BRPI0708680A2 - processo para produção de beta-lisina, para a produção de beta-amino-epsilon-caprolactama, para a produção de epsilon-caprolactama, e para a produção de ácido epsilon-amino-capróico - Google Patents
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Abstract
PROCESSOS PARA A PRODUçãO DE BETA-USINA, PARA A PRODUçãO DE BETA-AMJNO-EPSILON-CAPROLACTAMA, PARA A PRODUçãO DE EPSILON-CAPROLACTAMA, E PARA A PRODUçãO DE áCIDO EPSILON-AMINO-CAPRóICO. Processo para a produção de 13-usina por meio da construção de um microorganismo recombinante que possui um gene de lisina-2,3-amino-mutase desregulado e pelo menos um gene desregulado selecionado do grupo de (i) que consiste de aspartocinase, asparto-semialdeido-desidrogenase, di-hidro-dipicolinato-sintase, di-hidro-dipicolinato-redutase, tetra-hidro-dipicolinato-succinilase, succinil-amino-ceto-pimelato transaminase, succinil-diamino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase, piruvato-carboxilase, fosfoenol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase, frutose-1,6-bisfosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfoenol-piruvato-carbóxi-cinase, succinil-CoA-sintetase, metil-malonil-CoA-mutase, desde que se aspartocinase estiver desregulada como gene (i) pelo menos um segundo gene (i) diferente de aspartocinase terá que estar desregulado, e do cultivo de citado microorganismo.
Description
"PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE BETA-LISINA, PARA APRODUÇÃO DE BETA-AMINO-EPSILON-CAPROLACTAMA, PARA APRODUÇÃO DE EPSILON-CAPROLACTAMA, E PARA A PRODUÇÃODE ÁCIDO EPSILON-AMINO-CAPRÓICO"
Campo da invenção
A presente invenção refere-se à produção de β-lisina (beta-lisina). Mais particularmente, esta invenção refere-se ao uso demicroorganismo recombinante compreendendo moléculas de DNA em umaforma desregulada que são essenciais para produzir β-lisina.
Arte relacionada
Embora menos abundante do que os a-aminoácidoscorrespondentes, os β-aminoácidos ocorrem na natureza tanto em formaslivres quanto em peptídeos. Cardillo e Tomasini, Chem. Soe. Rev. 25:77(1996); Sewald, Aminoacids 11:397 (1996). Visto que β-aminoácidos sãobases mais fortes e ácidos mais fracos do que as contra-partes a-aminoácidos,peptídeos que contêm um β-aminoácido no lugar de um a-aminoácido,possuem um padrão de átomo de esqueleto diferente, resultando empropriedades novas.
Em 1950's, L-p-lisina foi identificada em vários antibióticos depeptídeo fortemente básico produzidos por Streptomyces. Antibióticos quedão L-p-lisina sob hidrólise incluem viomicina, estreptolina A, estreptotricina,roseotricina e geomicina. Stadtman, Adv. Enzymol. Relat. Areas Molec. Biol.38:413 (1973). β-Lisina também é um constituinte de antibióticos produzidospelos fungos Nocardia, tal como micomicina, e β-lisina pode ser usada parapreparar outros compostos biologicamente ativos. Contudo, a síntese químicade β-lisina é consumidora de tempo, requer materiais iniciais caros, e resultaem uma mistura racêmica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processopara a produção de β-lisina pela construção de um microorganismorecombinante que possui uma lisina-2,3-amino-mutase desregulada e pelomenos um gene desregulado selecionado dos genes que são essenciais na rotade biossíntese de lisina, e o cultivo de citado microorganismo.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de P-amino-e-caprolactama compreendendo umaetapa como mencionada acima para a produção de β-lisina.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de ε-caprolactama compreendendo uma etapa comomencionada acima para a produção de β-lisina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na descrição que segue, numerosos termos são utilizadosextensivamente. Definições são aqui proporcionadas para facilitar oentendimento da invenção.
O termo β-lisina significa L^-lisina.
Promotor. Uma seqüência de DNA que dirige a transcrição deum gene estrutural para produzir mRNA. Tipicamente, um promotor estálocalizado na região 5' de um gene, próximo do códon de iniciação de umgene estrutural. Se um promotor é um promotor induzível, então a velocidadede transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, avelocidade de transcrição não é regulada por um agente indutor, se opromotor é um promotor constitutivo.
Intensificador. Um elemento de promotor. Um intensificadorpode aumentar a eficiência com a qual um gene particular é transcrito emmRNA independente da distância ou da orientação do intensificador emrelação ao sítio de iniciação de transcrição.
Expressão. Expressão é o processo pelo qual um polipeptídeoé produzido de um gene estrutural. O processo envolve transcrição do geneem mRNA e a tradução de tal mRNA em polipeptídeo(s).Vetor de clonagem. Uma molécula de DNA, tal como umplasmídeo, cosmídeo, fagomídeo, ou bacteriófago, que possui a capacidade dese replicar autonomamente em uma célula hospedeira e que é usada paratransformar células para manipulação de gene. Vetores de clonagemtipicamente contêm um ou um número pequeno de sítios de reconhecimentode endonuclease de restrição no(s) qual(ais) seqüências de DNA estranhaspodem ser inseridas em um modo determinável sem perda de uma funçãobiológica essencial do vetor, bem como um gene marcador que é adequadopara uso na identificação e na seleção de células transformadas com o vetorde clonagem. Genes marcadores tipicamente incluem genes queproporcionam resistência à tetraciclina e resistência à ampicilina.
Vetor de expressão. Uma molécula de DNA compreendendoum gene estrutural clonado codificador de uma proteína estranha queproporciona a expressão da proteína estranha em um hospedeirorecombinante. Tipicamente, a expressão do gene clonado é posta sob ocontrole (i.e., operacionalmente ligada) certas seqüências regulatórias taiscomo seqüências de promotor e de intensificador. Seqüências de promotorpodem ser quer constitutivas quer induzíveis.
Hospedeiro recombinante. Um hospedeiro recombinante podeser qualquer célula procariótica ou eucariótica que contém quer um vetor declonagem quer um vetor de expressão. Este termo também significa a inclusãodaquelas células procarióticas ou eucarióticas que têm sido geneticamenteengenhadas para conterem gene(s) clonado(s) no cromossomo ou genoma dacélula hospedeira. Para exemplos de hospedeiros adequados, veja Sambrooket al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SecondEdition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)["Sambrook"].
Como aqui usado, uma proteína substancialmente purasignifica que a proteína purificada desejada está essencialmente livre decomponentes celulares contaminantes, como evidenciado por uma bandaúnica após eletroforese em gel de dodecil-sulfato de sódio - poliacrilamida(SDS-PAGE). O termo "substancialmente pura" significa adicionalmente adescrição de uma molécula que é homogênea por uma ou mais característicasde pureza ou de homogeneidade usadas por aquelas pessoas experientes naarte. Por exemplo, uma lisina-2,3-amino-mutase substancialmente puramostrará características constantes e reproduzíveis dentro de desvios padrãoexperimentais para parâmetros tais como os seguintes: peso molecular,migração cromatográfica, composição de aminoácido, seqüência deaminoácidos, Terminação-N bloqueada ou não-bloqueada, perfil de eluiçãoem HPLC, atividade biológica, e outros tais parâmetros. O termo, contudo,não significa a exclusão de misturas artificiais ou sintéticas de lisina-2,3-amino-mutase com outros compostos. Em adição, o termo não significa aexclusão de proteínas de fusão de lisina-2,3-amino-mutase isoladas de umhospedeiro recombinante.
Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de β-lisina pela construção de um microorganismorecombinante que possui uma lisina-2,3-amino-mutase desregulada e pelomenos um gene desregulado selecionado do grupo de (i) que consiste deaspartocinase, asparto-semialdeído-desidrogenase, di-hidro-dipicolinato-sintase, di-hidro-dipicolinato-redutase, tetra-hidro-dipicolinato-succinilase,succinil-amino-ceto-pimelato-transaminase, succinil-diamino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase,piruvato-carboxilase, fosfoenol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase,frutose-1,6-bisfosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfoenol-piruvato-carbóxi-cinase, succinil-CoA-sintetase, metil-malonil-CoA-mutase, desde quese aspartocinase estiver desregulada como gene (i) pelo menos um segundogene (i) diferente de aspartocinase terá que estar desregulado, e para o cultivode citado microorganismo.
As metodologias da presente invenção retratammicroorganismos recombinantes, preferivelmente incluindo vetores ou genes(e.g., genes de tipo selvagem e/ou mutados) como aqui descritos e/oucultivados em uma maneira que resulta na produção de β-lisina.
O termo microorganismo "recombinante" inclui ummicroorganismo (e.g., bactérias, célula de levedura, célula fungica, etc.) quetem sido geneticamente alterado, modificado ou engenhado (e.g.,geneticamente engenhado) de tal modo que exibe um fenótipo e/ou genótipoalterado, modificado e/ou diferente (e.g., quando a modificação genética afetaas seqüências de ácido nucleico codificadoras do microorganismo) emcomparação com o microorganismo naturalmente ocorrente do qual foiderivado.
O termo "desregulado" inclui expressão de um produto degene (e.g., lisina-2,3-amino-mutase) em um nível menor ou maior do queaquele expressado antes da manipulação do microorganismo ou em ummicroorganismo comparável que não tem sido manipulado. Em umamodalidade, o microorganismo pode ser geneticamente manipulado (e.g.,geneticamente engenhado) para expressar um nível de produto de gene em umnível menor ou maior do que aquele expressado antes da manipulação domicroorganismo ou em um microorganismo comparável que não tem sidomanipulado. Manipulação genética pode incluir, mas não é limitada à,alteração ou modificação de seqüências regulatórias ou sítios associados coma expressão de um gene particular (e.g., pela remoção de promotores fortes,promotores induzíveis ou promotores múltiplos), modificação da localizaçãocromossômica de um gene particular, alteração das seqüências de ácidonucleico adjacentes a um gene particular tal como um sítio de ligação deribossomo ou terminador de transcrição, decréscimo do número de cópias deum gene particular, modificação de proteínas (e.g., proteínas regulatórias,supressores, intensificadores, ativadores de transcrição e semelhantes)envolvidos em transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produtode gene particular, ou qualquer outros meios convencionais de desregulaçãode expressão de uma rotina de gene particular gene na arte (incluindo mas nãolimitado ao uso de moléculas de ácido nucleico de anti-senso, ou outrosmétodos para nocautear ou bloquear a expressão da proteína alva).
O termo "lisina-2,3-amino-mutase desregulada" tambémsignifica que uma atividade de lisina-2,3-amino-mutase é introduzida em ummicroorganismo onde uma atividade de lisina-2,3-amino-mutase não tem sidoobservada antes, e.g. pela introdução de um gene de lisina-2,3-amino-mutaseheterólogo em uma ou mais cópias no microorganismo preferivelmente pormeio de engenharia genética.
Lisina-2,3-amino-mutase catalisa a isomerização reversível deL-Iisina into β-lisina. A enzima isolada de cepa SB4 de Clostridiumsubterminale é uma proteína hexamérica de subunidades aparentementeidênticas, que possui um peso molecular de 285.000, como determinado doscoeficientes de difusão e de sedimentação. Chirpich et al., J. Biol. Chem.245:1778 (1970); Aberhart et al., J. Am. Chem. Soe. 105:5461 (1983); Changet al., Biochemistry 35:11081 (1996). A enzima clostridial contémagrupamentos de ferro-enxofre, cobalto e zinco, e 5'-fosfato piridoxal, e éativada por S-adenosil-metionina. Diferente de amino-mutases típicasdependentes de adenosil-cobalamina, a enzima clostridial não contém ourequer quaisquer espécies de coenzima de vitamina Bi2.
As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos predita delisina-2,3-amino-mutase clostridial (SEQ ID NOs:l e 2) são descritas em US6.248.874B1.
Moléculas de DNA codificadoras de gene de lisina-2,3-amino-mutase clostridial podem ser obtidas por triagem de bibliotecas de cDNA ougenômicas com sondas de polinucleotídeos possuindo seqüências denucleotídeos baseadas em SEQ ID NO:1. Por exemplo, uma bibliotecaadequada pode ser preparada pela obtenção de DNA genômico da cepa SB4de Clostridium subterminale (ATCC No. 29748) e construção de umabiblioteca de acordo com métodos padrão. Veja, por exemplo, Ausubel et al.(eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition,páginas 2-1 a 2-13 e 5-1 a 5-6 (John Wiley & Sons, Inc. 1995).
Alternativamente, o gene de lisina-2,3-amino-mutaseclostridial pode ser obtido por síntese de moléculas de DNA usandooligonucleotídeos longos mutuamente iniciadores. Veja, por exemplo,Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY, páginas 8.2.8 a 8.2.13 (1990) ["Ausubel"]. Também, vejaWosnick et al., Gene 60:115 (1987); e Ausubel et al. (eds.), SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, páginas 8-8 a 8-9(John Wiley & Sons, Inc. 1995). Técnicas estabelecidas usando a reação emcadeia de polimerase proporcionam a capacidade para sintetizar moléculas deDNA de comprimento de pelo menos 2 quilobases. Adang et al., Plant Molec.Biol. 21:1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266(1993); Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the RapidConstruction of Synthetic Genes," em METHODS IN MOLECULARBIOLOGY, Vol. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS ANDAPPLICATIONS, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993);Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995).
Podem ser produzidas variantes de lisina-2,3-amino-mutaseclostridial que contêm mudanças de aminoácido conservativo, comparadacom a enzima parental. Isto é, podem ser obtidas variantes que contêm umaou mais substituições de aminoácido de SEQ ID NO:2, na qual um alquil-aminoácido substitui um alquil-aminoácido na seqüência de aminoácidos delisina-2,3-amino-mutase clostridial aminoácido, um aminoácido aromáticosubstitui um aminoácido aromático na seqüência de aminoácidos de lisina-2,3-amino-mutase clostridial aminoácido, um aminoácido contendo enxofresubstitui um aminoácido contendo enxofre na seqüência de aminoácidos delisina-2,3-amino-mutase clostridial, um aminoácido contendo hidroxilasubstitui um aminoácido contendo hidroxila na seqüência de aminoácidos delisina-2,3-amino-mutase clostridial, um aminoácido ácido substitui umaminoácido ácido na seqüência de aminoácidos de lisina-2,3-amino-mutaseclostridial, um aminoácido básico substitui um aminoácido básico naseqüência de aminoácidos de lisina-2,3-amino-mutase clostridial, ou umaminoácido monocarboxílico dibásico substitui um aminoácidomonocarboxílico dibásico na seqüência de aminoácidos de lisina-2,3-amino-mutase clostridial.
Dentre os aminoácidos comuns, por exemplo, uma"substituição de aminoácido conservativo" é ilustrada por uma substituiçãodentre os aminoácidos dentro de cada um dos seguintes grupos: (1) glicina,alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenil-alanina, tirosina, e triptofano,(3) cisteína e metionina, (4) serina e treonina, (5) aspartato e glutamato, (6)glutamina e asparagina, e (7) lisina, arginina e histidina.
Mudanças de aminoácido conservativo na lisina-2,3-amino-mutase clostridial podem ser introduzidas pela substituição de nucleotídeoscitados em SEQ ID NO:l. Tais variantes de "aminoácido conservativo"podem ser obtidas, por exemplo, por mutagênese direcionada poroligonucleotídeo, mutagênese de varredura de ligante, mutagênese usando areação em cadeia de polimerase, e semelhante. Ausubel et al., supra, empáginas 8.0.3-8.5.9; Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, páginas 8-10 a 8-22 (John Wiley &Sons, Inc. 1995). Veja também em geral, McPherson (ed.), DIRECTEDMUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991). Acapacidade de tais variantes de converterem L-Iisina em L-p-lisina pode serdeterminada usando um ensaio de atividade enzimática padrão, tal como oensaio aqui descrito.
Lisina-2,3-amino-mutases de outras fontes diferentes deClostridium subterminale, e.g. de Bacillus subtilis ou de Escherichia coli têmsido descritas em US 6.248.874B1. As partes deste Patente US lidando com oisolamento, as SEQ ID NOs e a expressão de lisina-2,3-amino-mutases sãoaqui expressamente incorporadas como referência.
Lisina-2,3-amino-mutases preferidas de acordo com ainvenção são a lisina-2,3-amino-mutase de Clostridium subterminale, Bacillussubtilis e Escherichia coli e seus genes equivalentes, que possuem até 80%,preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95% e 98% de identidade deseqüência (baseada na seqüência de aminoácidos) com o correspondenteproduto de gene "original" e que possuem ainda a atividade biológica delisina-2,3-amino-mutase. Estes genes equivalentes podem ser facilmenteconstruídos pela introdução de substituições, deleções ou inserções denucleotídeo por métodos conhecidos na arte.
Outra modalidade preferida da invenção é a lisina-2,3-amino-mutase de Clostridium subterminale ( SEQ ID N0:2 de US 6.248.874B1) queé retraduzida em DNA pela aplicação do uso de códon de Corynebacteriumglutamicum. Esta seqüência de polinucleotídeo de lisina-2,3-amino-mutase éútil para a expressão de lisina-2,3-amino-mutase em microorganismo dogênero Corynebacterium, especialmente C. glutamicum.
Em adição ao gene desregulado de lisina-2,3-amino-mutase omicroorganismo de acordo com a invenção tem que possuir pelo menos umgene desregulado selecionado do grupo (i). O grupo (i) é um grupo de genesque desempenham um papel chave na biossíntese de lisina e consiste dosgenes de aspartocinase, aspartato-semialdeído-desidrogenase, di-hidro-dipicolinato-sintase, di-hidro-dipicolinato-redutase, tetra-hidro-dipicolinato-succinilase, succinil-amino-cetopimelato-transaminase, succinil-diamino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase,piruvaro-carboxilase, fosfo-enol-piruvaro-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase,frutose-l,6-bifosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol-piruvato-carboxicinase, succinil-CoA-sintetase, metil-malonil-CoA-mutase.
Pelo menos um gene do grupo (i) tem que ser desregulado deacordo com o processo da invenção. Preferivelmente mais do que um gene dogrupo (i), e.g. dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez genes sãodesregulados no microorganismo de acordo com a invenção.
Os genes e produtos de gene de grupo (i) são conhecidos naarte. EP 1108790 descreve mutações nos genes de homo-serina-desidrogenasee piruvato-carboxilase que possuem um efeito benéfico sobre a produtividadede corinebactérias recombinantes na produção de lisina. WO 00/63388descreve mutações no gene de aspartocinase que possuem um efeito benéficosobre a produtividade de corinebactérias recombinantes na produção de lisina.EP 1108790 e WO 00/63388 são aqui incorporadas como referências comrespeito às mutações nestes genes descritas acima.
Na tabela abaixo para cada gene / produto de gene sãomencionadas maneiras possíveis de desregulação do respectivo gene. Aliteratura e os documentos citados na coluna "Desregulação" da tabela sãoaqui incorporados como referências com respeito à desregulação de gene. Asmaneiras mencionadas na tabela são modalidades preferidas de umadesregulação do gene respectivo.Tabela. 1
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Uma maneira preferida de desregulação dos gene deaspartocinase, aspartato-semialdeído-desidrogenase, di-hidro-dipicolinato-sintase, di-hidro-dipicolinato-redutase, tetra-hidro-dipicolinato-succinilase,succinil-amino-cetopimelato-transaminase, succinil-diamino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase,piruvaro-carboxilase, fosfo-enol-piruvaro-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase,frutose-l,6-bifosfatase é uma "supra"- mutação que aumenta a atividade degene e.g. por amplificação de gene usando sinais de expressão fortes e/oumutações pontuais que intensificam a atividade enzimática.
Uma maneira preferida de desregulação dos genes de homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol-piruvato-carboxicinase, succinil-CoA-sintetase, metil-malonil-CoA-mutase é uma "infra"-mutação que diminui aatividade de gene e.g. por deleção ou disrupção de gene, usando sinais deexpressão fracos e/ou mutação pontual que destroem ou diminuem a atividadeenzimática.
Se aspartocinase é desregulada como um membro de grupo (i)de genes pelo menos um segundo membro de grupo (i) de genes - diferente deaspartocinase - também tem que ser desregulado.
Para expressar os genes desregulados de acordo com ainvenção, a seqüência de DNA codificadora da enzima tem que estaroperacionalmente ligada em seqüências regulatórias que controlam aexpressão de transcrição em um vetor de expressão e então, ser introduzidaem uma célula hospedeira quer procariótica quer eucariótica. Em adição àsseqüências regulatórias de transcrição, tais promotores e intensificadores,vetores de expressão podem incluir seqüências regulatórias de transcrição eum gene marcador que é adequado para seleção de células que trazem o vetorde expressão.
Promotores adequados para expressão em um hospedeiroprocariótico podem ser reprimíveis, constitutivos, ou induzíveis. Promotoresadequados são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte eincluem promotores capazes de reconhecer as T4, T3, Sp6 e T7 polimerases,os promotores Pr e Pl de bacteriófago lambda, os promotores trp, recA,promotor de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-la^pr, phoA, gal, trc e IacZ deΕ. coli, os promotores de α-amilase e os promotores σ -específicos de B.subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promotores deStreptomyces, o promotor int de bacteriófago lambda, o promotor bla do genede β-lactamase de pBR322, e o promotor CAT do gene de cloranfenicil-acetil-transferase. Promotores procarióticos são revistos por Glick, J. Ind.Microbiol. 1:277 (1987); Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THEGENE, 4 Ed., Benjamin Cummins (1987); Ausubel et al., supra, e Sambrooket al., supra.
Um promotor preferido para a expressão de lisina-2,3-amino-mutase é o promotor sodA de C. glutamicum. Com o objetivo de melhorar aexpressão de um terminador, e.g. o terminador groEL de C. glutamicum podeser inserido a jusante do gene de lisina-2,3-amino-mutase.
Métodos para a expressão de proteínas em hospedeirosprocarióticos são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte.Veja, por exemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coliusing plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," emDNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2nd Edition, Glover et al.(eds.), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Veja também, Ward etal., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," emMONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS,páginas 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995); e Georgiou, "Expression of Proteinsin Bactéria," em PROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES ANDPRACTICE, Cleland et al. (eds.), páginas 101-127 (John Wiley & Sons, Inc.1996).
Um vetor de expressão pode ser introduzido em célulashospedeiras bacterianas usando uma variedade de técnicas incluindotransformação em cloreto de cálcio, eletroporação, e semelhantes. Veja, porexemplo, Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY, 3rd Edition, páginas 1-1 a 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995).Um aspecto importante da presente invenção envolve o cultivoou a cultura de microorganismos recombinantes aqui descritos, de tal modoque um composto desejado de β-lisina seja produzido. O termo "cultivo"inclui manutenção e/ou crescimento de um microorganismo vivo da presenteinvenção (e.g., manutenção e/ou crescimento de uma cultura ou cepa). Emuma modalidade, um microorganismo da invenção é cultivado em meiolíquido. Em outra modalidade, um microorganismo da invenção é cultivadoem meio sólido ou em meio semi-sólido. Em uma modalidade preferida, ummicroorganismo da invenção é cultivado em meio (e.g., um meio líquido,estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutençãoe/ou o crescimento do microorganismo.
Fontes de carbono que podem ser usadas incluem açúcares ecarboidratos, tais como por exemplo sacarose, lactose, frutose, maltose,melaço, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como por exemplo óleo desoja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, ácidos graxos, taiscomo por exemplo ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, alcoóis,tais como por exemplo glicerol e etanol, e ácidos orgânicos, tal como porexemplo ácido acético. Em uma modalidade preferida, glicose, frutose ousacarose são usadas como fontes de carbono. Estas substâncias podem serutilizadas individualmente ou como uma mistura.
Fontes de nitrogênio que podem ser usadas compreendemcompostos contendo nitrogênio, tais como peptonas, extrato de levedo, extratode carne, extrato de malte, licor de macerado de milho, farinha de soja e uréiaou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio,carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem serusadas individualmente ou como uma mistura. Fontes de fósforo que podemser usadas são ácido fosfórico, di-hidrogeno-fosfato de potássio ou hidrogeno-fosfato de dipotássio ou os sais correspondentes contendo sódio. O meio decultura tem que conter adicionalmente sais de metal, tais como por exemplosulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para crescimento.Finalmente, substâncias promotoras de crescimento essenciais tais comoaminoácidos e vitaminas também podem ser usadas em adição às substânciascitadas acima. As substâncias alimentícias mencionadas acima podem seradicionadas na cultura como uma batelada única ou podem ser alimentadasapropriadamente durante a cultura.
Preferivelmente, os microorganismos da presente invenção sãocultivados sob pH controlado. O termo "pH controlado" inclui qualquer pHque resulta em produção do produto de química fina desejado, e.g., β-lisina.Em uma modalidade, microorganismos são cultivados em um pH de cerca de7. Em outra modalidade, os microorganismos são cultivados em um pH deentre 6,0 e 8,5. O pH desejado pode ser mantido por qualquer um denumerosos métodos conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte. Porexemplo, compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido depotássio, amônia, ou água amoniacal, ou compostos ácidos, tais como ácidofosfórico ou ácido sulfurico, são usados para apropriadamente controlar o pHda cultura.
Também preferivelmente, microorganismos da presenteinvenção são cultivados sob aeração controlada. O termo "aeraçãocontrolada" inclui aeração suficiente (e.g., oxigênio) para resultar emprodução do composto de química fina desejado, e.g., β-lisina. Em umamodalidade, aeração é controlada por regulação dos níveis de oxigênio nacultura, por exemplo, por regulação da quantidade de oxigênio dissolvido nomeio de cultura. Preferivelmente, aeração da cultura é controlada por agitaçãoda cultura. Agitação pode ser proporcionada por uma hélice ou equipamentode agitação mecânica similar, pelo revolvimento ou pela vascolejamento dovaso de crescimento (e.g., fermentador) ou por vários equipamentos debombeamento. Aeração pode ser adicionalmente controlada pela passagem deoxigênio ou ar estéril através do meio (e.g., através da mistura defermentação). Também, preferivelmente, microorganismos da presenteinvenção são cultivados sem espumação em excesso (e.g., via adição deagentes antiespumantes tais como poliglicol-ésteres de ácido graxo).
Além disso, microorganismos da presente invenção podem sercultivados sob temperaturas controladas. O termo "temperatura controlada"inclui qualquer temperatura que resulta em produção do composto de químicafina desejado, e.g., β-lisina. Em uma modalidade, a temperatura controladainclui temperaturas entre 15°C e 95°C. Em outra modalidade, temperaturascontroladas incluem temperaturas entre 15°C e 70°C. Temperaturas preferidasestão entre 20°C e 55°C, mais preferivelmente entre 30°C e 45°C ou entre30°C e 50°C.
Microorganismos podem ser cultivados (e.g., mantidos e/oucrescidos) em meios líquidos e preferivelmente são cultivados, quer contínuaquer intermitentemente, por métodos de cultura convencionais tais comocultura em repouso, cultura em tubo de ensaio, cultura com vascolejamento(e.g., cultura com vascolejamento rotativa, cultura em frasco devascolejamento, etc.), cultura rotativa com aeração, ou fermentação. Em umamodalidade preferida, os microorganismos são cultivados em frascos devascolejamento. Em uma modalidade mais preferida, os microorganismos sãocultivados em um fermentador (e.g., um processo de fermentação). Processosde fermentação da presente invenção incluem, mas não são limitados a,métodos de fermentação contínuos ou em batelada alimentada. A frase"processo em batelada" ou "fermentação em batelada" refere-se a um sistemafechado no qual a composição de meio, nutrientes, aditivos suplementares esemelhante são ajustados no início da fermentação e não são submetidos àalteração durante a fermentação, contudo, podem ser feitas tentativas paracontrolar fatores tais como pH e concentração de oxigênio para preveniracidulação excessiva do meio e/ou morte de microorganismo. A frase"processo em batelada alimentada" ou fermentação em "batelada alimentada"refere-se a uma fermentação em batelada exceto que um ou mais substratos ousuplementos são adicionados (e.g., adicionados em incrementos oucontinuamente) à medida que a fermentação progride. A frase "processocontínuo" ou "fermentação contínua" refere-se a um sistema no qual um meiode fermentação definido é adicionado em um fermentador e uma quantidadeigual de meio usado ou "condicionado" é simultaneamente removida,preferivelmente para recuperar a β-lisina desejada. Uma variedade de taisprocessos tem sido desenvolvida e é bem conhecida na arte.
A metodologia da presente invenção pode adicionalmenteincluir uma etapa de recuperação de β-lisina. O termo "recuperação de" β-lisina inclui extração, colheita, isolamento ou purificação do composto domeio de cultura. Recuperação do composto pode ser realizada de acordo comqualquer metodologia de isolamento ou purificação convencional conhecidana arte incluindo, mas não limitada a, tratamento com uma resinaconvencional (e.g., resina de troca aniônica ou catiônica, resina de adsorçãonão-iônica, etc.), tratamento com um adsorvente convencional (e.g., carvãoativado, ácido silícico, gel de sílica, celulose, alumina, etc.), alteração de pH,extração em solvente (e.g., com um solvente convencional tal como umálcool, acetato de etila, hexano e semelhante), destilação, diálise, filtração,concentração, cristalização, recristalização, ajuste de pH, liofilização esemelhante. Por exemplo β-lisina pode ser recuperada do meio de culturaprimeiro por remoção dos microorganismos. A biomassa removida do caldo éentão passada através ou sobre uma resina de troca catiônica para removercátions indesejados e então através ou sobre uma resina de troca aniônica pararemover ânions inorgânicos indesejados e ácidos orgânicos possuindoacidezes mais fortes do que a β-lisina.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de P-amino-s-caprolactama compreendendo umaetapa como mencionada acima para a produção de β-lisina. β-Lisina sofreuma ciclização intramolecular resultando em P-amino-e-caprolactama. Estareação de ciclização pode ser realizada quer diretamente antes do isolamentoe/ou da purificação da β-lisina quer com a β-lisina isolada.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de ε-caprolactama compreendendo uma etapa comomencionada acima para a produção de β-lisina. Como descrito acima β-lisinapode sofrer uma ciclização intramolecular resultando em β-amino-e-caprolactama, que pode ser desaminada seletivamente com o objetivo de darε-caprolactama. Este processo de desaminação é conhecido na arte.
Outro aspecto da presente invenção é um processo para aprodução de ácido compreendendo uma etapa como mencionada acima para aprodução de β-lisina e desaminação subseqüente da função β-amino da β-lisina. O ácido ε-amino-capróico resultante pode ser transformado quer em ε-caprolactama quer diretamente - sem ciclização para a lactama - em umapoliamina por técnicas de polimerização conhecidas.
ε-Caprolactama é um monômero muito importante para aprodução de poliamidas, especialmente PA6.
Exemplos
1.Clonagem de gene de lisina-2,3-amino-mutase de C.subterminale
Com regiões conservadas de a montante e a jusante do gene delisina-2,3-amino-mutase gene em Fusobacterium nucleatum eThermoanaerobacter tengcongensis, foi planejado um conjunto de iniciadoresoligonucleotídeo para isolar o gene de lisina-2,3-amino-mutase de C.subterminale (kamA). Iniciadores de PCR5 WKJ90/WKJ65 e WKJ68/WKJ93,foram usados com os cromossomo de C. subterminale como um modelo paraamplificar um fragmento de DNA da região a montante e a jusante incluindoa seqüência N- e C-terminal do gene kamA, respectivamente. A análise deseqüência com fragmentos de DNA amplificados foi realizada apóspurificação e resultou em produtos contendo seqüência inicial e final daregião estrutural de kamA. Baseado na seqüência a montante e a jusantedeterminada iniciadores de PCR, WKJ105/ WKJ106, foram sintetizados eusados para isolar a seqüência inteira do gene kamA de C. subterminale. Ofragmento de PCR amplificado foi purificado, digerido com enzimas derestrição Xho I e Mlu I e ligado no vetor pClik5aMCS digerido com asmesmas enzimas de restrição (pClik5aMCS kamA).
2. Clonagem de gene de lisina-2,3-amino-mutase sintético de
C. subterminale
O uso de códons para o gene kamA de C. subterminale ébastante diferente daquele para o C. glutamicum e desta maneira acarretadiminuição da expressão de gene em cepa de C. glutamicum produtora delisina. Para intensificar a expressão de gene em C. glutamicum, foi criadogene kamA sintético, que foi adaptado para uso de códon de C. glutamicum etinha promotor sodA (Psod) e terminador groEL de C. glutamicum em vezdos próprios do mesmo. O gene kamA sintético mostrou 72% de similaridadesobre a seqüência de nucleotídeos em comparação com a original. GenekamA sintético havia sido clonado no vetor pClik5aMCS (pClik5aMCSsynkamA).
3. Clonagem de gene de lisina-2,3-amino-mutase de B. subtilisO fragmento de DNA contendo o gene de lisina-2,3-amino-mutase de B. subtilis (yodO) foi amplificado de DNA cromossômico usandoiniciadores de PCR, WKJ71/WKJ72. O fragmento de DNA amplificado foipurificado, digerido com Xho I e Mlu I, e inserido entre os sítios de clivagemXho I e Mlu I do vetor pClik5aMCS (pClik5aMCS yodO).
Para aumentar a expressão do gene, o promotor sodA de C.glutamicum foi substituído no fronte da região de codificação do gene yodO.Os fragmentos de DNA contendo o promotor sodA e a região a montante dogene yodO foram amplificados de cada DNA cromossômico usandoiniciadores de PCR WKJ75/WKJ78 e WKJ73/WKJ76, respectivamente eusado como um modelo para PCR de fusão com iniciadores WKJ73/WKJ78para preparar o produto yodO upstream-Psod. Subseqüentemente, o geneyodO controlado por Psod foi criado por PCR de fusão com WKJ73/WKJ74como iniciadores e yodO upstream-Psod e região de codificação de yodO oqual foi amplificado com iniciadores WKJ77/WKJ74 como modelos. Oproduto de PCR foi purificado, digerido com Xho I e Mlu I, e inserido novetor pClik5aMCS (pClik5aMCS Psod yodO).
4. Clonagem de gene de lisina-2,3-amino-mutase de E. coli
Iniciadores de PCR WKJ29/WKJ30 foram usados com ocromossomo de E. coli como um modelo para amplificar o gene de lisina-2,3-amino-mutase (yjeK). O fragmento de PCR amplificado foi purificado,digerido com enzimas de restrição Xho I e Nde I e ligados no vetorpClik5aMCS digerido com as mesmas enzimas de restrição (pClik5aMCSyjeK).
Para aumentar a expressão do gene, promotor sodA de C.glutamicum foi substituído na frente de códon de iniciação do gene yjeK. Osfragmentos de DNA contendo o promotor sodA e a região de codificação dogene yjeK incluindo a região a jusante foram amplificados de cada DNAcromossômico usando iniciadores de PCR WKJ31/OLD47 e WKJ32/WKJ30,respectivamente, e usados como um modelo para PCR de fusão cominiciadores WKJ31/WKJ30 para preparar o gene Psod-yjeK. O fragmento dePCR foi purificado, digerido com Xho I e Nde I, e inserido em sítios declivagem Xho I-Nde I de vetor pClik5aMCS (pClik5aMCS Psod yjeK).
Iniciadores oligonucleotídeo usados:
WKJ29 gagagagactcgagttctacgcgagtaccggtcagWKJ3 O caacagcaatgcatatgaataattaaaggttatgcWKJ31 gagagagactcgagtagctgccaattattccgggWKJ3 2 tacgaaaggattttttacccatggcgcatattgtaaccctWKJ65 cagtctgcatcgctaacatcWKJ68 ggctctagaaccagtaggatWKJ71 gagagagagctcgagaagctttttaatcgaggcgtWKJ72 ctctctctcacgcgtaagcttgagctgctgatatgtcaggcWKJ73 tcccgaaagtttatggtgaaWKJ74 gagagagactcgagtagctgccaattattccgggWKJ75 acgaaaggattttttacccatgaacatcattgccattatgWKJ76 ctctctctcactagtgctcaatcacatattgcccaWKJ77 gagagagactcgagccggaagcgatggcggcatcWKJ78 tacgaaaggattttttacccatgagttctgccaagaagatWKJ90 cctaacacagaaatgtcWKJ93 tcctttgtaatatcgc
WKJl05 atcttcttggcagaactcatgggtaaaaaatcctttcgta
WKJl06 gagagagatctagatagctgccaattattccggg
OLD47 gggtaaaaaatcctttcgtag
Tabela 2. Plasmídeos usados
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5. Construção de cepa produtora de B-Iisina de C. glutamicumPara construir a cepa recombinante produtora de β-lisina, umacepa LUl 1271 produtora de lisina, que foi construída da cepa de tiposelvagem ATCC13032 de C. glutamicum pela incorporação de uma mutaçãopontual T311I em gene de aspartocinase, duplicação do gene de diamino-pimelato-desidrogenase e disrupção do gene de fosfo-enol-piruvato, foitransformada com os plasmídeos recombinantes possuindo os genes de lisina-2,3-amino-muatse.
6. Produção de β-Lisina em cultura em frasco devascolejamento
Experimentos em frascos de vascolejamento foram realizadosem cepas recombinantes para testar a produção de β-lisina. As mesmascondições e meio de cultura como a produção de lisina foram empregadoscomo descrito em W02005059139. Para o controle, a cepa hospedeira e acepa recombinante possuindo pClik5aMCS foram testadas em paralelo. Ascepas foram pré-cultivadas sobre ágar CM durante a noite a 3O0C. As célulascultivadas foram colhidas em um microtubo contendo 1,5 mL de NaCl 0,9% ea densidade celular foi determinada por absorbância a 610 nm após agitação.Para a cultura principal, células suspensas foram inoculadas para alcançar 1,5da OD inicial em 10 mL do meio de produção contido em um frascoErlenmeyer de 100 mL autoclavado possuindo 0,5 g de CaC03. A culturaprincipal foi realizada em um vascolejador rotativo (Infors AJl 18,Bottmingen, Suíça) com 200 rpm por 48-78 horas a 30°C. Para a medição decrescimento celular, 0,1 mL de caldo de cultura foi misturado com 0,9 mL deHCl 1 N para eliminar o CaCC>3, e a absorbância a 610 nm foi medida após adiluição apropriada. A concentração de β-lisina, lisina e açúcar residualincluindo glicose, frutose e sacarose foi medida pelo método de HPLC(Agilent 1100 Series LC system).
Como mostrado em tabela abaixo, um acúmulo de β-lisina foiobservado no caldo cultivado com cepa recombinante contendo gene kamAsintático de C. subterminale comparado com as cepas de controle. Isto indicaque o gene kamA sintético clostridial funciona em C. glutamicum. Em adição,expressão do gene kamA sintético, foi confirmada por SDS-PAGE.
Tabela 3. Cultura em frasco de vascolejamento com cepas deC. clostridium amplificadas em kamA
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Claims (9)
1. Processo para a produção de β-lisina, caracterizado pelo fatode compreender as etapas de construção de um microorganismo recombinanteque possui um gene de lisina-2,3-amino-mutase desregulado e pelo menos umgene desregulado selecionado do grupo (i) que consiste de aspartocinase,aspartato-semialdeído-desidrogenase, di-hidro-dipicolinato-sintase, di-hidro-dipicolinato-redutase, tetra-hidro-dipicolinato-succinilase, succinil-amino-cetopimelato-transaminase, succinil-diamino-pimelato-dessuccinilase,diamino-pimèlato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase, piruvaro-carboxilase, fosfo-enol-piruvaro-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase,transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase, frutose-l,6-bifosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol-piruvato-carboxicinase, succinil-CoA-sintetase,metil-malonil-CoA-mutase, desde que se aspartocinase está desregulado comogene (i) pelo menos um outro gene (i) diferente de aspartocinase tem que estardesregulado, e de cultivo de citado microorganismo.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o microorganismo pertence ao gênero Corynebacterium.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o microorganismo é Corynebacterium glutamicum.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a lisina-2,3-amino-mutase desregulada é uma lisina-2,3-amino-mutase heteróloga àquele microorganismo.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o microorganismo recombinante possui uma lisina-2,3-amino-mutase de Clostridium, Bacillus ou Escherichia.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a lisina-2,3-amino-mutase possui a seqüência de polipeptídeode lisina-2,3-amino-mutase de Clostridium subterminale, Bacillus subtilis ouEscherichia coli ou uma seqüência de polipeptídeo com uma atividade delisina-2,3-amino-mutase qUe é pelo menos 80% idêntica à do polipeptídeooriginal correspondente.
7. Processo para a produção de P-amino-e-caprolactama,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de acordo com areivindicação 1.
8. Processo para a produção de ε-caprolactama, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de acordo com a reivindicação 1.
9. Processo para a produção de ácido ε-amino-capróico,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de acordo com areivindicação 1.
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