BRPI0712165A2 - conjugado de análogos de aziridinil-eptiolona, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e usos dos mesmos - Google Patents
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Abstract
CONJUGADOS DE ANáLOGOS DE AZIRIDINILEPOTILONA, COMPOSIçõES FARMACêUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS E USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a compostos conjugados compreendendo um folato, ou um análogo ou derivado deste, e um análogo de epotilona de aziridinila, como também descrito aqui, e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis e/ou solvatos destes, úteis no tratamento de câncer ou outra condição associada ao receptor de folato.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGA- DOS DE ANÁLOGOS DE AZIRIDINIL-EPOTILONA E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS"
Este pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente Provi- sório dos Estados Unidos nQ 60/808.367, depositado em 25 de maio de 2006, que é pelo presente incorporado por referência aqui em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a conjugados de análogos de azi- ridinil-epotilona, mais particularmente, conjugados de folato de análogos azi- ridinil-epotilona, à composições farmacêuticas compreendendo os conjuga- dos, e a métodos de empregar os mesmos.
Técnica de Base Relacionada
Epotilonas AeB são compostos de ocorrência naural que foram descritos por Hõfle e outro, como isolado de produtos de fermentação do microorganismo, Sorangium cellulosum (veja, por exemplo, WO 93/10121). Hõfle e outro, também descreveram 37 variantes de epotilona naturais e compostos relacionados produzidos por Sorangium cellulosum, incluindo Epotilonas C, D, E, F e outros isômeros e variantes. Veja, por exemplo, Pa- tente dos Estados Unidos ns 6.624.310. Enquanto que em 1993 Hõfle e ou- tro, reportaram sobre os efeitos citotóxicos de epotilonas A e B, em 1995 pesquisadores com Merck reportaram que a epotilona B exerce efeitos esta- bilizantes de microtúbulo similar ao paclitaxel (TAXOL®) (Veja D.M. Bollag, "Epothilones, a New Class of Microtubule-Stabilizing Agents with a Taxol-Iike Mechanism of Action," Câncer Research, Vol. 55 (June 1995), nas páginas 2325-2333).
Vários derivados e análogos das Epotilonas de ocorrência natu- ral foram descobertos em Bristol-Myers Squibb Co. Exemplos de análogos de epotilona incluem o análogo de aza-epotilona B conhecido como ixabepi- lona, análogos 21-substituídos de epotilona B incluindo um análogo de 21- amino, análogos 2,3-olefínicos, análogos de C-3 ciano, análogos de ciclo- propila, e análogos heterocíclicos incluindo análogos aziridinil-epotilona. Ve- ja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nes 6.605.599, 6.262.094, 6.399.638, 6.498.257. 6.380.395, e 6.800.653, cada das quais é incorporada aqui por referência. Outros reportaram também sobre a descoberta de outros derivados de epotilona e análogos. Veja, por exemplo, WO 99/65913, Paten- te dos Estados Unidos ne 6,441,186, Patente dos Estados Unidos ns 6.284.781; Patente dos Estados Unidos ns 6.660.758; WO 98/25929; WO 00/99/07692; WO 99/67252; WO 00/00485; WO 00/37473; Patente dos Es- tados Unidos ns 6.380.394; Patente dos Estados Unidos ns 6.242.469; Pa- tente dos Estados Unidos ne 6.531.497; Pedido de Patente dos Estados Uni- dos ns 2004/0072870A1; Pedido de Patente dos Estados Unidos ns 2003/0023082 A1; WO 01/83800; Patente dos Estados Unidos ne 6.441.186; Patente dos Estados Unidos ns 6.489.314; Patente dos Estados Unidos ns 6.589.968, Pedido de Patente dos Estados Unidos ns 2004/0053910 A1; Pe- dido de Patente dos Estados Unidos ns 2004/0152708 A1; WO 99/67253; WO 99/07692; WO 00/00485; WO 00/49021; WO 00/66589; WO 03/045324; WO 04/014919; WO 04/056832; WO 03/022844; e Patente dos Estados Uni- dos ns 6,930,102 B2, todos os quais são incorporados por referência em sua totalidade.
As epotilonas de ocorrência natural e seus análogos, como ou- tros agentes estabilizantes de microtúbulo, podem ser úteis para tratar doen- ças proliferativas tal como câncer, que tipicamente funcionam matando (ou interrompendo o crescimento de) células de tumor, outras células patogêni- cas, e patógenos estranhos. Freqüentemente, entretanto, fármacos anticân- cer atacam não apenas células de tumor porém também tecido normal, in- duzindo a efeitos colaterais indesejados. Adicionalmente, fármacos anticân- cer tipicamente resultados de solubilidade presentes tal que a formulação e liberação dos agentes podem apresentar desafios, induzindo ao uso de a- gentes solubilizantes tal como Cremofor®. A citotoxicidade de alguns fárma- cos anticâncer e/ou ingredientes de formulação foram mostrados causar neuropatia ou outros efeitos colaterais tal como reações de hipersensibilida- de. Estes efeitos colaterais adversos destacam a necessidade de terapias anticâncer que são seletivas para populações celulares patogênicas e por- tanto, resultam em toxicidade ao hospedeiro reduzida.
Entretanto, como descrito em WO 2004/054622 A1 cientistas tentaram durante muitos anos utilizar anticorpos monoclonais (mAbs) em terapias de fármaco alvejadas para liberação de agentes quimioterápicos aos pacientes, porém encontrou-se desvantagens em termos de, entre ou- tras coisas, a porção clivável, os ligadores, e a forma de fármaco liberado na célula. Foi reportado que terapia bem sucedida de tumores com mAbs está limitada por penetração inadequada do anticorpo no tumor e pela distribui- ção heterogênea de antígeno associado com tumor correspondente no teci- do de tumor. Veja, Klar e outro,WO 05/074901 (nomeado por Schering AG). Conseqüentemente, existe uma necessidade na técnica de terapia de fár- maco alvejada utilizando, por exemplo, análogos de epotilona, para o trata- mento de câncer.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Certos estados de doença, tal como câncer, são caracterizados por uma população de células que unicamente expressam, superexpressam, ou preferencialmente expressam um sítio de ligação que é acessível a um folato, análogo de folato, ou derivado destes. Os Requerentes descreveram compostos conjugados tendo a seguinte fórmula I, incluindo sais farmaceuti- camente aceitáveis e/ou solvatos destes, que podem ser selectivamente al- vejados para células contendo estes sítios de ligação, desse modo reduzin- do muitos dos efeitos colaterais associados com quimioterapia típica.
<formula>formula see original document page 4</formula>
em que :
V é folato, ou um análogo ou derivado deste;
Q é O, S, ou NR7; M é a ligador liberável;
K é O, S, ou NR7a;
A é -(CR8R9)-(CH2)m-Z- em que Z é -(CHR10)-, -C(=0)-, -C(=0)- C(=0)-, -0C(=0)-, -N(Rii)C(=0)-, -SO2-, ou -N(R11)SO2-;
B1 é hidroxila ou ciano e R1 é hidrogênio ou B1 e R1 são empre- gados juntos para formar uma ligação dupla;
R2, R3, e R5 são, independentemente, hidrogênio, alquila, alquila substituída, arila ou arila substituída; ou R2 e R3 podem ser empregados jun- tamente com o carbono ao qual eles são ligados para formar uma cicloalqui- la opcionalmente substituída;
R4 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquila substituída, alquenila substituída, arila, ou arila substituída;
R6 é hidrogênio, alquila ou alquila substituída;
R7a, R7, R8, R9, R10, e R11 são independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, arila, arila substituída, heterocicloalquila, heterocicloalquila substituída, heteroarila, ou heteroarila substituída;
R12 é H, alquila, alquila substituída, ou halogênio;
R13 é arila, arila substituída, heteroarila ou heteroarila substituída;
m é O a 6;
T tem a fórmula :
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que
R14 em cada ocorrência é, independentemente, hidrogênio, al- quila, alquila substituída, arila, arila substituída, arilalquila, arilalquila substi- tuída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilalquila, substituído ciclo- alquilalquila, heteroarila, heteroarilalquila, substituído heteroarilalquila, subs- tituído heteroarila, heterocicloalquila, ou substituído heterocicloalquila; q é 1 a 10; e R15, R16 e R17 são independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituída, ou cicloalquila.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIG. 1 é a estrutura química, afinidade relativa, e valores EC50 (nM) contra células de tumor KB de seis conjugados de folato de análogo de epotilona Composto AA (conjugado número AA.I a AA-VI).
FIG. 2 é a estrutura química, afinidade relativa, e valores EC50 (nM) contra células de tumor KB de três conjugados de folato de análogo de epotilona Composto BB (conjugado número BB.I a BB.III).
FIG. 3 demonstra a fração de clones de KB sobreviventes (Fra- ção de sobrevivência; eixo-y) após tratamento com concentrações crescen- tes (Concentração (nM); eixo-x) de Composto G (barras), Composto CC (tri- ângulos), Composto AA (diamantes), ou ixabepilona (quadrados).
FIG. 4 demonstra a eficácia antitumor in vivo de tratamento de xenoenxertos de carcinoma epidermóides nasofaríngeos KB em camundon- gos nus com Composto J (quadrados cinzas, quadrados brancos, diamantes cinzas) em várias doses ou ixabepilona (barras pretas), comparado a ne- nhum tratamento (controle; círculos pretos), como uma medida de (A) peso de tumor médio (mg; eixo-y) diversos dias após implante de tumor (eixo-x) ou (B) perda de peso (% de mudança de peso corporal; eixo-y) diversos dias pós implante de tumor (eixo-x).
FIG. 5 demonstra os efeitos antitumor in vivo de Composto J (quadrados cinzas) ou ixabepilona (quadrados brancos), comparado a ne- nhum tratamento (controle; círculos pretos), contra carcinoma de pulmão de murino FR (-) M109 como uma medida de peso de tumor médio (mg; eixo-y) diversos dias após implante de tumor (eixo-x).
FIG. 6 demonstra os efeitos antitumor in vivo, como uma medida de peso de tumor médio (mg; eixo-y) diversos dias após implante de tumor (eixo-x), de nenhum tratamento (contrai, círculos pretos), tratamento com Composto J sozinho (quadrados cinzas), Composto J na presença de um análogo de folato, barras pretas), ou tratamento com Composto G (diaman- tes cinzas). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Uma das proteínas que é superexpressa ou preferencialmente expressa em certas células de câncer é o receptor de folato. Ácido fólico é requerido para síntese de DNA1 e certas células humanas de tumor são co- nhecidas superexpressarem proteínas de ligação de folato. Por exemplo, ambos Campbell e outro,"Folate Binding Protein é a Marker for Ovarian Cân- cer," Câncer Research, Vol. 51 (1 de outubro de 1991), nas páginas 5329- 38, e Coney e outro,"Cloning of a Tumor-Associated Antigen: M0v18 e M0v19 Antibodies Recognize Folate-binding Protein," Câncer Research, Vol. 51 (Nov. 15, 1991), nas páginas 6125-31, reportam que proteínas de ligação de folato são marcadores para câncer ovariano. Superexpressão de receptor de folato é também conhecida para outros cânceres tais como, por exemplo, cânceres de pele, renal, mama, pulmão, cólon, nariz, garganta, glândula mamária, e cérebro, bem como outros cânceres referenciados aqui.
Como mencionado, de acordo com uma modalidade da presente invenção, compostos conjugados são fornecidos compreendendo a folato, ou um análogo ou derivado deste (V) e um análogo de aziridinil epotilona, que podem ser seletivamente e/ou preferencialmente liberados para uma população celular tendo um sítio de ligação acessível para a vitamina, ou análogo ou derivado deste, em que the binding site, tal como the receptor de folato, é unicamente expresso, superexpresso ou preferencialmente expres- so pelas células.
DEFINIÇÃO DE TERMOS
Os seguintes são DEFINIÇÃO DE TERMOS utilizados na pre- sente especificação. A definição inicial fornecida para um grupo ou termo aqui aplica-se àquele grupo ou termo em toda a presente especificação indi- vidualmente ou como parte de outro grupo, a menos que de outro modo indicado.
O termo "porção de ligação de folato ou análogo ou derivado deste" como utilizado aqui significa uma porção que ligar-se-á a uma proteí- na receptora de folato (não um anticorpo monoclonal). Por exemplo, é co- nhecido, como acima descrito, que o receptor de folato (FR) é superexpres- so em células de câncer ovariano e outras células de câncer. Análogos ilus- trativos e derivados de folato são descritos no Pedido de Patente dos Esta- dos Unidos US 2005/0002942 de Vlahov e outro, (a seguir "Vlahov"), incor- porado aqui por referência.
O termo "ligador liberável" como aqui utilizado significa um Iiga- dor bivalente que inclui pelo menos uma ligação clivável que pode ser rom- pida sob condições fisiológicas (por exemplo, uma ligação lábil ao pH, redu- tivamente lábil, lábil ao ácido, oxidativamente lábil, ou lábil à enzima.) Deve ser apreciado que tais condições fisiológicas resultando em rompimento de ligação incluem reações de hidrólise química padrões que ocorrem, por e- xemplo, em pH fisiológico, ou com um resultado de compartmentalização em uma organela celular, tal como uma endossoma tendo um pH menor do que o pH citosólico ou com um resultado de reação com um agente de redução celular tal como glutationa.
Entende-se que uma ligação clivável pode conectar dois átomos adjacentes dentro do ligador liberável e/ou conectar outros grupos ao ligador liberável tal como QeK, como aqui descrito, em qualquer das duas ou am- bas as extremidades do ligador.
Os termos "alquila" e "alqu" se sozinhos ou em combinação com algum outro grupo, refere-se a um radical alcano de cadeia linear ou ramifi- cada (hidrocarboneto) ligado a qualquer átomo de carbono disponível, con- tendo de 1 a 10 átomos de carbono, preferivelmente 1 a 6 átomos de carbo- no, mais preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono. Tais grupos exempla- res incluem, porém não estão limitados a metila, etila, propila, isopropila, n- butila, t-butila, isobutila, pentila, hexila, heptila, 4,4-dimetilpentila, octila, 2,2,4-trimetilpentila, e similares. "Alquila inferior" ou "alquileno inferior" signi- fica uma alquila de cadeia linear ou ramificada tendo um a quatro átomos de carbono. Quando um subscrito é utilizado com referência a grupo alquila ou outro, o subscrito refere-se ao número de átomos de carbono que o grupo pode conter. Por exemplo, o termo "C0-4 alquila" inclui uma ligação e grupos alquila de 1 a 4 átomos de carbono, e o termo "C1-4alquila" significa grupos grupos alquila de 1 a 4 átomos de carbono. O termo "alquileno" refere-se a um radical de hidrocarboneto bivalente, como descrito acima para "alquila" porém com dois pontos de li- gação. Por exemplo, um grupo metileno é um grupo -CH2- e um grupo etile- no é um grupo -CH2-CH2-.
Quando o termo alquila é utilizado em ligação com outro grupo, como na heterocicloalquila ou cicloalquilalquila, isto significa que o outro grupo identificado (primeiro designado) está ligado diretamente por meio de um grupo alquila como definido acima (por exemplo, que pode ser de cadeia ramificada ou linear). Desse modo, o termo "alquila" é utilizado neste caso para referir-se a um alquileno, por exemplo, um grupo alquila divalente, ten- do dois pontos disponíveis de ligação. Por exemplo, ciclopropilCi-4alquila significa um grupo ciclopropila ligado por meio de um alquileno de cadeia linear ou ramificada tendo um a quatro átomos de carbono, e hidroxialquila significa o grupo OH ligado por meio de um alquileno de cadeia linear ou ramificada tendo um a dez átomos de carbono, preferivelmente 1 a 6 átomos de carbono, mais preferivelmente 1 a 4 átomos de carbono. No caso de substituintes, como em "cicloalquilalquila substituída," a porção de alquileno do grupo, além de ser cadeia ramificada ou linear, pode ser substituída como mencionado abaixo por grupos alquila substituída e/ou o primeiro grupo de- nominado (por exemplo, cicloalquila) pode ser substituído como mencionado aqui para aquele grupo denominado (por exemplo, cicloalquila).
"Alquila substituída" refere-se a um grupo alquila substituído com um ou mais substituintes, preferivelmente 1 a 4 substituintes, em qualquer ponto disponível de ligação. Entretanto, quando um grupo alquila é substituí- do com múltiplos substituintes de halo, a alquila pode conter como a valência permite até 10 substituintes, mais preferivelmente até sete substituintes. Substituintes alquila podem incluir um ou mais dos seguintes grupos: halo (por exemplo, um único substituinte halo ou múltiplos substituintes halo for- mando, no último caso, grupos tal como um grupo perfluoroalquila ou um grupo alquila transportando Cl3 ou CF3), ciano, -ORa, -SRa, -C(=0)Ra, -C(=0)0Ra, -0C(=0)Ra, -0C(=0)0Ra, -NRaRb, -C(=0)NRaRb, -0C(=0)NRaRb, -S(=0)Ra, -S(O)2Ra, -NHS(O)2Ra, -NHS(O)2NHRa, -NHC(=0)NHRa, -NHC(=0)Ra, -NHC(O)2Ra, -NHC(=N-CN)Ra, arila, heteroci- clo, cicloalquila, e/ou heteroarila, em que os grupos Ra e Rb são independen- temente selecionados de hidrogênio, alquila, alquenila, cicloalquila, heteroci- clo, arila, e heteroarila, e em que cada Ra e/ou Rb por sua vez é opcional- mente substituído com um a quatro grupos selecionados de alquila, alqueni- la, halogênio, haloalquila, haloalcóxi, ciano, nitro, amino, alquilamino, amino- alquila, hidróxi, hidroxialquila, alcóxi, tiol, alquiltio, fenila, benzila, fenila óxi, benzilóxi, C3-7Cicloalquila, heteroarila ou heterociclo de cinco ou seis mem- bros, e/ou uma alquila inferior ou alquenila inferior substituída com um a qua- tro grupos selecionados de hidróxi, ciano, halogênio, haloC-Malquila, haloC1-4 alcóxi, ciano, nitro, amino, C1-4alquilamino, aminoC1-4alquila, hidróxiC1-4 al- quila, C1-4alcóxi, tiol, e/ou C1-4alquiltio. Para evitar dúvidas, uma "alquila infe- rior substituída" significa um grupo alquila tendo um a quatro átomos de car- bono e um a quatro substituintes selecionados daqueles mencionados ime- diatamente acima para grupos alquila substituída. No caso de uma alquila inferior substituída, preferivelmente os grupos Ra e Rb são selecionados de hidrogênio, alquila inferior, alquenila inferior, C3-7Cicloalquila, fenila, e hetero- arila e/ou heterociclo monocíclico de cinco a seis membros, por sua vez op- cionalmente substituído como acima.
O termo "alquenila" refere-se a um radical de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada contendo de 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Tais grupos exemplares incluem etenila ou alila. "Alquenila substituída" refere-se a um grupo alquenila substi- tuído com um ou mais substituintes, preferivelmente 1 a 4 substituintes, em qualquer ponto disponível de ligação. Substituintes exemplares incluem al- quila, alquila substituída, e aqueles grupos mencionados acima como substi- tuintes alquila.
Os termos "alcóxi" e "alquiltio" referem-se a um grupo alquila como descrito acima ligado por meio de uma ligação de oxigênio (-0-) ou uma ligação de enxofre (-S-), respectivamente. Os termos "alcóxi substituí- do" e "alquiltio substituído" refere-se a um grupo alquila substituído como descrito acima ligado por meio de uma ligação de oxigênio ou enxofre, res- pectivamente. Um "alcóxi inferior" ou um C1-4alcóxi é um grupo OR, em que R é alquila inferior (alquila de 1 a 4 átomos de carbono).
"Amino" é -NH2. Um alquilamino é -NRcRd em que pelo menos um de Rc e Rd é uma alquila ou alquila substituída, e o outro de Rc e Rd é selecionado de hidrogênio, alquila, e alquila substituída. Uma "aminoalquila" significa um grupo amino ligado por meio de um grupo alquileno (-alquileno- NH2), e uma alquilaminoalquila significa um alquilamino como definido acima ligado por meio de um grupo alquileno (-alquileno-NRcRd).
O termo "arila" refere-se a grupos de hidrocarboneto aromáticos, cíclicos, que têm 1 a 3 anéis aromáticos, especialmente grupos monocíclicos ou bicíclicos tal como fenila a ou naftila. Grupos arila que são bicíclicos ou tricíclicos devem incluir pelo menos um anel carbocíclico totalmente aromáti- co, porém o outro anel ou anéis fundidos podem ser aromáticos ou não- aromáticos e podem opcionalmente conter heteroátomos, contanto que em tais casos o ponto de ligação será ao anel carbocíclico aromático. Adicio- nalmente, quando um grupo arila tem fundido a ele um anel heterocíclico ou cicloalquila, o anel heterocíclico e/ou cicloalquila pode ter um ou mais áto- mos de carbono de carbonila, isto é, ligados por meio de uma ligação dupla a um átomo de oxigênio para definir um grupo carbonila. Desse modo, e- xemplos de "arila" podem incluir sem limitação:
O termo "arileno" refere-se a um radical arila bivalente, isto é, um grupo arila como definido acima tendo dois pontos de ligação a dois ou- tros grupos, em quaisquer pontos disponíveis de ligação do anel arila. Anéis arileno podem também ser substituídos com qualquer dos grupos adequa- dos para substituição nos grupos arila definidos aqui.
"Arila substituída" refere-se a um grupo arila ou arileno como definido acima substituído por um ou mais substituintes, preferivelmente 1 a 4 substituintes, em qualquer ponto de ligação. Substituintes incluem alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, bem como aqueles gru- pos mencionados acima como substituintes alquila.
O termo "carbocíclico" significa um anel monocíclico, bicíclico, ou tricíclico saturado ou insaturado (preferivelmente mono- ou bicíclico) em que todos os átomos de todos os anéis são carbono. Desse modo, o termo inclui anéis cicloalquila e arila. O anel carbocíclico pode ser substituído em cujo caso os substituintes são selecionados daqueles mencionados acima para grupos cicloalquila e arila.
O termo "cicloalquila" refere-se a um grupo hidrocarboneto cícli- co totalmente saturado ou parcialmente saturado contendo de 1 a 3 anéis e 3 a 7 átomos de carbono por anel. Grupos cicloalquila totalmente saturados exemplares incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, e cicloexila. Grupos cicloalquila parcialmente saturados exemplares incluem ciclobutenila, ciclo- pentenila, e cicloexenila. O termo "cicloalquila" inclui tais grupos tendo uma ponte de três a quatro átomos de carbono. Adicionalmente, grupos cicloal- quila que são bicíclicos ou tricíclicos devem incluir pelo menos um anel de hidrocarboneto totalmente saturado ou parcialmente saturado, porém o outro anel ou anéis fundidos podem ser aromáticos ou não-aromáticos e podem conter heteroátomos, contanto que em tais casos o ponto de ligação seja ao grupo hidrocarboneto não aromático, cíclico. Adicionalmente, um ou mais átomos de carbono do grupo cicloalquila podem formar uma ligação dupla de carbono-a-oxigênio para definir um grupo carbonila. Desse modo, exemplos de grupos "cicloalquila" podem incluir, sem limitação: <formula>formula see original document page 13</formula>
e similares.
O termo "cicloalquileno" refere-se a um radical cicloalquila biva- lente, isto é, um grupo cicloalquila como definido acima tendo dois pontos de ligação a dois outros grupos, em quaisquer dois pontos de ligação disponí- veis do anel cicloalquila.
"Cicloalquila substituída" refere-se a um grupo cicloalquila como definido acima substituído em qualquer ponto disponível de ligação com um ou mais substituintes, preferivelmente 1 a 4 substituintes. Substituintes ciclo- alquila incluem alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, e aqueles grupos mencionados acima como substituintes alquila.
<formula>formula see original document page 13</formula>
O termo "guanidinila" significa o grupo η . Desse mo- do, uma guanidinilalquila significa um grupo alquila ligado à guanidinila tal
<formula>formula see original document page 13</formula>
como um grupo tendo a formula, η
O termo "halogênio" ou "halo" refere-se a flúor, cloro, bromo e iodo.
O termo "heteroátomos" inclui oxigênio, enxofre e nitrogênio.
O termo "haloalquila" significa uma alquila tendo um ou mais substituintes halo, incluindo sem limitação grupos tal como -CH2F, -CHF2 e - CF3.
O termo "haloalcóxi" significa um grupo alcóxi tendo um ou mais substituintes halo. Por exemplo, "haloalcóxi" inclui -OCF3.
Quando o termo "insaturado" é aqui usado para referir-se a um anel ou grupo, o anel ou grupo pode ser totalmente insaturado ou parcial- mente insaturado.
O termo "heteroarila" refere-se a um grupo aromático que é um sistema de anel monocíclico de 4 a 7 membros, bicíclico de 7 a 11 membros, ou tricíclico de 10 a 15 membros, que tem pelo menos um anel contendo pelo menos um heteroátomo. Cada anel do grupo heteroarila contendo um heteroátomo pode conter um ou dois átomos de oxigênio ou enxofre e/ou de um a quatro átomos de nitrogênio, contanto que o número total de heteroá- tomos em cada anel seja quatro ou menos e cada anel tem pelo menos um átomo de carbono. Os anéis fundidos que completam os grupos bicíclicos e tricíclicos podem conter apenas átomos de carbono e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou insaturados. Os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e os átomos de nitrogênio podem opcio- nalmente ser quaternizados. Grupos heteroarila que são bicíclicos ou tricícli- cos devem incluir pelo menos um anel totalmente aromático, porém o outro anel ou anéis fundidos podem ser aromáticos ou não-aromáticos e podem ser carbocíclico, contanto que em tais casos o ponto de ligação seja em qualquer átomo de nitrogênio ou carbono disponível de um anel contendo heteroátomo aromático. Adicionalmente, a definição de grupos heteroarila em si inclui anéis em que um ou mais dos átomos de carbono está ligado por meio de uma ligação dupla a um átomo de oxigênio para definir um grupo carbonila (contanto que o grupo heteroarila seja aromático) e também quan- do um grupo heteroarila tem fundido a ele um anel heterocíclico ou cicloal- quila, o anel heterocíclico e/ou cicloalquila pode ter um ou mais grupos car- bonila.
Grupos heteroarila monocíclicos exemplares incluem pirrolila, pirazolila, pirazolinila, imidazolila, oxazolila, isoxazolila, tiazolila (isto é, <formula>formula see original document page 14</formula>, tiadiazolila, isotiazolila, furanila, tienila, oxadiazolila, piridila, pirazini- la, pirimidinila, piridazinila, triazinila e similares. Adicionalmente, visto que a definição de grupos heteroarila em si inclui anéis em que um ou mais dos átomos de carbono define um grupo carbonila, anéis tal como 2,4-diidro- [1,2,4]triazol-3-ona (isto é, R22 é hidrogênio, alquila inferior, alquenila inferior, ou alquinila ) e similares são incluídos.
Grupos heteroarila bicíclicos exemplares incluem indolila, benzo- tiazolila, benzodioxolila, benzoxaxolila, benzotienila, quinolinila, tetraidroiso- quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, benzopiranila, indolizinila, benzofu- ranila, cromonila, cumarinila, benzopiranila, cinnolinila, quinoxalinila, indazoli- la, pirrolopiridila, furopiridinila, diidroisoindolila, tetraidroquinolinila e similares.
Grupos heteroarila tricíclicos exemplares incluem carbazolila, benzidolila, fenantrolinila, acridinila, fenantridinila, xantenila e similares.
O termo "heteroalquileno" refere-se a um radical heteroarila biva- lente, isto é, um grupo heteroarila como definido acima tendo dois pontos de ligação a dois outros grupos, em quaisquer dois pontos disponíveis de Iiga- ção do anel heteroarila.
Grupos "heteroarila substituída" são grupos heteroarila como definido acima substituído com um ou mais substituintes, preferivelmente 1 a 4 substituintes, em qualquer ponto disponível de ligação. Substituintes e- xemplares incluem, porém não estão limitados a alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, bem como aqueles grupos mencionados acima como substituintes alquila.
Os termos "heterociclo", heterocíclico" e "heterociclo" são utiliza- dos alternadamente e cada qual refere-se a um grupo cíclico não aromático totalmente saturado ou parcialmente insaturado, que pode ser substituído ou não substituído, por exemplo, que é um sistema de anel monocíclico de 4 a 7 membros, bicíclico de 7 a 11 membros, ou tricíclico de 10 a 15 membros, que tem pelo menos um heteroátomo em pelo menos um anel contendo á- tomo de carbono. Cada anel do grupo heterocíclico contendo um heteroáto- mo pode conter 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados de átomos de nitrogê- nio, oxigênio, e enxofre, onde os heteroátomos de nitrogênio e enxofre tam- bém opcionalmente podem ser oxidados e os heteroátomos de nitrogênio também opcionalmente podem ser quaternizados. Preferivelmente dois hete- roátomos adjacentes não são simultaneamente selecionados de oxigênio e nitrogênio. Heterocíclico grupos que são bicíclicos ou tricíclicos devem incluir pelo menos um anel não-carbocíclico não aromático, porém o outro anel ou anéis fundidos podem ser aromáticos ou não-aromáticos e podem ser car- bocíclico, contanto que em tais casos o ponto de ligação seja em qualquer átomo de nitrogênio ou carbono disponível de um anel contendo heteroáto- mo não-aromático. Adicionalmente, a definição de heterocíclico grupos em si inclui anéis em que um ou mais dos átomos de carbono são ligados por meio de uma ligação dupla a um átomo de oxigênio para definir um grupo carboni- la (contanto que o grupo heterocíclico seja não-aromático) e também quando um grupo heterocíclico tem fundido a ele um outro anel, tal outro anel pode ter um ou mais grupos carbonila.
Grupos heterocíclicos monocíclicos exemplares incluem pirroli- dinila, imidazolidinila, tetraidrofurila, piperidinila, piperazinila, pirazolidinila, imidazolinila, pirrolinila, tetraidropiranila, morfolinila, tiamorfolinila, e similares.
"Heterociclo substituído," "heterocíclico substituído,"e "substituí- do heterociclo" refere-se a grupos heterociclo, heterocíclico, ou heterociclo grupos como definido acima substituído com um ou mais substituintes, prefe- rivelmente 1 a 4 substituintes, em qualquer ponto disponível de ligação. Substituintes exemplares incluem alquila, alquila substituída, alquenila, al- quenila substituída, bem como aqueles grupos mencionados acima como substituintes alquila exemplares.
"Hidróxi" refere-se a -OH.
"Tiol" significa o grupo -SH.
O termo "nitrogênio quaternário" refere-se a um átomo de nitro- gênio positivamente carregado tetravalente incluindo, por exemplo, o nitro- gênio positivamente carregado em um grupo tetraalquilamônio (por exemplo, tetrametilamônio ou N-metilpiridínio), o nitrogênio positivamente carregado em espécies de amônio protonadas (por exemplo, trimetilhidroamônio ou N- hidropiridínio), o nitrogênio positivamente carregado em N-óxidos de amina (por exemplo, N-metil-morfolina-N-óxido ou piridine-N-óxido), e o nitrogênio positivamente carregado em um grupo N-amino-amônio (por exemplo, N- aminopiridínio).
Quando um grupo funcional é denominado "protegido", isto signi- fica que o grupo está em forma modificada para mitigar, especialmente im- pedir, reações colaterais indesejadas no sítio protegido. Grupos de proteção adequados para os métodos e compostos descritos aqui incluem, sem limi- tação, aqueles descritos em livros didáticos padrão, incluindo Greene, T.W. e outro, Protective grupos in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. (1991), incorpo- rado aqui por referência.
Para qualquer grupo bivalente listado aqui, tal como -(CR8Rg)- (CH2)m-Z-, que é capaz de inserção nos Compostos de Fórmula I,
<formula>formula see original document page 17</formula>
a inserção deve ser feita da esquerda para a direita. Por exemplo, na seguin- te situação onde A é definido como -(CR8Rg)-(CH2)m-Z-, o grupo metileno é ligado a K, e o grupo Z é ligado ao nitrogênio do anel de aziridinila, como segue:
<formula>formula see original document page 17</formula>
MODALIDADES ALTERNATIVAS DA INVENÇÃO
A presente invenção compreende compostos tendo a seguinte Fórmula I, como definido acima,
<formula>formula see original document page 17</formula> e inclui sais farmaceuticamente aceitáveis e/ou solvatos destes.
De acordo com uma modalidade da invenção,
K é O;
A é C2-4alquileno;
B1 é -OH;
R2, R3, R4 e R5 são, independentemente, hidrogênio ou alquila inferior;
R6 é hidrogênio ou metila;
R13 é uma heteroarila de 5 ou 6 membros opcionalmente substituída, preferi- velmente uma tiazolila, piridila, ou oxazolila opcionalmente substituída; e
M é -S-R30-O-C(=O)-, -S-R30-C(=O)- , ou -S-R34R3O-O-C(=O)- ,
em que
R30 é alquileno inferior ou substituído alquileno inferior; e R34 é arileno ou substituído arileno; e R1, R12 T, e Q são como definido em outro lugar aqui, por exemplo, como no Sumário da Invenção, acima, ou modali- dades alternativas, abaixo.
Em uma modalidade da presente invenção, são fornecidos com- postos tendo a seguinte fórmula Ia:
<formula>formula see original document page 18</formula>
em que V é uma porção de ligação de receptor de folato, e T, Q, M e R6 são como definidos em outro lugar aqui, por exemplo, como no Sumário da In- venção ou modalidade alternativa, acima, ou em modalidades alternativas abaixo, por exemplo, V pode ter a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 19</formula>
em que W e X são independentemente CH ou nitrogênio;
R20 é hidrogênio, amino ou alquila inferior;
R21 é hidrogênio, alquila inferior, ou forma um grupo cicloalquila com R23;
R22 é hidrogênio, alquila inferior, alquenila inferior, ou alquinila inferior; e
R23 é hidrogênio ou forma uma cicloalquila com R21.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, V é,
<formula>formula see original document page 19</formula>
De acordo com uma modalidade da presente invenção, são for- necidos compostos tendo a seguinte fórmula Ib:
<formula>formula see original document page 19</formula>
em que
V é uma porção de ligação de receptor de folato;
R é H ou alquila inferior;
Q é O, S, ou NR7;
M é a ligador liberável tendo a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 20</formula>
preferivelmente ;
Ri4 em cada ocorrência é, independentemente, hidrogênio, al- quila, alquila substituída, arila, arila substituída, arilalquila, arilalquila substi- tuída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilalquila, substituído ciclo- alquilalquila, heteroarila, heteroarilalquila, substituído heteroarilalquila, subs- tituído heteroarila, heterocicloalquila, ou substituído heterocicloalquila; e é preferivelmente um grupo selecionado de H, metila, guanidinilpropila, - (CH2)1-2-C02H, -CH2-SH, -CH2-OH, imidazolil(metil), aminobutila, e -CH(OH)- CH3; e é mais preferivelmente a Ci a C3 alquila substituído com um de - C(=0)-0H ou -NH-C(=NH)-NH2;
q é 1 a 10 (preferivelmente 1 a 5);
R15, R16 e R17 São independentemente hidrogênio, alquila inferior ou alquila inferior substituída; e
R18, R19, R31, R32, R33, R24, R25, R26, R27, R28 e R2g são cada qual, independentemente, H, alquila inferior, alquila inferior substituída, ci- cloalquila, ou cicloalquila substituída, ou qualquer de R18 e R19; R31 e R32; R19 e R31; R33 e R24; R25 e R26; R24 e R25; ou R27 e R28 podem ser empregados juntos para formar uma cicloalquila.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, são for- necidos compostos tendo a fórmula:
<formula>formula see original document page 20</formula>
e incluem sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos destes.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, métodos de tratar câncer são fornecidos compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da presente invenção, como aqui descrito. De acordo com uma modalidade preferida, métodos para tratar um câncer associado com o receptor de folato são fornecidos compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento, um conjugado tendo a seguinte fórmula:
<formula>formula see original document page 21</formula>
O uso de um agente para superregular o nível de receptor de folato (FR) pode ser eficaz para aumentar a expressão de FR em certas cé- lulas de câncer ou tipos de tumor para realçar as vantagens obtidas na ad- ministração dos compostos conjugados da invenção aos pacientes, e/ou pa- ra realçar as várias doenças ou tipos de tumor que podem ser tratados com os compostos conjugados de ligação de receptor de folato de acordo com a invenção. A expressão de receptor de folato em certos cânceres pode ser superregulada pela administração de um indutor de receptor de folato, que seletivamente aumenta o nível de receptor de folato nas células de câncer, desse modo realçando a eficácia de uma terapia alvejada de receptor de folato. Por exemplo, cânceres de mama positivos de receptor de estrogênio (ER+) expressam baixos níveis de receptores de folato. Tratamento com um indutor de receptor de folato, tal como tamoxifen, um antagonista de estro- gênio, é é conhecido superregular a expressão de receptores de folato em ER + cânceres de mama, aumentando a suscetibilidade de ER + células de câncer de mama para tratamento com uma terapia alvejada por receptor de folato.
Um aspecto da invenção fornece um método de tratar câncer ou uma doença proliferativa em um paciente em necessidade deste, compreen- dendo opcionalmente administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um indutor de receptor de folato e administrando uma quantidade eficaz de pelo menos um composto conjugado de acordo com a fórmula I. O indutor de re- ceptor de folato pode ser administrado antes ou concomitantemente com o composto conjugado de acordo com a fórmula I. Em uma modalidade, o in- dutor de receptor de folato é administrado antes do composto conjugado de fórmula I. Uma quantidade eficaz do indutor de receptor de folato refere-se a uma quantidade que superregula o receptor de folato nas células desejadas tal como aquela administração de um composto conjugado de receptor de folato é terapeuticamente eficaz.
Exemplos de indutores de receptor de folato para a superregula- ção de receptor de folato α (FRa) incluem: antagonistas de receptor de es- trogênio tal como tamoxifeno; agonistas de receptor de progesterona tal co- mo progestina; agonistas de receptor de androgênio tal como testosterona e diidroxitestosterona, e agonistas de receptor de glicocorticóide tal como de- xametasona.
Exemplos de indutores de receptor de folato para a superregula- ção de receptor de folato β (FRp) incluem: agonistas de receptor de ácido retinóide tal como ácido retinóide totalmente trans (ATRA), ácido benzóico de tetrametil naftalenil propenila (TTNPB), ácido 9-eis retinóico (9-cis RA), CD33336, LG101093, e CD2781.
Em uma modalidade, é fornecido um método de tratar câncer ou uma doença proliferativa em um paciente em necessidade deste, compreen- dendo administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um indutor de re- ceptor de folato e administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um composto conjugado de acordo com a fórmula I; em que o referido indutor de receptor de folato superregula o receptor alfa de folato. Preferivelmente, re- ferido câncer ou doença proliferativa é selecionado de câncer de mama, tal como ER+ câncer de mama, e câncer ovariano.
Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um mé- todo de tratar câncer ou uma doença proliferativa em um paciente em ne- cessidade deste, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um indutor de receptor de folato e administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um composto conjugado de acordo com a fórmula I; em que o referido indutor de receptor de folato superregula o receptor beta de folato. Preferivelmente, o referido câncer ou doença proliferativa é selecionado de leucemia, e mais preferivelmente de leucemia mielogenosa aguda (AML) e leucemia mielogenosa crônica (CML).
Em uma outra modalidade, é fornecido um método de tratar cân- cer ou uma doença proliferativa em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um indu- tor de receptor de folato, administrando pelo menos um inibidor de histona desacetilase, e administrando uma quantidade eficaz de pelo menos um composto conjungado de acordo com a fórmula I. Um exemplo de um inibi- dor de histona desacetilase é tricostatina A (TSA). Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos ne 2003/0170299 A1, WO 2004/082463, Kelly, K. M., B.G. Rowan1 e M. Ratnam, Câncer Research 63, 2820-2828 (2003), Wang, Zheng1 Behm, e Ratnam, Bloodl 96:3529-3536 (2000).
Os Compostos de Fórmula (I) podem formar sais ou solvatos que incluem-se também no escopo desta invenção. Referência a um com- posto da fórmula (I) aqui é entendido incluir referência a sais e solvatos des- tes, a menos que de outro modo indicado. O termo "sal(is)", como asqui em- pregado, denota sais acídicos e/ou básicos formados com bases e ácidos inorgânicos e/ou orgânicos. Além disso, quando um composto de fórmula (I) contém tanto uma porção básica, tal como porém não limitada a uma piridinil imidazolila, amina ou guanidinila quanto uma porção acídica tal como porém não limitada a um ácido carboxílico, zuitérions podem ser formados e são incluídos no termo "sal(is)" como aqui utilizados. Sais farmaceuticamente aceitáveis (isto é, não-tóxicos, fisiologicamente aceitáveis) são preferidos, embora outros sais sejam também úteis, por exemplo, em etapas de isola- mento ou purificação que podem ser empregadas durante a preparação. Sais dos compostos da fórmula (I) podem ser formados, por exemplo, rea- gindo um composto de fórmula (I) com uma quantidade de ácido ou base, tal como uma quantidade equivalente, em um meio tal como aquele em que o sal precipita-se ou em um meio aquoso seguido por liofilização.
Os compostos de Fórmula (I) que contêm uma porção básica, tal como porém não limitada a uma amina, um grupo quanidinila, ou um anel piridila ou imidazolila, podem formar sais com uma variedade de ácidos or- gânicos e inorgânicos. Sais de adição de ácido exemplares incluem acetatos (tal como as aqueles formados com ácido acético ou ácido trihaloacético, por exemplo, ácido trifluoroacético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, benzenossulfonatos, bissulfatos, boratos, butiratos, citratos, can- foratos, canforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsul- fatos, etanossulfonatos, fumaratos, glucoeptanoastos, glicerofosfatos, he- missulfatos, heptanoatos, hexanoatos, hidrocloretos, hidrobrometos, hidroio- detos, hidroxietanossulfonatos (por exemplo, 2-hidroxietanossulfonatos), Iac- tatos, maleatos, metanossulfonatos, naftalenossulfonatos (por exemplo, 2- naftalenossulfonatos), nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, fenila propionatos (por exemplo, 3-fenila propionatos), fosfatos, picratos, pi- valatos, propionatos, salicilatos, sucinatos, sulfatos (tal como aqueles forma- dos com ácido sulfúrico), sulfonatos (tal como aqueles mencionados aqui), tartaratos, tiocianatos, toluenossulfonatos tais como tosilatos, undecanoatos, e similares.
Os Compostos de Fórmula (I) que contêm uma porção acídica, tal como porém não limitada a um ácido carboxílico, podem formar sais com uma variedade de bases orgânicas e inorgânicas. Sais básicos exemplares incluem sais de amônio; sais de metal de álcali tais como sais de sódio, lítio, e potássio; sais de metal alcalino terroso tal como sais de cálcio e magnésio; sais com bases orgânicas (Por exemplo, aminas orgânicas) tal como benza- tinas, dicicloexilaminas, hidrabaminas (formados com N.N-bis(desidroabietil) etilenodiamina), N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glicamidas, t-butila aminas; e sais com aminoácidos tais como arginina, lisina, e similares. Grupos con- tendo nitrogênio básico podem ser quaternizados com agentes taiscomo ha- letos de alquila inferior (por exemplo, cloretos, brometos, e iodetos de metila, etila, propila, e butila), sulfatos de dialquila (por exemplo, sulfatos de dimeti- la, dietila, dibutila, e diamila), haletos de cadeia longa (por exemplo, cloretos, brometos, e iodetos de decila, laurila, miristila, e estearila), haletos de aral- quila (por exemplo, brometos de benzila e fenetila), e outros.
Solvatos dos compostos da invenção são também contemplados aqui. Solvatos dos compostos de Fórmula (I) incluem, por exemplo, hidratos.
Todos os estereoisômeros dos presentes compostos (por exem- plo, aqueles que podem existir devido aos carbonos assimétricos em vários substituintes), incluindo formas enantioméricas e formas diastereoméricas, são contemplados dentro do escopo desta invenção. Estereoisômeros indi- viduais dos compostos da invenção podem, por exemplo, ser substancial- mente livres de outros isômeros (por exemplo, como um isômero ótico puro ou substancialmente puro tendo uma atividade especificada), ou podem ser misturados, por exemplo, como racematos ou com todos os outros, ou ou- tros selecionados, estereoisômeros. Os centros quirais da presente invenção podem ter a configuração S ou R como definido pelas IUPAC 1974 Recom- mendations. As formas racêmicas podem ser resolvidass por métodos físi- cos, tal como, por exemplo, cristalização fracional, separação ou cristaliza- ção de derivados diastereométicos, ou separação por cromatografia de colu- na quiral. Isômeros óticos individuais podem ser obtidos de processos este- reoespecíficos, em que materiais de partida e/ou intermediásrios são sele- cionados tendo uma estereoquímica correspondente àquela desejada para os produtos acabados, e a estereoquímica é mantida por meio das reações, e/ou os isômeros podem ser obtidos de racematos por qualquer método a- dequado, incluindo sem limitação, métodos convencionais, tais como, por exemplo, formação de sal com um ácido oticamente ativo seguido por crista- lização.
Todos os isômeros configuracionais dos compostos da presente invenção são contemplados, ou em mistura, ou em forma pura ou substanci- almente pura. Como pode ser apreciado, a configuração preferida pode ser uma função do composto particular e a atividade desejada. Isômeros confi- guracionais podem ser preparados pelos processos descritos aqui, que po- dem ser estereosseletivos. Em outras palavras, uma estereoquímica deseja- da para os compostos finais pode ser obtida utilizando materiais de partida tendo a correspoondente estereoquímica desejada, e em seguida mantendo a estereosseIetividade em todo o processo de preparação. Alternativamente, os compostos podem ser preparados como racematos ou diastereômeros, e então a estereoquímica desejada pode ser obtida por meio de separação de isômeros configuracionais que podem ser obtidos por qualquer método ade- quado conhecido no campo, por exemplo, tal como cromatografia de coluna.
Em toda a especificação, grupos e substituintes destes podem ser escolhidos para fornecer porções estáveis e compostos úteis como com- postos farmaceuticamente aceitáveis e/ou compostos intermediários úteis na preparação de compostos farmaceuticamente aceitáveis. Alguém versado no campo apreciará seleções adequadas para variáveis para obter compostos estáveis.
Modalidades indicadas aqui como exemplares ou preferidas des- tinam-se a ser ilustrativas e não limitantes.
Outras modalidades da invenção serão evidentes para alguém versado no campo tais como, por exemplo, considerando combinações das modalidades referenciadas acima, e são contempladas como abrangidas dentro do escopo da invenção anexa.
UTILIDADE
Os compostos conjugados da presente invenção são úteis para liberar agentes estabilizantes de microtúbulo derivados de epotilona para tumores que expressam um receptor de folato. Eles são úteis no tratamento de uma variedade de cânceres e outras doenças proliferativas, particular- mente aqueles cânceres caracterizados por células de câncer ou tumores que expressam o receptor de folato. O termo "condição associada ao recep- tor de folato" como aqui utilizado compreende doenças ou distúrbios caracte- rizados pela expressão do receptor de folato, ou em outras palavras,aquelas doenças ou distúrbios que podem ser diagnosticados ou tratados com base no nível de expressão do receptor de folato em tecido doente quando com- parado com tecido normal.
Como um exemplo não-limitante, tal como cânceres associados ao receptor de folato incluem câncer ovariano e cânceres da pele, mama, pulmão, cólon, nariz, garganta, glândula mamária, fígado, rim, baço, e/ou cérebro; mesoteliomas, adenoma pituitário, câncer cervical, carcinoma de célula renal ou outro câncer renal, carcinoma do plexo coróide, e tumores epiteliais (Veja, Asok, Antony, "Receptor of folates: Reflections on a Personal Odyssey and a Perspective on Unfolding Truth," Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) at 1059-66).
Adicionalmente, uso de um antiestrogênio (tal como como tamo- xifeno, ICI 182, 780), pode ser eficaz para aumentar a expressão de FR em certas células de câncer ou tipos de tumor para realçar as vantagens obtidas na administração dos compostos conjugados da invenção a pacientes, e/ou para realçar as várias doenças ou tipos de tumor que podem ser tratados com os compostos conjugados de acordo com a invenção.
Por exemplo, as doenças que podem ser tratadas com os com- postos conjugados desta invenção, e/ou em uma terapia de combinação compreendendo os compostos conjugados desta invenção em combinação com um antiestrogênio, podem também incluir, sem limitação, os seguintes
- carcinomas incluindo aqueles listados acima e/ou aqueles da bexiga, pâncreas, estômago, tireóide, e próstata;
- tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo Ieu- cemias tal como leucemia linfocítica aguda e leucemia linfoblástica aguda, e linfomas, tal como Iinfoma de célula B, Linfoma de célula T, Linfoma de Hodgkins, não-linfoma de Hodgkins, Iinfoma de célula pilosa, e Iinfoma de Burkitts;
- tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemia mielogenosa aguda e crônica e leucemia promielocítica;
- tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwanomas;
- tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossar- coma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e
- outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, seminoma, ceratoacantoma, câncer folicular de tireóide, e teratocarcinoma.
Os compostos conjugados da presente invenção são úteis para tratar pacientes que foram previamente tratados de câncer, bem como aque- les que não foram previamente tratados de câncer. Os métodos e composi- ções desta invenção podem ser utilizados em tratamentos de câncer de pri- meira linha e segunda linha. Além disso, os compostos conjugados de Fór- mula I podem ser úteis para tratar cânceres refratários ou resistentes.
Os compostos conjugados da presente invenção podem também ser úteis no tratamento de outras condições responsivas a agentes estabili- zantes de microtúbulo liberados por meio do receptor de folato, incluindo porém não limitado a, artrite, especialmente artrite inflamatória e outras con- dições inflamatórias mediadas por macrófagos ativados, e distúrbios do sis- tema nervoso central tal como doença de Alzheimer.
Além disso, os compostos conjugados da presente invenção po- dem ser administrados em combinação com outros agentes anticâncer e citotóxicos e tratamentos úteis no tratamento de câncer ou outras doenças proliferativas. Em tratamento de câncer, uma combinação de compostos da presente invenção e um ou mais agentes adicionais e/ou outros tratamentos podem ser vantajosos. O segundo agente pode ter o mesmo ou diferente mecanismo de ação dos compostos de Fórmula (I). Especialmente úteis são as combinações de fármaco anticâncer e citotóxicos em que o segundo fár- maco escolhido age de uma maneira diferente ou fase diferente do ciclo ce- lular do que a porção de fármaco ativa dos presentes compostos da presen- te invenção.
Exemplos de classes de agentes anticâncer e citotóxicos inclu- em, porém não estão limitados a, agentes de alquilação, tal como mostardas de nitrogênio, sulfonatos de alquila, nitrosouréias, etileniminas, e triazenos; antimetabólitos, tal como antagonistas de folato, análogos de purina, e aná- logos de pirimidina; antibióticos ou anticorpos, tal como anticorpos monoclo- nais; enzimas; inibidores de farnesil-proteína transferase; agentes hormo- nais, tal como glicocorticóides, estrogênios/antiestrogênios, androgê- nios/antiandrogênios, progestinas , e antagonistas de liberação de hormônio de luteinização; agentes rompedores de microtúbulo, tal como ecteinascidi- nasou seus análogos e derivados; agentes estabilizantes de microtúbulo; produtos derivados de planta, tal como alcalóides vinca, epipodofilotoxinas, e taxanos; inibidores de topoisomerase; inibidores de prenil-proteína transfera- se; complexos de coordenação de platina; inibidores de cinase incluindo multi-inibidores de cinase e/ou inibidores de Src cinase ou Src/abl; inibidores de transdução de sinal; e outros agentes utilizados como anticâncer e agen- tes citotóxicos tal como modificadores de resposta biológica, fatores de cres- cimento, e moduladores imunes. Os compostos conjugados de Fórmula I podem também ser utilizados em conjunto com terapia de radiação.
Outros exemplos de agentes anticâncer que podem ser utiliza- dos em combinação com os compostos da invenção incluem o inibidor de Src Kinase inhibitor, 'N-(2-cloro-6-metilfenila)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-pipe- razinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, e outros compostos descritos em Patente dos Estados Unidos ns 6.596.746 e Pedido de Patente dos Estados Unidos ne 11/051.208, depositado em 4 de fevereiro de 2005, incorporado aqui por referência; ixabepilona, um análogo de aza-epotilona B, e/ou outros análogos de epotilona descritos nas Patentes dos Estados Uni- dos n2s 6.605.599, 6.262.094, 6.288.237, 6.291.684, 6.359.140, 6.365.749, 6.380.395, 6.399.638, 6.498.257, 6.518.421, 6.576.651, 6.593.115, 6.613.912, 6.624.310, Pedido de Patente dos Estados Unidos n2 2003/0060623, publicado em março de 2003; Patente Alemã nQ 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, 20 WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/00485, Pedido de Pa- tente dos Estados Unidos Nos. 2004/0053910 e 2004/0152708; inibidores de cinase dependente de ciclina encontrados em WO 99/24416 (Veja também a Patente dos Estados Unidos nQ 6.040.321); inibidores de prenil-proteína transferase encontrados em WO 97/30992 e WO 98/54966; agentes de far- nesyl proteína transferase descritos na Patente dos Estados Unidos ne 6.011.029; Anticorpos de CTLA-4 descritos na publicação PCT ηδ W001/14424, e/ou um anticorpo de CTLA-4 descrito na publicação PCT ns WO 00/37504 tais como, por exemplo, o anticorpo conhecido como CP- 675206 (ticilimunab) ORENCIA®; MDX-010; vinflunina (Javlor™), e Erbitux (cetixumamb).
Outros agentes potencialmente úteis em combinação com com- postos da presente invenção podem incluir paclitaxel (TAXOL®), docetaxel (TAXOTERE®) agentes heterogêneos tais como, hidroxiuréia, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, cisplatina e carboplatina; Avastina; e Hercep- tina.
Os compostos da presente invenção podem também ser formu- lados ou co-administered com outros agentes terapêuticos que são selecio- nados quanto a sua utilidade particular em terapias de administração associ- adas com as condições anteriormente mencionadas. Por exemplo, compos- tos da invenção podem ser formulados com agentes para prevenir náusea, hipersensibilidade e irritação gástrica, tal como antieméticos, e antihistamíni- cos H1 e H2.
Os outros agentes terapêuticos acima, quando empregados em combinação com os compostos da presente invenção, podem ser utilizados, por exemplo, naquelas quantidades indicadas na Physicians' Desk Referen- ce (PDR) ou como de outro modo determinado por alguém versado na técnica.
Os compostos da presente invenção podem ser administradas para qualquer dos usos descritos aqui por quaisquer métodos adequados, por exemplo, parenteralmente, tal como por injeção subcutânea, intraveno- sa, intramuscular, ou intrasternal ou técnicas de infusão (por exemplo, como suspensões ou soluções aquosas ou não-aquosas injetáveis estéreis), e/ou em formulações de unidade de dosagem contendo diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, não-tóxicos. Os presentes compostos podem, por exemplo, ser administrados em uma forma adequada para liberação i- mediata ou liberação prolongada. Liberação imediata ou liberação prolonga- da pode ser obtida pela utilização de composições farmacêuticas adequadas compreendendo os presentes compostos, ou, particularmente no caso de liberação prolongada, pelo uso de dispositivos tais como implantes subcutâ- neos ou bombas osmóticas.
Composições exemplares para administração parenteral incluem suspensões ou soluções injetáveis que podem conter, por exemplo, diluen- tes ou solventes parenteralmente aceitáveis, não-tóxicos adequados, tal co- mo manitol, 1,3-butanodiol, água, Solução de Ringer, uma solução de cloreto de sódio isotônica (0.9% Injeção de Cloreto de Sódio [Salina Normal] ou In- jeção de Dextrose a 5%), ou outros agentes de dispersão ou umectação e suspensão adequados, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos, e ácidos graxos. Composições e/ou métodos farmaceuticamente aceitáveis de admi- nistrar compostos da invenção podem incluir uso de co-solventes incluindo, porém não limitados a etanol, N,N dimetilacetamida, propileno glicol, glicerol e polietileno glicóis, por exemplo, polietileno glicol 300 e/ou polietileno glicol 400, podem compreender o uso de tensoativos (agente tensoativo farmaceu- ticamente aceitável que podem ser utilizados para aumentar as propriedades de dispersão ou umectação do composto reduzindo sua tensão de superfí- cie), incluindo sem limitação, CREMOFOR®, SOLUTOL HS 15®, polissorbato 80, polissorbato 20, poloxâmero, pirrolidonas tais como N-alquilpirrolidona (por exemplo, N-metilpirrolidona) e/ou polivinilpirrolidona; podem também compreender o uso de um ou mais "tampões" (por exemplo, um ingrediente que confere uma capacidade de resistir à mudança na acidez eficaz ou alca- linidade de um meio na adição de incrementos de um ácido ou base), inclu- indo, sem limitação, fosfato de sódio, sodium citrate, dietanolamina, trietano- lamina, L-arginina, L-lisina, L-histidina, L-alanina, glicina, carbonato de sódio, tromethamina (a/k/a tris[hidroximetil]aminometano ou Tris), e/ou misturas destes.
A quantidade eficaz do composto da presente invenção pode ser determinada por alguém versado na técnica, e inclui quantidades de dosa- gem exemplar para um humano adulto de cerca de 0,01-10 mg/kg de peso corporal de composto ativo por dia, que pode ser administrado em uma dose única ou na forma de doses divididas individuais, tal como de 1 a 4 vezes por dia. Uma faixa preferida inclui uma dosagem de cerca de 0,02 a 5 mg/kg de peso corporal, com uma faixa de cerca de 0,05 a 0,3, sendo mais preferi- da. Será entendido que o nível de dose e freqüência de dosagem específi- cos para qualquer indivíduo particular podem ser variados e dependerão de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico em- pregado, a estabilidade metabólica e tempo de ação daquele composto, a espécie, idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo, o mo- do e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármaco, e severidade da condição particular. Indivíduos preferidos para o tratamento incluem animais, mais preferivelmente espécies mamíferas, tal como huma- nos, e animais dométicos tais como cães, gatos e similares, submetidos à condições associadas com a estabilização de microtúbulo.
Compostos da presente invenção, tal como compostos descritos em um ou mais dos seguintes exemplos, foram testados em um ou mais dos ensaios descritos abaixo e/ou ensaios mostrados no campo, e demonstram um nível mensurável de atividade como agentes de estabilização de micro- túbulo.
Ensaio de Sobrevivência de Célula Clonogênica
Células de câncer foram semeadas a células 3,0E+05 em um frasco T75 com 10 ml de meios de RPM11640, livres de ácido fólico, e con- tendo 10% soro bovino fetal e 25 mM de HEPES. Células foram cultivadas em um incubador a 37°C contendo C02 a 5% durante 2 dias. No dia 2, os sobrenadantes foram removidos dos frascos, e os frascos foram divididos em 2 grupos. Um grupo de células foi incubado com 5 ml de meios contendo 100 M de ácido fólico (Sigma) durante 30 minutos e os outros foram cultiva- dos em 5 ml de meios sem ácido fólico adicionado. As células foram então tratadas com 20 nM da epotilona, análogo de epotilona, epotilona conjugada, ou análogo de epotilona conjugado durante uma hora. Ao término da incuba- ção, os fármacos foram removidos dos frascos e as células foram lavadas com tampão de PBS 3x. Após lavagem, 5 ml de meios completos foram adi- cionados em cada frasco, e a célula foi cultivada na incubadora de C02 du- rante 23 horas. Na manhã seguinte, as células foram removidas dos frascos por tripsinização, Os números celulares foram determinados, e em seguida as células foram semeadas em uma placa de 6 cavidades. Dez dias após a semeadura, as colônias foram manchadas com violeta cristal e contadas. A fração de sobrevivências foi determinada.
Ensaio de Citotoxicidade / Proliferação de MTS In Vitro
A citotoxicidade in vitro foi avaliada em células de tumor utilizan- do um ensaio colorimétrico com base em tetrazólio que tira vantagem da conversão metabólica de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboxime- toxifenila )-2-(4-sulfenila )-2H-tetrazólio, sal interno) em uma forma reduzida que absorve luz a 492 nm. Células foram semeadas 24 horas antes da adi- ção da epotilona, análogo de epotilona, epotilona conjugada, ou análogo de epotilona conjugado. Seguindo uma incubação de 72 horas a 37°C com composto serialmente diluído, MTS, em combinação com o agente de aco- plamento de elétron metossulfasto de fenazina, foi adicionado às células. A incubação foi continuada durante 3 horas, em seguida a absorvência do meio a 492 nm foi avaliada com um espectrofotômetro para obter o número de células sobreviventes com relação às populações de controle. Os resul- tados são expressos como concentrações citotóxicas médias (valores IC50).
Ensaio de Receptor de Folato
Todos os procedimentos de preparação de amostra utilizados para o ensaio FR foram realizados a 4SC. Amostras de tecido foram homo- geneizadas em tampão de homogenização (10 mM de Tris, pH 8,0, 0,02 mg/ml cada de Ieupeptina e aprotinina; 1 ml de tampão/50 mg de tecido) uti- lizando um homogeneizador PowerGen 125. Resíduos grandes foram remo- vidos por suave centrifugação (3000 X g durante 15 minutos). Péletes de membrana foram então coletadas por centrifugação a 40,000 X g durante 60 minutos e ressuspensas em tampão de-solubilização (50 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 25 mM de n-octil-p-D-glucopiranosídeo, 5 mM de EDTA, e 0,02% de azida de sódio). Material insolúvel foi removido por uma segunda centrifugação a 40.000 χ g 60 minutos, e a concentração total de proteína dos sobrenadantes foi determinada pelo método de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Chemical). Cada amostra foi então diluída para 0,25 mg/ml em tampão de solubilização, e 100 μΙ foram colocados dentro de cada dos dois microconcentradores (30,000-MW de corte, Millipore). Amostras foram então centrifugadas a 14.000 X g durante 10 minutos em temperatura ambi- ente para passar todo o líquido através da membrana, bem como para reter as FRs solubilizadas sobre a superfície da membrana do microconcentrador. Todas as etapas de centrifugação subseqüentes foram realizadas utilizando estes mesmos parâmetros. Em seguida 55 μl de 30 mM de tampão de ace- tato (pH 3,0) foram adicionados a cada microconcentrador, seguido por uma etapa de centrifugação. A seguir, 55 μl de salina tamponada por fosfato (PBS) foram distribuídos dentro de cada microconcentrador, seguido por ou- tra centrifugação. Em seguida 50 μl de reagente de ligação de ácido fólico [3H] (120 nM de ácido fólico [3H] (Amersham) em 10 mM de Na2PO4, 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4, contendo 500 mM de NaCI, 2,7 mM de KCl, e 25 mM de n-octil-p-D-glucopiranosídeo) ou 50 μΙ de um reagente de competição (reagente de ligação mais 120 μΜ de ácido fólico não rotulado) foram adi- cionados aos concentradores apropriados. Seguindo uma incubação de 20 minutos em temperatura ambiente, os concentradores foram lava- dos/centrifugados três vezes com 75 μl de 50 mM de n-octil-p-D-glucopi- ranosídeo, 0,7 M de NaCI em PBS, pH 7,4. Após a lavagem final, os retenta- tos contendo as FRs solubilizadas foram recuperados da superfície da membrana dos microconcentradores por duas enxaguadas com 100 μl de PBS contendo Triton X-100 a 4%. As amostras foram em seguida contadas em uma registradora de cintilação líquida (Packard Bioscience). Os valores de contagens por minuto (cpm) foram convertidos em picomoles de FR com base no cpm de um padrão conhecido, e os resultados finais foram normali- zados com respeito ao teor de proteína da amostra.
Animais e Tumores
Camundongos CD2F1 machos (Harlan Sprague-Dawley Inc., 20- g) mantidos em um ambiente controlado e providos com água e alimento ad libitum foram utilizados nestes estudos. O carcinoma de pulmão FRalfa(-) Madison 109 (M109) de murino (Marks e outro, 1977) e a variante (FRcc(+)) 98M109 expressando FR foram utilizados para avaliar a eficácia da epotilo- na, análogo de epotilona (por exemplo, derivado de epotilona), conjugado de folato-epotilona, ou conjugado de folato-análogo de epotilona. Além disso, o carcinoma KB epidermóide de cabeça e pescoço humano desenvolvido em camundongos nus fo também utilizado para este propósito.
Avaliação do Tratamento com Fármaco e Eficácia Antitumor
Para administração de epotilonas ou análogos de epotilona a camundongos, um excipiente consistindo nos seguintes foi utilizado: CRE- MO FO R®/etanol/água (1:1:8, v/v). Os compostos foram primeiro dissolvidos em uma mistura de CREMOFOR®/etanol (50:50). Diluição final para a inten- sidade de dosagem requerida foi feita menos do que 1 hora antes da admi- nistração do fármaco. Os camundongos foram administrados os agentes por injeção IV em bolos através da veia do rabo. Conjugado de folato-epotilonas ou conjugado de folato-análogo de epotilonas foram preparados em salina tamponada por fosfato estéril e administrados aos camundongos por injeção em bolos IV através da veia do rabo em um volume de 0,01 mL/g de camun- dongos. O tratamento de cada animal foi com base no peso corporal do indivíduo.
O número requerido de animais necessários para detectar uma resposta significativa foi agrupado no início do experimento e cada um foi administrado uma inoculação subcutânea de um homogeneizado de tumor (2% p/v). Os tumores foram deixados desenvolver durante 4 dias. No quarto dia, os animais foram uniformemente distribuídos para vários grupos de tra- tamento e controle. Os animais tratados foram checados diariamente quanto à toxicidade/mortalidade com relação ao tratamento. Cada grupo de animais foi pesado antes do início do tratamento (Wt1) e em seguida novamente se- guindo a última dose de tratamento (Wt2). A diferença em peso corporal (Wt2-Wt1) fornece uma medida de toxicidade com relação ao tratamento.
A resposta de tumor foi determinada por avaliação dos tumores com um compasso de calibre duas vezes por semana, até os tumores atingi- rem um tamanho "alvo" predeterminado de 1 gm. Os pesos do tumor (mg) foram estimados pela fórmula:
Peso de tumor = (comprimento χ largura2) ÷ 2
A atividade antitumor foi avaliada na dose máxima tolerada (MTD) que é definida como o nível de dose imediatamente abaixo do qual a toxicidade excessiva (isto é, mais do que uma morte) ocorreu. Quando a morte ocorreu, o dia da morte foi registrado. Os camundongos tratados que morrem antes de ter seus tumores atingido o tamanho alvo foram considera- dos ter morrido de toxicidade ao fármaco. Nenhum camundongo de controle morreu transportando tumores menores do que o tamanho alvo. Os grupos de tratamento com mais do que uma morte causada por toxicidade ao fár- maco foram considerados ter tido tratamentos excessivamente tóxicos e seus dados não foram incluídos na avaliação de uma eficácia antitumor do composto.
O ponto final da resposta de tumor foi expresso em termos de retardo do crescimento do tumor (valor T-C), definido como a diferença em tempo (dias) requerido para os tumores tratados (T) para atingir um tamanho alvo predeterminado em comparação àqueles do grupo de controle (C).
Para estimar a morte de célula de tumor, o tempo de duplicação de volume de tumor (TVDT) foi primeiro calculado com a fórmula :
TVDT = Tempo médio (dias) para os tumores de controle atingirem o tama- nho alvo - Tempo médio (dias) para os tumores de controle atingirem meta- de do tamanho alvo e,
Log morte celular = T-C -r (3.32 χ TVDT)
Avaliações estatísticas de dados foram realizadas utilizando
Teste Wilcoxon generalizado de Gehan. ABREVIAÇÕES
As seguintes abreviações são utilizadas nos esquemas e exem- pios inclusos para facilidade de referência:
CBZ-OSu = N-(BenziloxicarbonHóxi)sucinimida DCM = diclorometano DEA = dietilamina DIAD = diisopropil azodicarboxilato DIPEA = diisopropiletilamina DMA = dimetilamina DMF = dimetil formamida DMSO = dimetilsulfóxido EDC = cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida EtOH = etanol EtOAc = acetato de etila HOBt = n-hidróxi benzotriazol HPCL = cromatografia líquida de alto desempenho iPr-OH ou IPA = álcool isopropílico LC/MS = cromatografia líquida / espectrometria de massa LDA = diisopropilamida de Iftio MeOH = metanol OTES = o-trietilsilila; OMs = mesilato; Ph = fenila Pd/C = paládio sobre carbono PyBOP = hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-oxitripirrolidinofosfônio Py = piridila RT = temperatura ambiente Sat'd = saturado THF = tetraidrofurano TFA = ácido trifluoroacético TLC = cromatografias de camada fina TESCL = clorotrietilsilano UV = ultravioleta.
MÉTODOS DE PREPARAÇÃO
Compostos da presente invenção podem geralmente ser prepa- rados de acordo com os seguintes esquemas e o conhecimento de alguém versado na técnica, e/ou utilizando métodos mencionados nas Patentes dos Estados Unidos n2s 6.605.599, 6.831.090, 6.800.653, 6.291.684; 6.719.540, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos ne 2005/0002942 e Organic Letters, 2001, 3, 2693-2696, as descrições dos quais são aqui in- corporadas por referência e/ou nos Exemplos que seguem.
Como mostrado no Esquema 1, um composto de fórmula X pode ser preparado de um composto de fórmula II. Compostos de Fórmula II po- dem ser obtidos por fermentação (Veja, por exemplo, Gerth e outro,"Studies on the Biosynthesis de epotilonas: The Biosynthetic Origin of the Carbon Skeleton," Journal of Antibiotics, Vol. 53, ns 12 (Dec. 2000), e Hofle e ou- tro,"Epothilone AeB- Novel 16-Membered Macrolides: lsolation, Crystal S- tructure, and Conformation in Solution", Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 35, n9 13/14, 1567-1569 (1996), as descrições dos quais são aqui incorpora- das por referência) ou por síntese (Veja, por exemplo, Vite e outro, Patentes dos Estados Unidos nes 6.605.599, 6.242.469, 6.867.333, Publicação de Pe- dido de Patente dos Estados Unidos ns 2006/004065; e Johnson e outro, Organic Letters 2000, 2:1537-40; as descrições dos quais são aqui incorpo- radas por referência em sua totalidade). Por exemplo um composto de fór- mulas II onde R2, R3, R4, R5, e Ri2 são metila, Bi é hidroxila, Ri e R6 são hi- drogênio, e R2 é 2-metiltiazol-4-ila é referido como epotilona A e pode ser obtido de fermentação de sorangium cellulosum como referenciado acima.
Um composto de fórmula II pode ser convertido em um Composto de fórmula III onde P é um grupo de proteção de silila tal como trietilsilila, t-butil- dimetilsilila, t-butildifenila silila, triisopropilsilila, e similares (veja, por exem- plo, Greene e outro,"Protective grupos in Organic Synthesis", John Wiley e Sons, Inc.). Por exemplo, um composto de fórmula III onde P é trietilsilila pode ser preparado por tratamento de um composto de fórmula II com cloro- trietilsilano na presença de base de Hunig. No caso onde Bi é hidroxila no composto de fórmula II, em seguida B1 também seria convertido no éter de silila correspondente. Uma haloidrina de fórmula IV (Y é Cl, Br, ou I) pode ser preparada de um composto de fórmula III por tratamento com um sal de haleto de metal por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, abertura de epóxido utilizando eterato de brometo de magnésio em baixa temperatura (-20 a -5°C) pode fornecer haloidrinas diastereoméricas, onde Y é bromo.
Um composto de fórmula V pode ser preparado de um composto de fórmula IV por deslocamento do halogênio utilizando, por exemplo, azida de sódio em um solvente polar tal como dimetilformamida. Um técnico versado reco- nhecerá que a estereoquímica a C12 como representado no Esquema I não deve ser construída como limitante, porém de preferência exemplar. Se de- sejado, a inversão da estereoquímica na posição C12 pode ser obtida se- guindo o protocolo Mitsunobu que é bem estabelecido na técnica. Por exem- plo, tratamento de um composto de fórmula V com ácido p-nitrobenzóico, dietilazodicarboxilato, e trifenil fosfina fornece o correspondente éster de ni- trobenzoato, que pode em seguida ser clivado por suave hidrólise de éster utilizando, por exemplo, soluções metanólicas de amônia para fornecer um composto de fórmula VI. Novamente, a estereoquímica para C12 como repre- sentado para o Composto Vl não é limitante, e é representada como tal co- mo para mostrar que o tratamento de Composto V como descrito inverterá a estereoquímica naquela posição. Alternativamente, outros ácidos orgânicos, azodicarboxilatos, e organofosfinas podem ser utilizados para realizar a in- versão Mitsonuobu. Um composto de fórmula Vll onde OG é um grupo de saída tal como mesilato, tosilato, nosilato, triflato e similares pode ser prepa- rada de um composto de fórmula Vl por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, tratamento de Vl com cloreto de metanossulfonila e trietilamina em um solvente orgânico adequado tal como diclorometano fornece um compos- to de fórmula Vll onde OG é mesilato. Um composto de fórmula Vlll pode ser preparado de um composto de fórmula Vll por redução do grupo azido com um agente de redução tal como uma organofosfina (por exemplo, trimetilfos- fina). Alternativamente, um composto de fórmula VIII pode ser preparado diretamente de um composto de fórmula Vl utilizando um agente de redução de organofosfina tal como trifenila fosfina. Um composto de fórmula IX pode ser preparado de um composto de fórmula Vlll por métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos ns 6.800.653; e Re- gueiro-Ren e outro, Organic Letters, 2001, 3, 2693-2696). Por exemplo, um composto de fórmula IX onde H-K-A- é 2-hidroxietila pode ser preparado de um composto de fórmula VIII por alquilação do anel de aziridina utilizando, por exemplo, excesso de 2-bromoetanol e a base tal como carbonato de po- tássio. Um composto de fórmula X pode ser preparado de um composto de fórmula IX por remoção dos grupos de proteção de éter silíla utilizando mé- todos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Greene e outro,"Protective grupos in Organic Synthesis", John Wiley e Sons, Inc.). Por exemplo, quan- do P é trietilsilila, tratamento de um composto de fórmula IX com ácido triflu- oroacético em diclorometano realiza a desproteção para fornecer um com- posto de fórmula X. ESQUEMA 1
<formula>formula see original document page 40</formula>
O análogo de folato ou derivado Veo Iigador bivalente T-Q de um composto de fórmula I podem ser agrupados utilizando métodos conhe- cidos na técnica, especialmente no caso onde V é ácido fólico ou um análo-~ go de ácido fólico, como descrito, por exemplo, por Jackson, e ou- tro, Advanced Drug Delivery Rev. 56(2004) 1111-1125, a descrição do qual é aqui incorporada por referência, e T-Q é um peptídeo. Por exemplo, folato de peptidila Xl pode ser preparado como mostrado no Esquema 2. Acoplamento de peptídeo seqüencial de uma resina de poliestireno carregada de cisteína com aspartato protegido por Fmoc, arginina, aspartado, e em seguida gluta- mato pode ser realizado utilizando PyBOP como agente de acoplamento e piperidina como agente de desproteção por Fmoc. Ácido pteróico protegido por N 10-trifluoroacetamida pode ser preparado em duas etapas por conver- são enzimática (carboxipeptidase G) de ácido fólico em ácido pteróico, se- guido por proteção por N10 utilizando anidrido trifluoroacético. A seguir, aco- plamento do ácido pteróico protegido por N10 ao peptídeo ligado à resina seguido por clivagem da resina com ácido trifluoroacético e remoção do gru- po de N10-trifluoroacetila utilizando hidróxido de amônio fornece um fragmen- to de V-T-Q de um composto de fórmula I onde V é ácido fólico e T-Q é - Asp-Arg-Asp-Cys-OH. Alternativamente, análogos de ácido pteróico podem ser utilizados em lugar de ácido pteróico e outros aminoácidos podem ser utilizados em lugar daqueles ilustrados no Esquema 2.
ESQUEMA 2
Resina de H-Cys(4-metoxitritil)-2-clorotritila (loading 0.57mmol/g)
1) Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA, DMF, then piperidine
2) Fmoc-Arg(Pbf)-OH, PyBOP, DIPEA, DMF, then piperidine
3) Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA, DMF, then piperidine
4) Fmoc-Glu-OtBu, PyBOP, DIPEA, DMF, then piperidine
5) NloTFAPteroicAcid, PyBOP, DIPEA, DMSO
6) 92.5% TFA, 2.5% H2O, 2.5% i-Pr3SiH, and 2.5% ethanedithiol
7) NH4OH aq., then HCl aq.
<formula>formula see original document page 41</formula>
Legenda da figura:
Resina de H-Cys(4-metoxitritil)-2-clorotritila
1) a 4) - em seguida piperidina
5) Ácido pteróico de N10TFA
6) e etanoditiol a 2,5%
7) NH4OH aquoso, em seguida HCI aquoso
Final o agrupamento de Compostos de Fórmula I podem ser ob- tidos por acoplamento do análogo de epotilona da fórmula X a um fragmento V-T-Q por incorporação em etapas de um Iigador liberável Μ. A título de ilus- tração, um composto de fórmula X onde -A-K-H é -CH2CH2OH pode ser con- vertido em um dissulfaniletil carbonato Xlll utilizando um composto de ben- zotriazol ativado de fórmula XII. Um composto de fórmula Xll pode ser pre- parado de mercaptoetanol, cloreto de metoxicarbonil sulfenila, e uma 2- mercaptopiridina opcionalmente substituída para fornecer um 2-(2-piridin-2- il)dissulfanil)etanol intermediário, que pode em seguida ser convertido em um composto de fórmula Xll por tratamento com difosgeno e um 1- hidroxibenzotriazol opcionalmente substituído. Subseqüente permuta de dis- sulfito com um folato de peptidila tal como Xl fornece um composto de fór- mula I onde V é ácido fólico, T-Q é a -Asp-Arg-Asp-Cys-OH, M é - SCH2CH2O(C=O)-, A é -CH2CH2- e K é O.
ESQUEMA 3
<formula>formula see original document page 42</formula>
Esquema 4 ilustra um método alternativo para preparar um com- posto de fórmula X de um composto de fórmula XIV (Veja, Pedido de Paten- te dos Estados Unidos ns 60/940,088, depositado em 25 de maio de 2006, incorporado aqui em sua totalidade por referência). Compostos de Fórmula XIV podem ser obtidos por métodos bem conhecidos no campo, por exem- plo, por fermentação (Veja, por exemplo, Gerth e outro,"Studies on the Bi- osynthesis de epotilones: The Biosynthetic Origin of the Carbon Skeleton," Journal of Antibiotics, Vol. 53, ns 12 (Dec. 2000), e Hofle e outro,"Epothilone A e B- Novel 16-Membered Macrolides: lsolation, Crystal Structure, e Con- formation in Solution", Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 35, ns 13/14, 1567- 1569 (1996), as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência) ou por síntese total (Veja, por exemplo, Vite e outro, Patentes dos Estados Unidos nss 6,605,599; 6,242,469; 6,867,333 e Publicação de Pedido de Pa- tente dos Estados Unidos 2006/004065, as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Por exemplo um composto de fórmulas XIV onde R2, R3, R4, R5, e Ri2 são metila, B1 é hidroxila, R1 e R6 são hidrogênio, e R2 é 2-metiltiazol-4-ila é referido como epotilona C e pode ser obtido de fermentação de Sorangium cellulosum como referenciado aci- ma. Um composto de fórmula XIV pode ser convertido em um composto de fórmula XV onde P é um grupo de proteção de silila tal como trietilsilila, t- butildimetilsilila, t-butildifenila silila, triisopropilsilila, e similares (veja, por e- xemplo, Greene e outro,"Protective grupos in Organic Synthesis", John Wiley e Sons, Inc.). Por exemplo, um composto de fórmula XV onde P é trietilsilila pode ser preparado por tratamento de um composto de fórmula XIV com clorotrietilsilano na presença de base tal como base de Hunig. No caso onde B1 é hidroxila no composto de fórmula XIV, em seguida B1 também seria convertido no éter de silila correspondente. Uma haloidrina de fórmula XVI ou XVII (Y é Cl, Br, ou I) pode ser preparada de um composto de fórmula XV por tratamento com um agente de halogenação tal como Y2 por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, adição eletrofílica em solventes polares tal como acetonitrila utilizando iodo pode estereosseletivamente fornecer haloidrinas regioisoméricas de fórmulas XVI e XVII, onde Y é iodo. Alternati- vamente N-halo sucinimidas podem também ser utilizadas para a mesma transformação. Um composto de fórmula XVIII pode ser preparado de com- postos de fórmulas XVI e/ou XVII por fechamento de anel de epóxido na presença de bases tal como trietilamina ou base de Hunig em um sistema solvente polar/aquoso tal como acetonitrila/água. Se desejado, o Composto XIV pode ser diretamente transformado em um Composto de Fórmula XVI e/ou XVII (onde P é H), que poderia em seguida ser convertido no epóxido XVIII (onde P é Η). Um composto de fórmula XVIII pode ser transformado nos álcoois de azido de fórmulas Vl e XIX por deslocamento da azida na presença de sais de azida inorgânica ou azidas de tetraalquil amônio em solventes alcoólicos. No caso onde P é um grupo de proteção de silila, com- postos de fórmulas XX e/ou XXI onde OG é um grupo de saída tal como me- silato, tosilato, nosilato, triflato e similares pode ser preparada de compostos de fórmulas Vl e/ou XIX por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, tratamento de Vl e/ou XIX com cloreto de metanossulfonila e trietilamina em um solvente orgânico adequado tal como diclorometano fornece compostos de fórmulas XX e XXI onde OG é mesilato. Um composto de fórmula Vlll pode ser preparado de compostos de fórmulas XX e/ou XXI por redução do grupo azido por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, Composto Vlll pode ser preparada de compostos de fórmulas XX e/ou XXI através da reação com um agente de redução tal como uma organofosfina (por exemplo, trimetilfosfina) em solventes polares tal como acetonitrila. Al- ternativamente, Quando P é Η, o composto de fórmula^VW-pode-ser direta- mente preparado de compostos de fórmulas Vl e/ou XIX por redução do gru- po azido com um agente de redução tal como uma organofosfina (por exem- plo, trifenil fosfina) em solventes polares tal como acetonitrila. Um composto de fórmula IX pode ser preparado de um composto de fórmula Vlll por méto- dos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos ns 6.800.653; e Regueiro-Ren e outro, Organic Letters, 2001, 3, 2693-2696). Por exemplo, um composto de fórmula IX onde H-K-A- é 2-hidroxietila pode ser preparado de um composto de fórmula Vlll por alquilação do anel de azi- ridina utilizando, por exemplo, excesso de 2-bromoetanol e a base tal como carbonato de potássio. No caso de P ser uma trialquilsilila, um composto de fórmula X pode ser preparado de um composto de fórmula IX por remoção dos grupos de proteção de éter silila utilizando métodos conhecidos na téc- nica (veja, por exemplo, Greene e outro,"Protective grupos in Organic Syn- thesis", John Wiley e Sons, Inc.). Por exemplo, quando P é trietilsilila, trata- mento de um composto de fórmula IX com ácido trifluoroacético em dicloro- metano realiza a desproteção para fornecer um composto de fórmula X. ESQUEMA 4
<formula>formula see original document page 45</formula>
A invenção será agora também descrita com referência aos se- guintes exemplos ilustrativos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Análogos de epotilona conjugada a folato Como descrito na descrição detalhada acima, análogos e deriva- tives de folato são descritos em Vlahov. Em pesquisas e desenvolvimento direcionado ao alvejamento do receptor de folato para células de tumor de compostos de epotilona conjugada e análogo de epotilona, diversos compos- tos foram conjugados ao folato. Por exemplo, Composto AA e Composto BB foram considerados como candidatos para conjugação ao ácido fólico:
<formula>formula see original document page 46</formula>
Composto AA tem atividade em experiências clínicas de Fase II, e seis conjugados de folato de Composto AA (Compostos AA.I a AA.VI; veja FIG. 1) foram preparados e opcionalmente testados quanto à estabilidade, ligação de FR1 e atividade mediada por FRem cultura celular.
A ligação de conjugados de folato de Composto AA a FR foi de- terminada em um ensaio que avalia o deslocamento de ácido fólico radioro- tulado de FR expressa em células de tumor KB desenvolvidas para conflu- ência. Ligação dos conjugados de folato de Composto AA.I e AA.II foi julga- da aceitável [afinidade relativa (RA) >0,25; RA de ácido fólico = 1.0]. Entre- tanto, surpreendentemente, nenhum dos seis conjugados de Composto AA mostrado na Fig. 1 exibiu citotoxicidade apreciável contra células de tumor KB em ensaios antiproliferação que avaliam a incorporação de 3H-timidina (dados não mostrados).
Visto que conjugados de Composto AA demonstraram, citotoxi- cidade de desapontamento contra células de tumor, estudos foram conduzi- dos utilizando três conjugados de Composto BB (Compostos BB.I a BB.III). O Composto BB é também conhecido como epotilona F, e é um análogo de Composto AA, onde o grupo de 21-amino é substituído por um grupo 21- hidroxila. Enquanto o Composto BB.Il (Fig. 2) exibiu citotoxicidade em con- centrações elevadas, a atividade não foi atenuada em estudos de competi- ção utilizando excesso de ácido fólico. Portanto, a citotoxicidade observada foi atribuída para liberação não-específica de Composto BB.II. Outros análogos de epotilona, por exemplo, epotilonas de aziri- dinila, são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos ne 6.399. 638; Regueiro-Ren, A, e outro, (2001) Org. Letters. 3:2693- 96) e mostram potente citotoxicidade antitumor. Por exemplo, um ensaio de MTS que comparou a potência citotóxica relativa de um número de análogos de epotilona contra um par de cepas de célula de câncer resistente ao taxa- no (HCTVM46 e A2790Tax) foi conduzido (Veja a Tabela 1). HCTVM46 é uma cepa de célula de carcinoma de cólon humano derivada da cepa origem HCT116 sensível, e é resistente a taxanos devido à superexpressão do transportador de effluxo de fármaco de p-glicoproteína de 170kD. A2780Tax é uma cepa de célula de carcinoma de ovário humano derivada da cepa ori- gem A2780, e é resistente ao paclitaxel com um resultado de uma mutação na seqüência de aminoácido de tubulina que prejudica a capacidade do pa- clitaxel ligar-se.
Como é mostrado na Tabela 1, vários análogos de aziridinila de epotilona (Compostos CC-EE) mostram potente atividade antitumor tanto contra as cepas celulares de carcinoma de cólon HCT116 e ovário A2780, em comparação a outros agentes antitumor conhecidos, por exemplo, pacli- taxel, Composto AA, e epotilona B.
Tabela 1. Atividade in vitro de epotilonas de 12,13-aziridinila
<formula>formula see original document page 47</formula>
<table>table see original document page 47</column></row><table> A despeito das atividades antitumor doscompostos de epotilona de aziridinila CC-EE, os únicos grupos de hidroxila nestas moléculas dispo- níveis para conjugação ao folato são aqueles encontrados nos C3 e C7 áto- mos de carbono. Conseqüentemente, tendo pesquisado diversos compostos e análogos de epotilona, neste contexto permaneceu um desafio de desco- brir um composto que seria facilmente disponível para conjugação ao folato, e que demonstraria atividade por meio de liberação específica da porção de epotilona ativa nas células de tumor.
O composto G de epotilona de aziridinila foi descoberto ter a fórmula,
<formula>formula see original document page 48</formula>
Composto G
Composto G (Veja Exemplos 2 e 3) provou-se surpreendente- mente fácil de conjugar ao ácido fólico para formar o Composto J (Veja E- XEMPLO 2) com relativa afinidade de 0,77 para o receptor de folato, quando comparado ao ácido fólico.
Inesperadamente, o grupo de hidroxila polar na cadeia lateral de aziridina não afetou adversamente a atividade antitumor dos análogos de epotilona aziridina. Este é importante por que é o análogo de epotilona de aziridina, por exemplo, Composto G, que media os efeitos antitumor na libe- ração de ácido fólico. A potência de Composto G, e três outros análogos de epotilona altamente potentes (ixabepilona, Composto AA, e Composto BB) foram avaliados pelo ensaio de formação de colônia que é descrito acima. A concentração necessária para matar 90% de células de câncer KB clonogê- nicas (IC90) foi determinada após uma duração de exposição de fármaco de 17 horas. Como mostrado na FIG. 3, o Composto G exibiu uma IC90 de 4,3 nM e foi ~2, 4, e 6-vezes mais potente do que o Composto CC, Composto AA, e ixabepilona, respectivamente.
A conjugação de Composto G para formar o Composto J não afetou a atividade antitumor do Composto G. O Composto J demonstrou substancial atividade citotóxica contra células de tumor in vivo. No modelo de tumor FRa(+)/n vivo de KBI1 o Composto J demonstrou a atividade tanto em dose tolerada máxima (MTD) quanto em dois níveis menores que produ- ziram toxicidade mínima (Veja FlG. 4). Ao contrário, ixabepilona foi ativo apenas em seu MTD (5 μιτιοΙ/kg). Quando comparado nos MTDs, o Com- posto J produziu efeitos antitumor maiores do que ixabepilona (FIG. 4).
<formula>formula see original document page 49</formula>
Composto J
Ao contrário, com o modelo de tumor origem FRa (-) M109, o Composto J teve atividade fraca em todos os níveis dse dose testados, inclu- indo em seu MTD (2.4 μmol/kg), ao passo que a ixabepilona foi ativa em seu MTD de 5 μιτιοΙ/kg. (FIG. 5). Estes resultados indicam que o FRa (-) M109 é sensível à ixabepilona e a inatividade de Composto J é provavelmente am- piamente uma conseqüência da ausência de expressão de FRa por este tumor. Estes resultados também fornecem evidência de que a atividade anti- tumor de Composto J pode ser mediada por meio dos receptores FRa.
Outra evidência do mecanismo de liberação de fármaco mediada por FRa de Composto J é fornecida pela observação de que a co- administração de um análogo de folato em excesso de 20 vezes da dose de Composto J pode substancialmente competir com o Composto J para liga- ção do receptor e proteger tumores FRa(+) 98M109 dos efeitos antitumor do Composto J. (FIG. 6). Visto que o Composto Geo conjugado (Composto J) têm efeitos antitumor surpreendentes tanto in vitro quanto in vivo, e visto que as atividades antitumor de Composto J podem ser atribuídas aos efeitos mediados por FRa(+)-, também descrita aqui é a conjugação de análogo de epotilona de aziridinila Composto G (Veja Exemplos 2 e 3) para formar o Composto J. (Veja EXEMPLO 2).
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE COMPOSTO J
<formula>formula see original document page 50</formula>
Ácido (S)-2-(4-((2-amino-4-oxo-3,4-diidropteridin-6H'l)metilamino)benzamido)- 5-((S)-3-carbóxi-1 -((S)-1 -((S)-3-carbóxi-1 -((R)-1 -carbóxi-2-(2-(2-((2-((1 S,3S, 7SJ0RJ1SJ2SJ6R)-7,11-diidroóxi-8,8J0J2-tetrametil-3-((E)-1-(2-metil- tiazol-4-il)prop-1 -en-2-il)-5,9-dioxo-4-oxa-17-aza-biciclo[14.1 .Ojheptadecan- 17-il)etóxi)carbonilóxi)etil)dissulfanil)etilamino)-1-oxopropan-2-ylamin guanidino-1-oxopentan-2-llamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5-oxopentanóico
A. [1 S-[1 R*,3R*(E),7R*,1OS*,11 R*,12R*,16S*]]-8,8,10,12-tetrame- til-3-[1-metH-2-(2-metil-4-tiazolil)etenil]-7,11-bis[(trietilsili)óx^ xabiciclo[14.1.0]heptadecano-5,9-diona.
<formula>formula see original document page 50</formula>
A uma solução agitada de epotilona A (5,0 g, 10,1 mmol), imida- zol (3,40 g, 49,9 mmols) e DIPEA (28,5 mL, 163,6 mmol) em DMF anidroso (100 mL) sob atmosfera de N2 foi adicionado cloreto de trietilsilila (15,0 mL, 89,4 mmol). após a adição ser completa, a solução reacional foi aquecida a 55°C (temperatura em banho de óleo) durante 12 horas para fornecer uma única mancha (tlc) do produto desejado.
A reação acima foi repetida mais duas vezes. O DMF da solução combinada foi destilado sob vácuo elevado, o resíduo espumoso foi purifica- do por cromatográfia de coluna (silica gel, E. Merck, 230-400 mesh, 600 g; 5:95, 10:90 e 15:85 EtOAc/hexanos) para fornecer 19,4 g (88,6%) de Com- posto A como sólido branco.
HPLC: ES Industries FIuoroSep RP Fenila, 4,6 χ 250 mm, isocrá- tico, 30 min, 100%B, (B = 90% MeQH/H20 + 0,2% H3PO4), taxa de fluxo a 1,0 ml/min, UV 254, t = 23,15 min. LC/MS (ES+) 722 (M+H).
B. Preparação de [4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,13S*,14S*,16R*(E)]]-14- Bromo-13-hidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil) ete- nil]-4,8-bis[(trietilsilil)óxi]-1 -oxacicloexadecano-2,6-diona
<formula>formula see original document page 51</formula>
A uma solução agitada de [1S-[1R*,3R*(E),7RM0SM1R*, 12R*,16S*]]-8,8,10,12-tetrametil-3-[1 -metil-2-(2-metil- 4-tiazolil)etenil]-7,11 - bis[(trietilsili)óxi]-4,17-dioxabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona (5,0 g, 6,92 mmol) em diclorometano anidroso (140 mL) a -20°C sob atmosfera de N2 foi adicionado MgBr2-Et2O (3 χ 2,13 g, 24,78 mmol) em três porções a cada du- as horas ao mesmo tempo que mantendo uma temperatura interna abaixo de -5°C. Após cerca de 7 horas, a mistura reacional foi diluída com dicloro- metano e lavada com NaHCO3 saturado (2 x), secada sobre Na2SO4 anidro- so e evaporada em vácuo para fornecer uma espuma. O resíduo foi purifica- do por cromatográfica de coluna (silica gel, E. Merck, malha 230-400, 180 g; 5:95, 7,5:92,5 e 12,5:87,5 EtOAc/hexanos) para fornecer Composto B (2,5 g, 45% de produção) como uma espuma branca juntamente com o material de partida recuperado (0,9 g, 18%).
HPLC: ES Industries FIuoroSep RP Fenila, 4,6 χ 250 mm, isocrá- tico, 30 min, 100%B, (B = 90% de MeOH/H20 + 0,2% de H3PO4), taxa de fluxo a 1,0ml/min, UV 254, t =14,37 min.(100% puro) LC/MS (ES+): 802 (M+H).
C. Preparação de [4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,13S*,14R*,16R*(E)]]-14- Azido-13-hidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-[1-metil-2-(2-metil- 4-tiazolil)etenil] -4,8-bis[(trietilsilil)óxi]-1-oxacicloexadecano-2,6-diona
<formula>formula see original document page 51</formula> A uma solução de [4S-[4R*,7S*,8R*,9RM3SM4S*,16R*(E)]]-14- Bromo-13-hidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-[1 -metil-2-(2-metil- 4-tiazolil)etenil] - 4,8-bis[(trietilsilil)óxi]-1-oxacicloexadecano-2,6-diona (9,9 g, 12,3 mmol) em 1,2 L de DMF foram adicionados azida de sódio (8,01 g, 123,3 mmol) e 18- coroa-6 (3,26 g, 12,3 mmol) a RT sob atmosfera de N2. A solução clara foi agitada mecanicamente em rt durante 7 dias. A solução foi diluída com EtO- Ac (4 L), e lavada com H2O (6x3 L). A camada orgânica foi secada (Na2SO4), e em seguida evaporada para fornecer 9,2 g do produto cru. Cro- matografia de coluna (silica gel 450 g, 5 - 15% EtOAc/hexane) forneceu 6,7 g (71% de produção) Composto C como uma espuma branca.
HPLC: YMC ODS-A S5, 4,6 χ 50 mm, isocrático, 30 min, 100%B. (B = 90% Me0H/H20 + 0,2% H3PO4), taxa de fluxo a 4,0 mUmin, UV 254 nm, t =2,00 min. LC/MS (ES+) 765 (M+H).
D. Preparação de [4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,13R*,14R*,16R*(E)]]-14- Azido-5,5,7,9-tetrametil-16-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil)etenil]-13-[(4-ni- trobenzoil)óxi]- 4,8-bis[(trietilsilil)óxi] -1 -oxacicloexadecano-2,6-diona
<formula>formula see original document page 52</formula>
[4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,13S*,14R*,16R*(E)]]-14-Azido-13-hidróxi- 5,5,7,9-tetrametiM 6-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil)etenil] -4,8-bis[(trietilsilil)óxi]- 1-oxacicloexadecano-2,6-diona (7,0 g, 9,15 mmol), ácido 4-nitrobenzóico (3,82 g, 22,9 mmol), e trifenilfosfina (6,0 g, 22,9 mmol) foram dissolvidos em THF (100 mL). Dietilazodicarboxilato (9,0 mL de 40% de solução em tolueno, 22,9 mmol) foi adicionado durante um período de 5 minutos. A mistura rea- cional foi mantida em RT durante 4 horas, concentrada e purificada por cro- matografia em sílica gel (gradientes em etapas de 5% de etilacetato/hexanos a 15% etilacetato/hexanos) para isolar o éster nitrobenzoato como uma es- puma branca (7,3g, 87%). LC-MS: Phenomenex C18, 4,6 χ 50 mm, isocrático, 15 min, 100%B. (B = 90% Me0H/H20 + 0,1% TFA), taxa de fluxo a 4,0 mL/min, UV 220 nm. tempo de retenção = 8,9 min. MS (ESI) M+H = 886,7
E. Preparação de [4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,13R*,14R*,16R*(E)]]-14- Azido-13-hidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil)etenil]- 4,8-bis[(trietilsilil)óxi] -1 -oxacicloexadecano-2,6-diona
<formula>formula see original document page 53</formula>
O éster de nitrobenzoato Composto D (7,3g, 7,98 mmol) foi dis- solvido em acetato de etil (35 mL)e resfriado para 0°C. Amônia em metanol (350 mL de solução a 2M em metanol) foi adicionada, e a mistura reacional agitada em RT durante 4 horas, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (gradientes em etapas de 10 % de etilacetato/hexanos a 30% de etilacetato/hexanos) para isolar [4S-[4R*,7S*,8R*,9RM3R*, 14R*, 16R* (E)]]-14-Azido-13-hidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil) etenil]-4,8-bis[(trietilsilil)óxi] -1-oxacicloexadecano-2,6-como um sólido bran- co vítreo (5,97g, 98%).
LC-MS: Phenomenex C18, 4,6 χ 50mm, isocrática, 5 min, 100%B. (B = 90% Me0H/H20 + 0,1% TFA), taxa de fluxo a 4,0 mUmin, UV 220 nm. tempo de retenção = 2,25 min. MS (ESI) M+H = 765,66.
F. Preparação de [1 S-[1 R*,3R*(E),7R*,1 OS*,11 R*,12R*,16S*]]-8,8, 10,12-tetrametil-3-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil)etenil]-7,11 -bis[(trietilsilil) oxi]-4-oxa-17-azabicioclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona.
<formula>formula see original document page 53</formula>
[4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,13R*, 14R*, 16R*(E)]]-14-azido-13-hidróxi- 5,5,7,g-tetrametil-16-[1 -metil-2-(2-metil- 4-tiazolil)etenil]-4,8-bis[(trietilsilil)óxi] -1-oxacicloexadecano-2,6-diona (5,97 g, 7,8 mmols) e trietilamina (4,34 mL, 31,2 mmols) foram dissolvidos em diclorometano (85 mL) e resfriados para 0°C. Metanossulfonilcloreto (1,8 mL, 23,4 mmols) foi adicionado gota a gota durante um período de 5 min. Após 10 min, a mistura reacional foi removida em banho gelado, e agitada em RT. Após 3 horas, a mistura reacional foi absorvida em NaHC03 saturado (300 mL), extraída com diclorometano (3 X 100 mL), secada sobre Na2SO4, concentrada e elavada para próxima etapa sem outra purificação.
O éster de metanossulfonato cru foi dissolvido em THF/H20 (12:1, 130 mL). Trietilamina (2,2 mL, 16 mmols) e trimetilfosfina (16 mmols, 16 mL of 1,0 M solução em THF) foram adicionados, e a mistura reacional foi agitada em RT. Após 3 horas, a reação foi aquecida aa 45°C durante 7 ho- ras, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (gradientes em etapas de 2% metanol/clorofórmio a 5% metanol/clorofórmio) para isolar o Composto F como sólido branco (5,08 g, 88% para duas etapas).
LC-MS: Phenomenex C18, 4,6 χ 50 mm, isocrático, 5 min, 100%B. (B = 90% Me0H/H20 + 0,1% TFA), taxa de fluxo a 4,0 mL/min, UV 220 nm. tempo de retenção = 0,298 min. MS (ESI) M+H = 721,58
G. Preparação de [1S-[1 R*,3R*(E),7R*,10S*,11 R*,12R*,16S*]]- 7,11 -Dihidróxi-17-[2-hidroxietil]-8,8,10,12-tetrametil-3-[1-metil-2-(2-metil- 4-tiazolil)etenil]-4-oxa-17-azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona
<formula>formula see original document page 54</formula>
K2CO3 (1,4g, 10,2 mmol) e 2-bromoetanol (0,52 mL, 7,3 mmols) foram adicionados a [1S-[1R*,3R*(E),7RM0SM1R*,12RM6S*]]-8,8,10,12- tetrametil-3-[1 -metil-2-(2-metil-4-tiazolil)etenil]-7,11 -bis[(trietilsilil)óxi]-4-oxa- 17-azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona (1,05 g, 1,46 mmol) em acetoni- trila (20 mL) e aquecido a 82°C. Durante 4 horas, 2-bromoetanol adicional (0,52 mL, 7,3 mmols) e K2CO3 (1,4 g, 10,2 mmol) foram adicionados. Duran- te 5 horas, 2-bromoetanol adicional (0,21 mL, 2,92 mmol) foi adicionada. A- pós 3 horas, a mistura reacional foi resfriada para temperatura ambiente, filtrada através de Celita, lavada com acetonitrila (5X5 mL), diclorometano (2X5 mL), concentrada e elavada para próxima etapa sem outra purificacao.
O produto de reação cru foi dissolvido em diclorometano (40 mL), resfriado para O°C, e ácido trifluoroacético (8,0 mL) foi adicionado. Após 1 hora, a mistura reacional foi concentrada, absorvida em NaHC03 saturado (200 mL), extraída com diclorometano (3 X 100 mL), secada sobre Na2SO^ concentrada, e purificada por cromatografia em sílica gel (10% meta- nol/diclorometano) para isolar [1S-[1 R*,3R*(E),7R*,10S*,11RM2R*,16S*]]- 7,11 -Dihidróxi-17-[2-hidroxietil]-8,8,10,12-tetrametil-3-[1 -metil-2-(2-metil-4-tia- zolil)etenil]-4-oxa-17-azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona (Composto G), como uma película clara (0,62g, 79% para duas etapas).
LC-MS: Waters Sunfire C18, 4,6 χ 50mm, gradiente, 0 a 100% de B durante 4 minutos. (A= 10% de Me0H/H20 + 0,1 % de TFA; B = 90% de Me0H/H20 + 0,1% de TFA), taxa de fluxo a 4,0 mUrnin, UV 220 nm. tempo de retenção = 2,12 min. MS (ESI) M+H = 537,52.
H. Preparação de ácido (S)-2-(4-((2-amino-4-oxo-3,4-diidrop- teridin-6-il)metilamino)benzamido)-5-((S)-3-carbóxi-1 -((S)-I -((S)-3-carbó- xi-1-((S)-1-carbóxi-2-mercaptoetilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5-gua- nidino-1-oxopentan-2-ilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5-oxopenta- nóico.
<formula>formula see original document page 55</formula>
Ácido (S)-2-(4-((2-amino-4-oxo-3,4-diidropteridin-6-il)metilamino) benzamido)-5-((S)-3-carbóxi-1 -((S)-1 -((S)-3-carbóxi-1 -((S)-1 -carbóxi-2- mercaptoetilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5-guanidino-1-oxopentan-2- ilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5-oxopentanóico foi sintetizado por síntese de peptídeo de fase sólido em cinco etapas iniciando de H-Cys(4- metoxitritil)-2-clorotritil-resina. A tabela 2 mostra a quantidade de reagentes utilizados na síntese.
TABELA 2
<table>table see original document page 56</column></row><table>
Os seguintes procedimentos foram utilizados:
Etapas de acoplamento:
À resina em vaso de síntese de peptide foram adicionados a so- lução de aminoácido, DIPEA, e PyBOP. A mistura foi borbulhada durante lhora e lavada 3X com DMF e álcool isopropílico. Desproteção de FMOC foi realizada por tratamento com 20% piperidina em DMF1 2X (10 min), antes de cada acoplamento de aminoácido. Esta seqüência foi repedida para cada etapa de acoplamento de aminoácido.
Síntese de ácido pteróico protegido por N10-TFA:
A 10 L de 0,1 M de solução de base Tris (121,1 g de base Tris em 10 L de água) em um frasco de base redonda mecânicamente agitado de 22 L, equipado com uma manta de aquecimento, foi adicionado 200 g (0,453 mol) de ácido fólico. A mistura foi agitada para dissolver o ácido fólico, e em seguida 500 mg (3,67 mmoles) de cloreto de zinco foi adicionada. Carboxi- peptidase G (frasconetes de 13 χ 20 unidades disponibilizado por Sigma) foi adicionado e o pH foi ajustado para 7,3 com 1N de HCI e mantido em toda reação. A mistura foi protegida de luz e aquecida a 30SC durante 8 a 10 dias (o uso de um auto-titulador para manter o pH constante reduziu o tempo de converson em 4 a 5 dias). A reação foi monitorada por HPLC analítica até 80% da conversão serem obtidos (outra conversão é desejável porém não foi otimizada). O produto foi precipitado da mistura reacional ajustando a so- lução para pH=3,0 utilizando 6N de HCI. A solução foi transferida para um frasconete centrífugo a 4000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi decantado. O sólido úmido foi então diretamente purificado como segue (o sólido úmido pode ser congelado para armagenagem ou primeiro secado por congelamento; entretanto, a armazenagem de sólidos úmidos no congelador até a dissolução foi mais efeciente). A 40 g de ácido pteróico cru em 700 ml_ de água foi adicionado 1,0 M de NaOH até pH=11,5. A mistura foi filtrada (Whatman tipo 1) e em seguida cromatografada (coluna: 10 χ 120 cm; fase estacionária: 8 kg de celulose de DEAE; fase móvel: 1,0 M de NaCI/0,01 M de NaOH, pH=11,5; taxa de fluxo: 17 ml/min). Frações de cor amarela de um litro foram coletadas e analisadas por HPLC. Frações contendo ácido pterói- co puro foram ajustadas para pH=3 com 6 M de HCI para precipitar o ácido pteróico. A mistura foi centrifugada a 3000 rpm durante 20 minutos. O so- brenadante foi decantado e lavado com água (3x). O sólido foi secado por congelamento durante pelo menos 72 horas. O impacto de água residual sobre a reação seguinte não é conhecido.
O ácido pteróico novamente secado sobre P2Os sob vácuo ele- vado durante mais 24 horas (observe que resultados similares na etapa de desproteção foram obtidos sem esta etapa de secagem adicional). Em se- guida, 100 g (0,32 mol) de ácido pteróico foram adicionados a um frasco de base redonda de 5 L1 equipado com um agitador mecânico e uma entrada de argônio, e armazenados sob vácuo elevado durante a noite. Gás de argônio foi adicionado seguido por 3500 g (2316 mL) de anidrido trifluoroacético. O frasco foi selado com uma tampa de borracha ou adaptador de entrada de argônio, e e em seguida agitado vigorossamente. O frasco foi protegido de luz e agitado em temperatura ambiente sob atmosfera de argônio durante 7 dias (a reação foi monitorada por HPLC de alíquotas diluídas 20x cada uma com água e DMSO). A mistura foi evaporada rotação até a secura e tratada com 2,5 L de ácido trifluoroacético a 3% em água. A mistura foi agitada du- rante a noite em temperatura ambiente para hidrolizar sub produtos de ani- drido. Evaporação giratória forneceu sólido seco. O sólido foi suspenso em 2 L de água e em seguida centrifugado em frascos centrífugos de 250-mL a 3000 rpm durante 20 minutos. O sobrenadante foi removido e o sólido foi lavado com água e centrifugado (4 vezes). O sólido foi secado por congela- mento durante 3 dias, transferidos para frasco âmbar, e secado sob vácuo elevado na presença de P2O5 durante 2 dias (Puresa >95%; TFA residual analisado por análise elementar).
Etapa de clivaqem:
O intermediário protegido foi liberado da resina utilizando o rea- gente de clivagem preparado de 92,5% (50mL) de TFA, 2,5% (1,34mL) de H2O1 2,5% (1,34mL) de Triisopropilsilano, e 2,5% (1,34mL) de etanoditiol. O reagente de clivagem foi adicionado a um vaso de reação (25mL). Argônio foi borbulhado através da mistura durante 1,5 horas. O líquido foi drenado do vaso, e Resina foi lavada com o reagente restante (3 X 8mL). Os voláteis foram concentrados por evaporação rotatória para um volume de 10 mL. É- ter dietílico (35,0 mL) foi adicionado para realizar precipitação. O sólido foi coletado por centrifugação e secado para fornecer 1,25 g de produto de cli- vagem.
Etapa de desprotecão:
O grupo de proteção de N10-trifluoroacetila na porção de ácido pteróico foi removido sob condições básicas. Iniciando com 250 mg de in- termediário protegido em 10 mL de água, o pH foi ajustado para 9,3 e manti- do durante 1 hora utilizando 4:1 de H20:hidróxido de amônio (1 - 2 mL). A- pós 1hora, o pH foi ajustado para 5 com 1N de HCI (~1 mL) e o produto foi purificado em HPLC preparativa para produzir 125 mg de Composto H.
Condições de purificação de HPLC:
Coluna: Waters NovaPak Ci8 300x19mm
Solvente A: Tampão de 10mM de Acetato de amônio, pH=5
Solvente B: Acetonitrila
Eluição: 1% de B a 20% de B em 40 minutos a 15mL/min Produção total de reações combinadas: 625 mg
I. Preparação de carbonato de 2-((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)- 7,11 -diidróxi-8,8,10,12-tetrametil-3-((E)-1-(2-metiltiazol-4-il)prop-1 -en-2- il)-5,9-dioxo-4-oxa-17-aza-biciclo[14,1,0]heptadecan-17-il)etil 2-(2-(piri- din-2-il)dissulfanil)etila
1. Preparação de 2-(2-(Piridin-2-il)dissulfanil)etanol
<formula>formula see original document page 59</formula>
A uma solução de cloreto de metoxicarbonil sulfenil (10 mL, 110 mmol), em diclorometano (100 mL), resfriado para 0°C, foi adicionado mer- captoetanol (7,6 mL, 110 mmol), em gotas. A mistura reacional foi deixada agitar a 0°C durante 30 minutos. Neste ponto, uma solução de 2-mercap- topiridina (12,2 g, 110 mmol) em diclorometano (160 mL) foi adicionada. A solução foi deixada reagir a 0°C durante 1 hora e em seguida foi deixada aquecer para RT por mais 1 hora. Produto sólido foi observado ter desavia- do-se da solução. TLC (1:1 de Éter de Pet/EtOAc) mostrou que produto sig- nificante formou-se. A mistura reacional foi concentrada para um volume de 125 mL. A mistura foi filtrada através de um funil Buchner. A massa filtrante foi lavada com diclorometano e em seguida secada sob vácuo durante a noi- te para fornecer 2-(2-(Piridin-2-il)dissulfanil)etanol (23,6 g), como o sal de HCl.
TLÇ: R, = 0,45
Placas - sílica gel EMD 60 F254, 5 X 10 cm, 250 M
2. Preparação de carbonato de Benzo[d][1,2,3]triazol-1-il 2-(2- (piridin-2-il)dissulfanil)etila
<formula>formula see original document page 59</formula>
Uma solução de difosgene (2,28 g, 11,5 mmol) em 15 mL de di- clorometano anidroso foi agitada sob argônio em um frasco de base redonda e resfriada por um banho de gelo/sal. Um funil de adição com uma mistura de 2-(piridin-2-ildissulfanil)etanol (5,01 g, 22,4 mmol) e trietilamina (2,25 g, 22,2 mmol) em 65 mL de diclorometano anidroso foi colocado no frasco de base redonda. A mistura foi adicionada gota a gota durante um período de 20 minutos. A mistura de reação foi deixada aquecer para RT e agitada du- rante mais 1 hora. Análise de TLC da mistura reacional mostrou que o mate- rial de partida foi consumido e houve formação de um "vestígio" de produto de cloroformiato menos polar, TLC (6:4 de EtOAc:Hexanos): Rf de material de partida 0,4; Rf de produto de cloroformiato: 0,8.
A mistura reacional foi agitada em um frasco de base redonda sob argônio e resfriada por um banho de gelo/sal . Uma mistura de 3,02 g, 22,4 mmol de HOBt e 2,23 g, 22,0 mmol de trietilamina em 10 mL de diclo- rometano anidroso foi adicionada a um funil de gotejamento afixado ao fras- co de base redonda. A mistura foi lentamente adicionada ao frasco de base redonda mantendo a temperatura de reação a 2°C. A mistura de reação foi deixada aquecer para RT e agitada durante a noite. Aproximadamente 27 mL de diclorometano foi em seguida destilada da mistura reacional em pres- são atmosférica. A mistura foi em seguida deixada resfriar para RT e agitar durante 2 horas. Os sólidos foram coletados por filtração, e a massa filtrante foi lavada com 20 mL de diclorometano. Os sólidos foram em seguida seca- dos sob vácuo a 40°C em um evaporador rotatório para fornecer 7,81 g de sólidos não totalmente branco. Este produto foi analisado por 1H- NMR e determinado ser o produto desejado.
3. Preparação de Carbonato de 2-((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)- 7,11 -diidróxi-8,8,10,12-tetrametil-3-((E)-1-(2-metiltiazol-4-il)prop-1 -en-2-il)- 5,9-dioxo-4-oxa-17-aza-biciclo[14,1,0]heptadecan-17-il)etil 2-(2-(piridin-2- il)dissulfanil)etila
A uma solução de [1S-[1R*,3R*(E),7RM0SM1RM2R*,16S*]]- 7,11 -Diidróxi-17-[2-hidroxietil]-8,8,10,12-tetrametil-3-[1 -metil-2-(2-metil-4-tia- zolil)etenil]-4-oxa-17-azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona em diclorome- tano anidroso a O-C foi adicionado DMAP (1,2 eq.) e carbonato de ben- zo[d][1,2,3]triazol-1-il 2-(2-(piridin-2-il)dissulfanil)etila (1,0 eq.) em tandem. A mistura reacional foi agitada a OeC sob argônio e monitorada por TLC a cada 10 min. DMAP adicional (1,2 eq.) e Composto I (2)(1,0 eq.) foram adiciona- dos quando necessário até que todo o Composto G fosse consumido. A rea- ção foi extingüida com MeOH (1 ml) a O2C, o solvente foi removido sob vá- cuo, e o resíduo foi purificada por cromatografia (silica gel, 2,5-5% de MeOH em DCM) para proporcionar o composto título como um sólido bege. Recu- perações e quantidades do composto são listadas abaixo na Tabela 3. Ren- dimento total de 2,95 g de Composto G foi de 2,80 g (67,9%) do Composto I.
TABELA 3
<table>table see original document page 61</column></row><table>
* Cada purificação cromatográfica tipicamente produziu o produto puro junto com algum produto impuro (80-90% de pureza). O produto impuro foi combi- nado com o produto cru da próxima batelada para purificação cromatográfi- ca. Para bateladas #2 e 4, duas purificações cromatográficas foram realizadas.
J. Preparação de ácido (S)-2-(4-((2-amino-4-oxo-3,4-diidrop- teridin-6-il)metilamino)benzamido)-5-((S)-3-carbóxi-1-((S)-1-((S)-3-carbó- xi-1 -((R)-1 -carbóxi-2-(2-(2-((2-((1 S,3S,7S,10R,11 S,12S,16R)-7,11 -diidróxi- 8,8,10,12-tetrametíl-3-((E)-1-(2-metiltia2ol-4-il)prop-1-en-2-il)-5,9-dioxo-4- oxa-17-aza-biciclo[14,1,0]heptadecan-17-il)ethóxi)carbonilóxi) etil) dis- sulfanil)
etilamino)-1-oxopropan-2-ílamino)-5-guanidino-1-oxopentan-2-ilamino)- 1 -oxopropan-2-ilamino)-5-oxopentanóico <formula>formula see original document page 62</formula>
Para 15 mL de H2O (borbulhado com argônio durante 10 min antes do uso) foi adicionado ácido (S)-2-(4-((2-amino-4-oxo-3,4-diidropteri- din-6-il)metilamino)benzamido)-5-((S)-3-carbóxi-1 -((S)-1-((S)-3-carbóxi-1 - ((S)-1 -carbóxi-2-mercaptoetilamino)-1 -oxopropan-2-ilamino)-5-guanidino-1 - oxopentan-2-ilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5-oxopentanóico (498 mg, 0,534 mmol) em um tubo de centrífua de medida de 50 mL. A esta suspen- são, enquanto borbulhando com argônio, foi adicionado gota a gota solução de NaHCO3 saturada (borbulhada com argônio durante 10 min antes do uso) até que o pH da solução resultante alcançasse 6,9. Carbonato de 2- ((1 S,3S,7S, 10R, 11S, 12S, 16R)-7,11 -diidróxi-8,8,10,12-tetrametil-3-((E)-1 -(2- metiltiazol-4-il)prop-1 -en-2-il)-5,9-dioxo-4-oxa-17-aza- biciclo[14,1,0]heptadecan-17-il)etil 2-(2-(piridin-2-il)dissulfanil)etila (400 mg, 0,534 mmol) em THF foi adicionado rapidamente e a solução homogênea resultante foi agitada sob argônio durante 30 min. O progresso da reação foi verificado por HPLC analítica em 15 min. O pico do produto desapareceu em ~ 6,4 min sob condições de HPLC analítica. A mistura foi diluída com -15 mL de tampão de fosfato e o THF foi removido sob vácuo. A solução turva foi centrifugada e filtrada. O filtrado amarelo foi dividido em duas porções e purificado por HPLC preparativa. Frações puras (>98% pura) foram agrupa- das e secas por congelamento. Frações de traço (<98% pure) foram coleta- das e re-purificadas para cada 3-6 ciclos de cromatografia para fornecer 700 mg do composto título como um pó branco (contém 11,8% em peso de água e 8,7% em peso de sódio e sais de fosfato de sódio, como determinado por Karl Fischer e análise elementar).
Parâmetros HPLC preparativa:
Coluna: Waters Nova-Pak HR C18 6μm 30x300 mm
Fase móvel A: 7,0 mM de tampão de fosfato de sódio, pH=7,2
Fase móvel B: acetonitrila
Método: 10% de B-50% de B em 30 min, taxa de fluxo: 40 mL/min
Parâmetros de HPLC analítica:
Coluna: Waters Simmetry C18 3,5pm 4,6x75 mm
Fase móvel A: 10 mM de Tampão de acetato de trietilamônio (TEAOAc), pH=7,5
Fase móvel B: Acetonitrila
Método: 20% de B-40% de B em 10 min, taxa de fluxo: 1,0 mL/min
Massa precisa m/z (C67H92N16022S3):
Calculado: 1570,58907 (M+2H), 785,29454 (M+2H)2+, 523,86563 (M+3H)3+, 393,15118 (M+4H)4+
Encontrado: (M+2H)2+ em 785,29100 (4,5 ppm), (M+3H)3+ em 523,86431 (2,5 ppm), (M+4H)4+ em 393,14996 (3,1 ppm)
EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO ALTERNATIVA DO COMPOSTO J
<formula>formula see original document page 63</formula>
Ácido (S)-2-(4-((2-amino-4-oxo-3,4-diidropteridin-6-il)metilami- no)benzamido)-5-((S)-3-carbóxi-1 -((S)-1 -((S)-3-carbóxi-1 -((R)-1 -carbóxi-2-(2- (2-((2-(( 1 S.3S.7S, 10R111S, 12S, 16R)-7,11 -diidróxi-8,8,10,12-tetrametil-3- ((E)-1-(2-metiltiazol-4-il)prop-1-en-2-il)-5,9-dioxo-4-oxa-17-aza-biciclo[14,1,0] heptadecan-17-il)ethóxi)carbonilóxi)etil)dissulfanil)etilamino)-1-oxopropan-2- ilamino)-5-guanidino-1-oxopentan-2-ilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5- oxopentanóico
3A. Preparação de [4S,7R,8S,10R,9S,13R,16S]-4,8,13-triidróxi-14- iodo-5,5,7,9-tetrametil-16-[(E)-1-[2-metiltiazol-4-il]prop-1 -en-2-il] oxaci- cloexadecano-2,6-diona.
<formula>formula see original document page 64</formula>
Epotilona C (54,3 g, 113,7 mmol) foi dissolvida em acetonitrila (480 mL) e água (50 mL). A solução foi resfriada a -5°C a -10°C. lodo (144,3 g, 568,4 mmol) foi adicionado à reação e a reação foi mantida pelo menos durante 15 hr.
A reação foi extingüida com 15% de solução de metabissulfito de sódio (900 mL). A mistura foi extraída com acetato de etila (2 χ 1,1 L). As fases orgânicas foram coletadas e lavadas sucessivamente com solução de bicarbonato de sódio saturada (675 mL) e solução de cloreto de sódio satu- rada (675 mL). Os solventes foram evaporados sob pressão reduzida para produzir o composto A cru como óleo amarelo (85,6 g). O Composto A foi utilizado na próxima reação sem outra purificação.
HPLC: Phenomex Luna C8 (2) 3um, 4,6 χ 150mm, isocrático, 18 min, 36% de B, 17 min, 56% de B, (Fase móvel A = 0,01 M de NH40Ac em ACN:Água (5:95), Fase móvel B = 0,01 M de NH40Ac em ACN:Água (95:5)), taxa de fluxo em 1 ,Oml/min, UV 245, Rt = 22,4 min.
3B. Preparação de [1R,3S,7S,10R,11S,12S,16S]-7,11-diidróxi- 8,8,10,12-tetrametil-3-[(E)-1-[2-metiltiazol-4-il]prop-1-en-2-il]-4,17-dioxa- biciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona.
<formula>formula see original document page 64</formula>
[4S,7R,8S,10R,9S,13R,16S]-4,8,13-triidróxi-14-iodo-5,5,7,9- tetrametil-16-[(E)-1 -[2-metiltiazol-4-il]prop-1 -en-2-il] oxacicloexadecano-2,6- diona (85,6 g) foi dissolvido em acetonitrila (670 mL) e água (130 mL). Trieti- lamina (135 mL, 968,5 mmol) foi adicionada à solução. A reação foi aquecida a 50°C a 60°C durante pelo menos 8 hr.
Depois que foi resfriada em RT, a solução foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com EtOAc (1,2 L) e lavado com so- lução de cloreto de sódio saturada (3 χ 500 mL). Os solventes foram evapo- rados sob pressão reduzida para produzir o produto cru como óleo amarelo. Purificação por filtração de almofada de sílica gel (silica gel 700 g, 66% de EtOAc em heptano, 2 χ 4 L, e 1 χ 3 L) proporcionou o Composto B como es- puma (50,3 g, 90% de rendimento) com HPLC AP 80, HPLC: Phenomex Lu- na C8 (2) 3um, 4,6 χ 150mm, isocrático, 18 min, 36% de B, 17 min, 56% de B, (Fase móvel A = 0,01 M de NH40Ac em ACN:Água (5:95), Fase móvel B = 0,01 M de NH40Ac em ACN:Água (95:5)), taxa de fluxo em 1,0ml/min, UV 245, Rt= 15,0 min.
3C/3D. Preparação de (4S,7R,8S,9S,13R,14R,16S)-13-Azido-4,8,14- triidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-((E)-1 -(2-metiltiazol-4-il)prop-1 -en-2-il) oxa- cicloexadecano-2,6-diona e (4S,7R,8S,9S,13S,14S,16S)-14-Azido-4,8,13- triidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-((E)-1 -(2-metiltiazol-4-il)prop-1 -en-2-il)oxa- cicloexadecano-2,6-diona.
<formula>formula see original document page 65</formula>
Em uma solução agitada of epi-Epotilona-A (14,35 g, 29,07 mmol) em etanol (240 mL) e água (48 mL) foi adicionado azida de sódio (11,45 g, 174,41 mmol) e cloreto de amônio (3,14g, 58,14 mmol). A mistura foi agitada a 60°C durante 17-20h. Os voláteis foram evaporados no evapo- rador giratório sob pressão reduzida abaixo de 50°C. O resíduo foi dissolvi- do em mistura de acetato de etila (287 mL) e água (50 mL). As fases foram separadas e a fase aquosa da base foi extraída com acetato de etila (115 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavada com 25% de solução de cloreto de sódio aquosa (salmoura). O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi passado através de uma almofada de sílica gel elu- indo com mistura de acetato de etila/n-heptano (2:1). Evaporação do solven- te sob pressão reduzida forneceu mistura regio-isomérica de azido-álcoois, (4S,7R,8S,9S,13R, 14R, 16S)-13-Azido-4,8,14-triidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16- ((E)-1-(2-metiltiazol-4-il)prop-1-en-2-il)oxacicloexadecano-2,6-diona e (4S, 7R,8S,9S,13S,14S,16S)-14-Azido-4,8,13-triidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-((E)-1 - (2-metiltiazol-4-il)prop-1-en-2-il)oxacicloexadecano-2,6-diona em relação de -6:1 (12,8 g, 82%) como uma espuma branca.
LC-MS: Coluna Phenomenex Luna C8(2): 3 μηη, 4,6 χ 50 mm.
Gradiente: 15 min, 0% de B para 100% de B em 10 min, em seguida 100% de B durante 5 min. Fase móvel: A = 0,01 M de NH4OAc em CH3CN/H20 5:95; B = 0,01 M de NH4OAc em CH3CN/H20 95:5, Taxa de fluxo: 3,0 mL/min. Comprimento de onda: UV 250 nm. Tempo de retenção = 5,52 min. MS (ESI) (M+H)+ = 537,69.
Esta reação também funciona em outros solventes como, aceto- na, acetonitrila, tetraidrofurano, 2-propanol, dimetilformamida, metilsulfóxido e N-metil-pirrolidinona.
Reagente de azida de tetrabutilamônio pode da mesma forma ser utilizado em vez de azida de sódio/cloreto de amônio.
3E. Preparação de (1S,3S,7S,10R,11S,12S16R)-7,11-diidróxi-8,8, 10,12-tetrametil-3-((E)-1 -(2-metiltiazol-4-il)prop-1 -en-2-il)-4-oxa-17-azabi- ciclo(14,1,0)heptadecano-5,9-diona.
14R, 16S)-13-Azido-4,8,14-triidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-((E)-1 -(2-metiltiazol- 4-il)prop-1-en-2-il)oxacicloexadecano-2,6-diona e (4S,7R,8S,9S,13S,14S, 16S)-14-Azido-4,8,13-triidróxi-5,5,7,9-tetrametil-16-((E)-1 -(2-metiltiazol-4- il)prop-1-en-2-il)oxacicloexadecano-2,6-diona (12,8 g, 23,85 mmol) em ace- tonitrila anidroso (90 mL) foi adicionado trifenilfosfina (9,48 g, 35,77 mmol) sob atmosfera de nitrogênio. A solução clara foi agitada em 20-40°C durante 19-40h. A mistura reacional foi resfriada a 0-5°C durante 3-4h e o produto filtrado. A massa foi lavada com heptano (64 mL) e secada a 40°C sob pressão reduzida durante 15-18h para produzir (1S,3S,7S,10R,11S, 12S16R)-7,11 -diidróxi-8,8,10,12-tetrametil-3-((E)-1 -(2-metiltiazol-4-il)prop-1 - en-2-il)-4-oxa-17-azabiciclo(14,1,0)heptadecano-5,9-diona como um sólido branco (5,41 g, 46%).
LC-MS: Coluna Phenomenex Luna C8(2): 3 Dm, 4,6 χ 50 mm. Gradiente: 15 min, 0% de B para100% de B em 10 min, em seguida 100% de B durante 5 min. Fase móvel: A = 0,01 M de NH4OAc em CH3CN/H20 5:95; B = 0,01 M de NH4OAc em CH3CN/H20 95:5, Taxa de fluxo: 3,0 mL/min. Comprimento de onda: UV 250 nm. Tempo de retenção = 4,43 min. MS (ESI) (M+H)+ = 493,68.
Esta reação da mesma forma funciona com outras fosfinas co- mo, tricicloexilfosfina, trimetilfosfina, tributilfosfina e tris(4-methoxifenil)- fosfina e outro solvente tetraidrofurano.
3G. Preparação de [1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]- 7,11 -Diidróxi-17-[2-hidroxietil]-8,8,10,12-tetrametil-3-[1 -metil-2-(2-metil- 4-tiazolil)etenil]-4-oxa-17-azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona.
<formula>formula see original document page 67</formula>
Legenda:
- fórmula química
- massa exata
- peso molecular
Et3N (4,95 mL, 35,52 mmol) e 2-bromoetanol (3,02 mL, 42,62 mmol) foram adicionados a (1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-diidróxi- 8,8,10,12-tetrametil-3-((E)-1-(2-metiltiazol-4-il)prop-1-en-2-il)-4-oxa-17- azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9-diona, 3,50 g, 7,10 mmol) em acetonitrila (35 mL) e aquecidos a 72,5°C. Depois de 20 hr, a mistura reacional foi res- friada em temperatura ambiente, concentrada até a secura através da desti- lação à vácuo giratória. O cru foi dissolvido em acetato de etila (50 mL) e misturado com água desionizada ( 35 mL). A mistura foi extraída com aceta- to de etila (3 χ 35 mL), secada em Na2SO4, filtrada, concentrada, cristalizada em acetonitrila (35 mL), lavada com acetonitrila (2x5 mL), e secada em for- no à vácuo a 455°C durante a noite para isolar (1S,3S,7S,10R,11S, 12S,16R)-7,11 -diidróxi-17-(2-hidroxietil)-8,8,10,12-tetrametil-3-((E)-1 -(2- metiltiazol-4-il)prop-1-en-2-il)-4-oxa-17-azabiciclo[14,1,0]heptadecano-5,9- diona como um pó cristalino branco (2,60g, HPLC AP 97,1, 68,2% de rendimento).
LC-MS: Phenomenex C8, 3 μm, 4,6 χ 150mm, gradiente, 10 a 50% de B durante 10 min, e interromper em 20 minutos. (A= 5% de MeCIWH2O + 0,01 M de NH40Ac; B = 95% de Me0H/H20 + 0,01 M de NH4OAc), taxa de fluxo em 1,0 mUmin, UV 254 nm. Tempo de retenção = 9,43 min. MS (ESI) M+H = 537,21.
Um técnico ordinariamente versado reconhecerá que o Compos- to 3G como preparado por este Exemplo 3 é idêntico ao Composto G como preparado pelo Exemplo 2, e desse modo, o Composto 3G pode ser utilizado para preparar os Compostos Η, I, e J, os métodos de preparação e compos- tos dos quais são descritos no Exemplo 2.
Claims (14)
1. Composto conjugado tendo a fórmula (I), <formula>formula see original document page 69</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável e/ou solvato deste, em que : V é uma porção de ligação de receptor de folato; Q é O, S, ou NR7; M é a Iigador liberável; K é O, S1 ou NR7a; A é -(CR8R9)-(CH2)m-Z- em que Z é -(CHRi0)-, -C(=0)-, -C(=0)-C(=0)-, -0C(=0)-, -N(R11)Ci=O)-, -SO2-, ou -N(R11)SO2-; B1 é hidroxila ou ciano e R1 é hidrogênio ou B1 e R1 são empre- gados juntos para formar uma ligação dupla; R2, R3, e R5 são, independentemente, hidrogênio, alquila, alquila substituída, arila ou arila substituída; ou R2 e R3 podem ser empregados jun- tamente com o carbono ao qual eles são ligados para formar uma cicloalqui- la opcionalmente substituída; R4 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquila substituída, alquenila substituída, arila, ou arila substituída; R6 é hidrogênio, alquila ou alquila substituída; R7a, R7, R8, Rg1 R1O, e R11 são independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, arila, arila substituída, heterocicloalquila, heterocicloalquila substituída, heteroarila, ou heteroarila substituída; R12 é H, alquila, alquila substituída, ou halogênio; R13 é arila, arila substituída, heteroarila ou heteroarila substituída; m é O a 6; T tem a fórmula : <formula>formula see original document page 70</formula> em que R14 em cada ocorrência é, independentemente, hidrogênio, alquila, alquila substituída, arila, arila substituída, arilalquila, arilalquila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilalquila, substituído cicloalqui- lalquila, heteroarila, heteroarilalquila, substituído heteroarilalquila, substituído heteroarila, heterocicloalquila, ou substituído heterocicloalquila; q é 1 a 10; e R15, R16 e R17 são independentemente hidrogênio, alquila inferi- or, ou alquila inferior substituída ou Ri6 e R^ são empregados junto para formar uma cicloalquila.
2. Composto conjungado de acordo com a Reivindicação 1, em que : K é O; A é C2-4alquileno; B1 é -OH; R2, R3, R4 e R5 são, independentemente, hidrogênio ou alquila inferior; R6 é hidrogênio ou metila; R13 é uma heteroarila de 5 ou 6 membros opcionalmente substi- tuída; e que M é -S-R30-O-Ci=O)-, -S-R30-C(=O)-, ou -S-R34R3o-0-C(=0)- em que R30 é alquileno inferior ou substituído alquileno inferior; e R34 é arileno ou substituído arileno.
3. Composto conjungado de acordo com a Reivindicação 2, em que R13 é uma opcionalmente substituída tiazolila, piridila, ou oxazolila.
4. Composto conjungado de acordo com a Reivindicação 2, ten- do a fórmula Ia <formula>formula see original document page 71</formula>
5. Composto conjugado tendo a seguinte fórmula Ib: <formula>formula see original document page 71</formula> em que V é a folato, ou um análogo ou derivado deste; R6 é H ou alquila inferior; Q é O, S, ou NR7; M é <formula>formula see original document page 71</formula> R14 em cada ocorrência é, independentemente, hidrogênio, al- quila, alquila substituída, arila, arila substituída, arilalquila, arilalquila substi- tuída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloalquilalquila, substituído ciclo- alquilalquila, heteroarila, heteroarilalquila, substituído heteroarilalquila, subs- tituído heteroarila, heterocicloalquila, ou substituído heterocicloalquila; q é 1 a 10; R15, R16 e R17 são independentemente hidrogênio, alquila inferior ou alquila inferior substituída; e R18, R19, R31, R32, R33, R24, R25, R26, R27, R28 e R29 são cada qual, independentemente, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou substitu- ído cicloalquila; ou qualquer de R18 e R19; R31 e R32; R19 e R31; R33 e R24; R25 e R26; R24 e R25; ou R27 e R2S podem ser empregados juntos para formar uma cicloalquila.
6. Composto conjugado de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1, 2, 3, 4, ou 5, em que q é 1 a 5, e cada R14 é independente- mente H, metila, guanidinilpropila, -(CH2)1-2-C02H, -CH2-SH, -CH2-OH, imi- dazolil(metil), aminobutila, ou -CH(OH)-CH3.
7. Composto conjugado de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1,2,3, 4, 5, ou 6, em que M é: <formula>formula see original document page 72</formula>
8. Composto conjugado de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que V é <formula>formula see original document page 72</formula> W e X são independentemente CH ou nitrogênio; R20 é hidrogênio, amino ou alquila inferior; R21 é hidrogênio, alquila inferior, ou forma um grupo cicloalquila com R23; inferior; e R22 é hidrogênio, alquila inferior, alquenila inferior, ou alquinila R23 é hidrogênio ou forma uma cicloalquila com R21.
9. Composto conjugado de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que V é <formula>formula see original document page 73</formula>
10. Composto conjungado de acordo com a Reivindicação 1, tendo a fórmula <formula>formula see original document page 73</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável e/ou solvato deste.
11. Composto conjungado de acordo com a Reivindicação 10, tendo a fórmulae formula <formula>formula see original document page 73</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável e/ou solvato deste.
12. Composição farmacêutica compreendendo o composto con- jugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, -9, 10 ou 11, ou um sal farmaceuticamente aceitável desta e/ou solvato des- ta, em um veículo farmaceuticamente aceitável.
13. Uso de composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 ou 11, para preparar um medicamento para o tratamento de uma condição associada com o receptor de folato em um paciente.
14. Uso de açoro com a Reivindicação 13 em que a referida condição é câncer selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer de pele, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de nariz, câncer de garganta, câncer de glândulas mamárias, câncer de fí- gado, câncer de rim, câncer de baço, câncer de cérebro, mesotelioma, ade- noma piíuitário, câncer cervical, carcinoma de célula renal ou outro câncer, carcinoma de plexo coróide, ou um tumor epitelial.
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