BRPI0717904B1 - "método para controlar as ervas daninhas, método para produzir uma linhagem vegetal de híbrido de sorgo e método para identificar linhagens vegetais de sorgo". - Google Patents

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(54) Título: MÉTODO PARA CONTROLAR AS ERVAS DANINHAS, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA LINHAGEM VEGETAL DE HÍBRIDO DE SORGO E MÉTODO PARA IDENTIFICAR LINHAGENS VEGETAIS DE SORGO.

(51) Int.CI.: C12N 15/82 (30) Prioridade Unionista: 07/12/2006 US 60/873,529 (73) Titular(es): KANSAS STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION (72) Inventor(es): MITCHELL R. TUINSTRA; KASSIM AL-KHATIB

1/37 “MÉTODO PARA CONTROLAR AS ERVAS DANINHAS, MÉTODO PARA

PRODUZIR UMA LINHAGEM VEGETAL DE HÍBRIDO DE SORGO E

MÉTODO PARA IDENTIFICAR LINHAGENS VEGETAIS DE SORGO” [001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 60/873.529, depositado em 7 de dezembro de 2006, incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [002] A presente invenção se refere a composições e métodos para produzir cultivares de sorgo que são resistentes aos herbicidas. Em particular, a presente invenção se refere a plantas de sorgo, tecido vegetais e sementes de plantas que contêm genes de acetolactato sintase (ALS) alterados e proteínas que são resistentes à inibição por herbicidas que normalmente inibem a atividade da proteína ALS.

Antecedentes da Invenção [003] O sorgo é o segundo mais importante grão alimentício de cereal cultivado nos Estados Unidos. Sua produção é crítica para fazendas que operam em áreas de chuvas marginais devido à capacidade do sorgo de tolerar aridez e calor. Tanto as indústrias de animais quando as de bioenergia utilizam o sorgo como um substrato de energia, o que faz dele uma cultura versátil.

[004] Em termos mundiais, o sorgo é o quinto grão alimentício de cereal mais importante. Como é tolerante tanto à aridez quanto ao calor, ele é certamente o grão alimentício mais amplamente cultivado nas regiões semiáridas da África subsaariana e na região peninsular central da Índia. Assim sendo, o sorgo é usado para consumo humano na maior parte das regiões mais secas do mundo, o que faz dele uma cultura da maior importância nessas localidades.

[005] O desenvolvimento da resistência aos herbicidas em plantas oferece uma produção significativa e vantagens econômicas, de modo

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2/37 que o uso de herbicidas para controlar as ervas daninhas nas culturas se tornou uma prática quase que universal. Todavia, a aplicação desses herbicidas pode também resultar na morte ou reduzir o crescimento da planta cultivada desejada, tornando o tempo e o método de aplicação críticos ou em alguns casos inviáveis.

[006] De particular interesse para os fazendeiros é o uso de herbicidas de maior potência, amplo espectro de ação contra as ervas daninhas e rápida degradação no solo. As plantas, os tecidos vegetais e as sementes com resistência a esses compostos constituem uma solução atraente pelo fato de permitirem que herbicidas sejam usados para controlar o crescimento das ervas daninhas, com pequeno risco de danos para a cultura. Uma dessas classes de herbicidas de amplo espectro é a que inibe a atividade da enzima acetolactato sintase (ALS) em uma planta. A acetolactato sintase é necessária para a produção de aminoácidos essenciais tais como a valina, a leucina e a isoleucina nas plantas (essa via bioquímica não está presente nos seres humanos ou nos outros animais). O sorgo é suscetível a diversos herbicidas que inibem A ALS que têm como alvo espécies monocotiledônas, tornando o uso desses herbicidas para controlar ervas daninhas gramíneas quase impossível, pois eles inibem também o crescimento das plantas cultivadas.

[007] Os herbicidas acetolactato sintase controlam um amplo espectro de gramíneas e ervas daninhas de folha larga em doses de aplicação muito baixas. Existem atualmente mais de 56 diferentes espécies de herbicidas ALS disponíveis feitos a partir de várias formulações de sulfoniluréias (SU), imidazolinonas (IMI), triazolopirimidinas (TP) e pirimidiniltiobenzoatos (PTB). Constatou-se que mutações em algumas plantas cultivadas, por exemplo, tabaco, milho (US Patente No, 5.767.361) e soja, conferem resistência ao herbicida ALS, entretanto até a presente data tal verificação não foi feita em

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3/37 relação ao sorgo (para exame ver Tan et al., 2005, Pest. Manag. Sci. 61:246257). Devido à importância do sorgo no cenário mundial, são precisos cultivares de sorgo que sejam resistentes aos efeitos inibidores dos herbicidas

ALS, permitindo assim um rendimento maior quando esses herbicidas são usados para controlar ervas daninhas gramíneas.

Descrição Resumida da Invenção [008] A presente invenção se refere a composições e métodos para produzir cultivares de sorgo que são resistentes a herbicidas. Em particular, a presente invenção se refere a plantas de sorgo, tecidos vegetais e sementes vegetais que contêm genes da acetolactato sintase (ALS) alterados e proteínas que são resistentes à inibição pelos herbicidas que normalmente inibem a atividade da Proteína ALS.

[009] O sorgo cultivado (Sorgo bicolor (L.) Moench) é suscetível a vários herbicidas inididores de ALS cujo alvo são as espécies monocotiledôneas ou gramíneas. A análise genética identificou diferenças genéticas no germoplasma do sorgo que resulta em um fenótipo de resistência ao herbicida ALS.

[0010] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a uma ou mais plantas de sorgo cujo germoplasma compreende uma mutação que torna a planta resistente aos herbicidas ALS. Além disso, em outros modos de realização, a presente invenção trata da descendência (por exemplo, F1, F2, F3, etc.) de um cruzamento da referida planta em que o germoplasma da referida descendência possui a mesma mutação que a planta progenitora. Consequentemente, os modos de realização da presente invenção se referem a híbridos de sorgo cujo germoplasma contém uma mutação, tal como o fenótipo é de resistência ao herbicida ALS.

[0011] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo, em que o germoplasma do referido híbrido de sorgo

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4/37 confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetolactato sintase em níveis dos referidos um ou mais herbicidas que normalmente inibiriam o crescimento de um híbrido de sorgo. Em alguns modos de realização, os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase pertencem a um grupo constituído por sulfoniluréias, imidazolinonas, triazolopirimidas e pirimidiniltiobenzoatos. Em alguns modos de realização, o referido germoplasma de híbrido de sorgo que confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetolactato sintase compreende mutações no gene de acetolactato tal como encontrado no ATCC No. PTA-7999. Em alguns modos de realização, as sementes do referido híbrido de sorgo são revestidas com um herbicida acetolactato sintase.

[0012] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um método para controlar as ervas daninhas nas proximidades de um híbrido de sorgo tal como descrito aqui, que compreende fornecer um ou mais herbicidas acetolactato sintase, aplicar os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase em um campo que compreende um híbrido de sorgo tal como descrito aqui, e controlando as ervas daninhas nas proximidades do referido híbrido de sorgo de modo que o crescimento da erva daninha seja adversamente afetado pela aplicação dos referidos um ou mais herbicidas e o crescimento do referido híbrido de sorgo não seja adversamente afetado. Em alguns modos de realização, os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase pertencem a um grupo constituído por sulfoniluréias, imidazolinonas, triazolopirimidas e pirimidiniltiobenzoatos. Em alguns modos de realização, o referido híbrido de sorgo compreende uma ou mais mutações no gene da acetolactato sintase tal como encontrado na ATCC No. PTA-7999.

[0013] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo, em que o referido híbrido de sorgo compreende um germoplasma que compreende uma ou mais mutações no gene da acetolactato

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5/37 sintase de modo que resistência a um ou mais herbicidas acetolactato sintase seja conferida ao referido híbrido. Em alguns modos de realização, o referido híbrido de sorgo é criado por introgressão de um germoplasma de sorgo que compreende as referidas uma ou mais mutações para conferir resistência a um ou mais herbicidas acetolactato sintase. Em alguns modos de realização, o referido híbrido de sorgo é criado por incorporação de um gene heterólogo que compreende uma ou mais mutações para conferir resistência a um ou mais herbicidas acetolactato sintase.

[0014] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um método para produzir uma linhagem vegetal híbrida de sorgo resistente a um ou mais herbicidas acetolactato sintase que compreende a identificação de um germoplasma que confere a referida resistência a herbicida, em que o referido germoplasma resistente a herbicida deriva de uma planta de sorgo resistente a herbicida, e a introdução do referido germoplasma em uma linhagem vegetal de sorgo de elite. Em alguns modos de realização, a referida introdução da referida linhagem vegetal de sorgo de elite é realizada por introgressão. Em alguns modos de realização, a referida introdução do referido germoplasma na referida linhagem vegetal de sorgo de elite é por introdução de um gene heterólogo.

[0015] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo em que o germoplasma do referido híbrido compreende resistência conferida a um ou mais herbicidas acetolactato sintase e resistência a um ou mais compostos de um ou mais grupos herbicidas que não são inibidores da acetolactato sintase.

[0016] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um método para identificar linhagens vegetais de sorgo resistentes a herbicidas acetolactato sintase que compreende fornecer uma amostra de ácido nucleico para uma planta de sorgo, fornecer primers de amplificação para

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6/37 amplificar uma região de uma planta de sorgo que corresponde a um gene da acetolactato sintase presente na referida amostra de ácido nucleico, aplicar os referidos primers de amplificação à referida amostra de ácido nucleico de modo que a amplificação da referida região do referido gene da acetolactato sintase gene ocorra, e identificar as plantas de sorgo resistentes a herbicidas acetolactato sintase com base na presença de uma ou mais mutações que conferem resistência a herbicidas acetolactato sintase presentes na referida amostra de ácido nucleico amplificada.

[0017] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a sementes de sorgo em que o referido germoplasma das referidas sementes compreende um gene da acetolactato sintase mutante de modo que a referida mutação confira resistência à inibição por herbicidas acetolactato sintase. Em alguns modos de realização, o germoplasma das referidas sementes de sorgo compreende um gene da acetolactato sintase gene mutante tal como encontrado no ATCC No. PTA-7999. Em alguns modos de realização, o gene da acetolactato sintase mutante é um fragmento funcional do gene tal como encontrado no ATCC No. PTA-7999, tal como o fragmento de gene que codifica para um fragmento de proteína que é suficiente para conferir resistência à inibição por herbicidas acetolactato sintase a uma planta de sorgo. Em alguns modos de realização, a presente invenção se refere a plantas de sorgo que crescem a partir das referidas sementes e outras partes de planta que compreende a referida planta de sorgo cultivada a partir das referidas sementes.

[0018] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a ainda plantas híbridas de sorgo que possuem todas as características fisiológicas e morfológicas da referida planta de sorgo cultivada a partir da referida semente de sorgo. Em outras realizações, a presente invenção se refere a culturas tissulares e culturas tissulares regeneradas que provêm da

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7/37 referida semente de sorgo ou da referida parte vegetal de sorgo que compreende uma mutação no referido gene acetolactato sintase tal como encontrado no ATCC No. PTA-7999.

[0019] Em alguns modos de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo que compreende um gene que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 tal como encontrado no ATCC No. PTA-7999. Em alguns modos de realização, o gene resistente ao herbicida ALS que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 compreende um ou mais das substituições de aminoácidos Val531Ile e Trp545Leu, por exemplo, tal como encontrado na SEQ ID NO: 1.

[0020] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um método de produzir semente de sorgo que compreende cruzar uma planta que compreende um gene da acetolactato sintase mutante tal como encontrado no ATCC No. PTA-7999 com ela mesma ou uma segunda planta de sorgo e coletar a referida semente do referido cruzamento. Em alguns modos de realização, os métodos para produzir a referida semente de sorgo compreendem plantar uma linhagem de sorgo de semente progenitora em que a referida linhagem de semente progenitora compreende um germoplasma que confere resistência aos herbicidas acetolactato sintase com uma linhagem de sorgo polinizadora progenitora em que o referido germoplasma da linhagem de semente polinizadora compreende um germoplasma que confere resistência a

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8/37 herbicidas acetolactato sintase, cultivando a referida semente progenitora e as plantas de sorgo polinizadoras juntamente, permitindo que as referidas plantas de sementes progenitoras sejam polinizadas pelas referidas plantas polinizadoras parentais e colhendo as sementes que resultam da referida polinização.

Descrição das Figuras [0021] A Figura 1 mostra a dupla mutação de Val531Ile e Trp545Leu no gene de sorgo ALS associado com a resistência ao herbicida ALS.

Definições [0022] Tal como usado aqui, o termo “resistente” e “tolerante” designa plantas, por exemplo planta de sorgo, que são capazes de tolerar condições (por exemplo, herbicidas tais como herbicidas ALS) nocivas a outras cepas da mesma espécie.

[0023] Tal como usado aqui, o termo “cultivar” é sinônimo de “variedade” e é usado para designar plantas de colheita que são um grupo de plantas similares que por suas características estruturais e desempenhos podem ser identificadas em relação aos outros cultivares dentro da mesma espécie.

[0024] Tal como usado aqui, o termo “híbrido” designa a descendência ou progênie de progenitores de plantas progenitoras geneticamente dissimilares ou planta-mãe produzida como resultado de polinização cruzada controlada em oposição a uma semente não-híbrida produzida como resultado de polinização natural.

[0025] Tal como usado aqui, o termo “progênie” designa gerações de uma planta, em que a ascendência da geração pode ser traçada para trás até a referida planta.

[0026] Tal como usado aqui, o termo “derivado” de uma planta resistente a herbicidas inclui tanto a progênie dessa planta resistente a

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9/37 herbicidas, bem como qualquer mutante, recombinante, ou derivado geneticamente modificado dessa planta, seja ela da mesma espécie ou de uma espécie diferente, em que a(s) característica(s) de resistência aos herbicidas da planta resistente aos herbicidas original foi(foram) transferida(s) para a planta derivada.

[0027] Tal como usado aqui, o termo tecido vegetal compreende os tecidos de plantas diferenciados e indiferenciados incluindo os que estão presentes em raízes, brotos, folhas, pólen, sementes e tumores, bem como células em cultura (por exemplo, células únicas, protoplastos, embriões, calos, etc.). O tecido vegetal pode estar na planta, na cultura de órgão, na cultura de tecido, ou na cultura de células.

[0028] Tal como usado aqui, o termo parte de planta designa uma estrutura vegetal ou um tecido vegetal, por exemplo, pólen, um óvulo, um tecido, uma vagem, uma semente e uma célula. Em alguns modos de realização da presente invenção plantas transgênicas são plantas de colheita.

[0029] Tal como usado aqui, os termos geração-F e geração filial designa qualquer uma de gerações consecutivas de plantas, células, tecidos ou organismos após um cruzamento biparental. A geração resultante de um acasalamento de um cruzamento biparental (isto é, dois pais) é a primeira geração filial (designada por F1 e F1) em relação a uma semente e sua planta, ao passo que a que resulta do cruzamento de indivíduos F1 é a segunda geração filial (designada por F2 ou F2) em relação a uma semente e sua planta.

[0030] Tal como usado aqui, o termo germoplasma designa qualquer material genético de plantas que contenha unidades funcionais de hereditariedade. O termo germoplasma de elite em relação a uma planta designa o material hereditário de superioridade genética comprovada.

[0031] Tal como usado aqui, o termo planta de elite designa

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10/37 qualquer planta que tenha resultado de melhoramento e seleção para um desempenho agrícola superior. Por exemplo, a planta de elite de sorgo mencionada aqui inclui, mas sem que essa lista seja limitativa, as linhagens de sorgo Tx430, Tx2737, Tx2783, 00MN7645, HP162, Wheatland, Tx3042, OK11,

QL41 e Tx643, Bt.

[0032] Tal como usado aqui, o termo traço ou “fenótipo” designa uma característica observável e/ou mensurável de um organismo. Por exemplo, a presente invenção descreve plantas que são resistentes aos herbicidas ALS.

[0033] Tal como usado aqui, o termo “herbicida ALS”, também conhecido como herbicida AHAS, designa um herbicida que inibe a atividade da enzima acetolactato sintase (também conhecida como acetoidroxiácido sintase) em uma planta. Exemplos de Herbicidas ALS tal como descritos aqui incluem, mas sem que essa lista seja limitativa, as sulfoniluréias (SU), as imidazolinonas (INI), triazolopirimidinas (TI) e os pirimidiniltiobenzoatos.

[0034] Tal como usado aqui, os termos marcador e marcador de DNA e marcador molecular em relação a um marcador selecionável designa um traço fisiológico ou morfológico que pode ser determinado como marcador para sua própria seleção ou para a seleção de outros traços intimamente ligados a esse marcador. Por exemplo, esse marcador pode ser um gene ou traço que esteja associado com tolerância aos herbicidas incluindo, mas sem que essa lista seja limitativa, repetição de sequência simples (SSR), polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), inserções e/ou deleções genéticas, etc.

[0035] Tal como usado aqui, o termo introgresso e introgredindo e “introgressão” designa técnicas convencionais de melhoramento por polinização convencionais (ou seja, clássicas) para incorporar material genético estranho em uma linhagem de matrizes para melhoramento. Por exemplo, a presente invenção se refere a plantas de

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11/37 colheita de sorgo introgredidas com um gene mutante ALS para tolerância aos herbicidas por cruzamento de duas gerações de plantas.

[0036] Tal como usado aqui, o termo tipo silvestre quando faz referência a um gene designa um gene funcional comum em uma população vegetal. Um gene de tipo funcional é o que é mais frequentemente observado em uma população e é assim arbitrariamente designado como forma normal ou tipo silvestre de um gene [0037] Tal como usado aqui, os termos modificado ou mutante ou “mutante funcional” quando faz referência a um gene ou a um produto de gene designa, respectivamente, um gene ou um produto de gene que apresenta modificações na sequência e/ou nas propriedades funcionais (ou seja, características alteradas) quando comparadas com o gene de tipo silvestre ou produto de gene. Assim, os termos modificado e mutante quando usados em relação a uma sequência nucleotídica designa uma sequência de ácido nucleico que difere por um ou mais nucleotídeos de outra, usualmente uma sequência de ácido nucleotídeo relacionada e o termo “mutante funcional” quando usado em relação a um polipeptídeo codifica pelo referido ácido nucleico “modificado” ou “mutante” refere-se à proteína ou polipeptídeo que retém atividade. No presente pedido, a proteína mutante ALS, “ou mutante funcional” desta é um Gene ALS que retém sua atividade nativa para criar aminoácidos essenciais. Adicionalmente, uma sequência nucleotídica “modificada” é interpretada como a que é encontrada no código genético degenerado tal como conhecido pelo técnico no assunto. Por exemplo, o código genético é degenerado quando há vários casos em que códons diferentes especificam os mesmos aminoácidos; um código genético em que alguns aminoácidos podem ser codificados por mais de um códon. Estima-se que a presente invenção compreende essa degenerescência (por exemplo, em que um híbrido de sorgo compreende um Gene ALS que é pelo menos 70%

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12/37 homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo à SEQ ID NO: 1) tal como encontrado, por exemplo, no germoplasma do sorgo.

[0038] Tal como usado aqui, o termo heterólogo quando usado em relação a um gene ou ácido nucleico designa um gene que foi manipulado de alguma maneira.

[0039] Tal como usado aqui, o termo porção ou “fragmento funcional” quando usado em relação a uma proteína (tal como em um fragmento de uma determinada proteína ou “um fragmento de proteína”) refere-se a fragmentos dessa proteína. Os fragmentos podem variar de tamanho desde quatro resíduos de aminoácidos até uma sequência amino inteira menos um aminoácido. Na presente invenção, o fragmento de proteína é preferencialmente funcional de tal modo que o fragmento de proteína confira resistência à inibição a herbicidas acetolactato sintase a uma determinada planta.

Descrição Detalhada da Invenção [0040] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a genes que codificam Genes ALS alterados e proteínas. Em alguns modos de realização, a presente invenção se refere ao uso de herbicidas que não inibem a Enzima ALS no sorgo que contém uma Enzima ALS alterada a fim de reduzir a quantidade de ervas daninhas monocotiledôneas e dicotiledôneas presentes em um campo de colheita, em que as referidas ervas daninhas são suscetíveis aos herbicidas ALS.

[0041] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um germoplasma resistente a ALS de uma planta de sorgo que resulta, por exemplo, de um cruzamento entre duas plantas progenitoras, um sorgo silvestre “Tailwind ou Tw” e a linhagem vegetal polinizadora de elite Tx2783,

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13/37 produzindo uma geração F1, seguido de dois retrocruzamentos (BC2F3:F4), com a semente resultante sendo depositada sob ATCC No: PTA-7999, designada KSU 06MN8419.

[0042] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um germoplasma de sorgo que confere resistência à inibição por herbicidas ALS e também confere resistência aos insetos contra a broca com manchas da haste das gramíneas Chilo partellus (Girijashankar et al., 2005, Plant Cell Rep. 24:513-522, incorporado aqui em seu inteiro teor). Por exemplo, um híbrido de sorgo cujo germoplasma compreende um gene Ac cril sintético de Bacillus thuringiensis (Bt) é introgredido em uma linhagem de sorgo cujo germoplasma confere resistência aos herbicidas ALS. Além disso, a incorporação da resistência aos herbicidas ALS e a resistência aos insetos é realizada por transgênese vegetal no mesmo híbrido de sorgo. O técnico no assunto saberá reconhecer as várias técnicas tais como descritas aqui que são aplicáveis à incorporação de dois ou mais atributos de resistência no mesmo híbrido de sorgo.

[0043] Em um modo de realização, o gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no sorgo que compreende um germoplasma ALS KSU 06MN8419 depositado sob ATCC No: PTA-7999 é incorporado em variedades de sorgo de elite através do melhoramento e seleção da planta, assegurando com isso o desenvolvimento de variedades de culturas resistentes aos herbicidas que serão tolerantes ao uso de herbicidas inibidores de ALS para o controle das ervas daninhas. Em alguns modos de realização, o ALS gene resistente aos herbicidas é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene resistente aos herbicidas tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419. Em alguns modos de realização, o gene

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14/37 resistente aos herbicidas ALS que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao Gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 compreende um ou mais das substituições de aminoácidos Val531Ile e Trp545Leu. A implementação desse traço de resistência aos herbicidas nas variedades de plantas cultivadas supramencionadas permite o uso desses herbicidas para controlar as ervas daninhas monocotiledôneas e dicotiledôneas que crescem na presença dessas culturas. Em alguns modos de realização, a incorporação do germoplasma de resistência a ALS em linhagens de elite é feita através da introgressão, ou de métodos de melhoramento clássicos. Em alguns modos de realização, a incorporação do gene de resistência a ALS nas linhagens de elite é feita através da transgênese de um gene heterólogo. Em alguns modos de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo, em que pelo menos um ancestral do referido híbrido de sorgo é derivado do germoplasma resistente a ALS designado KSU 06MN8419 depositado sob ATCC No: PTA7999. Em alguns modos de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo, em que pelo menos um ancestral do referido híbrido de sorgo compreende o gene da acetolactato sintase que confere resistência a herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma designado KSU 06MN8419 depositado sob ATCC No: PTA-7999. Em alguns modos de realização, o gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado em um híbrido de sorgo é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419. Em alguns modos de realização, o gene resistente aos herbicidas

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ALS que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 compreende um ou mais das substituições de aminoácidos Val531Ile e Trp545Leu.

[0044] Em alguns modos de realização, o germoplasma de resistência aos herbicidas ALS é introgredido em uma linhagem de sorgo de elite por meio de técnicas clássicas de melhoramento. Exemplos de métodos clássicos de melhoramento para o sorgo podem ser encontrados, por exemplo, em Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, Fifth Edition, Blackwell Publishing, incorporados integralmente aqui por referência.

[0045] Em um modo de realização, o germoplasma de resistência aos herbicidas ALS é introgredido em uma planta de sorgo que fornece alimento para consumo humano. Em alguns modos de realização, germoplasma de resistência aos herbicidas ALS é introgredido em plantas de sorgo que fornecem alimento para animais de criação (por exemplo, aves, gado, suínos, ovinos, etc). Em um modo de realização, o gene de resistência aos herbicidas ALS é introduzido em um genoma vegetal por meio de transgênese usando vetores e tecnologias conhecidos no estado da arte.

[0046] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a métodos para controlar ervas daninhas em um campo de plantas de cultivadas. Em alguns modos de realização, o controle das ervas daninhas compreende a aplicação de um herbicida ALS ao referido campo de plantas de sorgo cultivadas, de modo que o crescimento da erva daninha seja inibido, mas o crescimento da planta de sorgo não seja adversamente afetado. Em alguns modos de realização, o herbicida ALS que é aplicado pertence à família herbicida da sulfonilureia, e compreende um ou mais dos ingredientes ativos

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16/37 amidossulfuron, azimsulfuron, bensulfuron-metil, clorimuron-etil, clorsulfuron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, etametsulfuron-metil, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron-metil-sodium, foramsulfuron, halosulfuron-metil, imazolsulfuron, iodosulfuron-metil-sodium, mesosulfuron-metil, metsulfuronmetil, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron-metil, piraxosulfuron-etil, rimsulfuron, sulfometuron-metil, sulfosulfuron, tifensulfuron-metil, triasulfuron, tribenuron-metil, trifloxisulfuron-sodium, triflusulfuron-metil, triofensulfuron, e tritosulfuron. Em alguns modos de realização, o herbicida ALS que é aplicado pertence à família herbicida da imidazolinona, que compreende um ou mais dos ingredientes ativos imazametabenz-metil, imazamox, imazapic, imizapir, imizaquin e imazetapir. Em alguns modos de realização, o herbicida ALS que é aplicado pertence à família herbicida do pirimidiniltiobenzoato, que compreende um ou mais dos ingredientes ativos bispiribac-sódio, piribenzoxim, piriftalid, piriminobac-metil e piritiobac-sódio. Em alguns modos de realização, o herbicida ALS que é aplicado pertence à família herbicida da triazolopirimidina, que compreende um ou mais dos ingredientes ativos cloransulam-metil, diclusolam, florasulam, flumetsulam, metosulam e penoxsulam. Em alguns modos de realização, o herbicida ALS que é aplicado compreende uma combinação de ingredientes ativos de uma ou mais famílias herbicidas ALS tais como descritas aqui. Entretanto, o presente pedido não se limita ao herbicida ALS usado, e o técnico no assunto saberá reconhecer que novas substâncias químicas que inibem a Enzima ALS estão sendo reveladas a todo momento.

[0047] Em um modo de realização, a presente invenção se refere ao uso de um transgene que compreende um gene heterólogo tal como um gene que codifica a proteína ALS mutante para conferir o traço agronômico selecionado de resistência aos herbicidas ALS. Em um modo de realização, o transgene compreende um gene ALS mutante tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 depositado sob ATCC No: PTA-7999. Em

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17/37 alguns modos de realização, o gene ALS é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene ALS mutante tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419. Em alguns modos de realização, o gene ALS mutante que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene ALS mutante tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 compreende um ou mais das substituições de aminoácidos Val531Ile e Trp545Leu.

[0048] A Striga comumente conhecida como erva-de-bruxa é um gênero de plantas parasitas nocivas de gramíneas e culturas de cereais monocotiledôneos tais como o milho, o trigo e o sorgo. Uma infestação grave de Striga em um campo de plantas cultivadas prejudica as plantas hospedeiras, causando retardo de crescimento, clorose, murchamento, e finalmente morte da planta hospedeira, especialmente em seu habitat nativo em que a água pode ser escassa. A Striga é nativa de regiões herbáceas semiáridas e temperadas da África e da Ásia, todavia ela pode florescer fora de seu espaço natural, e infestações existem atualmente em terras agrícolas nos Estados Unidos. As infestações são muito difundidas na África, portanto a Striga é um problema permanente para os fazendeiros nas regiões semiáridas e subsaarianas em que o sorgo é a principal cultura alimentícia. A planta parasita é difícil de erradicar, e suas sementes podem permanecer dormentes no solo por até dez anos antes da germinação.

[0049] Os sinais biológicos para a germinação das sementes de Striga incluem a estimulação por exsudatos de raízes de sua planta hospedeira. As sementes de Striga sementes germinam com o envio de uma

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18/37 estrutura infecciosa à planta hospedeira que se liga à raiz hospedeira e invade o sistema vascular do hospedeiro, privando com isso a planta hospedeira de água, minerais e carboidratos. Depois do contato inicial com a planta hospedeira, começam os brotos de Striga e as raízes adicionais, e o ataque à planta hospedeira aumenta. Em locais nativos em que a água é escassa, a Striga efetivamente exaure as reservas de minerais e de água da planta hospedeira.

[0050] O parasitismo da Striga é inibido pelos herbicidas ALS. A presente invenção não se limita a um mecanismo particular. Na verdade, uma compreensão do mecanismo não é necessária para praticar a presente invenção. Apesar disso, a infecção por Striga das raízes de sorgo é eliminada pelo revestimento das sementes de sorgo com herbicidas ALS antes da plantação. Em um modo de realização, as sementes de um híbrido de sorgo que compreendem um germoplasma que confere resistência aos herbicidas ALS ao referido híbrido de sorgo são revestidas com um ou mais herbicidas ALS antes da plantação. Em alguns modos de realização, as sementes revestidas são plantadas nas terras agrícolas em que reside a espécie de planta parasitária antes da plantação da Striga. Em alguns modos de realização, as plantas híbridas de sorgo que crescem a partir das referidas sementes revestidas são resistentes à infecção por Striga.

[0051] Em um modo de realização, a presente invenção se refere a um híbrido de sorgo cujo germoplasma confere resistência a Herbicidas ALS e resistência a um ou mais herbicidas adicionais de um ou mais herbicidas diferentes. Por exemplo, os grupos herbicidas adicionais usados para inibir o crescimento das ervas daninhas, incluem, mas sem que essa lista seja limitativa, inibidores de síntese de lipídios (por exemplo, ariloxifenoxipropionatos, cicloexanodeionas, benzofuranos, ácidos clorocarbônicos, fosforoditioatos, tiocarbamatos), inibidores de fotossíntese no

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19/37 fotossistema II (por exemplo, fenil-carbamatos, piridazinonas, triazinas, triazinonas, triazolinonas, uracilas, amidas, uréia, benzotiadiazinonas, nitrilas, fenil-piridinas), inibidores de fotossíntese no fotossitema I (por exemplo, bipiridílios), inibidores de fotoporfirinogênio oxidase (por exemplo, difeniléteres, N-fenilftalamidas, oxadiazóis, oxizolidinedionas, fenilpirazóis, pirimidindionas, tiadiazóis), inibidores de biossíntese carotenóide (por exemplo, piridazinonas, piridinecarboxamidas, isoxazolidinonas, triazóis), inibidores de 4-hidroxifenilpiruvato-dioxigenase (por exemplo, calistemonas, isoxazóis, pirazóis, tricetonas), inibidores de EPSP sintase (por exemplo, glicinas), inibidores de glutamina sintetase (por exemplo, ácidos fosfínicos), inibidores de diidropteroato sintase (por exemplo, carbamatos), inibidores de conjunto microtúbulo (por exemplo, benzamidas, ácidos benzóicos, dinitroanilinas, fosforoamidatos, piridinas), inibidores de divisão celular (por exemplo, acetamidas, cloroacetamidas, oxiacetamidas), inibidores de síntese de parede celular (por exemplo, nitrilas, triazolocarboxamidas) e inibidores transporte de auxinas (por exemplo, ftalamatos, semicarbazonas).

Melhoramento Clássico do Sorgo [0052] As culturas em campo têm sido classicamente melhoradas por meio de técnicas que tiram partido de método(s) de polinização das espécies vegetais. Uma planta é considerada “auto-polinizável” se o pólen de uma flor pode ser transmitido para a mesma ou outra flor, ao passo que plantas são consideradas com “polinização cruzada” se o pólen veio de uma flor em uma planta diferente para que a polinização ocorra.

[0053] As plantas que são autopolinizáveis e selecionadas ao longo de gerações se tornam homozigóticas em sua maioria, se não em sua totalidade, de seus loci gênicos, produzindo com isso uma população uniforme de progênie com melhoramento genético verdadeiro. Um cruzamento entre duas plantas homozigóticas de antecedentes diferentes ou duas linhagens

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20/37 homozigóticas diferentes produzirão uma população uniforme de plantas híbridas que serão mais que provavelmente heterozigóticas em uma série de loci gênicos. Um cruzamento de duas plantas que são, cada uma, heterozigóticas em uma série de loci dos genes produzirão uma geração de plantas híbridas que são geneticamente diferentes e não são uniformes.

[0054] As plantas de sorgo são plantas autopolinizáveis, mas podem também ser melhoradas por polinização cruzada. O desenvolvimento de híbridos de sorgo requer o desenvolvimento de pais polinizadores (restauradores de fertilidade) e linhagens de progenitores de sementes que usam o sistema restaurador de esterilidade-fertilidade citoplásmica, o cruzamento de progenitores de sementes e parentes polinizadores, e a avaliação dos cruzamentos. Os programas de cruzamento com pedigree combinam os traços desejáveis; no presente pedido o traço desejável é a resistência da planta aos herbicidas ALS. Esse traço é introduzido em um tanque de melhoramento genético a partir de uma ou mais linhagens, de modo que novas linhagens consanguíneas sejam criadas por cruzamento, seguido pela seleção de plantas com o traço desejado, seguido de outros cruzamentos, etc. Novas linhagens consanguíneas são cruzadas com outras linhagens consanguíneas (por exemplo, linhagens vegetais de elite como as descritas aqui).

[0055] O cruzamento com pedigree começa com o cruzamento de dois genótipos, tais como Tailwind e uma linhagem de sorgo de elite (por exemplo, sorgo Tx430, Tx2737, Tx2783, 00MN7645, HP162, Wheatland, Tx3042, OK11, QL41, Tx643 e Bt). Se os dois pais originais não fornecerem todas as características desejadas, outras fontes podem ser incluídas na população para melhoramento. Por exemplo, se for desejado para um híbrido que ele tenha resistência aos herbicidas ALS e também resistência a outro herbicida tal como descrito aqui, as plantas com esses dois atributos podem

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21/37 ser cruzadas por meio de técnicas clássicas de melhoramento. No método do pedigree, as plantas superiores são autopolinizadas e selecionadas em gerações sucessivas. Nas gerações que se sucedem, a condição heterozigota dá lugar a linhagens homogêneas como resultado da autopolinização e seleção. Tipicamente, no método do pedigree cinco ou mais gerações de autopolinização e seleção são praticadas (por exemplo, S1, S2, S3, S4, S5, etc.).

[0056] O retrocruzamento é usado para melhorar uma linhagem vegetal. O retrocruzamento transfere um traço desejável específico de uma fonte para outra que não possui o traço. Isso é realizado, por exemplo, pelo cruzamento de um doador (por exemplo, Tailwind) com uma linhagem consanguínea (por exemplo, Tx2783, uma linhagem de polinizador de elite tal como descrito aqui). A progênie desse cruzamento é então retrocruzada com um ascendente (isto é, retrocruzamento) com uma linhagem consanguínea de elite, seguido pela seleção na progênie resultante para o traço desejado (por exemplo, resistência a Herbicidas ALS). Após cinco ou mais gerações de retrocruzamento com seleção para o traço desejado a progênie é tipicamente heterozigota para o locus (loci) que controla o fenótipo desejado, mas será igual ao progenitor de elite para os outros traços genéticos. O último retrocruzamento é tipicamente autopolinizado a fim de conferir uma progênie pura com melhoramento genético para o gene que é transferido.

[0057] Nos programas atuais de melhoramento de sorgo por introgressão híbrida, novas linhas parentais são desenvolvidas para as linhagens de semente-progenitor (por exemplo, Wheatland, Tx3042, N223, 01MN1589, 03MN954, OK11, QL41 e Tx643) ou linhagens pólen-progenitor (por exemplo, Tx430, Tx2737, Tx2783, R45, 00MN7645 e HP162) dependendo do fato delas conterem ou não genes restauradores de fertilidade; as linhagens semente-progenitor não possuem genes restauradores de fertilidade e são

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22/37 macho-estéreis em certos citoplasmas (também conhecidas como plantas de “linhagem A”) e macho-fertéis em outros citoplasmas (também conhecidas como plantas de “linhagem B”), ao passo que as linhagens pólen-progenitor are não são macho-estéreis e contêm genes restauradores de fertilidade (também conhecidas como plantas de “linhagem-R”). As linhagens semente-progenitor são tipicamente criadas para ser citoplasmicamente macho-estéries de mono que as anteras são tipicamente mínimas a não existentes nessas plantas requerendo com isso polinização cruzada. As linhagens semente-progenitor só vão produzir semente, e o citoplasma é transmitido unicamente através do óvulo. O pólen para polinização cruzada é fornecido através das linhagens pólen-progenitor que contêm os genes necessários para restauração completa da fertilidade no híbrido F1 e o cruzamento combina com a semente progenitor macho-estéril para produzir um híbrido de cruzamento simples com alto rendimento boa qualidade de grãos. Exemplos de plantas de linhagem R e de linhagem B úteis na presente invenção incluem, mas sem que essa lista seja limitativa, as descritas na Tabela 1.

Tabela 1

Linhagem	Nova Fonte	Gene	Observações
Tx2737///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1903	BC2F5	Linhagem R
Tx2737///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1905	BC2F5	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1916	BC2F5	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1926	BC2F5	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1935	BC2F4	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1936	BC2F4	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1940	BC2F4	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1941	BC2F4	Linhagem R

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Linhagem	Nova Fonte	Gene	Observações
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1944	BC2F4	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1945	BC2F4	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1956	BC2F4	Linhagem R
Tx2737///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1981	BC2F3	Linhagem R
Tx2737///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1984	BC2F3	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1987	BC2F3	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1992	BC2F3	Linhagem R
Tx430///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-1995	BC2F3	Linhagem R
R45////R45///Tx2737//90SN7/Tw	MN07-2013	BC2F3	Linhagem R
Tx2783//Tx2783/Tw	MN07-2075	BC2F4	Linhagem R
N223///N223//N223/Tw	MN07-2094	BC2F6	Linhagem B
Wheatland///N223//N223/Tw	MN07-2113	BC2F4	Linhagem B
Wheatland///N223//N223/Tw	MN07-2118	BC2F4	Linhagem B
N223///N223//N223/Tw	MN07-2134	BC2F5	Linhagem B
N223///N223//N223/Tw	MN07-2136	BC2F5	Linhagem B
OKI 1////OK11///N223//N223/Tw	MN07-2164	BC3F3	Linhagem B
QL41 /////QL41 ////OK11 ///N223//N223/Tw	MN07-2198	BC4F3	Linhagem B 75 % DPI (QL41)
01 MN1589////Wht///N223//N223/Tw	MN07-2230	BC4F3	Linhagem B
01 MN1589////Wht///N223//N223/Tw	MN07-2248	BC3F3	Linhagem B
01 MN1589////Wht///N223//N223/Tw	MN07-2251	BC3F3	Linhagem B
01 MN1589////Wht///N223//N223/Tw	MN07-2254	BC3F3	Linhagem B
03MN954////Wht///N223//N223/Tw	MN07-2261	BC3F3	Linhagem B
Tx3042/////Tx3042////N223///N223//N223/Tw	MN07-2290	BC4F3	Linhagem B
Tx3042/////Tx3042////N223///N223//N223/Tw	MN07-2293	BC4F2	Linhagem B
N223///N223//N223/Tw	MN07-2084	BC2F4	Linhagem B
N223///N223//N223/Tw	MN07-2088	BC2F4	Linhagem B

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24/37 [0058] Tipicamente, esse sistema restaurador de esterilidadefertilidade macho citoplásmico é realizado para a produção de sementes híbridas pela plantação de blocos de fileiras de plantas macho-estéreis (semente-progenitor) e blocos de fileiras de plantas de restauração de fertilidade (pólen-progenitor), de modo que as plantas semente-progrenitor são polinizadas pelo vento com pólen da planta pólen-progenitor. Esse processo produz um híbrido de cruzamento simples vigoroso que e colhido e plantado pelo consumidor.

[0059] As plantas macho-estéreis, semente-progrenitor também podem ser criadas por genes nucleares macho estéreis recessivos melhorados geneticamente em uma população específica, entretanto o sistema restaurador de esterilidade-fertilidade macho citoplásmico é tipicamente o sistema usado para melhorar o sorgo híbrido. Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, Fifth Ed., Blackwell Publishing apresenta um bom exame dos processos atuais de melhoramento do sorgo e está inteiramente incorporado por referência.

[0060] A presente invenção não se limita às linhagens de sorgo parentais de elite relacionadas, e o técnico no assunto saberá reconhecer que qualquer linhagem de sorgo de elite pode ser igualmente introduzida nas composições e nos métodos tais como descritos aqui.

Transgênicos Vegetais [0061] Os genes heterólogos destinados à expressão em plantas são primeiramente reunidos em vetores de expressão que contêm um gene heterólogo e elementos de controle transcripcional e translacional apropriados, cujos métodos são bem conhecidos do técnico no assunto. Esses métodos incluem as técnicas do DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vitro. Exemplos dessas técnicas estão amplamente descritos no estado da arte ((Ver por exemplo, Sambrook. et al. (1989)

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Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., incorporado aqui por referência).

[0062] Em geral, esses vetores compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene heterólogo operacionalmente ligados a um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, enhancers (melhoradores), sinais de poliadenilação, etc.) necessários para expressão em uma planta.

[0063] Os promotores incluem, mas sem que essa lista seja limitativa, os promotores constitutivos, os promotores de tecido, órgão e desenvolvimentalmente específicos, e os promotores induzíveis. Como exemplos de promotores podem ser citados, mas sem que essa lista seja limitativa; o promotor constitutivo 35S do vírus mosaico da couve-flor; um promotor induzível por ferimento do tomate, leucina amino peptidase (Chao et al., 1999, Plant Physiol 120:979-992, incorporado aqui por referência em sua totalidade); um promotor quimicamente induzível do tabaco, Relacionados com a Patogênese 1 (induzidos pelo éster S-metil do ácido benzotiadizol-7 carbotióico; um promotor de choque ao calor (Patente U.S. No. 5,187,267, incorporado aqui por referência em sua totalidade); um promotor induzível por tetraciclina (Patente U.S. No. 5,057,422, incorporada aqui por referência em sua totalidade); e promotores específicos de semente.

[0064] Os cassetes de expressão podem ainda compreender quaisquer sequências exigidas para a expressão de mRNA. Essas sequências incluem, mas sem que essa lista seja limitativa, os terminadores de transcrição, os enhancers tais como os íntros, as sequências virais, e as sequências destinadas endereçamento do produto de gene para organelas específicas e compartimentos celulares.

[0065] Uma variedade de terminadores transcripcionais está

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26/37 disponível para uso na expressão de sequências que usam os promotores tais como os descritos aqui. Os terminadores transcripcionais são responsáveis pela terminação da transcrição além do transcrito e sua poliadenilação correta. Os terminadores transcripcionais apropriados e aqueles que são conhecidos para funcionar em plantas incluem, mas sem que essa lista seja limitativa, o terminador CaMV 35S, o terminador tml, o terminador pea rbcS E9, e o terminador nopalina e octopina sintase (Odell et al., 1985, Nature 313:810; Rosenberg et al., 1987, Gene, 56:125; Guerineau et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot, 1991, Cell, 64:671; Sanfacon et al., 1990, Genes Dev. 5:141; Mogen et al., 1990, Plant Cell, 2:1261; Munroe et al., 1990, Gene, 91:151; Ballas et al., 1989, Ácido nucleicos Res. 17:7891; Joshi et al., 1987, Ácido nucleico Res., 15:9627, todos eles estão incorporados aqui por referência em sua totalidade).

[0066] Em alguns modos de realização, os construtos para a expressão do gene heterólogo de interesse incluem uma ou mais sequências encontradas para melhorar a expressão do gene a partir do interior da unidade transcripcional. Essas sequências podem ser usadas conjuntamente com a sequência de ácido nucleico de interesse para aumentar a expressão nas plantas. Várias sequências de íntrons foram mostradas para melhorar a expressão, particularmente em células monocotiledôneas. As sequências de íntrons foram regularmente incorporadas em vetores de transformação vegetal, tipicamente com o líder não-translatado.

[0067] Em alguns modos de realização, um constructo para a expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico de interesse também inclui um regulador tal como um sinal de localização nuclear (Kalderon et al., 1984, Cell 39:499; Lassner et al., 1991, Plant Molecular Biology 17:229), uma sequência de consenso translacional vegetal (Joshi, 1987, Nucleic Acids Research 15:6643), um íntron (Luehrsen and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet.

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225:81), etc., operavelmente ligados à sequência de ácido nucleico que codifica um gene heterólogo.

[0068] Na preparação da construção que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica um gene heterólogo, ou que codifica uma sequência designada para diminuir a expressão do gene heterólogo, vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer sequências de DNA na orientação desejada (por exemplo, sentido ou antissentido) e, quando for apropriada, na moldura de leitura desejada. Por exemplo, adaptadores ou ligantes podem ser usados para se juntar aos fragmentos de DNA, ou outras manipulações podem ser usadas para fornecer sítios de restrição apropriados, remoção do DNA supérfluo, remoção dos sítios de restrição, etc. Para esse fim, mutagênese in vitro, restauração de primer, restrição, recozimento, ressecção, ligação, etc. são preferencialmente empregadas, quando inserções, deleções e substituições (por exemplo, transições e tranversões) estiverem envolvidas.

[0069] Diversos vetores de transformações estão disponíveis para a transformação da planta. A seleção de um vetor para uso vai depender da técnica de transformação preferida e da espécie alvo para transformação. Para certas espécies alvo, diferentes antibióticos ou marcadores de seleção de herbicidas são preferidos. Os marcadores de seleção são regularmente usados na transformação e incluem o gene nptII que confere resistência à canamicina e os antibióticos relacionados (Messing and Vierra, 1982, Gene 19: 259; Bevan et al., 1983, Nature 304:184, e todos eles estão incorporados aqui por referência), o gene bar que confere resistência à fosfinotricina herbicida (White et al., 1990. Nucl Ácidos Res. 18:1062; Spencer et al., 1990. Theor. Appl. Genet. 79:625, heterologous gene em sua totalidade), o gene hph que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochlinger and Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2929, incorporado aqui por referência em sua totalidade), e o gene

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28/37 dhfr que confere resistência ao metotrexato (Bourouis et al., 1983, EMBO J., 2:1099, incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0070] Em alguns modos de realização, o vetor plasmídeo Ti (TDNA) é adaptado para uso em um processo de transfecção mediado por Agrobacterium tal como na Patente US 6,369, 298 (sorgo), e nas Patentes US 5.981.839, 6.051.757, 5.981.840, 5.824.877 e 4.940.838, as quais estão todas incorporadas aqui por referência em sua totalidade. A construção de plasmídeos recombinantes Ti e Ri em geral segue métodos tipicamente usados com vetores mais comuns, tais como pBR322. Um uso adicional pode ser feito de elementos genéticos acessórios às vezes encontrados nos plasmídeos nativos e algumas vezes construídos para sequências exógenas. Estas podem incluir, mas sem que essa lista seja limitativa, os genes estruturais para genes de seleção as de resistência a antibióticos.

[0071] Existem dois sistemas de sistemas de vetor de plasmídeos Ti e Ri recombinantes usados atualmente. O primeiro sistema é denominado sistema “co-integrado”. Nesse sistema, o vetor bifuncional que contém o gene de interesse é inserido por recombinação genética em um plasmídeo Ti não oncogênico que contém os elementos cis-atuantes e trans-atuantes exigidos para a transformação da planta tal como, por exemplo, no vetor bifuncional pMLJ1 e no plasmídeo pGV3850 Ti não-oncongênico. O uso do T-DNA como uma região do flanco em um constructo para interação em um plasmídeo Ti ou RI tal como descrito em EPO No. 116,718 e no Pedido PCT Nos. WO 84/02913, 02919 e 02920; Herrera-Estrella, 1983, Nature 303:209-213; Fraley et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80:4803-4807; Horsch et al., 1984, Science 223:496-498; e DeBlock et al., 1984, EMBO J. 3:1681-1689, os quais estão todos incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[0072] O segundo sistema é denominado “binário” e nele dois plasmídeos são usados e o gene de interesse é inserido em um vetor

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29/37 bifuncional que contém os elementos cis-atuantes exigidos para a transformação da planta. As outras funções necessárias são fornecidas em trans pelo plasmídeo Ti não oncogênico tal como exemplificado pelo vetor bifuncional pBIN19 e o plasmídeo PAL4404 Ti não oncongênico. Alguns desses vetores estão disponíveis comercialmente.

[0073] Em alguns modos de realização, a sequência de ácido nucleico de interesse é endereçada a um locus particular no genoma da planta. A integração direcionada ao sítio da sequência de ácido nucleico de interesse no genoma da célula da planta pode ser realizada, por exemplo, por recombinação homóloga usando sequências derivadas de Agrobacterium. Geralmente, as células vegetais são incubadas com uma cepa de Agrobacterium que contém um vetor de endereçamento em que as sequências que são homólogas a uma sequência de DNA no interior do locus alvo são flanqueadas por sequências de transferência de DNA (T-DNA) de Agrobacterium, tal como descrito previamente (Patente U.S. No. 5,501,967 incorporada aqui por referência em sua totalidade). O técnico no assunto sabe que a recombinação homóloga pode ser realizada por meio de vetores de endereçamento que contém sequências que são homólogas a qualquer parte do gene vegetal alvo, quer ele pertença aos elementos regulatórios do gene ou às regiões codificadoras do gene. A recombinação homóloga pode ser realizada em qualquer região de um gene vegetal desde que a sequência de ácido nucleico das regiões que flanqueiam o sítio que será o alvo seja conhecida. Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria comum do solo que provoca a doença galha da coroa pela transferência de parte de seu DNA à planta hospedeira. O DNA transferido (T-DNA) é estavelmente integrado no genoma da planta, onde sua expressão conduz à síntese de hormônios da planta e assim ao crescimento tumoral das células. Um complexo macromolecular putativo forma no processo de transferência T-DNA da célula

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30/37 bacteriana para a célula da planta.

[0074] Em alguns modos de realização, os ácidos nucleicos tais como descritos aqui são usados para construir vetores derivados de vírus RNA (+) de plantas (por exemplo, vírus mosaico do capim bromo, vírus mosaico do tabaco, vírus mosaico da alfafa, vírus mosaico do pepino, vírus mosaico do tomate, e suas combinações e seus vírus). Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo inserido pode ser expresso a partir desses vetores como uma proteína de fusão (por exemplo, proteína de fusão de proteína de revestimento) ou a partir de seu próprio promotor subgenônico ou outro promotor. Métodos para a construção e o uso desses vírus estão descritos nas Patentes U.S. Nos. 5,846,795; 5,500,360; 5,173,410; 5,965,794; 5,977,438; and 5,866,785, os quais estão todos incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[0075] Em alguns modos de realização, uma sequência heteróloga de ácido nucleico de interesse que compreende um transgene ALS mutante tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 depositado sob ATCC No: PTA-7999 é introduzido diretamente em uma planta. Em alguns modos de realização, o transgene ALS mutante é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419. Em alguns modos de realização, o transgene ALS mutante que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99% homólogo ao gene resistente aos herbicidas ALS tal como encontrado no germoplasma KSU 06MN8419 compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos Val531Ile e Trp545Leu. Um vetor útil para as técnicas de transferência de genes diretas em combinação com a seleção pelo herbicida Basta (ou fosfinotricina) é uma

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31/37 versão modificada do plasmídeo pCIB246, com um promotor CaMV 35S em fusão operacional com o gene GUS E. coli e o terminador transcricional CaMV 35S (WO 93/07278, incorporada aqui por referência).

[0076] Depois que a sequência de ácido nucleico que codifica o gene heterólogo estiver operacionalmente ligada a um promotor apropriado e inserida em um vetor apropriado para a técnica de transformação particular utilizada (por exemplo, um dos vetores descritos acima), o DNA recombinante descrito acima pode ser introduzido na célula da planta em um número de maneiras reconhecidos pela arte. O técnico no assunto saberá reconhecer que a escolha do método depende do tipo de planta que é alvo para a transformação. Em alguns modos de realização, o vetor é mantido episomalmente. Em alguns modos de realização, o vetor é integrado no genoma. Em alguns modos de realização, a transformação direta no genoma plastídico é usada para introduzir o vetor na célula da planta (por exemplo, ver Patente U.S. Nos. 5,451,513; 5,545,817; 5,545,818; pedido PCT WO 95/16783 os quais estão todos incorporados aqui por referência em sua totalidade).

[0077] A técnica básica para a transformação cloroplástica envolve introduzir regiões de DNA plastídico clonada flanqueando um marcador selecionável juntamente com o ácido nucleico que codifica as sequências de interesse em um tecido alvo apropriado (por exemplo, usando transformação biolística ou protoplástca com cloreto de cálcio ou PEG). As regiões flanqueadoras 1 a 1,5 kb, denominadas sequências de direcionamento, facilitam a recombinação homóloga com o genoma plastídico e permite assim a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma. Inicialmente, mutações de ponto no cloroplasto 16S rRNA e genes rps12 que conferem resistência a espectinomicina e/ou estreptomicina são usados como marcadores selecionáveis para transformação (Svab et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:8526; Staub and Maliga, 1992, Plant Cell, 4:39, todos os quais

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32/37 são incorporados aqui por referência). A presença de sites de clonagem entre esses marcadores permite a criação de uma introdução de vetor de direcionamento de plastídeos de moléculas de DNA exógenas (Staub and Maliga, 1993, EMBO J., 12:601). Aumentos substanciais na frequência de transformação são obtidos por substituição dos genes de resistência aos antibióticos rRNA recessivo ou r-proteína com um marcador selecionável dominante, o gene bacteriano aadA que codifica a enzima espectinomicinadesentoxificadora aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase (Svab and Maliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:913). Outros marcadores selecionáveis úteis para a transformação plastídica são conhecidos no estado na arte e estão compreendidos no âmbito da presente invenção. Os homoplásmicos vegetais para genomas plastídicos que contêm as duas sequências de ácido nucleicos separadas por um promotor da presente invenção são obtidos, e são de preferência capazes de alta expressão de RNAs codificados pela molécula de DNA.

[0078] Em um modo de realização, os vetores úteis na prática da presente invenção são microinjetados diretamente nas células da planta (Crossway, 1985, Mol. Gen. Genet, 202:179). Em alguns modos de realização, o vetor é transferido para a célula da planta através de um polietileno glicol (Krens et al., 1982, Nature, 296:72; Crossway et al., 1986, BioTechniques, 4:320); fusão de protoplastos com outras entidades tais como minicélulas, células, lisossomas ou outros corpos com lipídios na superfície fusíveis (Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:1859); e transformação protoplástica (EP 0 292 435); transferência de gene direta (Paszkowski et al., 1984, EMBO J., 3:2717; Hayashimoto et al., 1990, Plant Physiol. 93:857).

[0079] Em alguns modos de realização, o vetor pode também ser introduzido nas células da planta por eletroporação. (Fromm, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824; Riggs et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

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83:5602). Nessa técnica, os protoplastos da planta são eletroporados na presença de plasmídeos que contêm o constructo dos genes. Impulsos elétricos de força de campo elevada permeabilizam de modo reversível as biomembranas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos da planta eletroporada reforma a parede celular, divide, e forma calos vegetais. Além da transformação direta, em alguns modos de realização, os vetores que compreendem a sequência de ácido nucleico que codifica um gene heterólogo são transferidos por meio de transformação mediada por Agrobacterium(Hinchee et al., 1988, Biotechnology, 6:915; Ishida et al., 1996, Nature Biotechnology 14:745, as quais estão todas incorporadas aqui por referência). Agrobacterium é um gênero representativo gram-negativo pertencente à família das Rizobiáceas. Suas espécies são responsáveis por tumores vegetais tais como as doenças galha da coroa e raízes em cabeleira. Nos tecidos desdiferenciados característicos dos tumores, derivados de aminoácidos conhecidos como opinas são produzidos e catabolizados. Os genes bacterianos responsáveis pela expressão das opinas são uma fonte apropriada de elementos de controle para cassetes de expressão quiméricos. As sequências genéticas heterólogas (por exemplo, sequência de ácido nucleicos operacionalmente ligada a um promotor da presente invenção) podem ser introduzidas nas células apropriadas da planta, por meio do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens (descrito anteriormente). O plasmídeo Ti é transmitidos a células vegetais infectadas com Agrobacterium tumefaciens, e é estavelmente integrado no genoma da planta (Schell, 1987, Science, 237:1176). As espécies que são sujetíveis à infecção por Agrobacterium podem ser transformadas in vitro. Os métodos de transformação para produzir plantas transgênicas de sorgo usando uma transformação mediada por Agrobacterium são fornecidos na Patente U.S. 6.369.298.

[0080] Em alguns modos de realização, o vetor é introduzido

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34/37 através de aceleração balística de partículas (Patente U.S. No. 4.945.050; Casas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212, todas elas incorporadas aqui em sua totalidade).

[0081] Em alguns modos de realização, depois de selecionar o material vegetal transformado que pode expressar um gene heterólogo que codifica uma proteína heteróloga ou sua variante, plantas inteiras são regeneradas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados está descrita em Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co. New York, (1983); Vasil I. R. (ed.), Cell Cultures and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, (1984) and Vol. III, (1986), incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Sabe-se que muitas plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidos cultivados incluindo, mas sem que essa lista seja limitativa, todas as principais espécies de cana de açúcar, beterraba açucareira, algodão, frutas, legumes e vegetais, e monocotiledônas (por exemplo, as plantas descritas acima). Os meios de regeneração variam espécie para espécie de plantas, mas geralmente uma suspensão de protoplastos transformados contendo cópias do gene heterólogo é fornecida em primeiro lugar. O tecido do calor é formado e brotos podem ser induzidos dos calos e depois enraizados.

[0082] De modo alternativo, a formação do embrião pode ser induzida a partir da suspensão de protoplasto. Esses embriões germinam e formam plantas maduras. O meio de cultura conterá geralmente diversos aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citoxinas. Os brotos e as raízes normalmente se desenvolvem simultaneamente. Uma regeneração eficiente vai depender do meio, do genótipo, e da história da cultura. A reprodutibilidade de regeneração depende do controle dessas variáveis.

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Exemplos

Exemplo 1

Resistência a Herbicidas em Genótipo de Sorgo [0083] Sementes de genótipo de sorgo silvestre apresentados para exigir um fenótipo resistente a ALS, designado “Tailwind”, e um genótipo de sorgo suscetível aos herbicidas designado 90SN7 foram plantados em vasos de 12 litros em uma estufa. Diversos exemplares de cada tipo de planta foram borrifados com 1) Lightning Herbicide (uma combinação de Imazetapir e Imazapir) em uma dose de 2,56 oz/acre (uma taxa de herbicida de 2x), 2) Steadfast® Herbicide (DuPont™; uma combinação de Nicosulfuron e Rimsulfuron) a uma dose de 1,50 oz/acre (uma taxa de herbicida de 2x), ou 3) uma combinação de Lightning Herbicide a uma dose de 2,56 oz/acre e Steadfast® Herbicide a uma dose de 1,50 oz/ acre. Para cada tratamento, as plantas Tailwind mostraram essencialmente nenhum dano após 12 dias de aplicação do herbicida, ao passo que as plantas 90SN7 morreram, mostrando que Tailwind possui uma resistência cruzada às classes IMI (Lightening Herbicide) and SU (Steadfast® Herbicide) classes de herbicidas inibidores de ALS.

Exemplo 2

Cruzamentos de Tailwind com Linhagens Parentais de Sorgo de Elite [0084] Tailwind foi cruzado com vários pais de elite incluindo Tx430 e Wheatland. As populações F2 derivadas de cruzamentos com esses pais foram avaliadas por análise de segregação a fim de determinar o número de genes envolvidos na expressão de tolerância. As populações de plantas foram cultivadas em uma estufa e foram borrifadas com 1x e 3x doses de Accent® Herbicide (DuPont™; Nicosulfuron), Option® Herbicide (BayerCropScience; Foramsulfuron), e Steadfast® Herbicide. As contagens da população de plantas vivas/mortas permitiram análises genéticas.

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36/37 [0085] As análises de segregação indicaram que um único gene principal, parcialmente dominante na população é derivado de Tx430 para cada tratamento com herbicida. Análises similares de populações derivadas de cruzamentos com Wheatland indicaram um único gene principal, parcialmente dominante bem como potencialmente dois ou três genes modificadores que influenciaram a expressão relativa do traço de tolerância.

[0086] Os esforços para melhorar a planta foram iniciados pelo retrocruzamento do traço de tolerância em progenitores polinizadores de sorgo de elite comercialmente importantes incluindo Tx430, Tx2737, Tx2783, 00MN7645, e HP162 bem como progenitores de sementes de sorgo de elite comercialmente importantes incluindo Wheatland, Tx3042, OK11, QL41 e Tx643, com seleção para tolerância aos herbicidas em cada geração. A semente resultante do cruzamento de Tailwind com Tx2783 (BC2F3:F4) foi depositada na ATCC para acesso público.

Exemplo 3

Sequenciamento de Genes para Gene de Resistência a ALS [0087] Esforços de sequenciamento de genes foram iniciados para determinar se uma mutação visível alvo existia para a tolerância do fenótipo ao herbicida. Uma pesquisa de sequência realizada com o Instrumento de procura por alinhamento local básico do National Institute of Health (BLAST) na Base de Dados os Conjuntos de Transcritos de Plantas do Instituto de Pesquisa Genômica (TIGR) identificou uma Conjunto de Transcritos que representam um gene ALS de sorgo (TA3960_4558; SEQ ID NO: 1). Primers de amplificação para reação em cadeia da polimerase (PCR) foram designados, F4r-CACATCACCCTTGTACCAGCTC (SEQ ID NO: 3) e B5GATTGTGCACATTGATATTGATCC (SEQ ID NO: 4), para amplificar regiões do gene de sorgo análogo a regiões do gene de Arabidopsis thaliana AHAS considerado como tendo influência sobre a expressão da tolerância dos

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37/37 herbicidas a (A. thaliana: Ala122, Pro197, Ala205, Trp574, and Ser653; Tan et al., 2005).

[0088] Os primers de amplificação da cadeia da polimerase foram usados com sucesso para amplificar a região do gene em genótipos de sorgo resistentes aos herbicidas (S1-1, S1-2 e S1-3) e suscetíveis (Tx623 e Tx430) usando as seguintes condições de ciclagem térmica: desnaturação a 94°C durante 60 segundos, recozimento a 62°C durante 45 segundos, e extensão a 72°C durante 45 segundos. Os produtos de amplificação PCR foram purificados com o Kit de Purificação PCR QIAquick (QIAGEN) e sequenciados na unidade de sequenciamento da Kansas State University. A sequência de aminoácidos deduzidos (SEQ ID NO: 2) mostra mutações em Val531Ile (GTC a ATC), correspondentes a A. thaliana Val560Ile, e Trp545Leu (TGG a TTG), correspondentes a A. thaliana Trp574Leu, nos genótipos resistentes aos herbicidas (Figura 1).

[0089] Todas as publicações e patentes mencionadas no presente pedido estão incorporadas aqui por referência. Diversas modificações e variações dos métodos descritos acima ficarão evidentes para o técnico no assunto sem que isso represente um afastamento do escopo e do espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação com modos de realização específicos preferidos, deve-se entender que ela tal como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a modos específicos de realização. De fato, diversas modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvios para o técnico no assunto nos campos de interesse destinam-se a entrar no âmbito das reivindicações apresentadas a seguir.

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Claims (15)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA CONTROLAR AS ERVAS DANINHAS, nas proximidades de um híbrido de sorgo, em que o germoplasma do referido híbrido de sorgo confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetolactato sintase em níveis dos referidos um ou mais herbicidas que inibiriam normalmente o crescimento de um híbrido de sorgo, em que o referido método é caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) fornecer um ou mais herbicidas acetolactato sintase,

   b) aplicar os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase em um campo que compreende um híbrido de sorgo, em que o referido germoplasma de referido híbrido de sorgo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, contanto que referida sequência de nucleotídeos codifique uma proteína acetolactato sintase de sorgo modificada que compreende uma substituição de aminoácidos de valina para isoleucina na posição 531 e uma substituição de aminoácidos de triptofano para leucina na posição 545, em que a expressão de referida sequência de nucleotídeos confere a referido híbrido de sorgo resistência aumentada à inibição por um ou mais herbicidas de acetolactato sintase comparado a um híbrido de sorgo que não expressa a referida sequência de nucleotídeos, e

   c) controlar as ervas daninhas nas proximidades do referido híbrido de sorgo de modo que o crescimento das ervas daninhas seja adversamente afetado pela aplicação dos referidos um ou mais herbicidas e o crescimento do referido híbrido de sorgo não seja adversamente afetado.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase pertencem a um grupo constituído por sulfoniluréias, imidazolinonas, triazolopirimidas e pirimidiniltiobenzoatos.
3. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

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   2/4 pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos é introduzida no referido germoplasma do referido híbrido de sorgo por introgressão.
4. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que sementes do referido híbrido de sorgo são revestidas com um herbicida acetolactato sintase.
5. 5. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido híbrido de sorgo é criado por incorporação de um gene heterólogo que compreende referida sequência de nucleotídeos no referido híbrido de sorgo.
6. 6. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA LINHAGEM VEGETAL DE HÍBRIDO DE SORGO, resistente a um ou mais herbicidas acetolactato sintase, caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) identificar um germoplasma que confere a referida resistência a herbicida, em que o referido germoplasma resistente a herbicida deriva de um híbrido de sorgo resistente a herbicida, em que o germoplasma do referido híbrido de sorgo confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetolactato sintase em níveis dos referidos um ou mais herbicidas que inibiriam normalmente o crescimento de um híbrido de sorgo, em que o referido germoplasma do referido híbrido de sorgo que confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetolactato sintase compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo a SEQ ID NO:1 que compreende adicionalmente guanina substituída por adenina na posição 1641 e guanina substituída por timina na posição 1684; e

   b) introduzir o referido germoplasma em uma linhagem vegetal de sorgo de elite pela introdução de um gene heterólogo, em que referida introdução ocorre por (i) transformação de referido gene heterólogo na linhagem vegetal de sorgo de elite; ou (ii) um programa introgressivo de cruzamento de sorgo por meio do qual referido gene heterólogo é introgredido

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   3/4 na linhagem vegetal de sorgo de elite.
7. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase pertencem a um grupo constituído por sulfoniluréias, imidazolinonas, triazolopirimidas e pirimidiniltiobenzoatos.
8. 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetolactato sintase é introduzida no referido germoplasma do referido híbrido de sorgo por introgressão.
9. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que sementes do referido híbrido de sorgo são revestidas com um herbicida acetolactato sintase.
10. 10. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida introdução do referido germoplasma na referida linhagem vegetal de sorgo de elite é realizada por introgressão.
11. 11. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido germoplasma resistente a herbicida compreende resistência a um ou mais herbicidas acetolactato sintase e resistência a um ou mais compostos de um ou mais grupos herbicidas que não são inibidores de acetolactato sintase.
12. 12. MÉTODO PARA IDENTIFICAR LINHAGENS VEGETAIS DE SORGO, resistentes a herbicidas acetolactato sintase, caracterizado pelo fato de que compreende:

    a) fornecer uma amostra de ácido nucleico de uma planta de sorgo, em que referida amostra de ácido nucléico compreende uma sequência que compreende a SEQ ID NO:1 que compreende adicionalmente guanina substituída por adenina na posição 1641 e guanina substituída por timina na posição 1684,

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    b) fornecer primers de amplificação para amplificar uma região de uma planta de sorgo que corresponde a um gene da acetolactato sintase presente na referida amostra de ácido nucleico,

    c) aplicar os referidos primers de amplificação à referida amostra de ácido nucleico de modo que a amplificação da referida região do referido gene da acetolactato sintase ocorra, e

    d) identificar as plantas de sorgo resistentes a herbicidas acetolactato sintase com base na presença de uma ou mais mutações que conferem resistência a herbicidas acetolactato sintase presentes na referida amostra de ácido nucleico amplificada.
13. 13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o herbicida acetolactato sintase é um herbicida sulfoniluréia selecionado a partir do grupo que consiste em nicosulfuron, rimsulfuron e metsulfuron-metil.
14. 14. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais herbicidas acetolactato sintase são selecionados a partir do grupo que consiste em sulfoniluréias, imidazolinonas, triazolopirimidas e pirimidiniltiobenzoatos.
15. 15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o herbicida acetolactato sintase é um herbicida sulfoniluréia selecionado a partir do grupo que consiste em nicosulfuron, rimsulfuron e metsulfuron-metil.

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