicos e químicos são usados. Em certas modalidades, os materiais de partida isoprenóides Cio são cada um preparados por células hospedeiras pela conversão de açúcar simples no produto desejado.

Células hospedeiras

Os materiais de partida isoprenóides C]0 também podem ser

preparados por qualquer método conhecido na arte incluindo métodos biológicos, sínteses químicas, e métodos híbridos. Quando o material de partida isoprenóide Ci0 é preparado biologicamente, células hospedeiras que são modificadas para produzirem o produto desejado podem ser usadas. Como todos isoprenóides, o material de partida isoprenóide Cjo é preparado bioquimicamente através de um intermediário comum, difosfato de isopentila ("IPP").

A célula hospedeira pode ser crescida de acordo com qualquer técnica conhecida por aquelas pessoas experientes na arte. Em particular, a célula hospedeira pode ser crescida em meio de cultura apropriado para a célula hospedeira. Em modalidades vantajosas, o meio de cultura compreende componentes prontamente disponíveis, renováveis. A presente invenção assim proporciona fontes de energia prontamente disponíveis, renováveis métodos de seu uso para produzir composições de combustível. Em certas modalidades, a célula hospedeira é crescida ou cultivada por contato com um açúcar simples sob condições adequadas para seu crescimento e produção de um isoprenóide Ci0. Em certas modalidades, a célula hospedeira pode ser crescida ou cultivada pelo contato com glicose, galactose, manose, frutose, ribose, ou uma combinação dos mesmos. A presente invenção assim proporciona composições de combustível derivadas de açúcares simples, e.g. glicose, galactose, manose, frutose, ribose, e suas combinações, e métodos de sua produção a partir dos açúcares simples.

Qualquer célula hospedeira adequada pode ser usada na prática dos métodos e composições aqui descritos. Em uma modalidade, a célula hospedeira é um microorganismo hospedeiro geneticamente modificado no qual moléculas de ácido nucleico têm sido inseridas, deletadas ou modificadas (i.e., mutadas; e.g., por inserção, deleção, substituição, e/ou inversão de nucleotídeos), quer para produzir o isoprenóide ou derivado de isoprenóide desejado, quer para produzir rendimentos aumentados do isoprenóide ou derivado de isoprenóide desejado. Em certas modalidades, a célula hospedeira é capaz de ser crescida em meio de crescimento líquido.

Exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas incluem qualquer célula de archae, bacteriana, ou eucariótica. Exemplos de uma célula de archae incluem, mas não são limitadas àquelas pertencendo aos gêneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobaeterium, Piroeoceus, Sulfolobus, e Thermoplasma. Exemplos ilustrativos de espécie archae incluem mas não são limitadas a: Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Methanoeoceus jannasehii, Methanobaeterium thermoautotrophieum, Piroeoceus abyssi, Pirococcus horikoshii, Thermoplasma aeidophilum, e Thermoplasma voleanium.

Exemplos de espécies bacterianas úteis incluem, mas não são limitadas àquelas pertencendo aos gêneros: Agrobaeterium, Aliciclobacillus, Anabaena, Anaeystis, Arthrobaeter, Azobaeter, Baeillus, Brevibaeterium, Chromatium, Clostridium, Corynebaeterium, Enterobaeter, Erwinia, Eseheriehia, Lactobacillus, Laetococeus, Mesorhizobium, Metilobaeterium, Mierobaeterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobaeter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodoeoeeus, Salmonella, Seenedesmun, Serratia, Shigella, Staphloeoeeus, Strepromyees, Synneeoeeus, e Zymomonas.

Exemplos ilustrativos de espécies bacterianas úteis incluem mas não são limitadas a: Bacíllus subtilis, Bacillus amiloliquefatines, Brevibaeterium ammoniagenes, Brevibaeterium immariophilum, Clostridium beigerinekii, Enterobaeter sakazakii, Eseheriehia eoli, Lactoeoceus laetis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudiea, Rhodobaeter eapsulatus, Rhodobaeter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum,. Salmonella enteriea, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphilococcus aureus, e semelhantes.

Em geral, se uma célula hospedeira bacteriana é usada, é preferida uma cepa não-patogênica. Exemplos ilustrativos de cepas não- patogênicas incluem mas não são limitados a: Bacillus subtilis, Eseheriehia eoli, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helvetieus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudita, Rhodobacter sphaeroides, Rodobaeter eapsulatus, Rhodospirillum rubrum, e semelhantes.

Exemplos de células eucarióticas úteis incluem mas não são limitados células fungicas. Exemplos de células füngicas incluem, mas não são limitadas àquelas pertencendo aos gêneros: Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotoeoeeus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penieillium, Piehia, Saccharomyces, e Triehoderma.

Exemplos ilustrativos de espécies eucarióticas úteis incluem mas não são limitados a: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida albieans, Chrysosporium lueknowense, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Kluyveromyces laetis, Neurospora erdssa, Piehia angusta, PiehiaFinlândiaiea, Piehia kodamae, Piehia membranaefadens, Piehia methanolica, Piehia opuntiae, Piehia pastoris, Piehia pijperi, Piehia quereuum, Piehia salictaria, Piehia thermotolerans, Piehia trehalophila, Piehia stipitis, Streptomyees ambofaeiens, Streptomyees aureofaciens, Streptomyces aureus, Saccaromyees bayanus, Saccaromyees boulardi, Saccharomyees eerevisiae, Streptomyees fungieidieus, Streptomyees griseoehromogenes, Streptomyees griseus, Streptomyees lívidans, Streptomyees olivogriseus, Streptomyees rameus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees vinaeeus, e Triehoderma reesei.

Em geral, se uma célula eucariótica é usada, é preferida uma espécie não-patogênica. Exemplos ilustrativos de espécies não-patogênicas incluem mas não são limitados a: Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Piehia pastoris, Saccaromyees boulardi, e Saccaromyees eerevisiae.

Em adição, certas espécies têm sido denominadas pela Food e Drug Administration como GRAS ou Geralmente Consideradas Seguras. Estas cepas incluem: Bacillus subtilis, Lactibacillus aeidophilus, Lactobacillus helvetieus, e Saccharomyees eerevisiae. Vias de IPP

Há duas vias biossintéticas que sintetizam IPP e seu isômero, pirofosfato de dimetil-alila ("DMAPP"). Eucariotos diferentes de plantas usam a via de isoprenóide dependente de mevalonato ("MEV") exclusivamente para converter acetil-coenzima A ("acetil-CoA") em IPP, que é subseqüentemente isomerizado para DMAPP. Procariotos, com algumas exceções, a via de desóxi-xilulose-5-fosfato ("DXP") ou independente de mevalonato para produzir IPP e DMAPP separadamente através de um ponto de ramificação. Em geral, plantas usam ambas as vias MEV e SXP para a síntese de IPP. ViaMEV

Uma representação esquemática da via MEV é descrita em Figura 1. Em geral, a via compreende seis etapas.

Na primeira etapa, duas moléculas de acetil-coenzima A são enzimaticamente combinadas para formar aceto-acetil-CoA. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, acetil-CoA tiolase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados aos seguintes números de acesso em Banco de Gene e organismo do qual as seqüências são derivadas: (NC_000913 REGION: 2324131..2325315;

Escherichia colí), (D49362; Paracoccus denitrifieans), e (L20428; Saccharomyees eerevisiae).

Na segunda etapa da via MEV, aceto-acetil-CoA é enzimaticamente condensada com outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidróxi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA). Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (NC_001145. complemento 19061..2053 6; Saccharomyees eerevisiae), (X96617; Saccharomyees eerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), e (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; Staphilococcus aureus).

Na terceira etapa, HMG-CoA é enzimaticamente convertida em mevalonato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA redutase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC 002758, Locus tag SAV2545, Gene ID 1122570 Staphilococcus aureus), (NM_204485; Gallus gallus), (ABO 15627 Streptomyees sp. KO 3988), (AF542543; Nieotiana attenuata), (AB037907 Kitasatospora griseola), (AX128213, proporcionando a seqüência codificadora de uma HMGR truncada; Saccharomyees eerevisiae), e (NC001145: complemento (115734.. 118898; Saccharomyces eerevisiae).

Na quarta etapa, mevalonato é enzimaticamente fosforilado para formar mevalonato 5-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato cinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (L77688; Arabidopsis thaliana), e (Χ55875; Saccharomyces eerevisiae).

Na quinta etapa, um segundo grupo fosfato é enzimaticamente adicionado em mevalonato 5-fosfato para formar mevalonato 5-pirofosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, fosfomevalonato cinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), e (NC_001145. complemento 712315..713670; Saccharomyees eerevisiae).

Na sexta etapa, mevalonato 5-pirofosfato é enzimaticamente é convertido em IPP. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato pirofosfato descarboxilase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (X97557; Saccharomyees eerevisiae), (AF290095; Enterocoeeus faeeium), e (U49260; Homo sapiens).

Se IPP é para ser convertido em DMAPP usando a via de mevalonato, então é exigida uma sétima etapa. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, IPP isomerase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (NC_000913,3 031087..3031635; Eseheriehia eolí), e (AF082326; Haematoeoeeus pluvialis). ViaDXP

Uma representação esquemática da via DXP é descrita em Figura 2. Em geral, a via DXP compreende sete etapas. Na primeira etapa, piruvato é condensado com D-gliceraldeído 3-fosfato para preparar 1-desóxi- D-xilulose-5-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF035440; Eseherichia eolí), (NC 002947, locus tag PP0527; Pseudomonasputida KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella enteriea Paratyphi, veja ATCC 9150), (NC_007493, locus tag RSP_0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC_004556, locus tag PD1293; Xilellafastidiosa Temeculal), e (NC_003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana).

Na segunda etapa, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato é convertido em 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AB013300; Escherichia eolí), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, locus tag PPl 597; Pseudomonasputida KT2440), (AL939124, locus tag SC05694; Streptomyees eoelicolor A3(2)), (NC_007493, locus tag RSP_2709; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1), e (NC_007492, locus tag PflJ 107; Pseudomonasfluorescens PfO-1).

Na terceira etapa, 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato é convertido em 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF230736; Escherichia eolí), (NC_007493, locus tag RSP 2835; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1), (NC 003071, locus tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana), e (NC_002947, locus tag PP1614; Pseudomonas putida KT2440).

Na quarta etapa, 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol é convertido em 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfo-citidil-2C-metil- D-eritritol cinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF216300; Eseheriehia eolí) e (NC 007493, locus tag RSPJ779; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1).

Na quinta etapa, 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol-2- fosfato é convertido em 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclo-difosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 2C-metil-D-eritritol 2,4- ciclo-difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF230738; Escherichia coli), (NC_007493, locus tag RSP 6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC_002947, locus tag PPl618; Pseudomonasputida KT2440).

Na sexta etapa, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclo-difosfato é convertido em l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 1-hidróxi-2-metil-2-(E)- butenil-4-difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AY033515; Eseheriehia coli), (NC 002947, locus tag PP0853; Pseudomonas putida KT2440), e (NC_007493, locus tag RSP_2982; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1).

Na sétima etapa, l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato é convertido em quer IPP quer seu isômero, DMAPP. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, isopentil/dimetil-alil difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AY062212; Escheriehia coli) e (NC_002947, locus tag PP0606; Pseudomonas putida KT2440).

Em algumas modalidades, "conversação cruzada" (ou interferência) entre os processos metabólicos da própria célula hospedeira e aqueles processos envolvidos com a produção de IPP como aqui proporcionados são minimizadas ou inteiramente eliminadas. Por exemplo, conversação cruzada é minimizada ou inteiramente eliminada quando o microorganismo hospedeiro baseia-se exclusivamente na via DXP para sintetizar IPP, e uma via MEV é introduzida para proporcionar IPP adicional. Um tal organismo hospedeiro não estaria equipado para alterar a expressão das enzimas da via MEV ou processar os intermediários associados com a via MEV. Organismos que se baseiam exclusivamente ou predominantemente na via DXP incluem, por exemplo, Escherichia coli. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz IPP via a via MEV, quer exclusivamente quer em combinação com a via DXP. Em outras modalidades, uma via DXP de hospedeiro é funcionalmente desativada de modo que a célula hospedeira produza IPP exclusivamente através de uma via MEV heterogeneamente introduzida. A via DXP pode ser funcionalmente desativada pela desativação da expressão de gene ou inativação da função de uma ou mais das enzimas da via DXP. Material de partida isoprenóide

Em algumas modalidades GPP é preparado pelo método como descrito esquematicamente em Figura 3. Uma molécula de IPP e uma molécula de DMAPP são condensadas para formar GPP. Em algumas modalidades, a reação pode ser catalisada por uma enzima conhecida em catalisar esta etapa, por exemplo, geranil-difosfato-sintase. Vários materiais de partida isoprenóides Ci0 podem ser preparados a partir de GPP. Exemplos ilustrativos de polinucleotídeos codificadores de

pirofosfato de geranila sintase incluem mas não são limitados a: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AEO16877, Locus API 1092; Bacillus cereus-, ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ipspini), (DQ286930; Lyeopersieon eseulentum), (AF182828; Menthaxpiperita), (AF182827; Menthaxpiperita), (MPI249453; Mentha xpiperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paraeoeeus zeaxanthinifaeiens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), e (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).

GPP pode ser subseqüentemente convertido em vários materiais de partida isoprenóides Ci0 usando uma ou mais terpeno sintases. Alguns exemplos não-limitantes incluem os seguintes exemplos e seus estereoisômeros. Careno

Careno, cuja estrutura é

é encontrado na resina de várias árvores, particularmente pinheiros. Careno é preparado a partir de GPP de careno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem mas não são limitados a: (AF461460, REGION 43..1926; Picea abies) e (AF527416, REGION: 78.. 1871 -,Salviastenophilla). g-Pineno

α-pineno, cuja estrutura é

partir de GPP por α-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem mas não são limitados a: (+) α-pineno sintase (AF543530, REGION: 1..1887; Pinus taeda), (-)a-pineno sintase (AF543527, REGION: 32.. 1921; Pinus taeda), e (+)/(-)a-pineno sintase (AGU87909, REGION: 6111892; Abies grandis). β-Pineno

β-Pineno, cuja estrutura é roseira. β-Pineno é preparado a partir de GPP por β-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem mas não são limitados a: (-) p-pineno sintases (AF276072, REGION: I.M49; Artemisia annua) e (AF514288, REGION: 26.. 1834; Citrus limorí).

Sabineno

Sabineno, cuja estrutura é

é encontrado em pimenta preta, semente de cenoura, salva, e árvores de chá. Sabineno é preparado a partir de GPP por sabineno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui mas não é limitada a AF051901, REGION: 26.. 1798 de Salvia officinalis.

Em algumas modalidades, os materiais de partida isoprenóides podem ser obtidos ou preparados de terpenos naturalmente ocorrentes que podem ser produzidos por uma ampla variedade de plantas, tais como Copaifera langsdorfii, coníferas, e eufórbias; insetos, tais como borboletas com asas traseiras em forma de cauda de andorinha, besouros de folha, térmites, e vespões de pinheiro; e organismos marinhos, tais como algas, esponjas, corais, moluscos, e peixes.

Copaifera langsdorfii ou árvore Copaifera também é conhecida como a árvore de diesel e a árvore de querosene. Tem muitos nomes em linguagens locais, incluindo kupa'y, cabismo, e copauva. Árvore Copaifera pode produzir uma quantidade grande de compostos terpênicos em suas madeira e folhas. Geralmente, uma árvore Copaifera pode produzir de cerca de 30 a cerca de 40 litros de óleo terpênico por ano.

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Oleos terpênicos também podem ser obtidos de coníferas e eufórbias. Coníferas pertencem à divisão de planta Pinophyta ou Coniferae e são geralmente plantas de semente cônica com tecido vascular. As coníferas são em sua maioria árvores, mas algumas coníferas podem ser arbustos. Alguns exemplos não-limitantes de coníferas adequadas incluem cedros, ciprestes, pinheiros-douglas, pinheiros, juníperos, dâmaras, lariços, pinheiros, sequóias, abetos, e teixos. Eufórbias, também conhecida como Euphorbia, são um gênero de plantas mundial muito diverso, pertencendo à família eufórbia (Euphorbiaceae). Consistindo de cerca de 2160 espécies, eufórbias são um dos gêneros maiores do reino vegetal.

Os materiais de partida isoprenóides Ci0 são monoterpenos que são parte de uma classe maior de compostos chamados terpenos. Uma classe grande e variada de hidrocarbonetos, terpenos inclui hemiterpenos, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, sesterterpenos, triterpenos, tetraterpenos, e politerpenos. Como um resultado, materiais de partida isoprenóides C]0 adequados podem ser isolados de óleos terpênicos para uso na presente invenção Conversão Química

Em certas modalidades, um ou mais materiais de partida isoprenóides Cio são isolados de fontes naturalmente ocorrentes e subseqüentemente são convertidos nos isoprenóides bicíclicos Cio correspondentes.

Independente de sua fonte, um material de partida isoprenóide Ci0 pode ser quimicamente convertido em um isoprenóide bicíclico Ci0 por qualquer reação de redução conhecida tal como reação de hidrogenação. Em algumas modalidades, o material de partida isoprenóide C]0 pode ser reduzido por hidrogênio com um catalisador tal como Pd, Pd/C, Pt, PtCh, Ru(PPh3)2Cl2, níquel de Raney e suas combinações. Geralmente, após completitude, a mistura reacional pode ser lavada, concentrada, seca para dar o produto hidrogenado correspondente.

O catalisador para a reação de hidrogenação dos materiais de partida isoprenóides Cj0 pode estar presente em qualquer quantidade para a reação prosseguir. Em algumas modalidades, a quantidade de catalisador de hidrogenação é de cerca de 1 g a cerca de 100 g por litro de reagente, de cerca de 2 g a cerca de 75 g por litro de reagente, de cerca de 3 g a cerca de 50 g por litro de reagente, de cerca de 4 g a cerca de 40 g por litro de reagente, de cerca de 5 g a cerca de 25 g por litro de reagente, ou de cerca de 5g a cerca de 10 g por litro de reagente.

Em algumas modalidades, a reação de hidrogenação procede na temperatura ambiente. Em certas modalidades, a temperatura de reação entre cerca de 10°C e cerca de 75°C, entre cerca de 15°C e cerca de 60°C, entre cerca de 20°C e cerca de 50°C, ou entre cerca de 20°C e cerca de 40°C. Em outras modalidades, a temperatura de reação is entre cerca de 75 0C e cerca de 150°C, entre cerca de 90°C e cerca de 130°C, ou entre cerca de IOO0Cecercade 125°C. A pressão do hidrogênio para a reação de hidrogenação pode

ser qualquer pressão que pode fazer com que a reação ocorra. Em algumas modalidades, a pressão do hidrogênio is entre cerca de 69 kPa e cerca de 6.895 kPa, entre cerca de 345 kPa e cerca de 5.516 kPa, entre cerca de 2.758 kPa e cerca de 4.137 kPa, ou entre cerca de 4345 kPa e cerca de 5345 kPa. Em outras modalidades, a pressão de hidrogênio é menor do que 689,5 kPa.

Em algumas modalidades, o catalisador é um catalisador de Pd. Em outras modalidades, o catalisador é Pd 5%/C. Em ainda outras modalidades, o catalisador é Pd 10%/C. Em alguma destas modalidades, a carga de catalisador está entre cerca de 1 g e cerca de 10 g por litro de reagente. Em outras modalidades, a carga de catalisador está entre cerca de 5 g e cerca de 5 g por litro de reagente.

Em algumas modalidades, as ligações C=C dos materiais de partida isoprenóides Cj0 são reduzidas para as ligações C-C correspondentes por hidrogenação na presença de um catalisador e hidrogênio na temperatura ambiente. Em certas modalidades, careno é reduzido a carano por hidrogênio na presença de um catalisador Pd 10%/C como mostrado em Esquema 1 abaixo

Esquema 1 10% Pd/C

H2

Em outras modalidades, α-pineno ou p-pineno é reduzido a pinano por hidrogênio na presença de um catalisador Pd 10%/C como mostrado em Esquema 2 abaixo

Esquema 2

10% Pd/C

Em ainda outras modalidades, sabineno é reduzido a sabinano por hidrogênio na presença de um catalisador Pd 10%/C como mostrado em Esquema 3 abaixo

Esquema 3

10% PdC

η,

Alternativamente, qualquer agente redutor que pode reduzir uma ligação C=C a uma ligação C-C também pode ser usado. Por exemplo, o material de partida isoprenóide Cio pode ser hidrogenado pelo tratamento com hidrazina na presença de um catalisador, tal como, perclorato de 5-etil-3- metil-umiflavínio, sob atmosfera de oxigênio para dar os produtos hidrogenados correspondentes. Uma reação de redução com hidrazina é mostrada em Imada et al, J. Am. Chem. Soe. 127,14544-14545 (2005), que é aqui incorporado como referência.

A hidrogenação dos materiais de partida isoprenóides C]0 pode ser realizada na presença de um catalisador de hidrogenação assimétrica tal como complexo de ródio-difosfina quiral para formar produtos hidrogenados estereoespecíficos substancialmente livres de outros estereoisômeros. Um exemplo não-limitante do catalisador de hidrogenação assimétrica inclui o catalisador ródio-PAMP. O catalisador ródio-DIPAMP e outros catalisadores de hidrogenação assimétrica são mostrados em Vineyard et al., J. Am. Chem. Soe. 1977,99, (18), 5946; Ryoji Noyori, "Asymmetric Catalysis in Organic Synthesis" John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque, Capítulo 2, pp. 16-94 (1994); e Blaser et al., "Asymmetrie Catalysis on Industrial Seale: Challenges, Approaehes and Solutions" Wiley-VCH, Weinheim, pp. 23-52 (2004), todos os quais são aqui incorporados como referências em sua totalidade.

Em algumas modalidades, careno pode ser hidrogenado na presença de um catalisador de hidrogenação assimétrica para formar um dos quatro possíveis isômeros de carano que são mostrados abaixo:

XxXxXx Xx

' ♦ . e

Em outras modalidades, α-pineno ou p-pineno podem ser hidrogenados na presença de um catalisador de hidrogenação assimétrica para formar um dos quatro possíveis isômeros de pinano que são mostrados abaixo:

^X-tyr-^r -φ*

> e .

Em outras modalidades, sabineno pode ser hidrogenado na presença de um catalisador de hidrogenação assimétrica para formar um dos quatro possíveis isômeros de sabinano (também conhecida como tujano ou Um aspecto da presente invenção refere-se a um método comercial compreendendo: (a) obter um biocombustível compreendendo isoprenóide bicíclico Ci0 derivado de um material de partida isoprenóide Ci0 pela realização de uma reação de fermentação de um açúcar com uma célula hospedeira recombinante, sendo que a célula hospedeira recombinante produz o material de partida isoprenóide C]0; e (b) comercializar e/ou vender dito biocombustível.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um método de comercializar ou distribuir o biocombustível aqui mostrado a negociantes, fornecedores, e/ou usuários de um combustível, cujo método compreende anunciar e/ou oferecer para venda o biocombustível aqui mostrado. Em outras modalidades, o biocombustível aqui mostrado pode ter características comerciais ou físicas aperfeiçoadas em relação ao combustível natural ou à contra-parte biocombustível contendo etanol.

Em certas modalidades, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um refinador de óleo de petróleo estabelecido para misturar o biocombustível aqui mostrado em combustíveis baseados em petróleo tais como uma gasolina, combustível de jato, querosene, combustível diesel ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um refinador de óleo de petróleo estabelecido para processar (por exemplo, hidrogenar, hidrocraquear, craquear, adicionalmente purificar) os biocombustíveis aqui mostrados, modificando-os deste modo em uma tal maneira para conceder propriedades benéficas aos biocombustíveis. O refinador de óleo de petróleo estabelecido pode usar o biocombustível aqui mostrado como uma matéria-prima para modificação química adicional, cujo produto final poderia ser usado como um combustível ou um componente de mistura de uma composição de combustível.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um produtor de açúcar a partir de uma fonte renovável (por exemplo, milho, cana-de-açúcar, bagaço, ou material lignocelulósico) para produzir tais fontes de açúcar renováveis para a produção dos biocombustíveis aqui mostrados. Em algumas modalidades, milho e cana-de-açúcar, as fontes de açúcar tradicionais, podem ser usadas. Em outras modalidades, material lignocelulósico barato (resíduo agrícola, forragem de milho, ou colheitas de biomassa tais como switchgrass (.Panicum virgatum) e capim dos pampas) pode ser usado como uma fonte de açúcar. Derivado de açúcar tais fonte baratas pode ser alimentado na produção do biocombustível aqui mostrado, de acordo com os métodos da presente invenção.

Em certas modalidades, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um produtor químico que produz e/ou usa açúcar de uma fonte renovável (por exemplo, milho, cana-de-açúcar, bagaço, ou material lignocelulósico) para utilizar açúcar obtido de um recurso renovável para a produção do biocombustível aqui mostrado.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são intencionados apenas para propósitos ilustrativos e em nenhum modo limitam o escopo da presente invenção.

A prática da presente invenção pode empregar, a não ser que seja indicado de outra maneira, técnicas convencionais da indústria biossintética e semelhantes, que estão dentro da habilidade da arte. Pelo fato de que tais técnicas não são totalmente aqui descritas, pode-se encontrar referência ampla a elas na literatura científica.

Nos seguintes exemplos, têm sido feitos esforços para garantir acurácia com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, e assim por diante), mas variação e desvio podem ser acomodados, e no caso de existir erro clerical nos números aqui relatados, uma pessoa ordinariamente experiente na arte à qual esta invenção pertence pode deduzir a quantidade correta em vista da revelação aqui restante. A não ser que seja indicado de outro modo, temperatura é relatada em graus Celsius, e pressão está na ou próxima da pressão atmosférica ao nível do mar. Todos os reagentes, a não ser que seja indicado de outra maneira, foram obtidos comercialmente. Os seguintes exemplos são intencionados apenas para propósitos ilustrativos e em nenhum modo limitam o escopo da presente invenção. Exemplo 1

Este exemplo descreve métodos para preparar plasmídeos de expressão que codificam enzimas incluindo enzimas da via MEV de Saccharomyces eerevisiae organizados em operons.

Plasmídeo de expressão pMevT foi gerado pela inserção do operon MevT no vetor pBAD33. O operon MevT codifica o grupo de enzimas da via MEV que juntas transformam o precursor ubíquo acetil-CoA em (R)- mevalonato, a saber aceto-acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, e HMG- CoA redutase. O operon MevT foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Eseheriehia eoli a seqüência codificadora do gene atoB (número de acesso no Banco de Gene de NC_000913 REGION: 2324131..2325315) (codifica uma aceto-acetil-CoA tiolase), de DNA genômico de Saccharomyees eerevisiae a seqüência codificadora do gene ERGl3 (número de acesso no Banco de Gene de X96617, REGION: 220.. 1695) (codifica uma HMG-CoA sintase), e de DNA genômico de Saccharomyces eerevisiae um segmento da região codificadora do gene HMGl (número de acesso no Banco de Gene de M22002, REGION: 1660..3165) (codifica uma HMG-Coa redutase truncada (tHMGR)). O iniciador de PCR a montante para a amplificação do fragmento de gene HMGl incluiu um códon de iniciação artificial. Os fragmentos amplificados foram editorados juntos usando extensões de recobrimento (SOEing), durante cujo processo sítios de ligação de ribossomo foram introduzidos após as seqüências codificadoras atoB e ERGl3. Após a adição de projeções 3' A, o operon MevT foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O operon MevT foi subseqüentemente ligado no sítio de restrição XmalPstI de vetor pBAD33 (Guzman et ai. (1995) J. Bacteriol. 177(14): 4121-4130). Para por o operon sob o controle do Puc promoter, o fragmento araC-PSael Nsil-Xmal de pBAD33 foi substituído pelo fragmento Nsil-Xmal de pBBRIMCS, dando plasmídeo de expressão pMevT (veja Patente U.S. Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pAM36-MevT66 foi gerado pela inserção do operon MeVT66 no vetor pAM36. O vetor pAM36 foi gerado pela inserção de um cassete de oligonucleotídeo contendo sítios de restrição Asel-Sfil-AsiSI-XhoI-Pael-FsIl-Pmel no vetor pACYC184 (número de acesso no Banco de Gene de X06403), e pela remoção do gene concessor de resistência à tetramicina em pACYC184. O operon MevT66 foi sinteticamente gerado usando SEQ ID NO: 1 como um modelo, que compreende o gene atoB de Eseheriehia eoli (número de acesso no Banco de Gene de NC_000913 REGION: 2324131..2325315), o gene ERGl3 de Saccharomyees eerevisiae (número de acesso no Banco de Gene de X96617, REGION: 220.. 1695), e uma versão truncada do gene HMGl de Saccharomyees eerevisiae (número de acesso no Banco de Gene de M22002, REGION: 1777..3285), todas as três seqüências sendo códon-otimizadas para expressão em Eseheriehia eoli. 0 operon MevT66 sinteticamente gerado foi flanqueado por um sítio de restrição 5' EcoRI e um sítio de restrição 3' HindIII, e assim pôde ser clonada nos sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pACYC ou pUC padrão. Deste construto, o operon MevT66 foi amplificado por PCR com sítios de restrição SfiI e AsiSI flanqueando, o fragmento de DNA amplificado foi digerido até completitude usando enzimas de restrição SfiI e AsiSI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído do gel usando um kit de purificação de gel (Qiagen, Valencia, CA), e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição SfiI AsiSI do vetor pAM36, dando plasmídeo de expressão ρ AM3 6-Me vT66.

Plasmídeo de expressão pAM25 foi gerado pela inserção do operon MeVT66 no vetor pAM29. O vetor pAM29 foi criado por montagem da origem de replicação pl5A e gene concedente de resistência à canamicina de pZS24-MCSl (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210) com um promotor IaeUV5 gerado de oligonucleotídeo. O construto de síntese de DNA compreendendo o operon MevT66 (veja definição para pAM36- MevT66 acima) foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição EeoRI e HindIII, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído de gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição EeoRI HindIII de pAM29, dando plasmídeo de expressão pAM25.

Plasmídeo de expressão pMevB-Cm foi gerado pela inserção do operon MevB no vetor pBBRIMCS-l. O operon MevB codifica o grupo de enzimas que juntas convertem (R)-mevalonato em IPP, a saber mevalonato cinase, fosfomevalonato cinase, e mevalonato pirofosfato carboxilase. O operon MevB foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Saccharomyees cerevisiae a seqüência codificadoras do gene ERG12 (número de acesso no Banco de Gene de X55875, REGION: 580.. 1911) (codifica uma mevalonato cinase), o gene ERG8 (número de acesso no Banco de Gene de Z49939, REGION: 3363..4718) (codifica uma fosfomevalonato cinase), e o gene MVDl (número de acesso no Banco de Gene de X97557, REGION: 544.. 1734) (codifica uma mevalonato pirofosfato carboxilase), e por editoração dos fragmentos de PCR juntos usando extensões de recobrimento (SOEing). Pela escolha das seqüência de iniciador apropriadas, os códons de terminação de ERG12 e ERG 8 foram mutados de TAA para TAG durante amplificação para introduzir sítios de ligação de ribossomo. Após a adição de projeções 3' A, o operon MevB foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O operon MevB foi excisado por digestão do construto de clonagem até completitude usando enzima de restrição PstI, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de restrição Pstl de vetor pBBRlMCS-I (Kovach et ai, Gene 166(1): 175-176 (1995)), dando plasmídeo de expressão pMevB-Cm.

Plasmídeo de expressão pMBI foi gerado pela inserção o operon MBI no vetor pBBRlMCS-3 vetor. Em adição às enzimas do operon MevB, o operon MBI também codifica uma isopentenil pirofosfatase isomerase, que catalisa a conversão de IPP em DMAPP. O operon MBI foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Escherichia coli a seqüência codificadora do gene idi (número de acesso no Banco de Gene de AFl 19715) usando iniciadores que continham um sítio de restrição XmaI em suas extremidades 5', digerindo o fragmento de DNA amplificado até completitude usando enzima de restrição XmaI, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de aproximadamente 0,5 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de restrição XmaI de plasmídeo de expressão pMevB-Cm, posicionando deste modo idi na extremidade 3' do operon MevB. O operon MBI foi subclonado no SalSacI sítio de restrição de vetor pBBRlMCS-3 (Kovach et al., Gene 166(1): 175-176 (1995)), dando plasmídeo de expressão pMBI (veja Patente U.S. Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pMBIS foi gerado pela inserção do gene ispA no pMBI. O gene ispA codifica uma farnesil difosfato sintase, que catalisa a condensação de duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP para preparar farnesil pirofosfato (FPP). A seqüência codificadora do gene ispA (número de acesso no Banco de Gene de D00694, REGION: 484.. 1383) foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Escherichia coli usando um iniciador direto com a sítio de restrição SaeII e um iniciador inverso com um sítio de restrição Saci. O produto de PCR amplificado foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição SaeII e Saci, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de aproximadamente 0,9 kb foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição SacIl e SacI de pMBI, posicionando deste modo o gene ispA 3' de idi e o operon MevB, e dando plasmídeo de expressão pMBIS (veja Patente U.S. Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pMBIS-gpp^ foi derivado de plasmídeo de expressão pMBIS pela substituição da seqüência codificadora ispA por uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma geranil- difosfato-sintase ("gpps")-\Jm fragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma geranil-difosfato-sintase foi gerada sinteticamente usando a seqüência codificadora do gene gpps de Arabidopsis thalicma (número de acesso no Banco de Gene de Yl7376, REGION: 52.. 1320), códon-otimizada para expressão em Escherichia coli, como um modelo (SEQ ID NO: 2). A seqüência de nucleotídeos foi flanqueada por um sítio de restrição líder SacII e um sítio de restrição terminal Saci, e assim pôde ser clonada nos sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pACYC ou pUC padrão. A seqüência de geranil-difosfato-sintase sinteticamente gerada foi isolada por digestão do construto de síntese de DNA até completitude usando enzimas de restrição SacII e Saci, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de restrição SacII SacI de plasmídeo de expressão pMBIS, dando plasmídeo de expressão pMBIS-gp/w. Exemplo 2

Este exemplo descreve métodos para preparar vetores de expressão codificadores de enzimas incluindo enzimas da via MEV de Staphilococcus aureus organizados em operons. Plasmídeo de expressão pAM41 foi derivado de plasmídeo de

expressão pAM25 por substituição da seqüência codificadora do gene HMGl, que codifica a Saccharomyees eerevisiae HMG-CoA redutase, pela seqüência codificadora do gene mvaA, que codifica a Staphilococcus aureus HMG-CoA redutase (número de acesso no Banco de Gene de BAOOOO17, REGION: 2688925..2687648). A seqüência codificadora do gene mvaA foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Staphilococcus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores 4-49 mvaA SpeI (SEQ ID NO: 11) e 4-49 mvaAR XbaI (SEQ ID NO: 12), o fragmento de DNA amplificado foi digerido até completitude usando enzima de restrição SpeI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb foi extraído do gel. A seqüência codificadora HMGl foi removida de pAM25 por digestão do plasmídeo até completitude usando enzima de restrição HindIII. As projeções terminais do fragmento de DNA linear resultante foram cegadas usando T4 DNA polimerase. O fragmento de DNA foi então parcialmente digerido usando enzima de restrição SpeI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de 4,8 kb foi extraído do gel. O fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de mvaA PCR SpeI-à\gQÚào, dando plasmídeo de expressão pAM41.

Plasmídeo de expressão pAM52 foi derivado de plasmídeo de expressão pAM41 por substituição da seqüência codificadora do gene ERGl3, que codifica a Saccharomyces eerevisiae HMG-CoA sintase, pela seqüência codificadora do gene mvaS, que codifica a Staphilococcus aureus HMG-CoA sintase (número de acesso no Banco de Gene de BAOOOO17, REGION: 2689180..2690346). A seqüência codificadora do gene mvaS foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Staphiloccoccus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores HMGS 5' Sa mvaS-S (SEQ ID NO: 13) e HMGS 3' Sa mvaS-AS (SEQ ID NO: 14), e o fragmento de DNA amplificado foi usado como um iniciador de PCR para substituir a seqüência codificadora do gene HMGl em pAM41 de acordo com o método de Geiser et al. (.BioTeehniques 31:88-92 (2001)), dando plasmídeo de expressão pAM52. Exemplo 3

Este exemplo descreve métodos para preparar plasmídeos de expressão que codificam enzimas incluindo enzimas da via DXP de Eseheriehia eoli organizados em operons.

Plasmídeo de expressão pAM408 foi gerado pela inserção genes codificadores de enzimas da via "top" DXP no vetor pAM29. Enzimas da via "top" DXP incluem l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (codificada pelo gene dxs de Eseherichia eoli), l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (codificada pelo gene dxr de Eseheriehia eoli), 4-difosfo- citidil-2C-metil-D-eritritol sintase (codificada pelo gene ispD de Eseheriehia eoli), e 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol sintase (codificada pelo gene ispE de Eseheriehia eoli), que juntas transformam piruvato e D-gliceraldeído- 3-fosfato em 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato. Fragmentos de DNA compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam enzimas da via "top" DXP foram gerados por amplificação por PCR de seqüências codificadoras de dxs (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION: 437539..439401), dxr (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION: 193521.. 194717), ispD (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION: 2869803..2870512), e IspE (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION 1261249.. 1262100) genes de Escherichia coli cepa DHl (ATCC #33849) com seqüências de Shine Dalgarno ótimas adicionadas e sítios de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR mostrados em SEQ ID NOs: 15 até 22. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, extraídos de gel, digeridos até completitude usando enzimas de restrição apropriadas (XhoI e KpnI para o produto de PCR compreendendo o gene dxs; KpnI e ApaI para o produto de PCR compreendendo o gene dxr; ApaI e NdeI para o produto de PCR compreendendo o gene ispD; NdeI e MluI para o produto de PCR compreendendo o gene ispE), e purificados usando o kit de purificação de PCR (Qiagen, Valencia, CA). Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto de PCR foram então adicionadas em uma reação de ligação para montar os genes individuais em um operon. Desta reação de ligação, 1 \\L de mistura reacional foi usado para amplificar por PCR dois cassetes de gene separados, a saber os cassetes de gene dxs-dxr e ispD-ispE. O cassete de gene dxs-dxr foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-IA-C (SEQ ID NO: 15) e 67-1D-C (SEQ ID NO: 18), e o cassete de gene ispD-ispE foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-IE-C (SEQ ID NO: 19) e 67-IH- C (SEQ ID NO: 22). Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, e extraídos do gel. O produto de PCR compreendendo o cassete de gene dxs-dxr foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição XhoI e ApaI, e o produto de PCR compreendendo o cassete de gene ispD-ispE g foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição ApaI e MluI. Os dois produtos de PCR foram purificados, e os fragmentos de DNA purificados foram ligados no sítio de restrição SalI MluI do vetor pAM29, dando plasmídeo de expressão pAM408 (veja Figura 4A para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeo de expressão pAM409 foi gerado pela inserção genes codificadores de enzimas da via "de fiindo" DXP no vetor pAM369. Enzimas da via "de fundo" DXP incluem 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclo- difosfato sintase (codificada pelo gene ispF de Escherichia colí), l-hidróxi-2- metil-2-(E)-butenil-4-difosfato sintase (codificada pelo gene ispG de Escherichia colí), e isopentenil/dimetil-alil difosfato sintase (codificada pelo gene ispH de Eseheriehia colí), que juntas transformam 4-difosfo-citidil-2C- metil-D-eritritol-2-fosfato em IPP e DMAPP. IPP também é convertido em DMAPP até a atividade de isopentil difosfato isomerase (codificada pelo gene gene idi de Escherichia colí). DMAPP pode ser adicionalmente convertido em FPP até a atividade de uma farnesil difosfato sintase (tal como codificada pelo gene ispA de Escherichia colí). Um operon codificador de enzimas da via "de fundo" DXP bem como uma isopentil difosfato isomerase e uma farnesil difosfato sintase foi gerado por amplificação por PCR os genes LspF (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION: 2869323..2869802), ispG (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION: 2638708..2639826), ispH (número de acesso no Banco de Gene de U00096 REGION: 26277.-27227), idi (número de acesso no Banco de Gene de AFl 19715), e ispA (número de acesso no Banco de Gene de D00694 REGION: 484.. 1383) de Escherichia coli cepa DHl (ATCC #33849) com seqüências de Shine Dalgarno ótimas adicionadas e sítios de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR mostrados em SEQ ID NOs: 23 até 32. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, extraídos do gel, digeridos com as enzimas de restrição apropriadas (BamHI e ApaI para o produto de PCR compreendendo o gene ispF; KpnI e ApaI para o produto de PCR compreendendo o gene ispG; SalI e KpnI para o produto de PCR compreendendo o gene ispH; SalI e HindlII para o produto de PCR compreendendo o gene idi\ HindlII e NcoI para o produto de PCR compreendendo o gene ispA), e purificados. Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto de PCR foram então adicionadas em uma reação de ligação para montar os genes individuais em um operon. Desta reação de ligação, 1 μΐ, de mistura reacional foi usado para amplificar por PCR dois cassetes de gene separados, a saber os cassetes de gene ispF-ispG e ispH-idi- íspA. O cassete de gene ispF-ispG foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-2A-C (SEQ ID NO: 23) e 67-2D-C (SEQ ID NO: 26), e o cassete de gene ispH-idi-ispA foi amplificado por PCR usando iniciadores 67- 2E-C (SEQ ID NO: 27) e 67-2J-C (SEQ ID NO: 32). Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, e extraídos do gel. O produto de PCR compreendendo o cassete de gene ispF-ispG foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição BamHI e KpnI, e o produto de PCR compreendendo o cassete de gene ispH-idi- ispA foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição KpnI e NcoI. Os dois produtos de PCR foram purificados. Vetor pAM369 foi criado pela montagem da origem de replicação pl5A de pAM29 e gene beta-lactamase para resistência à ampicilina de pZE12-luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203- 1210) com um promotor oligonucleotídeo-gerado IacUW5. Os dois produtos de PCR isolados contendo o operon da via "de fundo" DXP foram ligados no sítio de restrição BamHI NeoI do vetor pAM369, dando plasmídeo de expressão pAM409 (veja Figura 4B para um mapa de plasmídeo). Plasmídeo de expressão pAM424, um derivado de plasmídeo

de expressão pAM409 contendo a origem de replicação RK2 de amplo espectro de hospedeiro, foi gerado pela transferência do Iae UV5 promoter e o operon ispFGH-ídi-ispA de pAM409 no vetor pAM257. Vetor pAM257 foi gerado como segue: o locus RK2 par foi amplificado por PCR de DNA plasmídeo RK2 (Meyer et ai. (1975) Science 190:1226-1228) usando iniciadores 9-156A (SEQ ID NO: 33) e 9-156B (SEQ ID NO: 34), o produto de PCR de 2,6 kb foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição AatlI e XhoI, e o fragmento de DNA foi ligado em um plasmídeo contendo a origem de replicação pl5 e o gene concedente de resistência a cloranfenicol de vetor pZA31-luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210), dando plasmídeo pAM37-par; pAM37-par foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição SacI e HindlII, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA compreendendo o locus RK2par e o gene de resistência a cloranfenicol foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio SaeI HindlII de mini-RK2 replicon pRRIO (Roberts et ai. (1990) J Baeteriol. 172:6204-6216), dando vetor pAM133; pAM133 foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição BglII e HindlII, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 6,4 kb faltante do gene de resistência à ampicilina e origem conjugativa oriT foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado com um fragmento de DNA sinteticamente gerado compreendendo um sítio de clonagem múltipla que continha sítios de restrição PeiI eXhol, dando vetor pAM257. Plasmídeo de expressão pAM409 foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição XhoI e PeiI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,4 foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição XhoI PeiI do vetor pAM257, dando plasmídeo de expressão pAM424 (veja Figura 4C para um mapa de plasmídeo). Exemplo 4

Este exemplo descreve métodos para preparar vetores para a integração selecionada de ácidos nucleicos codificadores de enzimas incluindo enzimas da via MEV em localizações cromossômicas específicas de Saccharomyees eerevisiae. DNA genômico foi isolado de Saccharomyees eerevisiae cepas

Y002 (CEN.PK2 background; MATA; ura3-52; trpl-289; leu2-3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2), Y007 (S288C background MATA trplA63), Y051 (S288C background; MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0 Pgal1 -HMGlxsu' 3323 Pgali-upc2-1 erg9::Pmet3-ERG9::HIS3 PGal1-ERG20 PGal,-HMG11586'3323) e EG123 (MATA ura3; trpl; leu2; his4 canl). As cepas foram crescidas durante a noite em meio líquido contendo 1% de extrato de levedo, 2% de peptona-Bacto, e 2% de dextrose (meio YPD). Células foram isoladas de 10 mL de culturas líquidas por centrifugação a 3.100 rpm, lavagem das pelotas celulares em 10 mL de água ultra-pura, e re-centrifiigação. DNA genômico foi extraído usando the kit de extração de DNA de levedura Y-DER (Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico extraído foi ressuspenso em 100 μΕ 10 mM Tris- Cl, pH 8,5, e leituras de OD260/280 foram obtidas em um espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) para determinar a pureza e a concentração de DNA genômico.

Amplificação de DNA por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um Applied Biosystems 2720 Thermocycler (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) usando o sistema Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Com a completitude da amplificação por PCR de um fragmento de DNA que era para ser inserido no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), projeções de nucleotídeo A foram criadas pela adição de 1 \iL de Qiagen Taq Polimerase (Qiagen, Valencia, CA) na mistura reacional e realização de uma etapa de extensão de PCR a 72°C, de 10 minutos adicionais, seguida pelo esfriamento para 4°C. Com a completitude de uma amplificação por PCR, 8 \iL de uma solução de glicerol50% foram adicionados na mistura de reação, e a mistura inteira foi carregada sobre um gel de agarose com 1% de TBE (Tris 0,89 M, Ácido Bórico 0,89 M, EDTA sal de sódio 0,02 M) contendo 0,5 μg /mL de brometo de etídio.

Eletroforese em gel de agarose foi realizada a 120 V, 400 mA por 30 minutos, e Bandas de DNA foram visualizadas em luz ultravioleta. Bandas de DNA foram excisadas do gel com uma lâmina de barbear estéril, e ο DNA excisado foi purificado do gel usando o Kit de Recuperação de DNA de Gel Zymoclean (Zymo Research, Orange, CA) de acordo com protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA purificado foi eluído em 10 \iL de água ultra-pura, e leituras de OD26o/28o foram obtidas em um espectrofotômetro ND-1000 para determinar a pureza e a concentração de DNA.

Ligações foram realizadas usando 100-500 μg de produto de PCR purificado e T4 DNA Ligase de Concentração Alta (New England Biolabs, Ipswich, MA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Para propagação de plasmídeo, construtos ligados foram transformados em células quimicamente competentes de Escherichia coli DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Transformantes positivos foram selecionados sobre meios sólidos contendo 1,5% de Ágar Bacto, 1% de Triptona, 0,5% de extrato de levedo, 1% de NaCl, e 50 μg /mL de um antibiótico apropriado. Transformantes isolados foram crescidos por 16 horas em meio líquido LB contendo 50 μg /mL de antibiótico carbenicilina ou canamicina a 37°C, e plasmídeo foi isolado e purificado usando um QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Construtos foram verificados por realização de digestões diagnosticas por enzima de restrição, resolvendo os fragmentos de DNA sobre um gel de agarose, e visualizando as bandas usando luz ultravioleta. Construtos selecionados também foram verificados por seqüenciamento de DNA, que foi feito por Elim Biopharmaceuticals Inc. (Hayward, CA).

Plasmídeo pAM489 foi gerado pela inserção do inserto ERG20- PcAL-tHMGR de vetor pAM471 no vetor pAM466. Vetor pAM471 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG20-PcAL-tHMGR, que compreende a matriz de leitura aberta (ORF) de ERG20 (posições de nucleotídeo de ERG20 1 a 1208; A de códon de iniciação ATG é nucleotídeo 1) (ERG20), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (PGal)· e uma ORF truncada de HMGl (posições de nucleotídeo de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vetor pAM466 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA TRpi"856 a +548 que compreende um segmento do locus TRPl de tipo selvagem de Saccharomyces eerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -856 até a posição 548 e hospeda um sítio de restrição interno não-nativo XmaI entre bases -226 e -225, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fragmentos de DNA ERG20-PGAL-tHMGR e TRPl"856 a 4 548 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 1. Para a construção de pAM489, 400 ng de pAM471 e 100 ng de pAM466 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI (New England Biolabs, Ipswich, MA), fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG20-PGAL-tHMGR e o vetor pAM466 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando pAM489 (veja Figura 5A para um mapa e SEQ ID NO: 3

para a seqüência de nucleotídeos do inserto ERG20-PGAL-tHMGR).

Tabela 1 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM489 Rodada de PCR Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de PCR 1 100 ng de DNA genômico Y051 61-67-CPK001-G (SEQ ID NO:35) 6I-67-CPK002-G (SEQ ID NO: 36) yJ^p ι -856 a -Ilb 61-67-CPK003-G (SEQ ID NO:37) 61-67-CPK004-G (SEQ ID NO: 38) TRPl a +548 100 ng de DNA genômico EG123 6I-67-CPK025-G (SEQ ID NO: 59) 61-67-CPK050-G (SEQ ID NO: 67) ERG20 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK051-G (SEQ ID NO: 68) 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: 69) PGAL 61-67-CPK053-G (SEQ ID NO: 70) 6I-67-CPK031-G (SEQ ID NO: 60) tHMGR 2 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados TRPr"856 a "226and TRPr"225 a +548 61-67-CPK001-G (SEQ ID NO: 37) 61-67-CPK004-G (SEQ ID NO: 38) JJ^ ρ j -856 a +548 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG20 e PGal 61-67-CPK025-G (SEQ ID NO: 59) 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: 69) ERG20-PGal 3 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG20-PGal e tHMGR 61-67-CPK025-G (SEQ ID NO: 59) 61-67-CPK031-G (SEQ ID NO: 60) ERG20-PGal- tHMGR

Plasmídeo pAM491 foi gerado pela inserção o inserto ERG

13-PGAL-tHMGR de vetor pAM472 no vetor pAM467. Vetor pAM472 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG13-PGAL-tHMGR, que compreende a ORF de ERG13 (posições de nucleotídeo de ERG13 1 a 1626) (ERG13), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -Ia -668) (Pgal)j e uma ORF truncada de HMGl (posição de nucleotídeo de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), no sítio de restrição XmaI de Vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM467 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA URA3"723 a

701

, que compreende um segmento do locus de tipo selvagem URA3 de Saccharomyces eerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -723 até a posição -224 e hospeda um sítio de restrição interno não-nativo XmaI entre bases -224 e -223, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA ERG13 -PcAL-tHMGR e URA3"723 a701 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 2. Para a construção de pAM491, 400 ng de pAM472 e 100 ng de pAM467 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG13-P gal-íHMGR e o vetor pAM467 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando pAM491 (veja Figura 5B para um mapa e SEQ ID NO: 4 para a seqüência de nucleotídeos

do inserto ERG13-PGAL-tHMGR).

Tabela 2 - Amplifícações por PCR realizadas para gerar pAM491 Rodada de PCR Modelo Iniciador I Iniciador 2 Produto de PCR 1 100 ng de DNA genômico Y007 61-67-CPK005-G (SEQ ID NO:39) 61-67-CPK006-G (SEQ ID NO: 40) URA3a ■ 224 61-67-CPK007-G (SEQ ID NO: 41) 61-67-CPK008-G (SEQ ID NO: 42) URA3"/ZJ a 701 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK032-G (SEQ ID NO: 61) 61-67-CPK054-G (SEQ ID NO: 71) ERG13 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: 69) 61-67-CPK055-G (SEQ ID NO: 72) Pgal 61-67-CPK031-G (SEQ ID NO: 60) 61-67-CPK053-G (SEQ ID NO: 70) tHMGR 2 IOOng de cada um de produtos de PCR purificados URA3"723 a 224 e URA3 223 a701 61-67-CPK005-G (SEQ ID NO: 39) 61-67-CPK008-G (SEQ ID NO: 42) URA3-'" a 701 100 ng de cada um de ERGO e Pgal produtos de PCR purificados 61-67-CPK032-G (SEQ ID NO: 61) 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: 69) ERG13-PGal 3 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG13-Pgal e tHMGR 61-67-CPK031-G (SEQ ID NO: 60) 61-67-CPK032-G (SEQ ID NO: 61) ERGl 3- Pgal" tHMGR Plasmídeo pAM493 foi gerado pela inserção o inserto IDIl- Pgal-íHMGR de vetor pAM473 no vetor pAM468. Vetor pAM473 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA IDIl-Pgal-tHMGR, que compreende a ORF de IDI 1 (posição de nucleotídeo de IDIl 1 a 1017) (IDIl)9 o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (PGal), e uma ORF truncada de HMGl (posições de nucleotídeo de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM468 foi gerado pela inserção de

fragmento de DNA ADEl

-825 a 653

, que corresponde a um segmento do locus

de tipo selvagem ADEl de Saccharomyces eerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -225 até a posição 653 e hospeda um sítio de restrição interno não-nativo Xmal entre bases -226 e -225, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA IDIl-PGAL-tHMGR e ADEl"825 a 653 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 3. Para a construção de pAM493, 400 ng de pAM473 e 100 ng de pAM468 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto IDIl-Pgal-tHMGR e o vetor pAM468 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando vetor pAM493 (veja Figura 5C para um mapa e SEQ ID

Tabela 3 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM493 Rodada de PCR Modelo Iniciador 1 Inieiador 2 Produto de PCR 1 100 ng de DNA genômico Y007 61-67-CPK009-G (SEQ ID NO: 43) 61-67-CPK010-G (SEQ ID NO: 44) ADEf825 a " 226 61-67-CPK011-G (SEQ ID NO: 45) 61-67-CPK012-G (SEQ ID NO: 46) ADEl-225 a 653 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK047-G (SEQ ID NO: 66) 61-67-CPK064-G (SEQ ID NO: 81) IDIl 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: 69) 61-67-CPK065-G (SEQ ID NO: 82) Pgal 61-67-CPK031-G (SEQ ID NO: 60) 61-67-CPK053-G (SEQ ID NO: 70) tHMGR 2 100 ng de cada Utn de produtos de PCR purificados ADEl 825 a 226 e ADEl225a653 61-67-CPK009-G (SEQ ID NO: 43) 61-67-CPK012-G (SEQ ID NO: 46) ADEl"825 a 653 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados IDIl e Pgal 61-67-CPK047-G (SEQ ID NO: 66) 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: 69) IDII-Pgal 3 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados IDIl -Pgal e tHMGR 61-67-CPK031-G (SEQ ID NO: 60) 61-67-CPK047-G (SEQ ID NO: 66) IDII-Pgal- tHMGR

Plasmídeo pAM495 foi gerado pela inserção o inserto

ERGIO-Pgal-ERG 12 de pAM474 no vetor pAM469. Vetor pAM474 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG10-Pgal-ERG12, que compreende a ORF de ERG 10 (posição de nucleotídeo de ERG 10 1 a 1347) (ERG10), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (PGal), e a ORF de ERG 12 (posição de nucleotídeo ERG12 de 1 a 1482) (ERG12), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM469 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA HIS3"32 a 1000-HISMX- HIS3504 a -1103, que compreende dois segmentos do locus de tipo selvagem HIS de Saccharomyces eerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -32 até a posição -1000 e da posição de nucleotídeo 504 até a posição 1103, um marcador HISMX, e um sítio de restrição não-nativo XmaI entre a seqüência HIS3504 a ~1103 e o marcador HISMX, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA ERG10-PGal-ERG12 e HIS3"32 a 1000-HISMX- HIS3504 a"1103 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 4. Para construção de pAM495, 400 ng de pAM474 e 100 ng de pAM469 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG10- Pqal-ERG 12 e o vetor PAM469 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando vetor pAM495 (veja Figura 5D para um mapa e SEQ ID NO: 6 para a seqüência de nucleotídeos do inserto ERG10-Pgal-ERG12). Tabela 4 - Reações PCR realizadas para gerar pAM495 Rodada de PCR Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de PCR 1 IOO ng de DNA genômico Y007 61-67-CPK013-G (SEQ ID NO:47) 61-67-CPKO 14alt- G (SEQ ID NO: 48) HIS3 32 a"10<JÜ 61-67-CPK017-G (SEQ ID NO:51) 61-67-CPKO 18-G (SEQ ID NO: 52) HIS35ü4a"1103 61-67-CPK035-G (SEQ ID NO:62) 61-67-CPK056-G (SEQ ID NO: 73) ERG10 61-67-CPK057-G (SEQ1DN0:74) 61-67-CPK058-G (SEQ ID NO: 75) Pqal 61-67-CPK040-G (SEQ ID NO: 63) 61-67-CPK059-G (SEQ ID NO: 76) ERG12 10 ng de plasmídeo pAM330 DNA** 61 -67-CPKO15alt-G (SEQ ID NO: 49) 61-67-CPKO 16-G (SEQ ID NO: 50) HISMX 2 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados HIS3504 a"1103 e HlSMX 61-67-CPKO 15alt-G (SEQ ID NO: 49) 61-67-CPKO 18-G (SEQ ID NO: 52) HISMX- HIS3504 a"n03 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG 10ePgal 61-67-CPK035-G (SEQ ED NO: 62) 61-67-CPK058-G (SEQ ID NO: 75) ERGlO-P0al 3 IOOng de cada um de produtos de PCR purificados HIS3"32 a -,00° e HISMX- HIS3504 a"U03 61-67-CPKO 13-G (SEQ ID NO: 47) 61-67-CPKO 18-G (SEQ ID NO: 52) HIS3 32 a lüuü HISMX HIS3504 103 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG IO-P0ALeERG 12 61-67-CPK03 5-G (SEQ ID NO: 62) 61-67-CPK040-G (SEQ ID NO: 63) ERGIO-Pgal- ERG12 ** O marcador HISMX em pAM330 originado de pFA6a-HISMX6-PGALl como descrito por van Dijker et ai. ((2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706-714)

Plasmídeo pAM497 foi gerado pela inserção o inserto ERG8-

Pgal-ERG 19 de pAM475 no vetor pAM470. Vetor pAM475 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG8-PGal-ERG19, que compreende a ORF de ERG8 (posição de nucleotídeo de ERG8 de 1 a 1512) (ERG8), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (Pqal), e a ORF de ERG19 (posição de nucleotídeo de ERG19 de 1 a 1341) (ERG19), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM470 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA LEU2"lü0a4S0-HISMX- LEU21096 a 17?0, que compreende dois fragmentos do locus de tipo selvagem LEU2 de Saccharomyces eerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo - 100 até a posição 450 e da posição de nucleotídeo 1096 até a posição 1770, um marcador HISMX, e um sítio de restrição não-nativo XmaI entre a seqüência LEU2i096a 1770 e Q marcador HISMX, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA ERG8-PGal-ERG19 e LEU2"100a450-fflSMX- LEU21096 a1770 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 5. Para a construção de pAM497, 400 ng de pAM475 e 100 ng de pAM470 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG8-PGAl-ERG19 e o vetor pAM470 linearizado foram purificados, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando vetor pAM497 (veja Figura 5E para um mapa e SEQ ID NO: 7 para a seqüência de nucleotídeos do inserto ERG8-Pgal-ERG 19).

Tabela 5 - Reações PCR realizadas para gerar pAM497 Rodada de PCR Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de PCR 1 100 ng de DNA genômico Y007 61-67-CPK019- G (SEQ ED NO: 53) 61-67-CPK020-G (SEQ ID NO: 54) LEUr1uua45u 61-67-CPK023- G (SEQ ID NO: 57) 61-67-CPK024-G (SEQ ID NO: 58) leu2l0»6al770 10 ng de plasmídeo pAM330 DNA ** 61-67-CPK021- G (SEQ ID NO: 55) 61-67-CPK022-G (SEQ ID NO: 56) HISMX 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK041- G (SEQ ID NO: 64) 61-67-CPK060-G (SEQ ID NO: 77) ERG 8 61-67-CPK061- G (SEQ ID NO: 78) 61-67-CPK062-G (SEQ ID NO: 79) Pgal 61-67-CPK046- G (SEQ ID NO: 65) 61-67-CPK063-G (SEQ ID NO: 80) ERG19 2 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados LEU21096 a 1770 e HISMX 61-67-CPK021- G (SEQ ID NO: 55) 61-67-CPK024-G (SEQ ID NO: 58) HISMX- LEU21096 3 1770 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG8 e Pgal 61-67-CPK041- G (SEQ ID NO: 64) 61-67-CPK062-G (SEQ ID NO: 79) ERG8-PGal 3 100 ng de produtos de PCR purificados LEU2"100 a 450 e HISMX- LEU21096 3 1770 61-67-CPK019- G (SEQ ID NO: 53) 6I-67-CPK.024-G (SEQ ID NO: 58) LEU2"'00 a 4SU- HISMX- leu21096 al770 100 ng de cada um de produtos de PCR purificados ERG8-Pgal e ERG 19 61-67-CPK041- G (SEQ ID NO: 64) 61-67-CPK046-G (SEQ ID NO: 65) ERG8-Pgal- ERG19 ** O marcador HISMX em pAM330 originado de pFA6a-HISMX6-PGALl como descrito por van Dijker et ai. ((2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706-714) Exemplo 5

Este exemplo descreve métodos para preparar plasmídeos de expressão que codificam enzimas que convertem GPP.

Plasmídeo de expressão pTrc99A-APS foi gerado pela inserção uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma α-pineno sintase ("APS") no vetor pTrc99A. O inserto da seqüência de nucleotídeos foi gerado sinteticamente, usando como um modelo a seqüência codificadora de the a- pineno sintase gene de ρinus taeda (número de acesso no Banco de Gene de AF543530 REGION: 1..1887), códon-otimizada para expressão em Escherichia coli (SEQ ID No:8). A seqüência codificadora foi fraqueada por um sítio de restrição líder XmaI e um sítio de restrição terminal XbaI. O ácido nucleico sintético foi clonado nos sítios de enzima de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pACYC ou pUC padrão, do qual foi liberado de novo por digestão do construto de síntese de DNA até completitude usando enzimas de restrição NcoI e XmaI, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, e extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 1,9 kb codificador de terpeno sintase. O fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição Xmal XbaI de vetor pTrc99A (Amman et al., Gene 40:183-190 (1985)), dando plasmídeo de expressão pTrc99A- APS (veja Figura 6 para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeos de expressão pTrc99A-BPS, pTrc99A-CS, e pTrc99A-SS são geralmente gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma p-pineno sintase ("BPS"), careno sintase ("CS"), ou sabinina sintase ("SS"), respectivamente, no vetor pTrc99A. O inserto de seqüência de nucleotídeos é gerado sinteticamente, usando como um modelo por exemplo a seqüência codificadora da β-pineno sintase de Artemisia annua (número de acesso no Banco de Gene de AF276072 REGION: 1.. 1749), a seqüência codificadora do gene de careno sintase de Salvia stenophilla (número de acesso no Banco de Gene de AF527416 REGION: 78..1871), ou a seqüência codificadora do gene de sabinina sintase de Salvia officinalis (número de acesso no Banco de Gene de AF051901 REGION: 26.. 1798). As seqüências de nucleotídeos codificadora de p-pineno e sabinina sintases são flanqueadas por um sítio de enzima de restrição líder XmaI um sítio de enzima de restrição terminal XbaI, e as seqüências de nucleotídeos codificadoras da careno sintase são flanqueadas por um sítio de enzima de restrição líder NcoI e um sítio de enzima de restrição terminal XmaL Os construtos de síntese de p-pineno e sabinina sintase DNA são digeridos até completitude usando enzimas de restrição Xmal e XbaI, e o construto de síntese careno sintase DNA é digerido até completitude usando e enzimas de restrição XmaI. A mistura reacional é resolvida por eletroforese em gel, os fragmentos de DNA de aproximadamente 1,7 a 1,8 kb são extraídos do gel, e os fragmentos de DNA isolados são ligados no sítio de restrição Xmal XbaI (para os insertos de β-pineno e sabinina sintase) ou o sítio de restrição NcoI XmaI (para o inserto careno sintase) do vetor pTrc99A, dando plasmídeo de expressão pTrc99A-BPS, pTrc99A-CS, ou pTrc99A-SS (veja Figura 6 para mapas de plasmídeo).

Plasmídeo de expressão pRS425-leu2d-APS, pRS425-leu2d- BPS, pRS425-leu2d-CS, e pRS425-leu2d-SS são geralmente gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma a-pineno sintase ("APS"), uma p-pineno sintase ("BPS"), uma careno sintase ("CS"), ou uma sabinina sintase ("SS"), respectivamente, ligados nos promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (Pgal)· no vetor pRS425-leu2d. Vetor pRS425-leu2d foi gerado por amplificação por PCR do gene leu2 de pAM178 (SEQ ID NO: 10) usando iniciadores PW-91-079-CPK373-G (SEQ ID NO: 87) e PW-79-079-CPK374- G (SEQ ID NO: 88), e a estrutura principal de vetor pRS425 (número de acesso no Banco de Gene de U03452) usando iniciadores PW-91-079- CPK376-G (SEQ ID NO: 89) e PW-79-079-CPK375-G (SEQ ID NO: 90), resolvendo as misturas reacionais por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de gene leu2 de aproximadamente 1,6 kb e a estrutura principal de vetor pRS425 de aproximadamente 4,6 kb, tratando os fragmentos de DNA com T4 cinase para adicionar grupos fosfato terminais, e ligando os dois fragmentos de DNA. O inserto de seqüência de nucleotídeos é gerado sinteticamente, usando como um modelo por exemplo a seqüência codificadora do gene de α-pineno sintase de ρinus taeda (número de acesso no Banco de Gene de AF543530 REGION: 1..1887), a seqüência codificadora do gene de β-pineno sintase gene de Artemisia annua (número de acesso no Banco de Gene de AF276072 REGION: 1..1749), a seqüência codificadora do gene de careno sintase de Salvia stenophilla (número de acesso no Banco de Gene de AF527416 REGION: 78.. 1871), ou a seqüência codificadora do gene de sabinina sintase de Salvia officinalis (número de acesso no Banco de Gene de AF051901 REGION: 26.. 1798), cada seqüência codificadora sendo ligada nos promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (Pgal)· A seqüência de nucleotídeo tem terminais cegos, e assim pode ser clonada nos sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como vetor de origem ρACYC ou pUC padrão. A seqüência de PoAL-terpeno sintase sinteticamente gerada é isolada por digestão do construto de síntese de DNA até completitude usando enzima de restrição SmaI, a mistura reacional é resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 2,5 kb a 2,6 kb é extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado é ligado no sítio de restrição SmaI de vetor pRS425-leu2d, dando plasmídeo de expressão pRS425-leu2d-APS, pRS425-leu2d-BPS, pRS425- leu2d-CS, ou pRS425-leu2d-SS (veja Figura 7 para mapas de plasmídeo). Exemplo 6

Este exemplo descreve a geração de cepas hospedeiras de Escherichia eoli úteis na invenção.

Como detalhado em Tabela 6, cepas hospedeiras foram ou são criadas por transformação de células parentais de Escherichia coli

quimicamente competentes com um ou mais plasmídeos de expressão de Exemplos 1 até 3 e Exemplo 5.

Tabela 6 - Cepas hospedeiras de Escherichia coli Cepa Hospedeira Cepa Parental de E.coli Plasmídeos de expressão Seleção de Antibiótico 1 DHl pMevT pMBIS-gpyw pTrc99A-APS 100 μβ /mL de carbenicilina34 μg /mL de cloranfenicol5 μg /mL de tetraciclina 2 pMevT pMBIS-gp/w pTrc99A-BPS 3 pMevT pMBIS-g/f/tt pTrc99A-CS 4 pMevT pMBIS-,g/>/« pTrc99A-SS pAM408 pAM424 pTrc99A-APS 100 μ^ηιί de carbenicilina50 μg /mL de canamicina35 μg/mL de cloranfenicol 6 pAM408 pAM424 pTrc99A-BPS 7 pAM408 pAM424 pTrc99A-CS 8 pAM408 pAM424 pTrc99A-SS

Os transformantes de célula hospedeira são selecionados sobre

ágar de Luria Bertoni (LB) contendo antibióticos. Colônias individuais são transferidas de ágar LB para tubos de cultura contendo 5 mL de meio líquido LB e antibióticos. As culturas são incubadas a 37°C em um agitador rotativo a 250 rpm até o crescimento alcançar a fase exponencial tardia. As células são adaptadas para meios mínimos pela passagem delas até 4 a 5 rodadas sucessivas de meios M9-MOPS contendo 0,8% de glicose e antibióticos (veja Tabela 7 para a composição do meio M9-MOPS). As células são armazenadas a -80°C em criofrascos em 1 mL de alíquotas de estoque composto de 400 μί de glicerol estéril 50% e 600 μί de cultura líquida. Tabela 7 - Composição do Meio de Cultura M9-MOPS Componente Quantidade (por L) Na2HPO4 7H20 12,8 g KH2PO4 3g NaCl 0,5 g NH4Cl Ig MgSO4 2 mmol CaCl2 0,1 mmol Tiamina 0,1 Hg Tampão MOPS pH 7,4 100 mmol (NH3)6Mo7O2^H2O 3,7 Hg H3BO4 25 Hg CoCl2 7,1 Hg CuSO4 2,4 Hg MnCl2 16 Hg ZnSO4 2,9 Hg FeSO4 0,28 mg

Exemplo 7

Este exemplo descreve a geração decepas de Saccharomyces eerevisiae úteis na invenção.

Saceharomyces eerevisiae cepas CEN.PK2-1C (Y002)

(MATA; ura3-52; trpl-289; leu2-3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) e CEN.PK2-1D (Y003) (MATalfa; ura3-52; trpl-289; Ieu2-3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) (van Dijken et al. (2000) Enzyme Mierob. Teehnol 26(9- 10):706-714) foram preparadas pela introdução de genes de via MEV induzíveis pela substituição do promotor ERG9 pelo promotor MET3 de Saccharomyees eerevisiae, e a ADEl ORF pelo gene Candida glabrata LEU2 (CgLEU2). Isto foi feito por amplificação por PCR da região KanMX-PMET3 de vetor pAM328 (SEQ ID NO: 9) usando iniciadores 50-56-pwl00-G (SEQ ID NO: 85) e 50-56-pwl01-G (SEQ ID NO: 86), que incluem 45 pares de bases de homologia com o promotor nativo ERG9, transformando 10 μg de produto de PCR resultante em células Y002 e Y003 crescendo exponencialmente usando Poli(etileno-glicol) 3350 40% de p/p (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), Acetato de Lítio 100 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e 10 μg de DNA de Esperma de Salmão (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), e incubando as células a 3 0°C por 30 minutos seguido por choque calorífico delas a 42°C por 30 minutos (Schiestl e Gietz. (1989) Curr. Genet. 16,339-346). Recombinantes positivos foram identificados por sua capacidade para crescerem em meio rico contendo 0,5 μg ImL de Geneticina (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), e colônias selecionadas foram confirmadas por PCR diagnostica. Os clones resultantes receberam as designações Y93 (ΜΑΤ A) e Y94 (ΜΑΤ alfa). O locus genômico CgLEU2 de 3,5 kb foi então amplificado de DNA genômico de Candida glabrata (ATCC, Manassas, VA) usando iniciadores 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 83) e 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 84), que contêm 50 pares de bases de homologia de flanco à ADEl ORF, e 10 μg de produto de PCR resultantes foram transformados em células Y93 e Y94 crescendo exponencialmente, recombinantes positivos foram selecionados para crescimento na ausência de suplementação de leucina, e clones selecionados foram confirmados por PCR diagnostica. Os clones resultantes receberam as designações Yl76 (ΜΑΤ A) e Yl77 (ΜΑΤ alfa).

Cepa Yl 88 foi então gerada por digestão de 2 μg de DNA plasmídeo pAM491 e pAM495 até completitude usando enzima de restrição PmeI (New England Biolabs, Beverly, MA), e introduzindo os insertos de DNA purificados nas células Yl 76 crescendo exponencialmente. Recombinantes positivos foram selecionados para crescimento sobre meio faltante de uracila e histidina, e integração no locus genômico correto foi confirmado por PCR diagnostica.

Cepa Yl89 foi logo a seguir gerada por digestão de 2 μg de DNA plasmídeo pAM489 e pAM497 até completitude usando enzima de restrição PmeI, e introduzindo os insertos de DNA purificados em células Yl 17 crescendo exponencialmente. Recombinantes positivos foram selecionados para crescimento sobre meio faltante de triptofano e histidina, e integração no locus genômico correto foi confirmado por PCR diagnostica. Aproximadamente 1 X IO7 células de cepas Yl88 e Il 89 foram misturadas sobre uma placa de meio YPD por 6 horas na temperatura ambiente para permitir acasalamento. A cultura de célula mista foi plaqueada em meio faltante de histidina, uracila, e triptofano para selecionar para crescimento de células diplóides. Cepa Y238 foi gerada por transformação de células diplóides usando 2 de pAM493 plasmídeo DNA que havia sido digerido até completitude usando enzima de restrição PmeI, e introduzindo o inserto de DNA purificado nas células diplóides crescendo exponencialmente. Recombinantes positivos foram selecionados para crescimento sobre meio faltante de adenina, e integração no locus genômico correto foi confirmado por PCR diagnostica.

Cepa haplóide Y211 (ΜΑΤ alfa) foi gerada por esporulação de cepa Y238 em meio líquido de Acetato de Potássio 2% e Rafinose 0,02%, isolando aproximadamente 200 tétrades genéticos usando um micromanipulador da série MSM300 da Singer Instrument (Singer Instrument LTD, Somerset, UK), identificando isolados genéticos independentes contendo o complemento apropriado de material genético introduzido por sua capacidade para crescer na ausência de adenina, histidina, uracila, e triptofano, e confirmando a integração de todo o DNA introduzido por PCR diagnostica.

Finalmente, cepas hospedeiras 9 até 12 são geradas pela transformação de cepa Y211 com plasmídeo de expressão pRS425-leu2d- APS, pRS425-leu2d-BPS, pRS425-leu2d-CS, ou pRS425-leu2d-SS. Transformantes de célula hospedeira são selecionados sobre meios sintéticos definidos, contendo 2% de glicose e todos aminoácidos exceto leucina (SM- glu). Colônias individuais são transferidas para frascos de cultura contendo 5 mL de SM-glu líquido faltante de leucina, e as culturas são incubadas por agitação a 3 O0C até crescimento alcançar fase estacionária. As células são armazenadas a -80°C em criofrascos em 1 mL de alíquotas congeladas compostas de 400 μΐ. de glicerol estéril 50% e 600 μί de cultura líquida. Exemplo 8

Este exemplo descreve a produção de α-pineno, P-pineno, careno, e sabinina via a via MEV em cepas hospedeiras de Escherichia coli.

Culturas de semente das cepas hospedeiras 1 até 4 são estabelecidas pela adição de uma alíquota de estoque de cada cepa em frascos de 125 mL separados contendo 25 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos como detalhado em Tabela 6, e pelo crescimento das culturas durante a noite. As culturas de semente são usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 mL separados contendo 40 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos. Culturas são incubadas a 30°C em um agitador rotativo a 250 rpm até alcançarem uma OD600 de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção do composto de interesse nas células hospedeiras é induzida pela adição de 40 μί de 1 MIPTG no meio de cultura. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração em solvente- solvente, ou por sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for suficientemente grande para saturar o meio e para formar uma segunda fase. Exemplo 9

Este exemplo descreve a produção de α-pineno, p-pineno, careno, e sabinina via a via DXP em cepas hospedeiras de Escheriehia coli.

Culturas de semente das cepas hospedeiras 5 até 8 são estabelecidas pela adição de uma alíquota de estoque de cada cepa em frascos de 125 mL separados contendo 25 mL de M9-MOPS, 0,8% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos como detalhado em Tabela 6, e pelo crescimento das culturas durante a noite. As culturas de semente são usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 mL separados contendo 40 mL de M9-MOPS, 45 μg /mL de Tiamina, micronutrientes, l,00E-5 mol/L FeSO4,MOPS 0,1 Μ, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos. Culturas são incubadas a 3O0C em um agitador incubador umidificado a 250 rpm até alcançarem uma OD600 de 0,2 a 0,3, em cujo ponto a produção do composto de interesse nas células hospedeiras é induzida pela adição de 40 μΐ, de 1 MIPTG no meio de cultura. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração em solvente-solvente, ou por sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for suficientemente grande para saturar o meio e para formar uma segunda fase. Exemplo 10

Este exemplo descreve a produção de α-pineno, P-pineno, careno, e sabinina em cepas hospedeiras de Saccharomyces eerevisiae.

Culturas de semente de cepas hospedeiras 9 até 12 são estabelecidas pela adição de alíquotas de estoque em frascos de 125 mL separados contendo 25 mL de SM-glu faltante de leucina, e crescimento de cada cultura durante a noite. A cultura de semente é usada para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 um frasco de 250 mL com defletor contendo 40 mL de meio sintético definido contendo 0,2% de glicose e 1,8%» de galactose, e faltante de leucina. A cultura é incubada a 30°C em um agitador rotativo a 200 rpm. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração em solvente-solvente, ou por sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for suficientemente grande para saturar o meio e para formar uma segunda fase. Exemplo 11

Este exemplo descreve a hidrogenação de α-pineno to pinano.

Em um vaso de reação, α-pineno e Pd 10%/C [paládio, 10% em peso sobre carbono ativado, Aldrich #205699] são adicionados em carregamento de 6 g/L. O vaso é fechado, purgado com gás nitrogênio, então evacuado sob vácuo doméstico. Para iniciar a reação, o vaso é agitado enquanto adiciona-se gás hidrogênio comprimido a 552 kPa (manométrico). A reação suavemente exotérmica prossegue na temperatura ambiente. Conversão final é 100%, marcada pelo final do consumo de hidrogênio e verificada por cromatografia a gás com detecção por ionização de chama. A mistura de produto-catalisador é separada via filtração por gravidade através de um gel de sílica 60 A e analisada com coluna Agilent DB-XLB e detector por ionização de chama. Exemplo 12

A composição de combustível (chamada de AMJ-400) compreendendo 98.7% de pinano é misturada com várias quantidades de jato A. Os componentes de AMJ-400 foram identificados por cromatografia gasosa/detector por ionização de chama (GC/FID). Os resultados de várias misturas para sua capacidade para atender ASTM D 1655 são mostrados em Figura 8: Jato A, 100% AMJ-400,50% AMJ-400 e 50% Jato A, e 20% AMJ- 400 e 80%) Jato A. Figura 9 mostra as curvas de destilação para um Jato A e certas misturas de jato A e AMJ-400.

As composições de combustível aqui descritas podem ser produzidas em uma maneira efetiva em termos de custo e ambientalmente benéfica. Vantajosamente, os compostos bicíclicos isoprenóides Cjo usados nas composições de combustível aqui podem ser produzidos por um ou mais microorganismos. Estes compostos bicíclicos isoprenóides Ci0 assim podem proporcionar uma fonte de energia renovável para combustíveis de jato ou diesel, em particular as composições de combustível aqui proporcionadas. Ademais, estes compostos bicíclicos isoprenóides Cio podem diminuir a dependência de fontes de combustível não renováveis, componentes de combustível e/ou aditivos de combustível. Em certas modalidades, a composição de combustível aqui proporcionada compreende um carano, pinano, e sabinano bioengenheirado.

Embora a invenção tenha sido descrita com respeito a um número limitado de modalidades, as características específicas de uma modalidade não devem ser atribuídas a outras modalidades da invenção. Nenhuma modalidade individual é representativa de todos os aspectos do assunto reivindicado. Em algumas modalidades, as composições ou os métodos podem incluir numerosos compostos ou numerosas etapas aqui não mencionados(as). Em outras modalidades, as composições ou os métodos não incluem, ou estão substancialmente livres de, quaisquer compostos ou etapas não aqui enumerados(as). Existem variações e modificações das modalidades descritas. Deve ser notado que a aplicação das composições de combustível de jato aqui mostradas não é limitada aos motores a jato; podem ser usadas em qualquer equipamento que exige um combustível de jato. Embora haja especificações para a maioria dos combustíveis de jato, nem todas as composições de combustível de jato aqui mostradas necessitam atendem todas as exigências nas especificações. É notado que os métodos para preparar e usar as composições de combustível de jato aqui mostradas são descritos com referência a numerosas etapas. Estas etapas podem ser praticadas em qualquer seqüência. Uma ou mais etapas podem ser omitidas ou combinadas mas ainda alcançam substancialmente os mesmos resultados. As reivindicações anexadas intencionam cobrir todas tais variações e modificações que caem dentro do escopo da invenção.

Todas as publicações e todos os pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referências na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência. Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente evidente para aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas na mesma sem se desviarem do espírito ou do escopo das reivindicações anexadas.

As composições de combustível aqui descritas podem ser produzidas em uma maneira efetiva em termos de custo e ambientalmente benéfica. Vantajosamente, os compostos bicíclicos isoprenóides Cio usados nas composições de combustível aqui podem ser produzidos por um ou mais microorganismos. Estes compostos bicíclicos isoprenóides Ci0 assim podem proporcionar uma fonte de energia renovável para combustíveis de jato ou diesel, em particular as composições de combustível aqui proporcionadas. Ademais, estes compostos bicíclicos isoprenóides Cj0 podem diminuir a dependência de fontes de combustível não renováveis, componentes de combustível e/ou aditivos de combustível. Em certas modalidades, a composição de combustível aqui proporcionada compreende um carano, pinano, e sabinano bioengenheirado.

Embora a invenção tenha sido descrita com respeito a um número limitado de modalidades, as características específicas de uma modalidade não devem ser atribuídas a outras modalidades da invenção. Nenhuma modalidade individual é representativa de todos os aspectos do assunto reivindicado. Em algumas modalidades, as composições ou os métodos podem incluir numerosos compostos ou numerosas etapas aqui não mencionados(as). Em outras modalidades, as composições ou os métodos não incluem, ou estão substancialmente livres de, quaisquer compostos ou etapas não aqui enumerados(as). Existem variações e modificações das modalidades descritas. Deve ser notado que a aplicação das composições de combustível de jato aqui mostradas não é limitada aos motores a jato; podem ser usadas em qualquer equipamento que exige um combustível de jato. Embora haja especificações para a maioria dos combustíveis de jato, nem todas as composições de combustível de jato aqui mostradas necessitam atendem todas

r

as exigências nas especificações. E notado que os métodos para preparar e usar as composições de combustível de jato aqui mostradas são descritos com referência a numerosas etapas. Estas etapas podem ser praticadas em qualquer seqüência. Uma ou mais etapas podem ser omitidas ou combinadas mas ainda alcançam substancialmente os mesmos resultados. As reivindicações anexadas intencionam cobrir todas tais variações e modificações que caem dentro do escopo da invenção.

Todas as publicações e todos os pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referências na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência. Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente evidente para aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas na mesma sem se desviarem do espírito ou do escopo das reivindicações anexadas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: 1

operon MevT66 (5' a 3')

GAATTCAAAGGAGG AAAATAA AATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTC

CGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGA

TCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGC

CAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTC

AAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTG

TGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGG

CAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCAT

GGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGT

TATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAAT

GTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAA

GAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGC

GCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCC

AGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTC

CCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCITAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTG

ACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGC

AGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACC

CCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGAT

GGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTG

CAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGT

TCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAA

CGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATC

TTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGG

CGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTG

AACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCT

GGTGTGGCATCAAGGGTCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAA

CACGAACCTGCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAA

GACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCGACG

CAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCAGCCAGGGTA

AGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCTTCGTGAACGACCGTGA

GGACATCTATrCTATGAGCCTGACGGTGCTGTCTAAGCTGATCAAGAGCTACA ACATCGACACGAATAAGATCGOTCGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGAT

TGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAAC

ACGGATGTCGAGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACG

CACTGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCCGCGA

TGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGGGTGCGGCACGT

CCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGATTGGCCCGGACGCACCAA

TTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACA

AGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACC

TGCTATGTGAAGGCGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAGCAAAAAGGCGA

TrrCTAAGGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCT

GAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTAGTGACCA

AATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCAGCTGTTC

CCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTGATTACGACGAGAGCCTGACCG

ACAAGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGA

GCGTGTGGCCCAAAGCCTGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACC

GCGTCTGTCTACGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACOA

CCTGCAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCGGCC

AGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGC

TGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCGAGACGCCGAAAGATTA

CGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAG

CCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACA

TTGACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGG

AAAACATCATGGTGCTGACGAACAAAACCGTCATTAGCGGCAGCAAGGTGAA

GTCTCTGAGCAGCGCCCAAAGCTCTAGCAGCGGCCCGTCTAGCAGCAGCGAG

GAGGACGACAGCCGTGACATTGAGTCTCTGGACAAGAAGATCCGCCCGCTGG

AGGAGTTAGAGGCCCTGCTGAGCAGCGGCAACACCAAGCAGCTGAAGAACA

AGGAAGTTGCAGCGCTGGTGATCCACGGTAAGCTGCCACTGTATGCGCTGGA

AAAGAAACTGGGCGATACGACGCGTGCGGTCGCGGTGCGTCGCAAAGCCTTA

AGCATCTTAGCGGAGGCCCCGGTGTTAGCCAGCGACCGCCTGCCGTACAAGA

ACTACGACTACGACCGCGTGTTTGGCGCGTGCTGCGAGAATGTCATTGGCTAC

ATGCCGTTACCGGTTGGTGTGATCGGCCCGCTGGTCATTGATGGCACGAGCTA

TCACATTCCAATGGCGACCACGGAAGGTTGCTTAGTCGCCAGCGCCATGCGT

GGCTGTAAGGCGATTAACGCCGGCGGTGGCGCGACGACCGTGTTAACCAAGG

ATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCGTCCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGG CGCGTGT AAGATTTGGCTGGATTCTGAGGAGGGCCAAAACGCGATCAAGAAA

GCCTTCAACTCTACGAGCCGTTTCGCGCGTTTACAGCATATCCAGACCTGCCT

GGCCGGCGACCTGCTGTTCATGCGCTTCCGCACCACCACGGGCGATGCGATG

GGCATG AACATGATCAGCAAGGGCGTCGAATATAGCCTGAAACAAATGGTGG

AAGAATATGGCTGGGAGGACATGGAGGTTGTCTCTGTGAGCGGCAACTATTG

CACCGACAAGAAGCCGGCAGCCATTAACTGGATTGAGGGTCGCGGCAAAAGC

GTCGTGGCAGAAGCGACCATCCCAGGCGACGTGGTCCGTAAGGTTCTGAAGA

GCGACGTCAGCGCCCTGGTTGAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAG

CGCGATGGCGGGCAGCGTGGGTGGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTGGTT

ACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAGCA

GCAACTGCATTACCTTAATGAAAGAGGTTGACGGTGACCTGCGCATCAGCGT

TTCTATGCCGTCTATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAAC

CGCAAGGTGCGATGCTGGATCTGCTGGGCGTGCGCGGCCCACATGCAACGGC

CCCAGGCACCAATGCCCGCCAACTGGCCCGTATCGTGGCCTGCGCGGTTCTGG

CGGGTGAGCTGAGCCTGTGCGCCGCATTAGCCGCGGGCCATTTAGTTCAATCT

CACATGACCCACAACCGCAAGCCGGCAGAACCAACCAAGCCAAATAACCTGG

ACGCAACCGACATTAACCGTCTGAAGGATGGCAGCGTCACGTGCATTAAAAG

CTGAGCATGCTACTAAGCTT

SEQ ID ΝΟ:2

geranil-difosfato-sintase de Arabidopsis thaliana códon-otimizada para

expressão em Escherichia coli e com sítios de restrição NotI e SacI

flanqueando (5' a 3')

GCGGCCGCGGAAAAGGAGGCCGGCCGGCATGCTGCTGTCTAATAAACTGCGT

GAAATGGTTCTGGCTGAAGTACCTAAACTGGCCTCCGCAGCAGAATATTTCTT

CAAGCGTGGCGTTCAGGGCAAACAGTTCCGTAGCACCATCCTGCTGCTGATG

GCTACCGCCCTGGACGTGCGTGTCCCGGAAGCCCTGATCGGCGAATCCACCG

ACATCGTGACCTCTGAACTGCGTGTTCGTCAGCGTGGTATCGCGGAAATCACC

GAAATGATCCACGTTGCGTCTCTGCTGCACGACGATGTGCTGGACGATGCAG

ACACCCGTCGTGGTGTTGGTTCCCTGAACGTGGTGATGGGTAACAAAATGAG

CGTGCTGGCAGGCGACTTTCTGCTGTCTCGCGCCTGTGGTGCTCTGGCTGCGC

TGAAGAACACCGAGGTAGTGGCACTGCTGGCGACTGCCGTAGAGCACCTGGT

TACCGGCGAAACGATGGAAATTACTTCTTCCACCGAACAGCGTTACTCCATGG

ACTACTACATGCAGAAGACTTACTATAAAACCGCGTCCCTGATTAGCAACTCT

TGTAAAGCAGTAGCAGTACTGACTGGCCAAACTGCAGAAGTAGCGGTGCTGG CTTTCGAGTACGGTCGTAACCTGGGTCTGGCTTTCCAOCTGATCGATGACATC

CTGGACTTTACTGGTACCAGCGCAAGCCTGGGTAAAGGTTCCCTGTCTGACAT

TCGTCACGGCGTTATCACCGCTCCGATTCTGTTCGCGATGGAAGAATTCCCGC

AGCTGCGTGAAGTTGTTGACCAGGTTGAAAAAGACCCGCGTAACGTCGATAT

CGCACTGGAATACCTGGGCAAATCCAAAGGTATCCAACGCGCGCGTGAACTG

GCTATGGAGCACGCÇAACCTGGCAGCAGCAGCAATTGGCTCTCTGCCGGAAA

CCGACAACGAAGATGTTAAACGCAGCCGTCGTGCACTGATCGACCTGACTCA

TCGTGTAATCACCCGCAACAAATAAGATTGAGTGATGTTCCTGAGCATCCACC

AGAACATTCCGCACTTTATCTGTCGTATTCTGCTGGTGCAATTCGTAAGCCGC

TGATAATAGGAGCTC

SEQ ID NO: 3

inserto ERG20-PGAL-tHMGR de pAM489 (5' a 3')

GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAG

TGCTTGCATTCAAAGACATGGAGGGCGTTATTACGCCGGAGCTCCTCGACAG

CAGATCTGATGACTGGTCAATATATTTTTGCATTGAGGCTCTGTTTGGAATTA

TATTTTGAGATGACCCATCTAATGTACTGGTATCACCAGATTTCATGTCGTTTT

TTAAAGCGGCTGCTTGAGTCTTAGCAATAGCGTCACCATCTGGTGAATCCTTT

GAAGG AACCACTGACGAAGGTTTGGACAGTGACGAAGAGGATCTTTCCTGCT

TTGAATTAGTCGCGCTGGGAGCAGATGACGAGTTGGTGGAGCTGGGGGCAGG

ATTGCTGCrcCGTCGTGGGTCCTGAATGGGTCCTTGGCTGGTCCATCTCTATTCT

GAAAACGGAAGAGGAGTAGGGAATATTACTGGCTGAAAATAAGTCTTGAATG

AACGTATACGCGTATATTTCTACCAATCTCTCAACACTGAGTAATGGTAGTTA

TAAGAAAGAGACCGAGTTAGGGACAGTTAGAGGCGGTGGAGATATTCCTTAT

GGCATGTCTGGCGATGATAAAACTTTTCAAACGGCAGCCCCGATCTAAAAGA

GCTGACACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATG

CACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATA

TTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGaTCrTmCAAGAGAATACCAATGA

CGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGA

TTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTG

TTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATA

AGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGT

GCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCA

ACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCG ATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAA

TGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCA

AGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGA

CCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATG

CGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCT

TCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTT

TTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGC

CATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATAT

TCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCT

CCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTT

AAAAGCTTTTTTAAITCKrGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACA

GGCACCAGATCITITCAAAGTTGGGAAACGGACrrACTGGGCCrCTTGTCATAC

CATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAG

CCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATG

ATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGC

ATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATA

ATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTG

AAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTC

TCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTT

TGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAA

AGGACGTATTTTCnTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACT

AGATGATGAACKjTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTT

TCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGT

ACAGGAGCAGTAAAAGACITCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGC

AGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACOTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAAT

TTTrTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAAT

GTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGrrATGCAGCTTTrGCATTTATATATCTGTTA

ATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAA

AAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAG

GTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTA

GTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGT

TTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTC

GGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATG

AGCAGTTAAGCGTATTACTGAMGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAA GATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGAT

ATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCAT

CCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAA

AGAAATTAGGAGAGAGAGATTCTTGAACGTTITCCCTAAATTAGTAGAGGAA

TTGAACGCATCGCTTTTGGCTTACGGTATGCCTAAGGAAGCATGTGACTGGTA

TGCCCACTCATTGAACTACAACACTCCAGGCGGTAAGCTAAATAGAGGTTTGT

CCGTTGTGGACACGTATGCTATTCTCTCCAACAAGACCGTTGAACAATTGGGG

CAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGCATTGAGTTGTTGC

AGGCTTACTTCTTGGTCGCCGATGATATGATGGACAAGTCCATTACCAGAAGA

GGCCAACCATGTTGGTACAAGGTTCCTGAAGTTGGGGAAATTGCCATCAATG

ACGCATTCATGTTAGAGGCTGCTATCTACAAGCTTTTGAAATCTCACTTCAGA

AACGAAAAATACTACATAGATATCACCGAATTGTTCCATGAGGTCACCTTCCA

AACCGAATTGGGCCAATTGATGGACTTAATCACTGCACCTGAAGACAAAGTC

GACTTGAGTAAGTTCTCCCrAAAGAAGCACTCCTTCATAGTTACTTTCAAGAC

TGCTTACTATTCTTTCTACTTGCCTGTCGCATTGGCCATGTACGTTGCCGGTAT

CACGGATGAAAAGGATTTGAAACAAGCCAGAGATGTCTTGATTCCATTGGGT

GAATACTTCCAAATTCAAGATGACTACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACA

GATCGGTAAGATCGGTACAGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATC

AACAAGGCATTGGAACTTGCTTCCGCAGAACAAAGAAAGACTTTAGACGAAA

ATTACGGTAAGAACKjACTCAGTCGC^GAAGCCAAATGCAAAAAGATTTTCAA

TGACTTGAAAATTGAACAGCTATACCACGAATATGAAGAGTCTATTGCCAAG

GATTTGAAGGCCAAAATTTCTCAGGTCGATGAGTCTCGTGGCTTCAAAGCTGA

TGTCTTAACTGCGTTCTTGAACAAAGTTTACAAGAGAAGCAAATAGAACTAA

CGCTAATCGATAAAACATTAGATTTCAAACTAGATAAGGACCATGTATAAGA

ACTATATACTTCCAATATAATATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGAT

CTACCGTTCCACGTGACTAGTCCAAGGATTTTTTTTAACCCGGGATATATGTG

TACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAA

GATTAAGAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCA

TTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCT

TGGAGTATGTCTGTrATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGT

TTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCT

GACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGG

TTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGG TCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTOTCGGTACAGTAGTTACCAGAAAC

GGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATG

AGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTT

GTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTG

CAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTITAATTGCGTrTTGTC

CCTCTTCTGAGTCrAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGG

AAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGC

ACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAA

CAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAA

GGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAA

CAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAG

ATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGC

AACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACT

TACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCrCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGT ATTTC

C ACTACTT AAT AATGCTTCTAATTCTTCTAA AGG ACGTA ITiIC ITATCCAAGC

TTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAG

CTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTT

ATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTITGTACACKiAGCAGTAAAAGACTTCT

TGGTGACITCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTITTTTCTCCTT

GACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAAC^TTTTTTGTTGATACTTTrATGACA

TTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTG

GTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTC

GCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCT

ATGGTTGTTAATTrGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGC

CAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTC

GGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAG

ACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGC

GGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAA

AGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTC

CACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATG

TAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTT

TGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTA

AAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCA

AATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCA AAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACC

AATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGT

CTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGAT

GTCCCT AACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATGGACACCAACA

AAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTC

TGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTA

TTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTG

AACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCG

GTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGG

TACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAG

AGCTrCrrACATGGAACACGCCTACGArTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCG

AATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTG

ATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGC

GATCCCGCTGGTTCGGATGCirrGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGT

TTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTAT

ATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTA

GCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTT

TGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTG

TTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCA

TCTCT ATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTT

ATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGG

TGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAG

AGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAA

ATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAA

AGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGA

TGTTAAAAAATAATCTTCCCCCATCGATTGCATCTTGCTGAACCCCCTTCATA

TITTTTAATCTATATACTAGGAAAACTCTTrATTTAATAACAATGATATATATA

TACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTiHlliril TGTTCTTTTTTTTGATTCC

GGTTTCTTTGAAATTTITTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGA

AGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAG

AAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTG

CAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCT

ACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCA AACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGT

TAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATC

TTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGC

CAAGTACAATITrTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATA

CAGTC AAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGA

CATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAG

CAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAG

AATTGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTT

GACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAG

ACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGT

GGGTTT AGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGAACCGTGGAT

GATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGGTTTAAAC

SEQ ID ΝΟ:5

inserto IDIl-PGAL-tHMGR de pAM493 (5' a 3')

GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGAATTGAAGGGCGAACTCTTATTCG

AAGTCGGAGTCACCACAACACTTCCGCCCATACTCTCCGAATCCTCGTTTCCT

AAAGTAAGTTTACTTCCACTTGTAGGCCTATTATTAATGAT ATCTGAAT AATC

CTCTATTAGGGTTGGATCATTCAGTAGCGCGTGCGATTGAAAGGAGTCCATGC

CCGACGTCGACGTGATTAGCGAAGGCGCGTAACCATTGTCATGTCTAGCAGC

TATAGAACTAACCTCCTTGACACCACTTGCGGAAGTCTCATCAACATGCTCTT

CCTrATTACTCATTCTCTTACCAAGCAGAGAATGTTATCTAAAAACTACGTGT

ATTTCACCTCTTTCTCGACTTGAACACGTCCAACTCCTTAAGTACTACCACAG

CCAGGAAAGAATGGATCCAGTTCTACACGATAGCAAAGCAGAAAACACAAC

CAGCGTACCCCTGTAGAAGCTTCTTTGTTTACAGCACTTGATCCATGTAGCCA

TACTCGAAATTTCAACrCATCTGAAACTTTTCCTGAAGGTTGAAAAAGAATGC

CATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTTATGACAATTACAAC

AACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGAC

GTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTOCTTCT

TTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTG

ACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTT

TGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGC

CGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGC

AACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGC ctcttacacctaataagtccaacatggcaccttgtggttctagaacagtacca

ccaccgatggtacctacttcgatggatggcatggatacggaaattctcaaatc

accgtccacttctttcatcaatgttatacagttggaactttcgacattttgtgc

aggatcttgtcctaatgccaagaaaacagctgtcactaaattagctgcatgtg

cgttaaatccaccaacagacccagccattgcagatccaaccaaattcttagc

aatgttcaactcaaccaatgcggaaacatcactttttaacacttttctgacaa

catcaccaggaatagtagcttctgcgacgacactcttaccacgaccttcgatc

cagttgatggcagctggttttttgtcggtacagtagttaccagaaacggagac

aacctccatatcttcccagccatactcttctaccatttgctttaatgagtattc

gacacccttagaaatcatattcatacccattgcgtcaccagtagttgttctaa

atctcatgaagagtaaatctcctgctagacaagtttgaatatgttgcagacgt

gcaaatcttgatgtagagttaaaagcttttttaattgcgttttgtccctcttct

gagtctaaccatatcttacaggcaccagatcttttcaaagttgggaaacgga

ctactgggcctcttgtcataccatccttagttaaaacagttgttgcaccaccg

ccagcattgattgccttacagccacgcatggcagaagctaccaaacaaccct

ctgtagttgccattggtatatgataagatgtaccatcgataaccaaggggcct

ataacaccaacgggcaaaggcatgtaacctataacattttcacaacaagcgc

caaatacgcggtcgtagtcataatttttatatggtaaacgatcagatgctaat

acaggagcttctgccaaaattgaaagagccttcctacgtaccgcaaccgctct

cgtagtatcacctaattttttctccaaagcgtacaaaggtaacttaccgtgaa

taaccaaggcagcgacctctttgttcttcaattgttttgtatttccactactta

ataatgcttctaattcttctaaaggacgtattitcttatccaagctttcaatat

cgcgggaatcatcttcctcactagatgatgaaggtcctgatgagctcgattgc

gcagatgataaactttrgactttcgatccagaaatgacrgttttattggttaa

aactggtgtagaagccttttgtacaggagcagtaaaagacitcntggtgactt

cagttttcaccaattggtctgcagccattatagttttttctccttgacgttaaa

gtatagaggtatattaacaattttttgttgatacttttatgacatttgaataa

gaagtaatacaaaccgaaaatgttgaaagtattagttaaagtggttatgcag

cttttgcatttatatatctgttaatagatcaaaaatcatcgcttcgctgattaa

ttaccccagaaataaggctaaaaaactaatcgcattattatcctatggttgtt

aatttgattcgttgatttgaaggtttgtchjggccaggttactgccaatttttcc

tcttcataaccataaaagctagtattgtagaa tcttta ttgttcggagcagtg

cggcgcgaggcacatctgcgtttcaggaacgcgaccggtgaagaccaggacg

cacggaggagagtcttccgtcggagggctgtcgcccgctcggcggcttctaa TCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAA

GAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATA

TAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGAT

TATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAA AA AAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTC

AATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCCCCATGGTGCAGTATCTAGTT

ACGCC AAATTAGTGCAAAACCAAACACCTGAAGACATTTTGGAAGAGTTTCC

TGAAATTATTCCATTACAACAAAGACCTAATACCCGATCTAGTGAGACGTCA

AATGACGAAAGCGGAGAAACATGTTTTTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTA

AGTTAATGAATGAAAATTGTAITGrnTGGATTGGGACGATAATGCTATTGGT

GCCGGTACCAAGAAAGmGTCATTTAATGGAAAATATTGAAAAGGGTTTAC

TACATCGTGCATTCTCCGTCTTTATmCAATGAACAAGGTGAATTACTTTTAC

AACAAAGAGCCACTGAAAAAATAACTTTCCCTGATCTTTGGACTAACACATG

CTGCTCTCATCCACTATGTATTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAG

ACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGAGAAAACTAGATCATGA

ATTAGGTATTCCAGAAGATGAAACTAAGACAAGGGGTAAGTTTCACTTTTTA

AACAGAATCCATTACATGGCACCAAGCAATGAACCATGGGGTGAACATGAAA

TTGATTACATCCTATTTTATAAGATCAACGCTAAAGAAAACTTGACTGTCAAC

CCAAACGTCAATGAAGTTAGAGACTTÇAAATGGGTTTCACCAAATGATTTGA

AAACTATGTITGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGATTATT

TGCGAGAATTACTTATTCAACTGGTGGGAGCAATTAGATGACCTTTCTGAAGT

GGAAAATGACAGGCAAATTCATAGAATGCTATAACAACGCGTCAATAATATA

GGCTACATAAAAATCATAATAACTTTGTTATCATAGCAAAATGTGATATAAA

ACGTTTCATTTCACCTGAAAAATAGTAAAAATAGGCGACAAAAATCCTTAGT

AATATGTAAACmATTTTCTTTATTTACCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGA

GAGATGAGGATGTAATAATACTAATCTCGAAGATGCCATCTAATACATATAG

ACATACATATATATATATATACATTCTATATATTCTTACCCAGATTCTTTGAGG

TAAGACGGTTGGGTTrTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCGAAT

CATAAGCATTGCTTACAAAGAATACACATACGAAATATTAACGATAATGTCA

ATTACGAAGACTGAACTGGACGGTATATTGCCATTGGTGGCCAGAGGTAAAG

TTAGAGACATATATGAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGAT

CGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAAAGGGGAT

CCTATTGACCAAACTGTCAGAGTTCTGGTTCAAGTTCCTGTCCAACGATGTTC

GTAATCATTTGGTCGACATCGCCCCAGGTAAGACTATTTTCGATTATCTACCT

GCAAAATTGAGCGAACCAAAGTACAAAACGCAACTAGAAGACCGCTCTCTAT tggttcacaaacataaactaattccattggaagtaattgtcagaggctacatc

accggatctgcttggaaagagtacgtaaaaacaggtactgtgcatggtttga

aacaacctcaaggacttaaagaatctcaagagttcccagaaccaatcttcac cccatcgaccaaggctgaacaaggtgaacatgacgaaaacatctctcctgcc caggccgctgagctggtgggtgaagatttgtcacgtagagtggcagaactgg ctgtaaaactgtactccaagtgcaaagattatgctaaggagaagggcatcat r. ατγγϊγ α η α γ α πτ α α αττπτττα α απ SEQ ID NO: 6

inserto ERG IO-Pgal-ERG 12 de ρΑΜ495 (5' a 3')

gtttaaactattgtgagggtcagttatttcatccagatataacccgagaggaa

acttcttagcgtctgttttcgtaccataaggcagttcatgaggtatattttcgt

tattgaagcccagctcgtgaatgcttaatgctgctgaactggtgtccatgtcg

cctaggtacgc aatctccacaggctgcaaaggttttgtctcaagagcaatgtt

attgtgcaccccgtaattggtcaacaagtttaatctgtgcttgtccaccagct

ctgtcgtaaccttcagttcatcgactatctgaagaaatttactaggaatagtg

ccatggtacagcaaccgagaatggcaatttctactcgggttcagcaacgctg

cataaacgctgttggtgccgtagacatattcgaagataggattatcattcata

agtttcagagcaatgtccttattctggaachtggattratggctcttttggttt

aatttcgcctgattcttgatctcctttagcttctcgacgtgggccttittcttg

ccatatggatccgctgcacggtcctgttccctagcatgtacgtgagcgtattt

ccitttaaaccacgacgctttgtcttcattcaacgtttcccattg1111111cta

ctattgctttgctgtgggaaaaacttatcgaaagatgacgactttttcttaat

tctcgttitaagagcttggtgagcgctaggagtcactgccaggtatcgtttga

acacggcattagtcagggaagtcataacacagtcctttcccgcaattttcttt

ttctattactcttggcctcctctagtacactctatatttttttatgcctcggta

gattggcattatcacataatgaattatacattatataaagtaatgtgatttct

tcgaagaatatactaaagtttagcttgcctcgtccccgccgggtcacccggcc

agcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagct

caggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagcccatacatccccatgta

taatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaatta

cggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcg

ttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataaaaggttaggattt GCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCrTTTAAAATCTTGCTAGGATACAG

TTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAA

AGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAA

TGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAA

AAGATTCGATTCTTCÇTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACT

CAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTGGATCATATGAT

CCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTG

ACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGG

GCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGT

ACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATC

TAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATTGGT

GATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGC

CAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAA

GTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGC

AATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGA

CAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGlllilTTATAT

TGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATAΠ" IiTlTiCGCCTC

GACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCG

TCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGC

CGCCATCCACCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCATTCTGTCTTCGAAAGCTGA

ATTGATACTACGAA AAA' 1ΊΊ T i T Π Ί GTTTCTCTTTCTATCTTTATTAC ATA AA

ACTTCATACACAGTTAAGATTAAAAACAACTAATAAATAATGCCTATCGCAA

ATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTGTTTCCTGGCAATAATAGATCGT

CAATTTGTTGCTTTGTGGTAGTmATTTTCAAATAATTGGAATACTAGGGATT

TGATTTTAAGATCTTTATTCAAATITTTTGCGCTTAACAAACACKJAGCCAGTC

CCACCCAAGTCTGTTTCAAATGTCTCGTAACTAAAATCATCTTGCAATTTCTTT

TTGAAACTGTCAATTTGCTCTTGAGTAATGTCTCTTCGTAACAAAGTCAAAGA

GCAACCGCCGCCACCAGCACCGGTAAGTTTTGTGGAGCCAATTCTCAAATCAT

CGCTCAGATTTTTAATAAGTTCTAATCCAGGATGAGAAACACCGATTGAGAC

AAGCAGTCCATGATTTATTCTTATCAATTCCAATAGTTGTTCATACAGTTCATT

ATTAGTTTCTACAGCCTCGTCATCGGTGCCTTTACATTTACTTAACTTAGTCAT

GATCTCTAAGCCTTGTAGGGCACATTCACCCATGGCATCTAGAATTGGCTTCA

TAACTTCAGGAAATTTCTCGGTGACCAACACACGAACGCGAGCAACAAGATC

TmGTAGACCTTGGAATTCTAGTATAGGTTAGGATCATTGGAATGGCTGGGA AATCATCTAAGAACTTAAAATTGTTTGTGTTTATTGTTCCATTATGTGAOTCTT

TTTCAAATAGCAGGGCATTACCATAAGTGGCCACAGCGTTATCTATTCCTGAA

GGGGT ACCGTGAATACACTTTTCACCTATGAAGGCCCATTGATTCACTATATG

CTTATCGTTTTCTGACAGCTTTTCCAAGTCATTAGATCCTATTAACCCCCCCAA

GTAGGCCATAGCTAAGGCCAGTGATACAGAAATAGAGGCGCTTGAGCCCAAC

CCAGCACCGATGGGTAAAGTA GACTTT AAAGAAAACTTAATATTCTTGGCAT

GGGGGCATAGGCAAACAAACATATACAGGAAACAAAACGCTGCATGGTAGT

GGAAGGATTCGGATAGTTGAGCTAACAACGGATCCAAAAGACTAACGAGTTC

CTGAGACAAGCCATCGGTGGCTTGTTGAGCCTTGCK:CAATTTTTGGGAGTTTA

CTTGATCCTCGGTGATGGCATTGAAATCATTGATGGACCACTTATGATTAAAG

CTAATGTCCGGGAAGTCCAATTCAATAGTATCTGGTGCAGATGACTCGCTTAT

TAGCAGGTAGGTTCTCAACGCAGACACACTAGCAGCGACGGCAGGCTTGTTG

TACACAGCAGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCGGTGCAGAAGTTA

AGAACGGTAATGACATTATAGTITrTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTA

TATTAACAATTTTTTGTTGATACnTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACA

AACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTA

TATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAA

ATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATrATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCG

ITGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACC

ATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGG

CACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAG

AGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCA

ATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTT

TTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGAT

TAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTT

CTTrGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTrTTGAAAATTCAATATAAATG

TCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCCAGAACCCCAATTGGTTCATTCCA

GGGTTCTCTATCCTCCAAGACAGCAGTGGAATTCKXjTGCTGTTGCTTTAAAAG

GCGCCTTGGCTAAGGTTCCAGAATTGGATGCATCCAAGGATTTTGACGAAATT

ATTTTTGGTAACGTTCTTTCTGCCAATTTGGGCCAAGCTCCGGCCAGACAAGT

TGCTTTGGCTGCCGGTTTGAGTAATCATATCGTTGCAAGCACAGTTAACAAGG

TCTGTGCATCCGCTATGAAGGCAATCATTTTGGGTGCTCAATCCATCAAATGT

GGTAATGCTGATGTTGTCGTAGCTGGTGGTTGTGAATCTATGACTAACGCACC

ATACTACAT(K:CAGCAGCCCGTGCGGGTGCCAAATTTGGCCAAACTGTTCTTG TTGATGGTGTCGAAAGAGATGGGTTGAACGATGCGTACGATGGTCTAGCCAT

GGGTGTACACGCAGAAAAGTGTGCCCGTGATTGGGATATTACTAGAGAACAA

CAAGACAATTTTGCCATCGAATCCTACCAAAAATCTCAAAAATCTCAAAAGG

AAGGTAAATTCGACAATGAAATTGTACCTGTTACCATTAAGGGATTTAGAGG

TAAGCCTGATACTCAAGTCACGAAGGACGAGGAACCTGCTAGATTACACGTT

GAAAAATTGAGATCTGCAAGGACTGTTTTCCAAAAAGAAAACGGTACTGTTA

CTGCCGCTAACGCTTCTCCAATCAACGATGGTGCTGCAGCCGTCATCTTGGTT

TCCGAAAAAGTTTTGAAGGAAAAGAATTTGAAGCCTTTGGCTATTATCAAAG

GTTGGGGTGAGGCCGCTCATCAACCAGCTGATTTTACATGGGCTCCATCTCTT

GCAGTTCCAAAGGCTTTGAAACATGCTGGCATCGAAGACATCAATTCTGTTGA

TTACTTTGAATTCAATGAAGCCTTTTCGGTTGTCGGTTTGGTGAACACTAAGA

TTTTGAAGCTAGACCCATCTAAGGTTAATGTATATGGTGGTGCTGTTGCTCTA

GGTCACCCATTGGGTTGTTCTGGTGCTAGAGTGGTTGTTACACTGCTATCCAT

CTTACAGCAAGAAGGAGGTAAGATCGGTGTTGCCGCCATTTGTAATGGTGGT

GGTGGTGCnrCCTCTATTGTCAITGAAAAGATATGATTACGTTCTGCGATTTTC

TCATGATCTTTTTCATAAAATACATAAATATATAAATGGCTTTATGTATAACA

GGCATAATTTAAAGTTTTATTTGCGATTCATCGTTTrTCAGGTACTCAAACGCT

GAGGTGTGCCTTTTGACTTACTTTTCCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTC

CACGTTGATTGTCTGCGAGGCAAGAATGATCATCACCGTAGTGAGAGTGCGT

TCAAGGCTCTTGCGGTTGCCATAAGAGAAGCCACCTCGCCCAATGGTACCAA

CGATGTTCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGTGACACCGATTATTTAAAG

CTGCAGCATACGATATATATACATGTGTATATATGTATACCTATGAATGTCAG

TAAGTATGTATACGAACAGTATGATACTGAAGATGACAAGGTAATGCATCAT

TCTATACGTGTCATTCTGAACGAGGCGCGCTTTCCIUlUUUCTTTTTGClll 1IC

TTTTTTnTCTCTTGAACTCGAGAAAAAAAATATAAAAGAGATGGAGGAACG

GGAAAAAGTTAGTTGTGGTGATAGGTGGCAAGTGGTATTCCGTAAGAACAAC

AAGAAAAGCATTTCATATTATGGCTGAACTGAGCGAACAAGTGCAAAATTTA

AGCATCAACGACAACAACGAGAATGGTTATGTTCCTCCTCACTTAAGAGGAA

AACCAAGAAGTGCCAGAAATAACAGTAGCAACTACAATAACAACAACGGCG

GCGTTTAAAC

SEQ ID NO: 7

inserto ERG8-Pgal-ERG19 de pAM497 (5' a 3') gtttaaacrittccaataggtggttagcaatcgtcttactttctaacttrtctr

accttttacatttcagcaatatatatatatatatttcaaggatataccattcta

atgtctgcccctaagaagatcgtcgttttgccaggtgaccacgttggtcaaga

aatcacagccgaagccattaaggttcttaaagctatttctgatgttcgttcca

atgtcaagttcgatttcgaaaatcatttaattggtggtgctgctatcgatgct

acaggtgttccacttccagatgaggcgctggaagcctccaagaaggctgatg

ccgttttgttaggtgctgtgggtggtcctaaatggggtaccggtagtgttaga

cctgaacaaggtttactaaaaatccgtaaagaacttcaattgtacgccaactt

aagaccatgtaactttgcatccgactctcttttagacttatctccaatcaagc

cacaatttgctaaaggtactgacitcgttgttgtcagagaattagtgggaggt

atttactttggtaagagaaaggaagacgtttagcttgcctcgtccccgccggg

tcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgac

gtgcgcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagcccataca

tccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaa

gcaaaaattacggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccct

cacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataaaa

ggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttg

ctaggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaaccatggcagaacc

agcccaaaaaaagcaaaaacaaactgttcaggagcgcaaggcgtttatctcc

cgtatcactaatgaaactaaaattcaaatcgctatttcgctgaatggtggtta

tattcaaataaaagattcgattcttcctgcaaagaaggatgacgatgtagctt

cccaagctactcagtcacaggtcatcgatattcacacaggtgttckx:tttttg

gatcatatgatccatgcgttggcaaaacactctggttggtctcttattgttga

atgtattggtgacctgcacattgacgatcaccatactaccgaagattgcggta

tcgcattagggcaagcgttcaaagaagcaatgggtgctgtccgtggtgtaaa

aagattcggtactgggttcgcaccattggatgaggcgctatcacgtgccgta

gtcgatttatctagtagaccatttgctgtaatcgaccttggattgaagagaga

gatgattggtgatttatccactgaaatgattccacactttttggaaagtttcg

cggaggcggccagaattactttgcatgttgattgtctgagaggtttcaacgat

caccacagaagtgagagtgcgttcaaggctttggctgttgccataagagaag

ctatttctagcaatggcaccaatgacgttccctcaaccaaaggtgttttgatg

tgaagtactgacaataaaaagattcntgttttcaagaacttgtcatttgtata

gtttttttatattgtagttgttctattttaatcaaatgtragcgtg

ttttttcgcctcgacatcatctgcccagatgcgaagttaagtgcgcagaaagt aatatcatgcgtcaatcotatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattc

gatactaacgccgccatccacccgggtttctcattcaagtggtaactgctgtt

aaaattaagatatttataaattgaagcttggtcgttccgaccaataccgtagg

gaaacgtaaattagctattgtaaaaaaaggaaaagaaaagaaaagaaaaat

gttacatatcgaattgatcitattcctttggtagaccagtctttgcgtcaatca

AAGATTCGTTTGTTTCTTGTGGGCCTGAACCGACTTGAGTTAAAATCACTCTG

gcaacatccttttgcaactcaagatccaattcacgtgcagtaaagttagatga

TTCAAATTGATGGTTGAAAGCCTCAAGCTGCTCAGTAGTAAATTTCTTGTCCC

atccagg aacagagccaaacaatttatagataaatgcaaagagtttcgactc

ATTTTCAGCTAAGTAGTACAACACAGCATTTGGACCTGCATCAAACGTGTATG

caacgattgtttctccgtaaaactgattaatggtgtggcaccaactgatgata

cgcttggaagtgtcattcatgtagaatattggagggaaagagtccaaacatg

tggcatggaaagagttggaatccatcattgtttcctttgcaaaggtggcgaa

atcttitrcaacaatggcrittacgcatgacttcaaatctctttggtacgacatg

ttcaattctttctttaaatagttcggaggttgccacggtcaattgcataccctg

agtggaactcacatcctttttaatatcgctgacaactaggacacaagctttca

tctgaggccagtcagagctgtctgcgatttgtactgccatggaatcatgacca

tcttcagcttttcccatttcccaggccacgtatccgccaaacaacgatctaca

agctgaaccagaccccnttcttgctattctagatatttctgaagttgactgtg

gtaattggtataacttagcaattgcagagaccaatgcagcaaagccagcagc

ggaggaagctaaaccagctgctgtaggaaagttattttcggagacaatgtgg

agtttccattgagataatgtgggcaatgaggcgtccttcgattccatttcctt

tcttaattggcgtaggtcgcgcagacaattttgagttctttcattgtcgatgct

gtgtggttctccatttaaccacaaagtgtcgcgttcaaactcaggtgcagtag

ccgcagaggtcaacgttctgaggtcatcttgcgataaagtcactgatatgga

cgaattggtgggcagattcaacttcgtgtcccttttcccccaatacttaaggg

TTGCGATGTTGACGGGTGCGGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTT

ttttctccttgacgttaaagtatagaggtatattaacaattttttgttgatact

tttatgacatttgaataagaagtaatacaaaccgaaaatgttgaaagtatta

GTTAAAGTGGTrATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAA

tcatcgcttcgctgattaattaccccagaaataaggctaaaaaactaa tcgca

TTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCA

ggttactgccaatttttcctcttcataaccataaaagctagtattgtagaatc

tttattgttcggagcagtgcggcgcgaggcacatctgcgittcaggaacgcg accggtgaagaccagoacgcacggaggagagtcttccgtcggagggctgtcg

CCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCG

tatractgaaagttccaaagagaaggtttttttaggctaagataatggggctc

TTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGG

TATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAG

TAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCC

ccagggaaagcgttactagctggtggatatttagttttagatccgaaatatga

agcatttgtagtcggattatcggcaagaatgcatgctgtagcccatccttacg

GTTCATTGCAAGAGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTT

aaagatggggagtggctgtaccatataagtcctaaaactggcttcattcctgt

TTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTAT

ttagctactttaagcctaacatggacgactactgcaatagaaacttgttcgtt

ATTGATATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGACAGCGTTACCGA

acatcgtggcaacagaagattgagttttcattcgcacagaattgaagaagtt

cccaaaacagggctgggctcctcggcaggtttagtcacagttttaactacagc

tttggcctccttttttgtatcggacctggaaaataatgtagacaaatatagag

aagttattcataatttatcacaagttgctcattgtcaagctcagggtaaaatt

ggaagcgggtttgatgtagcggcggcagcatatggatctatcagatatagaa

gattcccacccgcattaatctctaatttgccagatattggaagtgctacttac

GGCAGTAAACTGGCGCAmGGTTAATGAAGAAGACTGGAATATAACGATTA

aaagtaaccatttaccttcgggattaactttatggatgggcgatattaagaat

ggttcagaaacagtaaaactggtccagaaggtaaaaaattggtatgattcgc

atatgccggaaagcttgaaaatatatacagaactcgatcatgcaaattctag

atttatggatggactatctaaactagatcgcttacacgagactcatgacgatt

acagcgatcagatatttgagtctcttgagaggaatgactgtacctgtcaaaa

gtatcctgagatcacagaagttagagatgcagttgccacaattagacgttcct

TTAGAAAAATAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAAC

tagcttattgga tga ttgccagaccttaaaaggagttcttacttgcttaatac

CTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTGCTAAGCAAGATGTTGAT

cttagggctcaaaccgctgatgacaaaagattttctaaggttcaatggctgg

atgtaactcaggctgactggggtgttaggaaagaaaaagatccggaaactta

TCTTGATAAATAACTTAAGGTAGATAATAGTGGTCCATGTGACATCTTTATAA

ATGTGAAGTTTGAAGTGACCGCGCTTAACATCTAACCATTCATCTTCCGATAG

tacttgaaainrgttcctttcggcggcatgataaaatrcttttaatgggtacaa TTATAAATGAAATTCATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATGGAATATG

TTCATAGGGTAGACGAAACTATATACGCAATCTACATACATTTATC AAGAAG

GAGAAAAAGGAGGATGTAAAGGAATACAGGTAAGCAAATTGATACTAATGG

CTCAACGTGATAAGGAAAAAGAATTGCACTTTAACATTAATATTGACAAGGA

GGAGGGCACCACACAAAAAGTTAGGTGTAACAGAAAATCATGAAACTATGAT

TCCTAATTTATATATTGGAGGATTTTCTCTAAAAAAAAAAAAATACAACAAAT

AAAAAACACTCAATGACCTGACCATTTGATGGAGTTTAAGTCAATACCTTCTT

GAACCATTTCCCATAATGGTGAAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAA

ACGGCCTTAACGACGTAGTCGACCTCCTCTTCAGTACTAAATCTACCAATACC

AAATCTGATGGAAGAATGGGCTAATGCATCATCCTTACCCAGCGCATGTAAA

ACATAAGAAGGTTCTAGGGAAGCAGATGTACAGGCTGAACCCGAGGATAATG

CGATATCCCTTAGTGCCATCAATAAAGATTCTCCTTCCACGTAGGCGAAAGAA

ACGTTAACACGTTTAAAC

SEQ ID NO.-8

α-pineno sintase de pi nus taeda códon-otimizada para expressão em

Escherichia coli sítios de restrição Xmal e XbaI flanqueando (5' a 3')

GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGGAT

GATGATTCTATTGCATCTCTGAGCACGTCCTATGAAGCTCCTAGCTACCGCAA

GCGTGCGGATAAACTGATTGGCGAAGTGAAAAATATCTTTGATCTGATGTCTG

TGGAGGATGGTGTTTTCACTAGCCCGCTGAGCGACCTGCACCATCGCCTGTGG

ATGGTTGACTCTGTTGAACGCCTGGGCATCGACCGTCACTTTAAGGACGAGAT

CAACAGCGCTCTGGATCATGTGTACTCTTACTGGACCGAAAAGGGTATCGGC

CGTGGCCGTGAATCTGGTGTAACCGATCTGAACAGCACCGCACTGGGCCTGC

GTACCCTGCGCCTGCACGGTTATACCGTATCTAGCCATGTCCTGGATCACTTC

AAGAACGAAAAAGGTCAGTTCACTTGTTCCGCX5ATCCAGACCGAAGGCGAAA

TTCGTGACGTTCTGAACCTGTTCCGTGCGTCCCTGATCGCGTTTCCGGGTGAA

AAGATCATGGAAGCGGCCGAAATCTTCTCCACCATGTACCTGAAAGACGCTC

TGCAGAAAATTCCGCCGTCCGGTCTGAGCCAGGAAATTGAATATCTGCTGGA

GTTCGGCTGGCACACCAACCTGCCGCGTATGGAAACCCGCATGTAT ATCGAC

GTCTTTGGCGAAGACACCACCTTCGAAACCCCGTACCTGATCCGTGAAAAACT gctggaactggcgaaactggaatttaacatctttcattccctogtgaaacgtg

aactgcagtccctgtcccgctggtggaaggactacggtttccctgaaatcacc

ttctctcgtcaccgtcacgtagaatactacaccctggctgcctgtatcgctaa

tgacccgaaacacagcgcttttcgtctgggcttcggtaaaatctctcacatga

ttaccatcctggatgacatttatgacaccttcggcaccatggaagagctgaaa

ctgctgaccgcagctttcaaacgttgggacccgagctccattgagtgtctgcc

agactatatgaagggtgtttatatggcagtttacgataacattaacgagatg

gcgcgtgaagcgcagaagatccagggttgggacacggtttcctatgcgcgca

agtcttgggaagcntttatcggcgcgtacattcaggaggctaaatggatttct

tccggctacctgccgaccttcgacgaatacctggagaacggtaaagtctcctt

cggctcccgtatcactaccctggaaccgatgctgactctgggttttccgctgc

cgcctcgtattctgcaggaaatcgacttcccgtctaaattcaacgacctgatc

tgtgcaatcctgcgtctgaaaggcgatactcagtgctataaagcggaccgtg

cacgcggtgaagaagcctctgcggtttcctgttatatgaaagaccatccgggt

attaccgaagaagatgccgtaaaccaggtgaacgcgatggtggataatctga

ccaaagaactgaactgggaactgctgcgtccggattccggcgtcccgatcag

ctataaaaaggtggcgttcgatatttgccgcgttttccactacggttacaaat

atcgcgatggtttctccgtggcatctatcgaaatcaaaaacctggtgactcgt

accgtcgtggaaacggtgccgctgtgatagtaatctagaggaattt

SEQ ID NO: 9

região KanMX-PMET3 de pAM328 (5' a 3')

gaattcgcccttntggatggcggcgttagtatcgaatcgacagcagtatagc

gaccagcattcacatacgattgacgcatgatattactttctgcgcacttaact

tcgcatctgggcagatgatgtcgaggcgaaaaaaaatataaatcacgctaac

atttgattaaaatagaacaactacaatataaaaaaactatacaaatgacaag

ttcttgaaaacaagaatctttttattgtcagtactgattagaaaaactcatcg

agcatcaaatgaaactgc aatttattcatatcaggattatcaataccatattt

ttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccat

aggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaat

acaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcac

catgagtgacgactgaatccggtgagaatckm:aaaacm:ttatgcatttctttc

cagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatc aaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcga TCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGA

ACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAAT

ACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATC

AGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGC

CAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCC

ATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTG

TCGCACCTGATTGCCCGACAITATCGCGAGCCCAnTATACCCATATAAATCA

GCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACC

CATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTTT

AAAAGG AAGTATATGAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCTTTTATA

TTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGTGAGGGGAG

CGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAATTTTTGCTTCGCGCC

GTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGATTATACATGGGGATGTATGG

GCTAAATGTACGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTGAGCTGCGCACGTCAAG

ACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGGCCGGGTGACCCGGC

GGGGACGAGGCAAGCTAAACAGATCTGATCTTGAAACTGAGTAAGATGCTCA

GAATACCCGTCAAGATAAGAGTATAATGTAGAGTAATATACCAAGTATTCAG

CATATTCTCCTCTTCTTTTGTATAAATCACGGAAGGGATGATTTATAAGAAAA

ATGAATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATA

TGTACGTAGTGGTATAAGGTGAGGGGGTCCACAGATATAACATCGTTTAATTT

AGTACTAACAGAGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTAC

AGATATGACACACTTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAA

AAAAAGGTCACGTGACCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCAT

TCTAGCGGTCCCTGTCGTGCACACTGCACTCAACACCATAAACCTTAGCAACC

TCCAAAGGAAATCACCGTATAACAAAGCCACAGTTTTACAACTTAGTCTCTTA

TGAAGTTACTTACCAATGAGAAATAGAGGCTCTTTCTCGAGAAATATGAATAT

GGATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTAAACTTGGTTCTTT

TTTAGCITGTGATCTCTAGCTTGGGTCTCTCTCTGTCGTAACAGTTGTGATATC

GNAAGGGCGAATTC

SEQ ID NO: 10 pAM178(5' a 3')

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGA GACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAG GGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGOCAT

CAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATCGACTACGTCGTAAGGCCGTT

TCTGACAGAGTAAAATTCTTGAGGGAACTTTCACCATTATGGGAAATGCTTCA

AGAAGGTATTGACTTAAACTCCATCAAATGGTCAGGTCATTGAGTGTTTTTTA

TTTGTTGTATTTTTTTTTTTTTAGAGAAAATCCT

GTAGTTTCATGATTTTCTGTTACACCTAACrrTTTGTGTGGTGCCCT

GTCAATATTAATGTTAAAGTGCAATTCTTTTTCCTTATCACGTTGAGCCATTAG

TATCAATTTGCrTACCTGTATTCCTTTACTATCCTCCTTTr^

AATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTCTACCCTATGAACATATTCCATTT

TGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTTCATTTATAAAGTTTATGTACAAA

TATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGC

GACAGCATCACCGACTTCGGTGGTACTGTTGGAACCACCTAAATCACCAGTTC

TGATACCTGCATCCAAAACCTTTITAACTGCATCTrCAATGGCCTTACCTTCTT

CAGGCAAGTTCAATGACAATTTCAACATCATTGCAGCAGACAAGATAGTGGC

GATAGGGTCAACCTTATTCTTTGGCAAATCTGGAGCAGAACCGTGGCATGGTT

CGTACAAACCAAATGCGGTGTTCTTGTCTGGCAAAGAGGCCAAGGACGCAGA

TGGCAACAAACCCAAGGAACCTGGGATAACGGAGGCTTCATCGGAGATGATA

TCACCAAACATGTTGCTGGTGATTATAATACCATTTAGGTGGGTTGGGTTCTT

AACTAGGATCATGGCGGCAGAATCAATCAATTGATGTTGAACCTTCAATGTA

GGGAATTCGTTCTTGATCGTTTCCTCCACAGTTmCTCCATAATCTTGAAGAG

GCCAAAAGATTAGCTTTATCCAAGGACCAAATAGGCAATGGTGGCTCATGTT

GTAGGGCCATGAAAGCGGCCATTCrTGTGATTCTTTGCACTTCTGGAACGGTG

TATTGTTCACTATCCCAAGCGACACCATCACCATCGTCTrCCTTrCTCTTACCA

AAGTAAATACCTCCCACTAATTCTCTGACAACAACGAAGTCAGTACCTTTAGC

AAATTGTGGCTTGATTGGAGATAAGTCTAAAAGAGAGTCGGATGCAAAGTTA

CATGGTCTTAAGTrGGCGTACAArrGAAGTTCTTTACGGATTTTTAGTAAACC

TTGTTCAGGTCTAACACTACCGGTACCCCATTTAGGACCAGCCACAGCACCTA

ACAAAACGGCATCAACCTTCTTGGAGGCTTCCAGCGCCTCATCTGGAAGTGG

AACACCTGTAGCATCGATAGCAGCACCACCAATTAAATGATTTTCGAAATCG

AACTTGACATTGGAACGAACATCAGAAATAGCTTTAAGAACCTTAATGGCTT

CGGCTGTGATTTCTTGACCAACGTGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTA

GGGGCAGACATTACAATGGTATATCCTTGAAATATATATAAAAAAAGGCGCC

TTAGACCGCTCGGCCAAACAACCAATTACTTGTTGAGAAATAGAGTATAATT

ATCCTATAAATATAACGTTTTTGAACACACATGAACAAGGAAGTACAGGACA ATTGATTTTGAAGAGAATGTGGATmGATGTAATTGTTGGGATTCCATTrTTA

ATAAGGCAATAATATTAGGTATGTGGATATACTAGAAGTTCTCCTCGACCGTC

GATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCA

GGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATrTTTGTTAAA

TCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCA

AAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTC

CACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCA

GGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGA

GGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGC

TTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAA

AGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACC

ACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCGCGCCATTCGC

CATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCT

ATTACGCCAGCTGAATTGGAGCGACCTCATGCTATACCTGAGAAAGCAACCT

GACCTACAGGAAAGAGTTACTCAAGAATAAGAATTTTCGTTTTAAAACCTAA

AAAATCATAAATCATAAGAMTTCGCTTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCT

ACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTTCGTAAATTTCTGGCAAGGTAGACA

AGCCGACAACCTTGATTGGAGACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAATTGTTA

ATTAAGAGCTCAGATCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCATCGATACTAGTG

CGGCCGCCCTTTAGTGAGGGTTGAATTCGAATTTTCAAAAATTCTTACTTTTTT

TTTGGATGGACGCAAAGAAGTTTAATAATCATATTACATGGCATTACCACCAT

ATACATATCCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAAT

GTAAAGAGCCCCATTATCITAGCCrAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAG

TAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGA

GCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCAC

CGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAAT

AAAGATTCTACAATACTAGCITTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGT

AACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGA

TGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAG

CGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCAC

TTTAACTAATACrrrCAACATTTrCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAA

TAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGA

GAAAAAACCCCGGATCCGTAATACGACTCACTATAGGGCCCGGGCGTCGACA TGOAACAGAAGTTGATTTCCGAAGAAGACCTCGAGTAAGCTTGGTACCGCGG CTAGCTAAGATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTC TAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTΑΤΑ

CTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGATCCAGCTGCATTA

ATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC

GCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGT

ATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAAC

GCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAA

AAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA

CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAG

ATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCC

TGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTT

TCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA

GCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCG

GTAACTATCGTCITGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCA

GCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAG

AGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGT

ATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG

ATCCGGCAMCAAACCACCGCTGGTAGTCGGTGGTTlTrTTGTTTGCAAGCAGC

AGArrACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTAC

GGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATG

AGATTATCAAAAAGGATCTTCACCrAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTT

TAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCT

TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTT

GCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGG

CCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT

CAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAA

CTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGT

AGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGT

GGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGAT

CAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTC

GGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGT

TATGGCAGCACTGCATAATOTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTC tgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaataototatgcggcga

ccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagca

gaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctca

aggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaa

ctgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacag

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taatttttcaaacaaagaatctgagctgcattntacagaacagaaatgcaac

gcgagagcgctattttaccaacaaagaatctatacttcttttttgttctacaa

aaatgcatcccgagagcgctatttttctaacaaagcatcttagattacttttt

ttctc(mtgtgcgctctataatck:agtcrcitgataactitttgcactgtagg

tccgttaaggttagaagaaggctacitrggtgtctattttctcttccataaaa

aaagcctgactccacttcccgcgtttactgattactagcgaagctgcgggtgc

attttttcaagataaaggcatccccgattatattctataccgatgtggattgc

gcatactttgtgaacagaaagtgatagcgttgatgattcttcattggtcagaa

aattatgaacggtttcitctattttgtctctatatactacgtataggaaatgtt

tacattttcgtattgtittcgattcactctatgaatagttcttactacaattttt

ttgtctaaagagtaatactagagataaacataaaaaatgtagaggtcgagtt

tagatgcaagttcaaggagcgaaaggtggatgggtaggttatatagggatat

agcacagagatatatagcaaagagatacttttgagcaatgtttgtggaagcg

gtattcgcaatattttagtagctcgttacagtccggtgcgtttttggttttttg

aaagtgcgtcttcagagcgcttttggttttcaaaagcgctctgaagttcctat

actttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaaagcgtttccgaaa

acgagcgcttccgaaaatgcaacgcgagctgcgcacatacagctcactgttc

acgtcgcacctatatctgcgtgttgcctgtatatatatatacatgagaagaac

ggcatagtgcgtgtttatgcttaaatgcgtacttatatgcgtctatttatgta

ggatgaaaggtagtctagtacctcctgtgatattatcccattccatgcggggt

atcgtatgcitccttcagcactaccctttagctgttctatatgctgccactcct

caattggattagtctcatccitcaatgctatcatttccntgatattggatcat actaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcac

gaggccctttcgtc

SEQ ID NO: 11

Iniciador 4-49 mvaA SpeI (de 5' a 3') gctactagtaggaggaaaacatcatgcaaagtttagataagaatttccg

SEQ ID NO: 12

Iniciador 4-49 mvaARXbaI(áe 5' a 3') gcttctagactattgttgtctaatttcttgtaaaatgcg

SEQ ID NO: 13

Iniciador HMGS 5' Sa mvaS-S (de 5' a 3')

gaactgaagatctaggaggaaagcaaaatgacaataggtatcgacaaaata aact

SEQ ID NO: 14

Iniciador HMGS 3' Sa mvaS-AS (de 5' a 3')

ttgcatgatgttttcctcctactagttactctggtctgtgatattcgcgaac SEQ ID NO: 15 Inieiador 67-IA-C (de 5' a 3')

acactcgaggaggaataaatgagttttgatattgccaaatacccg

SEQ ID NO: 16 Inieiador 67-1B-C (de 5' a 3')

tgatggtaccttatgccagccaggccttgattttggc

SEQ ID NO: 17 Inieiador 67-IC-C (de 5' a 3')

actaggtaccaggaggaataaatgaagcaactcaccattctgggc

SEQ ID NO: 18

Inieiador 67-1D-C (de 5'a 3')

aattgatgggccctcagcttgcgagacgcatcacctc

SEQ ID NO: 19 Iniciador 67-IEC (de 5' a 3')

CATAAAGGGCCCAGGAGGAATAAATGGCAACCACTCATTTGGATG

SEQ ID NO: 20

Iniciador 67-IF-C Cde 51 a 3') TATTGTTCATATGTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTTCG

SEQ ID NO: 21

Iniciador 67-IG-C (de 5' a 3')

AACTAACACATATGAGGAGGAATAAATGCGGACACAGTGGCCCTC SEQ ID NO: 22 Inieiador 67-IH-C (de 5' a 3')

TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGCTCTGTGCAATGG SEQ ID NO: 23 Inieiador 67-2A-C (de 5' a 3')

ACGGGATCCAGGAGGAATAAATGCGAATTGGACACGGTTTTGACG

SEQ ID NO: 24 Inieiador 67-2B-C (de 5' a 3') TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC

SEQ ID NO: 25 Inieiador 67-2C-C (de 5' a 3') TACTAAGGGCCCAGGAGGAAATAATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACG

SEQ ID NO: 26

Inieiador 67-2D-C (de 5' a 3')

TCCGGGTACCTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTC AATTCG

SEQ ID NO: 27 Inieiador 67-2E-C (de 5' a 3') AACAGGTACCAGGAGGAAATAATGCAGATCCTGTTGGCCAACC

SEQ ID NO: 28 Inieiador 67-2F-C (de 5' a 3') TGGATGAAGTCGACTTAATCGACTTCACGAATATCGACACGCAGC

SEQ ID NO: 29 Iniciador 67-2G-C (de 5' a 3')

CATCAAGTCGACAGGAGGAAATAATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTG

SEQ ID NO: 30 Inieiador 67-2H-C (de 5' a 3') TAATGC AAGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG SEQ ID NO: 31

Inieiador 67-2I-C (de 5' a 3')

CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGC AACTCG SEQ ID NO: 32 Inieiador 67-2J-C (de 5* a 3')

TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC

SEQ ID NO: 33 Inieiador 9-156A (de 5' a 3*)

ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG

SEQ ID NO: 34 Inieiador 9-156B (de 5'a 3') TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG

SEQ ID NO: 35

Inieiador 61-67-CPK001-G (de 5' a 3') GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACT

SEQ ID NO: 36

Inieiador 61-67-CPK002-G (de 5' a 3')

ACTGCAAAGTACACATATATCCCGGGTGTCAGCTCTTTTAGATCGG

SEQ ID NO: 37

Inieiador 61-67-CPK003-G (de 5' a 3') CCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGT

SEQ ID NO: 38

Iniciador 61-67-CPK004-G (de 5' a 3') GTTTAAACGGCGTCAGTCCACCAGCTAACA

SEQ ID NO: 39

Inieiador 61-67-CPK005-G (de 5' a 3') GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACAC

SEQ ID NO: 40

Inieiador 61-67-CPK006-G (de 5' a 3')

AAAGATGAATTGAAAAGCTTCCCGGGTATGGACCCTGAAACCACAG

SEQ ID NO: 41

Inieiador 61-67-CPK007-G (de 5' a 3')

j Q CTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTT

SEQ ID NO: 42

Inieiador 61-67-CPK008-G (de 5' a 3*) GTTTAAACCCAACAATAATAATGTCAGATC

SEQ ID NO: 43 Inieiador 61-67-CPK009-G (de 5' a 3')

GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGA SEQ ID NO:44

Inieiador 61-67-CPK010-G (de 5' a 3*) ATCTCTCGCAAGAGTCAGACTGACTCCCGGGCGTGAATAAGCTTCGGGTGAC CCTTATGGCATTCTTTTT

SEQ ID NO:45

Inieiador 61-67-CPK011-G (de 5' a 3')

AAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTCAGT CTGACTCTTGCGAGAGAT

SEQ ID NO: 46

Inieiador 61-67-CPK012-G (de 5' a 3') GTTTAAACAATTTAGTGTCTGCGATGATOA

SEQ ID NO: 47

Iniciador 61-67-CPK013-G (de 5' a 3") GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTC

SEQ ID NO: 48

Inieiador 61-67-CPK014alt-G (de 5' a 3') GCGGGGACGAGGCAAGCTAAACTTTAGTATATTCTTCGAAGAAA SEQ ID NO: 49

Inieiador 61-67-CPK015alt-G (de 5' a 3')

TTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGC SEQ ID NO: 50

Inieiador 61-67-CPK016-G (de 5* a 3')

CAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTCCCGGGTGGATGGCGGCGTT AGTATCG

SEQ ID NO: 51

Inieiador 61 -67-CPKO17-G (de 5' a 3')

CGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTCCAC GTTGATrG

SEQ ID NO:52

Inieiador 61-67-CPKO 18-G (de 5' a 3') GTTTAAACGCCGCCGTTGTTGTTATTGTAG

SEQ ID NO:53

Inieiador 61-67-CPKO 19-G (de 5' a 3') GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAA

SEQ ID NO: 54

Inieiador 61-67-CPK020-G (de 5' a 3')

GGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACGTCTTCCTTTCTCTTACCAA AGT SEQ ID NO: 55

Iniciador 61-67-CPK021-G (de 5' a 3')

ACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCA CCC

SEQ ID NO: 56

Inieiador 61-67-CPK022-G (de 5' a 3')

AATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCG AATCGACAGC

SEQ ID NO: 57

Inieiador 61-67-CPK023-G (de 5' a 3')

GCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAAAGATTCTCTTTTTT TATGATATT

SEQ ID NO: 58

Inieiador 61-67-CPK024-G (de 5' a 3')

GTTTAAACGTGTTAACGTTTCTTTCGCCTACGTGGAAGGAGAATC Inieiador 61-67-CPK050-G (de 5' a 3*) AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGA

SEQ ID NO:68

Inieiador 61-67-CPK051-G (de 5' a 3')

TCCTAATTTCTTTTTCTGAAGCCATTTATATTGAATmCAAAAATT

SEQ ID NO: 69

Inieiador 61-67-CPK052-G (de 5' a 3') AGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTITITCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO: 70 Inieiador 61-67-CPK053-G (de 5' a 3')

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAAACT

SEQ ID NO: 71

Inieiador 61-67-CPK054-G (de 5' a 3') AATrmGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTT

SEQ ID NO: 72

Iniciador 61-67-CPK055-G (de 5' a 3")

aacaaagtttagttgagagtttcatttatattgaattttcaaaaatt

SEQ ID NO: 73

Inieiador 61-67-CPK056-G (de 5' a 3') aatttttgaaaattcaatataaatgtctcagaacgtttacattgtat

SEQ ID NO: 74

Inieiador 61-67-CPK057-G (de 5' a 3') atacaatgtaaacgttctgagacatttatattgaattttcaa aaatt

SEQ ID NO: 75

Inieiador 61-67-CPK058-G (de 5' a 3')

tgcagaagttaagaacggtaatgacattatagttttttctccttgacgtta

SEQ ID NO: 76 Inieiador 61-67-CPK059-G (de 5' a 3')

taacgtcaaggagaaaaaactataatgtcattaccgttcttaacttctgca

SEQ ID NO: 77

Inieiador 61-67-CPK060-G (de 5' a 3') aatttttgaaaattcaatataaatgtcagagttgagagccttcagtg

SEQ ID NO: 78

Inieiador 61-67-CPK061-G (de 5' a 3')

cactgaaggctctcaactctgacatrtatattgaattttcaaaaatt

SEQ ID NO: 79

Inieiador 61-67-CPK062-G (de 5' a 3*)

ggtaacggatgctgtgtaaacggtcattatagtitntctccttgacgtta

SEQ ID NO: 80

Inieiador 61-67-CPK063-G (de 5' a 3') TAACGTCAAGGAQAAAAAACTATAATGACCOTTTACACAGCATCCGTTACC

SEQ ID NO: 81

Iniciador 61-67-CPK064-G (de 5' a 31)

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGC

SEQ ID NO: 82

Iniciador 61-67-CPK065-G (de 5' a 3')

GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAA AAATT

SEQ ID NO: 83

Iniciador 61-67-CPK066-G (de 5' a 3')

GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCAC AGGAAACAGCTATGACC

SEQ ID NO: 84

Inieiador 61-67-CPK067-G (de 5' a 3')

TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCGAAAAGTT GTAAAACGACGGCCAGT

SEQ ID NO: 85

Inieiador 50-56-pwl00-G (de 5' a 3")

GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAGTGGATGG CGGCGTTAGTATC

SEQ ID NO: 86

Inieiador 50-56-pwl01-G (de 5' a 3')

CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACA ACTGTTACGA

SEQ ID NO: 87

Inieiador PW-91-079-CPK373-G (de 5' a 3') TCGACTACGTCGTAAGGCCGT SEQ ID NO: 88

Inieiador PW-91-079-CPK374-G (de 5" a 3') GCATCTGTGCGGTATTTCACTATATATATTTCAAGGATATAC SEQ ID NO: 89

Iniciador PW-91-079-CPK376-G (de 5' a 3') TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTG

SEQ ID NO: 90

Iniciador PW-91-079-CPK375-G (de 5' a 3') GTATATCCTTGAAATATATATAGTGAAATACCGCACAGATGC

Claims

1. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de compreender ou de ser obtenível de uma mistura compreendendo: (a) um isoprenóide bicíclico Ci0; (b) um combustível baseado em petróleo; e (c) um aditivo de combustível, sendo que a quantidade do isoprenóide bicíclico Cio é Pel° menos cerca de 2% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C e uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m .

2. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de compreender ou de ser obtenível de uma mistura compreendendo: (a) um isoprenóide bicíclico Ci0; (b) um combustível baseado em petróleo; (c) um aditivo de combustível; e (d) um composto aromático, sendo que a quantidade de o isoprenóide bicíclico C]0 é pelo menos cerca de 2% em volume, a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, e a quantidade do composto aromático é de cerca de 5% em volume a cerca de 35% em volume, todas as quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C e uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m3.

3. Composição de combustível de jato, caracterizada pelo fato de compreender: (a) um isoprenóide bicíclico C]0; (b) um combustível baseado em petróleo; e (c) um aditivo de combustível de jato; e sendo que a quantidade do isoprenóide bicíclico Ci0 é pelo menos cerca de 2% em volume, a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem uma densidade de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3 a 15°C, um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

4. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o isoprenóide bicíclico Ci0 é carano, pinano, sabinano, ou uma combinação dos mesmos.

5. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a quantidade do isoprenóide bicíclico C10 é pelo menos cerca de 2% em volume, baseada no volume total da composição.

6. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a quantidade do isoprenóide bicíclico Ci0 é pelo menos cerca de 10% em volume, baseada no volume total da composição.

7. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a quantidade do isoprenóide bicíclico Ci0 é pelo menos cerca de 15% em volume, baseada no volume total da composição.

8. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a quantidade do isoprenóide bicíclico Ci0 é pelo menos cerca de 30% em volume, baseada no volume total da composição.

9. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende p-cimeno.

10. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a quantidade do composto aromático é no máximo cerca de 25% em volume, baseada no volume total da composição.

11. Composição de combustível de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o combustível baseado em petróleo é querosene.

12. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o combustível baseado em petróleo é Jato A, Jato A-I ou Jato B.

13. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 12, caracterizada a composição de combustível pelo fato de que atende à especificação ASTM D 1655 para Jato A.

14. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 12, caracterizada a composição de combustível pelo fato de que atende à especificação ASTM D 165 5 para Jato A-1.

15. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 12, caracterizada a composição de combustível pelo fato de que atende à especificação ASTM D 1655 para Jato B.

16. Composição de combustível de jato de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o aditivo de combustível é pelo menos um aditivo selecionado do grupo consistindo de um oxigenado, um antioxidante, um aperfeiçoador de estabilidade térmica, um estabilizador, um aperfeiçoador de fluxo a frio, um aperfeiçoador de combustão, um antiespumante, um aditivo anti-névoa, um inibidor de corrosão, um aperfeiçoador de lubricidade, um inibidor de formação de gelo, um aditivo de limpeza de injetor, um supressor de fumaça, um aditivo redutor de arrasto, um desativador de metal, um dispersante, um detergente, um desemulsificador, um corante, um marcador, um dissipador estático, um biocida, e suas combinações.

17. Método para preparar a composição de combustível, caracterizado pelo fato de compreender: (a) contactar um material de partida isoprenóide Cj0 com hidrogênio na presença de um catalisador para formar um isoprenóide bicíclico Cio; e (b) misturar o isoprenóide bicíclico Ci0 com um combustível baseado em petróleo para preparar a composição de combustível; sendo que a quantidade do isoprenóide bicíclico Cj0 é pelo menos cerca de 2% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o material de partida isoprenóide Cio é careno, α-pineno, β- pineno, sabineno, ou uma combinação dos mesmos.

19. Método para preparar a composição de combustível a partir de um açúcar simples, caracterizado pelo fato de: (c) contactar uma célula capaz de preparar um material de partida isoprenóide Cio com o açúcar simples sob condições adequadas para preparar o material de partida isoprenóide Ci0; (d) converter o material de partida isoprenóide Ci0 em um isoprenóide bicíclico Cio; e (e) misturar o isoprenóide bicíclico Ci0 com um combustível baseado em petróleo para preparar a composição de combustível, sendo que a quantidade do isoprenóide bicíclico Ci0 é pelo menos cerca de 2% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o material de partida isoprenóide Cio é careno, α-pineno, β- pineno, sabineno, ou uma combinação dos mesmos.

21. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 20.

22. Veículo, caracterizado pelo fato de compreender um motor de combustão interna, um tanque de combustível conectado no motor de combustão interna, e a composição de combustível no tanque de combustível, sendo que a composição de combustível é a composição de combustível como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo que a quantidade do isoprenóide bicíclico Ci0 é pelo menos cerca de 2% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C, e sendo que a composição de combustível é usada para acionar o motor de combustão interna.

23. Método para acionar um motor, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de comburir a composição de combustível como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 no motor.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o motor é um motor a jato.